CN1571839A

CN1571839A - 利用可见光修复紫外线损伤的dna的酶基因

Info

Publication number: CN1571839A
Application number: CNA028205340A
Authority: CN
Inventors: 山本和生; 熊谷忠; 日初间纯; 广内笃久
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2001-10-18
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2005-01-26
Also published as: EP1445319A4; US7205149B2; JP2003116578A; EP1445319A1; WO2003033704A1; US20050074766A1; CA2463916A1

Abstract

从耐受紫外线的水稻中分离光复活酶，在目前依旧了解甚少的植物的光复活机理方面获得了信息，同时利用克隆的基因构建了耐受紫外线的植物。其目的是为解决由于臭氧层破坏造成的环境问题和食物资源这个21世纪重大问题助一臂之力。编码源自水稻的光复活酶的基因，特指编码以下(a)(b)两种蛋白质的基因：(a)用序列编号为1的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)一种通过缺失、置换或添加一个到几个氨基酸而由(a)序列衍生的氨基酸序列组成的具有光复活酶活性的蛋白质。

Description

利用可见光修复紫外线损伤的DNA的酶基因

技术领域

本发明涉及利用可见光修复DNA的紫外线损伤、编码光复活酶的基因，以及利用该基因赋予和增强对紫外线耐受性的方法。

技术背景

最近受到人们关注的环境问题之一是臭氧层破坏。这个问题给我们生带来生活的影响无法估量。地球上生物的繁衍生息，依靠太阳光来支撑，同时又受到太阳光中所包含的紫外线的威胁。紫外线是太阳光中波长为100-400nm的部分，主要分成3部分。100-290nm为UV-C，290-320nm为UV-B，320-400nm为UV-A。其中波长320nm以下的被臭氧层吸收，剩下UV-B的一部分和UV-A照射到地面。照射到地面的接近DNA吸收波长260nm的UV-B可以使DNA的碱基发生结构改变。这种改变有两种，一种形成环丁烷嘧啶二聚体(CPD)，一种形成6-4加成物。这两种改变的结构都是由于相邻的两个嘧啶之间发生共价键交联而形成为二聚体。假设紫外线引起的DNA变化为100％，则70-80％生成CPD，20-30％是6-4加成物。这两种结构都会抑制DNA复制和转录，从而引起细胞死亡或突变。强烈太阳光造成皮肤癌，据认为其原因就是紫外线造成了这类损伤。

对应于这种损伤，生物体具备种种修复损伤的机制。因此地上的生物暴露在太阳光下并不容易生癌。修复机制之一就是光复活作用。这个修复系统是光复活酶利用连续被照射的近紫外线和其后的蓝色光，进行紫外线引起的Py+Py→CPD和6-4加成物反应的逆反应，使因紫外线而生成的CPD和6-4加成物回复到原来的状态(1，图1)。进行这种修复的光复活酶有两种。一种特异修复CPD，另一种特异修复6-4加成物(2，3)。已经确认从原核生物到高等真核生物中广泛存在CPD光复活酶，但是，假如臭氧层受到破坏，到达地面的紫外线剂量增大，DNA发生超过现在的大量损伤，达到能够修复的极限，可以想象结果就会对生物造成重大影响。

这种现象在植物中也不例外。假如是不直接需要太阳光的生物，即使紫外线剂量增大，也可以在太阳光下生存，但是靠进行光合作用获得大量能量的植物则不能生存。因此可以预料，由于臭氧层破坏而受到的影响要比不直接需要太阳光的生物要更大。

最近已有实验报道，报道了拟南芥和烟草在特定紫外线剂量环境中的生长情况，该环境以实际的紫外线剂量为现在的基准值，增加到由于未来臭氧层减少而设想的剂量。也就是说，设定由于臭氧层破坏而预测的状况，观察对植物的实际影响。所得的结果如下：首先，随着紫外线剂量增加，细胞中CPD和6-4加成物比现在的水平有所增加，生长受到抑制，进而基因重组增加，因而基因组的不稳定性增加。而且这种不稳定性随世代延续而增加。即由于紫外线剂量的增加，影响不仅及于当代，还延续到若干代之后。由于保持该照射剂量，变异可以在后代积蓄起来，使后代比前代对紫外线更加敏感。可以认为这是由于拟南芥和烟草的花粉、生殖器官的花药从裂开到受粉期间暴露在外界，更容易受到紫外线到影响。可以认为，这种情况在地球上大多数植物中和拟南芥及烟草一样，都会由于臭氧层破坏导致的紫外线剂量增加而发生。这表明，在臭氧层被破坏后的若干年，生态系统有可能会发生大改变。

为此，对于难以避免太阳光中所包含的紫外线影响的植物，便利用与紫外线同样来自太阳光的可见光的能量，来减轻紫外线的影响，这种光复活作用是植物应对紫外线的有效防御体系。表明高等植物中存在光复活作用的报道证实了这种论断。

我们日本人已经报道了在熟悉的高等植物“水稻”中存在使CPD发生光复活的过程。在我们的实验中，用紫外线适当照射后，接着用可见光(蓝色)照射水稻叶片(第三叶)。结果发现，细胞中CPD的含量随可见光照射时间增加而减少(修复)。此外，在发芽后照射同水平的可见光，该个体CPD的修复效率提高(5)。也就是，同剂量的可见光可以修复更多的CPD。这种CPD光回复活性不仅在所有水稻品种中同样发生，而且在对紫外线不敏感对品种(农林1号)中，该修复速度比紫外线耐受品种(篁地锦)要缓慢(6)。对紫外线不敏感对品种(农林1号)修复速度缓慢，据认为是由于光复活酶本身存在差异，或是其表达机制发生了某种变异，目前尚未阐明。

与本专利发明有关现有技术的文献如下：

(1)Aziz Sancar.(1994)“DNA光解酶的结构和功能(Structure andFunction of DNA photolyase)”，Biochemistry 33：2-9.

