CN117511966B - 巴西蕉乙烯信号转导的MaEIL4基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种巴西蕉乙烯信号转导的MaEIL4基因及其应用，所述MaEIL4基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。与上述的MaEIL4基因调控互作的MaMADS36启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。本发明明确乙烯信号转导因子MaEIL4在调控香蕉果实成熟品质中的作用，拓展香蕉果实成熟品质的调控网络，为通过生物技术手段改善香蕉果实成熟品质提供靶基因，为催熟或保鲜新技术的研发提供理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及香蕉生物技术领域，具体涉及一种巴西蕉乙烯信号转导的MaEIL4基因及其应用。
背景技术
巴西蕉（Musa acuminate L.AAA group cv. Cavendish，BX）是公认的产量高品质优的品种，其果实采后成熟过程也是品质形成的主要过程。巴西蕉是典型的呼吸跃变型果实，乙烯信号在果实采后成熟过程中具有非常重要的作用。因此深入研究乙烯信号在巴西蕉的感受转导并调控果实成熟的分子机制，挖掘参与乙烯信号转导的关键基因，通过生物技术手段对香蕉进行遗传改良，对于调控果实货架期，减少采后损失，保障香蕉产业的可持续健康发展具有重要的意义。
目前，巴西蕉基因组中还没有找到参与乙烯信号转导的关键基因，因此，迫切希望找到一个参与乙烯信号转导调控巴西蕉果实成熟的关键基因，通过调控该基因表达进而调控香蕉的采后成熟，促进催熟或保鲜新技术的研发，实现香蕉的遗传改良。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种巴西蕉乙烯信号转导的MaEIL4基因及其应用。
为实现上述目的，本发明所设计的技术方案如下：
本发明提供了一种巴西蕉乙烯信号转导的MaEIL4基因，所述MaEIL4基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了一种上述的MaEIL4基因编码的蛋白MaEIL4，其氨基酸序列为如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了一种用于上述MaEIL4基因的引物对，所述引物对：
Primer-F：5’-AGTGGTCTCTGTCCAGTCCTCGTCGTATGTGGAGA-3’；
Primer-R：5’-GGTCTCAGCAGACCACAAGTGCATCTTCATGTAGA-3’。
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体为含有上述MaEIL4基因的表达载体，其中，所述表达载体为pCAMBIA-1300或者pTRV2或Prey。
本发明还提供了一种含有上述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞农杆菌GV3101。
本发明还提供了一种上述MaEIL4基因调控MaMADS36启动子在调控果实成熟品质中的应用，所述MaMADS36启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。
下述各项之一在调控香蕉果实成熟品质中或培育快速成熟优质香蕉新品种中的应用，它包括：
（1）上述的MaEIL4基因；
（2）上述的重组表达载体；
（3）上述的宿主细胞。
进一步地，所述香蕉为巴西蕉。
本发明的有益效果：
本发明明确乙烯信号转导因子MaEIL4在调控香蕉（尤其巴西蕉）果实成熟品质中的作用，拓展香蕉果实成熟品质的调控网络，为通过生物技术手段改善香蕉果实成熟品质提供靶基因，为催熟或保鲜新技术的研发提供理论依据。
附图说明
图1为香蕉果实采后成熟特征及MaEIL4在不同处理下果实成熟过程中的差异表达分析图；图中，A为香蕉果实采后不同处理条件下的成熟特征图，a, b和c分别为乙烯处理条件下成熟度I（0DPH）, II（2DPH）和VI（6DPH）的果实；d, e和f分别为自然成熟条件下采后I（0DPH）, II（8DPH）和VI（14DPH）的果实；g, h和i分别为1-MCP处理条件下采后0DPH, 8DPH和14DPH的果实。B为不同处理条件下乙烯释放量的示意图；C为不同处理条件下果实硬度的示意图；D为MaEIL4在不同处理下果实成熟过程中的差异表达分析图；
图2为香蕉MaEIL4的基因结构（A）、保守结构域分析（B）和亚细胞定位预测（C）的示意图；
图3为MaEIL4亚细胞定位观察图；
图4为MaEIL4转录活性鉴定图；
图5为MaEIL4在香蕉果实薄片上的功能验证图；图中，A为MaEIL4的瞬时沉默表达图，A1, A2和A3为CK的三次重复；A4, A5和A6为瞬时沉默的三次重复；B为MaEIL4的瞬时过表达图，B1,B2和B3为CK的三次重复，B4, B5和B6为瞬时过表达的三次重复；C为MaEIL4的瞬时沉默表达时果实薄片中的总淀粉含量图；D为MaEIL4的瞬时过表达时果实薄片中的总淀粉含量图；E为MaEIL4的瞬时沉默表达时果实薄片中β-淀粉酶活性图；F为MaEIL4的瞬时过表达时果实薄片中β-淀粉酶活性图；G为MaEIL4的瞬时沉默表达时果实薄片中可溶性糖含量图；H为MaEIL4的瞬时过表达时果实薄片中可溶性糖的含量图；I为MaEIL4的瞬时沉默表达时果实薄片中内源基因的表达量图；J为MaEIL4的瞬时过表达时果实薄片中内源基因的表达量图。
图6为启动子的生物信息学分析及活性检测图；图中，A为启动子结构可视化分析图；B为pNC-121载体构建示意图；C为香蕉果实切片GUS染色图，C1: pNC121（阳性对照）；C2:切除35S启动子的pNC121（阴性对照）；C3:将MaMADS36启动子替换pNC121载体中35S启动子成后染色结果图；D为GUS活性检测图，C1, C2, C3代表的样品与C中相同；
图7为MaEIL4对MaMADS36的转录调控作用的示意图；图中，A为酵母单杂交载体示意图；B为双荧素报告系统载体构建示意图；C为酵母单杂交验证图；D为EMSA验证图；E为双荧光素报告系统检测图；F为活体成像检测图；
