KR101451834B1 - 이온화에너지원 표지 유전자 OsUNP2 및 이를 이용한 형질전환 지표식물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이온화에너지원 표지 유전자로서 OsUNP2 유전자, 상기 방사선 표지 유전자를 이용한 이온화에너지원 검출용 키트, 상기 방사선 표지 유전자를 이용한 과발현(Over-expression) 벡터, 상기 벡터로 형질 전환한 식물체 및 상기 형질전환 식물체를 이용한 방사선 노출 여부 확인방법에 관한 것이다. 　　

Description

이온화에너지원 표지 유전자 OsUNP2 및 이를 이용한 형질전환 지표식물{Marker Gene OsUNP2 for Detecting Ionizing Energy and Transgenic Indicator Plant Using the Same}

본 발명은 이온화에너지원 표지 유전자 OsUNP2및 이를 이용한 형질전환 지표식물에 관한 것이다.

보다 구체적으로 본 발명은 이온화에너지원 표지 유전자로서 OsUNP2유전자, 상기 방사선 표지 유전자를 이용한 이온화에너지원 검출용 키트, 상기 방사선 표지 유전자를 이용한 과발현(Over-expression) 벡터, 상기 벡터로 형질 전환한 식물체 및 상기 형질전환 식물체를 이용한 방사선 노출 여부 확인방법에 관한 것이다. 　　

방사선이 생명체에 미치는 영향에 대한 연구는, 1927년 Muller가 연구한 초파리 실험에서 방사선에 의해 돌연변이가 일어난다는 사실이 밝혀지면서 시작되었다. 이 후 1928년 Stidler가 방사선을 보리에 처리하면서 인위적으로 돌연변이가 일어 날 수 있다는 사실을 밝혀내면서 방사선이 식물에 미치는 영향에 대한 연구가 시작되었으며, 현재까지 벼, 보리, 밀 등 다양한 작물에 방사선이 미치는 영향에 대한 연구가 지속적으로 진행되고 있다.

방사선에 의한 고등 식물에서의 돌연변이 연구에 따르면, 방사선은 DNA의 염기나 당의 결합, DNA와 DNA, DNA와 단백질간의 결합에 영향을 주거나, 단일 또는 이중가닥을 끊으며 역위, 전좌, 결손 등을 일으켜 유전자 이상을 나타내게 된다(Forey et al. 1997; Belli et al. 2002). 또한 방사선 에너지가 식물체 내의 물에 흡수하면서, 물 분자들이 전리되어 유리기를 발생하고 DNA가 이러한 이온 라디칼 또는 유리 라디칼 등과 상호작용을 일으켜 돌연변이가 발생하게 된다(Calucci et al. 2003; Lee et al. 2009; Roldan-Arijona and Ariza 2009).

방사선이 유전체에 미치는 영향에 관한 연구는 체르노빌 사건과 구소련 주변 국가 등지의 방사능 오염으로 인하여, 인간, 동물, 식물에 대한 방사능의 유전체 내 독성 영향 평가(genotoxic effect)에 많은 관심을 갖게 되었고, 근래에 일본 후쿠시마 원전 사고로 그 관심이 더욱 증대되었다. 　　　　　　　

　그 동안 식물체에　다양한 이온화에너지원의 조사와 이로 인한 생육, 생리, 유전적 변화에 대해 연구된 결과가 없다. 방사선 지표 식물로 활용하는 자주 달개비의 수술 세포 색 변이를 이용한 이온화에너지와 환경스트레스에 관한 연구가 이루어 진바 있지만, 이는 이온화에너지 노출 여부에만 초점이 맞추어져 있으며 식물 유전자 수준에서의 대단위 검정과 방사선에 반응하는 유전자나 이와 관련된 신호 전달 연구는 동물 모델에만 제한되어 이루어졌다.

이온화에너지는 크게 고 LET (Linear Energy Transfer)인 이온빔, α선과 중성자선과 저 LET인 X선과 γ선, 우주선과 같은 복합방사선 등으로 구분된다(Tanaka et al. 1999).

이와 같이 다양한 이온화에너지 중에서, 현재까지의 연구는 주로 저 LET에 의한 돌연변이 유도가 주를 이루었으며, 본원발명자들 또한 종전에 감마선에 의한 돌연변이 유도 및 유전자 발현 변화 연구를 수행한 바 있다.

이와 관련하여, 대한민국 공개특허공보 제10-2013-0037785호는 쌍자엽 식물인 애기장대를 대상으로 저 LET인 감마선 조사에 따른 유전자 발현의 영향을 조사하고, 그 결과 발현이 상향 조절되는 특정 유전자 및 그 유전자를 녹다운 시킨 애기장대에 관하여 개시하고 있다. 그러나, 상기 특허문헌에 개시된 유전자는 감마선에 대해서만 발현 변화가 확인된 것으로서, 다양한 이온화에너지 중 오직 감마선만을 검출할 수 있는 표지 유전자라는 점에서 한계가 있다.