(2)Takeshi Todo，Hiroshi Takemori，Haruko Ryo，Makoto Ihara，Tsukasa Matsunaga，Osamu Nikaido，Kenji Sato，Taisei Nomura(1993)“一种特异性修复紫外光诱导的(6-4)光生产物的新光复活酶(A newphotoreactivation enzyme that specifically repairs ultraviolet light-induced(6-4)photoproduct)”Nature 361：371-374.

(3)Aziz Sancar(1996)“光解酶的历史未结束(No″End of History″for Photolyases)”Science 272：48-49.

(4)Gerhard Ries，Werner Heller，Holger Puchta，HeninrichSandermann，Haraid K.Seidlitz，Barbaara Hohn(2000)“提高UV-B照射降低植物基因组的稳定性(Elevated UV-B radiation reduces genomestability in plants)″Nature 406.

(5)Hye-Sook Kang，Jun Hidema and Tadashi Kumagai(1998)″在培养期间光环境对UV诱导的环丁基嘧啶二聚体和水稻(Oryza sativa L.)光修复的影响(Effects of light environment during culture on UV-induced cyclobutyl pyrimidine dimers and their photorepair in rice(Oryzasativa L.))″Photochemistry and Photobiology 68：71-77

(6)Jun Ridema，Tadashi Kumagai，John C.Sutherland，Betsy MSutherland(1997)″紫外线B敏感的水稻栽培品种缺失环丁基嘧啶二聚体修复(Ultraviolet B-sensitive rice cultivar deficient in cyclobutylpyrimidine dimer repair)″Plant Physiology 113：39-44

(7)Satoshi Nakajima，Munetaka Sugiyama，Shigenori Iwai，KenichiHitomi，Eriko Otoshi，Sang-Tae Kim，Cai-Zhong Jiang，Takishi Todo，AnneB Britt，Kazuo Yamamoto(1998)″克隆和表征对光修复阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)的6-4光生产物所必需的基因(UVR3)(Cloningand characterization of a gene(UVR3)required for photorepair of 6-4photoproducts in Arabidopsis thaliana)″Nucleic Acid Research 26：638-644

(8)Jason L.Petersen，Darin W.Lang，Gary D.Small(1999)″克隆和表征衣藻(chlamydomonas)的II型DNA光解酶(Cloning andcharacterization of a class II DNA photolyase from Chlamydomonas)″Plant Molecular Biology 40：1063-1071

(9)Yao-Guang Liu，Kiyotaka Nagaki，Masao Fu]ita，KanakoKawaura，Masahike Uozumi，Yasunari Ogihara.(2000)“在转化感受态的人工染色体(TAC)载体中用于插入六倍体小麦的大基因组DNA文库的有效维持和筛选系统的开发(Development of an efficientmaintenance and screening system for large-insert genomic DNA librariesof hexaploid wheat in a transformation-competent artificial chromosome(TAC)vector.)″The Plant Journal 23：687-95.

(10)Kazuo Maruyama，Sumio Sugano(1994)″寡加帽：用寡核糖核苷酸替代真核生物mRNA的帽结构的简单方法(oligo-capping：asimple method to replace the cap structure of eukaryotic mRNAs witholigoribonucleotides)”Gene 138：171-174

(11)Michael Herrler(2000)″SMART生成的cDNA用于差异基因表达研究(Use of SMART-generated cDNA for Differential GeneExpression Studies)″Jounal of Molecular Medicine 78：B23.

发明内容

本发明从上述已证明存在光复活酶的耐受紫外线的水稻(篁地锦)中分离光复活酶，在目前依旧了解甚少的植物的光复活机制方面获得了信息，同时利用克隆的基因构建了耐受紫外线的植物。其目的是为解决由于臭氧层破坏造成的环境问题和食物资源这个21世纪重大问题助一臂之力。

为此，本发明涉及以下诸方面：

1.编码来源于水稻的光复活酶的基因。

2.编码嘧啶二聚体光复活酶的上述第1项中所述的基因。

3.来源于耐受紫外线的品种的上述第1项或第2项所述的基因。

4.水稻品种为篁地锦的上述第1项、第2项或第3项所述的基因。

5.水稻品种为Gulfmont的上述第1项中所述的基因。

6.含有编码下述(a)或(b)蛋白质的碱基序列的基因：

(a)编号为1的序列中从氨基末端第174个到第506个氨基酸表示的序列组成的蛋白质；

(b)通过缺失、置换或添加一个到几个氨基酸而由(a)序列衍生的氨基酸序列组成的具有光复活酶活性的蛋白质。

7.含有以下(a)、(b)所示DNA的基因

(a)编号为2的序列所表示的碱基序列中从第520个到第1521个碱基对组成的DNA；

(b)由碱基序列(a)组成的DNA和编码在严格条件下发生杂交而且有光复活酶活性的蛋白质的DNA。

8.编码以下(a)或(b)所示蛋白质的基因

(a)编号为1的序列所表示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)氨基酸序列(a)中一个或数个氨基酸缺失、置换或添加而组成的氨基酸序列，并且有光复活酶活性的蛋白质。