图8为MaEIL4与MaMADS36的相互作用鉴定图；图中，A为酵母双杂交鉴定图；B为Pull down验证图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
下述实施例中需要的相关材料：
1.1 材料
以巴西蕉（Musa acuminataL. AAA group, cv. Cavendish）为材料，采自于中国热带农业科学院热带生物技术研究所澄迈香蕉基地。本氏烟草（Nicotiana benthamiana）由中国热带农业科学院热带生物技术研究所香蕉品质遗传改良课题组提供。
1.2 菌株和载体
本实验所用感受态：DH5α、Y1HGold、GV3101（pSoup），EHA105等，实验中酵母单杂Bait载体选择用pAbAi，酵母单杂Prey载体为pGADT7。植物双荧光素酶报告实验所用载体为pGreenII 0800-LUC、pGreenII 62-SK均来自本实验室。pNC121载体由中国热带农业科学院热带生物技术研究所言谱老师馈赠。植物绿色荧光双元表达载体pCAMBIA1300-GFP由中国热带农业科学院生物所阮孟斌老师所赠送。
1.3 试剂
本研究所需要的主要试剂（表1）
表1 实验试剂
实施例1 巴西蕉乙烯信号转导的MaEIL4基因克隆
1.MaEIL4基因克隆
根据实验室前期分析巴西蕉的转录组数据的结果，选择表达量较高的基因进行克隆。用Prime 5.0设计引物，在两条引物前部添加无缝克隆特定接头序列，具体引物如下：
Primer-F：5’-AGTGGTCTCTGTCCAGTCCTCGTCGTATGTGGAGA-3’；
Primer-R：5’-GGTCTCAGCAGACCACAAGTGCATCTTCATGTAGA-3’。
以巴西蕉果实cDNA为模板进行扩增，扩增体系见表2。
表2 PCR 扩增体系
MaEIL4基因扩增的条件：94℃ 5 min，94℃ 60 s，56℃ 退火45 s，72℃ 60 s，扩增设置35个循环后，72℃ 10 min；反应结束后取3 μLPCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测条带大小是否正确。正确后利用胶纯化回收试剂盒（Omega）回收上述PCR产物，把回收到的目的片段与改造后的无缝克隆pGBKT7和pGADT7载体进行连接，连接体系见表3。
表3 pGBKT7/pGADT7载体连接体系
轻轻吸打混匀离心后于37℃金属水浴1 h。
2.转化
将连接产物转化大肠杆菌DH5α菌，转化步骤如下：
①从-80℃取出将大肠杆菌感受态DH5α，迅速插入冰中，约5 min待菌融化，加入连接产物并用枪头轻柔吸打混匀，插入冰水混合物中静置30 min。
②于金属浴中42℃热激90 s后，快速冰浴5 min，（注意拿取过程不能晃动离心管，否则会降低转化率）。
③将离心管小心放入超净工作台中，向其加入500 µL无抗生素的无菌LB培养基，混匀后于37℃，200 rpm培养1 h。
④在离心机中5000 rpm离心30 s，弃掉部分上清液后，剩余上清与菌体吸打混匀，吸取100 µL均匀涂抹于含氨苄（Ampicillin，缩写Amp）抗性LB平板上。于37℃培养箱倒置过夜培养。
⑤待长出单克隆后，选择形成单个的菌落溶于700 μL带氨苄抗性的LB液体培养基中吸打混匀，放于37℃摇床，200 rpm培养3-6 h。取2 µL作为PCR扩增模板，反应体系如表4。
表4 菌落PCR反应体系
反应程序如下：
扩增后取3 µLPCR产物电泳检测，若检测结果大小与目的条带大小一致，说明该单菌落为阳性克隆。
将上述检测获得阳性的菌液吸取200 µL，送生工生公司测序，得到巴西蕉乙烯信号转导的MaEIL4基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列为如SEQ ID NO：2所示。
将测序正确的剩余菌液加入等量的40%甘油于-80℃保存。测序正确的菌液，重新摇菌活化扩大培养，提取质粒，使用质粒DNA提取试剂盒（Omega）。方法步骤按试剂盒说明书。
实施例2 巴西蕉乙烯信号转导的MaEIL4基因的qRT-PCR
利用Primer 5软件设计MaEIL4基因特异表达引物：
MaEIL4P1： 5’-CTGTTTCTGGCATTCCTA-3’；
MaEIL4P2：5’-CGGTAAATCACAAGTCTCA-3’，
以香蕉actin基因为参照。以巴西蕉果实的cDNA为模板，按表5加样，混匀后瞬离，置于实时荧光定量PCR仪中扩增。
表5 qRT-PCR反应体系
反应程序为：
如图1所示：将采后香蕉果实进行自然成熟、乙烯和1-MCP处理，发现外源乙烯处理显著地促进了果实采后成熟。采后第2天（II）时，乙烯处理的果实已达到乙烯生物合成启动期，果皮开始由绿变黄（图1A-b），果实硬度由采收时的9.2下降到4.2，下降了54.3%（图1C），此时的乙烯释放量已达3.5（图1B），为刚采收时的16.5倍，到采后第6天（VI），果皮颜色金黄（图1A-c），已达到乙烯生物合成高峰期（图1B），乙烯释放量达到23.3，为采收时的116.3倍（图1B），果实完全软化（图1C）。自然成熟的果实颜色到采后第8天（II）才开始发生变化（图1A-e），乙烯释放量为1.8（图1B），为采收时的18倍，此时的果实硬度为4.3，比刚采收时的9.1下降了52.7%。到采后第14天（VI）果实颜色变黄，此时乙烯释放量为7.4，为刚采收时的74倍，果实软化。与之相对应的1-MCP处理的果实颜色仍为青绿色（图1A-h, i），果实硬度下降缓慢，分别比采收时的9.1下降了11.0%和34.1%（图1C），乙烯释放量仍为很低的水平，分别为采收时的1.3倍和2.5倍（图1B）。
MaEIL4在香蕉果实采后成熟过程中的表达明显受外源乙烯诱导，受1-MCP抑制（图1D）。在外源乙烯处理下，MaEIL4的表达量在采后0天（I）最高为44.2，然后迅速下降，分别为采后2天（II）时的2.9倍和采后6天（VI）时的44.2（图1D）。自然成熟的果实采后0天（I）最高为17.1，然后逐渐下降，分别为采后第8天（II）的3.1倍和采后第14天（VI）的10.8倍。而在1-MCP处理的果实中，在采后第8天和14天MaEIL4的表达量一直维持在比较低的水平。
实施例3MaEIL4基因的生物信息学分析
