CN115651072A - 一种枯草芽孢杆菌amep412蛋白在调节植物周际微生物群落结构中的应用 - Google Patents
一种枯草芽孢杆菌amep412蛋白在调节植物周际微生物群落结构中的应用 Download PDFInfo
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还涉及了上述枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412在调节植物周际微生物群落结构中的应用。本发明发现了枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412对植物周际微生物群落结构的调节作用；该蛋白可通过喷施叶片或施加入土壤，以直接的方式对其接触的叶际微生物或根际微生物群落结构进行调节；也可通过喷施叶片，以间接的方式对其未接触的新生叶的叶际微生物和根部的根际微生物群落结构进行调节；AMEP412蛋白可降低植物周际微生物中有害菌的比例，并提高有益菌的比例；本发明为植物健康生长提供了新的途径方法。
Description
技术领域
本发明属于生物与农业领域，涉及一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白在调节植物周际微生物群落结构中的应用。
背景技术
植物生长环境中存在着多种多样的微生物，根据其分布位置一般分为两种，包括叶际微生物和根际微生物。叶际微生物是指寄生或附生在植物叶子表面和内部的各种微生物。根际微生物是指在生活植物根系周围，受植物根系分泌物影响的土壤微生物。植物周际的微生物群落在植物生长过程中发挥着重要的生态功能，包括改变宿主微环境、促进植物生长、生物固氮、防御病害、作为外源基因载体以及吸附或降解环境污染物等。在正常情况下，微生物群落的组成丰富多样，有益菌和有害菌之间形成一定的平衡。但是，当菌落结构平衡出现失调，就会对植物产生不利的影响。
在以前的研究与应用中，人们通过在植物生长环境中加入各种肥料、杀菌剂、微生物菌剂等来改变周际的微生物群落，从而实现对植物周际菌群结构的调节，达到保障植物健康生长的目的。
然而，这些人工外加的物质一般只是针对外界微生物发生作用，而外界环境具有复杂与不确定性，这些物质难以长期稳定存在并发挥作用，导致效果缺乏规律性和稳定性。由此导致一些肥料和药剂过量使用，造成环境污染和残留。
以上研究忽视了植物在与周际微生物互作关系中的主体作用。通过调节植物代谢水平来影响周际微生物群落结构，是值得关注的新研究方向。
在之前的研究中，我们从枯草芽孢杆菌BU412中分离鉴定了AMEP412蛋白，具有抗菌肽和激发子的生物活性。但是，这些功能都是针对某个单一的植物或病原菌，关于AMEP412蛋白对植物周围微环境中微生物群落结构的影响并未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的新功能，主要涉及该蛋白对植物周际微生物群落结构的调节作用。
本发明通过以下技术方案来实现：
一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
上述枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白在调节植物周际微生物群落结构中的应用。
进一步的，所述的AMEP412蛋白通过直接的方式来发挥作用。
进一步的，所述的直接的方式为AMEP412蛋白喷施到叶片，会直接对其接触叶片的叶际微生物群落结构进行调节。
进一步的，所述的直接的方式为AMEP412蛋白施加入根部土壤，会直接对其接触土壤的根际微生物群落结构进行调节。
进一步的，所述的AMEP412蛋白通过间接的方式来发挥作用。
进一步的，所述的间接的方式为AMEP412蛋白喷施到叶片，会间接对其未接触的新生叶的叶际微生物群落结构进行调节。
进一步的，所述的间接的方式为AMEP412蛋白喷施到叶片，会间接对其未接触的根部的根际微生物群落结构进行调节。
采用上述技术方案的积极效果：本发明发现了枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白对植物周际微生物群落结构的调节作用；该蛋白可通过喷施叶片或施加入土壤，以直接的方式对其接触的叶际微生物或根际微生物群落结构进行调节；也可通过喷施叶片，以间接的方式对其未接触的新生叶的叶际微生物和根部的根际微生物群落结构进行调节； AMEP412蛋白可降低植物周际微生物中有害菌的比例，并提高有益菌的比例；本发明为植物健康生长提供了新的途径方法。
附图说明
图1为LC1和LA1的Shannon指数的稀释曲线；