따라서, 저 LET뿐만 아니라, 고 LET 및 복합방사선을 비롯한 다양한 이온화에너지에 대한 표지 유전자 및 지표 식물에 대한 요구가 여전히 존재한다.

최근 고 LET인 이온빔에 의한 돌연변이의 발생범위(Mutation spectrum)가 넓으며, 그 발생빈도(Mutation frequency) 또한 높다는 보고가 있으면서, 고 LET 선원을 이용한 연구에도 많은 관심이 집중되고 있다(Kaxama et al. 2008). 또한, 복합방사선 및 우주선과 관련하여, 최근 중국의 무인 육종 우주선을 비롯한 미국과 러시아의 우주정거장을 활용하여 우주 환경에 식물 종자를 노출시킨 우주 육종 연구 기법이 보고되고 있다. 우주는 양성자, 중이온, 감마선 등의 복합 방사선과 미소중력, 극고, 저온 등 다양한 환경적 영향이 식물 유전자의 변이를 유도하는 것으로 알려져 있다(Bao et al. 2006; Li et al. 2007).

한편, 벼는 우리나라는 물론 전 세계 인구의 반 이상이 주식으로 하는 중요한 식량 작물이다. 벼는 n=12 염색체인 이배체 식물로 게놈의 크기가 280~430mb로 비교적 작아 유전체 연구에 용이하다. 또한 유전체의 구성이 다른 작물과 높은 상동성을 보이며, 염색체 상의 유전자 배열이 유사하여 단자엽 식물의 모델로 많은 연구에 이용되고 있다(Jwa et al. 2006).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 공개특허공보 제10-2013-0037785호

본 발명자들은 저 LET뿐만 아니라, 다양한 종류의 이온화에너지원 누출 여부를 정확히 판단할 수 있는 이온화에너지원 표지 유전자 및 이를 이용한 이온화에너지원 지표 식물의 개발을 위하여 연구 노력하였다.

이를 위하여, 본 발명자들은 마이크로어레이(Microarray) 기술을 이용하여 다양한 이온화에너지원에 반응하는 단자엽 식물체 유전자 발현 프로파일(profiling)을 작성하고, 이온화에너지원 조사에 의하여 발현이 변화하는 수천 개에 달하는 유전자를 선별한 후, 상기 유전자들의 방사선 반응성을 규명하는 과정에서, 놀랍게도 특정 유전자가 저LET(Linear Energy Transfer), 고LET, 복합방사선 및 우주선 등의 다양한 이온화에너지원 모두에 반응하여 그 발현이 특히 매우 유의적으로 하향 조절된다는 점을 밝혀내기에 이르렀다. 더 나아가, 본 발명자들은 이와 같은 예기치 못한 놀라운 발견에 기초하여, 상기 유전자를 이종의 식물체 내에 도입한 형질전환 식물체를 성공적으로 제조해 내고, 실제로 식물 생태계 방사선 노출 여부에 대한 검지 가능성을 명확히 밝혀 냄으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은, 다양한 이온화에너지원에 매우 유의적으로 반응하는 상기 지표 유전자를 사용하여 형질전환된 식물체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환된 식물체를 사용하여 이온화에너지원 누출 여부를 판정하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 이온화에너지원 지표 유전자 또는 그의 단편 등을 포함하는 이온화에너지원 검출용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 이온화에너지원 검출용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 키트를 사용하여, 이온화에너지원 누출 여부를 판정하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 하나의 관점은, 이온화에너지원 지표 유전자 OsUNP2(Os12g0465000, Unknown protein)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

이온화에너지원 지표 유전자 OsUNP2

본 발명자들은 마이크로어레이(Microarray) 기술을 이용하여 다양한 이온화에너지원에 반응하는 단자엽 식물체 유전자 발현 프로파일(profiling)을 작성하고, 이온화에너지원에 반응하여 그 발현이 현저하게 감소하는 유전자로서 OsUNP2(Os12g0465000, Unknown protein) 유전자를 선별한 후, 상기 유전자의 방사선 반응성을 규명하였다.

본 발명의 OsUNP2 유전자는 서열목록 제1서열로 표시되며, 바람직하게는 벼(Oryza sativa)의 유전자일 수 있다.

OsUNP2유전자는 저LET(Linear Energy Transfer), 고LET, 복합방사선 또는 우주선으로부터 선택되는 이온화에너지원 모두에 반응하여 그 발현이 매우 유의한 수준으로 변화하며, 특히 감마선, 이온빔 및 우주선 모두에 반응하여, 그 발현이 현저하게 감소되는 것을 특징으로 한다.

