CN103160488A - 一种南极冰藻cpd光修复酶、其编码基因和表达载体以及该酶的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种南极冰藻CPD光修复酶，如（a）或（b）所述的蛋白质：（a）其如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；（b）将（a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一至十个氨基酸残基且具有CPD光修复酶活性的由（a）衍生的蛋白质；本发明同时公开了所述南极冰藻CPD光修复酶的编码基因、表达载体，以及该南极冰藻CPD光修复酶在化妆品、生物医药相关领域的应用。本发明首次克隆了南极冰藻CPD光修复酶基因，并成功将其克隆到表达载体中，获得大量CPD光修复酶，并将CPD光修复酶应用到化妆品、生物医药等相关领域，能够主动修复由紫外线引起病症，带来巨大的社会效益，意义重大。

Description

一种南极冰藻CPD光修复酶、其编码基因和表达载体以及该酶的应用

技术领域

本发明涉及生物学技术领域，具体涉及南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L中CPD光修复酶、其编码基因，以及南极冰藻CPD光修复酶的应用。 

背景技术

随着现代工业生产的高速发展，大气层中臭氧层遭到了破坏，南北两极臭氧空洞的出现、扩大，使得辐射到地球表面的太阳光中紫外线增强，导致生物圈受紫外线伤害日益严重。大剂量的紫外线（主要是UV-B）对整个地球生态环境来说是一个灾难性的威胁。紫外线已明显地抑制了南极水域中浮游植物群落的光合作用。其危害的根本原因是，生物体中DNA的四种碱基在近紫外波段（UV-B，280～320nm）有强吸收，进而诱发DNA同一条链内相邻的嘧啶碱基产生嘧啶二聚体，破坏DNA结构，这些损伤将可引起变异，或导致细胞死亡。紫外线也给人类皮肤健康带来严重的威胁，由于人皮肤细胞DNA极易吸收中波紫外线，对DNA造成损伤，因此近年来皮肤癌、黑瘤病的发病率激增。近年来DNA光致损伤与修复机制的研究，尤其对DNA上氧化态胸腺嘧啶二聚体修复机理的研究引起了人们的极大关注，研究极地耐辐射植物的光修复机理，将其应用于工业化生产，对生物和人类的生存极为重要。 

南极冰藻生长在南极海冰、海冰边缘或海水中，是一种极端微生物。在南极生态系统中占有极其重要的地位，是南极重要的初级生产力，同时也是南极浮游动物、磷虾、鱼类的重要实物来源。强紫外线辐射是南极生物所承受的主要环境胁迫之一。尽管生活在强辐射的环境中，南极冰藻仍旺盛生长繁殖，这预示着南极冰藻细胞内除了合成抗辐射物质来吸收紫外线和清除自由基外，遗传学上对DNA紫外损伤的高效自我修复功能应是其适应这种恶劣环境的关键机制。研究证实，DNA光修复酶承担了修复DNA损伤并保持生物遗传稳定性的重要功能。光修复酶广泛的存在于各种生物中，可以通过色氨酸电子传递链将光信号传递给FAD，FDA发生氧化还原反应改变嘧啶二聚体结构，使之裂解。 

光修复酶在生物体内的含量极少，每个细胞约有10～20个光修复酶分子，这使得直接进行生物体光修复酶的分离纯化和体外活性等研究极为困难。因此有必要对长期生存于强紫外线辐射条件下的南极冰藻进行深入研究，以利用基因工程手段克隆其光修复酶基因，并将其转化到目的宿主中，使其完成光修复酶的过量表达和纯化。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种南极冰藻CPD光修复酶，是将其编码基因克隆到表达载体中，得到其编码产物，并将编码产物合理应用到化妆品、生物医药等相关领域，从而消除上述背景技术中缺陷。 

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是： 

一种南极冰藻CPD光修复酶，如（a）或（b）所述的蛋白质： 

（a）其如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列； 

（b）将（a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一至十个氨基酸残基且具有CPD光修复酶活性的由（a）衍生的蛋白质。 

