JP2002539779A - 植物における導入遺伝子の発現のためのバナナプロモーターおよびメロンプロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、異種遺伝子の発現を提供し得るバナナ果実関連プロモーター、メロンアクチンプロモーター、およびバナナ融合プロモーターに関する。さらに本発明は、異種核酸構築物、ベクター、形質転換方法、トランスジェニック植物細胞、およびこのようなプロモーターを含むトランスジェニック植物に関する。本発明はまた、一過性発現アッセイを使用して、種々の型の植物組織において植物プロモーターをスクリーニングするための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、新規のバナナ果実関連プロモーター、メロンアクチンプロモーター
、およびバナナ果実関連／メロンアクチン融合プロモーターに関する。本発明は
また、異種核酸構築物、ベクター、キット、およびこのようなプロモーターを使
用する形質転換方法に関する。本発明はさらに、このプロモーターを含む異種核
酸構築物で形質転換されたトランスジェニック植物細胞および植物、ならびに一
過性発現アッセイを使用して種々の型の植物組織において植物プロモーターをス
クリーニングするための方法に関する。

【０００２】 （参考文献）

【０００３】

【化１】 （発明の背景） 植物において遺伝子発現を調節する転写調節配列またはプロモーターは、植物
遺伝子操作の必須の要素である。植物における異種遺伝子の発現に有用なプロモ
ーターのいくつかの例が、現在利用可能である（Ｚｈｕら、１９９５；Ｎｉら、
１９９５）。

【０００４】 大半のプロモーターが、約５００〜１５００塩基である。植物において異種遺
伝子配列を発現させるためのプロモーターは、植物ＤＮＡに由来し得る（例えば
、カリフラワー熱ショックタンパク質８０（ｈｓｐ８０、ＢｒｕｎｋｅおよびＷ
ｉｌｓｏｎ、１９９３；米国特許第５，６１２，４７２号）か、または他の供給
源（例えば、植物ウイルス（例えば、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロ
モーター）または植物に感染する細菌（例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由
来のノパリン合成酵素（ｎｏｓ）プロモーター（Ｒｏｇｅｒｓ、１９９１）、オ
クトピン合成酵素（ｏｃｓ）プロモーター（ＬｅｉｓｎｅｒおよびＧｅｌｖｉｎ
、１９８８）およびマンノピン合成酵素（ｍａｓ）プロモーター））由来であり
得る。

【０００５】 トランスジェニック植物における異種遺伝子または遺伝子中の選択された配列
の発現は、代表的に、構成的プロモーター（これは、すべての時期の植物を通し
て、そして大半の組織において、産物の発現を駆動する（例えば、ｈｓｐ８０、
トマトユビキチンプロモーター（Ｐｉｃｔｏｎら、１９９３）、およびキイチゴ
Ｅ４プロモーター（米国特許第５，７８３，３９３号；および同第５，７８３，
３９４号）））の使用を含む。

【０００６】 限られた数の誘導性プロモーターおよび／または組織特異的プロモーターが公
知である。果実特異的発現を提供するプロモーターとしては、トマト由来のＥ４
プロモーターおよびＥ８プロモーターが挙げられる（Ｃｏｒｄｅｓら、１９８９
；Ｂｅｓｔｗｉｃｋら、１９９５；米国特許第５，８５９，３３０号）。別の果
実特異的プロモーターは、トマト２Ａ１１遺伝子プロモーターである。トマト２
Ａ１１遺伝子の５’非コード領域の調節制御の下に配置された核酸配列が、発生
中の果実組織において優先的に転写されることが実証されている（Ｖａｎ Ｈａ
ａｒｅｎ、１９９３）。キーウィアクチニジンプロモーターの果実特異的調節が
、トランスジェニックペチュニア植物において保存されていることが報告されて
いる（Ｌｉｎら、１９９３）。

【０００７】 ペクチン酸リアーゼ（ＰＥＬ）が、バナナにおける果実関連および成熟関連と
して、以前に同定されており（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ−Ｐｕｉｇｊａｎｅｒら、１
９９７；Ｍｅｄｉｎａ−Ｓｕａｒｅｚら、１９９７）、そして近年、イチゴ果実
の成熟の間の細胞壁成分の崩壊および引き続く果実軟化と関連付けられた（Ｍｅ
ｄｉｎａ−Ｅｓｃｏｂａｒら、１９９７）。

【０００８】 エチレンは、植物の生育および発生の多くの局面に影響する植物ホルモンであ
り、そして果実および野菜における成熟プロセスにおいて主要な役割を果たすこ
とが公知である。多量のエチレンはまた、化学薬品、極度な温度、水ストレス、
紫外光、昆虫損傷、病害、または機械的創傷によって引き起こされる外傷後に生
成される。いくつかの組織では、わずか少量のエチレンへの曝露が、生鮮食品の
ような、隣接した植物または植物組織においてエチレン生成のなだれ（ａｖａｌ
ａｎｃｈｅ）を引き起こし得る。この自触反応効果は非常に明確であり得、そし
て輸送および貯蔵の間の果実の品質の損失へと導き得る。

【０００９】 植物では、メチオニンはＡｄｏＭｅｔに変換され、ＡｄｏＭｅｔはＡＣＣに変
換され、ＡＣＣはエチレンに変換される。ＡｄｏＭｅｔは、メチオニンとアデノ
シン三リン酸（ＡＴＰ）との間の縮合反応を通して合成される。細菌酵素である
ＡｄｏＭｅｔヒドロラーゼ（ＡｄｏＭｅｔａｓｅ）（これは通常、植物組織中に
存在しない）は、ＡｄｏＭｅｔをホモセリンおよびＭＴＡに加水分解し、このホ
モセリンおよびＭＴＡの両方はメチオニンに再循環される。植物形質転換ベクタ
ー、トマト果実特異的プロモーター、および植物細胞においてＡｄｏＭｅｔａｓ
ｅ（「ＳＡＭａｓｅ」とも呼ばれる）を発現し、それによってエチレン発現を調
節するために有効な異種核酸構築物で植物を形質転換する方法が、記載されてい
る。例えば、同時係属中の米国特許第５，４１６，２５０号；同第５，５８９，
６２３号；同第５，７２３，７４６号；同第５，７５０，８６４号；および同第
５，８５９，３３０号（特に、本明細書中で参考として援用される）を参照のこ
と。

【００１０】 植物起源の構成的プロモーターおよび果実において機能的である植物プロモー
ターについての必要性が存在し、そしてこれらは、果実の細胞において異種遺伝
子の高レベルの発現を提供し得る。

【００１１】 （発明の要旨） 本出願人は、本願において「ＴＲＸ」および「ＰＥＬ」と称される新規のバナ
ナ果実関連プロモーター、「ｍＡＣＴＩＮ」と称されるメロンアクチンプロモー
ター、および「ＴＲＸ−イントロン」および「ＴＲＸ−アクチン」と称されるメ
ロンアクチン：ＴＲＸ融合プロモーターを同定した。

【００１２】 １つの実施形態では、本発明は、バナナ果実関連ＴＲＸまたは「Ｇ１Ａ」プロ
モーターを含む単離された核酸分子を提供する。この実施形態の１つの局面では
、単離された核酸は、配列番号１のヌクレオチド１３〜９９０（配列番号２とし
て示される）もしくはその機能的部分を含むか、またはその核酸配列に対して相
補的であり、そして少なくとも中程度のストリンジェンシー条件および必要に応
じて高いストリンジェンシー条件下で、その核酸配列に対して安定的に結合を維
持される。

