CN109096378A

CN109096378A - 一种枯草芽孢杆菌蛋白激发子amep412及其功能

Info

Publication number: CN109096378A
Application number: CN201810919181.6A
Authority: CN
Inventors: 刘权; 殷奎德; 申永瑞; 向君亮; 刘爽; 李章雷
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Heilongjiang Quansheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-08-14
Filing date: 2018-08-14
Publication date: 2018-12-28
Anticipated expiration: 2038-08-14
Also published as: CN109096378B

Abstract

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌蛋白激发子AMEP412，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还涉及了上述枯草芽孢杆菌蛋白激发子AMEP412的新功能。本发明发现了一种未知功能的蛋白AMEP412的蛋白激发子功能，包括促进植物生长，提高植物抗病、耐盐碱、抗干旱和耐低温能力，为生物防治工作积累了新的材料。

Description

一种枯草芽孢杆菌蛋白激发子AMEP412及其功能

技术领域

本发明属于植物保护与生物防治领域，涉及一种枯草芽孢杆菌蛋白激发子AMEP412及其功能。

背景技术

植物在生长过程中与周围环境紧密关联，植物对环境影响会做出相应的反应，来避免危害发生。由此发展而来的激发子对植物病害防治和抗逆作用的研究成为一个新的研究方向。激发子是一类来自于病原物本身，能够作用于植物并诱导植物产生防卫反应的化合物。激发子是诱导植物自身免疫防卫体系发生作用，综合提高植物自身代谢水平，增强防御病害和自然胁迫的能力，进而提高作物产量和品质。激发子不作用于病原物，因此不会使病原物产生抗药性，对环境也不会产生有害影响，具有开发为绿色生物制剂的潜力。

按照激发子的来源通常分为非生物激发子和生物源激发子。非生物激发子指非生物来源的物质和胁迫性环境因子。生物源激发子是植物与微生物互作的桥梁，诱导植物防御反应的起始信号分子。蛋白类激发子可诱导植物防卫反应，还具有调节植物生长代谢，促进植物生长的功能。目前已经报道的蛋白类激发子包括糖蛋白 (Glycoprotein)、过敏蛋白(Harpin)、隐地蛋白(Elicitin)和激活蛋白(Activator)等。

目前关于蛋白激发子的报道大部分是关于病原菌蛋白激发子的研究。生防菌虽然是诱导植物系统抗性的一大生物类群，但由于起步较晚，导致对其蛋白激发子的研究相对较少。生防细菌诱导植物产生系统抗性的激发子包括蛋白多肽、脂多糖、嗜铁素、抗生素及挥发性有机物等。例如蜡样芽孢杆菌中C1L中分离出的激发子二甲基二硫醚，枯草芽孢杆菌S499中的丰原素，荧光假单胞菌SS101中分离出的Massetolide A激发子等。因此，生防菌中蛋白激发子的分离鉴定对于植物保护研究具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种枯草芽孢杆菌蛋白激发子AMEP412，克服目前对于生防菌的蛋白激发子鉴定较少，不利于植物保护与生物防治研究的问题。

本发明的第二目的是提供上述枯草芽孢杆菌蛋白激发子AMEP412的功能。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一种枯草芽孢杆菌蛋白激发子AMEP412，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

二、上述的枯草芽孢杆菌蛋白激发子AMEP412在激发植物功能中的应用。

进一步的，所述的激发植物功能为提高植物抗病性。

进一步的，所述的激发植物功能为提高植物抗盐碱胁迫。

进一步的，所述的激发植物功能为提高植物抗干旱能力。

进一步的，所述的激发植物功能为提高植物耐低温能力。

进一步的，所述的激发植物功能为促进植物生长。

首先对枯草芽孢杆菌BU412的培养液上清进行阴离子交换层析和分子筛纯化，对于分离到的蛋白质组分，检测其对植物的过敏反应。具有过敏反应活性的蛋白质组分进行SDS-PAGE电泳，切取蛋白质条带进行质谱测序。测序结果经数据库比对分析确认蛋白质组分为一功能未知蛋白(GenBank登录号：WP_017418614.1)，命名为蛋白激发子AMEP412。

随后对蛋白激发子AMEP412对植物的激发功能进行了细致的研究，发现该蛋白能够提高植物体内与抗逆相关的蛋白酶活性，促进水稻的生长，提高烟草对病原菌丁香假单胞菌的抗性，提高水稻的耐盐碱胁迫的能力，提高水稻的抗干旱和耐低温能力。

