CN101932712B - 用于改善植物应激耐性的玉米乙烯信号转导基因及其调节 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了分离的玉米EIN3、ERF3、EBF1、EBF2、EIN5核酸及其编码的蛋白，所述核酸与植物中乙烯信号转导相关。本发明提供了涉及改变植物乙烯敏感性的方法和组合物。本发明还提供了重组表达盒、宿主细胞、转基因植物和抗体组合物。

Description

用于改善植物应激耐性的玉米乙烯信号转导基因及其调节
发明领域
本发明通常涉及植物分子生物学。具体而言，其涉及核酸以及调节核酸在植物中表达的方法。
发明背景
植物激素对植物生命的不同和复杂效应已广泛研究了数十年。在5种主要的激素一植物生长激素、乙烯、脱落酸、细胞分裂素和赤霉素中，乙烯的分子信号转导(molecular signaling)和乙烯的作用模式阐述的最清楚。该进展主要在上世纪90年代通过克隆对应于乙烯产生和信号转导中突变的基因得以完成。
乙烯(C2H4)是一种气态植物激素，其影响植物多种发育过程和适应性反应，例如发芽、花和叶衰老、果实成熟、叶离现象、根生节、程序化细胞死亡和对应激和病原体攻击的反应性。在过去的十年中，基因筛选鉴定了超过一打多与植物中乙烯反应有关的基因。乙烯支配植物的多种过程，这些效应有时受到其他植物激素、其他生理学信号和生物和非生物环境影响。例如，已知细胞分裂素能通过乙烯的作用引起类乙烯效应。此外，脱落酸能抑制乙烯产生和信号转导。植物生长激素和乙烯还已知能在多种生理现象中合作。根据现有技术，一般而言，看起来乙烯并不是植物生命周期严格需要的，但其确实显著地改变了发育并调节对应激的条件反应。
现有技术所需的是，通过调节植物中乙烯介导的反应改善植物、尤其是谷类作物例如玉米农艺性状的方法。
发明概述
本发明涉及与乙烯信号转导途径有关的玉米基因的鉴定和其用于改善植物的应激耐性的调节。本发明涉及鉴定和调节与乙烯途径有关的4种不同的玉米基因，包括EIN3、ERF3、EBF1、EBF2和EIN5，以产生对应激和其他乙烯诱导条件的反应发生改变的植物。
本文给出了与乙烯转导途径有关的本发明玉米序列的多核苷酸、相关多肽和所有保守修饰的变体。包括乙烯信号转导相关基因的新的和部分玉米序列，包括EIN3、ERF3、EBF1、EBF2和EIN5。
本发明还包括改变作物植物尤其是玉米遗传组成的方法，使所述作物可对应激条件和其他乙烯介导的反应更有耐性。本发明这一类作物的用途是产量提高和应激耐性。
乙烯介导的反应包括涉及以下的反应：拥挤耐性、结籽(seed set)和发育、压实土壤中的生长、耐涝性(flooding tolerance)、成熟和衰老以及抗病性。本发明提供了在植物的乙烯介导的反应中实现各种改变的方法和组合物，这可导致农艺性状获得改善，尤其是在应激条件下。
因此，一方面本发明涉及分离的核酸，其包括与玉米乙烯信号转导有关的分离的多核苷酸序列。本发明的一个实施方案是分离的多核苷酸，其包含选自以下的核苷酸序列：(a)包含SEQ ID NO：1(EIN3)、3(EBF1)、5(EBF2)、7(EIN5)或9(ERF3)的核苷酸序列；(b)编码包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)与编码本发明多肽的多核苷酸具有指定的序列同一性的多核苷酸；(d)与(a)的多核苷酸互补的多核苷酸；(e)包含来自(a)或(b)的多核苷酸中指定数目的连续核苷酸的多核苷酸。分离的核酸可以是DNA。
本发明的组合物包括分离的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：(a)包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10的氨基酸序列，以及(b)包含与SEQ IDNO：2、4、6、8或10具有指定的序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有乙烯信号转导活性。
在另一方面，本发明涉及包含所述核酸的重组表达盒。此外，本发明涉及含有所述重组表达盒的载体。此外，含有重组表达盒的载体可促进宿主细胞中核酸的转录和翻译。本发明还涉及能表达本发明多核苷酸的宿主细胞。可使用多种宿主细胞，例如但不限于微生物、哺乳动物、植物或昆虫。
在另一个实施方案中，本发明涉及转基因植物或植物细胞，其含有本发明的核酸。优选的含有本发明的多核苷酸的植物包括但不限于玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉(canola)、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、番茄和谷子。在另一个实施方案中，该转基因植物是玉米植物或植物细胞。另一个实施方案是来自该转基因植物的转基因种子。
与对照植物相比，本发明的植物可改变对乙烯的反应。在某些植物中，该改变的乙烯反应位于营养组织、生殖组织或营养组织和生殖组织中。本发明的植物可具有至少一种下列表型，包括但不限于：在拥挤耐性、结籽和发育、压实土壤中的生长、耐涝性、成熟和衰老以及抗病性方面与未转化植物的差异。
本发明的另一个实施方案是在基因组位点已被遗传修饰的植物，其中，该基因组位点编码本发明的乙烯信号转导多肽。
提供了提高植物中乙烯信号转导多肽活性的方法，该方法包括向所述植物引入本发明的乙烯信号转导多肽。
同样提供了降低或消除植物中乙烯信号转导多肽水平的方法。所述多肽的水平或活性也可在具体组织中降低或消除，从而引起植物生长速率的改变。降低乙烯信号转导基因的水平和/或活性将产生对乙烯激素的反应发生改变的植物。
在另一方面，本发明涉及使用在严紧条件下与本发明多核苷酸内位点选择性杂交的引物从玉米(Zea mays)核酸文库中扩增的多核苷酸。
定义
单位、前缀和标号以其SI接受的形式表示。除非另外指明，核酸以5′到3′方向从左到右书写；氨基酸以从氨基到羧基方向从左到右书写。说明书中引用的数值范围包括定义范围的数字，并且包括该定义的范围内的每个整数。在本文中，氨基酸可通过其公知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会所建议的单字母符号表示。同样，核酸以其通常所接受的单字母代码表示。除非另外提供，本文使用的软件、电或电子术语如The New IEEE Standard Dictionary of Electrical andElectronics Terms(5th edition，1993)(电和电子新IEEE标准词典(第5版，1993))中所定义。下面定义的术语通过参照说明书整体更完整地定义。
“扩增”表示构建核酸序列的多个拷贝或与核酸序列互补的多个拷贝，其使用至少所述核酸序列之一作为模板。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连接酶链反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)、Q-Beta复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)和链置换扩增技术(SDA)。参见例如Diagnostic MolecularMicrobiology：Principles and Applications(诊断分子生物学：原理和应用)，Persing，et al.，Ed.，American Society for Microbiology，Washington，DC(1993)。扩增的产物称为扩增子。
术语“抗体”包括涉及抗体的抗原结合形式。术语“抗体”通常指本质上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因编码的多肽或其特异性结合并识别分析物(抗原)的片段。然而，尽管可以根据完整抗体的消化定义多种抗体片段，但本领域技术人员应当理解，可以化学方式或利用重组DNA技术从头合成所述片段。因此，本文所用术语抗体还包括抗体片段，例如单链FV、嵌合抗体(即包含不同来源的恒定区和可变区)、人源化抗体(即包含非人来源的互补决定区(CDR))和异源耦联抗体(例如双特异性抗体)。
术语“抗原”包括涉及这样的材料：可产生针对其的抗体和/或抗体对其具有特异性免疫反应性。抗原内的特异性免疫反应性位点称为表位或抗原决定簇。这些表位可以是多聚组合物中单体的线性阵列，例如蛋白质中的氨基酸，或包含更复杂的二级或三级结构或有其组成。本领域技术人员应当认识到，所有的免疫原(即能引起免疫反应的物质)都是抗原，然而某些抗原例如半抗原不是免疫原，但可与载体分子偶联致免疫原性。对特定抗原具有免疫反应性的抗体可在体内或通过重组方法产生，例如噬菌体或类似载体中选择重组抗体库。参见例如Huse，et al.，(1989)Science 246：1275-1281；和Ward，et al.，(1989)Nature 341：544-546；andVaughan，et al，(1996)Nature Biotech.14：309-314。
本文所用“反义方向”包括涉及在反义链转录的方向与启动子可操作地连接的双链多核苷酸序列。该反义链与内源性转录产物足够互补，因此内源性转录产物的翻译通常被抑制。
术语“保守修饰的变体”适用于氨基酸序列和核酸序列。对于具体的核酸序列，保守修饰的变体是指那些编码氨基酸序列的相同变体或其保守修饰变体的核酸。由于遗传密码的简并性，许多功能相同的核酸编码任何给定的蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在每个由密码子定义丙氨酸的位置，其密码子可以变为任何上述密码子，而不改变编码的多肽。所述核酸变异是“沉默变异”，代表一类保守修饰的变异。本文中编码多肽的每一核酸序列同样参照遗传密码描述了该核酸的每一可能的沉默变异。
本领域技术人员应当了解，核酸中的各密码子(除AUG，其通常为甲硫氨酸的唯一密码子，以及UGG，其通常为色氨酸的唯一密码子)经修饰可以产生功能相同的分子。因此，每一描述的多肽序列中暗含了编码本发明多肽的核酸的各沉默变异，其落于本发明的范围之内。
对于氨基酸序列，本领域技术人员应当了解，对核酸、肽、多肽或蛋白序列的个体取代、缺失和添加，其改变、添加或删除编码的序列中的单个氨基酸或低百分率氨基酸，为“保守修饰的变体”，其中所述改变导致化学类似的氨基酸取代某一氨基酸。因此，可改变选自1-15的整数的任意数目的氨基酸残基。因此，例如可进行1、2、3、4、5、7或10个改变。
保守修饰的变体通常提供与衍生它们的未修饰多肽序列类似的生物学性质。例如，底物特异性，酶活性或受体/配体结合通常为天然蛋白与其天然底物的30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。提供功能类似的氨基酸的保守取代表，在本领域内是公知的。
以下六组各自含有互相保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。同样参见Creighton(1984)Proteins(蛋白)W.H.Freeman and Company。
对于指定的核酸，“编码”或“编码的”表示包括翻译到指定的蛋白中的信息。编码蛋白的核酸可包含核酸翻译区域内的插入序列(例如内含子)，或可以缺乏所述插入非翻译序列(例如cDNA中)。编码蛋白质的信息通过使用密码子说明。通常，氨基酸序列由核酸使用“通用“遗传密码编码。然而，当表达核酸时，可使用例如存在于某些植物、动物和真菌线粒体、细菌山羊支原体或纤毛大核中的通用密码的变体。当合成制备或改变核酸时，可利用预期表达核酸的宿主已知密码子的优点。
例如，虽然本发明的核酸序列在单子叶植物和双子叶植物中均可表达，但可修饰序列以解释单子叶植物或双子叶植物的具体密码子偏好和GC含量偏好，这些偏好已显示是不同的(Murray，et al.，(1989)Nucl.AcidsRes.17：477-498)，因此，对于一具体的氨基酸，玉米优选密码子可来源于已知的玉米基因序列。上述Murray等的表4中列出了来自玉米植物28个基因的玉米密码子用法。
涉及指定的多核苷酸或其编码的蛋白时，本文所用“全长序列”表示具有该指定的蛋白的天然(非合成)、内源性、生物活性形式的全长氨基酸序列。确定某一序列是否为全长的方法是本领域公知的，示例性的技术包括RNA或蛋白质印迹、引物延伸、S1保护和核糖核酸酶保护。参见例如Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual(植物分子生物学：实验室手册)，Clark，Ed.，Springer-Verlag，Berlin(1997)。与已知的全长同源(直系同源或旁系同源)序列比较也可用于鉴定本发明的全长序列。此外，通常位于mRNA 5’和3’非翻译区的共有序列帮助鉴定全长的多核苷酸。例如共有序列ANNNNAUGG，其中带下划线的密码子代表N末端甲硫氨酸，能帮助确定该多核苷酸是否具有完整的5’端。3’端的共有序列，例如多腺苷酸序列，能帮助确定该多核苷酸是否具有完整的3’端。
涉及核酸时，本文所用“异源”是指来源于外来种类的核酸，或者，如果来源于同一种类，其本质上已通过故意的人为干预在组成和/或基因组位点上由天然形式进行了修饰。例如，可操作地连接于异源结构基因的启动子来源于不同于衍生该结构基因的种类，或者，如果来源于同一种类，其中之一或两者本质上由其天然形式进行了修饰。异源蛋白可来自外来种类，或者如果来自同一种类，其通过故意的人为干预本质上由原始形式进行了修饰。
“宿主细胞”表示含有载体并支持载体复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，例如E.coli，或真核细胞，例如酵母、昆虫、两栖类、或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是单子叶植物或双子叶植物细胞。尤其优选地，单子叶宿主细胞是玉米宿主细胞。
术语“杂交复合物”包括涉及由两条单链核酸序列选择性杂交所形成的双链核酸结构。
“免疫反应条件”或“免疫反应性条件”表示允许对具体表位具有反应性的抗体与该表位结合达到的程度可检测地大于(例如至少比背景高2倍)该抗体与包含该具体表位的反应混合物中实质上所有其他表位结合的程度。免疫反应性条件依赖于抗体结合反应的形式，通常为用于免疫测定法中的那些。关于免疫测定的形式和条件，参见Harlow and Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，Cold Spring HarborPublications，New York(1988)。
在将核酸插入细胞的意境中，术语“引入”表示“转染”或“转化”或“转导”，包括涉及将核酸并入原核或真核细胞，其中该核酸可并入细胞的基因组中(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转化为自主复制子，或瞬时表达(例如转染的mRNA)。
术语“分离的”表示诸如核酸或蛋白的材料，其(1)实质或基本上不含天然条件下通常与之伴随或与之相互作用的成分。该分离的材料任选地包含在天然条件下未发现与该材料在一起的材料或(2)如果该材料处于天然环境中，其通过故意的人为干预被合成地(非天然的)改变为组合物，和/或置于对在该环境中所发现的材料而言非天然的细胞内位置(例如基因组或亚细胞器)。可以对天然状态或由天然状态除去的材料进行产生合成材料的改变。例如，如果天然存在的核酸通过在其来源细胞内进行的人为干预的方法被改变，或从已改变的DNA中转录，则该天然存在的核酸变成分离的核酸。参见例如，Compounds and Methods for Site DirectedMutagenesis in Eukaryotic Cells(在真核细胞中定点诱变的化合物和方法)，Kmiec，US专利5,565,350号；In Vivo Homologous Sequence Targeting inEukaryotic Cells(真核细胞内的体内同源序列寻靶)；Zarling等的PCT/US93/03868。同样，如果将天然存在的核酸(例如启动子)通过非天然存在的方法引入到对该核酸而言并非天然的基因组位点时，则该天然存在的核酸变成分离的核酸。本文所定义“分离的”核酸也称为“异源”核酸。
除非另外说明，术语“EIN3、ERF3、EIN5、EBF1或EBF2核酸”是本发明的核酸，表示包含编码EIN3、ERF3、EIN5、EBF1或EBF2多肽的本发明多核苷酸(“EIN3、ERF3、EIN5、EBF1或EBF2多核苷酸”)的核酸。“EIN3、ERF3、EIN5、EBF1或EBF2基因”是本发明的基因，并指全长EIN3、ERF3、EIN5、EBF1或EBF2多核苷酸的异源基因组形式。
对于具体的标记，本文所用“位于定义的染色体区域和包括”是指以一定标记划界并包括所述标记的连续长度的染色体。
本文所用“标记”包括涉及染色体上的位点，其用于鉴定染色体上的独特位置。“多态性标记”包括涉及这样的标记，其以多种形式(等位基因)出现，以致当不同形式的标记存在于同源对中时，它们可遗传所述对中待追踪的每一染色体。基因型可使用一种或多种标记定义。
本文所用“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸聚合物，除非另外限制，包括具有天然核苷酸基本属性的已知类似物，因为它们以类似于天然存在核苷酸的方式与单链的核酸杂交(例如肽核酸)。
“核酸文库”表示分离的DNA或RNA分子的集合，其包含并实质上代表了特定生物体基因组的整个转录的部分。示例性核酸文库例如基因组和cDNA文库的构建在标准分子生物学参考文献中有教导，例如Bergerand Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techinque，Methods inEnzymology，Vol.152，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(Berger)；Sambrook，et al.，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(分子克隆-实验室手册)，2nd ed.(第二版)，Vol.1-3(1989)；和Current Protocols in MolecularBiology(最新分子生物学方法)，Ausubel，et al.，Eds.，Current Protocols，ajoint venture between Greene Publishing Associates，Inc.and John Wiley&Sons，Inc.(Greene Publishing Associates和约翰威立国际出版公司的合资公司)(1994)。
本文所用“可操作地连接”包括涉及启动子和第二序列间的功能性连接。其中启动子序列起始并介导对应于第二序列的DNA序列的转录。通常，可操作地连接表示连接的核酸序列是连续的，当需要连接两个蛋白编码区时，是连续的并位于同一阅读框(reading frame)内。
本文所用术语“植物”包括涉及完整植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子和植物细胞及其后代。本文所用植物细胞包括但不限于种子、悬液培养物、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、枝条、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可用于本发明方法中的植物种类通常为能接受转化技术的高等植物，包括单子叶植物和双子叶植物。尤其优选的植物是玉米。
本文所用“多核苷酸”包括涉及脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸、或其类似物，该类似物具有天然核苷酸的基本性质，因为它们在严紧杂交条件下与本质上和天然存在的核苷酸相同的核苷酸序列杂交，和/或可翻译为和天然核苷酸同样的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构或调节基因的全长或亚序列。除非另外说明，该术语包括涉及特定的序列及其互补序列。因此，骨架由于稳定性或其他原因而修饰的DNA或RNA是本文该术语所意指的“多核苷酸”。此外，包括稀有碱基或修饰的碱基的DNA或RNA，稀有碱基例如肌苷，修饰的碱基例如三苯甲基碱基，仅举两个实例，也是如同本文所用术语的多核苷酸。应当理解，可对DNA和RNA进行多种修饰，所述修饰用于本领域技术人员已知的多种有用的目的。
本文所用术语多核苷酸包括此类化学、酶促或代谢修饰形式的多核苷酸，以及有病毒和细胞特征的化学形式的DNA和RNA，除此之外，还包括简单和复杂的细胞。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可交换使用，是指氨基酸残基的聚合物。这些术语除适用于天然存在的氨基酸聚合物外，还适用于一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物。天然存在的氨基酸的此类类似物的本质属性是，当其并入某一蛋白中时，该蛋白对针对相同蛋白所诱发的但是全部由天然氨基酸组成的抗体具特异反应性。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”也包括修饰，所述修饰包括但不限于，糖基化、脂质连接、硫酸化作用、谷氨酸残基的γ羧化、羟基化和ADP核糖基化。应当理解，如同公知的和上文所述的，多肽并非总是是完全线性的。例如，多肽可以由于泛素化而是分枝的，它们也可以是含或不含支链的环状，通常是翻译后事件的结果，包括天然加工事件和非天然发生的人为操作事件。环状、分枝的和分枝的环状多肽可通过非翻译天然方法和完全合成方法合成。此外，本发明考虑了本发明蛋白的含甲硫氨酸变体和少甲硫氨酸氨基末端变体两者的用途。
本文所用“启动子”包括涉及转录起始开始上游的DNA区域，并与RNA聚合酶的识别和结合以及起始转录的其他蛋白有关。“植物启动子”是能起始植物细胞中转录的启动子，不论其来源是否为植物细胞。示例性的植物启动子包括但不限于从植物、植物病毒和包含在植物细胞中表达基因的细菌如农杆菌(Agrobacterium)或根瘤菌(Rhizobium)中获得的那些启动子。发育控制下的启动子实例包括优先在某些组织例如叶、根和种子中起始转录的启动子。此类启动子称为“组织优选的”。仅在某些组织中起始转录的启动子称为“组织特异性的”。“细胞类型”特异性启动子主要在一种或多种器官的某些细胞类型中驱动表达，例如，根或叶中的维管细胞。“诱导型”或“抑制型”启动子是在环境控制下的启动子。通过诱导型启动子实现转录的环境条件的实例包括缺氧条件或光照。组织特异性、组织优选、细胞类型特异性和诱导型启动子构成“非组成型”启动子类型。“组成型”启动子是在大多数环境条件下有活性的启动子。
术语“EIN3、ERF3、EIN5、EBF1或EBF2多肽”是本发明的多肽，指糖基化或非糖基化形式的一个或多个氨基酸序列。该术语还包括其片段、变体、同系物、等位基因或前体(例如前蛋白原或前蛋白)。“EIN3、ERF3、EIN5、EBF1或EBF2蛋白”是本发明的蛋白，并包含EIN3、ERF3、EIN5、EBF1或EBF2多肽。
本文所用“重组”是包括涉及通过引入异源核酸修饰的细胞或载体，或所述细胞来源于如此修饰的细胞。因此，例如，作为蓄意人为干预的结果，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中未发现的相同形式的基因，或表达在其他情况下异常表达、低表达或不表达的天然基因。本文所用术语“重组”不包括通过天然发生的事件(例如自发突变、天然转化/转导/转座)，例如不需要蓄意人为干预就发生的事件改变细胞或载体。
本文所用“重组表达盒”是重组或合成产生的核酸构建体，含有一系列特定的核酸元件，这些元件允许具体核酸在宿主细胞内转录。可将重组表达盒并入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，除其他序列外，表达载体的重组表达盒部分包括要转录的核酸和启动子。
术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”在本文中交换使用，是指并入蛋白、多肽或肽(统称为“蛋白”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另外限制，可包括天然氨基酸的非天然类似物，该类似物以相似的方式发挥天然氨基酸的功能。
术语“选择性杂交”包括涉及严紧条件下核酸序列与其他生物制品的杂交。因此在指定的免疫测定条件下，特定的抗体与具有可识别的表位的分析物结合的程度，比与实质上样品中所有缺乏该表位的分析物结合的程度高的多(例如至少2倍背景)。在这样的条件下与抗体的特异性结合需要选择对具体蛋白具有特异性的抗体。例如，可选择针对本发明多肽而产生的抗体，以获得对本发明的多肽具有特异性反应性的抗体。用作免疫原的蛋白可以是天然构象或变性的以提供线性表位。
多种免疫测定形式可用于选择与具体的蛋白(或其他分析物)特异性反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定法通常用于选择与蛋白特异性免疫反应的单克隆抗体。关于可用于测定选择反应性的免疫测定形式和条件说明，参见Harlow and Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)，Cold Spring Harbor Publications，New York(1988)。
术语“严紧条件”或“严紧杂交条件”包括涉及这样的条件，在该条件下探针与其靶序列杂交的程度可检测地比与其他序列结合的程度更高(例如至少2倍背景)。严紧条件是序列依赖性的，在不同的环境下不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严紧度，可鉴定与探针100％互补的靶序列(同源杂交(homologous probing))。
或者，可调节严紧条件以在序列中允许某些错配，这样可检测较低程度的相似性(异源杂交(heterologous probing))。通常，探针的长度低于约1000个核苷酸，任选低于500个核苷酸。
通常，严紧条件如下：盐浓度低于约1.5M Na离子，通常为约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)，pH 7.0至8.3，对短探针(例如10到50个核苷酸)而言，温度至少约30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言为至少约60℃。严紧条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂获得。示例性的低严紧条件包括用30-35％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS (十二烷基硫酸钠)的缓冲液在37℃下杂交，用1×到2×SSC(20×SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬三钠)在50-55℃下洗涤。示例性的中等严紧条件包括在40-45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中、在37℃下杂交，在＜RTI 0.5×到1×SSC中在55-60℃下洗涤。示例性的高严紧条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS在37℃下杂交，在0.1×SSC中在60-65℃下洗涤。杂交后洗涤的功能通常是特异性的，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA/DNA杂交物，Tm可根据Meinkoth和Wahl的方程式近似计算：(1984)Anal.Biochem.138：267-284：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％ form)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是甲酰胺在杂交溶液中的百分比，L是杂交物碱基对的长度。Tm是50％互补靶序列与完美匹配的探针杂交的温度(在给定的离子强度和pH下)。每1％的错配Tm降低约1℃；因此，可调节Tm、杂交和/或洗涤条件以与所需同一性的序列杂交。例如，如果需要寻找＞90％同一性的序列，可将Tm值降低10℃。一般而言，在给定的离子强度和pH下，选择严紧条件的温度为比特异性序列及其互补序列的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，严格的严紧条件可使用比热解链温度(Tm)低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中等严紧条件可使用比热解链温度(Tm)低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严紧条件可使用比热解链温度(Tm)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。使用该方程式，杂交和洗涤组合物以及所需的Tm，本领域技术人员应当理解杂交和/或洗涤溶液的严紧度的变化，已经做了固有描述。如果所需的错配度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度，这样可使用更高的温度。关于核酸杂交更广泛的指导见Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter2″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assays″，Elsevier，New York(1993)；Current Protocols in MolecularBiology(最新分子生物学方法)，Chapter 2(第2章)，Ausubel，et al.，Eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。
“受试植物”或“受试植物细胞”是其目的基因已实现遗传改变例如转化的植物或植物细胞，或者是遗传自如此改变并包含所述改变的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供了测定植物或植物细胞表型变化的参照点。
对照植物或植物细胞可以包括，例如：(a)野生型的植物或细胞，即与导致受试植物或细胞的遗传改变的起始材料基因型相同；(b)与起始材料基因型相同，但已用空构建体(即对目的性状无已知影响的构建体，例如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)，是受试植物或植物细胞子代的未转化分离子的植物或植物细胞；(d)与受试植物或植物细胞遗传上相同的植物或植物细胞，但未暴露于诱导目的基因表达的条件或刺激下；或者(e)有关基因不表达条件下的受试植物或植物细胞本身。
在本发明中，例如，可通过比较受试植物或植物细胞与对照植物或植物细胞，测量乙烯反应的变化，包括乙烯产生的量或时间选择、乙烯活性、乙烯分布、乙烯信号转导、乙烯识别，或者植物或植物细胞表型中的变化，例如开花时间、结籽、分枝、衰老、应激耐性或根质量。