利用Protparam（http://expasy.org/）分析MaEIL4编码蛋白的氨基酸序列组成、分子量、等电点等理化性质；用GSDS 2.0对基因结构进行分析；利用NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi）对其保守结构域分析；MEME Suite（http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi）软件对MaEIL4编码的蛋白质结构进行分析；PSORT（http://www.psort.org）软件对MaEIL4进行亚细胞定位分析。
（1）MaEIL4蛋白理化性质分析
利用Protparam分析MaEIL4蛋白理化性质。得到MaEIL4编码635个氨基酸，带负电荷的氨基酸残基（Asp+Glu）数为81，带正电荷的氨基酸残基数（Arg+Lys）为70。蛋白分子式为C3104H4837N883O970S34，分子量为71.13 kD，等电点为5.70，且都属于亲水性氨基酸。
（2）MaEIL4的结构分析和亚细胞定位预测
MaEIL4（Ma06_t17470.1）基因和CDS全长别为4304bp和1908 bp，用GSDS2.0对基因结构进行分析，结果表明：1-2016bp为upstream，2017-3925bp为单一外显子，3925-4254bp为downstream，没有内含子（图2A）。在NCBI对其保守结构域分析图1B所示：该基因313-969bp为典型的Ethylene insensitive 3 （EIN3）结构域，307-1077为典型的ETHYLENE-INSENSITIVE3-like 3 protein。因此预测该基因为EIN基因家族成员之一（图2B）。采用PSORT软件对MaEIL4进行亚细胞定位分析，发现其有73.9%的可能性定位于细胞核中，具有转录因子的特性（图2C）。
实施例4 MaEIL4亚细胞定位实验
1 .植物表达载体pCAMBIA1300-MaEIL4-GFP的构建
根据MaEIL4基因cDNA序列全长1905 bp，设计包含酶切位点为Xbal和Sall引物，需要将反向引物去除终止密码子。设计扩增引物如下：
MaEIL4P3：5’-TCTAGAATGGGTGGGCTACTAAT-3’，
MaEIL4P4： 5’-GTCGACGTAGAACCAGTTCAATGA-3’；
PCR程序如下：
扩增结束后取3 μLPCR产物，琼脂糖凝胶电泳检测目的片段条带大小是否正确。正确后利用胶纯化回收试剂盒（Omega）回收PCR产物，把回收到的目的片段与pMDTM19-T（Takara）16℃过夜连接12 h，连接体系如表6。连接结束后转化大肠感受态DH5α。
表6 连接体系
挑取板上单克隆，用菌液PCR进行阳性鉴定，检测正确的送生工测序，测序正确摇菌活化扩大培养提取质粒，连同pCAMBIA1300-GFP质粒一起用双酶切进行验证，验证体系如表7：
表7 双酶切反应体系
连接结束后转化大肠杆菌，挑取单克隆进行菌液PCR检测，正确的提取质粒，此质粒为pCAMBIA1300-MaEIL4-GFP重组质粒，用于农杆菌EHA105转化。
2.转化农杆菌EHA105
（1）pCAMBIA1300-MaEIL4-GFP重组质粒转化农杆菌EHA105
①取-80℃保存的农杆菌感受态细胞EHA105于冰上融化约5 min。
②于超净工作台中向刚融化的感受态细胞悬液中分别加入0.2 μg的pCAMBIA1300-MaEIL4-GFP重组质粒，轻柔混匀后冰水浴中静置5 min。
③然后封口放置液氮中速冻5 min，37℃水浴静置5 min，再冰浴5 min。
④加入700 μL预冷的无抗生素的YEP液体培养基，28-30℃，200 rpm振荡培养2-3h。
⑤离心机5000 rpm，1 min收集菌体，弃掉多余上清，留取100 μL吸打混匀，将菌液均匀涂布在含25 μg/mL Rif和50 μg/mL Kan的YEP平板上，28℃摇床倒置培养48-96 h。
用枪头挑选6个单克隆分别放入700 μL YEP液体培养基（含25μg/mL Rif和50 μg/mL Kan）中培养，将菌液用MaEIL4基因引物进行PCR鉴定，正确的菌液活化培养保存。将空pCAMBIA1300-GFP质粒也转化农杆菌EHA105当作对照。
（2）烟草瞬时表达和亚细胞定位观察
①将农杆菌菌液EHA105-pCAMBIA1300-MaEIL4-GFP以及EHA105-pCAMBIA1300-GFP分别活化于YEP液体培养基（含25 μg/mL Rif和50 μg/mL Kan），30℃，220 rpm培养至OD600=0.6-0.8。
②上述菌液于离心机5000 rpm，10 min收集菌体。
③用侵染液混匀重悬菌体调OD600=1.0，室温静置2 h。
④挑选长势良好的本氏烟草，用无针头注射器从叶片背面注射，将每个菌样注射3-4片叶片。
⑤弱光培养注射后的本氏烟草，期间喷水保持湿润。
⑥48 h后在激光共聚焦显微镜下观察注射后的叶片并拍照。
将构好的pCAMBIA1300-MaEIL4-GFP重组质粒转化农杆菌EHA105，活化摇菌使菌液OD600达到0.8注射到烟草叶片中，25℃弱光下放置过夜，1-3 d后在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白的分布。通过观察绿色荧光蛋白GFP分布情况来确定MaEIL4在细胞中发挥功能的位置。激光共聚焦图像显示（图3），对照空载pCAMBIA1300-GFP质粒的烟草细胞中绿色荧光蛋白GFP分布在整个细胞中；而转化pCAMBIA1300-MaEIL4-GFP重组质粒在烟草细胞中绿色荧光蛋白GFP均在细胞核分布。这些实验结果表明MaEIL4蛋白定位在细胞核中，与转录因子特性一致。
实施例5MaEIL4转录激活实验
1.pGBKT7-MaEIL4重组质粒的构建
以测序正确的pMD19-T-MaEIL4/pMD19-T-MaEIL4重组质粒为模板进行扩增，根据基因的cDNA序列设计引物扩增保守结构域750 bp的MaEIL4和760 bp的MaEIL4序列，设计包含酶切位点EcoRI和SaII的引物如下：
pGBKT7-MaEIL4 P1：5’-CGGAATTCCCGTCGTATGTGGA-3’；
pGBKT7-MaEIL4 P2：5’-GCGTCGACGGTGCATCTTCATGTAGAA-3’；