采用上述技术方案的积极效果：本发明发现了一种未知功能的蛋白AMEP412的蛋白激发子功能，包括促进植物生长，提高植物抗病、耐盐碱、抗干旱和耐低温能力，为生物防治工作积累了新的材料。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌BU412上清液的阴离子交换层析图谱，S1、S2、S3和S4：分别为4个洗脱峰；

图2为离子交换洗脱峰S2样品的分子筛纯化图谱，F1、F2、F3分别为3个洗脱峰；

图3为分子筛洗脱峰F2样品的过敏反应活性测试，CK为对照，1为洗脱峰F2；

图4为分子筛洗脱峰F2样品的SDS-PAGE图，M：低蛋白质分子量Marker，1：分子筛洗脱峰F2，B1：分子筛洗脱峰F2中的目的蛋白质条带；

图5为蛋白质条带B1进行Maldi-TOF质谱测序分析得到的质谱图；

图6为AMEP412重组蛋白纯化样品的SDS-PAGE结果，M为蛋白质分子量Marker， 1为诱导表达后的上清液，2为经过亲和纯化的洗脱样品；

图7为AMEP412重组蛋白引起水稻苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性变化。

图8为AMEP412重组蛋白引起水稻过氧化物酶(POD)的活性变化。

图9为AMEP412重组蛋白引起水稻多酚氧化酶(PPO)的活性变化。

图10为AMEP412重组蛋白激发烟草对丁香假单胞菌的抗性，CK为对照，1为重组AMEP412蛋白。

具体实施方式

以下通过实施例和试验例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的范围。

本发明中生物材料的来源：

1、本发明所涉及的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BU412，于2016年3月30日在中国专利局或国际专利组织承认的保藏中心进行了专利程序保藏，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称为 CCTCC，保藏单位地址：中国. 武汉. 武汉大学，保藏编号：CCTCCM 2016142；

2、所用的丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.3070。

实施例1

枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白的分离纯化与质谱鉴定。

将枯草芽孢杆菌BU412接种至YME液体培养基(麦芽糖10g/L、酵母浸粉4g/L、葡萄糖4g/L、pH 7.5)进行过夜培养，12000g离心收集上清，经过0.22μm的滤膜过滤，使用AKTA蛋白纯化仪进行阴离子交换层析，使用的纯化柱为GE公司的Q hp阴离子交换柱(柱体积为5mL)。使用20mM的Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液上样并平衡，以0.5M NaCl，20mM Tris-HCl缓冲液进行0-100％的线性梯度洗脱，根据吸收峰收集蛋白组分S1-S4(图1)。取蛋白组分S2，使用3kDa截留孔径的超滤管进行浓缩，经 AKTA蛋白纯化仪进行分子筛纯化，所使用的纯化柱为superdex-75分子筛纯化柱(柱体积为24mL)。使用20mM的Tris-HCl(pH7.5)缓冲液进行平衡和洗脱，根据吸收峰收集蛋白组分F1-F3(图2)，取组分F2测定其激发植物过敏反应的活性(图3)，并进行SDS-PAGE电泳检测(图4)。

切取图4中的蛋白条带B1，将胶条送交上海中科新生命生物科技有限公司进行Maldi-TOF质谱测序(图5)，经Mascot软件搜索NCBI数据库，发现该蛋白条带属于一个功能未知的蛋白(GenBank登录号为WP_017418614.1)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。由于该蛋白未经命名，我们将其命名为蛋白激发子AMEP412。

实施例2

蛋白激发子AMEP412的原核表达与分离纯化。

将AMEP412(GenBank登录号为WP_017418614.1)的基因序列交由北京华大基因生物有限公司进行全基因合成，并亚克隆到pET32a载体上，转化BL21(DE3)感受态细胞，获得阳性克隆。经IPTG诱导进行原核重组表达，收集菌体，超声破碎后的上清液使用Ni-NTA纯化柱进行亲和纯化，洗脱样品进行SDS-PAGE检测重组目标蛋白(图6)。结果显示，成功获得了蛋白激发子AMEP412的原核重组蛋白。