本文所用“转基因植物”包括涉及基因组内包含异源多核苷酸的植物。一般而言，将异源多核苷酸在基因组中稳定整合，这样该多核苷酸可被连续的世代遗传。异源多核苷酸可单独整合到基因组中或作为重组表达盒的一部分。本文所用“转基因”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，其基因型由于异源多核苷酸的存在发生改变，包括转最初就发生如此改变的那些转基因，以及通过最初转基因的有性杂交或无性生殖产生的那些。本文所用“转基因”不包括通过常规植物育种方法或通过天然发生的事件例如随机异体受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变造成的基因组改变(染色体或染色体外的)。
本文所用“载体”包括涉及宿主细胞转染所用的且可以插入多核苷酸的核酸。载体通常是复制子，表达载体允许插入其中的核酸的转录。
以下术语用于描述本发明多核苷酸/多肽与参考多核苷酸/多肽的序列关系：(a)“参考序列”，(b)“比较窗”，(c)“序列同一性”和(d)“序列同一性百分比”。
(a)本文所用“参考序列”是用作与本发明的多核苷酸/多肽序列进行比较的基础的确定序列。参考序列可以是特定序列的子集或整体；例如，全长cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因序列。
(b)本文所用“比较窗口”包括涉及多核苷酸/多肽的连续和特定的片段，其中所述多核苷酸/多肽序列可与参考序列比较，比较窗内的多核苷酸/多肽部分与参考序列(其不含添加或缺失)相比，可包含添加或缺失(即缺口)以用于两条序列的最佳匹配。一般而言，比较窗的长度为至少20个连续的核苷酸/氨基酸残基，任选地，可以是30、40、50、100或更长。本领域技术人员应对理解，为避免由于在所述多核苷酸/多肽序列中加入缺口而导致的与参考序列的高相似性，通常引入缺口罚分，从匹配数量中减去。
用于比较的序列比对方法是本领域公知的。用于比较的最佳序列比对可按照下列方法进行：Smith and Waterman，(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Needleman and Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Pearson and Lipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性检索方法；这些算法的计算机化执行，包括但不限于：PC/Gene程序中的CLUSTAL，Intelligenetics，Mountain View，California；GCG Wisconsin软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，第10版(Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，California，USA)。CLUSTAL程序在下述文献中有详细描述：Higgins andSharp，(1988)Gene 73：237-244；Higgins and Sharp，(1989)CABIOS5：151-153；Corpet et al.，(1988)Nucleic Acids Research 16：10881-90；Huanget al.(1992)Computer Applications in the Biosciences 8：155-65，以及Pearsonet al.，(1994)Methods in Molecular Biology 24：307-331。
可用于数据库相似性检索的BLAST家族程序包括：用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的BLASTN；用于针对蛋白数据库的核苷酸序列检索的BLASTX；用于针对蛋白数据库序列的蛋白质查询序列的BLASTP；用于针对核苷酸数据库序列的蛋白查询序列的TBLASTN；以及用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的TBLASTX。参见Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学方法)，Chapter 19(第19章)，Ausubel，et al.，Eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)；Altschul，et al.，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410和Altschul，et al.，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402。
公众可从例如国家医学图书馆的国家生物技术信息中心Building38A，Bethesda，Maryland，USA获得进行BLAST分析的软件。该算法包括首先通过在查询序列中确定长度为W的短字串确定高评分序列对(HSPs)，当其与数据库序列中相同长度的字串比对时，匹配或满足某种正值阈值(positive-valued threshold)评分T。T称为相邻字串序列评分阈值。这些起始的相邻字串搜索(word hit)作为启动检索的种子，以发现含有它们的更长的HSP。字串搜索沿每一序列在两个方向上延伸，直到累积的比对评分增加。对于核苷酸序列，用参数M(匹配残基对奖分，总是＞0)和N(错配残基罚分，总是＜0)计算累积的评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累积的评分。
当累积的比对评分从其最大获得值减少X时；当一个或多个负评分残基比对的累积，使累积的评分为0或以下时；或当到达任一序列的终点时，停止字串搜索在每一方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核酸序列)使用以下作为缺省值：字长(W)为11，期望值(E)为10，截断为100，M＝5，N＝-4，比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下作为缺省值：字长(W)为3，期望值(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff andHenikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。
除计算序列同一性百分比外，BLAST算法还对两条序列的相似性进行统计学分析(参见例如Karlin and Altschul，(1993)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 90：5873-5877)。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小和概率(smallest sum probability(P(N))，其表示两条核苷酸或氨基酸序列间可能偶然匹配的概率。BLAST检索假定蛋白质可作为随机序列模建，然而，许多实际的蛋白包含非随机的序列区域，其可能是同聚物域(homopolymeric tract)、短期重复(short-period repeat)或富含一种或多种氨基酸的区域。这些低复杂度区域可在不相关的蛋白间比对，甚至所述蛋白的其他区域完全不同。可使用多种低复杂度过滤程序降低此类低复杂度比对。例如，可单独或组合使用SEG(Wooten and Federhen，(1993)Comput Chem.17：149-163)和XNU(Claverie and States，(1993)Comput.Chem.17：191-201)低复杂度过滤程序。
除非另外说明，本文提供的核苷酸和蛋白同一性/相似性值使用GAP(第10版GCG)根据缺省值计算。GAP(全局比对程序)也可用于比较本发明的多核苷酸或多肽和参考序列。GAP使用Needleman和Wunsch (J.Mol.Biol.48：443-453(1970))的算法寻找两条完整序列的比对，该比对使匹配数最大并使缺口数最小。GAP考虑所有可能的比对和缺口位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的缺口的比对。其提供了匹配碱基单元的缺口产生罚分和缺口延伸罚分。对于其插入的每一缺口，GAP必须利用匹配的缺口产生罚分数。如果选择了大于0的缺口延伸罚分，则对于每个插入的缺口，GAP还必须利用缺口长度乘以缺口延伸罚分。在用于蛋白序列的第10版Wisconsin Genetic软件包中，缺省缺口产生罚分值和缺口延伸罚分值分别为8和2。对于核酸序列而言，缺省缺口产生罚分是50，而缺口延伸罚分是3。缺口产生和缺口延伸罚分可以表示为选自0-100的整数，因此，例如，缺口产生和缺口延伸罚分每一个都可以独立地是3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60或更高。
GAP给出最佳比对家族的一个成员。该家族可以有很多成员，但无任何其他成员具有更好的性质。GAP给出比对的4个优值：性质(Quality)、比率(Ratio)、同一性(Identity)和相似性(Similarity)。计量最大化性质以比对序列。比率是性质除以较短片段中的碱基数。同一性百分比是实际匹配的符号百分比。相似性百分比是类似符号的百分比。忽略缺口对面的符号。当一对符号的评分矩阵值大于等于相似性阈值0.50时，对相似性评分。第10版Wisconsin Genetic软件包中所用的评分矩阵是BLOSUM62(参见Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。
序列的多重比对可使用CLUSTAL比对方法进行(Higgins and Sharp(1989)CABIOS 5：151-153)，使用缺省参数(GAP罚分＝10，GAP长度罚分＝10)。使用CLUSTAL方法进行成对比对的缺省参数是KTUPLE 1，GAP(缺口罚分)＝3，WindoW(窗口)＝5并且DIAGONALS SAVED(现有诊断)＝5。
(c)在两条核酸或多肽序列的语境中，本文所用“序列同一性”或“同一性”包括涉及当在特定的比较窗口中进行最大一致性比对时在两条序列中相同的残基。当在涉及蛋白时，使用序列同一性百分比，则应认识到，不同的残基位置通常由于保守性氨基酸的取代而不同，其中用氨基酸残基取代具有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基，并且因此不改变所述分子的功能特性。如果序列的区别在于保守取代，则可上调序列同一性百分比，以校正取代的保守属性。认为因此类保守性取代而不同的序列具有“序列相似性”或“相似性”。进行该调整的方法对本领域技术人员来说是公知的。通常其包括将保守取代作为部分而非全部错配进行评分，由此增加序列同一性百分比。因此，例如当相同氨基酸被给予评分1，而非保守取代被给予评分0时，给予保守取代0-1之间的评分。保守取代的评分根据例如Meyers and Miller，(1988)Computer Applic.Biol.Sci.4：11-1，e.＜RTI g的算法计算，如程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California，USA)所执行的。
(d)本文所用“序列同一性百分比”表示，通过在比较窗内比较两条最佳比对的序列确定的值，其中比较窗口中一部分多核苷酸序列与参考序列(其不包括添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即缺口)，以用于两条序列的最佳比对。该百分比通过下述方式计算：确定在两条序列中存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，以产生匹配位置的数目，用比较窗中的位置总数除匹配位置的数目，将结果乘以100获得序列同一性百分比。
附图简要说明
图1是MPSS文库中Zm ERF3表达的组织分布图。
图2是微阵列中Zm ERF3表达的冷诱导时程图。
图3是在表达UBI::ZmERF3的转基因玉米的E3和E18中，上调或下调超过5倍的基因数目的图示。
发明的详细描述
综述
除了其他事项外，本发明提供了调节(即增加或降低)植物中本发明的多核苷酸和多肽水平的方法。特别是，本发明的多核苷酸和多肽可在一定时间或空间表达，例如在发育阶段在组织中，和/或大量表达，这不是非重组工程植物的特征。因此，本发明提供了在下文所提供的示例性应用中的用途。
EIN3是与乙烯反应因子例如ERF1或ERF3的启动子中存在的乙烯反应元件结合的核转录因子。因此下调EIN3会降低乙烯敏感性。
EBF1和EBF2是与EIN3结合并靶向EIN3蛋白用于通过泛素/蛋白酶途径降解的F-盒蛋白。因此EBF1和EBF2的超表达会降低乙烯的敏感性。
EIN3蛋白水平对乙烯做出反应而迅速增加，该反应需要若干乙烯信号转导途径组分，包括乙烯受体(ETR1和EIN4)、CTR1、EIN2、EIN5和EIN6。在无乙烯时，EIN3通过EBF1和EBF2介导的泛素/蛋白酶途径迅速降解。
EIN5具有对EBF1和EBF2转录物的内切核酸酶活性，由此通过促进EBF1和EBF2mRNA降解拮抗对EIN3的负反馈。因此下调EIN5可降低乙烯敏感性。
乙烯反应的变化可包括乙烯产生的量或时间选择、乙烯活性、乙烯分布、乙烯信号转导和乙烯识别中的一个或多个变化，其可以导致表型变化，例如改变的开花时间、结籽、分枝、衰老、应激耐性或根形成。
在某些实施方案中，本发明的核酸构建体可与其他目的多核苷酸序列组合(叠加)使用，以产生具有所需表型的植物。本发明的多核苷酸可与任何基因或基因组合叠加，产生的组合可包括任一或多个目的多核苷酸的多重拷贝。需要的组合可影响一种或多种性状，即，为了调节影响乙烯反应的基因表达，可产生某些组合。其他组合可设计成产生具有多种所需性状的植物，例如本文中其他部分描述的那些。
拥挤耐性
作物植物的农艺性状通常是它们耐受种植密度程度的函数。过度拥挤应激可能是由于简单限制营养物、水和阳光而引起的。拥挤应激也可以是由于植物间接触增强而导致的，植物通常通过减缓生长和加厚组织对身体接触做出反应。
乙烯与植物的拥挤耐性有关，例如，乙烯不敏感的烟草植物与相邻植物接触时并未减缓生长(Knoester，et al.，(1998)PNAS USA95：1933-1937)。同样，有证据表明乙烯和植物对乙烯的反应与缺水应激有关，乙烯可引起植物发生变化，除损失水分本身外，该变化还限制其生长和恶化干旱应激症状。
本发明提供了通过调节EIN3、ERF3、EBF1、EBF2或EIN5基因或基因产物中的一种或多种的表达或活性，降低植物尤其是诸如玉米的谷物的乙烯敏感性，以增加密集间隔(close spacing)耐受同时降低应激并使产量损失最小化。
玉米的结籽和发育
乙烯在种子发育中发挥多方面作用。例如，在玉米中，乙烯与发育中的胚乳细胞的程序性死亡有关(Young，et al.，(1997)Plant Physio.115：737-751)。此外，乙烯与例如在穗尖端发生的核败育(kernel abortion)有关，尤其是在应激条件下生长的植物中(Cheng et al.，Lur，(1996)Physiol.Plant 98：245-252)。核结籽降低理所当然导致产量降低。因此，本发明提供了通过调节与乙烯反应有关的基因的表达降低乙烯作用的植物，尤其是玉米植物。
压实土壤中的生长
植物生长受土壤的密度和压实状态影响。更密、更压实的土壤通常导致更差的植物生长。农业趋向于更多的最小化，直到目标为土壤和能量节约的种植和栽培实践的倾向，日益增加了在这些条件下能良好发育的作物植物的需要。
已公知乙烯影响植物的生长和发育，乙烯的一种效应是，当遭遇机械应激例如压实土壤时促进组织增厚和生长迟缓。这可以影响根和枝条。该效应假定在某些环境中是适应性的，因为其产生能打破障碍例如压实土壤的更强壮、更紧密的组织。然而，在这类条件下，乙烯的产生和乙烯途径的激活可能超过对压实土壤机械应激的适宜性调节的所需。任何导致的不必要的生长抑制是不需要的农艺结果。
本发明提供了通过调节EIN3、ERF3、EBF1、EBF2或EIN5基因或基因产物中的一种或多种的表达或活性，降低植物尤其是诸如玉米的谷物的乙烯敏感性。此类调节的植物在压实土壤中更好地生长和发芽，导致更高的群从计数(stand count)，预示着更高的产量。
耐涝性
每年全世界的淹水土壤(flooding soil)和水渍土壤(water-logged soil)引起作物产量的大量损失。淹水可以是广泛的或局部的和短暂或延长的。乙烯与淹水介导的损伤有关。实际上，乙烯产量在淹没的条件下升高。该升高有两个主要原因：1)在导致缺氧的此类淹没条件下，植物产生更多的乙烯，以及2)在淹没条件下，乙烯从植物中的扩散减缓，因为乙烯在水中几乎不溶，导致植物内乙烯水平上升。
在水稻中，耐淹没性(submergence tolerance)已知通过乙烯信号转导传递(Perata and Voesenek，(2007)Trends Plant Sci 12(2)：43-46)。
淹没的玉米根中的乙烯还可抑制向地性，其在发芽期间通常是适宜的，因为其使根向下，并使枝条向上。向地性是决定根结构的因素，其反过来在土壤来源获取中起重要作用。乙烯水平的操作可用于影响耐旱性、耐涝性、更高的稳定性和/或营养吸收改善的根的角度(root angle)。例如，以更直立的角度(更陡峭)生长的根，在土壤中生长的更深，由此在更深的地方获得水，从而改善耐旱性。无干旱应激时，对于根通过更平行于土壤表面的根更有效的吸收土壤上层中的营养和水分，可获得相反的观点。通常，具有接近于垂直(陡峭)的角度的根也比具有浅角度(平行于表面)的根对根倒伏更敏感，后者更耐根倒伏。
除了抑制向地性，可能的是，淹没条件下的乙烯进化抑制生长，尤其是根的生长。此类抑制会导致总体较差的植物生长，因此是不利的农艺性状。
本发明提供了通过调节EIN3、ERF3、EBF1、EBF2或EIN5基因或基因产物中的一种或多种的表达或活性，降低植物尤其是诸如玉米的谷物的乙烯敏感性。此类植物在淹没条件下或水渍土壤中更好的生长和发芽，从而导致更高的群从计数。
植物成熟和衰老
已知乙烯与控制衰老、果实成熟和脱落有关。乙烯在果实成熟中的作用历史悠久并应用于工业中。预期乙烯产生不足/不敏感会导致种子成熟或果实成熟变缓，反之则会导致种子成熟或果实成熟更快。主要研究了双子叶植物的脱落，显然脱落对单子叶植物例如谷物有很少的应用。乙烯介导的衰老也已在双子叶植物中进行了广泛研究，但衰老的控制对双子叶和单子叶作物种类在农学上都是重要的。乙烯不敏感性可延迟、但非抑制衰老。乙烯介导的衰老过程与细胞死亡过程在疾病症状和脱落区中具有某些相似性。通过控制EIN3、ERF3、EBF1、EBF2或EIN5基因中的一种或多种控制乙烯敏感性，可调节作物植物例如玉米的成熟速率。
本发明提供了通过调节EIN3、ERF3、EBF1、EBF2或EIN5基因或基因产物中一种或多种的表达或活性，降低植物尤其是诸如玉米的谷物的乙烯敏感性，其导致植物晚熟，这对于在不同的成熟区安置作物多样性是需要的。
对其他非生物应激的耐性
许多对植物的应激诱导乙烯产生(参见Morgan and Drew，(1997)Physiol.Plant 100：620-630)。这些应激例如可以是冷、热、创伤、污染、干旱和高盐度。上文描述了机械阻抗(土壤压实)和淹水应激。似乎某些所述应激通过普通机制起作用，例如水分缺陷。显然干旱引起水分缺陷，拥挤应激也可引起水分缺陷。此外，在玉米中，冷却可引起乙烯产量和活性升高，并且显然该诱导是因为冷却引起细胞的水分缺陷而导致的(Janowaik和Dorffling，(1995)J.Plant Physiol.147：257-262)。
应激后某些乙烯的产生可通过调节植物中乙烯介导的过程用于适应性的目的，该过程更适于所经历的应激、以这种方式改造的植物。然而，也有证据表明，在应激过程中乙烯产生可导致由应激造成的阴性症状的恶化，例如黄化、组织死亡和衰老。
在应激过程中的乙烯产生引起或增加阴性应激相关症状的情况下，需要产生对乙烯的敏感性较低的作物植物。为此，本发明提供了通过调节EIN3、ERF3、EBF1、EBF2或EIN5基因或基因产物中的一种或多种的表达或活性，降低植物尤其是诸如玉米的谷物的乙烯敏感性，以产生乙烯介导效应更少的植物。
抗病性
作物植物对广泛的病原体易感，无论病毒、细菌、真菌还是昆虫。该易感性导致每年世界范围内作物产量大幅下降。作物育种工作者尽力培育能抵抗病原体攻击的更具抗性或耐性的品种。另外基因工程策略也寻求同样的目标。在许多植物-病原体相互作用中，已知疾病症状，最常见的是组织坏死和导致弱植物生长，是植物针对病原体而做出的活性防御反应的结果。即，所述症状由植物直接引起，而非病原体简单造成。在所有作物植物及其潜在病原体列表中，抗性是规则，易感性是例外。易感相互作用通常认为由植物不适宜的或不充分的激活防御导致，其导致症状发展增加和无法控制所述病原体。
已知乙烯与植物病原体防御系统有关。许多致病相关基因在表达时在mRNA的水平上受到乙烯诱导。我们对乙烯在植物病原体防御中所起作用的理解趋势是，乙烯和乙烯介导效应是对病原体攻击的下游反应的主要部分，如在症状发展中。乙烯似乎与植物对病原体攻击的反应和病原体导致的组织损伤有关。在易感相互作用中，乙烯实际上可以促进组织损伤。因此在这种情况下阻断乙烯产生或作用可实际上导致较少的组织损伤，即更明显的抗性，即使所述病原体与该植物相容。已知阻断乙烯作用能导致更高的易感性(如Knoester，et al.，(1988))或更多的抗性(如Lund，et al.，(1998)Plant Cell 10：371-382)，这表明，跟预期一样，乙烯作用的机制是复杂的，其依赖于不同植物和病原体的相互作用。
本发明提供了EIN3、ERF3、EBF1、EBF2或EIN5基因中的一种或多种基因实现对植物病原体的抗性增加的用途，尤其是对于单子叶植物，例如玉米。
对于大多数应用而言，这将涉及到通过调节EIN3、ERF3、EBF1、EBF2或EIN5基因或基因产物的表达或活性降低乙烯信号转导，目标是，产生对乙烯反应更少的植物，由此产生在病原体感染后不致老是发生组织损伤的植物。
已认识到，对于某些病原体而言，乙烯信号转导是获得实质性抗性所需的。这可以通过以下方式操作：将功能性乙烯敏感基因连接于病原体诱导型启动子，尤其是其诱导优先对一种病原体或多种病原体作出反应的启动子，对于所述病原体而言，实现主动抗性需要植物乙烯信号转导。
植物转化
转基因植物的产生对作物植物基因工程策略非常重要。转基因通常包括将外源DNA通过多种方法引入植物细胞中，例如粒子轰击或农杆菌感染，随后通常进行组织培养和植物再生。转基因植物生产依然是基因工程中昂贵和低效率的步骤，尤其是对于许多经济上最重要的作物植物，例如谷物，如玉米来说。
因此改善该过程的效率是非常重要的。
很长时间以来，人们认为乙烯作用对植物转化有负面影响。因此多种结合、捕捉或其他阻断乙烯积聚的方法被用于转化和组织培养中(参见Songstad，et al.，(1991)Plant Cell Reports 9：694-702)。粒子轰击方法引起大量组织/细胞损伤，该损伤已知能导致乙烯积聚。而且，在大多数组织培养方法中，某些组织比另一些生长的更好，如在转化体的化学选择中设计的那样。这类濒死的组织可放出乙烯，引起阳性转化体的抑制。将植物组织限制在容器中用于组织再生加重了所述效果，其导致乙烯的积聚，同样引起生长迟缓。由于已知乙烯能降低组织生长速率，甚至能促进细胞/组织死亡，需要在转化期间具有阻断或最小化乙烯作用的方法。
因此，本发明还提供了通过降低一种或多种EIN3、ERF3、EBF1、EBF2或EIN5基因的表达或活性，EIN3、ERF3、EBF1、EBF2或EIN5基因产生乙烯作用暂时或稳定降低的用途。
其他用途
本发明还提供了分离的核酸用作检测、定量或分离基因转录物的探针或扩增引物，所述核酸包含足够长并与本发明基因互补的多核苷酸。例如，本发明分离的核酸可用作：在筛选所需的转基因植物中检测mRNA水平不足的探针，检测基因突变(例如取代、缺失或添加)，在化合物筛选测定中监测表达上调或酶活性变化的探针，检测基因的任何数目的等位基因变体(多态性)、直系同源或旁系同的探针，或用于在原核细胞中定向诱变(参见例如美国专利5,565,350号)的探针。本发明分离的核酸可用于其编码的多肽的重组表达，或在抗体的制备和/或筛选中用作免疫原。本发明分离的核酸还可用于在宿主细胞、组织或植物中有义或反义抑制一种或多种本发明基因。结合、嵌入、切割和/或交联本发明分离的核酸的化学试剂的连接，也可用于调节转录或翻译。
本发明还提供了分离的蛋白，其包含本发明的多肽(例如，前酶原、酶原或酶)。本发明还提供了包含本发明多肽的至少一个表位的蛋白。本发明的蛋白可用于测定酶功能的酶激动剂或拮抗剂，或用作免疫原或抗原以获得与本发明的蛋白特异性免疫反应的抗体。这些抗体可用于测定表达水平、从表达文库中鉴定和/或分离本发明的核酸、从其他种类中鉴定同源多肽或纯化本发明的多肽。
本发明分离的核酸和多肽可用于多种植物类型中，尤其是单子叶植物，例如禾本科的种类，包括大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、小麦属(Tritium)、高粱属(Sorghum)(例如高粱(S.bicolor)和玉米属(例如玉米(Z.mays))。本发明分离的核酸和蛋白也可用于下列属的种类中：南瓜属(Cucurbita)、玫瑰属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、胡桃属(Juglans)、草莓属(Fragaria)、莲花属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、红豆草属(Onobrychis)、红花草属(Trifolium)、葫芦巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芥属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、莨菪属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、喇叭花属(Petunia)、洋地黄属(Digitalis)、墨角纶属(Majorana)、菊苣属(Ciahorium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhiunum)、萱草属(Heterocallis)、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、稷属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛良属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、喇叭舌属(Salpiglossis)、黄瓜属(Cucumis)、紫水晶属(Browallia)、甘氨酸属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、黑麦草属(Lolium)、稻属(Oryza)和燕麦属(Avena)。
核酸
除其他外，本发明还提供了包含本发明多核苷酸的分离的RNA、DNA核酸及其类似物和/或嵌合体。
本发明的多核苷酸包括：
(a)编码SEQ ID NOS：2、4、6、8或10多肽的多核苷酸及其保守修饰和多态性变体，包括示例性的SEQ ID NOS：1(EIN3)、3(EBF1)、5(EBF2)、7(EIN5)或9(ERF3)的多核苷酸；
(b)分离的多核苷酸，其为使用在严紧条件下与本发明多核苷酸内位点选择性杂交的引物对从植物核酸文库中扩增的产物；
(c)分离的多核苷酸，其与(a)或(b)的多核苷酸选择性杂交；
(d)分离的多核苷酸，其与(a)、(b)或(c)的多核苷酸具有特定的序列同一性；
(e)分离的多核苷酸，其编码具有原型多肽的特定数目连续氨基酸的蛋白，其中所述蛋白被由该蛋白呈递所诱发的抗血清特异性识别，其中该蛋白不与完全被该蛋白免疫吸附的抗血清可检测地免疫反应；
(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的多核苷酸的互补序列；以及
(g)分离的多核苷酸，包含至少一定数目的来自(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸的连续核苷酸；
(h)来自全长富集的cDNA文库的分离的多核苷酸，所述文库具有与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)的多核苷酸选择性杂交的物理化学性质；
(i)分离的多核苷酸，通过下列过程制备：1)提供全长富集的核酸文库，2)将所述多核苷酸与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的多核苷酸选择性杂交，由此从核酸文库中分离该多核苷酸。
A.编码本发明多肽的多核苷酸
如上文(a)中所述，本发明提供了包含本发明多核苷酸的分离的核酸。其中所述多核苷酸编码本发明的多肽。参考遗传密码，本文中的每个编码多肽的核酸序列，同样记述了该核酸的每个可能的沉默变异。本领域技术人员应当认识到，核酸中的每个密码子(除通常为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG及通常为色氨酸的唯一密码子的UGG外)经修饰，可以产生功能相同的分子。因此，编码本发明多肽的核酸的各沉默变异暗含于每一描述的多肽序列中，并落于本发明的范围内。因此，本发明包括本发明的多核苷酸和编码本发明多肽的多核苷酸。
B.从植物核酸文库中扩增的多核苷酸
如上文(b)中所述，本发明提供了包含本发明多核苷酸的分离的核酸，其中所述多核苷酸在核酸扩增条件下从植物核酸文库中扩增。
各种扩增方法中每一方法的核酸扩增条件，是本领域技术人员公知的。植物核酸文库可从单子叶植物例如谷物作物构建。示例性的谷物包括玉米、高粱、苜蓿、卡诺拉、小麦或水稻。植物核酸文库也可从双子叶植物例如大豆中构建。玉米株系B73、PHRE1、A632、BMP2#10、W23和Mol7是已知的并且公众可获得。其他公众已知并可获得的玉米株系可从玉米遗传公司(Maize Genetics Cooperation，Urbana，IL)获得。
小麦株系可从小麦遗传资源中心(Wheat Genetics Resource Center，Manhattan，KS)获得。核酸文库可以是cDNA文库、基因组文库、或由内含子加工的任何阶段的核转录物一般性构建的文库。cDNA文库可被标准化以增加相对稀少的cDNA的代表性。在任选的实施方案中，cDNA文库使用富集的全长cDNA合成方法构建。此类方法的实例包括Oligo-Capping法(Maruyama and Sugano，(1994)Gene 138：171-174)、生物素化的CAP Trapper法(Carninci，et al.，(1996)Genomics 37：327-336)和CAP Retention Procedure(Edery，et al.，(1995)Molecular and CellularBiology 15：3363-3371)。优选快速生长组织或快速分裂细胞作为构建cDNA文库的mRNA源。玉米的生长阶段描述于1993年2月再版的″Howa Corn Plant Develops，″Special Report 48，Iowa State University of Scienceand Technology Cooperative Extension Service，Ames，Iowa中。