【００１３】 別の実施形態では、本発明は、バナナ果実関連ＰＥＬプロモーターを含む単離
された核酸分子を提供する。この実施形態の１つの局面では、単離された核酸は
、配列番号３（図３ＡおよびＢ）として示される配列、もしくはその機能的部分
（例えば、配列番号３のヌクレオチド５６４〜２０１０または１０９９〜２０１
０）を含むか、またはその核酸配列に対して相補的であり、そして少なくとも中
程度のストリンジェンシー条件および必要に応じて高いストリンジェンシー条件
下で、その核酸配列に対して安定的に結合を維持される。

【００１４】 別の実施形態では、本発明は、「ｍＡＣＴＩＮ」と称されるメロンアクチンプ
ロモーターを含む単離された核酸分子を提供する。この実施形態の１つの局面で
は、単離された核酸は、配列番号４（図４）として示されるｃＤＮＡ配列を含む
か、またはその核酸配列に対して相補的であり、そして少なくとも中程度のスト
リンジェンシー条件および必要に応じて高いストリンジェンシー条件下で、その
核酸配列に対して安定的に結合を維持される。

【００１５】 関連の実施形態では、本発明は、それぞれ「ＴＲＸ−イントロン」および「Ｔ
ＲＸ−アクチン」と称される、ＴＲＸ−単子葉植物イントロンおよびＴＲＸ−ア
クチンの融合プロモーターを提供する。１つの局面では、単離された核酸は、配
列番号５（図５Ａ〜Ｂ）として示されるＴＲＸ−イントロン融合プロモーター配
列を含むか、またはその核酸配列に対して相補的であり、そして少なくとも中程
度のストリンジェンシー条件および必要に応じて高いストリンジェンシー条件下
で、その核酸配列に対して安定的に結合を維持される。別の局面では、単離され
た核酸は、配列番号６（図６）として示されるＴＲＸ−アクチン融合プロモータ
ー配列またはその核酸配列に対して相補的であり、そして少なくとも中程度のス
トリンジェンシー条件および必要に応じて高いストリンジェンシー条件下で、そ
の核酸配列に対して安定的に結合を維持される。

【００１６】 本発明はまた、バナナ果実関連プロモーター、メロンアクチンプロモーター、
ＴＲＸイントロン融合プロモーターまたはバナナＴＲＸメロンアクチン融合プロ
モーターの転写制御下でＤＮＡコード配列を有する核酸構築物を提供する。ＤＮ
Ａコード配列は代表的に、プロモーターに対して異種であり、そして植物細胞に
おいてコードされた産物の発現を可能にするプロモーターに作動可能に連結され
る。

【００１７】 １つの局面では、本発明のバナナ果実関連プロモーター、ＴＲＸ−イントロン
プロモーター、およびＴＲＸ−アクチンプロモーターは、果実特異的様式で異種
遺伝子を発現させるために使用され得る。本発明の関連の局面では、このような
プロモーターは、形質転換された果実細胞におけるエチレン生成を調節するため
、およびそれによって、このような果実細胞を含むトランスジェニック果実の成
熟表現型を変更するために使用され得る。

【００１８】 別の局面では、本発明のメロンアクチンプロモーターは、双子葉植物起源また
は単子葉植物起源のいずれかの形質転換植物細胞において、異種遺伝子を発現さ
せるために使用され得る。

【００１９】 関連の局面では、メロンアクチンプロモーターは、双子葉植物または単子葉植
物の組織において、異種遺伝子を構成的に発現させるために使用され得る。

【００２０】 本発明はさらに、結果植物（ｆｒｕｉｔ−ｂｅａｒｉｎｇ ｐｌａｎｔ）のよ
うなトランスジェニック植物を作製するための方法を含む。この方法では、代表
的に、植物細胞において選択を可能にする発現ベクター中に保有される本発明の
キメラ遺伝子を、選択された植物の前駆細胞に導入する。次いで、このような前
駆細胞を生育させて、果実をつけるトランスジェニック植物を作製する。

【００２１】 さらなる関連の実施形態では、本発明は、上記のプロモーターのいずれかを含
む、植物細胞、植物組織、トランスジェニック植物、果実細胞、果実全体、種子
またはカルス、ならびにこのプロモーターの制御下で発現されるプロモーターお
よび／または遺伝子産物を含む植物細胞を含む。

【００２２】 別の実施形態では、本発明は、植物組織においてプロモーター発現を評価する
ための一過性発現方法（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｔｈ
ｏｄ）を提供する。この実施形態の１つの好ましい局面では、ＧＵＳレポーター
遺伝子に作動可能に連結された候補プロモーター配列を含む核酸構築物をアセン
ブルし、形質転換のための植物組織を調製し、そして核酸構築物をこの調製され
た植物組織に導入し、そして導入遺伝子の発現を検出するために有効な条件下お
よび十分な時間にわたってこの植物組織を培養する。

【００２３】 本発明のこれらのおよび他の目的および特徴は、添付の図面および実施例と合
わせて、以下の詳細な説明を読まれた場合に、より完全に明らかとなる。

【００２４】 （発明の詳細な説明） （Ｉ．定義） 本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、代表的にポリヌ
クレオチドに水素結合し得る塩基を支持するバックボーンを有する重合体分子を
いい、ここで重合体バックボーンは、重合体分子と代表的にはポリヌクレオチド
（例えば、一本鎖ＤＮＡ）との間で配列特異的な様式でこのような水素結合を可
能にする様式の塩基を示す。このような塩基は、代表的に、イノシン、アデノシ
ン、グアノシン、シトシン、ウラシル、およびチミジンである。重合体分子とし
ては、二本鎖および一本鎖のリボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）が挙げられ、そしてメチルホスホネート結合のようなバックボーンの改変を
有する重合体を含み得る。

【００２５】 核酸は、二本鎖、一本鎖であり得るか、または二本鎖配列および一本鎖配列の
両方の部分を含み得る。一本鎖の描画はまた、他の鎖の配列を規定し、従って、
記載された配列の相補体をも含む。

【００２６】 本明細書中で使用される場合、用語「組換え核酸」は、エンドヌクレアーゼに
よる核酸の操作によって、天然には通常見出されない形態で、一般的にはインビ
トロで本来形成される核酸をいう。

【００２７】 本明細書中で使用される場合、用語「キメラ遺伝子構築物」および「キメラ核
酸構築物」は、交換可能に用いられ、そして核酸コード配列および、植物細胞に
おけるコード配列の発現に必要とされるコントロール配列を含む組換え核酸配列
をいう。

【００２８】 本明細書中で使用される場合、用語「調節可能プロモーター」は、特定の環境
条件または生育条件によって活性が影響を受ける任意のプロモーターをいう（例
えば、トマトＥ４またはＥ８プロモーター）。

【００２９】 本明細書中で使用される場合、用語「構成的プロモーター」は、大半の時期で
、植物形質転換体の多くまたはすべての組織において、ＲＮＡ産生を指向させる
任意のプロモーターをいう。

【００３０】 本明細書中で使用される場合、用語「組織関連プロモーター」は、特定の型の
細胞および組織において、より高いレベルでＲＮＡ合成を指向する任意のプロモ
ーターをいう（例えば、果実関連プロモーター）。