（b）所述的蛋白质，例如将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的第162位Ile替换为Val、或将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸N端缺失十个氨基酸、或将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸第76位氨基酸前添加Gln等，以上修饰均不改变蛋白活性，且由（a）衍生，均属于本发明的保护范围。 

本发明还提供了南极冰藻CPD光修复酶的编码基因。 

南极冰藻CPD光修复酶的编码基因，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。 

或者，与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列有90%以上同源性且编码光修复酶活性蛋白的核苷酸序列，能够编码（b）所述蛋白质的核苷酸序列。例如，针对将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的第162位Ile替换为Val，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的第484-第486个核苷酸，替换为GTT；或针对将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸N端缺失十个氨基酸，SEQ ID NO:1所示的核苷酸3’端缺失33个核苷酸；或针对将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸第76位氨基酸前添加Gln，SEQ ID NO:1所示的核苷酸在5’端第228个核苷酸后添加 CAG。 

本发明还提供了南极冰藻CPD光修复酶的表达载体，该表达载体包括：导入了南极冰藻CPD光修复酶的编码基因而能够编码如（a）或（b）所述蛋白质的原核表达载体或真核表达载体。 

本发明提供的南极冰藻CPD光修复酶的表达载体中，还可以加入选择性标记基因，包括但不限于：可在表达菌株中产生颜色变化的酶的基因、或发光化合物的基因、或具有抗生素标记物的基因。 

具体的说，本发明的技术方案是，从南极冰藻转录组中筛查获得目的基因—南极冰藻CPD光修复酶基因片段序列，对此片段在NCBI上进行比对验证。通过RACE得到该基因cDNA全长，同时，根据该基因片段序列设计引物，进行PCR，扩增全长CPD光修复酶基因。同时，通过荧光定量PCR检测该基因在紫外胁迫和强光照射条件下的表达模式。将该基因克隆到原核克隆载体pMD18-T，进行测序验证。将构建好的重组载体经酶切后连接原核表达载体pET-28a(+)，在大肠杆菌BL21中表达。最终经过亲和层析得到纯化蛋白。为了方便过量表达菌株的鉴定和筛选，可对表达载体进行加工，如加入可产生颜色变化的酶或发光化合物基因(如GFP基因、荧光素酶基因等)，或具有抗性的抗生素标记物。 

1、南极冰藻总RNA的分离 

将南极冰藻培养至对数期，用Invitrogen公司的Trizol进行RNA的提取。 

2、CPD光修复酶基因cDNA序列的获得 

根据前期获得的冰藻转录组序列设计引物： 

5’-RACE引物GSP1:CGAGCACATGGGTCGTTCCTCTTATCG 

3’-RACE引物GSP2:TGGGACGGAAGTGGAGGGATGAGGT 

将获得的高质量RNA进行反转录，合成cDNA，进行PCR反应，PCR反应条件为：94℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃3min，27个循环。 

3、南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L CPD光修复酶表达载体构建 

根据测序得到的光修复酶基因完整序列设计引物： 

CPDF:TAGAATTCATGCCGAAGCGAAC 

CPDR:TATCTCGAGTCAAGCTCGTGGC 

PCR反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性15s，55℃退火1min，72℃延伸2min反应进行30个循环；将光修复酶基因的PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-28a(+)，得到重组质粒；将连接好的重组质粒转化大肠杆菌DH5α，碱裂解法提取质粒进行酶切鉴定；鉴定正确的质粒以相同方法转化大肠杆菌BL21(DE3)，测序鉴定得到重组菌株BL21(DE3)/pET-28a(+)/phr。 

4、南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L CPD光修复酶的纯化和蛋白检测 

将重组菌BL21(DE3)/pET-28a(+)/phr接种于含卡那霉素的LB液体培养基培养后，加入IPTG，收集菌体；Ni琼脂糖亲和柱亲和层析，得到目的蛋白。 

取上述诱导表达的BL21(DE3)/pET-28a(+)/phr菌体和纯化的目的蛋白，进行SDS-PAGE恒压电泳，电泳结束后将凝胶用聚丙烯酰胺凝胶染色液染色。 

人们在细菌、昆虫、高等植物、脊椎动物和某些低等哺乳动物体内发现了光修复酶及其基因，但在高等哺乳动物包括人体内尚未发现DNA光修复酶的存在。而在高等哺乳动物细胞中，核酸外切修复(NER)是修复DNA损伤的最主要途径。有部分群体存在NER修复系统缺乏或不完整，表现出各种疾病，最常见的是着色性干皮病(XP)患者，除此之外Cockayne综合症和光敏型的毛发硫营养障碍症也存在NER修复系统缺乏。因此，光修复酶也可以应用到以上疾病的治疗。 