图2为LC1、LC2、LA1和LA2的微生物群落的PCoA分析；
图3为LC1、LC2、LA1和LA2的细菌群落门的相对丰度；
图4为LC1、LC2、LA1和LA2的细菌群落属水平相对丰度热图；
图5为LC1和LA1的细菌群落与理化因子相关性冗余分析；
图6为RC1和R.A1的Shannon指数的稀释曲线；
图7为RC1、RC2、RA1和RA2的微生物群落的PCoA；
图8为RC1、RC2、RA1和RA2的细菌群落门的相对丰度；
图9为RC1、RC2、RA1和RA2的细菌群落属水平相对丰度热图；
图10为RC1和R.A1的细菌群落与理化因子相关性冗余分析；
图11为LC2和LA2的Shannon指数的稀释曲线；
图12为LC2和LA2的细菌群落与理化因子相关性冗余分析；
图13为RC2和R.A2的Shannon指数的稀释曲线；
图14为RC2和R.A2的细菌群落与理化因子相关性冗余分析。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的范围。
本发明中生物材料的来源：
1、所用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BU412于2016年3月23日在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏单位地址：中国湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016142；
实施例1
本实施例说明AMEP412蛋白对大豆叶际微生物群落结构的直接调节。
一、设置分组与样品处理
大豆在室内盆栽种植，待幼苗长至三出复叶(V3)期，选取长势一致的幼苗同步进行处理。喷施AMEP412蛋白(浓度为0.1mg/ml)至大豆叶片，以蒸馏水作为对照。待大豆长出四出复叶后，采集第三出复叶，对照命名为LC1，处理命名为LA1。本实施例中每个处理各设置3个重复，每个重复12株大豆，每株取2个叶片，即每个重复含 24片完整叶片。取样后立即用无菌离心管带回实验室后立即做菌体洗脱和收集。
二、叶际微生物菌体的洗脱和收集
大豆叶片放入500mL三角瓶，加入100mL无菌水，200r/min震荡45min，超声波振荡(40kHz)处理5min，200rpm摇床震荡45min，收集上清液加入到50mL离心管中，经0.22μm的滤膜抽滤收集菌体，滤膜放入离心管经液氮速冻，干冰保存送至公司进行微生物多样性的高通量测序分析。
三、高通量测序数据分析
经Illumina Miseq测序得到双端序列数据后，通过质控过滤，得到样品有效序列，校正序列方向，即为优化后的数据，得到的有效数据在97％的相似水平将序列聚类为一个OTU(operational taxonomic unit)。为获得每个OTU对应的物种分类信息，对97％相似水平的OTU序列进行分类学分析，细菌16S rRNA数据库为Silva，根据每个样品文库的OTU丰度信息，完成Alpha和Beta多样性分析。计算Chao1、ACE、Shannon 和Simpson指数，评估序列文库的多样性。随后进行不同处理微生物群落结构分析，进行柱状图、物种丰度热图、RDA图等绘制。
四、微生物群落分析结果
(1)大豆叶际微生物高通量测序数据预处理结果
利用高通量测序共得到319895条有效序列，单一样品序列数79762～80169条，每个样品至少产生79619条有效序列，平均产生79805条有效序列。对序列在97％相似水平下进行生物信息统计分析，获得452个OTU。采用稀释曲线分析样本间物种丰度及试验数据合理性(图1)结果表明，各个样本Shannon指数的稀释曲线平缓，即测序深度已覆盖样品中绝大多数物种，测序数据量足够反映样本中物种多样性。
(2)AMEP412蛋白直接处理对大豆叶际微生物群落的α多样性分析
97％序列相似度基于OTU分析对照组LC1和蛋白处理组LA1的Alpha多样性，并对各处理大豆叶际微生物多样性Chao1、ACE、Shannon、Simpson指数进行评估，结果表明(表1)，两组样品的细菌Coverage指数均达到0.994，表明测序结果合理。 AMEP412蛋白处理后的大豆叶片叶际微生物Shannon指数和Simpson指数均显著高于对照，说明AMEP412蛋白能够提高大豆叶片的细菌多样性；除此之外，AMEP412蛋白处理下的大豆叶片的Chao1也得到了显著提升，表明AMEP412蛋白可以提高叶片细菌的物种丰富度。
表1 Alpha多样性指数分析结果
注：表中不同小写字母表示组间差异有统计学意义，P≤0.052
(3)AMEP412蛋白直接处理对大豆叶际微生物群落的β多样性分析