【００３１】 本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」または「プロモーターセ
グメント」は、下流遺伝子の転写を指向させるように、本明細書中で開示される
プロモーターにおいて機能するＤＮＡの配列をいう。プロモーターは、一般的に
は、標的遺伝子が発現される宿主細胞に対して適切である。他の転写調節核酸配
列および翻訳調節核酸配列を伴うプロモーター（「コントロール配列」とも呼ば
れる）は、所定の遺伝子を発現させるために必要とされる。一般的に、転写調節
配列および翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転
写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびにエ
ンハンサー配列およびアクチベーター配列が挙げられるが、これらに限定されな
い。

【００３２】 「植物プロモーター」とは、そのネイティブな形態では、植物ゲノムＤＮＡに
由来する、プロモーターまたはプロモーター領域（上記で規定）を意味する。本
のバナナ果実関連プロモーターは、植物プロモーターである。

【００３３】 あるいは、果実関連ＴＲＸプロモーターは、バナナＴＲＸタンパク質をコード
する遺伝子から得られる。ここで、果実関連ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝
子は、配列番号１のバナナＴＲＸ遺伝子配列に対応する核酸配列の長さにわたっ
て、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは約８０％、そしてさらによ
り好ましくは約８５〜９０％の配列同一性を有する。当業者によって慣用的に用
いられる技術を使用して、一旦、果実関連ＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子
が配列同一性に基づいて同定されると、関連の果実関連ＴＲＸプロモーターは、
従来のゲノムウォーキング技術（すなわち、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｅｎｏｍ
ｅ Ｗａｌｋｅｒ Ｋｉｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉ
ｎｃ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して、容易に同定され得る。

【００３４】 本明細書中で使用される場合、「プロモーター強度」は、適切な標準と比較し
た、植物組織（１または複数）における異種遺伝子のプロモーター調節発現のレ
ベルをいう（例えば、特定の植物（例えば、バナナ）由来の果実関連プロモータ
ー対コントロールまたは標準遺伝子プロモーター（例えば、３５Ｓ ＣａＭＶプ
ロモーターまたはＣｓＶＭＶプロモーター（キャッサバ葉脈モザイクウイルスプ
ロモーター、Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら、１９９８）。発現レベルは、ＧＵＳ（β−
グルクロニダーゼ）のような適切なレポーター遺伝子にプロモーターを連結する
ことによって測定され得る。レポーター遺伝子の発現は、蛍光定量的、分光光度
的、または組織化学的アッセイによって、容易に測定され得る（Ｊｅｆｆｅｒｓ
ｏｎら、１９８７ａ；Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、１９８７ｂ；Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，
ＲＡ、１９８９）。

【００３５】 「異種」核酸構築物または配列は、発現される植物細胞内に導入された配列の
部分を有する。コントロール配列に関して異種は、天然では、同じ遺伝子（この
発現を、ここで調節する）を調節するために機能しないコントロール配列（すな
わち、プロモーターまたはエンハンサー）を言及し得る。一般的に、異種核酸は
、それらが存在する細胞またはゲノムの部分に導入され、そしてトランスフェク
ション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどによって細胞
に付加されている。この配列は、ネイティブな植物において見出されたコントロ
ール配列／コード配列の組合せと同じコントロール配列／コード配列の組合せか
、または異なるコントロール配列／コード配列の組合せを含み得る。

【００３６】 本明細書中で使用される場合、組換えＤＮＡ構築物またはベクターに関連して
用語「作動可能に連結された（した）」は、組換えＤＮＡ構築物またはベクター
のヌクレオチド成分が、別の核酸配列と機能的関係にあることを意味する。例え
ば、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合には
、コード配列に作動可能に連結されており；またはリボソーム結合部位は、それ
が翻訳を容易にするように位置付けられている場合には、コード配列に作動可能
に連結されている。一般的に、「作動可能に連結された」は、連結されたＤＮＡ
配列が近接していること、そして分泌リーダーの場合には、近接しかつ読み取り
相にあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接である必要はない。

【００３７】 本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関
与するＤＮＡのセグメントを意味し、これは、先行または追随するコード領域（
例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）または「リーダー」配列および３’ＵＴＲま
たは「トレーラー（ｔｒａｉｌｅｒ）」配列、ならびに個々のコードセグメント
（エキソン）間の介在配列（イントロン）の領域を、含んでいても含んでいなく
てもよい。

【００３８】 用語「遺伝子」は、本明細書中で、用語「異種核酸コード配列」と交換可能に
使用され得、そして用語「構造遺伝子」とは、ＤＮＡコード領域を意味する。

【００３９】 本明細書中で使用される場合、用語「配列同一性」とは、配列整列化プログラ
ムを使用して整列化された、２以上の整列化された配列における、核酸配列また
はアミノ酸配列の同一性を意味する。ＧｅｎＢａｎｋ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅｓおよび他の公的なデータベース中の核酸配列に対して所定の核酸配列を評価
する場合、配列検索は、好ましくは、ＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて実行され
る。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＧｅｎＢａｎｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅｓおよび他の公的なデータベース中のアミノ酸配列に対して、全てのリー
ディングフレームで翻訳された核酸配列を検索するのに好ましい。ＢＬＡＳＴＮ
およびＢＬＡＳＴＸの両方は、１１．０のオープンギャップペナルティー、およ
び１．０の伸長（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）ギャップペナルティーのデフォルトパラメ
ーターを用いて実行され、そしてＢＬＯＳＵＭ−６２マトリクスを利用する［Ａ
ｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７を参照のこと］。

【００４０】 用語「％相同性」は、本明細書中の用語「％同一性」と、本明細書中で交換可
能に使用され、そして２つの配列間の同一性のレベルをいう。すなわち、７０％
相同性とは、定義されたアルゴリズムによって決定される場合の７０％配列同一
性と同一のものを意味する。従って、所定の配列のホモログは、その所定の配列
の長さにわたって、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％、より好ましくは
約８５％、さらにより好ましくは約９０％の配列同一性を有する。

【００４１】 ２以上の配列間の「％同一性」を決定するための選択された配列の好ましい整
列化は、ＭａｃＶｅｃｔｏｒバージョン６．５においてＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプロ
グラムを用いて実行され、これは、１０．０のオープンギャップペナルティー、
０．１の伸長ギャップペナルティー、およびＢＬＯＳＵＭ３０類似性マトリクス
を含むデフォルトパラメーターを用いて操作される。

【００４２】 核酸配列は、参照核酸配列に、その２つの配列が中程度にストリンジェントな
ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で互いに特異的にハイブリダイズする
場合に、「選択的にハイブリダイズ可能」であるとみなされる。例示的な条件と
しては、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｓ ＺｅｔａＰｒｏｂｅマニュアル（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ Ｌａｂｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）（これは、本明細書中に参考とし
て明確に援用される）に記載されるように行われるハイブリダイゼーションが挙
げられる。例えば、ハイブリダイゼーションは、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、および７％ ＳＤＳ中、６０℃で行われ、その後、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＰＯ₄、５％ ＳＤＳ中、および１ｍＭ ＥＤＴＡ、４
０ｍＭ ＮａＰＯ₄、１％ ＳＤＳ中での洗浄が続く。ハイブリダイゼーション
条件は、さらに、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭら、１９９３（これは、本明細書中に参
考として明確に援用される）に列挙される。

