CN115960762B

CN115960762B - 一种极端东方假单胞菌及其应用

Info

Publication number: CN115960762B
Application number: CN202211291890.7A
Authority: CN
Inventors: 严丹侃; 王芳; 陈莹; 马超; 韩科雷; 胡淑珍; 李婷
Original assignee: Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality Safety of AAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality Safety of AAAS
Priority date: 2022-10-20
Filing date: 2022-10-20
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2042-10-20
Also published as: CN115960762A

Abstract

本发明属于微生物生物防治技术领域，本发明涉及微生物生物防治领域，具体的涉及一种具有烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）防治作用的新菌种极端东方假单胞菌，及其应用。本发明获得极端东方假单胞菌AV3已在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）登记保藏，保藏日期为2022年09月15日；保藏编号为CCTCC NO：M20221439，其对于TMV的平均抑制率达到了77%，筛选天然微生物拮抗菌防治烟草病毒病符合国家绿色防控发展需求，减少化学农药对土壤及环境的污染，避免植物病原菌产生抗药性。

Description

一种极端东方假单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物生物防治领域，具体的涉及一种具有烟草花叶病毒(Tobaccomosaic virus，TMV)防治作用的新菌种极端东方假单胞菌，及其应用。

背景技术

烟草花叶病毒病是由于烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)引起的一种毁灭性烟草病害，该病毒极其稳定，可在病叶内能大量地增殖，病毒粒子是长300nm、直径15nm 的棒状体，有一条分子量为2×10⁶道尔顿的单链RNA。TMV作为病原体的寄主范围是很广的，现已知对单子叶植物22科中的198种植物具有寄生性。该病毒主要通过机械摩擦传播，存活在土壤中的病毒可以经烟草根部的微伤口侵染烟草，而田间农事操作过于频繁也利于病毒的传播，从而加重危害。TMV会导致烟草叶片表现花叶症状，严重影响烟叶的品质，对烟草生产具有重大威胁，由烟草病毒病造成的经济损失已超过真菌引起的病害，成为烟草生产上威胁最大的一类病害。烟草花叶病毒在细胞内专性寄生，烟株一旦感染，生产上尚无有效的药剂进行控制。

长期以来，人类使用大量的有机和无机农药进行病虫害的控制，但是这些农药的使用一方面带来了病虫害的抗性增强，同时也带来了严重的环境污染以及生态平衡的破坏。而微生物源农药具有资源丰富、成本低、不会带来环境污染以及生态破坏的优势，是公认的无公害农药。近年来已经有一些微生物农药投入使用并且取得了比较好的效果，也有研究表明，微生物农药对于植物病毒也有作用，为包括TMV的防治带来了新的思路和手段，曹毅等人通过对47株放线菌进行筛选获得了对TMV有50％-70％抑制活性的链霉菌(江苏农业科学2014年第42卷第4期)；郭丛等人从TMV重病区中未发病的K326烟株根际土壤中筛选出对TMV 具有高度拮抗活性菌株A3，用半叶法接种，对TMV的抑制效果可达95％以上经生理生化以及16S rDNA鉴定为恶臭假单胞菌(华南农业大学学报，第32卷第3期，2011年7月)。CN202210796104.2公开了供一株具有防治烟草花叶病毒效果的海洋真菌菌株，为丛毛状曲霉 MFS2119菌株，其保藏编号为CGMCC NO.40163，利用局部枯斑法测定其发酵上清液对TMV的抑制率为95％；发酵粗提物对TMV的抑制率为74.74％；同时，MFS2119菌株发酵液粗提物对烟蚜也表现出一定的生物活性。然而，进一步的筛选更多可以抑制TMV的菌株对于TMV的防治以及发展绿色农药仍然具有重要的意义。