9.含有以下(a)或(b)所示DNA的基因

(a)编号为2的序列所表示的碱基序列组成的DNA；

10.包括通过反复进行的稀释PCR方法筛选水稻基因文库的方法在内的，上述第1到第9项任何一项所述的基因制备方法。

11.上述第10项所述的方法中，水稻基因文库指cDNA文库。

12.上述第11项所述的水稻指品种为篁地锦和Gulfmont。

13.含有上述第1项到第9项任何一项中所述的基因的重组表达载体。

14.上述第13项所述的重组表达载体为λ噬菌体。

15.上述第13项所述的重组表达载体为质粒载体。

16.用上述第13、14或15项所述的表达载体进行转化获得的转化子

17.上述第16项所述的转化子为植物。

18.上述第17项所述的植物转化子为水稻。

19.上述第16项所述的转化子为大肠杆菌。

20.借助上述第1项到第9项任何一项所述的基因，在由转化宿主而构成的宿主中赋予或增强宿主对紫外线耐受性的方法。

21.上述第20项所述的方法中宿主为植物。

22.上述第21项所述的方法中植物为水稻。

23.上述第22项所述的方法，其特征在于水稻是耐受紫外线的品种。

24.上述第23项所述的方法，其特征在于水稻是耐受紫外线的水稻品种的农林1号。

25.在水稻中筛选光复活酶基因的表达量的方法，其特征是利用上述第1项到第9项任何一项中所述的基因或它们的DNA片段。

26.测定在水稻中光复活酶基因转录为mRNA的转录量的方法，其是利用上述第1项到第9项任何一项中所述的基因或它们的DNA片段为探针，进行RNA印迹杂交。

27.上述第25或26两项所述的方法，其特征在于水稻是紫外线耐受性和/或紫外线敏感性的品种。

28.用上述第1项到第9项任何一项中所述的基因所编码的多肽或蛋白质。

29.有光复活酶活性的上述第28项所述的多肽或蛋白质。

30.制备编码源自植物的光复活酶的基因的方法。这个方法包括根据至少两种已知光复活酶的氨基酸序列相似性高的部分制备第一种引物，以植物染色体组为模板，用该第一种引物的PCR法，克隆出第一个DNA片段；再根据第一个DNA片段与拟南芥的光复活酶的氨基酸序列中相似性高的部分制备第二种引物，用该植物基因文库为模板，用第二种引物的PCR法克隆出第二个DNA片段，以第二个片段作为探针，借助核酸杂交方法克隆目的基因。

31.上述第30项所述的方法，已知的光复活酶是拟南芥和绿藻的光复活酶。

32.上述第30或31项所述的方法，植物基因文库是cDNA文库。

33.上述第30、31或32所述的方法，核酸杂交方法是噬斑杂交法。

34.上述第30至33项任何一项所述的方法中，植物是水稻。

35.上述第30项所述的方法中，基因是权利要求第1至第9项任何一项所述的基因。

附图简述

图1表示光复活机理。由于紫外线作用，DNA链上产生CPD或6-4加成物(A)。CPD光复活酶、6-4加成物光复活酶分别特异地和CPD、6-4加成物结合(B)、由于可见光(近紫外光，蓝色光)照射各自的损伤发生复活(C)。最后光复活酶从DNA链上脱离(D)。

图2表示拟南芥和绿藻光复活酶氨基酸序列之比较。A.T是拟南芥的序列，Cr是绿藻的序列AC1～AC5表示引物的位置。

图3表示Gulfmont品种水稻cDNA/pSPORT-T文库和篁地锦品种水稻cDNA/pBSSK(-)文库筛选过程的示意图。

图4表示光复活酶、蓝色受体、昼夜性节律受体各类群的系统进化树。

图5表示用混合引物扩增水稻基因组CPD光复活酶编码区的扩增。

图6表示根据水稻基因组AC1.1kbp推测的氨基酸序列与拟南芥的CPD光复活酶的氨基酸序列的比较，下部划双线的部分表示完全相一致的引物位置。

图7表示水稻基因组CPD光复活酶片段与拟南芥CPD光复活酶氨基酸序列的比较，下部划双线的部分表示完全相一致的引物位置。

图8表示水稻(Gulfmont)CPD光复活酶片段与拟南芥CPD光复活酶氨基酸序列的比较。

图9表示用大肠杆菌复活缺陷型菌株证明本发明光复活酶具有光复活活性的互补性实验。

图10育种操作示意图，表示通过导入本发明基因，赋予紫外线敏感品种以紫外线抗性，在紫外线耐受品系中培育出进一步增强表达CPD光复活酶的品种。

实施发明的最佳方式

如以下实例所示，本发明制备出源自水稻的编码光复活酶的各基因。例如利用本说明书内容中所述水稻的紫外线耐受品种Gulfmont和篁地锦的cDNA文库，采用本发明制备的适当引物，特别是根据与拟南芥和绿藻的嘧啶二聚体(CPD)光复活酶具有高相似性的氨基酸序列制备的引物，通过PCR方法制备而成这些基因。特别是通过反复进行稀释PCR，筛选水稻cDNA文库等基因文库，有效地获得了本发明的基因。

本发明为含有编码具有在编号为1的序列所标明的氨基末端开始第174到第506个氨基酸序列的蛋白质的碱基序列的基因，特别是在5’端有任意碱基序列的基因，该序列最好来自水稻(例如篁地锦品种)。编码编号为1的氨基酸序列组成的蛋白质的基因可以作为一个例子。

对于专业人员，根据本说明书内容提供的序列信息，采用该技术领域常用之化学合成手段即能制备。而且专业人员能够容易地采用该技术领域常用手段，使编号为1的氨基酸序列组成的蛋白质中1个到若干个氨基酸发生缺失、置换或添加，并实质性保持其光复活酶活性。

上述基因的具体实例可举出含有编号为2的序列所表示的碱基序列中第520到1521个碱基对构成的DNA的基因，特别是含有编号为2序列所表示的碱基序列组成的DNA的基因。

本发明中特定的基因或DNA，可以在专业人员常用的缓冲液中，在适当温度和盐浓度等严格条件下进行杂交。在这种严格条件下，本发明的基因或DNA进行杂交，获得了编码具有实质上与光复活酶活性相等活性的蛋白质的DNA，例如各自相对应基因的DNA相似性，可达90％以上，好的为95％以上，较好的在98％以上，更好的在99.5％以上。

另外，本发明的另一个形式涉及重组表达载体，该载体含有至少一个上述本发明的基因。重组表达载体包括专业人员都知道的各种运载工具，但本发明特别适用的是农杆菌(Agrobacteria)中含有的Ti质粒等各种质粒运载体，以及λ噬菌体等噬菌体载体等。