【００４３】 本明細書中で使用される場合、用語「発現」とは、ポリペプチドが、遺伝子の
核酸配列に基づいて産生されるプロセスをいう。このプロセスは、転写および翻
訳の両方を含む。

【００４４】 本明細書中で使用される場合、用語「形質転換された」、「安定に形質転換さ
れた」または「トランスジェニック」とは、非ネイティブ（異種）核酸配列がそ
のゲノム中に組み込まれ、それが、２以上の世代を通して維持される、植物細胞
をいう。

【００４５】 本明細書中で使用される場合、用語「調節する」とは、生物学的活性における
変化をいう。調節は、分子の生物学的活性、結合特性、あるいは任意の他の生物
学的、機能的または免疫学的特性における、増加または減少に関連し得る。

【００４６】 本明細書中で使用される場合、用語「エチレン調節性」とは、植物中のエチレ
ン濃度における変化によって誘導される調節をいう。例えば、果実発生の後期お
よび／または果実成熟の初期の間に生じる（または、主に生じる）、プロモータ
ー活性は、エチレン調節性といわれる。

【００４７】 本明細書中で使用される場合、「植物細胞」とは、植物から誘導される任意の
細胞（未分化組織（例えば、カルス）、ならびに植物種子、花粉、プロガグル（
ｐｒｏｇａｇｕｌｅ）および胚をいう。

【００４８】 （ＩＩ．バナナ果実関連プロモーターの単離および特徴付け） いくつかのｃＤＮＡフラグメントは、ディファレンシャルディスプレイによっ
て、バナナにおいて果実関連性でありかつ豊富に発現されているものとして同定
された。公知の配列の保存領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用い
たゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅と共に、果実関連ディファレンシャルディスプレイ
フラグメントの分析は、本明細書中に記載されるプロモーター配列の最終的な同
定および特徴付けを導いた。

【００４９】 （Ａ．バナナ果実関連ＴＲＸプロモーターの単離および特徴付け） ディファレンシャルディスプレイを、温室生長植物の果肉、根、球茎および葉
、ならびにインビトロ小植物（ｐｌａｎｔｌｅｔ）（根および苗条）由来の全バ
ナナＲＮＡを用いて行い、実施例１に記載のように、バナナにおいて差次的かつ
豊富に発現されるＲＮＡフラグメントを同定した。３６の果実関連ディファレン
シャルディスプレイフラグメントの分析は、プロモーターの単離および特徴付け
について、ある配列（Ｇ１Ａ）の最終的な選択を導いた。

【００５０】 このフラグメントの１つであるＧ１Ａを、成熟の異なる段階でのバナナ果肉由
来のＲＮＡにハイブリダイズさせた。このＧ１Ａ転写物は、果実が成熟するに従
い増加することが見出された。バナナゲノムサザンブロットにハイブリダイズさ
せた場合に、Ｇ１Ａは、バナナにおける小さい遺伝子ファミリーによって表され
ることが見出された。

【００５１】 ディファレンシャルディスプレイを、増幅に使用したＧアンカープライマー（
Ｈ−Ｔ₁₁Ｇ、配列番号１５）、ならびに任意のプライマーＨ−ＡＰ１〜Ｈ−ＡＰ
８（配列番号７〜１４；ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ
，ＴＮ）を用いて、果肉由来の全バナナＲＮＡを使用して行った場合、実施例１
に記載のように、いくつかの増幅されたディファレンシャルディスプレイ産物は
、果肉に固有であり、そして根、球茎および葉、ならびにインビトロ小植物組織
において検出可能でないことが見出された。これらの中でも、とりわけ、Ｈ−Ａ
Ｐ１プライマー（配列番号７、ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｎａｓｈｖｉ
ｌｌｅ，ＴＮ）を用いた、約４００ｂｐの産物が特徴的であった。

【００５２】 回収したディファレンシャルディスプレイ産物を、ノーザンブロットのプロー
ブとして使用して、関連する転写物の組織分布を確認した。Ｇ１Ａをプローブと
して用いるノーザンブロット分析からの結果は、このネイティブ転写物が約６０
０ｎｔであり、高度に果実関連性である（根、球茎、葉またはインビトロ小植物
を含む、他のいずれの分析した組織において検出されない）ことを示す。このＧ
１Ａ転写物を、成熟の異なる段階でのバナナ果肉由来のＲＮＡにハイブリダイズ
させた場合、エチレン処理していない緑色バナナ中では、ほとんど検出可能でな
く、そしてこの転写物の量は、エチレン処置後および成熟中に劇的に増加された
。

【００５３】 クローニング後、このディファレンシャルディスプレイ産物を配列決定し、そ
してデフォルトパラメーターを使用する、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎ
ｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｌｍ）を介する非重複核酸
配列データベースのＢａｓｉｃ ＢＬＡＳＴＮ検索を使用して、ＧｅｎＢａｎｋ
中の入手可能な配列と比較した。Ｇ１Ａ（ＴＲＸ）は、他の植物のチオレドキシ
ン遺伝子に対する有意な配列類似性を示すことが見出された。

【００５４】 多くの植物チオレドキシン遺伝子の配列が、ＧｅｎＢａｎｋに見出された。バ
ナナＧ１Ａのコード配列（本明細書中でＴＲＸと称される）は、最も近隣のコム
ギチオレドキシン（ＴＲＸ）（登録番号ＡＪ００９７６２）に対して、ヌクレオ
チドレベルで５８．６％（４７８ヌクレオチド中２８０ヌクレオチド）同一であ
る。コード配列の外側（ＴＲＸプロモーターを含む）では、デフォルトパラメー
ターを用いるＢＬＡＳＴＮプログラムを使用して、このバナナ配列とＧｅｎＢａ
ｎｋ中の他のいずれの配列との間で有意な一致が検出されなかった。

【００５５】 チオレドキシンは、高等植物中でいくつかの形態で存在することが公知である
。ｍイソフォームおよびｆアイソフォームは、葉緑体性であるが、一方、ｈイソ
フォームは、サイトゾル性であり、シグナル配列および輸送配列の両方を欠失す
る。２つのコムギチオレドキシン遺伝子が、最近、特徴付けられ、そしてＮ末端
で膜貫通ドメインを含むようであり、これは、膜結合を示す。本明細書中に記載
されるバナナチオレドキシンと関連するコード配列は、このｈイソフォームに最
も類似し、そしていかなる明白なプレ配列をも欠失し、これは、このバナナチオ
レドキシンがサイトゾル性であることを示唆する。

【００５６】 チオレドキシンｈ遺伝子は、一般に、高等植物中で小さい遺伝子ファミリーと
して存在するが、少なくとも５つの推定配列が、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおい
て特徴付けられている。コムギおよびタバコの両方は、２つの密接に関連するチ
オレドキシンｈ遺伝子を有し、これらは、差次的に発現される。本発明の前には
、果実関連チオレドキシンは、報告されていない。

【００５７】 ＴＲＸバナナディファレンシャルディスプレイ産物に関連する上流配列を、実
施例１に詳述するように、一連の工程で単離した。この上流配列は、ゲノムウォ
ーキングによって単離し、連続配列にアセンブルした（図１Ａ〜Ｄ）。

【００５８】 ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｎ
ｄｅｘ．ｈｔｌｍ）を介する非重複核酸配列データベースのＢａｓｉｃ ＢＬＡ
ＳＴＮ検索（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬ
ＡＳＴ／）は、図２に示されるＴＲＸプロモーターに有意な一致を明らかにしな
かった。

