CN113788882A - 一种枯草芽孢杆菌amep412蛋白在抑制肿瘤细胞增殖中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412在抑制肿瘤细胞增殖中的应用，所述的肿瘤细胞为肝癌细胞、子宫颈癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、子宫鳞状细胞癌细胞、胃腺癌细胞、恶性胶质母细胞瘤细胞、乳腺癌细胞中的任意一种。本发明发现了AMEP412蛋白对肿瘤细胞的抑制功能；该蛋白能够对10种肿瘤细胞产生抑制作用，且对不同种类的肿瘤细胞抑制效果具有选择特异性，其中，以针对乳腺癌细胞效果最好；转录组学研究发现AMEP412蛋白能够引起肿瘤细胞内部多条与细胞凋亡和死亡相关的通路的变化，本发明为肿瘤细胞活性的抑制积累了新的材料。

Description

一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白在抑制肿瘤细胞增殖中的 应用

技术领域

本发明属于生物与医药领域，涉及一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白在抑制肿瘤细胞增殖中的应用。

背景技术

从 21 世纪开始，肿瘤成为人类健康的严重威胁，同时也成为影响公共卫生的世界性难题。在中国，人口老龄化、环境变化以及生活方式的改变等因素导致我国恶性肿瘤发病率呈逐年上升趋势。目前，传统的肿瘤治疗方法主要有手术切除、化疗和放疗等。其中，化学疗法是通过化学合成或分离的药物抑杀肿瘤细胞的一种方法，在肿瘤治疗中发挥着重要作用。然而传统化疗药物存在水溶性差、肿瘤选择性差、副作用强以及易出现耐药等问题，从而降低了临床治疗效果。开发高效低毒的新型抗肿瘤药物对于肿瘤的临床治疗十分必要。

在如今分子生物学、生物化学等学科迅猛发展的背景下，肿瘤靶向药物的研发受到越来越多的关注。各种分子靶点的发现对研究肿瘤的生长、增殖、血管生成和转移具有重要意义，而开发特异性肿瘤靶点诊断和治疗药物一直是研究者的主要目标。与正常细胞相比，一些受体会在肿瘤细胞高表达。利用这种差异，将抗肿瘤药物靶向递送到肿瘤组织和细胞可以提高药物的治疗效果、降低药物的毒副作用，这已成为肿瘤靶向治疗的重要方向。

在抗肿瘤药物开发中，短肽和单克隆抗体在药物的肿瘤靶向运输中被广泛应用。单克隆抗体在肿瘤组织扩散速度慢、药物偶联方法较复杂、纯化以及表征难度高等缺点。与抗体蛋白相比，多肽分子更容易进行合成和结构优化，易于表征及与药物连接，并且具有良好的肿瘤组织穿透能力等优点；它们的空间结构不受限制且允许开发具有可变结构的靶向肽，具有良好的肿瘤治疗应用前景。

在之前的研究中，我们从枯草芽孢杆菌BU412中分离鉴定了AMEP412蛋白，具有抗菌肽的生物活性，并能提高植物的免疫力，刺激植物生长。在本发明中，我们旨在提供AMEP412蛋白在抑制肿瘤细胞增殖方面的新用途。

发明内容

本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412的新功能，主要涉及该蛋白对肿瘤细胞增殖的抑制功能。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412在抑制肿瘤细胞增殖中的应用。

进一步的，上述的肿瘤细胞为肝癌细胞、子宫颈癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、子宫鳞状细胞癌细胞、胃腺癌细胞、恶性胶质母细胞瘤细胞、乳腺癌细胞中的任意一种。

进一步的，上述的肿瘤细胞为子宫鳞状细胞癌细胞、胃腺癌细胞、恶性胶质母细胞瘤细胞、乳腺癌细胞中的任意一种。

进一步的，上述的肿瘤细胞为乳腺癌细胞。

具体的，所述的AMEP412蛋白对人肝癌细胞 HepG2的IC50值为136.70μg/mL，对人子宫颈癌细胞HeLa的IC50值为122.70μg/mL，对人转移胰腺癌细胞ASPC-3的IC50值为118.90μg/mL，对人结肠癌细胞HT29的IC50值为85.69μg/mL，对人前列腺癌细胞PC-3的IC50值为82.00μg/mL，对人肺癌细胞A549的IC50值为79.42μg/mL，对人子宫鳞状细胞癌细胞SiHa的IC50值为63.77μg/mL，对人胃腺癌细胞BGC-823的IC50值为61.33μg/mL，对恶性胶质母细胞瘤细胞U87MG的IC50值为58.37μg/mL，对小鼠乳腺癌细胞4T1.2的IC50值为48.79μg/mL。