该重组表达载体中，可以任意包容基因重组操作中专业人员通用的序列，例如具有能够和原核细胞的大肠杆菌的转录因子-各种σ亚基相结合区域的各种启动子、增强子等各种转录调节因子、限制性内切酶切割部位，以及卡那霉素耐性标记等选择标记基因，可以容易地采用专业人员通用的方法制备。

本发明还涉及用上述表达载体转化的宿主，特别是水稻等植物。

利用本发明的基因，通过转化宿主，可以赋予或增强该宿主对紫外线的耐受性。合适的宿主是水稻等植物，特别是农林1号等紫外线耐受品种。

同时，可以把本发明的基因或它的DNA片段，用作诸如探针等，筛选水稻等植物中光复活酶的表达量。例如用本发明的基因或它的DNA片段，用作探针，通过RNA印迹杂交法测定水稻中光复活酶基因转录为mRNA的数量。

本发明还涉及由上述基因编码的，有光复活酶活性的多肽或蛋白质。这些多肽或蛋白质可以通过培养上述转化子，从培养物上清液或菌体中制备。培养条件和从上清液中分离纯化的方法可参见本说明书的实例，由专业人员任意选用。

本发明涉及制备编码源自植物的光复活酶的基因的方法。该方法是根据至少2种已知光复活酶的氨基酸序列中高度相似部分构建第一引物，以植物基因组作为模板，用该第一引物借助PCR方法克隆第一个DNA片段，再根据第一个DNA片段与拟南芥光复活酶的氨基酸序列中高度相似的部分构建第二个引物，以该植物基因文库为模板，用该第二引物借助PCR方法克隆第二个DNA片段，用第二个DNA片段作为探针，通过核酸杂交克隆目的基因。此处已知的光复活酶可举拟南芥和绿藻的光复活酶为例。构建应用的植物基因文库的原始样品没有特别限制，但以cDNA文库为佳。同时，所采用的核酸杂交方法，有噬斑杂交法和DNA印迹杂交等专业人员常用的任何方法。所采用的植物，可以是水稻、小麦和大麦等。利用这些方法可以制备本发明的基因。

此外，在专利申请书(特愿)2001-320138说明书中所记述的内容，也全部采用到本说明书中。

实施例

以下用实施例来进一步具体说明本发明，但本发明并不受实施例的任何限制。

材料和方法

1大肠杆菌、质粒

所采用的大肠杆菌是XL1-Blue(Δ(lac)，endA1，gyrA96，hsdR17(rk^-，mk⁺)recA1，relA1，supE44，thi-1，[F’，laclq，lacZΔM15，proAB，Tn10(tet^r)]NKJ3002(Δ(lac-proAB)，endA1，gyrA96，hsdR17(rk^-，mk⁺)，relA1，supE44，thi-1，phr20∷Kan uvrA∷KanΔrecA，[F’laclq，lacZΔM15，proAB])。用pGEM-T、pGEM-T easy vector(Promega)进行PCR产物的克隆。同时，为了验证篁地锦的CPD光复活酶基因的光复活能力，将该基因重组到pTZ18R载体(PHARMACIA)上，再导入大肠杆菌中。

2水稻(篁地锦)cDNA文库的构建

从种子发芽开始到展开第3至第6叶片为止，将水稻置于可见光照射环境中生长，从稻叶中抽提m RNA，以此为模板合成cDNA。将接头与此cDNA两端进行连接，再包装到λzap II(STRAQTAGENE)中制成文库。

3混合引物的构建和序列的确定

根据拟南芥(7)和绿藻(8)二者之CPD光复活酶之间高度相似的5个区域(图2：AC1～AC5)的氨基酸序列，构建了混合引物。以大约1μg水稻基因组为模板，进行PCR([Mg²⁺]＝2.0Mm，93℃，1min，《93℃，1min，53℃1min 72℃1.5min》X 40个循环，72℃10min，采用Perkin Elmer公司的Gene Amp 480/9600 System)。将PCR产物克隆到pGEM-T、pGEM-T easy vector(Promega)。用荧光标记法，取混合试剂盒(ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kits或DYEnamic ET terminator Cycle Sequencing pre-mix kit)在310型或373型基因分析仪上确定碱基序列。

4用噬斑杂交法筛选λZAP II/水稻cDNA文库

λ噬菌体(λZAP II/水稻cDNA文库)在培养基上形成大约15000-20000个噬菌斑，用灭菌的Gene Screen plus(NEN Life ScienceProducts)覆盖，进行转化。转化后的Gene Screen plus浸入变性溶液(0.5N NaOH，1.5M NaCl)中5分钟，再在复性溶液(0.5M Tris-HCl，1.5M NaCl)中浸5分钟，最后在2X SSC溶液中浸5分钟，自然干燥30-60分钟后，在干热灭菌器中80℃烘烤2小时。将此制备物用3XSSC(65℃)处理30分钟，再用预备杂交溶液(5X SSC，1％SDS，1XDenhart：65℃)处理2小时，然后取约25ng ³²P标记的探针混入杂交溶液(0.75M NaCl，20mM Tris-HCl pH 8.0，2.5mM EDTA pH 8.0，1％SDS，1X Denhart，10μg/ml鱼精DNA)中，在65℃保温过夜(杂交)。取出杂交一夜的Gene Screen plus，用2X SSC，0.1％SDS溶液洗5分钟，用0.2X SSC，0.1％SDS溶液(65℃)洗2次，每次30分钟，洗涤后的样品覆盖在FUJI MEDICAL X-ray FILM(FUJI FILM)上，曝光显影。从培养基中回收产生信号的噬斑，为了确认在新培养基上形成的噬斑，再重复一次噬斑杂交操作。将此噬斑转变成pBlueScript SK(-)，确定插入的碱基序列。