本发明将南极冰藻CPD光修复酶应用于保健品、化妆品、生物医药等相关领域以主动修复由紫外线引起病症。例如，防晒霜可以将皮肤与紫外线隔离开来，通过对光的反射和吸收两种机制起作用，以减少紫外线对皮肤的损伤，但无法对损伤的皮肤进行修复。本发明的重组蛋白DNA光修复酶可以作为高级护肤品的功能成分，主动修复由紫外线引起的红斑、皮肤炎症以及基因损伤，延缓衰老，彻底突破了当前“防”紫外线的概念。 

由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是： 

本发明首次克隆了南极冰藻CPD光修复酶基因，并成功将其克隆到表达载体中，获得大量CPD光修复酶，并将CPD光修复酶应用到保健品、化妆品、生物医药等相关领域，能够主动修复由紫外线引起病症，带来巨大的社会效益，意义重大。 

附图说明

图1是紫外条件下南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L CPD光修复酶基因 表达变化图； 

图2是强光条件下南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L CPD光修复酶基因表达变化图； 

图3是SDS-PAGE电泳图。 

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。 

下述实施例中所使用的方法均为本领域常规操作，详见《分子克隆实验指南》。 

实施例1.南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L CPD光修复酶cDNA序列的获得 

1、南极冰藻的培养、总RNA的分离 

将南极冰藻4℃培养至对数期，用Invitrogen公司的Trizol进行RNA的提取。试验按照Trizol试剂的提取流程说明进行操作，在整个过程中保证无RNase污染，将提取的RNA分装成小份，冻存于-80℃冰箱备用。 

2、CPD光修复酶基因cDNA序列的获得 

根据前期获得的冰藻转录组序列设计引物： 

5’-RACE引物GSP1:CGAGCACATGGGTCGTTCCTCTTATCG 

3’-RACE引物GSP2:TGGGACGGAAGTGGAGGGATGAGGT 

将获得的高质量RNA进行反转录，合成cDNA。 

5’-RACE反转录体系如下： 

3’-RACE反转录体系如下： 

轻微振荡后离心数秒钟。于42℃90min，70℃10min，冰上急冷2min以上；用Tricine-EDTA buffer稀释，保存于-20℃，待用。 

PCR反应体系如下： 

PCR反应条件为：94℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃3min，27个循环。PCR结束后用1.0%的琼脂糖进行回收，连接到pMD18-T，转化E.coliDH5α，进行测序验证。利用NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在线工具，将所得序列应用BLAST程序进行序列同源性比对和相似性分析；用DNAstar软件进行序列拼接，并在NCBI中比对，以确认获得目的基因为光修复酶基因的完整编码区序列。 

实施例2.南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L CPD光修复酶表达载体构建 

1、根据测序得到的光修复酶基因完整序列设计引物： 

CPDF:TAGAATTCATGCCGAAGCGAAC 

CPDR:TATCTCGAGTCAAGCTCGTGGC 

PCR反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性15s，55℃退火1min， 72℃延伸2min反应进行30个循环。 

2、将光修复酶基因的PCR扩增产物和原核表达载体pET-28a(+)分别用EcoRⅠ和XhoⅠ于37℃酶切2h，用1.0%的琼脂糖分别进行回收，将纯化好的目的片段及载体用T4DNA连接酶于16℃下连接16h，连接体系如下。 