进一步的，所述的AMEP412蛋白对肿瘤细胞的抑制主要通过细胞凋亡和死亡相关的信号通路：TNF signaling pathway、IL-17 signaling pathway、Fanconi anemiapathway、Legionellosis、NF-kappa B signaling pathway、Rheumatoid arthritis、Homologous recombination。

首先使用不同浓度梯度的AMEP412蛋白对多种肿瘤细胞进行IC50值测定，采用方法为CCK8法。在确定AMEP412蛋白具有积极抑制效果的肿瘤细胞后，通过转录组学法测定蛋白处理肿瘤细胞后，细胞内部的信号通路变化。

采用上述技术方案的积极效果：本发明发现了AMEP412蛋白对肿瘤细胞的抑制功能；该蛋白能够对10种肿瘤细胞产生抑制作用，且对不同种类的肿瘤细胞抑制效果具有选择特异性，其中，以针对乳腺癌细胞效果最好；转录组学研究发现AMEP412蛋白能够引起肿瘤细胞内部多条与细胞凋亡和死亡相关的通路的变化，本发明为肿瘤细胞活性的抑制积累了新的材料。

附图说明

图1为不同浓度AMEP412蛋白作用于HepG2细胞的形态图；

图2为不同浓度AMEP412蛋白作用于HepG2的细胞活力曲线图；

图3为不同浓度AMEP412蛋白作用于Hela细胞的形态图；

图4为不同浓度AMEP412蛋白作用于HeLa细胞活力曲线图；

图5为不同浓度AMEP412蛋白作用于ASPC-3细胞的形态图；

图6为不同浓度AMEP412蛋白作用于ASPC-3细胞活力曲线图；

图7为不同浓度AMEP412蛋白作用于HT29细胞的形态图；

图8为不同浓度AMEP412蛋白作用于HT29细胞的活力曲线图；

图9为不同浓度AMEP412蛋白作用于PC-3细胞的形态图；

图10为不同浓度AMEP412蛋白作用于PC-3细胞的活力曲线图；

图11为不同浓度AMEP412蛋白作用于A549细胞形态图；

图12为不同浓度AMEP412蛋白作用于A549细胞的活力曲线图；

图13为不同浓度AMEP412蛋白作用于 SiHa细胞的形态图；

图14为不同浓度AMEP412蛋白作用于SiHa细胞的活力曲线图；

图15为不同浓度AMEP412蛋白作用于BGC-823细胞的形态图；

图16不同浓度AMEP412蛋白作用于 BGC-823细胞的活力曲线图；

图17为不同浓度AMEP412蛋白作用于U87MG的细胞的形态图；

图18为不同浓度AMEP412蛋白作用于U87MG细胞的活力曲线图；

图19为不同浓度AMEP412蛋白作用于4T1.2细胞的镜下图形态图；

图20为不同浓度AMEP412蛋白作用于4T1.2细胞的活力曲线图；

图21为AMEP412蛋白作用于 10 种肿瘤细胞 IC50 汇总图；

图22为欧式距离聚类热图；

图23为主成分分析PCA图；

图24为差异基因MA图；

图25为差异基因火山图；

图26为KEGG条目柱状图。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的范围。

本发明中生物材料的来源：

1、所用的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BU412于2016年3月30日在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC M 2016142；

2、正常人肝细胞 HL-7702、前列腺上皮细胞WPMY-1、人肝癌细胞 HepG2、人子宫颈癌细胞HeLa、人转移胰腺癌细胞ASPC-3、人结肠癌细胞HT29、人前列腺癌细胞PC-3、人肺癌细胞A549、人子宫鳞状细胞癌细胞SiHa、人胃腺癌细胞BGC-823、恶性胶质母细胞瘤细胞U87MG、小鼠乳腺癌细胞4T1.2均购自北京端点医药研究开发有限公司。

实施例1

枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白对肿瘤细胞活性的抑制。

方法：

（一）细胞复苏：佩戴无菌手套，从液氮罐中取出细胞冻存管。迅速放入37℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。加入5mL的1640培养液后接种于培养瓶中，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。