이와 같이, OsUNP2유전자는 저LET(Linear Energy Transfer), 고LET, 복합방사선 및 우주선 모두에 반응하여 그 발현이 현저하게 감소되므로, 이를 활용하는 경우 다양한 이온화에너지원의 누출 여부를 간단하게 판명할 수 있다.

형질전환용 재조합 벡터

형질전환용 재조합 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있는 벡터이며, 발현 벡터는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 형질전환 식물체를 제조하기 위하여 사용할 수 있는 식물 발현 벡터의 예로는, 아그로박테리움과 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터가 있다(EP 0116718 B1에 기재된 Ti-플라스미드 벡터의 경우 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 데에 이용되고 있다). 또한, EP 0120516 B1 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터도 본 발명의 형질전환 식물체를 제조하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 OsUNP2유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터로는, 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터 등이 있으며, 이러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 사용될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.　

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 벡터는 (i) OsUNP2유전자의 뉴클레오타이드 서열에 연결되어 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터 및 (ii) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 포함할 수 있으며, 또한 추가적으로 (iii) 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수도 있다.

본 발명의 벡터에 포함될 수 있는 프로모터로는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 사용할 수 있는데, 예컨대, 콜리플라우어 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제(nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터,　콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트(ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 쌀 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제(TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(APRT) 프로모터 또는 옥토파인 신타아제 프로모터 등을 사용할 수 있지만, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터에 포함될 수 있는 3'-비-해독화 부위로는, 아그로박테리움 튜머페이션스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (nos 3' end) (Bevan et al., Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분 또는 CaMV 35S 터미네이터 등이 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터에 포함될 수 있는 선택성 마커로는, 통상 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로서, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있게 하는 모든 유전자가 이에 해당되며, 그 예로는 글리포세이트(Glyphosate) 또는 포스피노트리신(Phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되지 않는다.

형질전환 숙주식물체

본 발명의 형질전환 식물체는 상술한 식물발현용 재조합 벡터를 숙주 특정 식물 세포로 도입하여 제조된다.

본 발명의 유전자 OsUNP2는 본래 단자엽 식물 내에서 발현되는 유전자이므로, 자연상태에서 유전자 OsUNP2를 발현하는 단자엽 식물, 예컨대 wild type 벼 자체를 이온화에너지 검출용 지표 식물로 사용하는 것도 가능하며, 이러한 발명적 사상 또한 본 발명의 권리범위에 속한다.

다만, 본 발명자들은 벼와 같은 단자엽 식물의 라이프 사이클이 상대적으로 긴 관계로, 상기 지표 유전자를 라이프 사이클이 더 짧고, 재배가 용이한 다른 식물체 내에 도입하여, 보다 간편하게 이온화에너지 검출할 수 있는 형질전환 지표 식물체를 제공하기 위하여 연구 노력하였다.

그 결과 실제 상기 유전자를 이종의 식물체 내에 도입한 형질전환 식물체를 성공적으로 제조해 내고, 제조한 형질전환 식물체를 사용하여 방사선 노출 여부에 대한 검지 가능성을 명확히 밝혀 냄으로써, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명에 있어서, OsUNP2유전자를 과발현 시키기 위한 숙주 식물세포는 특정 식물의 것에 한정되지 아니한다는 것은 당업자에게 자명하게 이해될 것이다.

다만, 본 발명에 따른 OsUNP2유전자를 과발현 시키기 위한 재조합 벡터는 상기 유전자를 "식물" 숙주 세포 내에 도입시키기 위하여 설계된 것이므로, 숙주세포로는 식물세포를 사용하여야 한다.

일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 OsUNP2유전자를 과발현 시키기 위한 숙주 식물 세포로서, 재배가 용이하고 지표 식물로서 활용하기에 적합한 것이라면 제한 없이 사용할 수 있는데, 예컨대 애기장대, 담배, 벼 등을 사용할 수 있다

바람직한 구현예에 따르면, 자연 상태에서는 OsUNP2유전자를 가지고 있지 않은 식물로서, 라이프 사이클이 짧고 재배가 용이한 식물을 숙주식물로서 사용하는 것이 좋으며, 예컨대 애기장대의 세포를 숙주세포로서 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 식물세포에 유전자를 도입하는 방법은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있는데, 예컨대 아그로박테리움(Agrobacterium) 매개방법, 유전자총(gene gun) PEG를 이용한 방법 또는 전기천공법(electroporation) 등을 사용할 수 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