试验例1

激发子AMEP412对烟草体内防御性蛋白酶活性的影响。

将纯化后的蛋白激发子AMEP412样品(50μg/mL)涂抹至烟草叶片上，重复9个叶片，以20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)为CK。处理后0、6、12、24、48、72、120、 168h分别取叶片用于防御相关酶活性的测定。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定：取叶片0.1g，放入研钵中，加入少许石英砂和4mL 0.1M硼酸缓冲液(pH 8.8，含5mM巯基乙醇)，研磨成匀浆。4℃下10000g离心 15min，上清液用于酶活性的检测。取酶液0.5mL、L-苯丙氨酸(0.02M)1mL、蒸馏水2.5mL，混匀后40℃下反应1h，加入0.2mL 6M HCl终止反应，用紫外分光光度计测OD₂₉₀值，以每克鲜组织每分钟OD₂₉₀值变化0.01为一个酶活性单位(U)。从结果来看，蛋白激发子AMEP412对烟草叶片PAL活性有明显影响(图7)，处理后0～168 小时酶活变化曲线显示，CK变化平缓，而蛋白激发子AMEP412处理的曲线起伏比较大，0～24小时PAL活性逐渐升高，至24小时达最高，较对照增加46.84％，以后又逐渐下降，至72小时又开始上升，168小时比对照增加21.92％。说明蛋白激发子 AMEP412能够提高烟草叶片PAL活性。

过氧化物酶(POD)活性测定：取叶片0.1g，放入研钵中，加入少许蒸馏水和石英砂，研磨成匀浆，用蒸馏水定容至10mL。4℃下4000g离心15min，上清液保存于冰箱，用于酶活性的检测。取酶液1mL、0.2M醋酸缓冲液(pH 5.0)1mL、0.1％邻甲氧基苯酚1mL，摇匀后，于30℃下反应5min，加入0.08％H₂O₂溶液1mL，反应到2min 时用紫外分光光度计测OD₄₇₀值，以每克鲜组织每分钟OD₄₇₀值变化0.01为一个酶活性单位(U)。从结果来看，蛋白激发子AMEP412对烟草叶片POD活性有显著影响(图 8)，处理后0～168小时酶活变化曲线显示，CK变化平缓，而蛋白激发子AMEP412 处理的曲线变化较大，0～72小时POD活性逐渐升高，在处理72小时出现活性高峰，较对照增加109.5％，以后逐渐下降。说明蛋白激发子AMEP412能够提高烟草叶片过氧化物酶活性。

多酚氧化酶(PPO)活性测定：酶液提取同POD。取酶液1mL、加0.02mol/L邻苯二酚溶液1.5mL、0.05mol/L磷酸缓冲液(pH 6.8)1.5mL，于30℃下反应2min，用紫外分光光度计测OD₃₉₈值，以每克鲜组织每分钟OD₃₉₈值变化0.01为一个酶活性单位 (U)。蛋白激发子AMEP412对烟草叶片PPO活性有明显影响(图9)，处理后0～ 168小时酶活变化曲线显示，CK变化平缓，而蛋白激发子AMEP412处理的曲线起伏较大，在72小时出现峰值，比对照增加111.0％。表明蛋白激发子AMEP412能够提高烟草叶片多酚氧化酶活性。

试验例2

蛋白激发子AMEP412促进水稻生长的作用。

取健康饱满的水稻种子，消毒后置于铺有滤纸的培养皿中，然后加入60g石英砂，适时补水，每组20粒水稻种子。水稻生长14天时使用蛋白激发子AMEP412样品 (50μg/mL)涂抹至水稻叶片，以Tris缓冲液(20mM Tris，pH 7.5)为对照。处理2 周后统计水稻株高和鲜重。由结果可见(表1)，经过蛋白激发子AMEP412处理的水稻植株株高和鲜重均明显高于CK处理组，其中株高提升了22.2％，达到极显著差异 (p<0.01)，鲜重提升了17.6％，达到显著差异(p<0.05)。这说明蛋白激发子AMEP412 能够促进水稻生长。

表1蛋白激发子AMEP412促进水稻生长的结果

试验例3

蛋白激发子AMEP412促进烟草抗病的作用。

将纯化后的蛋白激发子AMEP412样品(50μg/mL)涂抹至烟草叶片上，重复三个叶片，以Tris缓冲液(20mM Tris，pH 7.5)为对照。处理1天后接种病原菌。丁香假单胞菌在LLB培养基(蛋白胨10/L、酵母粉5g/L、NaCl 0.5g/L，pH 7.2)中培养至 OD₆₀₀为0.5，使用蒸馏水稀释100倍，使用1mL无针头注射器在烟草背面进行注射接种。接种后三天观察病斑形成情况。从图10中可以看出，经过AMEP412处理的烟草叶片上病斑面积明显减小，且发病程度也轻于对照，说明AMEP412能够激发烟草对丁香假单胞菌的抗性。