PcoA分析结果表明(图2)，主成分1(PC1)及主成分2(PC2)共解释了96.53％的微生物结构差异，贡献率分别为75.41％和21.12％。LC1和LA1在坐标轴上有一定距离但也有交叉部分，表明两处理之间微生物群落有相似也有差异。进一步采用非参数检验法ANOSIM分析得，R＝0.25，P＜0.05，即样品的组间差异大于组内差异，差异显著。综上所述，蛋白处理后的大豆叶片叶际细菌群落之间的差异被增大，而蛋白处理后的新生叶片叶际细菌群落的差异被减小。
(4)AMEP412蛋白直接处理对大豆叶际微生物分类学组成的分析
97％相似度水平下对样品序列进行OTU聚类，对各处理大豆叶片样品进行鉴定，得到细菌共19个门，37个纲，93个目，157个科，258个属，278个种。AMEP412蛋白对大豆叶际微生物分类学组成的分析结果表明(表2)，AMEP412蛋白处理后，叶际细菌数量增多，表现在门、纲、目、科、属水平上均高于对照。
表2不同处理下的细菌数量
(5)AMEP412蛋白直接处理对大豆叶际微生物门水平群落影响分析
大豆叶际微生物门水平上优势细菌群落为蓝细菌门Cyanobacteria、变形菌门Proteobacteria、厚壁菌门Fimicutes、放线菌门Actinobecteria、拟杆菌门Bacteroidetes、酸杆菌门Acidobacteria、绿弯菌门Chloroflexi、硝化螺旋菌门Nitrospirota、梭杆菌门 Fusobacteria、疣微菌门Verrucomicrobia、弯曲杆菌门Campylobacterota、芽单胞菌门 Gemmatimonadota、Deinococcota。喷施AMEP412蛋白后(图3)，蓝细菌门 Cyanobacteria、厚壁菌门Fimicutes、疣微菌门Verrucomicrobia、弯曲杆菌门 Campylobacterota分别降低了3.78％、34.11％、59.27％、37.34％。变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobecteria、拟杆菌门Bacteroidetes、酸杆菌门Acidobacteria、绿弯菌门 Chloroflexi、硝化螺旋菌门Nitrospirota、梭杆菌门Fusobacteria、芽单胞菌门 Gemmatimonadota、Deinococcota分别上升16.89％、22.68％、171.18％、70.70％、234.12％、 209.02％、28.32％、5.59％、9.33％。其中绿弯菌门Chloroflexi、硝化螺旋菌门Nitrospirota 成为优势菌。
(6)AMEP412蛋白直接处理对大豆叶际微生物属水平群落影响分析
大豆叶际细菌在属水平上(图4)，LC1的优势群落为气单胞菌属Aeromonas、Clostridium_sensu_stricto_1菌属、不动杆菌属Acinetobacter、Brevundimonas菌属、Woeseia菌属、unclassified_Actinobacteriota菌属、unclassified_Enterobacterales菌属、 unclassified_Enterobacteriaceae菌属、uncultured_delta_proteobacterium菌属、uncultured_gamma_proteobacterium菌属。施用蛋白后LA1的优势菌落为鞘脂单胞菌属Sphingomonas、假单胞菌属Pseudomonas、Blastomonas、植物杆菌属Lactiplantibacillus、芽孢杆菌属Bacillus、乳杆菌属Lactobacillus、薄层菌属Hymenobacter、栖粪杆菌属Faecalibacterium、拟杆菌属Bacteroides。其中鞘脂单胞菌属Sphingomonas、假单胞菌属Pseudomonas、Blastomonas、植物杆菌属Lactiplantibacillus、芽孢杆菌属Bacillus、乳杆菌属Lactobacillus成为优势菌属，unclassified_Actinobacteriota菌属、uncultured_delta_proteobacterium菌属、uncultured_gamma_proteobacterium菌属在施用 AMEP412蛋白后消失。
(7)AMEP412蛋白直接处理对大豆叶际微生物菌群与环境因子关联分析