이들 방법의 형질전환 효율은 각각 다양하여, 입자총에 의한 DNA 도입의 경우에는 일반적으로 소수의 세포들에만 유전자가 도입되며 전사를 위하여 DNA가 세포의 핵 내에 도달해야만 기능을 수행하게 된다. 이 방법은 stable transformation에 앞서서 재조합 단백질의 안정성 검사에 사용할 수 있지만 재조합 단백질의 대량 발현을 위해서는 부적당하다. 아그로인필트래이션법은 입자총보다 많은 세포들에 유전자가 도입될 수 있는데, 대상유전자를 포함하는 T-DNA가 몇 가지 세균 단백질들의 도움으로 능동적으로 핵 내에 도입된다. 이 방법 또한 도입된 T-DNA가 숙주세포의 염색체로 통합(integration)되어 지속적으로 발현되는 것이 아니고, 핵 내에 존재하여 대상유전자의 transient expression을 나타내는 것으로 단백질 안정성과 기능의 특성을 조사하기에 충분한 양의 단백질을 신속하게 확보하기에 적당하다. 그리고 바이러스벡터를 이용한 방법은 viral plant pathogene의 게놈에 외래 유전자를 도입하여 강한 프로모터의 조절을 받도록 하는 것으로, 외래 유전자를 포함한 재조합 viral vector를 식물에 감염시키면 도입된 유전자는 식물의 바이러스 복제 과정 중에 고효율로 함께 증폭된 후 발현이 이루어져 외래 단백질을 생산하게 된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 숙주 식물 세포로의 재조합 벡터 도입은 아그로인필트래이션법에 의하여 수행될 수 있다.

본 발명의 형질전환 식물체는, 당업계의 통상적인 방법인 유성번식 방법 또는 무성번식 방법을 통해 번식시킬 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 식물체는 꽃의 수분과정을 통하여 종자를 생산하고 상기 종자로부터 번식하는 과정인 유성번식을 통해 수득할 수 있다.

일 구현예에 따르면, 본 발명의 OsUNP2유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정인 무성번식 방법을 통해 수득할 수도 있다. 구체적으로, OsUNP2유전자가 포함된 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 당업계에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음, 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양하는 방법을 사용할 수 있다. 약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도하고, 뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 발생 또는 분화가 촉진된 식물을 수득할 수 있다. 본 발명에서 형질전환 식물은 전체 식물체뿐만 아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 관점은 i) 본 발명의 형질전환 식물체를 이온화에너지원 누출이 의심되는 곳에 노출시키는 단계; ii) 상기 노출시킨 형질전환 식물체에서 OsUNP2유전자 발현양을 측정하는 단계; 및 iii) 상기 발현양을 이온화에너지원에 피폭되지 않은 동일한 형질전환 식물체에서의 발현양과 비교하는 단계를 포함하는, 저LET, 고LET, 복합방사선 또는 우주선으로부터 선택되는 이온화에너지원 누출 여부를 판정하는 방법을 제공하는데 있다.

본 방법은 저LET, 고LET, 복합방사선 및 우주선 모두에 특이적으로 반응하여 그 발현이 하향 조절되는 OsUNP2유전자로 형질전환된 식물체를 사용하므로, 다양한 종류의 이온화에너지원 누출 여부를 단 한번에 판단할 수 있다는 장점이 있다.

예컨대, 본 발명의 형질전환 식물체를 이온화에너지원 누출이 의심되는 곳에 노출시키고, 상기 식물체로부터 OsUNP2유전자의 발현양을 측정하고, 이를 피폭되지 않은 동일한 대조군 식물체에서의 발현양과 비교한 결과 실질적인 발현양의 차이가 감지되지 않는다면, 저LET(Linear Energy Transfer), 고LET, 복합방사선 및 우주선 모두가 누출되지 않았다는 것을 단 한번에 판단할 수 있다는 장점을 제공한다.

본 발명의 또 다른 관점은 (i) 서열목록 제1서열로 표시되는 OsUNP2(Os12g0465000, Unknown protein)의 뉴클레오타이드 서열, (ii) 상기 뉴클레오타이드의 단편, 또는 (iii) 상기 뉴클레오타이드 서열 또는 그 단편에 상보적이거나 특이적으로 혼성화할 수 있는 서열로부터 선택되는 적어도 1종의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 저LET, 고LET, 복합방사선 또는 우주선으로부터 선택되는 이온화에너지원 검출용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 관점은 상기 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 저LET, 고LET, 복합방사선 또는 우주선으로부터 선택되는 이온화에너지원 검출용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 이온화에너지원 검출용 키트는 DNA-DNA, DNA-RNA 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들, 예컨대 DNA 칩, 중합효소 연쇄반응(PCR), 노던 블롯팅, 서던 블롯팅 등을 이용할 수 있다.