该实施方案的多核苷酸(或其子序列)例如可通过使用扩增引物获得，所述扩增引物在核酸扩增条件下，选择性杂交于并延伸至本发明多核苷酸内至少两个位点，或位于本发明多核苷酸的侧翼并包含本发明的多核苷酸的核酸内的两个位点，或本发明多核苷酸内的位点和包含本发明多核苷酸的核酸内的位点。获得载体插入物5′和/或3’末端的方法是本领域公知的。参见例如Frohman，PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(PCR策略：方法和应用指南)，Innis，et al.，Eds.(AcademicPress，Inc.，San Diego)，pp.28-38(1990))中描述的RACE(RapidAmplification of Complementary Ends(互补末端的快速扩增))；同样参见美国专利5,470,722号以及Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学方法)，Unit 15.6，Ausubel，et al.，Eds.，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York(1995)；Frohman and Martin，(1989)Techniques 1：165。
任选地，所述引物与其扩增的靶核酸子序列互补，但相对于以下多核苷酸可具有约85％到99％的序列同一性：所述引物经设计与所述多核苷酸退火。如本领域技术人员应当了解的，选择引物对选择性杂交的位点，使得在所需的核酸扩增条件下能形成单个连续的核酸。核苷酸中引物的长度选自由至少15-50组成的整数组。因此，引物的长度可以是至少15、18、20、25、30、40或50个核苷酸。本领域技术人员应当理解，可使用加长的引物序列以增加与靶序列结合(即退火)的特异性。在引物5’端可加入非退火序列(尾)，以便例如在扩增子的末端引入克隆位点。
扩增产物可使用本领域技术人员公知的表达系统翻译。所得翻译产物可例如通过测定适宜的催化活性(例如比活性和/或底物特异性)，或验证对本发明的多肽具有特异性的一个或多个表位的存在，证实为本发明的多肽。从PCR衍生模板的蛋白合成方法是本领域已知的，并且可从商业上获得。参见例如Amersham Life Sciences，Inc，Catalog′97，p.354。
C.与(A)或(B)的多核苷酸选择性杂交的多核苷酸
如上文(c)中所述，本发明提供了包含本发明多核苷酸的分离的核酸，其中该多核苷酸在选择性杂交条件下与上述(A)或(B)部分的多核苷酸选择性杂交。因此，该实施方案的多核苷酸可用于分离、检测和/或定量包含(A)或(B)的多核苷酸的核酸。例如，本发明的多核苷酸可用于鉴定、分离或扩增存储库中的部分或全长克隆。
在某些实施方案中，所述多核苷酸是基因组或cDNA序列，其分离自双子叶或单子叶核酸文库或相反与双子叶或单子叶核酸文库的cDNA互补。
单子叶植物和双子叶植物的示例性种类包括但不限于，玉米、卡诺拉、大豆、棉花、小麦、高粱、向日葵、苜蓿、燕麦、甘蔗、谷子、大麦和水稻。cDNA文库包含至少50％-95％的全长序列(例如至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的全长序列)。可标准化cDNA文库以增加稀有序列的代表性。参见例如美国专利5,482,845号。序列同一性相对于互补序列降低的序列，通常但非绝对使用低严紧杂交条件。对于具有更高同一性的序列可任选地使用中等和高严紧条件。低严紧条件允许具有约70％到80％序列同一性的序列选择性杂交，可用于鉴定正向同源和共生同源序列。
D.与(A)、(B)或(C)的多核苷酸具有特定序列同一性的多核苷酸
如上文(d)中所述，本发明提供了包含本发明多核苷酸的分离的核酸，其中该多核苷酸在核苷酸水平上与上述(A)、(B)或(C)部分的多核苷酸具有特定的同一性。同一性可使用例缺省条件下的BLAST、CLUSTALW或GAP算法计算。与参考序列的同一性百分比为至少60％，向上四舍五入至最接近的整数，可表达为选自60-99的整数。因此，例如与参考序列的同一性百分比可为至少70％、75％、80％、85％、90％或95％。
任选地，该实施方案的多核苷酸将编码这样的多肽，其与(A)、(B)或(C)部分的多核苷酸所编码的多肽共有表位。因此，这些多核苷酸编码诱发包含抗体的抗血清产生的第一多肽，所述抗体与由(A)、(B)或(C)的多核苷酸所编码的第二多肽特异性反应。然而，当抗血清被第一多肽完全免疫吸附时，第一多肽并不与针对其本身而产生的抗血清结合。因此，该实施方案的多核苷酸可用于产生抗体，其用于例如筛选包含(A)、(B)或(C)的多核苷酸的核酸的表达文库，或用于纯化或免疫测定(A)、(B)或(C)的多核苷酸所编码的多肽。本实施方案的多核苷酸包含可用于与编码本发明的多肽的多核苷酸选择性杂交的核酸序列。
可使用肽展示文库方便的筛选与抗血清特异性结合的多肽。该方法包括在大量的肽结合中筛选具有所需功能或结构的个体成员。
肽展示文库的抗体筛选是本领域公知的。展示的肽序列的长度可以为3-5000或更多个氨基酸，通常为5100个氨基酸，通常为约8-15个氨基酸。除直接化学合成产生肽文库外，已描述了某些重组DNA方法。一类方法包括在噬菌体或细胞表面展示肽序列。每个噬菌体或细胞含有编码具体展示的肽序列的核苷酸序列。这样的方法描述于PCT专利公开91/17271号、91/18980号、91/19818号和93/08278号中。其他用于产生肽文库的系统具有体外化学合成和重组方法两方面的内容。参见PCT专利公开92/05258号、92/14843号和97/20078号。同样参见美国专利5,658,754号和5,643,768号。肽展示文库、载体和筛选试剂盒可从诸如Invitrogen(Carlsbad，CA)的供应商处商购获得。
E.编码具有来自原型多肽的子序列并对原型多肽具有交叉反应性的 蛋白的多核苷酸
如上文(e)中所述，本发明提供了包含本发明多核苷酸的分离的核酸，其中该多核苷酸编码具有上述(a)中所提供的来自本发明原型多肽的连续氨基酸的子序列的蛋白。来自原型多肽的连续氨基酸的长度选自至少10到所述原型序列中的氨基酸数目之间的整数。因此，例如，所述多核苷酸可编码具有来自原型多肽的至少10、15、20、25、30、35、40、45或50个连续氨基酸的子序列的多肽。此外，本实施方案的多核苷酸编码的此类子序列数目可以为选自1-20的任意整数，例如2、3、4或5。所述子序列可被1到序列中核苷酸数目之间的任意整数的核苷酸分离，例如至少5、10、15、25、50、100或200个核苷酸。
该实施方案多核苷酸编码的蛋白当作为免疫原呈递时，诱发与原型多肽特异性结合的多克隆抗体，所述原型多肽包括但不限于上文(a)或(b)的多核苷酸所编码的多肽。然而，当抗血清被原型多肽完全免疫吸附时，通常该实施方案的多核苷酸所编码的蛋白不与针对原型多肽而产生的抗血清结合。制备和测定抗体结合特异性/亲和性的方法是本领域公知的。示例性的免疫测定方法包括ELISA、竞争性免疫测定、放射免疫测定、蛋白质印迹、间接免疫荧光测定等。
在优选的测定方法中，可在竞争性结合测定中使用原型多肽诱发的完全吸附和合并的抗血清测试蛋白。测定抑制50％抗血清与原型多肽结合所需的原型多肽的浓度。如果抑制结合所需的蛋白量低于原型蛋白量的两倍，则就说该蛋白与该免疫原所诱发的抗血清特异性结合。
因此，本发明的蛋白包括原型多肽的等位变体、保守修饰的变体以及次要的重组修饰。
本发明的多核苷酸任选地编码具有这样分子量的蛋白：作为非糖基化蛋白，其分子量在本发明全长非糖基化多肽的20％以内。分子量可在还原条件下通过SDS-PAGE方便地测定。任选地，所述分子量在本发明全长多肽的15％以内，更优选在10％或5％以内，最优选在本发明全长多肽的3％、2％或1％以内。任选地，该实施方案的多核苷酸编码具有特定酶活性的蛋白，所述酶活性至少为包含本发明的天然、内源性全长多肽的细胞提取物的50％、60％、80％或90％。
此外，该实施方案的多核苷酸所编码的蛋白将任选地具有与天然的内源性全长蛋白实质上相似的亲和常数(Km)和/或催化活性(即，微观速率常数，kcat)。本领域技术人员应当认识到，kcat/Km值决定了竞争底物的特异性，通常称为特异性常数。该实施方案的蛋白的kcat/Km值为至少本发明全长多肽的10％，这可使用多肽的内源性底物测定。任选地，该kcat/Km值为本发明全长多肽kcat/Km值的至少20％、30％、40％、50％和最优选至少60％、70％、80％、90％或95％。
kcat、Km和kcat/Km的测定可通过任何本领域技术人员公知的方法进行。例如，起始速率(即最初5％或更少的反应)可使用快速混合和取样技术(例如恒流或快速中止技术)、快速光解或松弛法(例如温度跃变)与诸如分光光度法、荧光分光光度法、核磁共振或放射性方法的此类示例性方法联合测定。使用Lineweaver Burk或Eadie-Hofstee作图法可方便的获得动力学值。
F.与(A)-(E)的多核苷酸互补的多核苷酸
如上文(f)中所述，本发明提供了分离的核酸，其包含与上文A-E段中的多核苷酸互补的多核苷酸。本领域技术人员应当认识到，互补序列在其整个长度内与(A)-(E)部分多核苷酸碱基配对(即在其整个长度内具有100％的序列同一性)。互补碱基在双链核酸内通过氢键结合，例如，下列碱基对是互补的：鸟嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；以及腺嘌呤和尿嘧啶。
G.为(A)-(F)的多核苷酸的子序列的多核苷酸
如上文(g)中所述，本发明提供了包含多核苷酸的分离的核酸，所述多核苷酸包含来自上文所述A(A)到(F)的多核苷酸的至少15个连续碱基。给出的该多核苷酸的长度为选自至少15到核酸序列的长度，所述多核苷酸是所述核酸序列的子序列。因此例如，本发明的多核苷酸包括包含来自(A)到(F)多核苷酸的长度为至少15、20、25、30、40、50、60、75或100个连续核苷酸的多核苷酸。任选地，该实施方案的多核苷酸所编码的此类子序列的数目可以是选自1-20的任意整数，例如2、3、4或5。所述子序列可被1到序列中核苷酸数目之间的任意整数的核苷酸分离，例如至少5、10、15、25、50、100或200个核苷酸。
子序列可通过体外合成、体外生物合成或体内重组方法制备。在任选的实施方案中，子序列可通过核酸扩增制备。例如，可构建核酸引物以与编码区内的序列(或其互补物)选择性杂交或与或编码区共同延伸。
本发明的子序列可包括本领域已知的结构文库，其是本领域已知的并在下文作了简要描述。cDNA文库包含至少50％-95％的全长序列(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的全长序列)。该cDNA文库可从不同发育阶段的单子叶或双子叶植物的多种组织中构建。示例性的种类包括玉米、小麦、水稻、卡诺拉、大豆、棉花、高粱、向日葵、苜蓿、燕麦、甘蔗、谷子、大麦和水稻。在选择性杂交条件下，使全长富集的文库中的多核苷酸与本发明的多核苷酸选择性杂交的方法，是本领域普通技术人员已知的。可使用任何数目的严紧条件，以允许选择性杂交。在任选的实施方案中，该严紧度允许在杂交区域长度内具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的序列同一性的序列选择性杂交。可标准化全长富集的cDNA文库，以增加稀有序列的代表性。
I.通过cDNA分离方法制备的多核苷酸产物
如上文(I)中所述，本发明提供了分离的核酸，其由下列方法制备：1)提供全长富集的核酸文库，2)使所述多核苷酸与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的多核苷酸选择性杂交，由此从核酸文库中分离该多核苷酸。如(G)段和下文所讨论的，构建全长富集的核酸文库。选择性杂交条件如(G)段中所讨论的。核酸纯化方法在本领域是公知的。
纯化可使用固相方法方便地完成；此类方法是本领域技术人员公知的，试剂盒可从例如Advanced Biotechnologies(Surrey，UK)的供应商处获得。例如，可将(A)-(H)段的多核苷酸固定至固相支持体例如膜、珠或颗粒上，参见例如美国专利5,667,976号。使本方法的多核苷酸产物与固定的多核苷酸选择性杂交，随后通过包括但不限于离心、磁分离(magneticseparation)、过滤、电泳等的方法，从非杂交的多核苷酸中分离固相支持体。
核酸的构建
本发明分离的核酸可使用以下制备：(a)标准重组方法，(b)合成技术或其组合。在某些实施方案中，本发明的多核苷酸将从单子叶植物例如玉米、水稻或小麦中，或双子叶植物例如大豆中克隆、扩增或构建。
除本发明的多核苷酸外，所述核酸可方便地包含其他序列。例如，可在核酸中插入包含一个或多个内切核酸酶限制性位点的多克隆位点，以帮助分离所述多核苷酸。同样可插入可译的序列以帮助分离翻译的本发明的多核苷酸。例如，六组氨酸标记序列提供了纯化本发明蛋白的便利方法。本发明的多核苷酸可与载体、接头(adapter)或连接子连接，用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸。在此类克隆和/或表达序列中可添加其他序列，以优化其克隆和/或表达功能，帮助分离所述多核苷酸或改善所述多核苷酸向细胞的引入。通常，本发明的核酸长度低于其本发明多核苷酸的长度，为低于20千个碱基对，通常低于15kb，更通常低于10kb。克隆载体、表达载体、接头和连接子的用途是本领域公知的，并有广泛描述。对于各种核酸的描述，可参见例如Stratagene Cloning Systems，Catalogs 1999(La Jolla，CA)；和Amersham Life Sciences，Inc，Catalog′99(Arlington Heights，IL)。
A.构建核酸的重组方法
本发明的分离的核酸组合物，例如RNA、cDNA、基因组DNA或其杂交物，可使用任何本领域技术人员已知的克隆方法从植物生物来源获得。在某些实施方案中，使用在严紧条件下与本发明的多核苷酸选择性杂交的寡核苷酸探针在cDNA或基因组DNA文库中鉴定所需的序列。RNA的分离及cDNA和基因组文库的构建是本领域技术人员公知的。参见例如Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual(植物分子生物学：实验室手册)，Clark，Ed.，Springer-Verlag，Berlin(1997)；以及CurrentProtocols in Molecular Biology(最新分子生物学方法)，Ausubel，et al.，Eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。
A1.全长富集的cDNA文库
已描述了许多cDNA合成的方法，其提供了富集的全长cDNA文库。构建富集的全长cDNA文库，使其在含有插入物的克隆中包含至少60％、更优选70％、80％、90％或95％全长插入物。此类文库中插入物的长度可以为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多千碱基对。容纳这些大小的插入物的载体是，本领域已知的且可商业上购买获得。参见例如Stratagene′s lambda ZAP Express(克隆能力为0-12kb的cDNA克隆载体)。构建超过95％纯度的全长cDNA文库的示例性方法描述于Carninci，et al.，(1996)Genomics 37：327-336中。产生全长文库的其他方法是本领域已知的，参见例如Edery，et al.，(1995)Mol. Cell Biol.15(6)：3363-3371；以及PCT申请WO96/34981。
A2标准化或扣除的cDNA文库
非标准化的cDNA文库代表其来源组织的mRNA群。由于衍生自高表达基因的克隆在数量上超过独特的克隆，因此独特克隆的分离是费力的。cDNA文库的标准化是建立文库的方法，在该文库中更能平等地代表每个克隆。标准化文库的构建描述于Ko，(1990)Nucl.Acids.Res.18(19)：5705-5711；Patanjali，et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.USA88：1943-1947；US专利5,482,685号、5,482,845号和5,637,685号中。在Soares等所述的示例性方法中，标准化导致克隆的丰度从4个数量级降低到仅1个数量级。Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：9228-9232(1994)。
扣除的cDNA文库是增加丰度较少的cDNA种类比例的另一种方法。在该方法中，从mRNA一个库中制备的cDNA被存在于mRNA的第二库的序列通过杂交耗竭。cDNA:mRNA杂交物得以除去，对于对该库独特的序列，富集剩余的未杂交cDNA库。参见Foote，et al.，in，PlantMolecular Biology：A Laboratory Manual(植物分子生物学：实验室手册)，Clark，Ed.，Springer-Verlag，Berlin(1997)；Kho and Zarbl，(1991)Technique3(2)：58-63；Sive and St.John，(1988)Nucl.Acids Res.16(22)：10937；CurrentProtocols in Molecular Biology(最新分子生物学方法)，Ausubel，et al.，Eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)；以及Swaroop，et al.，(1991)Nucl.Acids Res.19(8)：1954。cDNA扣除试剂盒可商购获得。参见例如PCR-Select(Clontech，Palo Alto，CA)。
为了构建基因组文库，例如使用限制性内切核酸酶，通过断裂，产生基因组DNA的大片段，并与载体DNA连接，形成可包装入适当载体内的多联体。完成该过程的方法以及验证核酸序列的测序方法是本领域公知的。足以指导本领域技术人员进行多种构建、克隆和筛选方法的适当分子生物学技术和说明参见Sambrook，et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，2nd Ed.(第二版)，Cold SpringHarbor Laboratory Vols.1-3(1989)，Methods in Enzymology，Vol.152：Guide to Molecular Cloning Techinque(分子克隆技术指南)，Berger andKimmel，Eds.，San Diego：Academic Press，Inc.(1987)，Current Protocols inMolecular Biology(最新分子生物学方法)，Ausubel，et al.，Eds.，GreenePublishing and Wiley-Interscience，New York(1995)；Plant MolecularBiology：A Laboratory Manual(植物分子生物学：实验室手册)，Clark，Ed.，Springer-Verlag，Berlin(1997)。构建基因组文库的试剂盒也是商业上可获得的。
cDNA或基因组文库可使用基于本发明的多核苷酸序列的探针筛选，例如本文中公开的那些。可使用探针与基因组DNA或cDNA序列杂交，以分离同种或不同植物种类中的同源基因。本领域技术人员应当了解，该测定中可使用各种程度的杂交严紧度，杂交或洗涤介质可以是严紧的。
使用扩增技术，有关核酸也可从核酸样品中扩增。例如，聚合酶链式反应(PCR)技术可用于扩增本发明多核苷酸的序列，并从基因组DNA或cDNA文库中直接扩增相关基因。PCR和其他体外扩增方法也可用于，例如克隆编码要表达的蛋白的核酸序列，制备用作检测样品中所需mRNA存在的探针的核酸，核酸测序或其他目的。T4基因32蛋白(Boehringer Mannheim)可用于改善长PCR产物的产量。
已描述了基于PCR的筛选方法。Wilfinger等描述了基于PCR的方法，其中在第一步鉴定最长的cDNA，以从研究中除去不完整的克隆。BioTechniques 22(3)：481-486(1997)。所述方法与前述全长cDNA构建方法组合时尤其有用。
B.构建核酸的合成方法
本发明的分离的核酸也可通过下列方法使用直接化学合成制备：，Narang，et al.，(1979)Meth.Enzymol.68：90-99的磷酸三酯法；Brown，et al.，(1979)Meth.Enzymol.68：109-151的磷酸二酯法；Beaucage，et al.，(1981)Tetra.Lett.22：1859-1862的二乙基亚磷酰胺法；Beaucage and Caruthers，(1981)Tetra.Letts.22(20)：1859-1862描述的固相亚磷酰胺三酯法，例如使用自动合成器，例如Needham-VanDevanter，et al.，(1984)Nucleic Acids Res.12：6159-6168中所述；以及美国专利4,458,066号的固相支持体法。化学合成通常产生单链寡核苷酸。其可以通过与互补序列杂交，或通过使用该单链作为模板的DNA聚合酶聚合转化成双链DNA。本领域技术人员应当了解，尽管对于约100个碱基或更少的序列，最好使用DNA的化学合成，但可通过连接较短的序列获得更长的序列。
重组表达盒
本发明还提供了包含本发明核酸的重组表达盒。编码本发明的所需多肽的核酸序列，例如编码本发明全长多肽的cDNA或基因组序列可用于构建重组表达盒，其可被引入所需的宿主细胞。重组表达盒通常包含可操作地连接于转录起始调控序列的本发明的多核苷酸，该转录起始调控序列将指导所述多核苷酸在预期的宿主细胞例如转化的植物的组织中转录。
例如，植物表达载体可包括：(1)在5’和3’调控序列转录控制下的克隆的植物基因，以及(2)显性选择标记。如需要的话，此类植物表达载体还可含有启动子调节区(例如赋予诱导型或组成型、环境或发育调节的、或细胞或组织特异性/选择性表达的启动子调节区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。
植物启动子片段可用于指导本发明多核苷酸在再生植物的所有组织中表达。这类启动子在本文中称为“组成型”启动子，在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下是活性的。组成型启动子的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区、来源于根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)T-DNA的1′-或2′-启动子、泛素1启动子、Smas启动子，肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利5,683,439号)、Nos启动子、pEmu启动子、rubisco启动子、GRP1-8启动子和来自本领域技术人员已知的各种植物基因的其他转录起始区。
可选地，植物启动子可指导本发明的多核苷酸在特定的组织中表达，或可以受更精确的环境或发育控制。这类启动子在本文中称为“诱导型”启动子。通过诱导型启动子可影响转录的环境条件包括病原体攻击、缺氧条件或存在光。诱导型启动子的实例是，被缺氧或冷应激诱导的Adh1启动子，被热应激诱导的Hsp70启动子，以及被光诱导的PPDK启动子。
发育控制下启动子的实例包括仅在或优选在某些特定组织，例如叶、根、果实、种子或花中起始转录的启动子。示例性的启动子包括花药特异性启动子5126(美国专利5,689,049号和5,689,051号)、glob-1启动子和γ玉米醇溶蛋白启动子。启动子的操作也可根据其在基因组中的位置而变化。因此可诱导的启动子可以在某些位点变成完全或部分组成型的。
异源和非异源(即，内源性)启动子均可用于指导本发明的核酸的转录。这些启动子也可例如用于重组表达盒中以驱动反义核酸的表达，从而降低、增加或改变在所需组织中本发明蛋白的浓度和/或组成。因此，在某些实施方案中，核酸构建体将包括在植物细胞例如玉米内有功能的启动子，其可操作地连接于本发明的多核苷酸连接。用于这些实施方案中的启动子包括驱动本发明多肽表达的内源性启动子。
许多启动子可用于实施本发明，包括目的多核苷酸序列的天然启动子。所述启动子可基于所需的结果选择。核酸可与组成型、诱导型、组织优选或其他启动子组合，用于在植物中表达。
此类组成型启动子包括，例如Rsyn7启动子的核心启动子，以及WO99/43838和美国专利6,072,050号中公开的其他组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell，et al.，(1985)Nature 313：810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy，et al.，(1990)Plant Cell 2：163-171)；泛素(Christensen，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last，et al.，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten，et al.，(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利5,659,026号)；dMMV(烟草花叶病毒启动子的双倍增强版本；参见Dey and Maiti(1999)Plant Molecular Biology 40(5)：771-782)，LESVBV(增强的草莓脉结病毒启动子；参见美国专利申请2002/0182593号)等。其他组成型启动子包括，例如美国专利5,608,149号、5,608,144号、5,604,121号、5,569,597号、5,466,785号、5,399,680号、5,268,463号、5,608,142号和6,177,611号。
组织优选启动子可用于在具体植物组织中靶向增强的表达。组织优选启动子包括Yamamoto，et al.，(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kawamata，et al.，(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen，et al.，(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343；Russell，et al.，(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart，et al.，(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341；VanCamp，et al.，(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini，et al.，(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto，et al.，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196；Orozco，etal.，(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka，et al.，(1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590和Guevara-Garcia，et al.，(1993)Plant J. 4(3)：495-505。如果需要，可修饰这些启动子，用于弱表达。同样参见美国专利申请2003/0074698号，在此将其通过引用并入。
叶优选启动子是本领域已知的。例如参见Yamamoto，et al.，(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kwon，et al.，(1994)Plant Physiol.105：357-67；Yamamoto，et al.，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Gotor，et al.，(1993)Plant J. 3：509-18；Orozco，et al.，(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138；Baszczynski，et al.，(1988)Nucl.Acid Res.16：4732；Mitra，等，(1994)Plant Molecular Biology 26：35-93；Kayaya，et al.，(1995)Molecular and General Genetics 248：668-674；以及Matsuoka，et al.，(1993)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 90(20)：9586-9590。也使用调节衰老的启动子，例如SAM22(Crowell，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：459-466)。也参见美国专利5,689,042号，在此将其其通过引用并入。