试验例4

蛋白激发子AMEP412促进水稻耐盐碱胁迫的作用。

取健康饱满的水稻种子，消毒后置于铺有滤纸的培养皿中，然后加入60g石英砂，适时补水，每组20粒水稻种子。水稻生长14天时使用蛋白激发子AMEP412样品 (50μg/mL)涂抹至水稻叶片，以Tris缓冲液(20mM Tris，pH 7.5)为对照，加入15mM 的NaHCO₃(pH 8.5)进行盐碱胁迫，7天后观察植株萎蔫程度，统计植株存活率。结果发现CK组的植株存活率为5％，AMEP412处理组的植株存活率为81.66％(表2)，达到极显著差异，表明AMEP412能够提升水稻耐盐碱胁迫的能力。

表2蛋白激发子AMEP412提高水稻耐盐碱胁迫能力的结果

试验例5

蛋白激发子AMEP412促进水稻抗干旱的作用。

取健康饱满的水稻种子，消毒后置于铺有滤纸的培养皿中，然后加入60g石英砂，适时补水，每组20粒水稻种子。水稻生长14天时使用蛋白激发子AMEP412样品 (50μg/mL)涂抹至水稻叶片，以Tris缓冲液(20mM Tris，pH 7.5)为对照，停止补水，进行干旱胁迫，当70％植株萎蔫，叶片卷成针状时，复水，再次干旱胁迫后，再复水，一天后统计幼苗存活率和叶片抗衰度。计算幼苗抗旱综合系数。各处理均重复3 次。

叶片抗衰度(％)＝(叶片绿色段长/叶片全长)×100

幼苗抗旱综合系数＝(苗存活率+叶片抗衰度)/2

对水稻进行干旱胁迫后，对照组的水稻大部分萎蔫时，而蛋白激发子AMEP412 处理组的水稻生长良好，仍保持直立状态。干旱复水后，蛋白激发子AMEP412处理的水稻幼苗存活率比对照提高20.86％，叶片抗衰度提高20.23％，幼苗抗旱综合系数从 36.53提高到57.08，均达到极显著差异(p<0.01)(表3)。说明蛋白激发子AMEP412 激发了水稻抗旱性的提升。

表3蛋白激发子AMEP412提高水稻抗旱性的结果

试验例6

蛋白激发子AMEP412促进水稻耐低温的作用。

取健康饱满的水稻种子，消毒后置于铺有滤纸的培养皿中，然后加入60g石英砂，适时补水，每组20粒水稻种子。水稻生长14天时使用蛋白激发子AMEP412样品 (50μg/mL)涂抹至水稻叶片，以Tris缓冲液(20mM Tris，pH 7.5)为对照，转移至低温培养箱(16℃)中进行生长，1周后统计植株株高和鲜重。由结果可以看出(表4)，经过蛋白激发子AMEP412处理的水稻植株在低温条件下生长明显优于CK，株高提升了43.6％，鲜重提升了91.9％，均极显著差异(p<0.01)，说明蛋白激发子AMEP412 能够提高水稻在低温下的耐低温能力。

表4蛋白激发子AMEP412提高水稻耐低温能力的结果

本发明发现了一种未知功能的蛋白AMEP412的蛋白激发子活性，并进一步确认了该蛋白对植物的激发功能，包括促进植物生长，提高植物抗病、耐盐碱、抗干旱和耐低温能力，为生物防治工作积累了新的材料。

序列表

<110> 黑龙江八一农垦大学

<120> 一种枯草芽孢杆菌蛋白激发子AMEP412及其功能

<130> B005

<141> 2018-08-14

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 76

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 1

Met Phe Gly Pro Ile Leu Lys Ala Leu Lys Ala Leu Val Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Trp Gly Lys Val Ala Ser Phe Leu Lys Trp Ala Gly Asn Leu Ala

20 25 30

Ala Ala Ala Ala Lys Tyr Ser Tyr Thr Ser Gly Lys Lys Ile Leu Ala

35 40 45

Tyr Ile Gln Lys His Pro Gly Lys Ile Val Asp Trp Phe Leu Lys Gly

50 55 60

Tyr Ser Val Tyr Asp Val Ile Lys Met Ile Leu Gly

65 70 75

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌蛋白激发子AMEP412，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌蛋白激发子AMEP412在激发植物功能中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的激发植物功能为提高植物抗病性。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的激发植物功能为提高植物抗盐碱胁迫。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的激发植物功能为提高植物抗干旱能力。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的激发植物功能为提高植物耐低温能力。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的激发植物功能为促进植物生长。