【００５９】 ５’末端および３’末端に制限部位を操作した改変プロモーター配列を、以下
の実施例１に記載のように、ｐＡＧ１５９レポーター遺伝子構築物への組み込み
のために構築した。

【００６０】 （Ｂ．バナナ果実関連ＰＥＬプロモーターの単離および特徴付け） ペクチン酸リアーゼ（ＰＥＫ）は、以前に、バナナの果実および成熟（Ｄｏｍ
ｉｎｇｕｅｚ−Ｐｕｉｇｊａｎｅｒら、１９９７；Ｍｅｄｉｎａ−Ｓｕａｒｅｚ
ら、１９９７）、ならびにイチゴ果実成熟中の細胞壁成分の破壊および引き続く
果実の軟化（Ｍｅｄｉｎａ−Ｅｓｃｏｂａｒら、１９９７）に関連付けられた。
２つのバナナペクチン酸リアーゼｃＤＮＡ配列および１つのイチゴペクチン酸リ
アーゼｃＤＮＡ配列が、ＰＥＬ１、ＰＥＬ２およびイチゴＰＥＬについて、それ
ぞれ、登録番号Ｘ９２９４３、Ｚ９３１０６およびＵ６３５５０でＧｅｎＢａｎ
ｋ中に見出され得る。

【００６１】 バナナ果実におけるペクチン酸リアーゼの発現は、成熟と同調し、そして外因
性エチレンによって刺激され得る（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ−Ｐｕｉｇｊａｎｅｒら
、１９９７）。しかし、このＰＥＬ転写物の組織分布は、以前に報告されていな
い。

【００６２】 このＰＥＬコード配列の保存領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを
用いたバナナゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅は、２つの異なるサイズの産物（ＰＥＬ
１およびＰＥＬ２）を生じ、これらを、クローニングし、配列決定し、そして遺
伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために使用した。テンプレ
ートとして成熟バナナ果肉由来のｃＤＮＡを使用する、半定量性逆転写酵素ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の結果は、このＰＥＬ１転写物が、ＰＥＬ２
転写物よりも、成熟バナナ果肉においてより豊富であることを示した。

【００６３】 この２つのバナナＰＥＬ配列の、ＧｅｎＢａｎｋのＰＥＬ配列との整列化によ
って、ＰＥＬ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ９２９４３）がＤｏｍｉｎｇｕｅｚ
−Ｐｕｉｇｊａｎｅｒら、１９９７によって記載された配列と同じコード配列を
有すること、およびＰＥＬ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ９３１０６）が、Ｍｅ
ｄｉｎａ−Ｓｕａｒｅｚら、１９９７によって記載された配列と同じコード配列
を有することが示された。関連する配列についてのＧｅｎＢａｎｋの検索によっ
て、イチゴから単離された１つのさらなる果実関連ペクチン酸リアーゼ（Ｍｅｄ
ｉｎａ−Ｅｓｃｏｂａｒら、１９９７）が示された。

【００６４】 ＭａｃＶｅｃｔｏｒバージョン６．５を使用する、ＧｅｎＢａｎｋからの２つ
のバナナＰＥＬコード配列およびイチゴＰＥＬコード配列の整列化によって、こ
の３つの果実関連ペクチン酸リアーゼ間に保存される領域が明らかにされた。Ｐ
ＥＬプロモーター配列は、複数工程のプロセスで同定され、そして本発明の前に
は、このＰＥＬのプロモーター配列は、報告されなかった。

【００６５】 以下の実施例２に詳述するように、ｃＤＮＡの５’末端または３’末端高速増
幅（それぞれ、５’ＲＡＣＥまたは３’ＲＡＣＥ）のためのＰＣＲに利用可能な
ライブラリーを提供するために、ｃＤＮＡライブラリーを生成し、そして二本鎖
ｃＤＮＡにアダプターを連結させた。約２．５ｋｂの推定プロモーターフラグメ
ントを、ＳｃａＩ消化したゲノムバナナライブラリーから増幅し、クローニング
し、そして完全に配列決定した。

【００６６】 このＰＥＬ１の２．５ｋｂプロモーターフラグメントを、ＧＵＳとの翻訳融合
物としてレポーター遺伝子構築物にサブクローニングし、次いで、実施例２に記
載のように、その５’末端で切断して、プロモーターフラグメント２．０ｋｂ（
配列番号３）、ならびにその切断型１．４ｋｂおよび０．９ｋｂを生成した。図
３Ａおよび図３Ｂを参照のこと。また実施例２に記載のように、これらの種々の
ＰＥＬプロモーターフラグメントを、ＧＵＳ配列との翻訳融合物でレポーター構
築物内に組み込んだ。

【００６７】 （ＩＩＩ．メロンアクチンプロモーター） アクチンは、細胞骨格の必須の成分である、遍在的に発現されるタンパク質で
ある。ほとんど全ての真核生物組織における、その高度な保存および豊富な発現
に起因して、アクチンは、生物学的系の研究における一般的なスタンダードまた
はコントロール遺伝子となった。アクチン発現は、一般的に、遍在的かつ構成的
の両方であると考えられ、そしてアクチン配列および遺伝子構造は、植物間でよ
く保存されている。植物において、機能的なアクチン遺伝子は、一般的に、４つ
のイントロンに介在される５つのエキソンから構成される。イントロンの位置は
、植物間でよく保存されており、そしてどちらかと言えば小さいが、イントロン
の長さおよび配列は、様々である。例えば、ＰｅａｒｓｏｎおよびＭｅａｇｈｅ
ｒ，１９９０、ダイズアクチン；Ａｎら、１９９６、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓア
クチン；およびＭｃＥｌｒｏｙら、１９９０、イネ、を参照のこと。

【００６８】 メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）アクチンコード配列の上流のゲノムＤＮ
Ａフラグメントの単離および特徴付けは、本明細書中に記載され、メロンアクチ
ンプロモーター（「ｍＡＣＴＩＮ」、実施例３）として同定されている。ｍＡＣ
ＴＩＮプロモーター配列（配列番号４）は、双子葉植物から誘導されるが、これ
は、単子葉植物および双子葉植物の両方において、驚くほど強力な構成的プロモ
ーター活性を示す。このプロモーターは、植物起源のプロモーターであるが、こ
れは、一般に使用されるＣａＭＶウイルスプロモーターと類似のプロモーター活
性レベルを示す。

【００６９】 （ＩＶ．メロンアクチン：バナナ果実特異的ＴＲＸ融合プロモーター） バナナ果実特異的ＴＲＸプロモーターは、バナナ果実スライス中の一過性のレ
ポーター遺伝子活性によって決定されるように、中程度のレベルの活性を示した
。このプロモーターの２つの改変形態を、（１）バナナＴＲＸプロモーターの３
’末端に単子葉植物イントロンを付加することによって、および（２）バナナＴ
ＲＸプロモーターにそのＴＡＴＡボックスでメロンアクチンプロモーターと融合
させることによって、構築した。