根优选启动子是已知的，可选自可从篇文献获得的许多启动子，或从不同的适合种类中重新分离。参见，例如Hire，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.20(2)：207-218(大豆根特异性的谷氨酰胺合成酶基因)；Keller andBaumgartner(1991)Plant Cell 3(10)：1051-1061(菜豆GRP 1.8基因中根特异性的控制元件)；Sanger，et al.，(1990)Plant Mol.Biol.14(3)：433-443(根瘤农杆菌甘露碱合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；以及Miao，et al.，(1991)Plant Cell 3(1)：11-22(编码细胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。还参见Bogusz，et al.，(1990)Plant Cell 2(7)：633-641，其中描述了从来自固氮的非豆类Parasponiaandersonii和有关的非固氮非豆类山黄麻(Trema tomentosa)血红蛋白基因中分离的两种根特异性启动子。这些基因的启动子与β-葡糖苷酸酶报告基因连接，并引入非豆类烟草(Nicotiana tabacum)和豆类百脉根(Lotuscorniculatus)中，在两种情况下根特异性启动子的活性均得以保留。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们关于毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)高表达的rolC和rolD根诱导基因启动子的分析(参见Plant Science(Limerick)79(1)：69-76)。他们得出的结论是，增强子和组织优选DNA决定子在这些启动子中解离。Teeri，et al.，(1989)使用与lacZ的基因融合物表明，编码章鱼碱合酶的T-DNA基因在根尖的表皮中尤其具有活性，并且TR2′基因在完整的植物中是根特异性的，并受叶组织的创伤刺激，它们是特别期望的特征组合，用于与杀虫或杀幼虫基因一起使用(参见EMBO J. 8(2)：343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1′基因显示了类似的性质。其他根优选启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster，et al.，(1995)Plant Mol.Biol.29(4)：759-772)；rolB启动子(Capana，et al.，(1994)Plant Mol.Biol.25(4)：681-691；以及带有ADH第一内含子的CRWAQ81根优选启动子(美国专利申请公开2005/0097633号)。还参见美国专利5,837,876号、5,750,386号、5,633,363号、5,459,252号、5,401,836号、5,110,732号和5,023,179号。
“种子优选”启动子是指在种子发育过程中有活性的启动子，可包括在种子起始物或有关母体组织中的表达。这类种子优选启动子包括但不限于，Cim1(细胞分裂素诱导的信息)、cZ19B1(玉米19kDa玉米醇溶蛋白)、milps(肌红蛋白-肌醇-1-磷酸合酶)(参见WO 00/11177和美国专利6,225,529号；在此将其通过引用并入)。γ玉米醇溶蛋白是胚乳特异性启动子。球蛋白-1(Glob-1)是代表性胚特异性启动子。对于双子叶植物来说，种子特异性启动子包括但不限于，豆β-菜豆蛋白、napin、β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等。对于单子叶植物来说，种子特异性启动子包括但不限于，玉米15kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、γ玉米醇溶蛋白、waxy、shrunken 1和shrunken 2。同样参见WO 00/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子优选启动子；在此将其通过引用并入。其他胚特异性启动子公开于Sato，et al.，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93：8117-8122；Nakase，et al.，(1997)Plant J12：235-46；以及Postma-Haarsma，et al.，(1999)Plant Mol.Biol.39：257-71。其他胚乳特异性启动子披露于Albani，et al.，(1984)EMBO 3：1405-15；Albani，et al.，(1999)Theor.Appl. Gen.98：1253-62；Albani，et al.，(1993)Plant J. 4：343-55；Mena，et al.，(1998)The Plant Journal 116：53-62，以及Wu，et al.，(1998)Plant Cell Physiology 39：885-889。
同样感兴趣的是在分生组织区有活性的启动子，例如发育中的花序组织，以及驱使在花期或早期核发育时表达的启动子。其可包括，例如玉米Zag启动子，包括Zag1和Zag2(参见，Schmidt，et al.，(1993)The PlantCell 5：729-37；GenBank X80206；Theissen，et al.，(1995)Gene 156：155-166；以及美国专利申请10/817,483号)；玉米Zap启动子(也称为ZmMADS；美国专利申请10/387,937号；WO 03/078590)；玉米ckx1-2启动子(美国专利申请公开2002/0152500A1号；WO 02/0078438)；玉米eep1启动子(美国专利申请10/817,483号)；玉米end2启动子(美国专利6,528,704号和美国专利申请10/310,191号)；玉米lec1启动子(美国专利申请09/718,754号)；玉米F3.7启动子(Baszczynski，et al.，(1997)Maydica 42：189-201)；玉米tb1启动子(Hubbarda，et al.，(2002)Genetics 162：1927-1935和Wang，et al.，(1999)Nature 398：236-239)；玉米eep2启动子(美国专利申请10/817,483号)；玉米硫氧还蛋白H启动子(美国临时专利申请60/514,123号)；玉米Zm40启动子(美国专利6,403,862号和WO 01/2178)；玉米mLIP15启动子(美国专利6,479,734号)；玉米ESR启动子(美国专利申请10/786,679号)；玉米PCNA2启动子(美国专利申请10/388,359号)；玉米细胞分裂素氧化酶启动子(美国专利申请11/094,917号)；Weigal，et al.，(1992)Cell 69：843-859中所披露的启动子；登录号AJ131822；登录号Z71981；登录号AF049870；以及McAvoy，et al.，(2003)Acta Hort.(ISHS)625：379-385中披露的枝条优选启动子。其他目的分裂细胞或分生组织优选启动子披露于Ito，et al.，(1994)Plant Mol.Biol.24：863-878；Regad，et al.，(1995)Mo.Gen.Genet.248：703-711；Shaul，et al.，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93：4868-4872；Ito，et al.，(1997)Plant J.11：983-992；和Trehin，et al.，(1997)Plant Mol.Biol.35：667-672，在此将所有上述文献通过引用并入。
花序优选启动子包括查耳酮合酶启动子(Van der Meer，et al.，(1990)Plant Mol.Biol.15：95-109)、LAT52(Twell，et al.，(1989)Mol.Gen.Genet.217：240-245)、花粉特异性基因(Albani，et al.，(1990)Plant Mol Biol.15：605)、Zm13(Buerrero，et al.，(1993)Mol.Gen.Genet.224：161-168)、玉米花粉特异性基因(Hamilton，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：211-218)、向日葵花粉表达的基因(Baltz，et al.，(1992)The Plant Journal 2：713-721)，以及油菜(B.Napus)花粉特异性基因(Arnoldo，et al.，(1992)J.Cell.Biochem，Abstract Number Y101204)。
应激诱导启动子包括盐诱导或水应激诱导启动子，例如P5CS(Zang，et al.，(1997)Plant Sciences 129：81-89)；冷诱导启动子，例如corl5a(Hajela，etal.，(1990)Plant Physiol.93：1246-1252)、corl5b(Wlihelm，et al.，(1993)Plant Mol Biol23：1073-1077)、wscl20(Ouellet，et al.，(1998)FEBS Lett.423-324-328)、ci7(Kirch，et al.，(1997)Plant Mol Biol.33：897-909)、ci21A(Schneider，et al.，(1997)Plant Physiol.113：335-45)；干旱诱导启动子，例如Trg-31(Chaudhary，et al.，(1996)Plant Mol.Biol.30：1247-57)；渗透诱导启动子，例如Rab17(Vilardell，et al.，(1991)Plant Mol.Biol.17：985-93；Busk(1997)Plant J 11(6)：1285-1295)和渗调蛋白(osmotin)(Raghothama，etal.，(1993)Plant Mol Biol 23：1117-28)；以及热诱导启动子，例如热休克蛋白(Barros，et al.，(1992)Plant Mol.19：665-75；Marrs，et al.，(1993)Dev.Genet.14：27-41)，和smHSP(Waters，et al.，(1996)J.Experimental Botany47：325-338)。其他应激诱导启动子包括rip2(美国专利5,332,808号和美国专利申请公开2003/0217393号)，以及rd29a(Yamaguchi-Shinozaki，et al.，(1993)Mol.Gen.Genetics 236：331-340；同样参见GenBank登陆号D13044)。应激不敏感启动子也可用于本发明的方法中。
氮敏感启动子(nitrogen-responsive promoter)也可用于本发明的方法中，此类启动子包括但不限于，22kDa玉米醇溶蛋白启动子(Spena，et al.，(1982)EMBO J 1：1589-1594和Muller，et al.，(1995)J.Plant Physiol145：606-613)；19kDa玉米醇溶蛋白启动子(Pedersen，et al.，(1982)Cell29：1019-1025)；14kDa玉米醇溶蛋白启动子(Pedersen，et al.，(1986)J.Biol.Chem.261：6279-6284)、b-32启动子(Lohmer，et al.，(1991)EMBO J10：617-624)；以及亚硝酸还原酶(NiR)启动子(Rastogi，et al.，(1997)PlantMol Biol.34(3)：465-76和Sander，et al.，(1995)Plant Mol Biol.27(1)：165-77)。氮诱导启动子共有序列的综述参见例如Muller，et al.，(1997)The Plant Journal 12：281-291。
通过应用外源性化学调节剂，可使用化学调节的启动子调节植物中基因的表达。根据不同的目的，启动子可以是化学诱导启动子，其中化学制剂的应用诱导基因表达，或者是化学阻抑启动子，其中化学制剂的应用抑制基因表达。化学诱导启动子是本领域已知的，包括但不限于，玉米In2-2启动子，其由苯磺酰胺除草剂安全剂激活；玉米GST启动子，其由作为在萌发前施用的除草剂使用的疏水亲电化合物激活，以及烟草PR-1a启动子，其由水杨酸激活。其他目的化学调节的启动子包括类固醇敏感启动子(参见例如，Schena，et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10421-10425和McNellis，et al.，(1998)Plant J.14(2)：247-257)中的糖皮质激素诱导启动子，以及四环素诱导和四环素抑制启动子(参见例如，Gatz，等，(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237，和美国专利5,814,618号和5,789,156号)，在此通过引用并入。
其他诱导型启动子包括热休克启动子，例如Gmhsp17.5-E(大豆)(Czarnecka，et al.，(1989)Mol Cell Biol. 9(8)：3457-3463)、APX1基因启动子(拟南芥)(Storozhenko，et al.，(1998)Plant Physiol.118(3)：1005-1014)、Ha hsp17.7 G4(向日葵(Helianthus annuus))(Almoguera，et al.，(2002)Plant Physiol.129(1)：333-341；和玉米Hsp70(Rochester，et al.，(1986)EMBO J.5：451-8。
在某些实施方案中，可在本发明多核苷酸的非异源形式的适当位置(通常是上游)引入作为启动子或增强子元件的分离的核酸，以上调或下调本发明多核苷酸的表达。例如，体内的内源性启动子可通过突变、缺失和/或取代改变(参见Kmiec的美国专利5,565,350号；Zarling等的PCT/US93/03868)，或者在本发明基因的合适方向和距离处，将分离的启动子引入植物细胞中，以控制基因的表达。基因表达可在适合植物生长的条件下调节，以改变本发明多肽在植物细胞中的总浓度和/或组成。
因此，本发明提供了制备可操作地连接于天然、内源(即非异源)形式的本发明多肽的异源启动子和/或增强子的组合物和方法。
就组织类型、细胞类型、发育阶段和/或环境条件来讲，鉴定具有特定表达特征的启动子的方法是本领域公知的。参见例如玉米手册TheMaize Handbook(玉米手册)，Chapters 114-115(第114-115章)，Freeling andWalbot，Eds.，Springer，New York(1994)；Corn and Corn Improvement(玉米和玉米改良)，3rd edition(第3版)，Chapter 6，(第6章)，Sprague and Dudley，Eds.，American Society of Agronomy，Madison，Wisconsin(1988)。
启动子分离方法中的典型步骤是，鉴定在靶组织中以某种程度特异性表达的基因产物。方法包括：cDNA文库差示杂交、扣除杂交、差异展示、差异2-D蛋白凝胶电泳、DNA探针阵列；以及分离已知在靶组织中以某种程度的特异性表达的蛋白。此类方法对本领域技术人员来说是公知的。鉴定启动子的商业上可获得的产品是本领域已知的，例如Clontech′s(Palo Alto，CA)Universal Genome Walker Kit。
对于该基于蛋白的方法，有帮助的是，获得至少一部分已鉴定蛋白的氨基酸序列，随后用该蛋白序列作为制备核酸的基础，该核酸可用作探针直接鉴定基因组DNA，或优选鉴定来自由靶组织制备的文库的cDNA。一旦鉴定了此类cDNA克隆，则该序列可用于鉴定所示基因转录物5’端的序列。对于差示杂交、扣除杂交和差异展示，使用靶组织中鉴定为富集的核酸序列鉴定所示基因转录物5’端的序列。一旦鉴定了此类序列，从蛋白序列或核酸序列开始，任何鉴定为来自所述基因转录物的序列，可用于筛选从靶生物体制备的基因组文库。鉴定和确认转录起始位点的方法是本领域公知的。
在分离特定环境条件或应激下或特定组织中或特定发育阶段中表达的启动子的过程中，鉴定了许多在所需环境下、在所需组织中或在所需阶段中表达的基因。进一步的分析表明，每种具体基因在该植物的一种或多种其他组织中表达。可鉴定在所需组织或条件下具有活性，但在任何其他普通组织中没有活性的启动子。
为鉴定启动子序列，分析本文所述克隆的5’部分，以鉴定启动子序列的特征性序列。例如，启动子序列元件包括TATA盒共有序列(TATAAT)，其通常为5-10个bp的富含AT的一段序列，位于转录起始位点上游约20-40个碱基对。TATA盒的鉴定是本领域公知的。例如，一种预测该元件位置的方法是，使用标准mRNA作图技术，例如引物延伸、S1分析和/或RNA酶保护鉴定转录起始位点。为证实富含AT序列的存在，可进行结构功能分析，包括诱变假定的区域，量化突变对连接的下游报告基因表达的影响。参见例如The Maize Handbook(玉米手册)，Chapter 114(第114章)，Freeling and Walbot，Eds.，Springer，New York，(1994)。
在植物中，TATA盒的另一上游，位置约-80到-100处，通常有一个启动子元件(即，CAAT盒)，其具有围绕三核苷酸G(或T)N G一连串腺嘌呤。J.Messing，et al.，in Genetic Engineering in Plants，Kosage，Meredithand Hollaender，Eds.，pp.221-2271983。在玉米中，没有良好保守的CAAT盒，但在TATA盒上游有若干短的保守的蛋白结合基序。如果对每个基因是合适的，这些包括与光调节、缺氧诱导、激素调节或花青素生物合成有关的反式作用转录因子的基序。
一旦启动子和/或基因序列是已知的，从基因组DNA转录起始或翻译起始位点的5’端选取适当大小的区域，随后将所述序列连接于编码序列。如果使用转录起始位点作为融合点，可在转录起始位点和部分编码序列之间使用许多可能的5’非翻译区域中的任何非翻译区。如果使用特定启动子3’端的翻译起始位点，则随后将其直接连接到编码序列的甲硫氨酸起始密码子上。
如果需要多肽表达，通常需要在多核苷酸编码区的3’端包括多腺苷酸化区。该多腺苷酸化区可衍生自多种其他植物基因的天然基因或衍生自T-DNA。要加入的3’端序列可衍生自，例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或可选地另一植物基因，或较不优选地任何其他真核基因。
可向5’非翻译区或部分编码序列的编码序列添加内含子序列，以增加细胞溶质中积累的成熟信息的量。已显示在植物和动物表达构建体的转录单位中加入可剪切的内含子能使mRNA和蛋白水平上的基因表达增加高达1000倍，Buchman and Berg，(1988)Mol.Cell Biol.8：4395-4405；Callis，et al.，(1987)Genes Dev.1：1183-1200。此类基因表达的内含子增强通常在置于转录单位的5’端附近时最大。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6，Bronze-1内含子的使用是本领域已知的。通常参见The MaizeHandbook(玉米手册)，Chapter(第116章)，Freeling and Walbot，Eds.，Springer，New York(1994)。
包含来自本发明多核苷酸的序列的载体通常包含标记基因，其赋予植物细胞选择表型。通常，选择标记基因编码抗生素抗性，并带有合适的基因，包括编码抗生素壮观霉素抗性的基因(例如aada基因)，编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因，编码卡那霉素或遗传抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因，编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因，编码抑制乙酰乳酸合酶(ALS)作用的除草剂抗性的基因，尤其是磺酰脲类除草剂(例如含有导致所述抗性的突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因，尤其是S4和/或Hra突变)、编码抑制谷氨酰胺合酶作用的除草剂例如草胺磷或basta抗性的基因(例如bar基因)，或本领域已知的其他基因。Bar基因编码除草剂basta抗性，nptII基因编码抗生素卡那霉素抗性，ALS基因编码除草剂氯磺隆抗性。
可用于在高等植物中表达基因的典型启动子是本领域公知的，包括衍生自根瘤农杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体，Rogers，et ak，，(1987)Meth.in Enzymol.153：253-277其做了描述。这些载体是植物整合型载体，因为转化后，所述载体将部分载体DNA整合到宿主植物的基因组中。本文所用的示例性根瘤农杆菌载体是Schardl，et al.，(1987)Gene 61：1-11和Berger，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8402-8406的质粒pKYLX6和pKYLX7。可用于本文的另一载体是质粒pBI101.2，其可从Clontech Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)获得。
本发明的多核苷酸可根据需要以有义或反义方向表达。应当理解，有义或反义方向的基因表达的控制，对于可观察的植物特征具有直接影响。反义技术可方便地用于抑制植物中的基因表达。为实现此目的，从所需基因中克隆核酸片段并可操作地连接于启动子，以转录RNA的反义链。随后将构建体转化入植物中，产生RNA的反义链。
在植物细胞中，已证明，反义RNA通过防止编码目的酶的mRNA的积聚而抑制基因表达。参见例如Sheehy，et al.，(1988)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：8805-8809；和Hiatt，et al.，美国专利4,801,340号。
另一种抑制方法是有义抑制。已证明，在有义方向上引入配置的核酸，是阻断靶基因转录的有效方法。使用该方法调节内源性基因表达的实例，参见Napoli，et al.，(1990)The Plant Cell 2：279-289和美国专利5,034,323号。
催化性RNA分子或核酶也可用于抑制植物基因的表达。可能的是，设计与任何靶标RNA特异性配对并在特定位点切割磷酸二酯骨架的核酶，由此使靶RNA的功能失活。在进行该切割时，核酶本身不发生改变，因此能重复利用并再切割其他分子，从而使之成为真正的酶。在反义RNA中加入核酶序列，赋予它们RNA切割活性，由此增加了构建体的活性。靶RNA-特异性核酶的设计和使用描述于Haseloff，et al.，(1988)Nature334：585591中。多种交联剂、烷化剂和作为本发明多核苷酸的悬垂基团的基团产生分子(radical generating species)，可用于结合、标记、检测和/或切割核酸。例如，Vlassov，et al.，(1986)Nucleic Acids Res 14：4065-4076，描述了单链DNA片段与和靶序列互补的核苷酸的烷化衍生物的共价结合。同一研究组的类似工作报道是Knorre，et al.，(1985)Biochimie67：785-789。Iverson和Dervan。
本发明还提供了包含与本发明的多肽具有特定序列同一性的多肽的蛋白。该序列同一性百分比选自由60-99组成的整数，示例性的序列同一性值包括60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％。
如本领域技术人员所了解的，本发明包括本发明的催化活性多肽(即酶)。催化活性多肽具有的特异性活性，为天然(非合成)内源性多肽的特异性活性的至少20％、30％或40％，并且优选至少50％、60％或70％，最优选至少80％、90％或95％。此外，底物特异性(kcat/Km)任选实质上类似于天然(非合成)内源性多肽。通常，Km至少是天然(非合成)内源性多肽Km的至少30％、40％或50％，更优选为至少60％、70％、80％或90％。酶活性和底物特异性(热/km)测定和定量测量方法是本领域技术人员已知的。
通常，本发明的蛋白作为免疫原呈递时，能诱发对本发明多肽具有特异反应性的抗体产生。此外，本发明的蛋白不结合针对本法多肽产生的已被同样多肽完全免疫吸附的抗血清。测定结合的免疫测定是本领域技术人员公知的。优选的免疫测定是下文所讨论的竞争性免疫测定。因此，对于如免疫测定或担保纯化技术的此类示例性用途，可用本发明的蛋白作为构建对本发明蛋白具有免疫反应性的抗体的免疫原。
宿主细胞中蛋白的表达
使用本发明的核酸，可在重组的工程细胞，例如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物或优选植物细胞中表达本发明的蛋白。所述细胞在非天然的条件下(例如数量、组成、位点和/或时间)产生蛋白，因为，它们为此已通过人为干预发生遗传改变。
预期本领域技术人员知晓大量的可用于表达编码本发明蛋白的核酸的表达系统。不试图详细描述已知的各种用于在原核和真核细胞中表达蛋白的方法。
简而言之，编码本发明蛋白的分离核酸的表达通常通过以下实现：可操作地将例如DNA或cDNA连接于启动子(组成型或调节型)，随后整合到表达载体中。所述载体适于在原核或真核细胞中复制和整合。典型的表达载体含有转录和翻译终止子、起始序列和启动子，用于调节编码本发明蛋白的DNA的表达的启动子。为获得克隆基因的高水平表达，需要构建这样的表达载体，其至少含有指导转录的强启动子、启动翻译的核糖体结合位点以及转录/翻译终止子。本领域技术人员应当了解，可在不损失生物活性的情况下对本发明的蛋白进行修饰。可进行某些修饰，以便利于引导分子(targeting sequence)的克隆、表达或并入融合蛋白中。
这些修饰对本领域技术人员是公知的，包括例如在氨基端添加甲硫氨酸以提供起始位点，或在任一端添加氨基酸(例如多个组氨酸)以产生便于定位的纯化序列。也可引入限制性位点或终止密码子。
A.原核生物中的表达
原核细胞可用作表达宿主。最常用的原核生物是大肠杆菌(E.coli)的各种菌株，然而，其他微生物菌株也可使用。通常使用的原核细胞控制序列在本文中定义为包括用于转录起始的启动子，任选地含操纵子以及核糖体结合位点序列，包括诸如以下启动子的常用启动子：β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(Lac)启动子系统(Chang，et al.，(1977)Nature 198：1056)，色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，et al.，(1980)Nucleic Acids Res.8：4057)和λ衍生的P L启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake，et al.，(1981)Nature 292：128)。在E.coli中转染的DNA载体中加入选择标记也是有用的。此类标记的实例包括确定氨苄西林、四环素或氯霉素抗性的基因。
选择载体以在适当的宿主细胞中引入。细菌载体通常是质粒或噬菌体来源的。适当的细菌细胞用噬菌体载体颗粒感染，或用裸噬菌体载体DNA转染。如果使用质粒载体，则用所述质粒载体DNA转染细菌细胞。使用芽孢杆菌(Bacillus sp.)和沙门氏菌(Salmonella)，可获得表达本发明蛋白的表达系统(Palva，et al.，(1983)Gene 22：229-235；Mosbach，et al.，(1983)Nature 302：543-545)。
B.真核生物中的表达
本领域技术人员已知多种真核表达系统，例如酵母、昆虫细胞系，植物和哺乳动物细胞。如下简述，本发明的多核苷酸可在这些真核系统中表达。在某些实施方案中，下文所讨论的转化的/转染的植物细胞可用作产生本发明蛋白的表达系统。
异源蛋白在酵母中的合成是公知的。Sherman，et al.，Methods in YeastGenetics(酵母遗传学方法)，Cold Spring Harbor Laboratory(1982)是公认的著作，其描述了在酵母中产生蛋白的多种方法。两种用于广泛产生真核蛋白的酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)。在酵母和毕赤酵母中表达的载体、菌株和方法是本领域已知的，并可从供应商处获得(例如Invitrogen)。
适当的载体通常具有表达控制序列，例如启动子，包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶，以及复制的起点，终止序列等。
本发明的蛋白一旦表达，可通过裂解细胞，并对裂解液应用标准蛋白分离技术，从酵母中分离。纯化过程的监测可使用蛋白质印迹技术或放射免疫测定或其他标准免疫测定技术完成。
编码本发明蛋白的序列也可与多种表达载体连接，用于转染例如哺乳动物、昆虫或植物来源的细胞培养物。可用于产生肽的示例性细胞培养物是哺乳动物细胞。尽管也可以使用哺乳动物细胞悬液，但哺乳动物细胞系统通常是单层细胞的形式。本领域已开发了许多能表达完整蛋白的适宜的宿主细胞系，包括HEK293、BHK21和CHO细胞系。这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，例如复制起点、启动子(例如CMV启动子、HSVtk启动子或pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子)、增强子(Queen，et al.，(1986)Immunol. Rev.89：49)和必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点(例如SV40大T Ag poly A(多A)添加位点)和转录终止序列。其他可用于生产本发明蛋白的动物细胞可从例如美国典型菌株保藏中心(American Type Culture Collection)获得。
在昆虫细胞中表达本发明蛋白的适当载体，通常衍生自SF9杆状病毒。适当的昆虫细胞系包括蚊幼虫、蚕、粘虫、蛾和果蝇细胞系，例如Schneider细胞系(参见Schneider，(1987)J.Embryol.Exp.Morphol.27：353-365)。
与酵母一样，当使用更高级的动物或植物宿主细胞时，通常在载体中并入多腺苷酸化或转录终止序列。终止序列的实例是来自牛生长激素基因的多腺苷酸化序列。也可包括精确剪接转录物的序列。剪接序列的实例是来自SV40的VP1内含子(Sprague，et al.，(1983)J.Virol.45：773-781)。此外，可在载体中并入在宿主细胞中控制复制的基因序列，例如在牛乳头状瘤病毒类型载体中发现的那些。Saveria-Campo，BovinePapilloma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector in DNA Cloning Vol.II aPractical Approach，Glover，Ed.，IRL Press，Arlington，Virginia pp.213-238(1985)。
增加乙烯信号转导相关多肽的活性和/或水平
提供了增加本发明乙烯信号转导相关多肽的活性和/或水平的方法。本发明乙烯信号转导相关多肽的活性和/或水平的增加，可通过向植物提供乙烯信号转导相关多肽完成。可通过向植物中引入编码乙烯信号转导相关多肽的氨基酸序列或向植物中引入编码乙烯信号转导相关多肽的核苷酸序列，或可选地通过修饰编码本发明乙烯信号转导相关多肽的基因组位点，提供乙烯信号转导相关多肽。