对各样本的优势细菌属与环境因子进行RDA分析(图5)，第1轴可解释所有信息的62.21％，第2轴可解释32.14％，总解释率达94.35％，可反映实际情况。通过Canoco 软件对土壤理化因子对菌群结构的影响进行分析，因子为AMEP412蛋白处理。如图5 所示，喷施AMEP412蛋白后LA1中鞘脂单胞菌属Sphingomonas、假单胞菌属 Pseudomonas、Blastomonas菌属、植物杆菌属Lactiplantibacillus、芽孢杆菌属Bacillus 与AMEP412蛋白处理成正相关。结合菌群功能来看，有诸多研究已经证实来自芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌具有拮抗病原菌、诱导系统抗性或促进植物生长等特性，鞘单胞菌属(Sphingomonas spp.)能够分泌植株生长所需的吲哚乙酸等促进植物生长，丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)菌株产生的生物活性分子通过引导气孔关闭从而阻止病原体的进入。在喷施AMEP412蛋白后大豆叶际微生物中鞘脂单胞菌属 Sphingomonas、假单胞菌属Pseudomonas、Blastomonas菌属、植物杆菌属 Lactiplantibacillus、芽孢杆菌属Bacillus等有益菌含量都相对增加。
实施例2
本实施例说明AMEP412蛋白对大豆根际微生物群落结构的直接调节。
一、设置分组与样品处理
大豆在室内盆栽种植，待幼苗长至三出复叶(V3)期，选取长势一致的幼苗同步进行处理。浇灌AMEP412蛋白(浓度为0.1mg/ml，50ml/株)至大豆根部土壤，以蒸馏水作为对照。待大豆长出四出复叶后，收集大豆根部的根际土壤，对照命名为RC1，处理命名为RA1。本实施例中每个处理各设置3个重复。取样后立即用液氮速冻，干冰保存送至公司进行土壤的微生物多样性的高通量测序分析。
二、高通量测序数据分析
同实施例1。
三、微生物群落分析结果
(1)大豆叶际微生物高通量测序数据预处理结果
利用高通量测序共得到159758条有效序列，单一样品序列数79726～80032条，每个样品至少产生79263条有效序列，平均产生79438条有效序列。对序列在97％相似水平下进行生物信息统计分析，获得967个OTU。采用稀释曲线分析样本间物种丰度及试验数据合理性(图6)结果表明，各个样本Shannon指数的稀释曲线平缓，即测序深度已覆盖样品中绝大多数物种，测序数据量足够反映样本中物种多样性。
(2)AMEP412蛋白直接处理对大豆根际微生物群落的α多样性分析
对大豆根际细菌16S rRNA基因V3～V4区进行了高通量测序。97％序列相似度基于OTU分析对照组(RC1)和蛋白处理组(RA1)的Alpha多样性，并对各处理大豆叶际微生物多样性Chao1、ACE、Shannon、Simpson指数进行评估，结果表明(表3)，两组样品的细菌Coverage指数均分别达到0.9992-0.9995之间，表明测序结果合理。与 RC1相比，蛋白处理后的大豆根际微生物的Chao1、ACE、Simpson指数上升，其中细菌增长幅度分别为3.01％、0.71％、0.41％，细菌的Shannon指数下降4.43％，差异显著 (P＜0.05)，表明AMEP412蛋白处理的大豆根际微生物群落多样性和相对丰富度显著高于对照。
表3 Alpha多样性指数分析结果
注：表中不同小写字母表示组间差异有统计学意义，P≤0.052
(3)AMEP412蛋白直接处理对大豆根际微生物群落的β多样性分析
PcoA分析结果表明(图7)，主成分1(PC1)及主成分2(PC2)共解释了96.62％的微生物结构差异，贡献率分别为73.51％和23.11％。根际土壤样品中有部分交叉，表明各处理之间微生物群落有相似也有差异。RC1与RA1的细菌群落结构组成差异较大。由此可以看出，AMEP412蛋白改变了根际土壤细菌群落结构，并随着时间的增加群落组成差异明显。
(4)AMEP412蛋白直接处理对大豆根际微生物分类学组成的分析
97％相似度水平下对样品序列进行OTU聚类，对各处理大豆叶片样品进行鉴定，得到细菌共21个门，40个纲，96个目，163个科，356个属，401个种。AMEP412蛋白对大豆根际微生物分类学组成的分析结果表明(表4)，AMEP412蛋白处理后，根际细菌数量增多，表现在门、纲、目、科、属水平上均高于对照。
表4不同处理下的细菌数量
(5)AMEP412蛋白直接处理对大豆根际微生物门水平群落影响分析