技术方案

为发展防治TMV的微生物防治农药，本发明通过大量的筛选工作，筛选到了一种对TMV 具有较强抑制作用的新菌种，基于此，本发明提出如下技术方案：

一种极端东方假单胞菌，极端东方假单胞菌的16SrDNA与SEQ ID No.1至少具有99.77％一致性的序列。

本发明的一个方面，本发明提供的极端东方假单胞菌，其16SrDNA与SEQ ID No.1至少具有99.8％，99.9％，100％的一致性。

本发明的一个方面，本发明提供的极端东方假单胞菌，其16SrDNA与SEQ ID No.1至少具有16sRNA与SEQ ID No.1具有99.8％-100％一致性；

一种极端东方假单胞菌，其特征在于，所述极端东方假单胞菌的gyrB基因与SEQID No.2 至少具有96.66％一致性的序列。

本发明的一个方面，本发明提供的极端东方假单胞菌，其gyrB基因与SEQ ID No.2至少具有97％，98％，99％，100％的一致性。

本发明的一个方面，本发明提供的极端东方假单胞菌，其至少具有gyrB基因与SEQID No.2具有97％-100％一致性。

本发明的一个方面，本发明提供给了一种极端东方假单胞菌，所述极端东方假单胞菌菌株为AV3，该菌株已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)登记保藏，保藏日期为2022年09 月15日；保藏编号为CCTCC NO：M20221439。

本发明的一个方面，本发明还提供了本发明所述极端东方假单胞菌在防治烟草花叶病毒中的应用。所述防治的方法可以由多种，包括喷涂、喷洒、与其他肥料或农药共同施用于对象植物。

本发明的一个方面，本发明还提供了一种微生物菌剂，所述菌剂中含有本发明中的极端东方假单胞菌或其代谢产物。本发明中的极端东方假单胞菌可以通过发酵培养放大以收获更多的菌，也可以用发酵液中分离获得发酵上清液，从上清液中获得本发明中的极端东方假单胞菌的代谢产物。代谢产物的分离方法包括但不限于离心，过滤，抽滤，层析，树脂分离等。本发明制备的微生物菌剂可以用于烟草花叶病毒的防治，菌剂也可以根据需求和使用的方便性制备为各种形式，例如液体制剂、冻干粉剂、固体固定剂。液体制剂可以制备成为各种混悬剂、乳液；冻干粉剂是一种常用的微生物农药的制剂形式，其可以较好的保护好微生物的活性；固体制剂则通过吸附、连接等多种形式将微生物或其代谢产物固定在载体上，也能够在一定时间内保持微生物的活性。

本发明的一个方面，本发明还提供了一种极端东方假单胞菌培养基，所述培养基组成为牛肉膏3.0g/L、蔗糖10.0g/L、蛋白胨5.0g/L、酵母提取物1.0g/L，琼脂15.0g/L，pH＝7.1。

本发明的一个方面，本发明还提供了一种极端东方假单胞菌培养物，由本发明所述的菌种发酵培养而成，大量的培养物的制备为微生物农药的制备奠定了基础。

本发明的一个方面，本发明还提供了一种防治烟草花叶病毒的方法，其特征在于，给予感染或可能感染烟草花叶病毒的对象施加本发明所述的菌剂。

有益效果

本发明通过筛选获得了新的可以抑制TMV的菌种，本发明的极端东方假单胞菌对于TMV 的平均抑制率达到了77％，为TMV的防治提供了新的选择和思路，筛选天然微生物拮抗菌防治烟草病毒病符合国家绿色防控发展需求，减少化学农药对土壤及环境的污染，避免植物病原菌产生抗药性。

附图说明

图1本发明筛选得到的极端东方假单胞菌AV3。

图2本发明极端东方假单胞菌AV3与抗病毒常规药剂宁南霉素对TMV的钝化作用，其中 A为拮抗菌株AV3与TMV病毒钝化(叶片左侧)与阴性对照(叶片右侧)；B是宁南霉素与TMV钝化(叶片左侧)与阴性对照(叶片右侧)(图片是烟草背面)。C为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)与TMV病毒钝化(叶片左侧)与阴性对照(叶片右侧)。