（二）细胞传代：细胞融合至90%时，弃25cm²培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞两次；添加 0.25%胰蛋白酶消化液1.5ml，放于37℃培养箱孵育一定时间，待细胞回缩变圆后加入完全培养基终止消化。用移液器轻轻吹打细胞使之脱落，将细胞悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；弃上清，用新鲜培养基 重悬细胞沉淀，根据细胞增殖速度调整细胞比例为1:2-1:4区间进行传代。细胞两天换液一次。每次观察填写相应实验记录，实行单株细胞单独记录原则。

（三）细胞铺板：获取一定量的细胞沉淀用完全培养基重悬，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，每孔100uL，每个浓度梯度8个复孔铺设在96孔板中。

（四）细胞加药：24小时后更换蛋白溶液，实验前AMEP412蛋白溶液用细胞对应的基础培养基稀释，稀释梯度为200μg/mL，150μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、基础培养基孔，加药24小时后观察细胞状态，拍摄各蛋白浓度下细胞生长图片，后用CCK8检测细胞活力。

（五）细胞活力测定：用细胞所用基础培养基配置10%的CCK8检测液，用HBSS清洗96孔板后，在吸水纸上拍干孔板中残留液体，避光条件下每孔加入100uL的CCK8检测液，并设置校准孔，操作结束后放入避光培养箱中，37℃孵育。根据细胞密度间隔30min或1h在酶标仪下检测一次OD值，基础培养基组OD值达到0.7-1.0的范围内，停止检测。获取OD值后计算出各浓度梯度下细胞活力百分比。

（六）数据统计：总体计量数据以均值和标准差表示，利用 GraphPad Prism 8进行作图及 IC50 值的计算。

结果：

（一）肿瘤细胞活力测定结果

各肿瘤细胞在不同浓度AMEP412蛋白作用下， 细胞活力如表1 所示，该蛋白对各肿瘤细胞均显示出较好的抑制作用，其 IC50值越低，说明抗肿瘤药效越强。

表1 肿瘤细胞在不同蛋白浓度下的细胞活力和 IC50 值汇总表

（二）各肿瘤细胞在不同浓度梯度下的细胞形态图

（1）人肝癌细胞 HepG2 细胞：AMEP412蛋白作用于HepG2的镜下图（1）及各浓度下细胞存活率折线图（2）如下所示：HepG2细胞的融合性较高，在镜下主要呈片状分布，当药物浓度为200μg/mL、150μg/mL、100μg/mL时，药物对细胞的抑制效果较为明显，细胞间的融合现象被明显抑制，随着浓度的增高细胞会呈现收缩破碎的现象。

（2）人子宫颈癌细胞HeLa细胞：AMEP412蛋白作用于Hela细胞的镜下图（图3）及各浓度下细胞存活率折线图（图4）如下所示：HeLa细胞的增殖碎度较快，细胞成圆形随着药物浓度的增加，细胞会逐渐变圆脱落。当药物浓度为150μg/mL、100μg/mL、75μg/mL、50μg/mL时，药物对细胞的抑制效果较为明显。

（3）人转移胰腺癌ASPC-3细胞：不同浓度AMEP412蛋白作用于ASPC-3细胞的镜下图（图5）及各浓度下细胞存活率折线图（图6）如下所示：ASPC-3细胞增殖较慢，在镜下主要呈多边性，随着药物浓度的增高，细胞会收缩变圆，但当药物浓度为150μg/mL、100μg/mL、75μg/mL、50μg/mL时细胞镜下形态整体变化不明显，但细胞活性测定结果显示出一定的抑制性。

（4）人结肠癌细胞HT29细胞：AMEP412蛋白作用于HT29细胞的镜下图（图7）及各浓度下细胞存活率折线图（图8）如下所示：HT29细胞增殖较慢，但其融合性较高，当细胞到达一定数量时在显微镜下会观察到其成片状分布，但随着药物浓度的增加，这种细胞间的融合现象被明显抑制，当药物浓度为200μg/mL、150μg/mL时细胞收缩变圆的现象会非常明显，破碎细胞占据较大比例。

（5）人前列腺癌细胞PC-3细胞：AMEP412蛋白作用于PC-2细胞的镜下图（图9）及各浓度下细胞存活率折线图（图10）如下所示：随着药物浓度的增加部分PC-3细胞会收缩变圆，当药物浓度为200μg/mL、150μg/mL时，显微镜下细胞破碎现象比较明显，说明药物对PC-3 细胞有明显的抑制作用。

