CN117546873B - 极端东方假单胞菌在防治辣椒轻斑驳病毒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物生物防治技术领域，具体的涉及一种对辣椒轻斑驳病毒具有防治作用的极端东方假单胞菌及其应用。本发明的极端东方假单胞菌AV3（Pseudomonas extremorientalis AV3）已在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）登记保藏，保藏日期为2022年09月15日；保藏编号为CCTCC NO：M20221439，其对于PMMoV的平均抑制率达到了85.5%，筛选和利用天然微生物拮抗菌防治辣椒轻斑驳病毒减少了化学农药对土壤及环境的污染，避免植物病原菌产生抗药性。
Description
技术领域
本发明涉及微生物生物防治领域，具体的涉及一种具有辣椒轻斑驳病毒防治作用的菌株极端东方假单胞菌及其应用。
背景技术
辣椒轻斑驳病毒PMMoV属于帚状病毒科(Virgaviridae)的病毒，是正单链RNA病毒，无包膜，是世界范围内威胁辣椒生产的重要病毒病害。其症状表现为，辣椒叶片被侵染后表现不明显，可能出现褪绿斑驳和花叶症状，植株生长明显变缓，发病越早对长势的影响越大，果实症状明显，表现为果小、果面有褪绿斑驳、凹凸斑点、甚至出现畸形与坏死现象。PMMoV可随带病的辣椒进入人体，经过消化排出人体后，仍具有侵染活性。PMMoV最早于1964年在美国发现，很快在世界各地均有报道，对一些地区的辣椒生产造成了严重的经济损失。
微生物源农药具有资源丰富、成本低、不会带来环境污染以及生态破坏的优势，是公认的无公害农药。此外，微生物药剂的应用可以有效减少人类使用有机和无机农药的使用量，缓解传统农药带来的严重的环境污染以及生态平衡的破坏。近年来，一些微生物农药的投入使用已经取得了良好效果，同时，微生物农药对于植物病毒也有一定的作用，为包括PMMoV的防治带来了新的思路和手段。皮氏罗尔斯通氏菌(Ralstonia pickettii)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的混悬液浸根，可以能有效地抑制PMMoV的土传危害。食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)菌株KBPF-004能影响病毒的机械传播，具有抗病毒活性。Oka等发现纤维素酶对植物PMMoV感染有很强的抑制作用，使用纤维素酶溶液处理甜椒叶片可大大减少PMMoV感染植株的数量。因此，进一步的筛选更多可以抑制PMMoV的菌株对于PMMoV的防治以及发展绿色农药仍然具有重要的意义。
发明内容
提供更多的有效的能够对辣椒轻斑驳病毒产生抑制作用的菌株也是本领域技术人员不断研究的方向。基于此，通过大量的筛选和测试，本发明提供如下技术方案。
本发明提供了一种对辣椒轻斑驳病毒具有抑制作用的极端东方假单胞菌，所述极端东方假单胞菌菌株为AV3(Pseudomonas extremorientalis AV3)，该菌株已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)登记保藏，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2022年09月15日；保藏编号为CCTCC NO：M20221439。
本发明的一个方面，本发明还提供了本发明所述极端东方假单胞菌及其代谢产物在防治辣椒轻斑驳病毒中的应用。所述防治的方法可以由多种，包括喷涂、喷洒、与其他肥料或农药共同施用于对象植物。
本发明的一个方面，本发明还提供了一种微生物菌剂，所述菌剂中含有本发明中的极端东方假单胞菌或其代谢产物。本发明中的极端东方假单胞菌可以通过发酵培养放大以收获更多的菌，也可以用发酵液中分离收获发酵上清液，从上清液中获得本发明中的极端东方假单胞菌的代谢产物。代谢产物的分离方法包括但不限于离心，过滤，抽滤，层析，树脂分离。本发明制备的微生物菌剂可以用于辣椒轻斑驳病毒的防治，菌剂也可以根据需求和使用的方便性制备为各种形式，例如液体制剂、冻干粉剂、固体固定剂。液体制剂可以制备成为各种混悬剂、乳液、分散剂；冻干粉剂是一种常用的微生物农药的制剂形式，其可以较好的保护好微生物的活性，冻干粉剂中还可以含有多种对于微生物活性有保护或稳定作用的物质，例如甘油、蛋白、糖醇、DMSO、缓冲液；固体制剂则通过吸附、连接等多种形式将微生物或其代谢产物固定在载体上，也能够在一定时间内保持微生物的活性，起到富集和增效的作用。
本发明的一个方面，本发明还提供了一种极端东方假单胞菌培养物，由本发明所述的菌种发酵培养而成，大量的培养物的制备为微生物农药的制备奠定了基础。
本发明的一个方面，本发明还提供了一种防治辣椒轻斑驳病毒的方法，给予感染或可能感染辣椒轻斑驳病毒的对象植物施加本发明所述的菌剂。
有益效果
本发明通过筛选获得了新的可以抑制辣椒轻斑驳病毒的菌种，通过测试发现本发明的极端东方假单胞菌对于辣椒轻斑驳病毒的平均抑制率达到了85.5％，为辣椒轻斑驳病毒的防治提供了新的选择和思路，筛选和利用天然微生物拮抗菌防治烟草病毒病减少了化学农药对土壤及环境的污染，避免植物病原菌产生抗药性。
附图说明
图1本发明筛选得到的极端东方假单胞菌AV3。
图2本发明极端东方假单胞菌AV3与抗病毒常规药剂宁南霉素对PMMoV的钝化作用，其中A为拮抗菌株AV3与PMMoV病毒钝化(叶片左侧)与阴性对照(叶片右侧)；B是宁南霉素与PMMoV钝化(叶片左侧)与阴性对照(叶片右侧)(图片是烟草背面)。C为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)与PMMoV病毒钝化(叶片左侧)与阴性对照(叶片右侧)。