즉 상기 유전자의 전부 또는 일부를 프로브로 사용하여 대상체 시료로부터 분리한 핵산과 혼성화시킨 후, 당 분야에 공지된 다양한 방법, 예컨대 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction), 써던 블롯팅(Southern blotting), 노던 블롯팅(Northern blotting) 등으로 이를 검출함으로써 대상체에서 상기 유전자가 고발현된 상태인지 또는 저발현된 상태인지 조사하면, 상기 대상체가 이온화에너지에 피폭되었는지 여부뿐만 아니라, 피폭된 이온화에너지원의 종류 및 그 피폭양까지 판단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 관점은 상술한 본 발명의 키트를 사용하여 이온화에너지원 피폭이 의심되는 단자엽 식물로부터 OsUNP2유전자의 발현양을 측정하는 단계; 및 (ii) 상기 발현양을 이온화에너지원에 피폭되지 않은 동일한 단자엽 식물에서의 발현양과 비교하는 단계를 포함하는, 저LET(Linear Energy Transfer), 고LET, 복합방사선 또는 우주선으로부터 선택되는 이온화에너지원 누출 여부를 판정하는 방법을 제공하는 것이다.

상술한 바와 같이, 본래 단자엽 식물은 그 천연 상태로서 유전자 OsUNP2를 발현하는 식물이므로, 피폭이 의심되는 곳에서 자라고 있는 단자엽 식물을 채취하여 상기 유전자의 발현양을 측정하고, 이를 피폭된 적 없는 동일한 대조군 식물의 것과 비교하면, 다양한 이온화에너지 누출 여부를 정확하게 판단할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 이온화에너지 지표 식물로서 상기 단자엽 식물은 벼(Oryza sativa)인 것이 좋다.

본 발명은 수천 수만개에 달하는 수많은 유전자 중에서, 특히 OsUNP2다양한 이온화에너지원 조사 조건에서 발현이 현저하게 억제되는 것을 확인하여 방사선 표지 유전자로서의 기능을 규명해 내고, 이를 도입한 형질전환 식물체를 제작하여 식물 생태계 방사선 노출 여부에 대한 검지 가능성을 밝힘으로써 완성된 것이다.

본 발명의 방사선 표지 유전자를 이용하면 다양한 종류의 이온화에너지원 노출 여부를 한번에 확인할 수 있고, 이 유전자를 이용한 형질전환 식물체는 후쿠시마 원전 사고 등 방사선 발생 동위원소 누출지역, 간접적 안전성 검지를 위한 원전 및 방폐장 주변 식물의 유전체 영향 검지에 활용이 가능할 것으로 기대된다.

도 1은 대조군 식물체(방사선 비조사)와 세 개의 이온화 에너지 조사 식물체 간의 해당 유전자의 마이크로어레이 발현 정도(fold change) 분석 값을 나타낸다.
도 2는 마이크로어레이 결과를 토대로 발현이 감소한 유전자중 대표적인 몇 개의 유전자를 선별해 방사선 조사 선원에 따른 발현양상을 역전사 중합 효소반응(RT-PCR)으로 검증한 결과를 나타낸 도이다
도 3은 본 발명의 OsUNP2(Os12g0465000) 과발현 벡터 구축에 대한 상세 모식도를 나타낸 도이다.
도 4는 과발현 벡터에 삽입한 OsUNP2(Os12g0465000) 유전자의 DNA 염기서열을 데이터베이스상의 Os12g0465000 DNA 염기서열과 비교한 도이다.
도 5는 과발현 벡터에 삽입한 OsUNP2(Os12g0465000) 유전자의 염기서열을 단백질로 번역 했을 때의 단백질 서열을 데이터베이스상의 Os12g0465000 단백질 서열과 비교한 도이다.
도 6은 본 발명의 OsUNP2 유전자의 과발현 T3 형질전환 식물체에서의 과발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 OsUNP2 유전자 과발현 형질전환 식물체의 발아 24일 후 대조군과 비교하여 생육 차이를 나타낸 도이다(좌측: 대조군 및 우측: 본 발명의 형질전환 식물체).
도 8은 본 발명의 OsUNP2 유전자 과발현 형질전환 식물체의 발아 45일 후 대조군과 비교하여 생육 차이를 나타낸 도이다(좌측: 대조군 및 우측: 본 발명의 형질전환 식물체).
도 9는 OsUNP2 유전자 과발현 형질전환 식물체의 영양생장기에 각각 1, 10, 25, 50, 100, 200 Gy 선량의 방사선을 재조사하여 해당유전자의 발현 감소 양상을 규명한 정량적 실시간 중합효소 반응(quantitative realtime PCR) 결과를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

< 실시예 1> 벼의 방사선 조사

본 실험은 일품벼(Oryza sativa L. cv. Il-pum-byeo) 종자를 대상으로 하여 실험을 수행하였다. 감마선은 한국 원자력 연구원 첨단 방사선 연구소의 저준위 조사시설 (⁶⁰co, 150 TBq of capacity)에서 200 Gy의 감마선을 조사하였다. 그리고 중국의 무인 육종 우주선인 Shijian-8호에서 15일 동안 우주 환경에 노출된 종자를 이용하였다. 또한, 일본의 다카시키 원자력 연구소의 이온빔 조사시설에서 200 MeV 탄소 이온 (LET 107 Kev μm^-1)을 이용하여 40 Gy의 중이온빔을 조사하여 실험에 사용하였다.