（6）人肺癌细胞A549细胞：AMEP412蛋白作用于A549细胞的镜下图（图11）及各浓度下细胞存活率折线图 （图12）如下所示：A549增殖较快，显微镜下主要呈长梭形，均匀分布，该细胞随着受试药物浓度的增加，会出现细胞收缩变圆的现象，镜下结果表明受试药物对A549细胞的抑制效果主要体现在抑制其增殖。

（7）人子宫鳞状癌细胞 SiHa 细胞： AMEP412蛋白作用于SiHa细胞的镜下图（图13）及各浓度下细胞存活率折线图（图14）如下所示：SiHa细胞随着细胞增殖细胞间的融合度较高，会呈现片状分布，但随着药物浓度的升高细胞会缩小变圆，当受试药物浓度为200μg/mL、150μg/mL、100μg/mL 时细胞破碎现象比较明显，说明药物对细胞具有明显的抑制作用。

（8）人胃腺癌细胞BCG-823细胞：AMEP412蛋白作用于BCG-823细胞的镜下图（图15）及各浓度下细胞存活率折线图（图16）如下所示：BCG-823细胞的增殖速度较快，但随着药物浓度的增加，细胞会收缩变圆甚至死亡，出现对细胞的抑制作用。

（9）人恶性胶质瘤母细胞瘤细胞U87MG细胞：AMEP412蛋白作用于U87MG细胞的镜下图（图17）及各浓度下细胞存活率折线图（图18）如下所示：当受试药物浓度为200μg/mL、150μg/mL、100μg/mL时，镜下细胞多数为细胞碎片，U87细胞属于相互依赖性生长的细胞，但加入受试药物后细胞相互依赖连接现象随药物浓度增加而降低，高浓度会致使细胞大面积破碎，说明药物对该细胞有明显的抑制作用。

（10）小鼠乳腺癌细胞4T1.2细胞：AMEP412蛋白作用于4T1.2细胞的镜下图（图19）及各浓度下细胞存活率折线图（图20）如下所示：当受试药物浓度为 200μg/mL、150μg/mL、100μg/mL时，镜下细胞呈现明显的破碎现象，多数为细胞碎片，药物对该细胞的抑制作用显著。

总之，从IC50值可见，AMEP412蛋白对乳腺癌细胞4T1.2抑制效果最佳，其次是脑胶质瘤U87MG、胃癌BGC-823以及人子宫鳞状癌SiHa细胞，建议后期研究时更加关注这类癌种。（图21）。

实施例2

AMEP412蛋白作用于乳腺癌细胞4T1.2的转录组学分析。

（一）细胞样品制备

复苏 4T1.2 细胞，进行扩增培养。当细胞达到一定量时，进行传代，用 PBS清洗细胞两次；添加 0.25%胰蛋白酶消化液消化，放于 37℃培养箱孵育一定时间，待细胞回缩变圆后加入完全培养基终止消化。用移液器轻轻吹打细胞使之脱落，将细胞悬液转移至 15ml离心管中， 1000rpm 离心 5min；弃上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀，调整细胞浓度，制备复数批量样本，随机分为对照组和给药组。24 小时细胞贴壁后给药组更换为含 50ug/mLAMEP412蛋白的培养基，对照组更换为原始培养基，待细胞收缩时，收集各组细胞样品。

（二）测序样品制备

将收集到的各组细胞样品沉淀用 Trizol混悬、吹打，待细胞完全破裂后，每组制备三个样品并做好标记，放置于-20℃用于测序样品送检。

（三）转录组结果分析

（1）样本间相关性

生物学重复通常是所有生物学实验所必须的，目前主流期刊基本都会要求有生物学重复。生物学重复主要具有证明实验操作是可重复的与保证下游分析结果是可靠的两种作用。样本间的基因表达水平相关性是检验实验或样本选择可靠性的重要指标。

我们使用欧式距离来分组度量样本之间的相关性并绘制样本层次聚类热图（图22）。实验组和对照组分别聚在一起。这说明两组之间表达谱差异较大，而组内差异较小。图中颜色深浅代表样本之间基因表达模式的差异，颜色越浅代表样本之间的表达模式差异越大，颜色越深代表样本之间表达模式差异越小。聚类树代表样本之间的相似性，相似性越高的样本倾向于聚类在一起。