PCR反应体系同表8。PCR反应结束后，取3 μLPCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测条带大小是否正确。正确后利用胶纯化回收试剂盒（Omega）回收上述PCR产物。回收产物与pMDTM19-T（Takara）连接，连接体系同上。金属浴16℃反应过夜16 h，连接产物转化大肠杆菌DH5α。
挑取单克隆后进行菌液PCR检测，检测为阳性的菌液活化后送去生工测序，测序正确的提取质粒，然后将载体pGBKT7与之一起进行双酶切检测。双酶切检测体系如表8：
表8 双酶切反应体系
金属浴37℃反应3 h后，将酶切产物进行纯化回收，用T4连接酶进行连接16℃过夜反应16 h，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α。挑取单克隆后进行菌液PCR检测，检测正确的提取质粒再次进行双酶切验证，验证正确，则说明此pGBKT7-MaEIL4重组质粒的构建完成。
2.转化
将转化至酵母感受态Y2HGold的pGBKT7-MaEIL4点涂在SD/-Trp培养基上和加了X-α-gal（20 mg/mL）的SD/-Trp平板上，30℃避光培养48 h左右，其中pGBKT7-p53+pGADT7-largeT（阳性对照）、pGBKT7（阴性对照）。若MaEIL4能使酵母分泌X-α-gal（α-半乳糖苷酶分解底物），长出蓝色菌斑则说明其具有转录激活活性，能激活下游报告基因的表达。
实验结果表明：pGBKT7-MaEIL4都长出蓝色菌斑，这与阳性对照pGBKT7-p53+pGADT7-largeT结果一致，而阴性对照pGBKT7的菌落不变蓝（图4）。证明MaEIL4具有转录激活活性，结合亚细胞定位实验结果，说明MaEIL4是转录因子。
实施例6MaEIL4在香蕉果实薄片中的功能验证
1. 病毒介导的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）载体构建及农杆菌转化
根据MaEIL4全长cDNA序列，设计特异引物，设计时，在引物两端各加入XbaI和KpnI，扩增产物连接到TRV2载体和植物过表达载体pCAMBIA1300中。所有病毒载体和植物过表达载体构建完成后检测载体的正确性，提取质粒，进行农杆菌感受态细胞转化，步骤同上。具体引物序列如下所示：
MaEIL4F：5’-TCTAGAAAGGATTTACAGACA-3’
MaEIL4R：5’-GGTACCAAACGCTTCCCAAAGT-3’。
2. 农杆菌侵染
将含有目标载体的pTRV2-MaEIL4、pCAMBIA1300-MaEIL4的农杆菌gV3101涂布在相应抗生素的YEP板（板中同时加入50 µg/ ml Kna，40 µg/ ml Rif）上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。挑取单克隆于YEP液体培养基于28℃恒温摇床上，200 r/ min摇晃培养，OD600约为0.6到0.8时停止培养；将45 ml菌液于超干净工作台中移至50 ml离心管中，于室温条件 5000 r/ min 离心 5 min，弃上清，再用pH5.6-5.7侵染缓冲液（10mmol/L mgCl2、10mmol/L MES、200 µmol/L 乙酰丁香酮）菌液重悬离心弃去上清，室温黑暗放置2 h。
将普通存放的巴西蕉果实取出，切片前将香蕉果实表面及刀具消毒，用锋利的水果刀切除果实顶部及果实底部大小不均匀部分，沿果实赤道面横切，切成大小一致，厚度为0.4 cm左右的果实薄片，放置于0.1%的亚硫酸氢钠中浸泡10 min。
将pTRV1与pTRV2混合以及pCAMBIA1300作为空载对照，采用真空渗透的方式侵染巴西蕉果实薄片，以重悬液没过果实为宜。病毒诱导的基因沉默是pTRV1与pTRV2与目标基因共同作用的结果，实验室前期探索出合适条件即将pTRV1与病毒载体农杆菌菌液以1:3的比例混合，重悬液OD600为0.8进行真空渗透，并将侵染后的果实薄片放在MS固体培养基上，23℃放置3天。
3. 沉默和过表达处理的香蕉果实切片I2-KI染色
避光环境下将4.4 g碘化钾溶于30 ml蒸馏水中研磨混匀，充分溶解后再加入1.1g 结晶碘，加蒸馏水定容至500 ml后移入棕色广口瓶中避光保存。将配置好的I-KI溶液稀释成0.5%浓度备用。把香蕉薄片放入玻璃培养皿中将上述浓度的I-KI溶液倒入，做好编号后染色2 min30 s，染色完成后确保同一时间取出，立即拍照，实验设置3次重复。
4. 总淀粉含量的测定
香蕉果实淀粉含量的测定由苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒完成。将侵染过的香蕉切片放入37℃烘箱完全烘干后研磨成粉，称取0.01g样本加入1mL试剂一，充分匀浆后转移至EP管中涡旋混匀，80℃水浴20min。4000rpm 离心5min，弃上清。向沉淀中加入500µL蒸馏水，95℃水浴糊化15min。糊化后冷却加入350试剂二µL，95℃水浴10min。完成后加入850µL蒸馏水混匀后4000rpm 离心10min，取上清200µL加入1mL试剂三混匀后95℃水浴10min。自然冷却至室温，将分光光度计波长调节至620nm处测定吸光值。
5.蔗糖含量的测定
香蕉果实果糖含量的测定由苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒完成。将侵染过的香蕉切片放入37℃烘箱完全烘干后研磨成粉，称取0.1g样本加入1mL提取液，置于80℃水浴锅水浴10min期间震荡3-5次，冷却后室温5000rpm 离心10min后取上清液加入少量活性炭80℃水浴30min 脱色，再加入1mL提取液室温5000rpm 离心10min取上清液加入700µL试剂二和200µL试剂三，95℃水浴30min。将分光光度计波长调节至480nm处测定吸光值。
6. 葡萄糖含量的测定
香蕉果实葡萄糖含量的测定由苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒完成。将侵染过的香蕉切片放入37℃烘箱完全烘干后研磨成粉，称取0.1g样本加入1mL蒸馏水混成匀浆，置于95℃水浴锅水浴10min期间震荡3-5次，冷却后室温12000rpm 离心10min，取上清液备用。将试剂二试剂三等体积混匀，加入100µL 上清液室温放置15min于分光光度计505nm波长下读取吸光值。