< 실시예 2> 세 개의 이온화에너지원 (우주방사선, 감마선, 이온빔)에 대한 특이반응 유전자 선별

우주방사선, 감마선, 이온빔 등 세 개의 이온화에너지원에 특이적인 유전자 선별을 위하여, 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행하였다.

구체적으로, 일품벼 종자에 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 각각 우주방사선, 감마선, 이온빔의 이온화에너지원을 조사하였다. 그런 다음, 5% 소듐하이포클로라이드로 소독 후 1/2 MS 배지에서 24℃ (18hr light, 8 hr dark)로 2주 생장시킨　식물체에서 RNA를 추출하여 세 개의 이온화 에너지원에 특이적으로 반응하는 유전자 대량 검정을 위한 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 마이크로어레이 분석을 위한 칩은 상용화되어 있는 Affymetrix GeneChip^® iceGenomeArray 사용하였고, 혼성화(hybridization) 후, 이미지 정량화(image quantification)는 Gene Chip Operating Software (GCOS 1.2)를 사용하였으며, GeneChip robust multi-array average (GCRMA) algorithm을 사용하여 정규화(nomalization)을 수행하였다.　 또한, 상기 마이크로어레이 분석은 2회 반복 수행하였다.　

그 결과, 우주방사선과 감마선과 이온빔조사에서 공통적으로 발현이 감소되는 유전자 중에서도 특히 현저하게 발현 정도(fold change)가 하향 조절되는 OsUNP2 (Os12g0465000)유전자를 선별하였다. 상기 OsUNP2 (Os12g0465000)유전자를 제1서열로 명명하고 그 서열목록을 전자파일로 첨부하였다.

< 실시예 3> 세 개의 이온화에너지원 (우주방사선, 감마선, 이온빔)에 따른 OsUNP2 ( Os12g0465000 )유전자의 발현양상 확인

상기 <실시예 2>에서 선별한 OsUNP2 (Os12g0465000) 유전자의 에너지원별 조사 선원에 따른 발현양상을 확인하기 위하여, 각각 우주방사선, 감마선, 이온빔을 조사 후 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하였다.

구체적으로, 식물체 전체 RNA는 TRI reagent를 이용하여 추출하였으며, OsUNP2 (Os12g0465000) 유전자의 이온화 에너지원 조사 후 실제적인 발현은 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통하여 정량적으로 상호 비교검토 하였다. Total RNA 2㎍을 가지고 Power cDNA synthesis kit (Intron Biotech Inc., Sungnam, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성하였고, 합성된 cDNA는 RT-PCR의 template로 사용되었다. 1㎕ cDNA에 각각의 항산화 유전자의 프라이머 1㎕ (서열번호 2번과 서열번호 3번), dNTP 2㎕, 10 X buffer 2㎕, Ex-Tag 0.1㎕를 첨가하고 DW를 넣어 전체 볼륨을 20㎕로 조절하였다. PCR 조건은　94℃에서 5분 동안 변성시키고, 94℃ (45 초) - 58℃ (45 초) - 72℃ (90 초)로 28 에서 35 cycles, 그리고 72℃에서 7분 동안 중합반응시켰다.

OsUNP2 (Os12g0465000) 정방향 프라이머: 5'-GCACAATGGCGCTCAAGCGGCTT-3'(서열번호: 2); 및

OsUNP2(Os12g0465000) 역방향 프라이머: 5'-GCATCTGAAAGTAGTGGTCCCACGCA-3'(서열번호: 3).

　그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, OsUNP2 (Os12g0465000) 유전자는 대조군(이온화에너지 비조사구)과 비교하여 우주방사선, 감마선, 이온빔 조사 후 해당유전자의 발현이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 2).

< 실시예 4> OsUNP2 ( Os12g0465000 ) 유전자 과발현을 위한 과발현 식물 형질전환 운반체의 제조

OsUNP2 (Os12g0465000) 유전자 과발현을 위한 과발현 식물 형질전환 운반체의 제조하기 위하여, 젠닥스사의 pHC21 벡터에 삽입하였다.

구체적으로 일품벼 cDNA를 주형(template)으로 하는 프라이머(서열번호 4 및 서열번호 5)를 이용하여 PCR 증폭하였다. 밑줄 친 시퀀스는 벡터 삽입 시 사용할 제한효소 시퀀스이다.

OsUNP2 (Os12g0465000) 정방향 프라이머: 5'-tctagaATGGCGCTCAAGCGGCTTGTTCTG-3'(서열번호: 4); 및

OsUNP2 (Os12g0465000)역방향 프라이머: 5'-ggtaccCTAGCAATCGGCCTGGACGCT-3'(서열번호: 5).