5基因组步查

用4种限制性内切酶(Dra I，EcoR V，Stu I，Pvu II)处理约5μg从水稻种抽提出的基因组，接上接头(参看Universal Genome Walker KitManual：CLONTECH)，将此样品作为模板，用连接了接头的引物和从已经确定的水稻cDNA序列构建的引物进行PCR([Mg²⁺]＝2.0mM，93℃，1min，《93℃，1min，50-55℃1min，72℃1.5min》X 40个循环，72℃10min，采用Perkin Elmer公司的Gene Amp 480/9600System)。得到的PCR产物用电泳展开，将被转化的Gene Screen plus用DNA印迹杂交法确定目的区带，再用低融点琼脂(LMA)进行电泳，展开PCR产物，提取出有信号的区带，克隆进pGEM-T或pGEM-T easyvector(Promega)，确定其碱基序列。

6水稻(Gulfmont)cDNA/p SPORT-T文库或水稻(篁地锦)cDNA/p

BS SK(-)/λZAP II文库的筛选

将GIBCO BRL公司之品牌水稻(CV.Gulfmont)叶片cDNA文库和以前使用过的λZAP II/水稻cDNA文库转化p BS SK(-)质粒，得到的水稻(篁地锦)cDNA/p BS SK(-)/λZAP II文库，用稀释PCR法筛选([Mg²⁺]＝1.0mM，93℃，1min，《93℃，1min，60℃1min，72℃1.5min》X 40个循环，72℃10min，采用Perkin Elmer公司的Gene Amp480/9600 System)。为了解原液状态下(5×10⁹大肠杆菌/ml)目标质粒(CPD光复活酶的 cDNA)的含有率，制备10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7和10^-1的稀释液各5ml，分别培养、扩增到静止期，抽提质粒并进行PCR。5ml 10^-6的稀释液中不含目标质粒，5ml 10^-5类稀释液中含有1～9个质粒。将出现质粒的最后一个稀释度10^-5的培养液再分成10分(#1～10)，分别培养到静止期使质粒扩增，再用PCR抽提质粒(图3)。#1和#3中含有10倍于原始液体的目标质粒。将出现质粒的最高稀释度的培养液进行与原液同样的操作，反复操作到只有一个克隆为止。

结果与讨论

(1)混合引物的构建

现在已经从各种生物中分离到光复活酶。它们与植物的蓝色感受体基因、人类掌管昼夜节律性的基因具有相似性，成为一个族群(图4)，根据氨基酸序列的不同又可以分成两个类群。虽然有一些例外，但大肠杆菌等微生物属于第一群，高等真核生物属于第二群。植物中已经分离出光复活酶的拟南芥和绿藻属于第二群。因为我们本次作为实验对照的水稻属于高等真核生物，光复活酶的氨基酸序列与拟南芥和绿藻相近，估计应属于第二群。因此比较拟南芥和绿藻的氨基酸序列，根据5个相似性高的区域合成了引物(图2)。为了与决定一个氨基酸的多种密码子相对应，这个引物便是全部含有与这5个区域的氨基酸序列相对应的碱基序列的混合引物。通过从这5个引物组成的可以认为是完全组合的引物进行的PCR，如果以引物为依据的氨基酸序列与本实验采用的光复活酶一级结构具有相同的序列，因为基因组DNA中存在与其相对应的碱基序列，用PCR扩增确定它们之间的碱基序列，从理论上说是可行的。

(2)以水稻基因组DNA为模板进行PCR

图5表示的是使用上述引物实际的操作。以水稻基因组DNA为模板，用AC1～5引物进行PCR的实验设计。AC1-2等表示引物的组合：AC1-2表示用AC1和AC2引物获得的水稻基因组中编码CPD光复活酶的密码区。结果表明，AC2和AC4相组合的引物获得大约1.1kbp，AC3和AC4相组合的引物大约600bp大小的DNA片段。由图中可见，600bp的片段不能扩增到1.1kbp大小，AC2-4之间，是拟南芥(735bp)和绿藻(732bp)，AC3-4之间是拟南芥的127个氨基酸残基(381bp)，绿藻也同样是127个氨基酸残基(381bp)。由于基因组序列间有内含子插入，可以估计它们的序列长度会更长，所以1.1kbp片段和600bp片段有可能是所需要的目的片段。同时，采用其它引物，即使改变温度或Mg²⁺浓度，也完全得不到PCR产物。把这些PCR产物克隆到pGEM-T vector(CLONTECH)中，确定用AC2-4获得的1.1kbp片段和用AC3-4获得的600bp片段的序列，并转换为氨基酸，再和拟南芥的光复活酶的氨基酸序列相比较，发现从1.1kbpDNA片段得到的氨基酸序列有高度相似性(图6)。而600bp的片段则如前所述，在PCR中几乎没有扩增，据认为，这可能由于引物类似构成基础的氨基酸序列发生了退火，扩增的只是它的背景序列。

(3)水稻cDNA文库的筛选

为了得到没有内含子的cDNA片段，从1.1kbp序列中显示与拟南芥CPD光复活酶高度相似的部分构建引物(图6下限部)。用这种引物以水稻cDNA为模板进行PCR(93℃，1min，《93℃，1min，55℃1min，72℃1.5min》X 40个循环，72℃10min，采用Perkin Elmer公司的Gene Amp System)，得到600bp的片段。与基因组DNA一样，确定其序列，再转换为氨基酸，将此序列与拟南芥CPD光复活酶的序列相比较，确认在与基因组DNA之1.1kbp相同的区域有高度的相似性。再用这种cDNA片段作为探针，通过与作为600bp模板基础的λZAP II/水稻cDNA文库形成噬菌斑，用DNA印迹杂交法筛选，并重复数次。结果从约20万个噬菌斑中获得2个候补目的物。确定这两个被包装噬菌斑的DNA碱基序列后，得知两者序列相同，探针的600bp序列就是1.1kbp片段的5’端直向3’端发生部分缺失而成的(图7)。这种5’端的缺失，可认为是由于制备cDNA时，在它的模板mRNA转录为cDNA之前，被附着在器皿上的RNase分解所致。同时由于这种分解是不均一的，在cDNA文库中除含有全长的片段外，还含有5’发生序列缺失而形成的不同长度的片段。此次用噬斑杂交获得了1.1kbp的片段，再进行同样实验，还可能得到更接近全长的片段。但是，后来用这个文库进行的几次实验，并没有能得到。