物种组成分析反映样品在不同分类学水平上的群落结构。图8展示了门(phylum)水平的群落结构和分类比较结果，大豆根际微生物门水平上相对含量前十的菌门是厚壁菌门Fimicutes、变形菌门Proteobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、放线菌门Actinobecteria、蓝细菌门Cyanobacteria、螺旋体门Spirochaetes、绿弯菌门Chloroflexi、酸杆菌门Acidobacteria、梭杆菌门Fusobacteria、芽单胞菌门Gemmatimonadota。浇灌AMEP412蛋白后厚壁菌门Fimicutes、拟杆菌门Bacteroidetes、螺旋体门 Spirochaetes、酸杆菌门Acidobacteria、梭杆菌门Fusobacteria、芽单胞菌门Gemmatimonadota分别上升了14.01％、1.81％、16.67％、3.23％、11.44％、5.98％。变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobecteria逐渐减少，蓝细菌门Cyanobacteria差异不大。
(6)AMEP412蛋白直接处理对大豆根际微生物属水平群落影响分析
大豆根际细菌在属水平上(图9)看，图中列出了相对丰度前30的属。RC1的优势群落为Streptomyces菌属、Fusarium oxysporum菌属、Gliocladium roseum菌属、 Fusariumsemitectum菌属、不动杆菌属Agathobacter、瘤胃梭菌属Ruminiclostridium、瘤胃球菌属Ruminococcus_1。浇灌蛋白后RA1的优势菌落为布劳特氏菌属Blautia、拟杆菌属Bacteroides、鞘脂单胞菌属Sphingomonas、假单胞菌属Pseudomonas、另枝菌属Alistipes、普拉梭菌Faecalibacterium、Azoarcus菌属。其中布劳特氏菌属Blautia、拟杆菌属Bacteroides成为优势菌属，Streptomyces菌属、Fusarium oxysporum菌属、Gliocladium roseum菌属、Fusarium semitectum菌属、不动杆菌属Agathobacter、瘤胃梭菌属Ruminiclostridium、瘤胃球菌属Ruminococcus_1在施用AMEP412蛋白后消失。
(7)大豆根际微生物菌群与环境因子(AMEP412蛋白直接处理)的关联分析
通过Canoco软件对AMEP412蛋白直接处理与根际微生物菌群结构的关联进行分析，理化因子为AMEP412蛋白。如图10所示，RA1含有的菌属与AMEP412蛋白呈正相关，RC1含有的菌属与AMEP412蛋白呈负相关。在大豆根际微生物中，AMEP412 蛋白处理过的大豆土壤中Blautia、拟杆菌属Bacteroides、鞘脂单胞菌属Sphingomonas、假单胞菌属Pseudomonas、另枝菌属Alistipes等有益菌含量明显增加。而未处理的土壤中，Streptomyces菌属、Fusarium oxysporum菌属、Gliocladium roseum菌属、不动杆菌属Agathobacter、瘤胃梭菌属Ruminiclostridium等致病菌较多。
实施例3
本实施例说明AMEP412蛋白对大豆叶际微生物群落结构的间接调节。
一、设置分组与样品处理
大豆在室内盆栽种植，待幼苗长至三出复叶(V3)期，选取长势一致的幼苗同步进行处理。喷施AMEP412蛋白(浓度为0.1mg/ml)至大豆叶片，以蒸馏水作为对照。待大豆长出四出复叶后，采集新生的第四出复叶，对照命名为LC2，处理命名为LA2。本实施例中每个处理各设置3个重复，每个重复12株大豆，每株取2个叶片，即每个重复含24片完整叶片。取样后立即用无菌离心管带回实验室后立即做菌体洗脱和收集。
二、叶际微生物菌体的洗脱和收集
同实施例1。
三、高通量测序数据分析
同实施例1。
四、微生物群落分析结果
(1)大豆叶际微生物高通量测序数据
利用高通量测序共得到160110条有效序列，单一样品序列数79614～80010条，每个样品至少产生79753条有效序列，平均产生79867条有效序列。对序列在97％相似水平下进行生物信息统计分析，获得476个OTU。采用稀释曲线分析样本间物种丰度及试验数据合理性(图11)结果表明，各个样本Shannon指数的稀释曲线平缓，即测序深度已覆盖样品中绝大多数物种，测序数据量足够反映样本中物种多样性。
(2)AMEP412蛋白间接处理大豆新生叶叶际微生物群落的α多样性分析