7. 果糖含量的测定
香蕉果实果糖含量的测定由苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒完成。将侵染过的香蕉切片放入37℃烘箱完全烘干后研磨成粉，称取0.1g样本加入1mL提取液，置于80℃水浴锅水浴10min期间震荡3-5次，冷却后室温5000rpm 离心10min后取上清液加入少量活性炭80℃水浴30min 脱色，再加入1mL提取液室温5000rpm 离心10min取上清液加入700µL试剂二和200µL试剂三，95℃水浴30min。将分光光度计波长调节至480nm处测定吸光值。
8. β-淀粉酶含量的测定
香蕉果实β-淀粉酶活性的测定由苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒完成。将侵染过的香蕉切片鲜样经液氮快速冷冻研磨成粉，称取0.1g样本加入1mL蒸馏水，研磨匀浆，将匀浆倒入离心管中室温放置15min，每5min震荡一次，使其充分提取。5000rpm室温离心10min，取上清液加蒸馏水定容至10mL获得淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液1mL加入4mL蒸馏水获得淀粉酶稀释液。α-淀粉酶测定管取250µL淀粉酶稀释液70℃水浴15min，总淀粉酶测定管加入250µL淀粉酶稀释液，α-淀粉酶测定管和总淀粉酶测定管均加入250µL试剂二40℃水浴5min后加入500µL试剂一混匀95℃水浴5min，冷却后在分光光度计波长540nm下测定吸光值后计算，分别获得α-淀粉酶和总淀粉酶的活性，将总淀粉酶的活性减去α-淀粉酶活性即可获得β-淀粉酶活性。
9. 定量表达分析
将沉默处理后的香蕉果实用液氮速冻后，放于-80℃超低温冰箱中用于总RNA的提取。提取方法参照RNA提取试剂盒进行。利用Primer Premier 5.exe软件设计基因特异表达引物，具体引物序列如下：
Q MaEIL4P1： 5’-GGGAGACCTGGTAGATCCTC-3’
Q MaEIL4P2： 5’- CTCAAACGCTTCAAACGCAT-3’
Q MaMADS36 P1： 5’-GGTCGCCCTAATCGTGTT-3’
Q MaMADS36 P2： 5’-TTGGCAGATTCTTGCTGATAG-3’
以香蕉ACTIN基因为参照，以所得cDNA为模板进行实时荧光定量分析。反应体系如下：
表9 荧光定量PCR反应体系
PCR扩增条件如下：步骤95℃预变性3 min，步骤：95℃变性45 s，步骤：56℃退火45s，步骤：72℃延伸30 s，步骤2-4扩增35个循环，并做溶解曲线。实验设3次重复。
10. 结论
构建含MaEIL4的病毒介导基因沉默载体和植物过表达载体，分别转化采后8天的香蕉果实薄片，观察果实薄片碘-碘化钾染色情况，并对果实薄片中总淀粉含量、β-淀粉酶活性、可溶性糖含量和内源MaEIL4的表达量进行检测，结果发现与对照相比，在香蕉果实薄片中瞬时沉默MaEIL4后碘-碘化钾染色显著加深，果实总淀粉含量926.2，比对照增加8.0%；β-淀粉酶活性为0.7，比对照低24.7%；蔗糖、葡萄糖、果糖含量分别为9.0，3.6和3.2，分别比对照降低41.9%，26.5%和25.6%；内源MaEIL4和MaMADS36的表达量显著降低，分别比对照降低了45.5%和32.3%。相反，在香蕉果实薄片中瞬时过表达MaEIL4后碘-碘化钾染色明显变淡，果实总淀粉含量626.3，比对照降低了26.8%；β-淀粉酶活性为1.2，比对照提高了30.2%；蔗糖、葡萄糖、果糖含量分别为21.2，7.1和5.5，分别比对照增加了37.7%，37.5%和35.2%；内源MaEIL4和MaMADS36的表达量显著增加，分别比对照增加了3.0和2.11倍（图5）。
实施例7MaMADS36启动子的序列扩增和分析
1.MaMADS36启动子的序列扩增
香蕉基因组DNA中分离出MaMADS36启动子序列；其核苷酸序列如核苷酸序列为SEQID NO：3所示。
2.MaMADS36启动子的生物信息学分析
利用在线网站PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行启动子元件的生物信息学分析。PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）启动子元件的生物信息学分析表明，预测MaMADS36启动子包含与EIN3结合的TGAA-motif核心启动子元件，还包括19个假定的CAAT框“CAAT”和9个负责启动、促进和增强转录的TATA-box“TATAT”等。用TBtools软件进行启动子可视化分析（如图6A）。
实施例7MaMADS36启动子的活性检测
用农杆菌介导法侵染香蕉果实切片，然后将pNC121的35S启动子替换为MaMADS36启动子，将香蕉果实切成形状和厚度大致相同的薄片，于1.5%亚硫酸氢钠溶液中浸泡10min备用，参照（赵东方，2020）。将农杆菌菌液重悬至OD600=0.6-0.8，用液体培养基MS，加入200 μmol/L乙酰丁香酮（AS），室温暗处静置孵育2-3 h，将适量的香蕉薄片放入孵育好的菌液中，进行真空辅助侵染，再将香蕉薄片均匀放置于1/2MS固体培养基上28℃暗培养3 d，每组重复三次，切去35S启动子的空载体为阴性对照组，正常pNC121载体为阳性对照。选取大小相近的薄片置于50 mL离心管中，采用GUS染色试剂盒进行染色处理，操作步骤按照试剂盒说明书。染完色进行75%乙醇脱色，直到脱色液透明，将果片在体视显微镜下观察拍照。
如图6所示：将MaMADS36启动子取代pNC121载体的35S启动子（图6B），利用农杆菌介导法转化侵染香蕉果实切片。pNC121作为阳性对照，去除35S启动子的pNC121作为阴性对照进行GUS染色。染色结果显示，使用MaMADS36启动子侵染的香蕉薄片颜色比阴性对照要蓝得多，但比阳性对照要浅（图6C）。GUS活性检测结果表明，MaMADS36启动子启动的GUS活性达2.8，为阴性对照的9.3倍，但比阳性对照低39.7%（图6D）。这表明MaMADS36启动子具有一定的启动活性。
实施例8MaEIL4对MaMADS36的转录调控作用分析
1.酵母单杂交