本发明极端东方假单胞菌菌株为AV3(Pseudomonas extremorientalis AV3)，该菌株已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)登记保藏，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2022年09月15日；保藏编号为CCTCC NO：M20221439。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。本发明所述技术方案，如未特别说明均为本领域的常规方式，所述试剂或材料，如未特别说明，均为常规试剂，来源于商业渠道。
实施例1
菌种的筛选与鉴定
(1)取样：在已有烟草花叶病发生的烟田中，选取仍然生长健康的烟株，在烟株根部20厘米深度选取烟株根际土壤，备用；
(2)研磨：将备用的土壤10g置于灭过菌的三角瓶中，加入20ml无菌水，震荡待液体浑浊，室温静止10分钟，备用；
(3)纯化：用无菌枪头吸取静止后的液体上清200微升，在NA培养基(牛肉膏3.0g/L、蔗糖10.0g/L、蛋白胨5.0g/L、酵母提取物1.0g/L，琼脂15.0g/L，pH＝7.1)上采用涂布平板法，28℃培养24h，待分离平皿上菌落长出后，根据微生物菌落的形态、大小、表面结构、边缘结构、质地、光泽、透明度、颜色和产生的可溶性色素等方面特征，用接种环将孤立的单个菌落一一挑出，挑取形态不同的单菌落在相应的空白NA培养基平板上进行划线纯化，并在28℃恒温培养箱中倒置培养24h，得纯化菌株，备用；
(4)筛选：挑选单菌落细菌于已经灭菌的盛有20ml培养基的100ml锥形瓶中，振荡培养(28℃，200r/min)24h，使菌液含量足够大，作发酵备用菌种。选用PMMoV的枯斑寄主枯斑心叶烟(Nicotiana glutinosa)利用半叶法摩擦接种试验：利用枯斑心叶烟对PMMoV的过敏性坏死反应，采用半叶法测定不同菌株对PMMoV侵染的抑制率。
(5)鉴定：选取步骤(4)中获得抑制率最高的菌株AV3根据常规的微生物鉴定方法进行生理生化和分子生物学鉴定。经测定，此次筛选得到的菌株AV3菌落呈奶白色，近圆形，突起，边缘整齐，表面光滑湿润，革兰氏染色阴性。利用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Promega，Madison，WI)提取病原菌DNA。利用gyrB基因P895(TGGGTGTTGAAGTCGCCCTGCAA)；P1213r(TCCAACAGGAAATCGGCGAAGA)PCR扩增条件：96℃预变性5min；96℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min。PCR产物进行测序，测序结果是SEQ IDNo.1：
结果于NCBI网站上用BLAST软件进行同源性比对，与Pseudomonasextremorientalis的gyrB基因(Genbank登录号：LT629708.1)相似度达到96.66％。综合以上结果，判断该菌为Pseudomonas extremorientalis，命名为极端东方假单胞菌AV3(Pseudomonas extremorientalis AV3)，该菌活体纯培养已于2022年09月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号：CCTCC NO：M20221439。
实施例2
极端东方假单胞菌AV3的PMMoV抑制效果比较
将极端东方假单胞菌AV3(Pseudomonas extremorientalis AV3)的菌落进行发酵培养，获得菌液，利用枯斑心叶烟对PMMoV的过敏性坏死反应，采用半叶法测定AV3对PMMoV侵染的抑制率。将充分发病的PMMoV毒源幼嫩叶片以1∶10(质量比体积)加蒸馏水研磨过滤后，作为病毒供试样品。病毒供试样品与液体NA培养基等体积混合，10min后摩擦枯斑心叶烟左半叶，作为对照。将AV3与病毒样品等体积混合，10min后摩擦接种于枯斑心叶烟的右半叶，作为处理组1；此外，还使用宁南霉素处理组作为阳性对照，使用荧光假单胞菌作为处理组2。待出现枯斑后，分别记录左、右半叶的枯斑数。三次重复，每株烟接种三片叶。左右半叶枯斑数及抑制率如下表1：
表1不同处理对于PMMoV的抑制效果比较
抑制率(％)＝[(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数]×100％。
参见表1，以平均抑制率进行评价，菌株AV3对PMMoV拮抗作用较好，三次重复试验得出，AV3发酵液对PMMoV的抑制率可达85.5％，而宁南霉素的平均抑制率只有63.5％，本发明筛选得到的极端东方假单胞菌AV3对PMMoV抑制效果显著高于化学农药宁南霉素、荧光假单胞菌。
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。
Claims (4)
1.极端东方假单胞菌在防治辣椒轻斑驳病毒中的应用，其特征在于，所述极端东方假单胞菌为极端东方假单胞菌AV3（Pseudomonas extremorientalis AV3），该菌株已在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）登记保藏，保藏地址为中国 武汉 武汉大学，保藏日期为2022年09月15日；保藏编号为CCTCC NO：M20221439。
2. 一种微生物菌剂在防治辣椒轻斑驳病毒中的应用，其特征在于，所述菌剂中含有权利要求1所述的极端东方假单胞菌AV3（Pseudomonas extremorientalis AV3）。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述菌剂为液体制剂、冻干粉剂中的一种。
4.一种防治辣椒轻斑驳病毒的方法，其特征在于，给予感染辣椒轻斑驳病毒的对象施加含有权利要求1所述的极端东方假单胞菌AV3（Pseudomonas extremorientalis AV3）。
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