【００７０】 メロンアクチンプロモーターは、強力な構成的プロモーターであり、これは、
単子葉植物および双子葉植物の両方において活性であり、そして５’非翻訳化リ
ーダー中に１つのイントロンを含む。この機構は、本発明の部分ではないが、こ
のバナナＴＲＸプロモーターへの５’非翻訳化リーダー中のイントロンの付加は
、このバナナＴＲＸプロモーターの活性を増加するが、このＴＲＸプロモーター
の果実特異性は、依然変化されないままであることが推測された。なぜなら、組
織特異性を制御する機能的エレメントは、ＴＡＴＡボックスの上流に存在すると
予測されるからである。

【００７１】 ＴＲＸ−メロンアクチン融合プロモーターおよびＴＲＸ−単子葉植物イントロ
ン融合プロモーターの構築および評価は、実施例４にさらに記載される。改変Ｔ
ＲＸプロモーターを使用する一過性発現アッセイの結果に従って、これらの融合
プロモーターは、一過性発現アッセイにおいて、バナナ果実特異的ＴＲＸプロモ
ーターと比べて、改善された性能を示す。

【００７２】 （Ｖ．植物細胞を形質転換するためのベクター） 本発明は、植物の形質転換に適切なベクターを提供する。本発明のベクター、
キメラ遺伝子およびＤＮＡ構築物もまた、異種遺伝子の発現に有用である。本発
明のキメラ遺伝子を保有する、トランスジェニック植物、トランスジェニック植
物細胞およびトランスジェニック果実は、組換え発現される物質の有用な供給源
であり得る。

【００７３】 本発明のバナナ果実関連およびＴＲＸ融合プロモーターは、プロモーターに作
動可能に連結される異種構造遺伝子の果実関連発現のためのキメラ遺伝子構築物
における有用性を見出す。本明細書中に記載の方法および結果は、トランスジェ
ニック植物細胞における、本発明のバナナ果実関連およびＴＲＸ融合プロモータ
ーの制御下での果実関連遺伝子発現ならびにメロンアクチンプロモーターの制御
下での構成的遺伝子発現に関する。本発明のプロモーターは、形質転換された植
物細胞における、このプロモーターに作動可能に連結される遺伝子の転写を促進
するＤＮＡの領域を含む。

【００７４】 Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されるような、公知の、慣用的なＤＮ
Ａ操作技術を使用して、異種遺伝子構築物を作製し、これによって、目的の外来
構造ＤＮＡ配列（すなわち、遺伝子）を、本発明のバナナ果実関連プロモーター
の調節制御下に配置し得る。

【００７５】 植物への形質転換技術に適切な発現ベクターまたは異種遺伝子構築物の構築は
、当業者に公知である（例えば、ＨｏｕｃｋおよびＰｅａｒ，１９９０、および
Ｂｅｃｋｅｒら、１９９２を参照のこと）。

【００７６】 植物における発現のために、本発明の発現ベクターは、目的のＤＮＡコード配
列のための挿入部位を含むように構築され得る。次いで、このような挿入された
ＤＮＡの転写は、本発明のバナナ果実関連プロモーターの制御下にある。

【００７７】 このような発現ベクターは、発現されるＤＮＡ配列の３’末端に、単一または
複数の転写終結シグナルを有し得る。この発現カセットはまた、例えば、（ｉ）
リーダー配列をコードするＤＮＡ配列（すなわち、分泌または液胞標的化を可能
にするため）、（ｉｉ）翻訳終結シグナル、（ｉｉｉ）植物細胞における使用の
ための選択マーカー遺伝子、（ｉｖ）二次宿主中での選択および増殖を可能にす
る配列（例えば、複製起点および選択マーカー配列）を含み得る。

【００７８】 選択マーカー遺伝子は、形質転換されていない植物細胞に対して毒性である、
ある量の抗生物質に対して、細胞を耐性にすることによって、この遺伝子を含む
形質転換された植物細胞の選択を可能にするポリペプチドをコードする。例示的
な選択マーカー遺伝子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐ
ｔＩＩ）耐性遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）、
ブロモキシニル特異的ニトリラーゼ（ｂｘｎ）、フォスフィノスリシンアセチル
トランスフェラーゼ酵素（ＢＡＲ）およびスペクチノマイシン耐性遺伝子（ｓｐ
ｔ）が挙げられ、ここで、その選択薬剤は、それぞれ、カナマイシン、ハイグロ
マイシン、ゲネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）、除草剤グルフォシネート（ｇｌ
ｕｆｏｓｉｎａｔｅ）アンモニウム（「Ｂａｓｔａ」）またはスペクチノマイシ
ンである。

【００７９】 代表的な二次宿主としては、細菌および酵母が挙げられる。１つの実施形態に
おいて、二次宿主は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉであり、複製起点は、
ｃｏｌＥ１型であり、そして選択マーカーは、アンピシリン耐性をコードする遺
伝子である。二次宿主において作動的な複製起点および選択マーカー配列は、当
該分野で周知であり、そして多くが市販されている（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ
）。

【００８０】 本発明のベクターは、植物細胞における核酸コード配列の、果実組織関連発現
（バナナＴＲＸプロモーターまたはバナナＰＥＬプロモーター、ＴＲＸイントロ
ン融合プロモーターまたはＴＲＸアクチン融合プロモーターを使用する）または
構成的発現（ｍＡＣＴＩＮ）に有用である。例えば、選択されたペプチドまたは
ポリペプチドコード配列が、本発明の発現ベクターに挿入され得る。次いで、こ
のベクターは、宿主細胞に形質転換され、そしてこの宿主細胞は、そのタンパク
質コード配列の発現を可能にする条件下で培養される。いくつかの場合、この発
現されたペプチドまたはポリペプチドは、その細胞から単離される。形質転換さ
れた植物前駆細胞はまた、トランスジェニック結果植物を生成するために使用さ
れ得る。

【００８１】 さらに、本発明は、トランスジェニック結果植物を生成するための方法を包含
する。ここで、この植物によって産生された果実は、改変された表現型を有する
。この方法において、異種遺伝子構築物が、その植物の前駆細胞に導入される（
例えば、形質転換によって）。例示的な異種遺伝子構築物は、（ｉ）植物の表現
型特徴を改変する（例えば、植物によって産生された果実におけるエチレン生合
成を減少させる）のに有効である遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列、この配列
に作動可能に連結される（ｉｉ）本発明のバナナプロモーターまたはＴＲＸ融合
プロモーターからなり、ここで、発現は、果実関連性である。別の実施形態にお
いて、本発明は、トランスジェニック植物を生成するための方法を包含し、ここ
で、例示的な異種遺伝子構築物は、（ｉ）導入遺伝子産物をコードするＤＮＡ配
列、その配列に作動可能に連結される（ｉｉ）メロンアクチンプロモーターから
なり、ここで、発現は構成的である。

【００８２】 このＤＮＡ配列は、このプロモーターに対して異種であり、そしてこのキメラ
遺伝子は、植物細胞中での発現に必要な、適切な調節エレメントを含む。形質転
換された前駆細胞を生育させて、トランスジェニック結果植物を生成する。この
方法はさらに、選択マーカーおよび異種遺伝子を含むベクターでの、その植物の
前駆細胞の形質転換を包含する。

【００８３】 本明細書中に記載されるベクターは、植物形質転換キットの一部を形成し得る
ことが理解される。このキットの他の成分としては、植物細胞形質転換に有用な
試薬が挙げられるが、これらに限定されない。