97％序列相似度基于OTU分析对照组(LC2)和蛋白处理组(LA2)的Alpha多样性，并对各处理大豆叶际微生物多样性Chao1、ACE、Shannon、Simpson指数进行评估，结果表明(表5)，两组样品的细菌Coverage指数均分别达到0.996-0.997之间，表明测序结果合理。AMEP412蛋白处理后，在处理第十天时新生叶片中叶际细菌群落丰富度略低于对照(Chao1：327.5＜338.85；ACE：314.68＜329.92；P＞0.05)但无显著性差异； AMEP412蛋白处理后细菌群落多样性高于对照(Shannon：2.2256＞1.5292；Simpson：0.656 ＞0.4339；P＜0.05)，达到差异显著。说明AMEP412蛋白处理后可增加大豆喷施后的叶片的细菌多样性和物种丰富度对大豆新生叶影响效果也较明显。
表5 Alpha多样性指数分析结果
注：表中不同小写字母表示组间差异有统计学意义，P≤0.052.
(3)AMEP412蛋白间接处理大豆新生叶叶际微生物分类学组成的分析
97％相似度水平下对样品序列进行OTU聚类，对各处理大豆叶片样品进行鉴定，得到细菌共20个门，41个纲，100个目，165个科，271个属，289个种。AMEP412蛋白间接处理对大豆叶际微生物分类学组成的分析结果表明(表6)，AMEP412蛋白处理后，叶际细菌数量增多，表现在门、纲、目、科、属水平上均高于对照。
表6不同处理下的细菌数量
(4)AMEP412蛋白间接处理大豆新生叶叶际微生物门水平群落变化分析
与对照LC2相比(图3)，LA2的叶际微生物在门水平有明显变化。其中，变形菌门Proteobacteria、梭杆菌门Fusobacteria、疣微菌门Verrucomicrobia分别下降了26.53％、72.92％、47.98％。蓝细菌门Cyanobacteria、厚壁菌门Fimicutes、放线菌门Actinobecteria、拟杆菌门Bacteroidetes、酸杆菌门Acidobacteria、绿弯菌门Chloroflexi、硝化螺旋菌门 Nitrospirota、弯曲杆菌门Campylobacterota、芽单胞菌门Gemmatimonadota、Deinococcota 分别上升了12.47％、29.04％、57.78％、93.47％、64.25％、59.56％、79.40％、17.86％、86.71％、 13.73％。拟杆菌门Bacteroidetes和芽单胞菌门Gemmatimonadota成为优势菌属。
(5)AMEP412蛋白间接处理大豆新生叶叶际微生物属水平群落影响分析
与对照LC2相比(图4)，LA2的叶际微生物在属水平有更为明显的变化。其中， LC1的优势菌群落为Klebsiella菌属、游球菌属Planococcus、Escherichia Shigella菌属、unclassified_Nostocaceae菌属、unclassified_Lachnospiraceae菌属。LA1的优势菌群为拟杆菌属Bacteroides、布劳特氏菌属Blautia、Lachnospiraceae菌属、Pseudonocardia 菌属、寡养单胞菌属Stenotrophomonas。Pseudonocardia菌属、寡养单胞菌属Stenotrophomonas为LA2独有菌属。游球菌属Planococcus、unclassified_Lachnospiraceae 菌属、unclassified_Nostocaceae菌属则消失。
(6)大豆新生叶叶际微生物菌群与环境因子(AMEP412蛋白间接处理)的关联分析
通过Canoco软件对AMEP412蛋白处理与新生叶叶际微生物菌群结构的关联进行分析，理化因子为AMEP412蛋白。结果显示(图12)，unclassified Enterobacteriaceae、unclassified Nostocaceae、不动杆菌属Acinetobacter的相对丰度与AMEP412蛋白处理成负相关。芽孢杆菌属Bacillus、鞘脂单胞菌属Sphingomonas、假单胞菌属Pseudomonas 的相对丰度与AMEP412蛋白处理成正相关。且随着AMEP412蛋白处理后，在新生叶中也有少量的鞘脂单胞菌属Sphingomonas、假单胞菌属Pseudomonas和芽孢杆菌属 Bacillus。说明AMEP412蛋白可以促进新生叶中有益菌含量增加，致病菌含量减少。
实施例4
本实施例说明AMEP412蛋白对大豆根际微生物群落的间接调节。
一、设置分组与样品处理
大豆在室内盆栽种植，待幼苗长至三出复叶(V3)期，选取长势一致的幼苗同步进行处理。喷施AMEP412蛋白(浓度为0.1mg/m1)至大豆叶片，以蒸馏水作为对照。待大豆长出四出复叶后，采集根部的根际土壤，对照命名为RC2，处理命名为RA2。本实施例中每个处理各设置3个重复，每个重复12株大豆的根际土壤。根际土壤放入离心管经液氮速冻，干冰保存送至公司进行微生物多样性的高通量测序分析。