(4)水稻基因组DNA的基因组步查法

由于从cDNA文库的技术路线存在上述困难，我们采用了基因组步查法。用这种方法不容易引起cDNA分解。在“材料与方法”中已经叙述，水稻基因组用4种限制性内切酶(Dra I，EcoR V，Stu I，Pvu II)处理，再连接上接头(Genome Walker文库：CLONTECH)。将此样品作为模板，用与连接了接头的引物构建的完全配对的引物进行PCR。其结果，用Pvu II处理过的文库作模板，用与GSP4连接的接头作引物进行PCR，得到多个DNA片段。在这多种PCR产物中，用DNA印迹杂交法在500bp附近挑取所需要的目的片段，将其克隆并确定其序列。结果在5’端尽管只有100bp，却是未知的部分(转换为氨基酸后没有看出与该CPD光复活酶的相似性)。除用经Pvu II处理的文库外，用其它文库通过DNA印迹杂交也未能取得更好的结果。

(5)异种水稻cDNA文库的筛选

如前所述，在水稻(篁地锦)的λZAP II/水稻cDNA文库中，只不过得到5’端缺失的片段。为此，由其它途径构建了p SPORT-T/水稻(Gulfmont)cDNA文库，并进行了筛选。Gulfmont品种的水稻原产美国，没有检测过光复活酶的活性。筛选用稀释PCR法，以已知片段的扩增为指标(图3)。首先，将文库的原液按10^-1比例稀释，经培养后抽提质粒，进行PCR。取出现阳性带的最高稀释度的培养液十等分后再培养。通过此操作再10个培养试管中出现含有或不含所需目的质粒的试管。将此十等分的培养液再进行十倍稀释，由于没有再出现阳性带的，理论上全部试管都不会呈阳性。分别从十支试管中抽提质粒，进行PCR。由于出现阳性带的试管排除了其没有包含的部分，所以比原液含有更多所需的目的基因。重复此操作浓缩目的基因，可以挑取出1个质粒。利用这一操作，得到了大约1.8kbp的含有插入序列的质粒。确定这个片段的碱基序列，与已经确定的篁地锦的cDNA序列作比较，结果显示其相似性为99.5％。但是，如果转换呈氨基酸，则发现在篁地锦序列的某个位置插入了4bp的碱基，这样便引起了移码变异。但是，减除这部分，再变换为氨基酸序列，则显示与拟南芥CPD光复活酶的氨基酸序列有高度的相似性(图8)。

进一步以根据λZAP II/水稻cDNA文库构建的篁地锦Cdna/pBS SK(-)文库为模板，用上述稀释PCR法进行筛选，从光复活酶野生型的篁地锦克隆编码光复活酶的基因。得到编号为2的碱基序列(1521个碱基对)，该碱基对编码的蛋白质的氨基酸序列用编号为1的序列(506个氨基酸残基数)表示。

(6)CPD光复活酶基因的光复活能力的实证

为了进一步证明借助本发明获得的篁地锦CPD光复活酶基因的光复活能力，进行了以下实验。首先预备大肠杆菌DNA修复能力缺陷型菌株NKJ3002，用紫外线照射该菌株。由于NKJ3002菌株不能修复因紫外线照射形成CPD、6-4加成物而发生的DNA损伤，存活率随照射剂量增加而减少。又因为该菌株缺失了大肠杆菌的光复活基因，在照射紫外线后即使再照射可见光，也和不照射可见光时一样看不出任何变化。将调节篁地锦的CPD光复活酶基因使其可以表达的质粒导入该菌株中，进行同样的实验。结果观察到该菌株在紫外线照射后再照射可见光时，存活率有很大增加。篁地锦的CPD光复活酶基因可以弥补缺失光复活基因的大肠杆菌对紫外线的敏感性。亦即证明了篁地锦的CPD光复活酶基因的产物(在本发明中是光复活酶)具有不容置疑的光复活活性。

工业适用性

如前所述，水稻中有紫外线耐受性品种(篁地锦)和敏感品种(农林1号)。在系统上颇为相近的这两个品种的CPD光复活活性的差异目前尚未阐明。然而，通过用本发明获得的新型基因及其cDNA片段进行RNA印迹杂交，可以比较这两个品种的CPD光复活酶的mRNA的转录量(酶的表达量)。而且水稻的光复活活性，在水稻发芽(长出叶片)后照射可见光而得到增强，当叶片完全展开时达到最高位。光复活活性受光环境的诱导因植物之不同而不同，如前所述，水稻是随可见光照射而增强，而拟南芥是由紫外线所诱导。因此，植物光复活活性受光环境诱导的机理还有许多不了解的地方。不过，利用本次得到的基因及其cDNA片段，在不同光环境和植物的不同生长阶段进行RNA印迹杂交，可以预期将能够提供一种手段，以便了解水稻因不同光环境的作用而在各生长阶段受到的影响。

另外，利用本发明得到的基因，有可能进行与光复活酶缺陷型大肠杆菌的互补性实验，还可以实现酶的结晶化和制备出抗体。同时，用这种抗体通过原位杂交手段观察CPD光复活酶在植物细胞中的分布，这样也能够了解它和核外DNA(线粒体和叶绿体中)的关系。通过导入基因的技术，又可以赋予对紫外线敏感品种(例如农林1号)以紫外线耐受性，进行互补性试验，还可能在紫外线耐受性品种中培育出CPD光复活酶表达量更强的品种，因而具有在将来因臭氧层破坏而紫外线大量降临的环境下稳定生产的可能性。