【００８４】 （ＶＩ．植物細胞を形質転換する方法） 本発明のバナナ果実関連プロモーター（例えば、ＴＲＸまたはＰＥＬ）、本発
明のメロンアクチンプロモーター、本発明のＴＲＸ：イントロン融合プロモータ
ーまたはＴＲＸ：メロンアクチン融合プロモーターを含む、キメラ遺伝子は、多
くの植物形質転換方法論によって植物細胞に移入され得る。これらの方法論とし
ては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベースの方法［Ｒａｎｉｅｒら、１９９０（
イネ）；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、１９８６（トマト）；Ｎｏｒｅｌｌｉら、１９
９６（リンゴ）］、エレクトロポレーション、マイクロインジェンクション、お
よびマイクロプロジェクタイルボンバードメント（例えば、ＣｏｍａｉおよびＣ
ｏｎｉｎｇ、１９９３；Ｋｌｅｉｎら、１９８８；Ｍｉｋｉら、１９８７；Ｂｅ
ｌｌｉｎｉら、１９８９を参照のこと）が挙げられる。

【００８５】 １つの実施形態において、キメラ遺伝子は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによって運ばれる、Ｔ−ＤＮＡのないＴｉプラスミドによ
って植物に導入され、次いで、このＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞と植物細胞
とを同時培養する。このような場合、本発明における使用のためのベクターは、
選択マーカー遺伝子、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由
来のＴ−ＤＮＡボーダー（ｂｏｒｄｅｒ）領域、目的の異種遺伝子、および他の
エレメント（所望の場合）を含む。例示的なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転
換ベクターは、Ｃｋｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）より市販され、
そしてＡｎら、１９８５にさらに記載される。

【００８６】 他の適切なベクターは、本発明のプロモーターおよび標準的な植物形質転換ベ
クターを使用して構築され得る。これらの標準的ベクターは、商業的に（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、および学術的供給源から［Ｓａｌｋ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｓ；Ｔｅｘａｓ
Ａ ＆ Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｆｒｉｓｃｈら、１９９５）；Ｗａｋｓｍ
ａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｒｕｔｇｅｒｓ，Ｔｈｅ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ］の両
方で、入手可能である。

【００８７】 別の実施形態は、ＤＮＡを充填した微小粒子を使用する、マイクロプロジェク
タイルボンバードメントに基づき、このＤＮＡは、「遺伝子銃」技術を使用して
細胞にボンバードされる（例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ＨＬおよびＴｏｒｒｅｓ
，ＣＡ，１９９７を参照のこと）。

【００８８】 エレクトロポレーションまたはマイクロプロジェクタイルボンバードメントの
形質転換技術を利用する場合、形質転換ベクターは、一般に、目的の異種遺伝子
、および形質転換事象が成功したか否かを決定するための選択マーカー遺伝子構
築物を含む。

【００８９】 形質転換された植物細胞は、異種遺伝子に作動可能に連結された本発明のプロ
モーターを含む異種遺伝子構築物での、植物細胞の形質転換の結果として得られ
る。この植物細胞を、適切な選択薬剤を含む培地中で培養し、キメラ遺伝子を発
現する植物細胞を同定および選択する。キメラ遺伝子を発現する植物細胞が選択
された後、植物全体を、そのトランスジェニック植物細胞から再生する。形質転
換された植物細胞から植物全体を再生するための技術は、当該分野で公知である
。適切な植物再生プロトコルもまた、公知である。

【００９０】 本発明はさらに、結果植物のようなトランスジェニック植物を生成するための
方法を包含する。この方法において、本発明のキメラ遺伝子（これは、代表的に
、植物細胞中で選択を可能にする発現ベクターに保持される）が、植物の前駆細
胞に導入される。次いで、これらの前駆細胞を生育させて、トランスジェニック
結果植物を生成する。

【００９１】 本発明のバナナ果実関連プロモーター、メロンアクチンプロモーターおよびＴ
ＲＸ融合プロモーターを使用する形質転換に適切な好ましい植物としては、以下
が挙げられるが、これらに限定されない：バナナ、トマト、パイナップル、ブド
ウ、ラズベリー、イチゴ、キーウィ、アボカト、メロン、マンゴー、パパイヤ、
リンゴ、モモ、セイヨウナシ、サクランボ、柑橘類、ナツメヤシ、オオバコ、ダ
イズ、ワタ、アルファルファ、アブラナ、アマ、テンサイ、ヒマワリ、ジャガイ
モ、タバコ、トウモロコシ、コムギ、イネ、堅果およびレタス。

【００９２】 １つの例示的実施形態において、市販のカンタループメロン（ｃａｎｔａｌｏ
ｕｐｅ）変種（Ｃｕｃｕｍｉｓ Ｍｅｌｏ、マスクメロン）の子葉外植片を、上
記に記載の二方向性ベクターを植物に導入するための安全化（ｄｉｓａｒｍｅｄ
）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を用いて、公知の方法（ＦａｎｇおよびＧｒｕ
ｍｅｔ、１９９０；ＶａｌｌｅｓおよびＬａｓａ、１９９４；Ｄｏｎｇら、１９
９１；Ｇｏｎｓａｌｖｅｓら、１９９４；Ｙｏｓｈｉｏｋａら、１９９２；Ａｙ
ｕｂら、１９９６）に従って、形質転換する。この安全化Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ株を、メロン子葉組織外植片と共に同時培養し、一次形質転換体を、抗生
物質カナマイシンを含む培地上での、根を再生および発生するそれらの能力に基
づいて、選択する。

【００９３】 他の例示的実施形態において、バナナ、イネ、トマト、リンゴについて記載さ
れるようなＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換方法を使用して、本発明のプロ
モーターを用いて植物細胞を形質転換する。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転
換は、イネ、トマト、リンゴ、アーモンド、アスパラガス、アボカト、ブロッコ
リー、ニンジン、カリフラワー、セロリ、キュウリ、ブドウ、カキ、およびホウ
レンソウについて、以前に記載されている。例えば、Ｓａｇｉら、１９９５（バ
ナナ）；Ｒａｎｉｅｒら、１９９０（イネ）；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、１９８６
（トマト）、Ｖａｎ Ｅｃｋ ＪＭら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ
１４：２９９−３０４、１９９５（トマト）；Ｎｏｒｅｌｌｉら、１９９６（
リンゴ）；Ｍｉｇｕｅｌ ＣＭら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １
８：３８７−９３、１９９９（アーモンド）；Ｃａｂｒｅｒａ−Ｐｏｎｃｅ Ｊ
Ｌら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １６：２５５−２６０、１９９
７、Ｄｅｌｂｒｅｉｌ Ｂら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １２：
１２９−１３２、１９９３（アスパラガス）；Ｍｏｇｉｌｎｅｒ Ｎら、Ｍｏｌ
Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ ６（５）：６７３−５、１
９９３（アボカト）；Ｈｏｓｏｋｉ Ｔら、Ｊ．Ｊａｐａｎ Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ
．Ｓｃｉ．６０：７１−７５、１９９１（ブロッコリー）；Ｈａｒｄｅｇｇｅｒ
Ｍら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ４：１１９−１２７、１９９
８（ニンジン）；Ｂｈａｌｌａ ＰＬおよびＳｍｉｔｈ Ｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ４：５３１−４１、１９９８（カリフラワー）；Ｃａｔ
ｌｉｎ Ｄら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７：１００−１０３、
１９８８（セロリ）；Ｓａｒｍｅｎｔｏ ＧＧら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉ
ｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ３１：１８５−１９３、１９
９２、およびＴｒｕｌｓｏｎ ＡＪら、Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ７
３：１１−１５、１９８６（キュウリ）；Ｓｃｏｒｚａ Ｒら、Ｐｌａｎｔ Ｃ
ｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １４：５８９−９２、１９９５、およびＦｒａｎｋｓ
Ｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ４：３２１−３３、１９９８
（ブドウ）；Ｎａｋａｍｕｒａ Ｙら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ
１７：４３５−４４０（カキ）；ならびにＺｈａｎｇ ＨＸおよびＺｅｅｖａ
ａｒｔ ＪＡＤ、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １８：６４０−４５
、１９９９（ホウレンソウ）を参照のこと。