（2）主成分分析

主成分分析（Principal Components Analysis, PCA）也常用于评估组间差异及组内样本重复情况，PCA采用线性降维的方法，对数以万计的基因变量进行降维并提取主成分，从而可以很好的反映样本之间的关系^[22-25]。我们对所有样本的基因表达值进行PCA分析，并使用第1，2主成分绘制PCA图。理想条件下，组内重复应更为相似，在图中会聚在一起，而组间的样本的样本相似度不如组内那么高，倾向于不聚在一起（图23）。图中横坐标为第一主成分，纵坐标为第二主成分，每个点为各样本在第1、2主成分中的坐标。不同颜色代表不同的分组。百分比代表该主成分能够解释原始数据信息的比例。

（3）差异基因/转录本统计

我们使用MA图和火山图来直观展示每个组合比较的差异基因分布情况，从而展示了基因丰度、变化幅度与统计显著性之间的关系。

一般来说，丰度较大，变化明显且显著性较高的基因可以作为后续分析与实验研究的靶点。MA图展示的是利用两组归一化后表达量的均值和差异倍数之间的关系，靠近右下和左上的基因即为丰度较高且变化幅度较大的基因（图24）。图中横坐标为归一化后表达量的均值，纵坐标为差异倍数(log2FC)，红色和蓝色分别代表显著上调和显著下调的基因，灰色为不显著变化基因。标签标注的点为显著变化排名前20的基因名称。火山图展示的是差异倍数与padj值之间的关系，靠近左上角和右上角的基因即为统计显著性较强且变化幅度较大的基因（图25）。图中横坐标为差异倍数(log2FC)，纵坐标为显著性（-log10padj），红色和蓝色分别代表显著上调和显著下调的基因，灰色为不显著变化基因。标签标注的点为显著变化排名前20的基因名称。

（4）KEGG富集分析

经KEGG富集分析，主要有以下通路：TNF signaling pathway、IL-17 signalingpathway、Fanconi anemia pathway、Legionellosis、NF-kappa B signaling pathway、Rheumatoid arthritis、Homologous recombination。（图26）以上通路都是肿瘤细胞凋亡或者坏死的相关通路，这些结果在转录水平上支持了AMEP412蛋白对4T1.2 细胞的抑制活性。

实施例3

AMEP412蛋白对正常细胞的毒性实验。

为了检测AMEP412蛋白对正常细胞是否具有毒性，采用实施例1中的方法，对正常人肝细胞 HL-7702和前列腺上皮细胞WPMY-1进行了IC50值的测定，采用方法为CCK8法。结果发现，HL-7702的IC50值为312μg/mL，而WPMY-1的IC50值为357μg/mL，均显著高于各个肿瘤细胞，说明适当浓度的AMEP412蛋白能够在不影响正常细胞活性的情况下对肿瘤细胞的增殖产生抑制作用，具备开发为肿瘤治疗药物的潜力。

本发明发现了AMEP412蛋白对肿瘤细胞的抑制功能；该蛋白能够对10种肿瘤细胞产生抑制作用，且对不同种类的肿瘤细胞抑制效果具有选择特异性，其中，以针对乳腺癌细胞效果最好；转录组学研究发现AMEP412蛋白能够引起肿瘤细胞内部多条与细胞凋亡和死亡相关的通路的变化，本发明为肿瘤细胞活性的抑制积累了新的材料。

序列表

<110> 黑龙江八一农垦大学

<120> 一种枯草芽孢杆菌AMEP412蛋白在抑制肿瘤细胞增殖中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 76

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 1

Met Phe Gly Pro Ile Leu Lys Ala Leu Lys Ala Leu Val Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Trp Gly Lys Val Ala Ser Phe Leu Lys Trp Ala Gly Asn Leu Ala

20 25 30

Ala Ala Ala Ala Lys Tyr Ser Tyr Thr Ser Gly Lys Lys Ile Leu Ala

35 40 45

Tyr Ile Gln Lys His Pro Gly Lys Ile Val Asp Trp Phe Leu Lys Gly

50 55 60

Tyr Ser Val Tyr Asp Val Ile Lys Met Ile Leu Gly

65 70 75

Claims (4)

1.一种氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的枯草芽孢杆菌蛋白AMEP412在抑制肿瘤细胞增殖中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，所述的肿瘤细胞为肝癌细胞、子宫颈癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、子宫鳞状细胞癌细胞、胃腺癌细胞、恶性胶质母细胞瘤细胞、乳腺癌细胞中的任意一种。

3.根据权利要求2所述的应用，所述的肿瘤细胞为子宫鳞状细胞癌细胞、胃腺癌细胞、恶性胶质母细胞瘤细胞、乳腺癌细胞中的任意一种。

4.根据权利要求3所述的应用，所述的肿瘤细胞为乳腺癌细胞。

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