序列表

<110>独立行政法人科学技术振兴机构

(Japan Science and Technology Agency)

<120>利用可见光修复紫外线损伤的DNA的酶基因

(Rice gene encoding photolyase that repairs ultraviolet DNA lesions

using visible light)

<130>SCT040802-47

<150>JP2001-320138

<151>2001-10-18

<160>2

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>506

<212>PRT

<213>水稻(Oryza Sativa)

<400>2

Met Pro Pro Thr Ser Val Ser Pro Pro Arg Thr Ala Pro Gly Pro Ala

1 5 10 15

Asn Pro Ser Pro Ala His Pro Ser Arg Val Arg Val Ile His Pro Gly

20 25 30

Gly Gly Lys Pro Gly Gly Pro Val Val Tyr Trp Met Leu Arg Asp Gln

35 40 45

Arg Leu Ala Asp Asn Trp Ala Leu Leu His Ala Ala Gly Leu Ala Ala

50 55 60

Ala Ser Ala Ser Pro Leu Ala Val Ala Phe Ala Leu Phe Pro Arg Pro

65 70 75 80

Phe Leu Leu Ser Ala Arg Arg Arg Gln Leu Gly Phe Leu Leu Arg Gly

85 90 95

Leu Arg Arg Leu Ala Ala Asp Ala Ala Ala Arg His Leu Pro Phe Phe

100 105 110

Leu Phe Thr Gly Gly Pro Ala Glu Ile Pro Ala Leu Val Gln Arg Leu

115 120 125

Gly Ala Ser Thr Leu Val Ala Asp Phe Ser Pro Leu Arg Pro Val Arg

130 135 140

Glu Ala Leu Asp Ala Val Val Gly Asp Leu Arg Arg Glu Ala Pro Gly

145 150 155 160

Val Ala Val His Gln Val Asp Ala His Asn Val Val Pro Val Trp Thr

165 170 175

Ala Ser Ala Lys Met Glu Tyr Ser Ala Lys Thr Phe Arg Gly Lys Val

180 185 190

Ser Lys Val Met Asp Glu Tyr Leu Val Glu Phe Pro Glu Leu Pro Ala

195 200 205

Val Val Pro Trp Asp Arg Glu Gln Pro Glu Gly Val Asp Trp Asp Ala

210 215 220

Leu Ile Ala Arg Val Cys Ser Glu Ala Glu Asn Val Pro Glu Ile Asp

225 230 235 240

Trp Cys Glu Pro Gly Glu Glu Ala Ala Ile Glu Ala Leu Leu Gly Ser

245 250 255

Lys Asp Gly Phe Leu Thr Lys Arg Ile Lys Ser Tyr Glu Thr Asp Arg

260 265 270

Asn Asp Pro Thr Lys Pro Arg Ala Leu Ser Gly Leu Ser Pro Tyr Leu

275 280 285

His Phe Gly His Ile Ser Ala Gln Arg Cys Ala Leu Glu Ala Lys Lys

290 295 300

Cys Arg His Leu Ser Pro Lys Ser Val Asp Ala Phe Leu Glu Glu Leu

305 310 315 320

Val Val Arg Arg Glu Leu Ala Asp Asn Phe Cys Tyr Tyr Gln Pro Gln

325 330 335

Tyr Asp Ser Leu Ser Gly Ala Trp Glu Trp Ala Arg Lys Thr Leu Met

340 345 350

Asp His Ala Ala Asp Lys Arg Glu His Ile Tyr Thr Arg Glu Gln Leu

355 360 365

Glu Asn Ala Lys Thr His Asp Pro Leu Trp Asn Ala Ser Gln Leu Glu

370 375 380

Met Val His His Gly Glu Met His Gly Phe Met Arg Met Tyr Trp Ala

385 390 395 400

Lys Lys Ile Leu Glu Trp Thr Ser Gly Pro Glu Glu Ala Leu Ser Thr

405 410 415

Ala Ile Tyr Leu Asn Asp Lys Tyr Glu Ile Asp Gly Arg Asp Pro Ser

420 425 430

Gly Tyr Val Gly Cys Met Trp Ser Ile Cys Gly Leu His Asp Gln Gly

435 440 445

Trp Lys Glu Arg Pro Val Phe Gly Lys Ile Arg Tyr Met Asn Tyr Ala

450 455 460

Gly Cys Lys Arg Lys Phe Asp Val Asp Ala Tyr Ile Ser Tyr Val Lys

465 470 475 480

Arg Leu Ala Gly Gln Ser Lys Lys Arg Asn Ala Glu Glu Ser Pro Asn

485 490 495

Pro Val Val Lys Leu Ser Lys Ser Gln His

500 505

<210>2

<211>1521

<212>DNA

<213>水稻(Oryza Sativa)