1. 1 pAbAi-MaMADS36载体的构建
（1）MaMADS36启动子的扩增
设计包含结合位点的MaMADS36启动子序列（2000 bp）引物，加上无缝克隆接头序列，设计引物如下：
MaMADS36P1：5’-AGTGGTCTCTGTCCAGTCCTGACATTTTGTCACTGAATTAA-3’；
MaMADS36P2：5’-GGTCTCAGCAGACCACAAGTCTTTGTTGATGTCCTTTG-3’：
以巴西蕉DNA为模板，扩增体系同表2，PCR程序同1.5。扩增反应结束，回收产物，进行Nimble cloning连接，连接体系同表9。连接反应结束后转化大肠杆菌感受态，挑菌进行PCR鉴定，检测阳性的菌株送去测序，将测序正确的菌株活化培养提取质粒。此质粒为pAbAi-MaMADS36重组质粒。
1.2 AbA的背景筛选
（1）转化Y1H Gold酵母感受态
将构建好的pAbAi-MaMADS36和pAbAi-p53i质粒用BstBI单酶切，酶切体系如表10：
表10 pAbAi-MaMADS36的单酶切体系
65℃酶切1 h。电泳泡胶检测正确后，纯化回收目的片段，转化Y1HGold酵母感受态细胞。转化步骤如下：
①取10 µL Carrier DNA 100℃沸水浴变性5 min，快速冰浴2 min，重复1次。将Y1Hgold酵母菌感受态（100 µL）从-80℃取出插在冰上，约5 min后待其融化至冰沙状时，于超净工作台中分别加入2 µg pAbAi-MaMADS36和pAbAi-p53i质粒，变性后的Carrier DNA和500 µL PEG/LiAc，轻柔吸打混匀。
②金属浴30℃30 min（每15 min混匀6-8次）。
③金属浴42℃15 min（每7.5 min混匀6-8次）。
④5000 rpm离心30 s，弃上清。
⑤用400 μL ddH2O重悬1遍，5000 rpm离心30 s，弃上清。
⑥向管中加入50 µL ddH2O重悬，涂布于SD/-Ura固体培养基上，于28℃倒置培养48-96 h。
挑选出阳性菌落，用PCR进行鉴定pBait-AbAi整合到Y1HGold基因组中的情况，PCR体系如下：
将检测正确的菌株保存（划线板上保存4℃一个月，-80℃用甘油保存）。此板为Y1HGold[Bait/AbAi]阳性菌株。
（2）AbA背景表达水平筛选
挑取Y1Hgold[Bait/AbAi]阳性菌株的培养基的单克隆，用100 µL 0.9% NaCl溶液吸打混匀，测定其吸光度，根据比例稀释菌液至OD600=0.002。吸取100 µL混合液均匀涂布于加了不同浓度AbA抗生素的SD/-Ura固体培养基上，设置AbA浓度每100 ng为一个梯度，设置范围为0-1000 ng/mL。30℃倒置培养48-72 h。观察不同AbA浓度下平板中单菌落的生长情况，若到某一个浓度酵母菌无法生长，则在这个浓度范围内进行细致筛选，最终筛选AbA表达水平为酵母无法生长的最低浓度或比最低浓度高50-100 ng/mL的浓度。
1.3 酵母转化
（1）Y1H Gold（pBait）酵母感受态制备
①挑取pAbAi-MaMADS36在SD/-Ura板上3-5个克隆于3 mL YPDA培养基中，在30℃摇床中200 rpm，活化培养8-12 h。
②选取活性强的菌液，吸取5 μL加入到50 mL的YPDA培养基中在250 mL的锥形瓶继续培养孵育，16-20 h至OD600=0.15-0.3。
③将菌液收集于50 mL离心管中，离心700 g 5 min，弃上清，加入50 mL的YPDA重悬，于250 mL的锥形瓶培养3-5 h使得OD600=0.4-0.5。
④收集菌体离心700 g 5 min，弃上清，加入30 mLddH2O，离心700 g 5 min，弃上清，将沉淀重悬于1.5 mL的1.1×TE/LiAC。
⑤细胞悬液转移至1.5 mL离心管中，12000 rpm，50 s，弃上清，向管中沉淀加入600 μL1.1×TE/LiAC。酵母Bait-MaMADS36感受态制备完成（保存于冰上，2 h内转化）。
（2） Y1HGold（pBait）酵母感受态与Prey表达载体互作验证
①取上述50 μL Bait-MaMADS36酵母感受态细胞依次加入预冷的100 ng Prey表达载体pGADT7-MaEIL4，与5 μL Carrier DNA（95-100℃水浴5 min 迅速冰浴2 min，重复一次），500 μL PEG/LiAC分1.5离心管中，注意轻柔混匀。
②将离心管放入金属水浴30℃，30 min，每10 min颠倒混匀一次。
③再向离心管中加入20 μL DMSO，吸打混匀。
④将离心管放入42℃中的金属水浴锅热激15 min，每5 min颠倒混匀一次。
⑤取出离心管，12000 rpm，30 s，弃上清。
⑥分别加入1 mL YPD plus Medium振荡混匀，30℃摇床培养10-30 min。
⑦高速离心12000 rpm，15 s，弃上清。
⑧分别加入1 mL 0.9% NaCl重悬混匀，吸取100 μL 涂布于SD/-Leu板上。
⑨待菌落长出后，挑取单菌落溶于1 mL 0.9% NaCl，将OD600调至0.2，点涂于SD/-Leu和SD/-Leu with AbA固体培养基上，观察每组酵母菌的生长情况，从而确定互作情况。
2. 凝胶阻滞实验（Electrophoretic mobility shift assay, EMSA）
将MaEIL4基因的编码序列克隆到pGEX-4T-1载体（Amersham Biosciences, USA）上， 获得带GST（glutathione S-transferases）标签的重组蛋白，将重组蛋白转化Escherichia coli菌株 BM Rosetta （DE3），得到的蛋白用Glutathione-Superflow Resin（Clontech）进行纯化。来自MaMADS36启动子包含与MaEIL4结合顺式作用元件的15个bp探针序列由上海生工合成，其5'端用生物素标记。EMSA具体操作步骤参照Xiaoet al. （2018）的方法进行。
3. 双荧光素酶报告实验
3.1 载体构建及农杆菌转化
（1） 构建载体