二、高通量测序数据分析
同实施例1。
三、微生物群落结构分析
(1)大豆根际微生物高通量测序数据
利用高通量测序共得到159763条有效序列，单一样品序列数79814～79949条，每个样品至少产生79172条有效序列，平均产生79372条有效序列。对序列在97％相似水平下进行生物信息统计分析，获得777个OTU。采用稀释曲线分析样本间物种丰度及试验数据合理性(图13)结果表明，各个样本Shannon指数的稀释曲线平缓，即测序深度已覆盖样品中绝大多数物种，测序数据量足够反映样本中物种多样性。
(2)AMEP412蛋白间接处理大豆根际微生物群落的α多样性分析
97％序列相似度基于OTU分析对照组(RC2)和蛋白处理组(RA2)的Alpha多样性，并对各处理大豆根际微生物多样性Chao1、ACE、Shannon、Simpson指数进行评估，结果表明(表7)，两组样品的细菌Coverage指数均分别达到0.991-0.994之间，表明测序结果合理。AMEP412蛋白处理后，在处理第十天时新生叶片中Chao1：8.0925＞7.4757；ACE：782.6412＞770.8593说明根际细菌群落丰富度高于对照； AMEP412蛋白处理后细菌群落多样性略低于对照(Shannon：685.6250＜750.8571； Simpson：0.9927＞0.9706；P＜0.05)，但差异不显著。说明AMEP412蛋白处理后可增加大豆喷施后的叶片的细菌多样性和物种丰富度。
表7 Alpha多样性指数分析结果
注：表中不同小写字母表示组间差异有统计学意义，P≤0.052.
(3)AMEP412蛋白间接处理大豆根际微生物分类学组成的分析
97％相似度水平下对样品序列进行OTU聚类，对各处理大豆叶片样品进行鉴定，得到细菌共20个门，42个纲，101个目，168个科，273个属，293个种。AMEP412蛋白间接处理对大豆根际微生物分类学组成的分析结果表明(表8)，AMEP412蛋白处理后，叶际细菌数量增多，表现在门、纲、目、科、属水平上均高于对照。
表8不同处理下的细菌数量
(4)AMEP412蛋白间接处理大豆根际微生物门水平群落变化分析
对于细菌的注释分析(16S rRNA)，与对照LC2相比(图8)，LA2的叶际微生物在门水平有明显变化，其中含量最多的是厚壁菌门Firmicutes，接下来根据含量依次为拟杆菌门Bacteroidetes、放线菌门Actinobacteria、蓝细菌门Cyanobacteria、绿弯菌门Chloroflexi、酸杆菌门Acidobacteria、芽单胞菌门Gemmatimonadetes。在大豆根际土壤中喷施AMEP412蛋白后厚壁菌门Firmicutes的含量均高于45％，拟杆菌门和放线菌门均达10％以上。其中，AMEP412蛋白间接处理后的大豆根际微生物含量显著高于对照组。
(5)AMEP412蛋白间接处理大豆根际微生物属水平群落影响分析
与对照RC2相比(图9)，RA2的根际微生物在属水平有更为明显的变化。其中， RC2的优势菌群落为气单胞菌属Aeromonas、Geobacter菌属、Cellvibrio菌属、链球菌属Streptococcus、脱硫弧菌属Desulfovibrio。RA2的优势菌群为Flavobacterium菌属、双歧杆菌属Bifidobacterium、苍白杆菌属Ochrobactrum、乳杆菌属Lactobacillus、甲基杆菌属Alloprevotella、Acidovorax菌属。双歧杆菌属Bifidobacterium、苍白杆菌属Ochrobactrum为RA2独有菌属。鞘脂单胞菌属、假单胞菌属是喷施AMEP412蛋白后共有的有益菌属。气单胞菌属Aeromonas、链球菌属Streptococcus、脱硫弧菌属 Desulfovibrio则消失。
(6)大豆根际微生物菌群与环境因子(AMEP412蛋白间接处理)的关联分析
AMEP412蛋白间接处理与根际微生物菌群结构的关联进行分析，理化因子为AMEP412蛋白。结果显示(图14)，气单胞菌属Aeromonas、Geobacter菌属、Cellvibrio 菌属、链球菌属Streptococcus、脱硫弧菌属Desulfovibrio的相对丰度与AMEP412蛋白处理成负相关。Flavobacterium菌属、双歧杆菌属Bifidobacterium、鞘脂单胞菌属 Sphingomonas、假单胞菌属Pseudomonas的相对丰度与AMEP412蛋白处理成正相关。其中鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas trueperi)可以用来防治具刺腐霉(Pythium spinosum) 和异丝绵霉(Achlya klebsiana)等引起的病害，假单胞菌属中的部分细菌种是典型的根际促生菌(PGPR)，可以用来防治棉花黄萎病和立枯病、小麦全蚀病等多种土传病害。在AMEP412蛋白喷施叶片后土壤中Flavobacterium菌属、双歧杆菌属Bifidobacterium、鞘脂单胞菌属Sphingomonas、假单胞菌属Pseudomonas的相对丰度均有所增加，说明 AMEP412蛋白间接处理可以增加土壤有益菌含量。