如本文其他地方所述，本领域已知可向植物提供多肽的许多方法，包括但不限于，直接向植物引入多肽，向植物中引入(临时或稳定地)编码具有活性增强的多肽的多核苷酸构建体等。同样已知，本发明的方法可使用不能在转化植物中指导蛋白或RNA表达的多核苷酸。因此，可通过改变编码乙烯信号转导相关多肽的基因或其启动子，增加乙烯信号转导相关多肽的水平和/或活性。参见例如Kmiec的美国专利5,565,350号；Zarling等的PCT/US93/03868。因此，提供了诱变的植物，其在乙烯信号转导相关基因中具有突变，其中该突变增加了乙烯信号转导相关基因的表达，或增加了编码的乙烯信号转导相关多肽的乙烯信号转导相关活性。
降低乙烯信号转导相关多肽的活性和/或水平
提供了通过用表达抑制乙烯信号转导相关多肽的多核苷酸的表达盒转染植物细胞，降低或消除本发明乙烯信号转导相关多肽的活性的方法。所述多核苷酸可通过以下方式直接或间接抑制乙烯信号转导相关多肽的表达：防止乙烯信号转导相关信使RNA的转录和翻译，或编码这样的多肽，该多肽抑制编码乙烯信号转导相关多肽的乙烯信号转导相关基因的转录或翻译。抑制或消除植物中基因表达的方法是本领域公知的，本发明可使用任何所述方法抑制乙烯信号转导相关多肽的表达。
根据本发明，如果乙烯信号转导相关多肽的蛋白水平低于未被遗传修饰或诱变以抑制乙烯信号转导相关多肽表达的植物中同样的乙烯信号转导相关多肽蛋白水平的70％，则乙烯信号转导相关多肽的表达受到抑制。在本发明的具体实施方案中，根据本发明，修饰的植物中乙烯信号转导相关多肽的蛋白水平，低于非突变体或未被遗传修饰以抑制乙烯信号转导相关多肽表达的植物中同样的乙烯信号转导相关多肽蛋白水平的60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或2％。乙烯信号转导相关多肽的表达水平可直接测定，例如通过测定植物细胞或植物中表达的乙烯信号转导相关多肽水平，或间接测定，例如通过测量植物细胞或植物中的乙烯反应，或通过测量植物中的表型变化。进行此类测定的方法在本文其他地方做了描述。
在本发明的其他实施方案中，通过用包含编码抑制乙烯信号转导相关多肽的多核苷酸的表达盒转染植物细胞，降低或消除乙烯信号转导相关多肽的活性。根据本发明，如果乙烯信号转导相关多肽的活性低于未被修饰以抑制所述多肽乙烯信号转导相关活性的植物中同样的乙烯信号转导相关多肽活性的70％，则该乙烯信号转导相关多肽受到抑制。在本发明的具体实施方案中，根据本发明，修饰的植物中乙烯信号转导相关多肽的乙烯信号转导相关活性低于未被遗传修饰以抑制该乙烯信号转导相关多肽表达的植物中同样的多肽的乙烯信号转导相关活性的60％、50％、40％、30％、20％、10％或5％。根据本发明，当不能被本文其他地方所述的测定方法检测到时，乙烯信号转导相关多肽的乙烯信号转导相关活性被“消除”。测定乙烯信号转导相关多肽活性改变的方法，在本文的其他地方做了描述。
在其他实施方案中，可通过破坏编码乙烯信号转导相关多肽的基因降低或消除乙烯信号转导相关多肽的活性。本发明包括在乙烯信号转导相关基因中携带突变的诱变植物，其中所述突变降低了乙烯信号转导相关基因的表达，或抑制编码的乙烯信号转导相关多肽的活性。
因此，许多方法可用于降低或消除乙烯信号转导相关多肽的活性。此外，超过一种以上方法可用于降低单个乙烯信号转导相关多肽的活性。
1.基于多核苷酸的方法
在本发明的某些实施方案中，植物用能表达抑制本发明乙烯信号转导相关多肽表达的多核苷酸的表达盒转化。本文所用术语“表达”是指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。例如，为本发明的目的，能表达抑制至少一种乙烯信号转导相关多肽表达的多核苷酸的表达盒是能够产生抑制至少一种本发明乙烯信号转导相关多肽转录和/或翻译的RNA分子的表达盒。从DNA分子“表达”或“产生”蛋白或多肽是指转录和翻译编码序列以产生蛋白或多肽，而从RNA分子“表达”或“产生”蛋白或多肽是指翻译RNA编码序列以产生蛋白或多肽。
抑制乙烯信号转导相关多肽表达的多核苷酸实例在下文给出。
i.有义抑制/共抑制
在本发明的某些实施方案中，可通过有义抑制或共抑制抑制乙烯信号转导相关多肽的表达。对于共抑制，将表达盒设计为以“有义”方向表达对应于全部或部分编码乙烯信号转导相关多肽的信使RNA的RNA分子。RNA分子的超表达可导致天然基因的表达降低。因此，筛选用所述共抑制表达盒转化的多个植物株系，以鉴定显示最强的乙烯信号转导相关多肽抑制的那些植物株系。
用于共抑制的多核苷酸可对应于全部或部分编码乙烯信号转导相关多肽的序列，全部或部分乙烯信号转导相关多肽转录物5’和/或3’非翻译区，或全部或部分编码乙烯信号转导相关多肽的转录物的编码序列和非翻译区。在多核苷酸包含全部或部分乙烯信号转导相关多肽的编码区的某些实施方案中，将表达盒设计为消除该多核苷酸的起始密码子，从而不会翻译任何蛋白产物。
共抑制可用于抑制植物基因的表达，以产生具有不可检测蛋白水平的所述基因编码的蛋白的植物。参见例如，Broin，et al.，(2002)Plant Cell14：1417-1432。共抑制也可用于抑制同一植物中多种蛋白的表达。参见例如，美国专利5,942,657号。使用共抑制抑制植物内源性基因表达的方法描述于Flavell，et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3490-3496；Jorgensen，et al.，(1996)Plant Mol.Biol.31：957-973；Johansen andCarrington，(2001)Plant Physiol.126：930-938；Broin，et al.，(2002)PlantCell 14：1417-1432；Stoutjesdijk，et al.，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Yu，et al.，(2003)Phytochemistry 63：753-763；以及美国专利5,034,323号、5,283,184号和5,942,657号中，上述每一文献，通过引用并入。可通过在有义序列3’且多腺苷酸化信号5’位置处在表达盒内添加多poly-dt(多dT)区，增加共抑制的效率。参见美国专利申请公开2002/0048814号，其在此通过引用并入。通常，此类核苷酸序列与内源性基因转录物的序列具有本质序列同一性，优选超过约65％的序列同一性，更优选超过约85％的序列同一性，最优选超过约95％的序列同一性。参见美国专利5,283,184号和5,034,323号，其在此通过引用并入。
ii.反义抑制
在本发明的某些实施方案中，可通过反义抑制抑制乙烯信号转导相关多肽的表达。对于反义抑制，将表达盒设计为表达与全部或部分编码乙烯信号转导相关多肽的信使RNA互补的RNA分子。反义RNA分子的超表达可导致天然基因的表达降低。因此，可筛选用所述反义抑制表达盒转化的多种植物株，以鉴定显示最强乙烯信号转导相关多肽抑制的那些。
用于反义抑制的多核苷酸可对应于全部或部分编码乙烯信号转导相关多肽的序列的互补物，全部或部分乙烯信号转导相关多肽转录物5’和/或3’非翻译区的互补物，或全部或部分编码乙烯信号转导相关多肽的转录物的编码序列和非翻译区的互补物。此外，反义多核苷酸可以与靶序列完全互补(即与靶序列的互补物100％相同)或部分互补(即与靶序列的互补物低于100％相同)。反义抑制可用于抑制同一植物中多种蛋白的表达。参见例如，美国专利5,942,657号。此外，部分反义核苷酸可用于破坏靶基因的表达。通常使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300、400、450、500、550或更多核苷酸的序列。使用反义抑制在植物中抑制内源性基因表达的方法描述于，例如Liu，et al.，(2002)PlantPhysiol.129：1732-1743和美国专利5,759,829号和5,942,657号中，上述每一文献在此通过引用并入。可通过在反义序列3’且腺苷酸化信号5’位置处在表达盒内添加poly-dT区，增加反义抑制的效率。参见美国专利申请公开2002/0048814号，在此通过引用将其并入。
iii.双链RNA干扰
在本发明的某些实施方案中，可通过双链RNA(dsRNA)干扰抑制乙烯信号转导相关多肽的表达。对于dsRNA干扰，在同一细胞中表达如同上述用于共抑制的有义RNA分子和与有义RNA分子完全或部分互补的反义RNA分子。从而导致相应内源性信使RNA表达的抑制。
有义和反义分子的表达可通过将表达盒设计为包含有义序列和反义序列完成。或者，可针对有义和反义序列使用分离的表达盒。随后可筛选用dsRNA干扰表达盒转化的多种植物株系，以鉴定显示最强乙烯信号转导相关多肽抑制的植物株系。使用dsRNA干扰抑制内源性植物基因表达的方法描述于Waterhouse，et al.，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：13959-13964，Liu，et al.，(2002)Plant Physiol.129：1732-1743，和WO99/49029，WO 99/53050，WO 99/61631，以及WO 00/49035，其中上述每一篇文献在此通过引用并入。
iv.发夹RNA干扰和含内含子的发夹RNA干扰
在本发明的某些实施方案中，可通过发夹RNA(hpRNA)干扰或含内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰抑制乙烯信号转导相关多肽的表达。这些方法在抑制内源性基因表达方面是极为有效的，参见Waterhouse andHelliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38和其引用的参考文献。
对于hpRNA干扰，将表达盒设计为表达与其自身杂交形成包含单链环区和碱基配对的茎的发夹结构的RNA分子。该碱基配对的茎区包含对应于全部或部分编码要被抑制表达的基因的内源性信使RNA的有义序列，以及与所述有义序列全部或部分互补的反义序列。或者，碱基配对的茎区可对应于控制要被抑制基因表达的部分启动子序列。因此，该分子碱基配对的茎区通常决定了RNA干扰的特异性。hpRNA分子在抑制内源性基因表达方面是极为有效的，其诱导的RNA干扰可被植物的后代遗传。参见例如，Chuang and Meyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：4985-4990；Stoutjesdijk，et al.，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；以及Waterhouse and Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38。使用hpRNA干扰抑制或沉默基因表达的方法描述于，例如Chuang and Meyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990；Stoutjesdijk，et al.，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Waterhouse and Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Pandolfini et al.，BMC Biotechnology 3：7以及美国专利申请公开2003/0175965号，每一上述文献，在此通过引用并入。短期测定hpRNA构建体在体内沉默基因表达效果的方法描述于Panstruga，et al.，(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140，在此将其通过引用并入。
对于ihpRNA，干扰分子具有与hpRNA相同的通式结构，但该RNA分子还包含能在表达ihpRNA的细胞内剪接的内含子。内含子的使用使剪接后发夹RNA分子中的环最小化，这提高了干扰的效率。参见例如，Smith，et al.，(2000)Nature 407：319-320。实际上，Smith等显示使用ihpRNA介导的干扰可抑制100％的内源性基因表达。使用ihpRNA干扰抑制内源性植物基因表达的方法描述于，例如Smith，et al.，(2000)Nature407：319-320；Wesley，et al.，(2001)Plant J.27：581-590；Wang andWaterhouse，(2001)Curr.Opin.Plant Biol.5：146-150；Waterhouse andHelliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Helliwell and Waterhouse，(2003)Methods 30：289-295，以及美国专利申请公开2003/0180945号，每一篇上述文献在此通过引用并入。
用于hpRNA干扰的表达盒也可如此设计：即使有义序列和反义序列不对应于内源性RNA。在该实施方案中，有义和反义序列位于环序列的侧翼，所述环序列包含对应于全部和部分靶基因的内源性信使RNA的核苷酸序列。因此，是环区决定了RNA干扰的特异性。参见例如，WO02/00904；Mette，et al.，(2000)EMBO J 19：5194-5201；Matzke，et al.，(2001)Curr.Opin.Genet.Devel.11：221-227；Scheid，et al.，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 99：13659-13662；Aufsaftz，et al.，(2002)Proc.Nat’l.Acad.Sci.99(4)：16499-16506；Sijen，et al.，Curr.Biol.(2001)11：436-440)，在此将上述文献通过引用并入。
v.扩增子介导的干扰
扩增子表达盒包含植物病毒衍生的序列，其含有全部或部分靶基因，但通常不含全部天然病毒的基因。存在于表达盒转录产物中的病毒序列允许转录产物指导其自身的复制。扩增子所产生的转录物相对于靶序列(即，乙烯信号转导相关多肽的信使RNA)可以是有义的或反义的。使用扩增子抑制内源性植物基因表达的方法描述于例如Angell and Baulcombe，(1997)EMBO J. 16：3675-3684，Angell and Baulcombe，(1999)Plant J.20：357-362，以及美国专利6,646,805号，每一篇上述文献在此通过引用并入。
vi.核酶
在某些实施方案中，本发明的表达盒所表达的多核苷酸是催化性RNA，或具有乙烯信号转导相关多肽的信使RNA特异性的核酶活性。因此，该多核苷酸引起内源性信使RNA的降解，导致乙烯信号转导相关多肽的表达降低。该方法描述于例如，美国专利4,987,071号中，其在此通过引用并入。
vii.小干扰RNA或微RNA
在本发明的某些实施方案中，乙烯信号转导相关多肽表达的抑制，可通超表达编码微RNA(miRNA)的基因的RNA干扰获得。miRNA是由约22个核糖核苷酸组成的调节剂。miRNA在抑制内源性基因的表达方面非常有效，参见，例如Javier，et al.，(2003)Nature 425：257-263，在此将其通过引用并入。
对于miRNA干扰，将表达盒设计为，表达在内源性miRNA基因上被模拟的RNA分子。miRNA基因编码RNA，该RNA形成含有与另一个内源性基因(靶序列)互补的22个核苷酸序列的发夹结构。为抑制乙烯信号转导相关的表达，该22个核苷酸序列选自乙烯信号转导相关转录物序列，并在有义方向上含有所述乙烯信号转导相关序列的22个核苷酸和与所述有义序列互补的相应反义序列的21个核苷酸。miRNA分子在抑制内源性基因表达方面非常有效，其诱导的RNA干扰可被植物后代遗传。
2.基因表达基于多肽的抑制
在一个实施方案中，所述多核苷酸编码与编码乙烯信号转导相关多肽的基因结合的锌指蛋白，导致所述基因的表达降低。在具体的实施方案中，所述锌指蛋白与乙烯信号转导相关基因的调节区结合。在其他实施方案中，所述锌指蛋白与编码乙烯信号转导相关多肽的信使RNA结合并防止其翻译。已描述了选择锌指蛋白靶向的位点的方法，例如在美国专利6,453,242号中，以及使用锌指蛋白抑制植物基因表达的方法，例如在美国专利申请公开2003/0037355号中，在此将上述两篇文献通过引用并入。
3.蛋白活性基于多肽的抑制
在本发明的某些实施方案中，所述多核苷酸编码与至少一种乙烯信号转导相关多肽结合的抗体，并且降低了乙烯信号转导相关多肽活性的增强。在另一个实施方案中，所述抗体的结合通过细胞质量控制机制导致抗体-乙烯信号转导相关复合物的周转增加。抗体在植物细胞中的表达以及通过抗体的表达和与植物中蛋白的结合抑制分子途径是本领域公知的，参见例如，Conrad and Sonnewald，(2003)Nature Biotech.21：35-36，在此通过引用将其并入。
4.基因破坏
在本发明的某些实施方案中，乙烯信号转导相关多肽的活性通过破坏编码乙烯信号转导相关多肽的基因得以降低或消除。编码乙烯信号转导相关多肽的基因可通过本领域已知的任何方法破坏。例如，在一个实施方案中，所述基因通过转座子标记破坏，在另一个实施方案中，所述基因通过随机或定向诱变使植物发生诱变进行破坏，从而选择活性降低的植物。
i.转座子标记
在本发明的一个实施方案中，使用转座子标记降低或消除一种或多种乙烯信号转导相关多肽的乙烯信号转导活性。转座子标记包括在内源性乙烯信号转导相关基因中插入转座子，以降低或消除乙烯信号转导相关多肽的表达。
在该实施方案中，通过在编码乙烯信号转导相关多肽的基因的调节区或编码区插入转座子，降低或消除一种或多种乙烯信号转导相关多肽的表达。外显子、内含子、5’或3’非翻译序列、启动子或任何其他乙烯信号转导相关基因的调节序列内的转座子，可用于降低或消除编码的乙烯信号转导相关多肽的表达和/或活性。
用于植物中特定基因的转座子标记的方法是本领域公知的，参见例如，Maes，et al.，(1999)Trends Plant Sci.4：90-96；Dharmapuri and Sonti，(1999)FEMS Microbiol.Lett.179：53-59；Meissner，et al.，(2000)Plant J.22：265-274；Phogat，et al.，(2000)J.Biosci.25：57-63；Walbot，(2000)Curr.Opin.Plant Biol.2：103-107；Gai，et al.，(2000)Nucleic Acids Res.28：94-96；Fitzmaurice，et al.，(1999)Genetics 153：1919-1928)。此外，在选定的基因中选择Mu插入物的TUSC方法描述于Bensen，et al.，(1995)Plant Cell7：75-84；Mena，et al.，(1996)Science 274：1537-1540；以及美国专利5,962,764号，在此将每一篇上述文献，通过引用并入。
ii.活性降低的突变植物
用于降低或消除植物内源性基因表达的其他方法也是本领域已知的，可类似地用于本发明。这些方法包括其他形式的诱变，例如甲磺酸乙酯诱导的突变、缺失诱变、以及用于反求遗传学意义(用PCR)中鉴定内源性基因缺失的植株的快速中子缺失诱变。这些方法的实例参见Ohshima，et al.，(1998)Virology 243：472-481；Okubara，et al.，(1994)Genetics137：867-874；以及Quesada，et al.，(2000)Genetics 154：421-436，将每一上述文献在此通过引用并入。此外，用于筛选化学诱导突变的快速自动方法TILLING(Targeting Induced Local Lesion In Genomes，定向诱导基因组局部病变)也适用于本发明，其使用变性HPLC或选择性内切核酸酶消化选定的PCR产物。参见McCallum，et al.，(2000)Nat.Biotechnol.18：455-457，其引入本文作为参考。
影响基因表达或干扰编码的蛋白功能(增强的活性)的突变，是本领域公知的。基因外显子中插入的突变通常导致无效突变体。保守残基中的突变在抑制编码的蛋白活性方面尤其有效。已描述了适于诱变以消除乙烯信号转导相关活性的植物乙烯信号转导相关多肽的保守性残基。此类突变体可根据公知的方法分离，不同乙烯信号转导相关位点中的突变可通过遗传杂交聚集。参见例如，Gruis，et al.，(2002)Plant Cell14：2863-2882。
在本发明的另一个实施方案中，可使用显性突变体触发基因倒置和复制的基因位点的重组导致的RNA沉默。参见例如，Kusaba，et al.，(2003)Plant Cell 15：1455-1467。
本发明包括降低或消除一种或多种乙烯信号转导相关多肽活性的其他方法。其他用于改变或突变植物中基因组核苷酸序列的方法的实例是本领域已知的，包括但不限于，RNA:DNA载体、RNA:DNA突变载体、RNA:DNA修复载体、混合的双链寡核苷酸、自体互补性RNA:DNA寡核苷酸和重组发生寡核碱基(oligonucleobase)的使用。此类载体和使用方法是本领域已知的，参见例如，美国专利5,565,350号、5,731,181号、5,756,325号、5,760,012号、5,795,972号和5,871,984号，每一上述专利在此通过引用并入。同样参见WO 98/49350、WO 99/07865、WO 99/25821和Beetham，et al.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8774-8778，每一上述文献，在此通过引用并入。
细胞的转染/转化
转化/转染的方法对本发明不是关键性的。多种转化或转染方法目前是可以利用的，可应用较新的方法转化可被直接应用的作物或其他宿主细胞。
因此开发了多种方法以将DNA序列插入到宿主细胞基因组中，使所述序列转录和翻译，从而实现生物体内的表型变化。因此，可使用任何能有效转化/转染的方法。
A.植物转化
编码所需是本发明多肽的DNA序列，例如编码全长蛋白的cDNA或基因组序列，将用于构建重组表达盒，可将该表达盒引入所需的植物中。
本发明分离的核酸可根据本领域已知的技术引入植物中。一般而言，制备上述且适于转化植物细胞的重组表达盒。转化多种高等植物的技术是公知的，描述于技术、科学和专利文献中。参见例如，Weising，et al.，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477。例如，DNA构建体可使用诸如电穿孔、聚乙二醇(PEG)、穿孔、粒子轰击、硅纤维送递或植物细胞原生质体或胚胎发生的愈伤组织微量注射的技术直接引入植物细胞的基因组DNA。参见例如Tomes，et al.，Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells ViaMicroprojectile Bombardment.pp.197213 in Plant Cell，Tissue and OrganCulture，Fundamental Methods.eds.Gamborg and Phillips.Springer-VerlagBerlin Heidelberg New York，1995。或者，DNA构建体可与适当的T-DNA侧翼区结合，并引入到常规的根瘤农杆菌宿主载体中。当细胞受到细菌感染时，根瘤农杆菌宿主的毒性功能将指导构建体和邻近标记插入到植物细胞DNA中。参见美国专利5,591,616号。
使用PEG沉淀引入DNA构建体描述于Paszkowski，et al.，(1984)Embo J.3：2717-2722中。电穿孔技术描述于Fromm，et al.，(1985)Proc.Natl.Acad. Sci.(USA)82：5824中。弹道转化技术(ballistic transformationtechnique)描述于Klein，et al.，(1987)Nature 327：70-73中。
根瘤农杆菌介导的转化技术在科学文献中有充分描述。参见例如Horsch，et al.，(1984)Science 233：496-498，以及Fraley，et al.，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)80：4803。尽管农杆菌主要用于双子叶植物，某些单子叶植物也可使用农杆菌转化。例如，玉米的农杆菌转化描述于美国专利5,550,318号中。
转染或转化的其他方法包括(1)毛根农杆菌介导的转化(参见例如Lichtenstein and Fuller In：Genetic Engineering，vol.6，Rigby，Ed.，London，Academic Press，1987；以及Lichtenstein and Draper，In：DNA Cloning，Vol.II，Glover，Ed.，Oxford，IRI Press，1985)，申请PCT/US87/02512(WO88/02405，1988年4月7日公开)描述了毛根农杆菌菌株A4和Ri质粒及其根瘤农杆菌载体pARC8或pARC16的使用；(2)脂质体介导的DNA摄取(参见例如Freeman，et al.，(1984)Plant Cell Physiol.25：1353)；(3)涡旋方法(参见例如Kindle，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)87：1228)。
DNA也可通过DNA向花粉内的直接转移引入植物，如Zhou et al.，(1983)Methods in Enzymology 101：433；Hess，(1987)Intern Rev.Cytol.107：367、Luo，et al.，(1988)Plant Mol.Biol.Reporter 6：165所述。多肽编码基因的表达可通过将DNA注射到植物的生殖器官中获得，如Pena，et al.，(1987)Nature 325：274所述。
DNA也可直接注射到未成熟胚的细胞中，干燥胚的再水合，如Neuhaus，et al.，(1987)Theor.Appl.Genet.75：30以及Benbrook，et al.，(1986)in Proceedings Bio Expo 1986，Butterworth，Stoneham，Mass.，pp.27-54所述。可用作载体的多种植物病毒在本领域中是已知的，包括花椰菜花叶病毒(CaMV)、双粒病毒组、雀麦草花叶病毒和烟草花叶病毒。
B.原核细胞、低等真核细胞和动物细胞的转染
动物和低等真核(例如酵母)宿主细胞可通过多种方法转染或致转染。有若干公知的将DNA引入动物细胞的方法。其包括：磷酸钙沉淀、受体宿主细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、用含有DNA的脂质体处理受体细胞、DEAE葡聚糖、电穿孔、基因枪以及直接将DNA微量注射到细胞内。转染的细胞通过本领域公知的方法培养。Kuchler，BiochemicalMethods in Cell Culture and Virology，Dowden，Hutchinson and Ross，Inc.(1977)。
蛋白的合成
本发明的蛋白可使用非细胞合成方法构建。长度低于约50个氨基酸的蛋白质的固相合成，可通过在将所述序列的C末端氨基酸连接在不溶性支持体上，随后依次添加序列中剩余的氨基酸完成。固相合成的技术描述于Barany and Merrifield，Solid-Phase Peptide Synthesis，pp.3-284 inThe Peptides：Analysis，Synthesis，Biology Vol.2：Special Methods inPeptide Synthesis，Part A.；Merrifield，et al.，(1963)J. Am.Chem.Soc.85：2149-2156以及Stewart，et al.，Solid Phase Peptide Synthesis(固相肽合成法)，2nd ed(第二版)，Pierce Chem.Co.，Rockford，IL(1984)。更长的蛋白质可通过较短片段的氨基和羧基端缩合合成。通过活化羧基端形成肽键(例如，通过使用偶联剂N，N′-二环己基碳化二亚胺)的方法是本领域技术人员已知的。
蛋白的纯化
本发明的蛋白可通过本领域技术人员公知的标准技术纯化。本发明重组产生的蛋白可直接表达或表达为融合蛋白。重组蛋白通过细胞裂解(例如声裂法、弗氏细胞压碎器)和亲和层析的组合纯化。对于融合产物，用合适的蛋白水解酶随后消化融合蛋白，释放所需的重组蛋白。
本发明的蛋白，重组或合成的，可通过本领域公知的标准技术纯化为实质纯度，所述技术包括去垢剂增溶、用诸如硫酸铵的物质选择性沉淀、柱层析、免疫纯化方法等。参见例如R.Scopes，Protein Purification：Principles and Practice(蛋白纯化：原理和实践)，Springer-Verlag：New York(1982)；Deutscher，Guide to Protein Purification，Academic Press(1990)。例如，可产生针对本文所述蛋白的抗体。按照美国专利4,511,503号所述的方法，可实现从大肠杆菌的纯化。蛋白随后从表达该蛋白的细胞内分离，通过本文所述的标准的蛋白质化学技术进一步纯化。表达的蛋白的检测通过本领域已知的方法实现，包括，例如放射免疫测定、蛋白质印迹技术或免疫沉淀。
转基因植物再生
通过任何上述转化技术衍生的植物细胞经培养可再生具有转化的基因型的完整植物。此类再生技术通常依赖于组织培养生长培养基中的某些植物激素的操作。对于玉米的转化和再生，参见Gordon-Kamm，et al.，(1990)The Plant Cell 2：603-618。
用植物表达载体转化的植物细胞可按照标准植物组织培养技术从例如单细胞、愈伤组织或叶片再生。本领域公知的是，几乎任何植物的各种细胞、组织和器官经成功的培养可再生完整的植物。从培养的原生质体中再生植物描述于Evans，et al.，Protoplasts Isolation and Culture，Handbook of Plant Cell Culture(植物细胞培养手册：原生质体的分离和培养)，Macmillan Publishing Company，New York，pp.124-176(1983)；以及Binding，Regeneration of Plants，Plant Protoplasts，CRC Press，Boca Raton，pp.21-73(1985)。
含有通过叶外植体的农杆菌引入的外源基因的植物的再生，可按照Horsch，et al.，(1985)Science 227：1229-1231的描述实现。在该方法中，转化体在选择性试剂存在下，在诱导正转化的植物种类的枝条再生的培养基中生长，如Fraley，et al.，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803所述。该方法通常在2-4周内产生枝条，随后将这些转化枝条转移至含有选择性试剂和预防细菌生长的抗生素的适当根诱导培养基中。本发明的转基因植物可以是可育和不育的。