本发明极端东方假单胞AV3的活体纯培养已于2022年09月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：武汉市武昌珞珈山)，保藏号：CCTCC NO：M20221439。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。本发明所述技术方案，如未特别说明均为本领域的常规方式，所述试剂或材料，如未特别说明，均为常规试剂，来源于商业渠道。

实施例1

菌种的筛选与鉴定

(1)取样：在已有烟草花叶病发生的烟田中，选取仍然生长健康的烟株，在烟株根部 20厘米深度选取烟株根际土壤，备用；

(2)研磨：将备用的土壤10g置于灭过菌的三角瓶中，加入20ml无菌水，震荡待液体浑浊，室温静止10分钟，备用；

(3)纯化：用无菌枪头吸取静止后的液体上清200微升，在NA培养基(牛肉膏3.0g/L、蔗糖10.0g/L、蛋白胨5.0g/L、酵母提取物1.0g/L，琼脂15.0g/L，pH＝7.1)上采用涂布平板法，28℃培养24h，待分离平皿上菌落长出后，根据微生物菌落的形态、大小、表面结构、边缘结构、质地、光泽、透明度、颜色和产生的可溶性色素等方面特征，用接种环将孤立的单个菌落一一挑出，挑取形态不同的单菌落在相应的空白NA培养基平板上进行划线纯化，并在28℃恒温培养箱中倒置培养24h，得纯化菌株，备用；

(4)筛选：挑选单菌落细菌于已经灭菌的盛有20ml培养基的100ml锥形瓶中，振荡培养(28℃，200r/min)24h，使菌液含量足够大，作发酵备用菌种。选用TMV的枯斑寄主枯斑三生烟(Nicotiana tabacum var.samsun NN)利用半叶法摩擦接种试验：利用枯斑三生烟对 TMV的过敏性坏死反应，采用半叶法测定不同菌株对TMV侵染的抑制率。

(5)鉴定：选取步骤(4)中获得抑制率最高的菌株AV3根据常规的微生物鉴定方法进行生理生化和分子生物学鉴定。经测定，此次筛选得到的菌株AV3菌落呈奶白色，近圆形，突起，边缘整齐，表面光滑湿润，革兰氏染色阴性。利用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Promega，Madison，WI)提取病原菌DNA。16SrDNA基因引物为FD1(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和RD1(AAGGAGGTGATCCAGCC)。利用引物进行PCR扩增，反应体系为50μL(10×PCR buffer 5μL、dNTP 1μL、FD1 2μL、FD2 2μL、Tag酶1μL、模板DNA 2μL、dd H20 37μL)，扩增条件为：94℃5min；94℃30s，55℃1min，72℃90s，30个循环；72℃1min；10℃20min。 PCR产物进行测序，测序结果是SEQ ID No.1：AGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAGAGAGAAGCTTGCTTCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGAACGCTAATACCGCATACGTCC TACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACG GGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTTACCTAATACGTGATTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGG CTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGACTGACTAGAGTATGGTAGAG GGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAAC TAGCCGTTGGAAGCCTTGAGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAACTC，结果于NCBI网站上用BLAST软件进行同源性比对，与Pseudomonas extremorientalis 的16SrDNA基因(Genbank登录号：MT348509.1)相似度达到99.77％，进一步利用gyrB基因P895(TGGGTGTTGAAGTCGCCCTGCAA)；P1213r(TCCAACAGGAAATCGGCGAAGA)。PCR扩增条件：96℃预变性5min；96℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸7min。PCR产物进行测序，测序结果是sEQ ID No.2：CGCGCTCGAAGCTCATCGTGTGAGTTCACCAACATGTCGCGCTTGGGCACCACCTCGTCTTCCTCCACCTGGCTG ATCCAGTTATGGGGCAGGTTGGGGCCGGTGAGGAACAGGCTTTCCGGGTAGAAATTGCCGATGTAGTCACCGATAAACACCTTGCCGGAGCTGGCGACGATCAGGTGCAGCTCGTATTCCTTGTGGAAGTGCCAGCGCACCAGCGGGCAAGGGAAACCGT GTTGGCGATAAATAATGGACAGGCCGTTGTGGTCCTCCATCAGTTCGTACGAAGGGTCGGTGATGCGCGTTGCTCGGGTCATGCTGCCGTCGCTTTATTGTGGTTGCTGCGTAGGATAATGCCCCCTTGCGCACGACCTCGCCAGCGTCGATGTTTATAC GTTGCGGTTTTTTGCCTCGATCCACTGGGACATGTACTGCGTACTTTTGTGGGCATGGTGGCGCATCATGCTGCCGGTGAAGTTATCGCGGCGATGGGCCGAAAGGCGCCCGCGGCACTGCTCCAGGCAGGCCACCAGCGCCAGGCCATGGATGTTCTGG TCATACCGTCTGGCCAGCAGTCGGCGACCGTCCTCCTGGGCCTGGTTCCAGCGTTCACAGTCTTGATACAGGGCCACCGCGGCTGCCGCGAGGGCCGGGGCGCTTTGTTCCACGGCACCGGGCCACGGCTGTTCATCCCCCATGGCCTCGGCACCGATCG GCGTGGTGACGTTTGGCGTGCCGCACAGCATCGCATCCGCCAGCTTGCCCTTGATCCCGGCGCCGAATCGCAAGGGTGCCAGGCAGATGCGCGCCGCGGACATCACTTGCAGGGCGACTTC，结果于NCBI网站上用BLAST软件进行同源性比对，与Pseudomonas extremorientalis的gyrB基因(Genbank登录号：LT629708.1) 相似度达到96.66％。综合以上结果，判断该菌为Pseudomonas extremorientalis，命名为极端东方假单胞菌AV3(Pseudomonas extremorientalis AV3)，该菌活体纯培养已于2022年 09月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：武汉市武昌珞珈山)，保藏号：CCTCC NO：M20221439。