本发明发现了枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白对植物周际微生物群落结构的调节作用；该蛋白可通过喷施叶片或施加入土壤，以直接的方式对其接触的叶际微生物或根际微生物群落结构进行调节，也可通过喷施叶片，以间接的方式对其未接触的新生叶的叶际微生物和根部的根际微生物群落结构进行调节；AMEP412蛋白可降低植物周际微生物中有害菌的比例，并提高有益菌的比例；本发明为植物健康生长提供了新的途径方法。
序列表
<110> 黑龙江权晟生物科技有限公司
黑龙江八一农垦大学
<120> 一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白在调节植物周际微生物群落结构中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 76
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
Met Phe Gly Pro Ile Leu Lys Ala Leu Lys Ala Leu Val Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Trp Gly Lys Val Ala Ser Phe Leu Lys Trp Ala Gly Asn Leu Ala
20 25 30
Ala Ala Ala Ala Lys Tyr Ser Tyr Thr Ser Gly Lys Lys Ile Leu Ala
35 40 45
Tyr Ile Gln Lys His Pro Gly Lys Ile Val Asp Trp Phe Leu Lys Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Tyr Asp Val Ile Lys Met Ile Leu Gly
65 70 75
Claims (8)
1.一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白在调节植物周际微生物群落结构中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的AMEP412蛋白通过直接的方式来发挥作用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的AMEP412蛋白通过间接的方式来发挥作用。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的直接的方式为AMEP412蛋白喷施到叶片，直接对其接触叶片的叶际微生物群落结构进行调节。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的直接的方式为AMEP412蛋白施加入根部土壤，直接对其接触土壤的根际微生物群落结构进行调节。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的间接的方式为AMEP412蛋白喷施到叶片，间接对其未接触的新生叶的叶际微生物群落结构进行调节。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的间接的方式为AMEP412蛋白喷施到叶片，间接对其未接触的根部的根际微生物群落结构进行调节。
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| CN113788882A (zh) * | 2021-08-12 | 2021-12-14 | 黑龙江八一农垦大学 | 一种枯草芽孢杆菌amep412蛋白在抑制肿瘤细胞增殖中的应用 |
-
2022
- 2022-06-16 CN CN202210682729.6A patent/CN115651072A/zh active Pending
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