再生也可从植物愈伤组织、外植体、器官或其部分实现。此类再生技术通常描述于Kleen，et al.，(1987)Ann.Rev.of Plant Phys.38：467-486。从单个植物原生质体或各种外植体再生植物是本领域公知的。参见例如，Methods for Plant Molecular Biology(植物分子生物学方法)，Weissbachand Weissbach，eds.，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.(1988)。该再生和生长过程包括如下步骤：选择转化细胞和枝条，使所述转化体枝条生根并在土壤中生长小植株。玉米细胞培养和再生一般参见The MaizeHandbook(玉米手册)，Freeling and Walbot，Eds.，Springer，New York(1994)；Corn and Corn Improvement，3rd edition，Sprague and Dudley Eds.，American Society ofAgronomy，Madison，Wisconsin(1988)。
本领域技术人员应当认识到，在重组表达盒稳定地并入到转基因植物中，经确认是可操作的后，其可以通过有性杂交引入其他植物。依赖于要杂交的种类，可使用任何标准育种技术。在无性繁殖的作物中，成熟的转基因植物可通过采集碎块或组织培养技术繁殖，产生多个相同的植物。
进行需要的转基因选择，获得新品种并无性繁殖以供商业使用。在种子繁殖的作物中，成熟的转基因植物可自交以产生纯合的近交植物。近交植物产生含有新引入异源核酸的种子，种植这些种子，产生能产生所选表型的植物。
从再生的植物中获得的部分，例如花、种子、叶、枝、果实等包括在本发明范围内，只要这些部分包括包含本发明分离的核酸的细胞。所述再生植物的子代和变体以及突变体也包括在本发明的范围内，只要这些部分包括引入的核酸序列。可通过例如标准免疫印迹和DNA检测技术筛选表达可选标记的转基因植物以遗传本发明的核酸。通常评估转基因系异源核酸的表达水平。最初可测定RNA水平的表达，以鉴定和量化表达阳性的植物。可使用RNA分析的标准技术，其包括使用经设计仅扩增异源RNA模板的寡核苷酸引物的PCR扩增测定和使用异源核酸特异性探针的溶液杂交测定。可随后使用本发明的特异反应性抗体通过蛋白质免疫印迹，分析RNA阳性植物的蛋白表达。此外，可按照标准方法，使用异源核酸特异性多核苷酸探针和抗体，分别进行原位杂交和免疫细胞化学测定，以定位转基因组织中的表达位点。通常，经常对大量转基因株筛选并入的核酸，以鉴定和选择具有最适表达特征的植物。
优选的实施方案是对添加的异源核酸是纯合的转基因植物，即含有两条添加的核酸序列的转基因植物，一个基因位于染色体对的每条染色体上同样的位点。纯合的转基因植物可通过有性交配(自交)含有单个添加的异源核酸的杂合的转基因植物，从而使部分产生的种子发芽，并分析所产生的所得植物的本发明的多肽表达相对于对照植物(即天然的非转基因的)的改变。也考虑与亲本植物的回交和与非转基因植物的异型杂交。
多肽水平和/或组成的调节
本发明还提供了调节(即增加或降低)本发明的多肽在植物或其部分中浓度或比例的方法。调节可通过增加或降低本发明的多肽在植物中的浓度和/或比例实现。
该方法包括向植物细胞中引入包含如前所述的本发明多肽的重组表达盒，以获得转化的植物细胞，在植物细胞生长条件下培养所述转化的植物细胞，并将本发明多肽在植物中的表达诱导或抑制足以调节所述多肽在植物或植物部分中的浓度和/或比例的时间。
在某些实施方案中，本发明多肽在植物中的浓度和/或比例，可通过体内或体外改变基因的启动子以上调或下调基因的表达来调节。在某些实施方案中，本发明天然基因的编码区可通过取代、添加、插入或缺失改变，以降低编码的酶的活性。参见例如Kmiec的美国专利5,565,350号；Zarling等的PCT/US93/03868。在某些实施方案中，将包含启动子序列的分离的核酸(例如载体)转染到植物细胞中。
随后，通过本领域技术人员已知的方法选择包含与本发明的多核苷酸可操作地连接的启动子的植物细胞，所述方法例如但不限于，DNA印迹、DNA测序或使用对所述启动子和基因具有特异性的引物进行PCR分析并检测其产生的扩增子。将通过上述实施方案改变或修饰的植物或植物部分在植物形成条件下生长一段时间，以调节植物中本发明多肽的浓度和/或比例。植物形成条件是本领域公知的，如上文中所讨论。
一般而言，所述多肽的浓度或比例相对于缺乏上述重组表达盒的天然对照植物、植物部分或细胞增加或降低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。本发明的调节可在植物生长至需要的发育阶段过程中和/或该过程后进行。临时和/或在特定的组织中调节核酸表达可通过使用例如在有义或反义方向可操作地连接于本发明的多核苷酸的适当启动子控制，如前文所详细讨论的。本发明多核苷酸表达的诱导也可通过外源性施用有效量的诱导化合物进行控制。诱导型启动子和激活这些启动子表达的诱导化合物是本领域公知的。在优选的实施方案中，本发明的多肽在单子叶植物、尤其是玉米中受到调节。
分子标记
本发明提供了对包含本发明的多核苷酸的植物进行基因分型的方法。任选地，所述植物是单子叶植物，例如玉米或高粱。基因分型提供了区分染色体对同系物的方法，可用于区分植物种群中的分离子。分子标记方法可用于系统发育研究，表征作物品种间的亲缘关系，鉴定杂交或体细胞杂种，定位影响单基因性状的染色体片段，基于作图的克隆，以及数量遗传研究。参见例如Clark，Ed.，Plant Molecular Biology：ALaboratory Manual(植物分子生物学：实验室手册).Berlin，Springer Verlag，1997.Chapter(第7章)。分子标记方法一般参见″The DNA Revolution(DNA革命)″in：Paterson，Genome Mapping in Plants(植物基因组作图)(Austin，TX，Academic Press/R.G Landis Company，1996)pp.7-21。
本发明中基因分型的具体方法可使用任何数目的分子标记分析技术，例如但不限于，限制性片段长度多态性(RFLPs)。RFLP是核苷酸序列变异导致的DNA限制性片段间等位基因区别的产物。如本领域技术人员所公知的，RFLP通常通过提取基因组DNA并用限制酶消化进行检测。通常，所得片段根据大小分离，并使之与探针杂交；优选单拷贝探针。来自同源染色体的限制性片段被显示。
等位基因间片段犬小差异代表了RFLP。因此，本发明还提供了使用诸如RFLP分析的技术分离本发明基因或核酸以及与这些基因或核酸遗传连接的染色体序列的方法，连接的染色体序列在本发明基因的50个厘摩(cM)以内，通常在40或30cM、优选20或10cM、更优选5、3、2或1cM以内。
在本发明中，用于植物核基因组分子标记作图的核酸探针，在选择性杂交条件下与编码本发明多核苷酸的基因选择性杂交。在优选的实施方案中，从本发明的多核苷酸中选择所述探针。
通常，这些探针是cDNA探针或限制酶(例如Pst I)处理的基因克隆。探针的长度在上文做了详细讨论，但通常其长度为至少15个碱基，更优选至少20、25、30、35、40或50个碱基。然而，通常探针的长度小于约1k个碱基。优选地，所述探针是与单倍体染色体组中独特位点杂交的单拷贝探针。RFLP作图所用的某些示例性限制酶是EcoRI、EcoRv和SstI。本文所用术语“限制酶”包括涉及识别并单独或与其他组合物联合在特定核苷酸序列处切割的组合物。
检测RFLP的方法包括下列步骤：(a)用限制酶消化植物的基因组DNA；(b)在选择性杂交条件下，使核酸探针与所述基因组DNA的的本发明多核苷酸的序列杂交；(c)由此检测RFLP。其他区分本发明多核苷酸多态性(等位基因的)变体的方法可利用本领域技术人员公知的分子标记技术进行，包括诸如以下的技术：1)单链构象分析(SSCA)；2)变性梯度凝胶电泳(DGGE)；3)RNA酶保护测定；4)等位基因特异性寡核苷酸(ASOs)；5)使用识别核苷酸错配的蛋白，例如E.coli mutS蛋白，以及6)等位基因特异性PCR。基于检测两条互补DNA链间错配的其他方法包括，夹紧变性凝胶电泳(clamped denaturing gel electrophoresis，CDGE)；异源双链体分析(HA)；以及化学错配切割(CMC)。因此，本发明还提供了基因分型的方法，包括在严紧杂交条件下使核酸探针与疑似包含本发明多核苷酸的样品接触的步骤。通常，该样品是植物样品；优选疑似包含本发明的玉米多核苷酸(例如基因，mRNA)的样品。所述核酸探针在严紧条件下与包含多态性标记的本发明多核苷酸的子序列选择性杂交。核酸探针与多态性标记核酸序列的选择性杂交产生杂交复合物。杂交复合物的检测表明样品中存在多态性标记。在优选的实施方案中，该核酸探针包含本发明的多核苷酸。
UTR和密码子偏好
通常，已发现RNA的5’非编码或非翻译区(5′UTR)中的特异性序列元件调节翻译效率。阳性序列基序包括翻译起始共有序列(Kozak，(1987)Nucleic Acids Res.15：8125)和7-甲基鸟苷帽结构(Drummond，et al.，(1985)Nucleic Acids Res.13：7375)。阴性元件包括稳定的分子内5′UTR茎环结构(Muesing，et al.，(1987)Cell 48：691)和5′UTR中的AUG序列或适当AUG后的短可读框(Kozak，supra，Rao，et al.，(1988)Mol.and Cell.Biol.8：284)。因此，本发明提供了调节异源编码序列翻译的5’和/或3’非翻译区。
此外，本发明多核苷酸的多肽编码片段经修饰可以改变密码子选择。改变的密码子选择可用于改变翻译效率和/或优化用于在所需宿主内表达的编码序列，例如优化在玉米中表达的异源序列的密码子选择。本发明多核苷酸编码区的密码子选择可使用商用软件包进行统计学分析，例如威斯康星大学遗传计算机组的″Codon Preference″(参见Devereaux，et al.，(1984)Nucleic Acids Res.12：387-395)或MacVector 4.1(Eastman KodakCo.，New Haven，Conn.)。因此，本发明提供了特征为至少一种本发明多核苷酸的编码区的密码子选择频率。可用于确定密码子选择频率的多核苷酸的数目可以是1到本文所提供的本发明多核苷酸数之间的任意整数。任选地，该多核苷酸是全长序列。用于统计学分析的示例性序列数目可以是至少1、5、10、20、50或100。
序列改组(sequence shuffling)
本发明提供了使用本发明的多核苷酸进行序列改组的方法，以及其产生的组合物。序列改组描述于PCT公开WO 97/20078号中，同样参见Zhang，et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509。一般而言，序列改组提供了产生具有可被选择或筛选的所需特征的多核苷酸文库的方法。重组多核苷酸文库由有关序列多核苷酸群体产生，其包括具有实质序列同一性并可在体外或体内同源重组的序列区域。序列重组的多核苷酸的群体包括具有所需或有利特征且可通过适当的选择或筛选方法选择的多核苷酸亚群。所述特征可以是任何能在筛选系统中被选择或检测的性质或属性，可包括下列性质：编码的蛋白、转录元件、序列控制转录、RNA加工、RNA稳定性、染色质构象其他基因或转基因的表翻译或达性质、复制元件、蛋白结合元件等，例如赋予任何选择或检测性质的特征。在某些实施方案中，选择的特征是相对于本文提供的野生型蛋白降低的Km和/或增加的KCat。在其他实施方案中，由序列改组产生的蛋白或多核苷酸将具有比非改组的野生型多核苷酸更高的配体结合亲和性。所述性质的增加可以是野生型值的至少110％、120％、130％、140％或至少150％。
通用和共有序列
本发明的多核苷酸和多肽还包括分别具有以下的多核苷酸和多肽：(a)至少两种本发明同源多核苷酸或多肽的通用序列，以及(b)至少三种本发明同源多核苷酸或多肽的共有序列。本发明的通用序列包含通用多肽或多核苷酸序列所分别包括的每种多肽或多核苷酸。具有氨基酸或核酸共有序列的多核苷酸所包括的个体种类可用于产生抗体或产生核酸探针或引物，以筛选其他种类、属、科、目、纲、门或界中的同源物。例如，具有来自玉米基因家族共有序列的多核苷酸可用于产生针对其他禾本科(Gramineae)种类例如小麦、水稻或高粱的抗体或核酸探针或引物。
或者，可使用具有同源基因所产生的共有序列的多核苷酸鉴定或分离其他分类群的直系同源物。通常，具有共有序列的多核苷酸的长度为至少25、30或40个氨基酸，或20、30、40、50、100或150个核苷酸。本领域技术人员了解，对于区别于比对的序列但具有如前所述同样保守性取代基团的氨基酸，可使用保守氨基酸取代。任选地，对于每10个氨基酸长度的共有序列，取代不超过1或2个保守氨基酸。
用于产生共有序列或通用序列的类似序列包括本文所提供的任何数目或组合的相同基因、直系同源或旁系同源序列的等位基因变体。任选地，用于产生共有或通用序列的类似序列使用BLAST算法的最小加和概率(smallest sumprobability)(P(N))鉴定。序列分析软件的不同供应者列于Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学方法)，Ausubel，etal.，Eds.，Current Protocols，a joint venture between Greene PublishingAssociates，Inc.and John Wiley&Sons，Inc.(Greene Publishing Associates，Inc和约翰威立国际出版公司的合资公司)(附录30)的第7章中。
如果测试核酸与参考核酸相比最小加和概率低于约0.1，更优选低于约0.01或0.001，最优选低于约0.0001或0.00001，则认为该多核苷酸序列类似于参考序列。类似的多核苷酸可进行比对，使用来自于许多供应者的多重序列比对软件产生共有或通用序列，例如Genetics ComputerGroup(Madison，WI)的PILEUP软件、Vector NTI(North Bethesda，MD)的ALIGNX或Genecode(Ann Arbor，MI)的SEQUENCHER。可方便的使用所述软件的缺省参数产生共有或通用序列。
机器应用
本发明提供了鉴定、模拟或分析本发明多核苷酸和多肽的机器(machine)、制品(articles of manufacture)及方法。鉴定方法可鉴定本发明多核苷酸或多肽的同源物，而模拟和分析方法可识别目的结构或功能特征。
A.机器：数据处理系统
在一个实施方案中，本发明提供了机器，其具有：1)包含代表至少一种通用序列的数据的存储器，2)访问数据的遗传鉴定、分析或模拟程序，3)根据程序使用基因序列或其子序列执行指令的数据处理器，以及4)储存或显示数据处理结果的输出端。
本发明的机器是数据处理系统，通常为数字计算机。术语“计算机”包括一个或多个台式或便携计算机、计算机工作站、服务器(包括内部网和因特网服务器)、主机和任何包括任何上述部件的整合系统，与计算机的处理、存储、输入或输出是远程或本地，以及计算机模块的任何联网互联无关。因此数据处理可以是远程的，或分布在一个或多个位置的若干处理器中。数据处理系统包括数据处理器，例如中央处理器(CPU)，其根据应用程序执行指令。当代表本发明多核苷酸或多肽序列的数据用于专利性检索时，本文所用的机器、制品和方法不包括美国专利和商标局或欧洲专利局使用的机器、产品和方法。
本发明的机器包括包含代表至少一基因序列的数据的存储器。本文所用“基因序列”是指本发明多核苷酸或多肽的一级序列(即氨基酸或核苷酸序列)。基因序列可代表来自全长蛋白、基因组DNA或全长cDNA/mRNA的部分序列。包含根据本发明鉴定、分析或模拟的基因序列的核酸或蛋白可被克隆或合成。
如本领域技术人员所了解的，本发明机器存储器形式或计算机可读介质的具体实施方案不是本发明的关键元素，可以是多种形式。所述机器的存储器包括但不限于ROM或RMA或计算机可读介质，例如但不限于，诸如计算机磁盘或硬盘的磁性介质，或诸如CD-ROM、DVD等的介质。包含代表基因序列的数据的存储器包括主存储器、寄存器和缓存。在某些实施方案中，所述数据处理系统在处理数据的同时在存储器中储存代表基因序列的数据，其中该数据的连续部分被依次拷贝到所述数据处理器的至少一个寄存器进行处理。因此，储存在存储器中的基因序列可以是在计算机运行期间或预先存储的基因序列。本发明的机器包括处理代表基因序列的数据的基因鉴定、分析或模拟程序(在下文讨论)。该程序可以在软件或硬件中执行。
本发明还考虑到本发明的机器将直接或间接给本发明多核苷酸或多肽的用途或功能加附注。例如，所述用途/功能可作为机器中的数据元件直接被加以附注并可被程序访问。或者，基因的用途/功能可被间接加以附注为电子记录或文字记录。基因序列的功能或用途可以是基因序列或代表所述序列的数据(即基因序列数据)的功能或用途。
示例性的基因序列的功能或用途包括：1)其名称(根据国际生物化学和分子生物学联合会命名规则)或所述基因序列代表的酶或蛋白的功能，2)所述基因序列代表的蛋白的代谢途径，3)所述基因序列代表的蛋白的底物或产物或结构作用，或4)调节所述基因序列代表的蛋白的表达或活性所影响的表型(例如农艺性状或药理学性状)。
本发明的机器还包括输出端，用于显示、打印或记录使用本发明的基因序列鉴定、分析或模拟的结果。示例性的输出端包括监视器、打印机或各种电子储存机制(例如软盘、硬盘、主存储器)，其可以用于显示结果或用作将存储的数据输入随后的应用或设备的工具。
在某些实施方案中，代表本发明基因序列的数据是数据结构内的数据元件。该数据结构可由定义鉴定、模拟或分析方法的计算机程序定义，或其由单独的数据存储和恢复程序子程序或系统的编程定义。因此，本发明提供了用于储存数据结构的存储器，其可由计算机程序化的执行鉴定、分析或模拟基因序列的方法而访问。存储在该存储器中的数据结构与代表基因序列的数据有关，并反映基因序列的基本组织(underlingorganizaiton)和结构，以促进程序访问对应于基因序列逻辑亚成分的数据元件。该数据结构使得基因序列能被鉴定、分析和模拟。基因序列的基本等级和结构是代表一级序列高级组织的数据。所述高级结构影响转录、翻译、酶动力学或反映结构域或基序。
组成基因序列高级组织的示例性逻辑亚成分包括但不限于，限制酶位点、内肽酶位点、大沟、小沟、β折叠、α螺旋、可读框(ORF)、5’非翻译区(UTRs)、3′UTR、核糖体结合位点、糖基化位点、信号肽结构域、内含子-外显子接头、poly-A尾、转录起始位点、翻译起始位点、翻译终止位点、甲基化位点、锌指结构域、修饰的氨基酸位点、前蛋白原-前蛋白接头、前蛋白-蛋白接头、转运肽结构域、单核苷酸多态性(SNP)、简单序列重复(SSR)、限制性片段长度多态性(RFLP)、插入元件、跨膜区和茎环结构。
在另一个实施方案中，本发明提供了数据处理系统，其包括至少一种存储器中的数据结构，其中该数据结构支持代表本发明基因序列的数据的加入。该系统还包括至少一个遗传鉴定、分析或模拟程序，其使用基因序列数据鉴定、分析或模拟至少一种作为基因序列逻辑亚成分的数据元件，指导系统执行指令。同样提供了处理结果的输出端。
B.制品：计算机可读介质
在一个实施方案中，本发明提供了计算机可读介质中的数据结构，其含有代表本发明基因序列的数据。该数据结构经组织反映所述基因序列的逻辑结构，使该序列可通过能访问该数据结构的软件程序分析。特别是，本发明的数据结构以允许软件工具使用每一基因序列的逻辑元件鉴定、分析或模拟的方式组织本发明的基因序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了含有计算机程序和基因序列数据的机器可读介质。该程序提供了足以执行鉴定、分析或模拟基因序列数据的指令。该介质还包括反映数据的基本组织和结构的数据结构，以利于程序访问对应于基因序列逻辑亚成分的数据元件，数据结构是程序内固有的并且以程序组织和访问数据的方式。
数据结构的实例类似于分层的杂凑表，其中在一个方向上所述序列的碱基内容由字符串A、T、C、G和N代表。5’端到3’端的方向反映为从位置0到字符串长度减1的位置。对应于目的核苷酸序列的此类字符串具有一定数目的亚字符串，其每一个均受到母体字符串内5’端字符串位置和3’端字符串位置的限制。在第二个方向上，每一亚字符串与一种或多种属性字段(attribute field)有关，此类属性字段含有对亚字符串所代表的核苷酸序列中区域的注释。
例如，所考察序列的长为520个碱基，用名称为SeqTarget的字符串表示。在位置12-38的5’上游非编码区处有小沟，其被鉴定为增强子蛋白HM-A的结合位点，该位点依次增加SeqTarget所代表的基因的转录。这里，亚字符串表示为(12，38)，具有以下属性：[上游非编码的]、[小沟]、[HM-A结合]和[HM-A结合后增加转录]。类似地，可通过这种方式存储和构建其他类型的信息，例如与全序列相关的信息，例如所述序列是否为全长的病毒基因、哺乳动物持家基因或克隆X的EST，涉及3’下游非编码区例如发夹结构的信息，以及涉及编码区的各种结构域例如锌指结构的信息。
该数据结构是开放的结构，能适应新产生的数据和需要的知识。所述结构还是柔性结构。其可以裁减为a1-D字符串以利于数据处理和分析步骤，例如群集(clustering)、重复掩蔽(repeat-masking)和HMM分析。同时，所述数据结构也可向多个方向延伸相关的属性。当需要在广泛的基因组知识库中促进数据管理和处理时，可在各方向属性间建立指示器。此外，所述数据结构是目标定向的。多态性可用一个家族或一类的序列对象代表，其中的每一个对象具有如前所述的内部结构。提炼共同的性状并分配给母体对象，其中每一子对象代表所述家族或类别的特定变体。这样的数据结构使数据能通过与序列数据库和/或知识库有关的软件应用得到有效的恢复、升级和整合。
C.方法：鉴定、分析或模拟
本发明还提供了鉴定、分析或模拟代表本发明基因序列的数据的方法。该方法包括：1)向提供机器代表基因序列的数据，所述机器具有硬件或软件执行的基因序列鉴定、模拟或分析程序，2)执行该程序，授权其访问所述基因序列数据，以及3)显示或输出鉴定、分析或模拟的结果。本文同样提供了本发明的方法制备的并在计算机可读的介质内具体化的数据结构。
本发明的另一方法包括提供由代表基因序列的数据所具体化的存储器，和在所述存储器内开发与数据相关的数据结构，以及反映所述数据的基本组织和结构以利于程序访问对应于所述序列逻辑亚成的分数据元件。计算机编程有含指令的程序，该程序足以执行鉴定、分析或模拟基因序列的方法，在计算机上执行该程序，同时授权该程序访问存储器内的数据和数据结构。输出程序结果。
鉴定、分析和模拟程序是本领域公知的，可商业获得。所述程序通常有至少一种应用，以便1)鉴定所述基因序列编码或从其翻译的基因的结构作用或酶功能，2)分析和鉴定基因序列内的高级结构，或者3)在特定的环境下模拟本发明的基因序列的理化性质。
模拟/分析工具包括方法：1)识别与本发明的多核苷酸重叠的序列(例如从测序项目获得)，建立称为“contig(重叠群)”的比对，2)鉴定本发明多核苷酸的限制酶位点，3)鉴定本发明多核苷酸的TI核糖核酸酶消化产物，4)鉴定具有最小自互补性的PCR引物，5)计算比对序列间的配对距离(pairwise distance)，使用间隔法重新构建系统发育树，并计算两个蛋白编码区的发散度(degree of divergence)，6)鉴定诸如本发明多核苷酸的编码区、终止子、重复和其他共有模式的模式，7)鉴定RNA二级结构，8)鉴定本发明多肽的序列基序、等电点、二级结构、疏水性和抗原性，9)翻译本发明的多核苷酸和回译本发明的多肽，以及10)比较两条蛋白或核酸序列，鉴定其相似性或异化性点。
基因序列功能/用途的鉴定通常通过与基因/蛋白数据库的比较分析，建立作为已知功能/用途的基因/蛋白候选同源物(直系同源物或旁系同源物)的基因序列完成。
候选同源物在统计学上非常可能具有与其比较的参考序列相同的生物学功能(例如，催化同样的反应、结合同源蛋白/核酸，具有类似的结构作用)。序列同一性/相似性通常用作鉴定候选同源物的标准，同样，本发明的基因序列可用于鉴定动物或其他植物种类中的同源物，尤其是禾本科中的植物种类，例如但不限于，高粱、小麦或水稻。功能经常建立在序列同一性/相似性的基础之上。示例性的序列比较系统在序列软件中提供，例如Genetics Computer Group(Madison，WI)或InforMax＜/RTI所提供的那些软件。
本发明还提供了在疑似含有本发明多核苷酸的核酸样品中检测本发明的多核苷酸的方法，所述样品例如是植物细胞裂解物、尤其是玉米裂解物。在某些实施方案中，本发明的基因或其部分可在使核酸样品与接触本发明的多核苷酸前扩增。使所述核酸样品与多核苷酸接触形成杂交复合物。所述多核苷酸在严紧条件下与编码本发明多肽的基因杂交。杂交复合物的形成用于在核酸样品中检测编码本发明多肽的基因。本领域技术人员应当了解，包含本发明多核苷酸的分离核酸缺乏与非靶基因共有的交叉杂交序列，该交叉杂交会产生假阳性结果。
杂交复合物的检测可通过任何公知的方法完成。例如，核酸样品或其部分杂交模式测定，所述杂交模式包括但不限于，溶液相、固相、混合相或原位杂交测定。简而言之，在溶液(或液态)相中，靶核酸和探针或引物都可在反应混合物中自由相互作用。在固相杂交测定中，探针或引物通常与固相支持体连接，其中，探针或引物可用于与溶液中的靶核酸杂交。在混合相中，在溶液中的核酸中间产物与溶液中的靶核酸杂交，以及与连接于固相支持体连接的核酸杂交。在原位杂交中，靶核酸从其细胞环境中释放出来，进而在保留细胞形态学的情况下杂交，用于随后的说明和分析。下列文献提供了关于各种杂交试验模式的综述：Singer，etal.，(1986)Biotechniques 4(3)：230-250；Haase，et al.，(1984)Methods inVirology 7：189-226；Wilkinson，The theory and practice of in situhybridization in：In situ Hybridization，Wilkinson，Ed.，IRL Press，OxfordUniversity Press，Oxford；以及Nucleic Acid Hybridization：A PracticalApproach，Hames，and Higgins，Eds.，IRL Press(1987)。
核酸标记和检测方法
标记本发明核酸的方法不是本发明的关键方面，并可用已知或后续开发的任何方法完成。适用于本发明的可检测标记包括任何可通过分光镜、放射性同位素、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法检测的组合物。
在本发明中有用的标记包括用于标记的抗生物素蛋白结合物染色的生物素、磁珠、荧光染料(例如萤光素、得克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记(例如3H、125I、35S、14C或32p)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA常用的其他酶)，以及比色标记，例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)珠。
本发明的核酸可用通常用于检测杂交核酸存在的几个方法中的任何方法标记。一种常用的检测方法是使用标记有3H、125I、35S、14C或32p等探针的放射自显影。放射性同位素的选择依赖于由于所选择同位素合成的容易度、稳定性和半衰期导致的研究偏好。其他标记包括结合标记有荧光团、化学发光剂和酶的抗体的配体。或者，探针可直接与标记例如荧光团、化学发光剂或酶缀合。标记的选择依赖于所需的灵敏度、与探针缀合的容易程度、稳定性需要和可用的仪器。通过例如使用标记的PCR引物可方便地标记本发明的核酸。
在某些实施方案中，所述标记在制备核酸的扩增步骤中同时并入。因此，例如，使用标记引物或标记核苷酸的聚合酶链式反应(PCR)可提供标记的扩增产物。在另一个实施方案中，使用标记的核苷酸(例如荧光素标记的UTP和/或CTP)的转录扩增将标记并入到转录的核酸中。
非放射性探针通常通过间接方法标记。例如，配体分子与探针共价结合。所述配基随后与抗配体分子结合，该分子是固有可检测的或与可检测的信号系统共价结合，例如酶、荧光团或化学发光化合物。作为标记的目的酶主要是水解酶，例如磷酸酶、酯酶和糖苷酶或氧化还原酶、尤其是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮等。化学发光物包括萤光素和2，3二氢酞嗪二酮，例如鲁米诺。
配体和抗配基可以是各种各样的，如果配体具有天然抗配体，即诸如生物素、甲状腺素和皮质醇的配体，其可会同其标记的天然抗配基使用。或者，任何半抗原或抗原化合物可与抗体组合使用。探针也可通过与标记直接缀合而得以标记，例如克隆的DNA探针已与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶直接偶联。
检测所述标记的方法是本领域技术人员公知的。因此，例如放射性标记可使用照相胶片或闪烁计数器检测，荧光标记可使用光电探测器检测发光进行检测。酶标记通常通过向所述酶提供底物，检测酶与底物作用产生的反应产物进行检测，比色标记通过简单地使染色的标记可视化而检测。
蛋白的抗体
可针对本发明的蛋白产生抗体，包括所述蛋白的天然形式(全长)或重组形式的个体、等位基因、品系或种类变体及片段。此外，还针对天然构型或非天然构型的蛋白产生抗体。本领域技术人员已知制备抗体的许多方法。多种分析方法可用于产生本发明蛋白的亲水性曲线。所述方法可用于指导技术人员选择本发明的肽，用于产生或选择在免疫原性条件下对本发明蛋白具特异反应性的抗体。参见例如Janin，(1979)Nature277：491-492；Wolfenden，et al.，(1981)Biochemistry 20：849-855；Kyte andDoolite，(1982)J.Mol Biol.157：105-132；Rose，et al.，(1985)Science229：834-838。以下讨论是现有技术的一般性综述；然而本领域技术人员应当了解针对下述方法的许多改变是已知的。
许多免疫原可用于产生与本发明蛋白特异性反应的抗体。分离重组的、合成的或天然的本发明多核苷酸是产生单克隆或多克隆抗体的优选抗原。在抗体形成前，用于筛选表达文库或其他测定，其中本发明推定的蛋白以非天然二级、三级或四级结构的形式得以表达或变性，本发明的多肽任选地变性，任选地还原。
随后将本发明的蛋白注射到能产生抗体的动物中。可产生单克隆或多克隆抗体，随后用于免疫测定中，测量本发明蛋白的存在和数量。产生多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的，简而言之，用抗原，优选纯化的蛋白、与适当载体偶联的蛋白(例如GST、琥珀酰化钥孔槭血兰蛋白等)或并入免疫载体例如重组痘苗病毒中的蛋白(参见美国专利4,722,848号)，与佐剂混合，用所述混合物免疫动物。通过取试验用血和测定对目的蛋白的反应性滴度监测动物对该免疫原制剂的免疫反应。当获得针对所述免疫原的高滴度抗体时，从动物收集血液并制备抗血清。需要时，进一步分级分离抗血清以富集对所述蛋白具有反应性的抗体(参见例如Coligan，(1991)Current Protocols in Immunology(最新免疫学方法)，Wiley/Greene，NY；和Harlow and Lane，Antibodies：A LaboratoryManual(抗体：实验室手册)，Cold Spring Harbor Press，NY(1989)).