根据MaMADS36基因启动子序列设计引物扩增全长，以pAbAi-MaMADS36质粒为模板，两端添加KpnI和BamHI酶切位点，扩增的目的片段插入到含有报告基因的pGreenⅡ0800-LUC表达载体中。扩增MaEIL4基因全长，以pMD19-T-MaEIL4质粒为模板，分别添加EcoRI和Xhol酶切位点连接到pGreenⅡ62-SK载体中。设计引物如下：
pGreenⅡ0800-LUC-MaMADS36 P1：5’-GGTACCGACATTTTGTCACTGAATTAA-3’，
pGreenⅡ0800-LUC-MaMADS36 P2： 5’-GGATCCCTTTGTTGATGTCCTTTG-3’；
pGreenⅡ62-SK –MaEIL4 P1：5’-GAATTCCGTCGTATGTGGAGAGATA-3’，pGreenⅡ62-SK–MaEIL4 P2：5’-CTCGAGG GTGCATCTTCATGTAGAA-3’。
扩增、回收、连接、转化鉴定并送测。扩大培养测序正确的菌液，抽提重组质粒。
（2） 转化农杆菌GV3101
pGreenⅡ0800-LUC-MaMADS36和pGreenⅡ-62-SK-MaEIL4质粒分别转化农杆菌感受态GV3101（含有pSoup质粒，四环素抗性）。pGreenⅡ0800-LUC和pGreenⅡ62-SK空载体也转化作为对照。参照上述转化农杆菌EHA105的转化方法。
3.2烟草转化和瞬时表达
（1）GV3101/pGreenⅡ-LUC-MaMADS36、GV3101/pGreenⅡ-62-SK-MaEIL4、对照组：GV3101/pGreenⅡ0800-LUC-MaMADS36和GV3101/pGreenⅡ-62-SK于YEP液体培养基（25 μg/mL Rif、50 μg/mL Kan和20 μg/mL Tet）中，30℃，220 rpm活化扩大培养至OD600=0.8左右。
（2） 收集菌体5000 rpm，离心10 min。
（3） 将菌体用侵染液重悬至OD600=1.0，室温静置2 h。
（4） 将GV3101/pGreenⅡ-LUC-MaMADS36分别与GV3101/pGreenⅡ-62-SK和GV3101/pGreenⅡ-62-SK-MaEIL4以1:3的体积比混匀。
（5） 用去掉针头的1 mL注射器将混合好的菌液从烟草叶背面进行注射。为保证实验背景的一致性，需要将对照载体和实验目标载体的菌液注射在同一叶片的不同部位上。
（6）室温条件下培养1-3 d，每天向叶片喷水1-2次，维持湿润。
3.3双荧光素酶报告基因活性检测
（1）取3-4片直径为6-8 mm的叶盘，放入研钵中研磨取80 mg粉末于管中加入100 μL裂解液。
（2）冰上孵育5 min左右，充分裂解叶片。
（3）12000 rpm离心1 min，取20 μL上清液，加至、不透光白色酶标板。设置3孔-5孔重复。
（4）配制萤火虫萤光素酶反应工作液和海肾萤光素酶反应液，即分别用对应的缓冲液稀释萤火虫萤光素酶底物（50×）和海肾萤光素酶底物（50×）至（1×）工作液。并孵育至室温（注意现配现用）。
（5）加入100 μL萤火虫萤光素酶反应液，震板混匀，检测时间设为2-10 s检测萤火虫萤光素酶的活力，检测尽量在30 min内完成。
（6）加入100 μL海肾萤光素酶反应液，震板混匀，检测海肾萤光素酶的活力，检测尽量在30 min内完成。
（7）计算萤火虫荧光素酶/海肾荧光酶活性值。
3.4 活体植物发光成像观察
将3.2中的菌液1:3混匀之后，在同一片叶片注射四种组合的菌液分为对照组和实验组。48 h后用活体植物发光成像系统进行拍照观察，观察前需要于暗处在烟草叶片上再注射反应底物D-虫荧光素钾盐，注射方法为用1 mL无针头注射器从烟草叶背面进行注射。
4.结论
4.1 MaEIL4与MaMADS36启动子的互作机制
采用酵母单杂交技术研究乙烯信号转导关键基因MaEIL4与MaMADS36启动子互作机制，并用EMSA， 双荧光素报告系统和活体成像系统进行验证。
（1）酵母单杂交
以香蕉果实DNA为模板，根据启动子序列设计包含结合位点的引物，扩增启动子全长，在设计引物时两端添加无缝克隆接头序列，用Nimble cloning进行克隆，测序结果证明MaMADS36基因启动子片段已成功插入到诱饵载体pAbAi中（图7A）。
将构建好的Bait载体pAbAi-MaMADS36和pAbAi-p53i质粒用BstBⅠ单酶切反应后回收。将酶切产物转化到酵母Y1HGold感受态中，取50 μL转化产物涂布于SD/-Ura培养基上，30℃倒置培养48-96 h挑取单菌落进行PCR检测鉴定pBait-AbAi是否整合到酵母菌株中，以pAbAi-p53i为阳性对照。PCR鉴定并测序表明pAbAi-MaMADS36载体成功整合到酵母基因组中，证明诱饵载体转化成功。
（2）AbA背景筛选
金担子素A（Aureobasidin A, AbA）是环酯肽类抗生素中的一种，其浓度0.1-0.5μg/ml范围时能抑制酵母菌株生长。把pAbAi-p53i作为对照检验金担子素的背景表达，其酵母菌株的生长浓度范围是0-100 ng/mL。结果表明，抑制pAbAi-MaMADS36酵母菌株生长的最低AbA浓度为400 ng/mL。
（3）酵母单杂交
为了验证MaEIL4是否与MaMADS36启动子存在互作关系，将pAbAi-MaMADS36诱饵载体制作成Y1HGold （pBait）酵母感受态后与MaEIL4构建的Prey表达载体共转化后观察酵母细胞的生长情况。如图5C所示，酵母细胞在不含有抗生素AbA的SD/-Leu培养基上生长良好。培养基内加入抗生素400 ng/mL的AbA后，阳性对照组（pGADT7-p53+p53promoter）、实验组MaEIL4与MaMADS36启动子共转化的酵母细胞可以正常生长；而阴性对照组（pGADT7-Empty+pAbAi-MaMADS36-promoter）共转化的酵母细胞则不能生长，说明MaEIL4可以结合MaMADS36的启动子，MaEIL4与MaMADS36启动子具有相互作用。
（4）凝胶阻滞实验（EMSA）
既然MaMADS36的启动子有MaEIL4的结合元件TGAA-box （图7A），因此采用EMSA技术来验证MaEIL4是否能与MaMADS36的启动子直接结合。
如图7D所示，重组的MaEIL4转录因子能与MaMADS36的启动子上的TGAA-box直接结合，而且随着竞争性的冷探针的加入显著降低了MaEIL4与MaMADS36的启动子的结合能力，非标记的突变探针则不能与MaEIL4结合（图7D）。以上结果表明MaEIL4转录因子能特异性地与MaMADS36的启动子上的TGAA-box直接结合。