<400>1

atgccgccga cctcagtgag cccaccaaga acagcgccgg ggccggcgaa cccgagcccg 60

gcacacccgt cccgcgtgcg ggtgatccac ccgggcggcg ggaagcccgg tgggccggtg 120

gtgtactgga tgctgcggga ccagcggctc gccgacaact gggcgctcct ccacgccgcc 180

ggcctcgccg ccgcctccgc gtccccgctc gccgtcgcgt tcgcgctgtt cccgaggccc 240

ttcctcctct ccgcccgccg ccgccagctc gggttcctcc tccgcggcct ccgccgcctc 300

gccgccgacg ccgccgcccg ccacctcccc ttcttcctct tcaccggtgg gcccgcggag 360

atcccggcgc tggtgcagcg ccttggtgcg tcgacgctgg tcgccgactt ctcgccgctg 420

cggccggtga gggaggcgct cgacgcggtg gtcggcgacc tgcggcggga ggcgcccggt 480

gtggccgtgc accaggtgga cgcgcacaac gtggtgcctg tgtggacggc gtcggcgaag 540

atggagtatt cagccaagac cttcagaggc aaggtgagca aggtgatgga tgagtacctt 600

gtggagttcc ctgaattgcc ggcggtggtg ceatgggaca gggagcagcc ggagggggtc 660

gactgggacg cactcatcgc cagggtttgc agtgaggcgg agaatgtgcc ggagattgac 720

tggtgtgagc ctggagagga agcagceata gaggcgcttc tcggcagcaa ggatggattc 780

ctgacgaaga ggatcaagag ctatgaaact gaccggaatg atcccacgaa accacgggca 840

ttgtctgggc tttcaccata ccttcatttt gggcacattt cggcacagcg gtgtgcgctc 900

gaggcaaaga aatgccgaca tcttagtccc aagtccgtcg atgctttctt ggaggaattg 960

gttgtaagga gggaattagc tgacaacttc tgctattacc aacctcaata tgattcgctg 1020

tctggtgcat gggaatgggc aaggaagaca ctgatggatc atgctgctga taaaagagag 1080

catatctata cgagggaaca gcttgagaat gccaaaacac atgatccttt gtggaatgca 1140

tcgcagttgg agatggttca ccatggagaa atgcatggat tcatgagaat gtactgggcc 1200

aaaaagattc tagaatggac tagtggacca gaagaagcac tttcaactgc aatttattta 1260

aatgacaagt atgagataga tggcagggac cccagtggtt acgtcggatg tatgtggtcc 1320

atatgtggcc tccatgatca gggttggaag gagcgtccag tatttggaaa gatacgttac 1380

atgaattacg ctggctgcaa gagaaaattc gatgttgacg cttacatttc ttatgtcaag 1440

agattagctg gtcaatccaa gaagaggaac gctgaggagt ctccaaatcc tgtagtcaag 1500

ctttccaagt ctcagcacta a 1521

Claims

1.编码源自水稻的光复活酶的基因。

2.根据权利要求1所述的基因，其编码嘧啶二聚体光复活酶。

3.根据权利要求1或2所述的基因，其源自紫外线耐受品种。

4.根据权利要求1～3所述的基因，其中水稻是篁地锦。

5.根据权利要求1所述的基因，其中水稻是Gulfmont。

6.含有编码下述(a)或(b)蛋白质的碱基序列的基因：

(a)编号为1的序列中，从N端起第174个到第506个为止所表示的氨基酸序列构成的蛋白质

(b)氨基酸序列(a)中缺失、置换或添加一个到几个氨基酸而形成的氨基酸序列组成的具有光复活酶活性的蛋白质。

7.含有下述(a)或(b)中的DNA的基因：

(a)编号为2序列所表示的碱基序列中，由第529个到第1521个碱基对组成的DNA。

(b)由碱基序列(a)组成的DNA与严格条件下发生杂交，并编码有光复活酶活性蛋白质的DNA。

8.编码下述(a)或(b)蛋白质的基因：

(a)编号为1序列所表示的氨基酸序列组成的蛋白质。

9.含有下述(a)或(b)中的DNA的基因

(a)编号为2序列所表示的碱基序列组成的DNA。

10.根据权利要求1～9任一项所述的基因的制备方法，其中通过反复操作稀释PCR方法，从水稻基因文库筛选到的。

11.根据权利要求10所述的方法，其中水稻基因文库为cDNA文库。

12.根据权利要求11所述的方法，其中水稻为篁地锦或Gulfmont。

13.重组表达载体，其中含有权利要求1～9任一项所述的基因。

14.根据权利要求13所述的重组表达载体，其是λ噬菌体。

15.根据权利要求13所述的重组表达载体，其是质粒载体。

16.用权利要求13、14或15中所述的表达载体转化而成的转化子。

17.根据权利要求16所述的转化子，其中转化子为植物。

18.根据权利要求17所述的转化子，其中转化子为水稻。

19.根据权利要求16所述的转化子，其中转化子为大肠杆菌。

20.赋予或增强该宿主紫外线耐受性的方法，其是利用权利要求1～9任一项所述的基因转化宿主。

21.根据权利要求20所述的方法，其中宿主为植物。

22.根据权利要求21所述的方法，其中植物为水稻。

23.根据权利要求22所述的方法，其中水稻是对紫外线敏感的品种。

24.根据权利要求23所述的方法，其中对紫外线敏感的品种是指农林1号。

25.在水稻中筛选光复活酶基因表达量的方法，其特征是利用权利要求1～9任一项所述的基因或它们的DNA片段。

26.测定在水稻中筛选光复活酶基因转录为mRNA的转录量的方法，其是利用权利要求1～9任一项所述的基因或它们的DNA片段作为探针进行RNA印迹杂交。

27.根据权利要求25或26所述的方法，其中水稻是指紫外线耐受性和/或紫外线敏感品种。

28.由权利要求1～9任一项所述的基因编码的多肽或蛋白质。

29.根据权利要求28所述的多肽或蛋白质，其具有光复活酶活性。

30.制备编码源自植物的光复活酶基因的方法，其中根据至少两种已知光复活酶的氨基酸序列中有高相似性的部分制备第一种引物，以植物基因组为模板，用该第一种引物PCR法，克隆出第一个DNA片段；再根据第一个DNA片段与拟南芥的光复活酶的氨基酸序列中相似性高的部分制备第二种引物，用该植物基因文库为模板，用第二种引物PCR法克隆出第二个DNA片段，以第二个片段为探针，借助核酸杂交方法克隆目的基因。

31.根据权利要求30所述的方法，其中已知光复活酶是指拟南芥和绿藻的光复活酶。

32.根据权利要求30、31所述的方法，其中植物基因文库是指cDNA文库。

33.根据权利要求30、31或32中任一项所述的方法，其中核酸杂交方法是噬斑杂交法。

34.根据权利要求30至33任一项所述的方法，其中植物是水稻。

35.根据权利要求30所述的方法，其中基因为权利要求1～9中任何一项所述的基因。