상기 PCR 산물을 gel elution 하여 T-Vector 넣은 후 시퀀싱하여 insert 삽입 유무를 확인하였다. 염기서열 변이가 없는 유전자를 골라서 T-Vector에서 제한 효소로 잘라낸 후 식물 발현 벡터인 젠닥스사 pHC21 벡터에 삽입하였다. 그 다음 시퀀싱 재 확인을 통하여 UNP2 유전자가 삽입 되었음을 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 OsUNP2 (Os12g0465000) 유전자를 과발현 시키기 위한 운반체를 제작하였고(도 3), 염기서열분석(Sequencing)을 통해 과발현 벡터에 삽입한 OsUNP2 유전자의 DNA 염기서열이 데이터베이스상의 Os12g0465000 DNA 염기서열과 2개의 염기서열에서 차이를 보였지만 (도 4). 단백질로 번역 했을 때의 단백질 서열을 데이터베이스상의 Os12g0465000 단백질 서열과 비교했을 때 일치함을 확인하였다 (도 5).

< 실시예 5> OsUNP2 ( Os12g0465000 ) 유전자 과발현 형질전환 식물체 제작 및 선별

　 OsUNP2 (Os12g0465000) 유전자 과발현 형질전환 식물체를 제작하기 위하여, 상기 <실시예 4>에서 제작한 식물 형질전환 운반체를 아그로박테리움(GV3101, Hellens et al. 2000)을 이용하여 floral dip 형질전환 방법으로 형질전환 식물체를 제작하였는데, 구체적으로 6주 자란 애기장대 식물체의 꽃을 제거하고 아그로박테리움에 식물체를 감염시킨 후 3일 동안 암조건에서 공조배양하고 온실로 옮겨서 애기장대 T0 형질전환체를 얻었고, 카나마이신 저항성 선발을 카나마이신 저항성을 가지는 식물체와 저항성을 가지지 않는 식물체의 분리비가 3:1 비율인 계통을 선별하여 OsUNP2 (Os12g0465000) 과발현 형질전환을 위한 벡터가 1 반복으로 삽입된 3개의 순계(#10-3, 17-5, 20-3)를 최종적으로 수득하였다. 그런 다음, 역전사 중합효소 연쇄반응[PCR cDNA 합성 -45℃ 50분 / pre-denaturation-94℃, 2분 / 35 cycles (denaturation-94℃, 45초/ annealing - 55℃, 45초 / extension - 72℃, 1분 30초), final extension-72℃, 10분]을 수행하여 OsUNP2 형질전환체에서의 유전자 과발현을 확인한 후 #20-3 계통을 감마선 재조사를 위해 최종적으로 선발하였다(도 6).

< 실시예 6> 과발현( Over - expression ) 형질전환 식물체 생육 분석

상기 <실시예 5>에서 최종적으로 선발된 #20-3 형질전환 식물체의 일반조건 생육조건에서의 특성을 검정하기 위하여 종자를 발아시킨 후 24일과 45일에 생육 차이를 검정하였다.

그 결과, 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이 발아 후 24일인 영양생장기에는 형질전환 식물체와 대조군 식물체는 생육 및 발달 상에 별다른 차이점이 관찰되지 않았으나(도 7), 발아 후 45일인 생식생장기 후에는 본 발명의 형질전환식물체는 추대(bolting) 및 씨방(silique)의 생육이 대조군 식물체에 비해 다소 느리게 진행되는 것을 확인하였다(도 8).

< 실시예 7> 방사선 재조사에 따른 OsUNP2 유전자 발현양상 검정

상기 <실시예 5>에서 최종적으로 선발된 OsUNP2 유전자가 효과적으로 과발현되었다고 판단되는 #20-3 계통의 T3 호모 계통의 종자를 파종하여 영양생장기 식물체를 대상으로 방사선에 대한 반응성을 재조사하기 위하여 1, 10, 25, 50, 100, 200 Gy의 감마선을 각각 조사하여 RNA를 추출하였다.　 이들을 주형으로 하여 정량적 실시간 중합효소 반응(quantitative realtime PCR)을 EcoTM real-time PCR system(Illumina)를 가지고 수행하여 방사선 조사 조건에서 가발현된 식물체의 해당 유전자 발현이 감소하는지 최종적으로 검증하였다.

구체적으로, 추출된 RNA 300 ng을 주형으로 해서 Quantimix Eco Probe Onestep Kit(Philekorea technology)의 교본에 따라 정량적 실시간 중합효소 반응을 TaqMan probe(5'-56FAM/CTGGTGCTG/ZEN/TCGGCTACCTCAT/3lABkFQ-3') 방식으로 수행하였다.　 cDNA 합성과 중합효소 연쇄반응 증폭은 한 튜브 내에서 유전자 특이적인 프라이머(서열번호: 6 및 서열번호: 7)를 이용하여 수행하였으며, 반응의 전체 부피는 20㎕였다.　 PCR cDNA 합성 -42℃ 15분 / polymerase activation-95℃, 10분 / 40 cycles(denaturation-95℃, 15초/ annealing & extension - 58℃, 45초) 등의 조건으로 수행하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 방사선이 조사되지 않은 과발현 대조군 식물체에 비해서 감마선 200 Gy 이하의 모든 조사 선량에서 해당 유전자의 발현이 뚜렷하게 감소하는 것을 확인하였다 (해당 유전자의 발현량은 2^{-ΔΔ Ct} 값에 밑이 10인 로그를 취해준 값으로 상대비교(relative quantification)에 의한 정량화 값이다.)(도 9).