针对本发明蛋白预定片段的抗体，包括其结合片段和单链重组形式，通过例如使用上述片段与载体蛋白的缀合物免疫动物产生。通常，目的免疫原是至少约5个氨基酸的蛋白，更典型地，所述蛋白的长度为10个氨基酸，优选为15个氨基酸，更优选所述蛋白的长度为20个氨基酸或更长。所述肽通常与载体蛋白偶联(例如作为融合蛋白)，或在免疫载体中重组表达。与抗体结合的肽上的抗原决定簇通常长3-10个氨基酸。
单克隆抗体从分泌所需抗体的杂种细胞制备。筛选单克隆抗体与衍生所述抗原蛋白的结合。特异性单克隆和多克隆抗体通常具有抗体结合位点，对于其同源单价抗原而言，该结合位点的亲和常数至少为106-107，通常至少为108，优选至少109，更优选至少110，最优选至少111升/摩尔。
在某些情况下，需要从不同哺乳动物宿主中制备单克隆抗体，例如小鼠、啮齿类、灵长类、人类等。制备这些单克隆抗体的技术说明可参见例如Basic and Clinical Immunology(基础和临床免疫学)，4th ed(第4版)，Stites，et al.，Eds.，Lange Medical Publications，Los Altos，CA和其中引用的参考文献；Harlow and Lane，同上；Going，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(单克隆抗体：原理和实践)，2nd ed(第2版)，Academic Press，New York，NY(1986)；和Kohler and Milstein，(1975)Nature 256：495-497。简而言之，该方法通过向动物注射包含本发明蛋白的抗原进行。随后处死动物，从其脾脏取细胞，该细胞与骨髓瘤细胞融合。产生能在体内复制的杂种细胞或“杂交瘤”。
随后筛选杂交瘤群以分离个体克隆，每个个体克隆分泌针对抗原的单个抗体分子。由此获得的个体抗体分子是响应抗原物质上所识别的特异位点而产生的来自免疫动物永生和克隆的单个B细胞的产物。
其他适当的技术包括在噬菌体或类似载体中选择重组抗体文库(参见例如Huse，et al.，(1989)Science 246：1275-1281；和Ward，et al.，(1989)Nature 341：544-546和Vaughan，et al.，(1996)Nature Biotechnology14：309-314)。或者，高亲和力的人单克隆抗体可从包含未重排人重链和轻链Ig位点片段的转基因小鼠(即微小基因座转基因小鼠)获得。Fishwild，et al.，(1996)Nature Biotech.14：845-851。同样，也可产生重组免疫球蛋白。参见Cabilly的美国专利4,816,567号和Queen，et al.，(1989)Proc.NatlAcad.Sci.86：10029-10033。
本发明的抗体也可用于亲和层析以分离本发明的蛋白。使用连接于固相支持体的抗体制备柱，所述固相支持体例如诸如琼脂糖、SEPHADEX等的颗粒，其中使细胞裂解液通过柱，洗涤并用递增浓度的温和变性剂处理，由此释放纯化的蛋白。
所述抗体可用于筛选特定表达产物的表达库，例如正常或异常的蛋白。通常此种情况下的抗体标记有允许方便地通过抗体结合检测抗原存在的部分(moiety)。针对本发明的蛋白而产生抗体也可用于产生抗独特型抗体。这可用于检测或诊断与各自抗原存在有关的不同病理状态。
本发明的蛋白和抗体经常通过共价或非共价的连接提供可检测信号的物质而标记。多种标记和缀合技术是已知的，并在科学和专利文献中有广泛报道。适当的标记包括放射性核苷酸、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光部分(fluorescent moiety)、化学发光部分(chemiluminescentmoiety)、磁性颗粒等。
在其他方法中，可通过视觉观察选择与野生型植物相比显示乙烯依赖性表型发生改变的植物。例如，可利用“三重反应”检测乙烯依赖表型的改变。“三重反应”由暴露于乙烯的黑暗生长苗的三种不同的形态学变化组成：抑制下胚轴和根延长、茎向膨胀和顶钩扩大。因此，乙烯抑制剂存在下所显示的三重应答显示了一种发生改变的乙烯依赖性表型。乙烯广泛影响农业上重要的植物过程，包括果实成熟、花和叶衰老以及叶离现象。控制植物对乙烯的敏感性的能力因此能显著改善许多作物的质量和寿命。本发明包括通过本发明方法产生的植物，以及植物组织和种子。
尽管通过举例详细描述了本发明，并为清楚理解的目的详细描述了实施例，但显然可以在所附权利要求范围内进行某些改变和修饰。
实施例1
本实施例描述了cDNA文库的构建。SEQ ID NO：1(EIN3)、SEQ IDNO：3(EBF1)、SEQ ID NO：5(EBF2)、SEQ ID NO：7(EIN5)或SEQ ID NO：9(ERF3)的总RNA从玉米基因型HiII获得(Armstrong and Phillips，(1988)Crop Sci.28：363-369)；对于ZmEIN3-2(SEQ ID NO：1)，从夜晚收集的玉米基因型B75的V8-V10阶段叶组织获得。所述总RNA用TRIzoI试剂从玉米组织中分离(Life Technology Inc.Gaithersburg，MD)，使用Chomczynski和Sacchi描述的经修饰的异硫氰酸胍/酸-酚方法(Chomczynski and Sacchi，(1987)Anal.Biochem.162：156)。简而言之，植物组织样品在液氮中雾化，随后加入TRIzol试剂，接着用研钵和研杵进一步均质化。加入氯仿，离心，用于分离水相和有机相。通过用异丙醇沉淀从水相中获得的总RNA。
Poly(A)+RNA分离
使用PolyATact系统(Promega Corporation.Madison，WI)，从总RNA中选择Poly(A)+RNA。简而言之，使用生物素化的寡(dT)引物与mRNA的3’poly(A)尾杂交。使用与顺磁性颗粒和磁性分离链偶联的抗生物素蛋白俘获该杂交物。在高严紧条件下洗涤mRNA，并用无RNA酶的去离子水稀释。进行cDNA Library Construction cDNA合成，并使用SuperScriptPlasmid系统(Life Technology Inc.Gaithersburg，MD)构建单向cDNA文库。cDNA的第一链通过引发含有Not I位点的寡(dT)引物合成。
反应由SuperScript逆转录酶II(SuperScript Reverse Transcriptase II)在45℃下催化。cDNA的第二链用α-32P-dCTP标记，一部分反应用琼脂糖凝胶电泳分析确定cDNA大小。通过Sephacryl-S400层析，除去小于500个碱基对的cDNA分子和未连接的接头。将选定的cDNA分子连接到pSPORTI载体的Not I和Sal I位点间。
实施例2
该实施例描述了cDNA测序和文库消减。测序模板的制备：挑取个体菌落，使用M13正向引物和M13反向引物通过PCR制备或通过质粒分离制备DNA。所有的cDNA克隆均使用M13反向引物测序。
Q-bot消减法：将经历消减的cDNA文库以约每板3000菌落的密度平铺于22×22cm2琼脂板上。将所述平板在37℃恒温箱中孵育12-24小时。用自动菌落采集器Q-bot(GENETIX Limited)挑取菌落置于384孔板中。这些平板在37℃孵育过夜。
一旦挑取了足够的菌落，使用Q-bot将其用针拴于22×22cm2尼龙膜上。每张膜含有9,216或36,864个菌落。这些膜置于含合适抗生素的琼脂平板上。将平板在37℃孵育过夜。
第二天收集菌落后，将这些滤器在用变性溶液预湿的滤纸上放置4分钟，随后在沸水浴上方再放置4分钟。将随后滤器在用中和溶液预湿的滤纸上放置4分钟。通过将滤器放置在干燥滤纸上1分钟，除去过量溶液后，将滤器的菌落侧置于蛋白酶K溶液中，在37℃孵育40-50分钟。将滤器置于干燥滤纸上，干燥过夜。随后通过紫外光处理将DNA与尼龙膜交联。
菌落杂交按照Sambrook等所述进行(Molecular Cloning：A laboratoryManual(分子克隆：实验室手册)，2nd Edition(第二版))。菌落杂交使用以下探针：
1.与文库一样来自相同组织的第一链cDNA，以除去最冗余的克隆。
2.基于之前的测序数据，来自相同文库的48-192最冗余的cDNA克隆。
3.整个玉米序列数据库中的192个最冗余的cDNA克隆。
4.ASal-A20寡核苷酸：TCG ACC CAC GCG TCC GAA AAA AAAAAAAAAAAAAAA，除去含有poly A尾但无cDNA的克隆。
5.衍生自rRNA的cDNA克隆。
将放射自显影的图像扫描进计算机，分析信号强度和每一菌落的冷菌落地址。使用Q-bot将冷菌落从384孔板中重排至96孔板中。
实施例3
本实施例描述了根据计算机同源性搜索的基因鉴定。进行BLAST确定基因同一性(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，et al.，(1993)J.Mol.Biol.215：403-410；同样参见National Center for BiotechnologyInformation，National Library of Medicine，Building 38A，Bethesda，Maryland，USA)，以缺省参数搜索BLAST“nr”数据库中序列的相似性(包含所有的非冗余GenBank CDS翻译，衍生自3维结构布克海文蛋白数据库(Brookhaven Protein Data Bank)的序列、SWISS-PROT蛋白序列数据库、EMBL和DDBJ的最新版本)。使用BLASTN算法，分析所述cDNA序列与“nr”数据库中所有公众可获得的DNA序列的相似性。
在所有的阅读框内翻译DNA序列，使用BLASTX算法分析与NCBI提供的“nr”数据库中所有公众可获得的蛋白序列的相似性(Gish and States，(1993)J.Nature Genetics 3：266-272)。在某些情况下，用来自两个或多个含有重叠DNA片段的克隆的测序数据构建连续的DNA序列。
实施例4
载体构建和ZM-ERF3在玉米中的超表达
PHP21751-UBI:ZM-ERF3
PCR扩增ZM-ERF3的编码区，克隆至pCR2.1TOPO载体内(Invitrogen)。对ZM-ERF3进行序列验证，并连接到含有玉米UBI启动子和PINII终止子的载体中。该基因盒随后连接产生UBIPRO:ZM-ERF3:PINII TERM+35S:BAR:PINII。使用35S:BAR作为除草剂抗性标记。通过限制性消化作图检查表达载体质量，并通过电穿孔转移到根瘤农杆菌LB4404JT中。用该农杆菌株转化GS3近交玉米。对T0事件进行分子分析，单拷贝的转基因表达事件用于进一步试验。
PHP25534-RAB17:ZM-ERF3
PCR扩增ZM-ERF3的编码序列，将其克隆到pCR2.1TOPO载体中(Invitrogen)。对ZM-ERF3进行序列验证，并连接到含有玉米RAB 17启动子和GZ-W64A终止子以及Gateway(Invitrogen)ATT位点的载体中。在单个位点Gateway(Invitrogen)反应中，使用入门载体(entry vector)和目的载体产生RAB 17:ZM-EFR3:GZ-W64A+UBI:MOPAT:PINII+LTP2:DS-RED:PINII。分别使用UBI:MOPAT和LTP2:RFP作为除草剂抗性和可视标记。通过限制性消化作图检查表达载体质量，并通过电穿孔转移到根瘤农杆菌LB4404JT中。用该农杆菌株转化GS3近交玉米。对T0事件进行分子分析，单拷贝的转基因表达事件用于进一步试验。进一步的试验包括自花传受粉或用亲本基因型传粉并选择转基因子代。例如，T1子代包括2倍的亲本基因型，可称为D2。高级株系可与测试基因型杂交，用于现场鉴定。
在谷物填充阶段(即，How a Corn Plant Develops，Iowa State Universityof Science and Technology Cooperative Extension Service Special Report No.48，Reprinted June 1993中描述的R2到R5阶段)，将代表10个PHP25534事件的杂种材料种植于经受了干旱应激的重复试验田中，10个事件中有4个与对照相比显示出在干旱应激下产量具有统计学上显著的改善。四个事件之一还在幼苗干旱耐性测定和低温应激下幼苗早期生长测定中显示出统计学上显著改善的性能。
PHP25536-RYE CBF31 PRO:ZM-ERF3
PCR扩增ZM-ERF3的编码序列，将其克隆到pCR2.1TOPO载体中(Invitrogen)。对ZM-ERF3进行序列验证，并与RYE CBF31启动子(2008年10月23日提交的美国专利申请序号12/256,568)一起连接到含有玉米GZ-W64A终止子以及Gateway(Invitrogen)ATT位点的载体中。在单个位点Gateway(Invitrogen)反应中，使用入门载体和目的载体产生RAB 17:ZM-EFR3:GZ-W64A+UBI:MOPAT:PINII+LTP2:DS-RED:PINII。使用UBI:MOPAT和LTP2:RFP分别作为除草剂抗性和可视标记。通过限制性消化作图检查表达载体质量，并通过电穿孔转移到根瘤农杆菌LB4404JT中。用该农杆菌株转化GS3近交玉米。对T0事件进行分子分析，单拷贝的转基因表达事件用于进一步试验。进一步的试验包括自花传粉或用亲本基因型传粉并选择转基因子代。例如T1子代包括2倍的亲本基因型，并可称为D2。高级株系可与测试基因型杂交，用于现场鉴定。
在谷物填充阶段，将代表9个PHP25536事件的杂交材料种植于经受了干旱应激的重复试验田中，9个事件中有3个与对照相比显示出在干旱应激下产量具有统计学上显著的改善。该3个事件中的2个，以及另外2个事件还显示在低温应激下幼苗早期生长测定中显示出统计学上显著改善的性能。
PHP25537-RYE CBF31 PRO:ZM-ERF3+RYE CBF31 PRO:ZM-CBF2
PCR扩增ZM-ERF3的编码序列，并将其克隆到pCR2.1 TOPO载体中(Invitrogen)。对ZM-ERF3进行序列验证，并与RYE CBF31启动子一起连接到含有玉米GZ-W64A终止子以及Gateway(Invitrogen)ATT位点的载体中。在多位点Gateway(Invitrogen)反应中，使用入门载体和RYECBF31 PRO:ZM-CBF2入门载体产生RYE CBF31PRO:ZM-EFR3:GZ-W64A+RYE CBF31:ZM-CBF2:PINII+UBI:MOPAT:PINII。使用UBI:MOPAT作为除草剂抗性标记。通过限制性消化作图检查表达载体质量，并通过电穿孔转移到根瘤农杆菌LB4404JT中。用该农杆菌株转化GS3近交玉米。对T0事件进行分子分析，单拷贝的转基因表达事件用于进一步试验。
PHP25538-RYE CBF31 PRO:ZM-ERE3+RYE CBF31 PRO:RYE CBF31
PCR扩增ZM-ERF3的编码序列，并将其克隆到pCR2.1TOPO载体中(Invitrogen)。对ZM-ERF3进行序列验证，并与RYE CBF31启动子一起连接到含有玉米GZ-W64A终止子以及Gateway(Invitrogen)ATT位点的载体中。在多位点Gateway(Invitrogen)反应中，使用入门载体和RYECBF31 PRO:ZM-CBF2入门载体产生RYE CBF31PRO:ZM-EFR3:GZ-W64A+RYE CBF31:RYE:CBF31:GZ-W64A+UBI:MOPAT:PINII。使用UBI:MOPAT作为除草剂抗性标记。通过限制性消化作图检查表达载体质量，并通过电穿孔转移到根瘤农杆菌LB4404JT中。用该农杆菌株转化GS3近交玉米。对T0事件进行分子分析，单拷贝的转基因表达事件用于进一步试验。
PHP26620-RD29A PRO:ZM-ERF3+RD29A:RYE CRF31
PCR扩增ZM-ERF3的编码序列，并将其克隆到pCR2.1TOPO载体中(Invitrogen)。对ZM-ERF3进行序列验证，与RD29A启动子一起连接到含有PINII终止子以及Gateway(Invitrogen)ATT位点的载体中。在多位点Gateway(Invitrogen)反应中，使用入门载体和RD29A PRO:RYECBF31入门载体产生RD29A PRO:ZM-EFR3:PINII+RD29A:RYE:CBF31:GZ-W64A+UBI:MOPAT:PINII。使用UBI:MOPAT作为除草剂抗性标记。通过限制性消化作图检查表达载体质量，并通过电穿孔转移到根瘤农杆菌LB4404JT中。用该农杆菌株转化EF09B近交玉米。对T0事件进行分子分析，单拷贝的转基因表达事件用于进一步试验。在花期和谷物填充期，在单独的干旱应激条件下的2个事件之一中观察到统计学上显著的产量改善。
实施例5
载体构建和ZM-EIN3在玉米中基因沉默
UBI:EIN3:PINII RNAi
PCR扩增两条约500个碱基对(有义和反义)的ZM-EIN3基因截短的片段，并将其克隆到Invitrogen TOPO载体中。对ZM-EIN3有义和反义截短的片段进行序列验证，并与ADH1内含子环序列一起连接到含有玉米UBI启动子和PINII终止子以及Gateway(Invitrogen)ATT位点的载体中。在单个位点Gateway(Invitrogen)反应中，使用入门载体和目的载体产生UBI:ZM-EIN3:PINII RNAi+UBI:MOPAT:PINII+LTP2:DS-RED:PINII。使用UBI:MOPAT和LTP2:RFP分别作为除草剂抗性和可视标记。通过限制性消化作图检查表达载体质量，并通过电穿孔转移到根瘤农杆菌LB4404JT中。用该农杆菌株转化EF09B近交玉米。对T0事件进行分子分析，单拷贝的转基因表达事件用于进一步试验。
实施例6
序列分离和内源性表达
序列分离
使用RNAi策略，将乙烯信号基因EIN3和EIN5用于下调构建体中。制备两个EIN3RNAi构建体和一个EIN5RNAi构建体。在EIN3的情况下，使用来自cfp7n.pk010.h4(PCO642867)的全长插入序列产生在编码序列5’端具有约500bp截短的片段的两个RNAi构建体。两个构建体之一在RNAi片段中包括起始ATG，而第二个避免了使用起始ATG，并且在其后立即开始。EIN5RNAi构建体使用编码序列5’端约500bp截短片段在第一ATG后立即开始制备。EIN5RNAi构建体的片段由cfp5n.pk005.c17.f：fis(PCO637491)扩增。
表达信息：
玉米乙烯基因ERF3、EIN3、EIN5、EBF1和EBF2在植物中所有的组织内表达(表2)。已发现ZmERF3的内源性表达在脉管束内最高，显示628ppm的MPSS表达水平(Solexa，Hayward，CA；Brenner，et al.，(2000)Nature Biotechnology 18：630-634)，而该基因实际上在所有玉米组织中表达(图1)。观察到的ZmEIN3、ZmEIN5、ZmEBF1和ZmEBF2最高表达水平分别为1603ppm(节间)、168ppm(穗分生组织)、560ppm(根)和902ppm根)。
在此考虑的基因在应激或激素存在下也显示出差异表达，如表2所示。ZmERF3在大多数组织中观察到由干旱诱导，尽管某个实验表明在干旱下叶和根中基因下调。同样观察到其由冷应激下调。如为确定冷诱导的玉米幼苗叶中基因表达时间过程而进行的微阵列试验所显示的，该基因的表达似乎与应激暴露时间密切相关，该基因的表达在暴露于冷应激后0.5小时的早期时间点达到最高，此后到应激暴露24小时下降到正常未诱导水平(图2)。
ZmEIN3在气生组织中被干旱应激诱导，较小程度被冷应激诱导，而其似乎在根中被干旱下调。它还在暴露于ABA较早时间(24h)时显示出响应ABA处理的较高表达。与此相反，ZmEIN5表达在大多数气生组织中被干旱下调，在根中上调。用ABA和乙烯处理后，其显示表达增强。
植物中ZmEBF1和ZmEBF2表达的调节或多或少相类似。其均在气生组织中被干旱上调，在根中被下调。此外，ZmEBF1被冷应激诱导，而ZmEBF2被ABA和乙烯处理诱导。
UBI::Zm ERF3转基因玉米中下游基因表达
ZmERF3在玉米中的组成型超表达导致了多效性效应，其中植物的茎生长时弯曲。所述植物还显示“buggy-whipping”，一种在抽穗前的生长阶段新生叶紧密卷曲和弯曲的现象。然而，当其向生殖阶段生长时，它们从该表型恢复。鉴于该基因在脉管束内源性表达最高，该组成型超表达可能不利于影响茎中脉管的形成，这引起生长时茎的弯曲。我们分析了两个由UBI启动子组成型表达ZmERF3的转基因玉米事件，即E3和E18，以鉴定下游基因表达的变化。事件E18显示显著的多效性效应，而事件E3未显示此类效应。通过RNA印迹验证，事件E18中的转基因表达相对于内源性水平高很多。由于ZmERF3是转录因子，该基因的组成型超表达将导致表达在转录水平受ZmERF3调节的基因的上调或下调。2个事件中上调和下调基因间有显著的重叠，E18中有比E3更多的基因发生变化(图3)。表3中列出了在2个事件中通常上调或下调的已知功能性的基因。下游基因表达的分析表明，应激和/或乙烯相关的基因在上调和下调类别中均存在。为克服UBI::ZmERF3的多效性效应，将构建体设计为由应激调节的启动子表达基因。由于在UBI::ZmERF3转基因中，若干应激相关的基因被下调，还制备一RNAi构建体，以评价该转录因子在转基因应激耐性中的效果。
表2.MPSS库中所表示的4个乙烯信号基因的内源性表达。
Figure BPA00001184763600871
表3-a：在包含UBI::ZmERF3的玉米转基因事件3和18中通常上调的已知功能的基因的Top-BLAST搜索(hit)。
  登录号   基因名称  E18中的倍数变化
  Q6Z2W4   AvrRpt2-诱导的蛋白2样[水稻(Oryza sativa)(日本品种群)]  81.584
  Q7XLD7   OSJNBa0070C17.11蛋白[水稻(日本品种群)]  21.523
  Q8S0K1   含硒蛋白样[水稻(日本品种群)]  26.790
  Q5VQ37   叶衰老蛋白样[水稻(日本品种群)]  6.737
  Q08062   苹果酸脱氢酶[玉米]  9.206
  Q0JQR6   Os01g0143500蛋白[水稻(日本品种群)]  9.720
  P42390   吲哚-3-甘油磷酸裂解酶，叶绿体前体[玉米]  54.913
  Q69XR7   推定的乙酰辅酶A氧化酶ACX3[水稻(日本品种群)]  164.089
  Q6K4Y6   前折叠相关K  9.165
  Q75I96   推定的受体样激酶[水稻(日本品种群)]   13.604
  Q9XF58   血浆膜内蛋白[玉米]   5.250
  Q43417   过氧化物酶前体[纤毛蒺藜草(Cenchrus ciliaris)]   8.826
  Q0DX49   推定的DNA-3甲基腺嘌呤转葡糖基酶[水稻(日本品种群)]   10.388
  Q6YW60   锌指(C3H4型环指)蛋白样[水稻(日本品种群)]   12.170
  Q5NA53   糖原蛋白(Glycogenin)样蛋白[水稻(日本品种群)]   5.573
  Q48558   60S核糖体蛋白L30[玉米]   12.328
  Q7XLD7   OSJNBa0070C17.11蛋白[水稻(日本品种群)]   21.523
  A2WNN4   Os01g0287400蛋白[水稻(印度品种群)]   41.096
  Q75IK0   推定的o-甲基转移酶ZRP4[水稻(日本品种群)]   17.086
表3-b：在包含UBI::ZmERF3的玉米转基因事件3和18中通常下调的已知功能基因的Top-BLAST搜索。
  登录号   基因名称  E18中的倍数变化
  Q6Z6M4   异柠檬酸裂解酶[水稻(日本品种群)]  -16.010
  Q75HZ0   推定的晚期胚胎发生富集蛋白[水稻(日本品种群)]  -7.250
  Q9AVM3   细胞色素P450[小麦]  -21.360
  Q40680   Os07g0614500蛋白[稻]  -11.691
  Q10LJ9   含重金属相关结构域的蛋白，已表达的[水稻]  -5.053
  Q9ZWI4   ZmGR2c蛋白[玉米]  -7.283
  Q6J555   MADS16[麻竹(Dendrocalamus latiflorus)]  -9.053
  A0S6X4   FT样蛋白[大麦(Hordeum vulgare subsp.Vulgare)]  -11.773
  Q5VMA5   推定的脂酶[水稻(日本品种群)]  -6.354
  Q9ZSX1   多聚蛋白[玉米]  -6.338
  O49010   除草剂安全剂结合蛋白[玉米]  -10.096
  Q6L5H6   Os05g0537400蛋白[水稻(日本品种群)]  -6.043
  Q10SX1   固醇去饱和酶家族蛋白，已表达的[水稻(日本品种群)]  -5.691
  Q2RBL6   主易化扩散载体超家族(Major FacilitatorSuperfamily protein)，已表达的[水稻(日本品种群)]  -9.974
  Q10S44   基本螺旋-环-螺旋，推定的，已表达的[水稻(日本品种群)]  -9.167
  Q8W2K4   细胞色素b5还原酶II型[玉米]  -12.870
  Q2R2W1   Adagio样蛋白3[水稻]  -6.005
  Q69Y12   推定的氨基肽酶C[水稻(印度品种群)]  -31.794
  Q53JI5   POT家族，推定的[水稻(日本品种群)]  -39.680
  Q7EYH1   推定的MDR样ABC转运蛋白[水稻(日本品种群)]  -10.733
  Q84ZF7   Os07g0293000蛋白[水稻(日本品种群)]  -13.433
  Q69J29   果胶甲酯酶样蛋白[水稻(日本品种群)]  -8.375
  Q8RZV3   锌指(C3HC4型环指)蛋白样[水稻(日本品种群)]  -8.153
  Q9LT02   推定的阳离子转运ATP酶[拟南芥]  -5.999
  Q7XIR1   碳酰还原酶样蛋白[[水稻(日本品种群)]  -7.132
实施例7
转基因植物的转化和再生
用含有可操作的连接于干旱诱导型启动子RAB17启动子(Vilardell，etal.，(1990)Plant Mol Biol 14：423-432)和选择标记基因PAT的乙烯信号转导相关序列的质粒轰击来自温室供体植物的未成熟玉米胚，所述选择标记基因提供对除草剂双丙氨磷(Bialaphos)的抗性。或者，选择标记基因用单独的质粒提供。如下进行转化，培养基处方如下。
靶组织的制备：
穗剥皮处理，在30％漂白粉+0.5％Micro去垢剂中表面灭菌20分钟，随后用无菌水冲洗2次。切除未成熟的胚，将胚轴侧向下放置(盾片部分朝上)。每板25胚，在560Y培养基上培养4小时，随后在2.5-cm靶区内对齐，用于准备轰击。
DNA的制备：
制备包含可操作地连接于泛素启动子的乙烯信号转导相关序列的质粒载体。使用如下氯化钙沉淀法，将该质粒DNA和含有PAT选择标记的质粒DNA沉淀到1.1μm(平均直径)钨颗粒上：
100μl制备的钨颗粒水溶液
10μl(1μg)DNA在Tris EDTA缓冲液中的溶液(1μg总DNA)
100μl 2.5M CaCl2
10μl 0.1M亚精胺
向钨颗粒悬液中依次加入各试剂，同时维持于多管涡旋器(multitubevortexer)上。对最终混合物进行简单的超声处理，在恒定涡旋下孵育10分钟。沉淀期后，使管短暂离心，除去液体，用500ml 100％的乙醇洗涤，并离心30秒。再次除去液体，向最终钨颗粒沉淀中加入105μl 100％乙醇。为进行基因枪轰击，对超声钨/DNA颗粒进行简单的超声处理，在每个大载体(macrocarrier)中心点样10μl，在轰击前干燥约2分钟。
基因枪处理：
样品板以#4水平在基因枪中轰击，所有的样品接受650 PSi的单次轰击，每管制备的颗粒/DNA各取10份等分试样。
随后处理：
轰击后，将胚在560Y培养基中保留2天，随后转移到含有3mg/升双丙氨磷的560R选择培养基中，每2周传代培养。约10周的选择后，将选择抗性的愈伤组织克隆转移到288J培养基中，以起始植物再生。体细胞胚成熟后(2-4周)，将发育良好的体细胞胚转移到培养基中进行发芽，并且转移到光照培养室中。约7-10天后，将发育的小植株转移到试管内272V无激素培养基中，培养7-10天，直到小植株完全生长。随后将植物转移插入到含有盆栽土壤的平面(等同于2.5″盆)中，在生长室内生长1周，随后在温室中继续生长1-2周，随后转移到标准的600盆(1.6加仑)中，生长至成熟。监测植物，并对耐旱性的改善进行评分。测定耐旱性改善的测定是本领域的常规技术，包括，例如在同等环境条件下，与对照玉米植物相比在干旱条件下核-抽穗容量产率增加。或者，可监测转化的植物分生组织发育调节(即，穗上小穗形成降低)。参见例如，Bruce，et al.，(2002)Journal of Experimental Botany 53：1-13。