实施例2

极端东方假单胞菌AV3的TMV抑制效果比较

将极端东方假单胞菌AV3的菌落进行发酵培养，获得菌液，利用枯斑三生烟对TMV的过敏性坏死反应，采用半叶法测定AV3对TMV侵染的抑制率。将充分发病的TMV毒源幼嫩叶片以1∶10(质量比体积)加蒸馏水研磨过滤后，作为病毒供试样品。病毒供试样品与液体NA培养基等体积混合，10min后摩擦枯斑三生烟左半叶，作为对照。将AV3与病毒样品等体积混合，10min后摩擦接种于枯斑三生烟的右半叶，作为处理组1；此外，还使用宁南霉素处理组作为阳性对照，使用荧光假单胞菌作为处理组2。待出现枯斑后，分别记录左、右半叶的枯斑数。三次重复，每株烟接种三片叶。左右半叶枯斑数及抑制率如下表1：

表1不同处理对于TMV的抑制效果比较

抑制率(％)＝[(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数]×100％。

参见表1，以平均抑制率进行评价，菌株AV3对TMV拮抗作用较好，三次重复试验得出，AV3发酵液对TMV的抑制率可达77.3％，而宁南霉素的平均抑制率只有50.4％，本发明筛选得到的极端东方假单胞菌AV3对TMV抑制效果显著高于化学农药宁南霉素、荧光假单胞菌。

以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

Claims

1.一种极端东方假单胞菌AV3（Pseudomonas extremorientalis AV3），该菌株已在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）登记保藏，保藏日期为2022年09月15日；保藏编号为CCTCCNO：M20221439。

2.根据权利要求1所述的极端东方假单胞菌在防治烟草花叶病毒中的应用。

3.一种微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂中含有权利要求1所述的极端东方假单胞菌。

4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为液体制剂、冻干粉剂、固体固定剂中的一种。

5.根据权利要求3所述的菌剂在防治烟草花叶病毒中的应用。

6.一种极端东方假单胞菌培养物，其特征在于，所述培养物由权利要求1所述的菌株发酵培养而成。

7.一种防治烟草花叶病毒的方法，其特征在于，给予感染烟草花叶病毒的对象施加权利要求3所述的菌剂。