OsUNP2_realtime_정방향 프라이머: 5'-CACAATCAATCCCAAGCTGTTC-3'(서열번호: 6); 및

OsUNP2_realtime_역방향 프라이머: 5'-CGCATACTGAAAGGCATAGA-3'(서열번호: 7).

<110> Korea Atomic Energy Research Institute <120> Marker Gene OsUNP2 for Detecting Ionizing Energy and Transgenic Indicator Plant Using the Same <130> IP12101602 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 384 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggcgctca agcggcttgt tctgccgtcg ttcgttgtaa ttattgtgct cctcatggct 60 gtccaagggg agtcccagcg gtgcgcactg tctagcatcg atgtcagtca gaccaatacc 120 gggaagaagg tcggaacact cgacacggtg ttccaggtga tggtgatcaa caggtgccag 180 tgcgcggtga gggccatctt cctccgtgcc gatggcttcg cgagctcggt cacaatcaat 240 cccaagctgt tccgccaggc tggtgctgtc ggctacctca tcggcgatgg ccggcggatc 300 ccgagcggcg agtctatcgc ctttcagtat gcgtgggacc actactttca gatgactcct 360 gctagcgtcc aggccgattg ctag 384 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsUNP2 forward primer <400> 2 gcacaatggc gctcaagcgg ctt 23 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsUNP2 reverse primer <400> 3 gcatctgaaa gtagtggtcc cacgca 26 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsUNP2 forward primer <400> 4 tctagaatgg cgctcaagcg gcttgttctg 30 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsUNP2 reverse primer <400> 5 ggtaccctag caatcggcct ggacgct 27 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsUNP2 realtime forward primer <400> 6 cacaatcaat cccaagctgt tc 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsUNP2 realtime reverse primer <400> 7 cgcatactga aaggcataga 20

Claims (10)

1. 이온화에너지원 표지 유전자로서, 서열목록 제1서열로 표시되는 OsUNP2(Os12g0465000, Unknown protein)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 이온화에너지원 검출용 형질전환 식물체.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 애기장대(Arabidopsis thaliana)인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 이온화에너지원은 저LET(Linear Energy Transfer), 고LET, 복합방사선 또는 우주선으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 이온화에너지원은 감마선, 이온빔 또는 우주선으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
   
5. i) 제 1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 형질전환 식물체를 이온화에너지원 누출이 의심되는 곳에 노출시키는 단계;
   ii) 상기 노출시킨 형질전환 식물체에서 OsUNP2유전자 발현양을 측정하는 단계; 및
   iii) 상기 발현양을 이온화에너지원에 피폭되지 않은 동일한 형질전환 식물체에서의 발현양과 비교하는 단계
   를 포함하는, 저LET(Linear Energy Transfer), 고LET, 복합방사선 또는 우주선으로부터 선택되는 이온화에너지원 누출 여부를 판정하는 방법.
   
6. (i) 서열목록 제1서열로 표시되는 OsUNP2(Os12g0465000, Unknown protein)의 뉴클레오타이드 서열, (ii) 상기 뉴클레오타이드의 단편, 또는 (iii) 상기 뉴클레오타이드 서열 또는 그 단편에 상보적이거나 특이적으로 혼성화할 수 있는 서열로부터 선택되는 적어도 1종의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 저LET(Linear Energy Transfer), 고LET, 복합방사선 또는 우주선으로부터 선택되는 이온화에너지원 검출용 조성물.
   
7. 제6항에 기재된 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 저LET(Linear Energy Transfer), 고LET, 복합방사선 또는 우주선으로부터 선택되는 이온화에너지원 검출용 키트.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이 또는 유전자 증폭 키트인 것인　이온화에너지원 검출용 키트.
   
9. (i) 제7항의 키트를 사용하여 이온화에너지원 피폭이 의심되는 단자엽 식물로부터 OsUNP2 유전자의 발현양을 측정하는 단계; 및
   (ii) 상기 발현양을 이온화에너지원에 피폭되지 않은 동일한 단자엽 식물에서의 발현양과 비교하는 단계를 포함하는, 저LET(Linear Energy Transfer), 고LET, 복합방사선 또는 우주선으로부터 선택되는 이온화에너지원 누출 여부를 판정하는 방법.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼(Oryza sativa)인 것인 방법.

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