轰击和培养基：
轰击培养基(560Y)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/lEriksson’s维生素混合物(1000×SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l 2，4-D以及2.88g/l L-脯氨酸(用KOH调节至pH5.8后用水定容)；2.0g/l
Figure BPA00001184763600901
凝胶剂(用水定容后加入)；以及8.5mg/l硝酸银(培养基灭菌并冷却至室温后加入)。选择培养基(560R)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson’s维生素混合物(1000×SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、30.0g/l蔗糖、以及2.0mg/l 2，4-D(用KOH调节至pH5.8后用水定容)；3.0g/l
Figure BPA00001184763600902
凝胶剂(用水定容后加入)；以及0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙氨磷(均在培养基灭菌并冷却至室温后加入)。
植物再生培养基(288J)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/lMS维生素储存溶液(0.100g烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆醇及0.40g/l甘氨酸，用精制D-I水定容)(Murashige et al.，Skoog，(1962)Physiol.Plant.15：473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米醇溶蛋白、60g/l蔗糖以及1.0ml/l的0.1mM脱落酸(调节至pH5.6后用精制D-I水定容)；3.0g/l凝胶剂(用D-I水定容后加入)；以及1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l双丙氨磷(培养基灭菌后冷却至60度加入)。无激素培养基(272V)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l MS维生素储存溶液(0.100g/l烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆醇、以及0.40g/l甘氨酸，用精制D-I水定容)、0.1g/l肌醇、以及40.0g/l蔗糖(调节至pH5.6后用精制D-I水定容)；以及6g/l BactoTM-agar凝固剂(用D-I水定容后加入)；灭菌并冷却至60℃。
实施例8
农杆菌介导的转化
对于本发明乙烯信号转导相关序列的反义序列进行农杆菌介导的玉米转化，优选使用Zhao的方法(美国专利5,981,840号，以及PCT专利申请公开WO98/32326号；其内容在此通过引用并入)。简而言之，从玉米中分离未成熟的胚，使胚与农杆菌的悬液接触，其中所述细菌能将反义乙烯信号转导相关序列转移至至少一个未成熟胚的至少一个细胞(步骤1：感染步骤)。在该步骤中将未成熟的胚优选浸入农杆菌悬液，用于开始接种。将所述胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。优选地，感染步骤后，将所述未成熟胚在固体培养基上培养。该共培养期结束后，任选“静止”步骤。在该静止步骤中，在至少一种已知能抑制农杆菌生长的抗生素存在下，孵育胚，不添加植物转化体的选择性试剂(步骤3：静止步骤)。优选将未成熟细胞在含有抗生素但不含选择性试剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并使感染细胞静止。下一步，将接种的胚培养在含有选择性试剂的培养基上，恢复生长中的转化的愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选将未成熟胚在含有选择性试剂的固体培养基上培养，以使得转化的细胞选择性生长。使所述愈伤组织随后再生成植物(步骤5：再生步骤)，优选在固体培养基上培养在选择性培养基上生长的愈伤组织，以再生植物。监测植物并对以对植物分生组织发育的调节评分。例如，尺寸改变及枝条和花分生组织出现和/或叶、花和/或果实产量的增加。
实施例9
大豆胚转化
用含有可操作连接于泛素启动子的反义乙烯信号转导相关序列的质粒按如下轰击大豆胚。为诱导体细胞胚，从大豆品种A2872灭菌表面的未成熟种子切割3-5mm长的小叶，在光照或黑暗条件下，在26℃于适当的琼脂培养基上培养6-10周。随后切除产生体细胞胚的次生胚，放置在合适的液体培养基中。重复选择作为早期球形阶段胚繁殖的体细胞胚簇后，按如下所述，保留悬液。
在26℃下，将大豆胚胎发生悬液培养物保留在旋转摇床中的35ml液体培养基中，150rpm，以16∶8小时白天/黑夜比例荧光照射。每2周将约35mg的组织接种到35ml液体培养基中对培养物进行传代培养。
大豆胚胎发生悬液培养物随后通过基因枪轰击法转化(Klein，et al.，(1987)Nature (London)327：70-73，美国专利4,945,050号)。使用Du PontBiolistic PDS 1000/HE仪器(helium retrofit)进行这些转化。
可促进大豆转化的选择标记基因是由来自花椰菜花叶病毒35S启动子(Odell，et al.，(1985)Nature 313：810-812)、来自质粒pJR225的潮霉素磷酸转移酶基因(来自E.coli；Gritz，et al.，(1983)Gene 25：179-188)以及来自根瘤农杆菌Ti质粒T-DNA的胆脂碱合酶基因3′域组成的转基因。包含可操作地连接于泛素启动子的反义乙烯信号转导相关序列的表达盒，可作为限制性片段分离。该片段可随后插入到携带标记基因的载体的独特限制性位点。
向50μl 60mg/ml的1μm金颗粒悬液中加入(依次)：5μl DNA(1μg/μl)、20μl亚精胺(0.1M)以及50μl CaCl2(2.5M)。颗粒制剂随后搅动3分钟，在微量离心机中离心10秒，除去上清液。DNA包被的颗粒随后在400μl 70％乙醇中洗涤1次，并重悬浮于40μl无水乙醇中。将DNA/颗粒悬液超声处理3次，每次1秒。随后在每个载体碟上加载5微升DNA的包被的金颗粒。
将约300-400mg 2周龄的悬液培养物放置于空的60×15mm皮氏培养皿中，用吸管从组织中除去残余液体。对于每次转化实验，正常轰击约5-10个平板的组织。膜破裂压设定为1100psi，枪膛抽真空至28英寸水银。距保留屏间约3.5英寸放置组织，并轰击3次。轰击后，将组织分成两半，放回到液体中，如前所述培养。
轰击后5-7天，用新鲜的培养基更换液体培养基，且轰击后11-12天用含有50mg/ml潮霉素的新鲜培养基更换。该选择培养基可每周更新一次。轰击后7-8周，可观察到绿色、转化的组织从未转化的坏死胚群中长出。除去分离的绿色组织，接种到个体烧瓶中以产生新的无性繁殖的、转化的胚胎发生悬液培养物。每个新系可作为独立的转化事件处理。这些悬液可随后进行传代培养，以未成熟胚群保留或通过个体体细胞胚的成熟和发芽再生成完整植物。
实施例10
向日葵分生组织转化
用含有可操作地连接于泛素启动子的反义乙烯信号转导相关序列的表达盒按如下转化向日葵分生组织(同样参见，欧洲专利号EP 0486233，在此通过引用将其并入，以及Malone-Schoneberg，et al.，(1994)PlantScience 103：199-207)。成熟的向日葵(Helianthus annuus)种子用单小麦头脱粒机(single-wheat head thresher)去壳。将种子在20％漂白粉溶液中表面灭菌30分钟，每50ml溶液加入2滴
Figure BPA00001184763600932
20。种子用无菌蒸馏水冲洗2次。
劈开胚轴的外植体通过改良的Schrammeijer等(Schrammeijer，et al.，(1990)Plant Cell Rep.9：55-60)所述的方法制备。表面灭菌过程后，将种子在蒸馏水中浸没60分钟。随后折断每粒种子的子叶，从而在胚轴平面产生干净折断。切除根尖后，在初叶间纵向对切外植体。将两部分切割面向上放置在由Murashige和Skoog矿物元素组成的GBA培养基中(Murashige，et al.，(1962)Physiol.Plant.，15：473-497)，Shepard′s维生素添加物(Shepard，(1980)in Emergent Techniques for the Genetic Improvement ofCrops(University of Minnesota Press，St.Paul，Minnesota)，40mg/l硫酸腺嘌呤、30g/l蔗糖、0.5mg/l 6-苄基氨基嘌呤(BAP)、0.25mg/l吲哚-3-醋酸(IAA)、0.1mg/l赤霉酸(GA3)，pH 5.6以及8g/l植物凝胶(Phytagar，Invitrogen，Carlsbad，CA)。
随后在农杆菌处理前对外植体进行微粒轰击(Bidney，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：301-313)。对于该处理，将30-40个外植体放置在60×20mm平板中心的圆环内。将约4.7mg 1.8mm的钨微粒重悬浮于25ml无菌TE缓冲液(10mM Tris HCl，1mM EDTA，pH 8.0)中，每次轰击使用1.5ml等分试样。在颗粒加速装置中，每个平板经放置在样品上方2cm处的150mm nytex屏幕轰击两次。
在所有转化实验中，使用无害的根瘤农杆菌菌株EHA105。将包含表达盒的二元质粒，如Holsters，et al.，(1978)Mol.Gen.Genet.163：181-187所述，通过冻融引入农杆菌株EHA105，所述表达盒含有可操作地连接于泛素启动子的反义乙烯信号转导相关基因。该质粒还包含卡那霉素选择标记基因(即nptII)。将用于植物转化实验的细菌在液体YEP培养基(10gm/l酵母提取物，10gm/l细菌用蛋白胨，以及5gm/l NaCl，pH 7.0)中生长过夜(28℃盒100RPM连续搅拌)，该培养基具有细菌菌株和二元质粒维持所需的适当抗生素。当其OD600到达约0.4-0.8时，使用悬液。沉淀农杆菌细胞，以0.5的最终OD600重悬浮于由12.5mM MES pH 5.7、1gm/lNH4Cl和0.3gm/l MgSO4组成的接种培养基中。
将新轰击的外植体置于农杆菌悬液中，混合，静置约30分钟。随后将外植体转移到GBA培养基中切割面向上共培养，26℃，18-小时天。共培养3天后，将外植体转移到补充有250mg/l头孢噻肟和50mg/l硫酸卡那霉素的374B(缺乏生长调节剂和蔗糖水平降低为1％的GBA培养基)中。外植体培养2到5周进行选择，随后转移到无卡那霉素的新鲜的374B培养基中1到2周，继续发育。将外植体转移到含有250mg/l头孢噻肟的GBA培养基中，进行第二次3-天植物激素处理，该外植体具有未形成适于切割枝条的分化的抗生素抗性生长区域。通过ELISA测定绿色卡那霉素抗性枝条的叶样品中NPTII的存在，并通过测定分生组织发育的调节(即，尺寸改变及枝条和花分生组织的出现)，确定转基因的表达。
将NPTII-阳性枝条移植到体外生长的向日葵幼苗根茎
Figure BPA00001184763600942
杂种6440中。表面灭菌的种子在48-0培养基中发芽(一半强度的Murashige和Skoog盐，0.5％蔗糖，0.3％
Figure BPA00001184763600951
胶凝剂，pH 5.6)，在外植体培养基中描述的条件下生长。除去幼苗的上部，制备下胚轴中1cm垂直切片，将转化的枝条插入切口。整个区域用
Figure BPA00001184763600952
柔性薄膜包裹，以固定枝条。移植的植物可在一周体外培养后转移至土壤中。土壤中的移植物维持在高湿度条件下，缓慢适应温室环境。温室中成熟的T0植物(亲代)转化部分通过叶提取物的NPTII ELISA和/或乙烯信号转导相关活性分析鉴定，而从NPTII阳性T0植物中收集的转基因种子通过少量干燥种子子叶的乙烯信号转导活性分析鉴定。
备选的向日葵转化方法可在不需要使用化学选择压力的情况下收集转基因子代。种子去壳并在每100ml溶液加入2到3滴吐温
Figure BPA00001184763600953
20的20％漂白粉溶液中进行20分钟的表面灭菌，随后用蒸馏水冲洗3次。灭菌的种子在黑暗中，在26℃下、在用水湿润的滤纸上吸水20小时。除去子叶和根(root radical)，随后将分生组织外植体在374E(GBA培养基，由MS盐、Shepard维生素、40mg/l硫酸腺嘌呤、3％蔗糖、0.5mg/l 6-BAP、0.25mg/l IAA、0.1mg/l GA和0.8％Phytagar(Invitrogen，Carlsbad，CA)组成，pH 5.6)上在黑暗中培养24小时。除去初生叶，以暴露顶端分生组织，将约40个外植体顶端圆顶朝上放置在374M(GBA培养基，含1.2％Phytagar(Invitrogen，Carlsbad，CA))中心2cm圆圈内，随后在所述培养基上黑暗培养24小时。
将约18.8mg 1.8μm的钨颗粒重悬浮于150μl无水乙醇中，超声处理后，将8μl该溶液滴于大载体表面的中心。在26mm Hg氦枪真空下，每个板用第一层架中650psi的安全膜轰击两次。
如前所述将目的质粒通过冻融法引入根瘤农杆菌菌株EHA105中。将28℃下过夜生长的细菌在存在50μg/l卡那霉素的情况下在液体YEP培养基(10g/l酵母提取物，10g/l细菌用蛋白胨以及5g/l NaCl，pH 7.0)中的沉淀物，重悬浮于接种培养基中(12.5mM 2-mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸、MES、1g/l NH4Cl和0.3g/l MgSO4，pH 5.7)获得OD600为4.0的最终浓度。将颗粒轰击的外植体转移到GBA培养基中(374E)，将1小滴细菌悬液直接置于分生组织顶部。将外植体在培养基上共培养4天，之后将外植体转移到374C培养基中(含1％蔗糖的GBA，不含BAP、IAA、GA3，补充有250μg/ml头孢噻肟)。小植株随后在培养基上培养约2周，每天16小时，26℃孵育条件。
筛选来自374C培养基中2周培养物的外植体(约2cm长)的分生组织发育调节(即，尺寸改变及枝条和花分生组织的出现)作用。鉴定阳性外植体后，弃去不显示修饰的乙烯信号转导相关活性的枝条，并将每个阳性的外植体细分成节外植体。一个节外植体含有至少一个可能的节。将节片段在GBA培养基上培养3到4天，以促进每个节的附着芽形成。随后将其转移至374C培养基中，继续发育4周。分离发育的芽，在374C培养基上再培养4周。再次通过适当的蛋白活性测定筛选由每个新恢复的枝条收集的叶样品。此时从单个节获得的阳性枝条通常已富含了在节培养前的最初测定中检测到的转基因。
将对修饰的乙烯信号转导相关表达阳性的恢复的枝条移植到体外生长的向日葵幼苗根茎
Figure BPA00001184763600961
杂种6440中。根茎以下列方法制备。种子去壳并在每100ml溶液加入2到3滴吐温
Figure BPA00001184763600962
20的20％漂白粉溶液中进行20分钟的表面灭菌，随后用蒸馏水冲洗3次。灭菌的种子再用水湿润的滤纸上发芽3天，随后将它们转移至48培养基中(半浓度的MS盐、0.5％蔗糖、0.3％
Figure BPA00001184763600964
胶凝剂，pH 5.0)，在26℃黑暗生长3天，随后在16-小时-天培养条件下孵育。除去所选幼苗的上部，制备各下胚轴垂直切片，将转化的枝条插入V型切口。切口区域用
Figure BPA00001184763600965
柔性薄膜包裹。在培养基上培养一周后，将移植的植物转移至土壤中。在最初的两周，将其维持在高湿度条件下，以适应温室环境。
实施例11
水稻组织转化
本领域技术人员可用的将DNA转化到高等植物细胞内的一种方法是，使用包被有目的核酸构建体的金属颗粒的高速弹道轰击(参见Klein，et al.，Nature(1987)(London)327：70-73和参见美国专利4,945,050号)。使用Biolistic PDS-1000/He (BioRAD Laboratories，Hercules，CA)进行这些补充性实验。颗粒轰击技术被用于用DNA片段转化乙烯信号转导相关突变体和野生型水稻。
使用来自赋予抗生素抗性的吸水链霉菌(Sreptomyces hygroscopicus)的细菌潮霉素B磷酸转移酶(Hpt II)基因作为水稻转化的选择标记。在载体pML18内，Hpt II基因用来自花椰菜花叶病毒的35S启动子和来自根瘤农杆菌的章鱼碱合酶基因的终止和多腺苷酸化信号进行改造。pML18描述于WO 97/47731中，其公开于1997年12月18日，其公开的内容在此通过引入并入。
衍生自发芽的水稻种子盾片的胚胎发生愈伤组织培养物用作转化实验的原材料。该材料通过在27-28℃下的黑暗中、在愈伤组织起始培养基(MS盐、Nitsch和Nitsch维生素、1.0mg/l 2，4-D和10μM AgNO3)上发芽无菌水稻种子产生。将从胚的盾片增生的胚胎发生愈伤组织转移到CM培养基中(N6盐、Nitsch和Nitsch维生素、1mg/l 2，4-D，Chu，et al.，1985，Sci.Sinica 18：659-668)。通过常规次代培养以2周间隔将愈伤组织培养物维持在CM上，用于在起始10周内转化。
通过传代培养的0.5-1.0mm碎片制备愈伤组织用于转化，该碎片相隔约1mm排列在放置于CM培养基上的
Figure BPA00001184763600971
#541纸上环中心约4cm直径的圆形区域内。将含愈伤组织的平板在27-28℃黑暗中培养3-5天。轰击前，将含愈伤组织的滤纸转移到补充有0.25M甘露醇和0.25M山梨醇的CM中，在黑暗中放置3小时。在无菌罩内，使皮氏培养皿的盖子半开约20-45分钟，驱散组织上的水分。
各基因组DNA片段用含有用于水稻转化的选择标记的pML18共沉淀至金颗粒表面。为此向以60mg ml-1浓度重悬浮的50μl金颗粒的等分试样中加入总共10μg 2∶1比例的性状∶选择标记DNA的DNA。随后向金-DNA悬液中加入氯化钙(50μl 2.5M溶液)和亚精胺(20μl 0.1M溶液)，同时涡旋试管3分钟。金颗粒随后在微量离心机中离心1秒，除去上清。金颗粒随后用1ml无水乙醇洗涤2次，随后重悬浮于50μl无水乙醇中，并进行用超声处理(水浴超声器)1秒，以分散金颗粒。金悬液随后在-70℃下孵育5分钟，根据需要，进行超声处理(水浴超声器)，以分散颗粒。随后将6μlDNA-包被的金颗粒加载到聚酯薄膜大载体盘上，使乙醇蒸发。
在干燥结束时，将含有该组织的皮氏培养皿置于PDS-1000/He腔内。随后将腔内的空气抽真空至28-29英寸Hg。使用当激波管内He压到达1080-1100psi时破裂的安全膜(rupture membrane)，用氦冲击波加速载体膜片。将组织放置在离阻止屏约8cm的地方，轰击愈伤组织两次。用DNA包被的金颗粒以此方式轰击2-4个平板的组织。轰击后，将愈伤组织转移到不含山梨醇或甘露醇的CM培养基中。
轰击后3-5天内将愈伤组织转移到SM培养基上(含有50mg/l潮霉素的CM培养基)。为此将愈伤组织从平板转移到无菌50ml锥形管中并称重。按2.5ml顶层琼脂/100mg愈伤组织的量，在40℃下加入熔化的顶层琼脂。用10ml的吸管重复分配将愈伤组织团块打断成低于2mm直径的片段。将3ml的愈伤组织悬液平铺于新鲜的SM培养基中，27-28℃下将平板在黑暗中孵育4周，4周后，鉴定转基因愈伤组织事件，转移至新鲜的SM平板中，继续在27-28℃下在黑暗中生长2周。
将生长的愈伤组织转移到RM1培养基(MS盐、Nitsch和Nitsch维生素、2％蔗糖、3％山梨醇、0.4％
Figure BPA00001184763600981
胶凝剂+50ppm hyg B)上，在25℃下于黑暗中2周。2周后将愈伤组织转移到RM2培养基(MS盐、Nitsch和Nitsch维生素、3％蔗糖、0.4％
Figure BPA00001184763600982
胶凝剂+50ppm hyg B)中，在冷白光(～40μEm-2s-1)、25℃、湿度30-40％下放置12小时。2-4周光照后，愈伤组织开始组织并形成枝条。从周围的愈伤组织/培养基中除去枝条，轻柔地转移到PhytatrayTM一次性植物细胞培养管(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)内的RM3培养基(1/2×MS盐、Nitsch和Nitsch维生素、1％蔗糖+50ppm潮霉素B)中，按上文所述步骤继续使用同样条件孵育。
2-3周后，当长出足够的根和枝条时，将植物从RM3转移到含有Scotts
Figure BPA00001184763600983
350生长培养基的4”盆中。检查从该转基因植物获得的种子乙烯信号转导相关突变与含有乙烯信号转导相关基因的野生型基因组DNA的遗传互补性。
实施例12
乙烯信号转导相关序列的变体
A.不改变编码的氨基酸序列的乙烯信号转导相关蛋白的突变的核苷酸序列
使用乙烯信号转导相关核苷酸序列产生突变的核苷酸序列，该突变的核苷酸序列具有当与相应SEQ ID NO起始未改变的ORF核苷酸序列相比，具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核苷酸序列同一性的可读框核苷酸序列。这些功能性变体使用标准密码子表产生。尽管所述变体的核苷酸序列发生了改变，但可读框所编码的氨基酸序列不变。
B.乙烯信号转导相关多肽的突变的氨基酸序列
产生了乙烯信号转导相关多肽的突变的氨基酸序列。在该实施例中，改变了一个氨基酸。具体而言，检查可读框以确定合适的氨基酸改变。通过查询蛋白比对(与另一个正向直系源物以及不同种类的其他基因家族成员)，选择要改变的氨基酸。选择认为不处于高选择压的氨基酸(非高度保守的)，其易于被具有类似化学性质的氨基酸所取代(即类似的功能性侧链)。使用蛋白比对，可改变合适的氨基酸。一旦鉴定了靶向氨基酸，则按下列C部分的方法进行。使用该方法产生具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核酸序列同一性的变体。
C.其他乙烯信号转导相关多肽氨基酸序列变体
在该实施例中，产生了相对于参考蛋白序列具有80％、85％、90％和95％同一性的人工蛋白序列。该最近的工作需要从比对中鉴定保守区和可变区，随后谨慎应用氨基酸取代表。这些部分将在下文详细讨论。
选择哪个氨基酸进行改变很大程度上依赖于乙烯信号转导相关蛋白或乙烯信号转导相关多肽间的保守区域。基于序列比对，可能改变的乙烯信号转导相关多肽的可变区用小写字母表示，而保守区用大写字母表示。已知可在下列保守区中进行保守取代而不改变功能。此外，本领域技术人员应当了解本发明乙烯信号转导相关序列的功能性变体可在保守结构域中具有较少的非保守的氨基酸改变。
随后产生在80-85％、85-90％、90-95％和95-100％同一性的区间内不同于原始序列的人工蛋白质序列。这些区间的中点例如用加或减1％的自由范围(literal latitude)定向。氨基酸取代将通过常规的Perl script完成。取代表提供于下文表4中。
表4.取代表
  氨基酸   高度相似和最佳的取代   改变的顺序评级   注释
  I   L，V   1   50:50取代
  L   I，V   2   50:50取代
  V   I，L   3   50:50取代
  A   G   4
  G   A   5
  D   E   6
  E   D   7
  W   Y   8
  Y   W   9
  S   T   10
  T   S   11
  K   R   12
  R   K   13
  N   Q   14
  Q   N   15
  F   Y   16
  M   L   17   第一个甲硫氨酸不能改变
  H   Na   无好的取代
  C   Na   无好的取代
  P   Na   无好的取代
首先，鉴定蛋白中任何不应被改变的保守氨基酸，“划界”以从取代中隔离。起始的甲硫氨酸当然自动添加至该列表。下一步，进行所述改变。
H、C和P在任何情况下不变。改变将从异亮氨酸开始，从N末端扫至C末端。随后为亮氨酸，按列表往下，直到达到所需的靶标。可进行中间数目的取代，以便不引起改变的逆转。该列表按1-17列出，因此以亮氨酸前所需的尽可能多的异亮氨酸改变开始，由此直到甲硫氨酸。显然许多氨基酸不会以此方式改变。L、I和V将包括两种可选的最佳取代的50:50取代。
突变的氨基酸序列作为输出结果记下，使用Perl script计算百分比同一性。使用该方法，产生乙烯信号转导相关多肽变体，该变体具有与SEQID NOS：1、3、5、7或9的起始未改变的ORF核苷酸序列约80％、85％、90％和95％的氨基酸同一性。
实施例13
转基因玉米植物
产生含启动子控制下的乙烯信号转导相关构建体的T0转基因玉米植物。这些植物在温室条件下，在FASTCORN系统内生长，详见美国专利申请公开2003/0221212号，美国专利申请序号10/367,417。
以下述方式分析每株植物的一种或多种下列特性的可测量改变：
分析转基因事件1:1分离的T1子代在低KNO3中改善的生长速率，所述子代衍生于各含有单拷贝的各乙烯信号转导相关构建体的T0植物自体受精。当对于测定转基因阳性、转基因无效和非转化的对照事件测定累积的植物生长、生长速率和穗重量时，监测生长直到开花。将个体植物的表型分布与对照组的分布以及剩余处理组的分布进行比较。计算各组的差异，用F检验(F test)比较，从将事件方差与非转基因对照组的方差以及该实验中剩余事件的合并方差进行比较。对KNO3的反应越大，事件组内的方差越大，F值也越大。将阳性结果和事件内转基因分布进行比较，以确认该反应与转基因分离。
本说明书中所有的出版物和专利申请表示本发明所述领域普通技术人员的水平。所有出版物和专利申请通过引用并入本文的程度，如同每个单独的出版物或专利申请特地和单独地通过引用指出。
参考多个特定和优选的实施方案和技术，对本发明进行了描述。然而，应当理解，可在本发明的精神和范围内进行许多变化和修饰。
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Claims (11)

1.分离的核酸，其由编码SEQ ID NO:10的多肽的多核苷酸组成。
2.分离的核酸，其由SEQ ID NO:9所示的多核苷酸组成。
3.重组表达盒，包含在有义或反义方向可操作地连接于启动子的权利要求1所述的多核苷酸。
4.生产转基因植物的方法，包括将权利要求3所述的重组表达盒引入所述植物。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述植物选自玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦和谷子。
7.产生转基因种子的方法，包括实施权利要求4所述的方法，并产生所述转基因植物的转基因种子。
8.调节玉米植物对干旱应激或冷应激的反应的方法，包括：
(a)将重组构建体引入玉米细胞中，所述重组构建体包含可操作地连接于SEQ ID NO:9的多核苷酸的启动子；
(b)在植物细胞生长条件下培养所述植物细胞，并将所述植物细胞再生为玉米植物；以及
(c)诱导所述多核苷酸表达足以调节所述植物的干旱应激或冷应激的时间。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述启动子是应激反应启动子。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述应激反应启动子是Rab17启动子、Rd29a启动子或RyeCBF31启动子。
11.分离的蛋白，由SEQ ID NO:10的多肽组成。
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