3、将连接好的重组质粒转化大肠杆菌DH5α，步骤如下： 

(1)取感受态细胞300μL于1.5mL离心管中，冰浴5min。 

(2)于每管中加入5μL连接过的质粒，轻轻旋转以混合内容物，冰浴30min。 

(3)42℃热休克90s，不要摇动试管。 

(4)取10mL无菌试管，每管加入800μL LB液体培养基，冰浴。 

(5)取转化后的细胞200μL加入800μL LB液体培养基中，37℃150rpm振荡培养45min。 

(6)将100μL转化的菌液涂布于平板表面，37℃培养培养12～16h。 

4、挑取白色的菌落分别置于5mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养8～12h，碱裂解法提取质粒以进行酶切鉴定。鉴定正确的质粒以相同方法转化大肠杆菌BL21(DE3)，测序鉴定得到重组菌株BL21(DE3)/pET-28a(+)/phr。 

实施例3.南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L CPD光修复酶的纯化及蛋白检测 

1、将重组菌BL21(DE3)/pET-28a(+)/phr接种于5mL含卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃振荡过夜培养。次日取5mL菌液接入500mL相同的培养基继续培养2～3h(OD600约0.6)后，加入终浓度为1mM的IPTG，于10℃振荡培养24h，8000g离心10min，收集菌体。 

2、Ni琼脂糖亲和柱亲和层析：将金属螯合剂Ni琼脂糖装入层析柱，用1×Ni柱结合缓冲液平衡。将上清液上柱。一般用40mM咪唑洗脱，得到目的蛋白。 

3、取上述诱导表达的BL21(DE3)/pET-28a(+)/phr菌体和纯化的phr基因表达的蛋白质，分别与等体积的2×上样缓冲液混合，100℃水浴3～5min。配制12%的SDS-PAGE分离胶和5%的浓缩胶，取30μL加样于凝胶，在浓缩胶中100V，分离胶中120V，进行SDS-PAGE恒压电泳，电泳结束后将凝胶用聚丙烯酰胺凝胶染色液染色。 

结果如图3所示，其中M表示标准分子量，P表示BL21(DE3)/pET-28a(+)/phr菌体蛋白，N表示空载体菌株对照，箭头为表达的南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L CPD光修复酶。说明，利用上述方法能够得到南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L CPD光修复酶。 

实施例4.南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L CPD光修复酶蛋白序列分析 

获得的的南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L CPD光修复酶基因的开放阅读框（ORF）长度为1740bp，编码579个氨基酸残基。CPD光修复酶等电点为8.91，相对分子质量为64.3KDa。将南极衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L的CPD光修复酶的氨基酸序列在NCBI上进行同源性比对，在核酸数据库中没有明显的序列同源性。发现南极衣藻CPD光修复酶的氨基酸序列与莱茵衣藻亲缘关系最近，相似度为68%。 

实施例5.南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L CPD光修复酶修复紫外损伤的作用检测 

1、南极冰藻CPD光修复酶基因重组菌株接种于三角烧瓶中，在摇床中进行培养。6000r·min-1离心收获菌体。超声破碎菌体，10000r·min-1离心去除菌体碎片，上清液先用超滤仪收集50000-100000Da组分进行初步分离，经过镍亲合柱层析分离，再经Sepharose Fast Flow进一步纯化，得到南极冰藻CPD光修复酶基因表达产物。 

2、人工合成的16个嘧啶碱基单链寡聚核苷酸溶液在30℃水浴中，用300W高压汞灯以5cm灯距对其进行辐照5h，得到含嘧啶二聚体的寡聚核苷酸，即d(pT)16(UV5h)。反应体系为样品缓冲液中加入0.001mol·L-1的二硫苏糖醇(DTT，作为电子供体)，加入2μmol·L-1的冰藻CPD光修复酶和4μmol·L-1d(pT)16(UV5h)。将反应液体置于700μL石英比色皿中，用15W近紫外灯管(主要输出波长为365nm)以灯距4cm光照进行光修复，按时间测定268nm处吸光度变 化。检测其体外修复活性和了解其修复过程。 

实施例6.紫外、强光胁迫下南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L CPD光修复酶基因表达变化 