4.2MaEIL4对MaMADS36启动子转录调控作用
（1）载体构建
根据MaMADS36基因启动子序列设计引物扩增全长，以pAbAi-MaMADS36质粒为模板，两端添加KpnI和BamHI酶切位点，扩增的目的片段插入到含有报告基因的表达载体pGreenⅡ 0800-LUC中（图7B）。以pMD19-T-MaEIL4质粒为模板，分别添加EcoRI和Xhol酶切位点将转录因子MaEIL4连接到pGreenⅡ 62-SK载体，并用双酶切检测其是否正确。双酶切鉴定结果表明双荧光酶表达载体构建完成。
（2）双荧光素酶报告系统及活体成像检测
用双荧光素酶报告基因检测试剂盒对荧光素酶活性进行检测，以此来验证MaEIL4与MaMADS36的启动子的互作能力。将报告载体与效应载体共侵染烟草叶片，将MaMADS36启动子加空效应载体作为对照组，其LUC/REN比值做为1。MaEIL4与MaMADS36启动子共同侵染叶片时，LUC活性均高于对照组。MaEIL4和MaMADS36启动子共侵染烟草叶片LUC活性是对照组的3.0倍多（图7E）。同样地，在活体植物发光成像系统下荧光强弱也直观显示出两个转录因子与启动子荧光素酶活性明显高于对照组（图7F），这充分说明MaEIL4对MaMADS36启动子具有转录激活作用。
实施例9MaEIL4与MaMADS36的相互作用分析
1.酵母双杂交（Yeast two hybrid, Y2H）检测
使用MATCHMAKER进行GAL4 Y2H 根据说明（Clontech, http://www.clontech.com/）。将MaMADS36克隆到pGADT7，将MaEIL4克隆到pGBKT7。在选择性缺陷培养基（SD/-Trp, SD/-Trp/-His, SD/-Trp/-His+X-α-gal）上检测自激活。然后，将重组质粒同时转化到酵母菌株AH109中。含有质粒pGADT7和pGBKT7的转化子作为阴性对照。通过在选择性缺陷培养基（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp+x-α-gal）上生长，根据其显色情况鉴定相互作用。
2. Pull Down实验
将MaMADS36的全长cDNA克隆到pET-28a载体上，将MaEIL4的全长cDNA克隆到pSumo-mut载体载体上，将Input 组各样品与GST Magarose Beads反应后，用洗脱液洗脱后，进行WB鉴定，从而判断验证蛋白MaMADS36和蛋白MaEIL4-his-sumo是否存在互作。具体步骤如下：
（1）平衡磁珠（GST Magarose Beads）
首先混匀GST Magarose Beads，彻底重悬磁珠，然后各取 100 µL 50% 磁珠悬浮液到5 个离心管中，2000 r/min 离心 2 min 弃上清，最后用500 µL PBS重悬磁珠，2000r/min离心2 min移除上清，重复3次。
（2）蛋白互作
按照方案设计表格加入相应的样品，并进行编号，混合后将平衡后的GSTMagarose Beads分别加入到Input混合的样品中，在4℃旋转混匀孵育4 h，2000r/min 离心5 min，吸取上清； 用500 µL PBS洗涤磁珠，2000 r/min 离心 2 min，弃上清，重复3次。
（3）GST Magarose Beads 洗脱
每管加入100 µL洗脱液，4℃旋转混匀孵育30 min，2000 r/min 离心 2 min 取上清，置于冰上；取 20 µL样品进行WB检测。
（4）Western Blot步骤
1）取自备好的样品 15% SDS-PAGE胶上样。
2）上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先100 V跑完积层胶，再将电压升至130 V直到电泳结束。
3）电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒流300 mA转膜，约为1h。
4）电转结束后，取下膜后先用PBST 洗涤4次，每次5 min。
5）将膜置于5%脱脂奶粉封闭液中封闭37℃ 1 h。
6）用PBST稀释一抗，膜在一抗稀释液中4℃过夜。
7）次日将膜取出后用PBST洗膜4次，每次5 min。
8）用含5%脱脂奶粉的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1 h。
9）反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4 次，每次5 min，ECL显影，曝光。
3. 结论
为了研究MaEIL4与MaMADS36的相互作用机制，进行了酵母双杂交实验。将MaMADS36克隆到pGADT7，将MaEIL4克隆到pGBKT7。结果MaMADS36与MaEIL4在四缺显色板菌落正常生长且显蓝色，这表明MaMADS36与MaEIL4相互作用（图8A）。
为了进一步确定MaEIL4是否真的与MaMADS36蛋白相互作用，将从大肠杆菌BL21中表达和纯化的MaMADS36-GST和MaEIL4- His-sumo蛋白进行了体外GST下拉实验。结果表明，GST标记的MaMADS36与his-sumo标记的MaEIL4蛋白相互作用（图8B）。这一结果再次证明了MaEIL4与MaMADS36相互作用。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (2)
1.一种MaEIL4基因调控MaMADS36启动子的转录活性中的应用，其特征在于：所述MaEIL6基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示；所述MaMADS36启动子的核苷酸序列为SEQID NO：3所示。
2.一种MaEIL4与MaMADS36启动子在共侵染烟草叶片提高荧光素酶活性中的应用，其特征在于：所述MaEIL4基因的核苷酸序列为SEQ IDNO：1所示；所述MaMADS36启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。
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