1、将对数生长期的南极冰藻离心浓缩后转到培养皿中，在紫外灯下培养，辐照强度为60μW/cm2，分别培养0，0.5，1，2，4，6h，然后进行荧光定量分析。每个取样点设3个重复。如图1所示：南极冰藻光修复酶基因的表达受紫外线影响显著。在紫外辐照条件下，随着时间的延长，光修复酶基因的表达先升高后降低，并且升高幅度很显著。在紫外辐照处理6h时，光修复酶基因的表达量达到最大值，为正常光照的50倍。 

2、强光条件下南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L CPD光修复酶基因表达量的变化。将对数生长期的南极冰藻离心浓缩后转到培养皿中，在高光强400μmol m-2s-1下分别培养0，0.5，1，2，3，6，9h，进行荧光定量分析。每个取样点设3个重复。如图2所示：南极冰藻光修复酶基因的表达受强光条件的诱导。在强光条件下，光修复酶基因的表达量上调，在4h时，光修复酶基因的表达量达到最大值，为正常光照的3.75倍。然后随着时间的延长，表达量逐渐降低。 

实施例7化妆品领域应用 

在紫外线损害下，人体肌肤加速衰老。DNA光修复酶可以保护皮肤免受紫外线的损伤，改善皮肤的健康状况，长期使用可以减少皮肤病和皱纹。1999年Helger Steg等研究发现DNA光修复酶可以有效的修复紫外线给人类皮肤带来的损伤。 

本实施例中，采用卵磷脂及胆固醇包埋实施例3纯化后的南极冰藻光修复酶，后添加至化妆品中。 

选择6周左右的小鼠，阳性对照涂抹光修复酶，对其背部皮肤进行紫外照射实验，每只小鼠经过3天重复处理，制作皮肤切片，进行苏木素-伊红染色。实验结果说明，光损伤小鼠表皮会明显增厚，而涂抹南极冰藻光修复酶的小鼠表皮正常。因此，可以将南极冰藻光修复酶添加到化妆品中。 

实施例8生物医药领域应用 

红斑反应是以一定剂量的紫外线照射皮肤后，经过一段时间，照射皮肤呈 现边界清楚、均匀充血的反应。用254nm波长紫外线照射小鼠背部皮肤30min，12h产生红斑,随机选取小鼠在红斑附近皮肤进行皮下注射，每天注射0.1mg南极冰藻光修复酶，连续3天，1周后治疗组红肿皮肤有明显改善。南极冰藻光修复酶可以应用于医药领域。 

本发明不局限于上述具体实施方式，一切基于本发明的技术构思，所作出的结构上的改进，均落入本发明的保护范围之中。 

Claims (9)

1.一种南极冰藻CPD光修复酶，其特征在于：如（a）或（b）所述的蛋白质：

（a）其如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

（b）将（a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一至十个氨基酸残基且具有CPD光修复酶活性的由（a）衍生的蛋白质。

2.如权利要求1所述的南极冰藻CPD光修复酶，其特征在于：（b）所述的蛋白质，包括：将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的第162位Ile替换为Val、或将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸N端缺失十个氨基酸、或将SEQID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸第76位氨基酸前添加Gln，而且具有CPD光修复酶活性的由（a）衍生的蛋白质。

3.编码如权利要求1或2所述的南极冰藻CPD光修复酶的编码基因。

4.如权利要求3所述的南极冰藻CPD光修复酶的编码基因，其特征在于：其如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

5.如权利要求3所述的南极冰藻CPD光修复酶的编码基因，其特征在于：与SEQID NO:1所示的核苷酸序列有90%以上同源性且编码光修复酶活性蛋白的核苷酸序列。

6.南极冰藻CPD光修复酶的表达载体，其特征在于：所述表达载体包括：导入了如权利要求3所述的南极冰藻CPD光修复酶编码基因而能够编码如（a）或（b）所述蛋白质的原核表达载体或真核表达载体。

7.如权利要求6所述的南极冰藻CPD光修复酶的表达载体，其特征在于，所述表达载体中加入选择性标记基因。

8.如权利要求1或2所述南极冰藻CPD光修复酶在化妆品领域的应用。

9.如权利要求1或2所述南极冰藻CPD光修复酶在生物医药领域的应用。

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