【００９４】 （ＶＩＩ．異種遺伝子） 目的の任意の構造遺伝子は、本発明のプロモーターの調節制御下に配置され得
る。この構造遺伝子は、目的のポリペプチドまたは他の遺伝子産物をコードし得
る。

【００９５】 本発明の方法に従って、異種遺伝子は、本発明のバナナ果実関連プロモーター
、メロンアクチンプロモーターまたはＴＲＸ融合プロモーターに作動可能に連結
され得る。

【００９６】 １つの局面において、本発明のバナナ果実関連プロモーターは、形質転換され
た果実細胞中でのエチレン生成を調節するため、そしてこれによって、このよう
な果実細胞から構成されるトランスジェニック果実の成熟を変化させ、そして老
化を遅らせるために使用される。

【００９７】 本発明のこの実施形態において、本明細書中に記載のプロモーターは、結果植
物（例えば、バナナ）由来の果実の、成熟の延長および老化の遅延のための方法
において使用される。本発明のこの局面において、本発明のプロモーターを含む
トランスジェニック植物細胞を生育させて、トランスジェニック結果植物を生成
する。

【００９８】 特に、植物細胞は、本発明のバナナプロモーターの制御下にある、植物細胞中
で発現された場合にエチレン生合成を減少し得る産物（例えば、Ｓ−アデノシル
−メチオニンヒドロラーゼ（ＳＡＭａｓｅ、Ｆｅｒｒｏら、１９９５；Ｈｕｇｈ
ｅｓら、１９８７）、アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）デアミ
ナーゼ、ＡＣＣオキシダーゼアンチセンス分子、ＡＣＣシンターゼアンチセンス
分子、ＡＣＣオキシダーゼコサプレッション分子、ＡＣＣシンターゼコサプレッ
ション分子）をコードする、異種核酸構築物で形質転換される。これらのトラン
スジェニック植物によって産生された果実は、以下のものに記載されるような、
改変された成熟表現型を有する：共有に係る米国特許第５，８５９，３３０号；
同第５，７８３，３９４号；同第５，７８３，３９３号；同第５，７２３，７４
６号；同第５，５８９，６２３号；同第５，４１６，２５０号および同第５，７
５０，８６４号（これらは、本明細書中に参考として援用される）。

【００９９】 改変された成熟表現型とは、成熟の速度における変化をいい；トランスジェニ
ック果実のその対応する（すなわち、非トランスジェニック）野生型果実と比較
した、成熟時間経過の増加、または成熟の延長および老化の遅延によって特徴付
けられる。

【０１００】 別の実施形態において、この核酸コード配列は、感染特異的遺伝子（例えば、
ポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質（ＰＧＩＰ）、グルカナーゼおよびキチナ
ーゼ）に対応し得る。

【０１０１】 さらなる実施形態において、この核酸コード配列としては、以下に影響する配
列が挙げられる：（ｉ）香味（例えば、タウマチン；ＧｅｎＢａｎｋ）；（ｉｉ
）色素沈着（例えば、リコピン合成を改変する産物（例えば、リコピンシクラー
ゼ；ＧｅｎＢａｎｋ）；（ｉｉｉ）植物細胞プロセスを改変する酵素または他の
触媒産物（例えば、リボザイムまたは触媒性抗体）；（ｉｖ）成熟した果実の分
解を阻害する酵素（例えば、アンチセンスポリフェノールオキシダーゼ、ならび
にアンチセンスポリフェノールペルオキシダーゼ（褐変を阻害するため）および
アンチセンスペクチン酸リアーゼ（軟化を阻害するため））；（ｖｉ）抗菌ペプ
チド、（ｖｉｉ）スクロース蓄積遺伝子（例えば、スクロースリン酸シンターゼ
遺伝子（ＧＥＮＢＡＮＫ）、ならびに（ｖｉｉ）スクロースの代謝に影響する遺
伝子（例えば、インベルターゼ）。

【０１０２】 （ＶＩＩＩ．形質転換体の同定および評価） 形質転換後、トランスジェニック植物細胞を、本発明のバナナ果実関連プロモ
ーター、メロンアクチンプロモーターまたはＴＲＸ融合プロモーターに作動可能
に連結されている導入遺伝子の発現についてアッセイする。トランスジェニック
植物細胞は最初に、選択薬剤（例えば、アミノグリコシド抗生物質カナマイシン
）の存在下で成長する能力によって、選択され得る。

【０１０３】 導入遺伝子の発現はまた、この導入遺伝子の発現と関連する、ＤＮＡ，ｍＲＮ
Ａおよびタンパク質の分析によって決定され得る。このアッセイは、代表的に、
種々の植物組織供給源（例えば、葉、茎または果実）を使用して行われる。

【０１０４】 （Ａ．植物形質転換ベクターの構築およびレポーター発現の評価） （バナナ果実関連プロモーター） 本発明のバナナ果実関連プロモーターの相対活性を、プロモーターからの組織
関連の調節可能な発現を評価するために有効なＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）
によって例示されるレポーター遺伝子を用いる一過性アッセイ系において評価し
た。ＧＵＳタンパク質の発現は、蛍光分析アッセイ、分光光度アッセイまたは組
織化学的アッセイ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，１９８７ａ）によって容易に測定され
る。

【０１０５】 ＧＵＳレポーター遺伝子構築物における果実関連プロモーターＰＥＬおよびＴ
ＲＸの機能アッセイの結果は、果実組織においてプロモーターとして機能するＰ
ＥＬ配列およびＴＲＸ配列がエチレン応答性であり、そして成熟に関連すること
を示唆する。

【０１０６】 ｐＡＧ１４２ａ−ｐｅｌ：：ＧＵＳ（２．０ｋｂ）、ｐＡＧ１４２ｂ−ｐｅｌ
：：ＧＵＳ（１．４ｋｂ）、ｐＡＧ１４２ｃ−ｐｅｌ：：ＧＵＳ（０．９ｋｂ）
、ｐＡＧ１５３−ＣｓＶＭＶ：：ＧＵＳ、ｐＡＧ１５９−ＴＲＸ：：ＧＵＳまた
はｐＢＩ２２１−３５Ｓ：：ＧＵＳを含む組換え核酸構築物を、単離されたプロ
モーター配列および当業者によって慣用的に用いられる技術を用いて調製し、次
いで、実施例１および実施例２において以下で記載したように、パーティクルボ
ンバードメントによってバナナ植物細胞に導入した。

【０１０７】 種々の組換え核酸構築物（ｐＡＧ１４２ａ−ｐｅｌ：：ＧＵＳ（２．０ｋｂ）
、ｐＡＧ１４２ｂ−ｐｅｌ：：ＧＵＳ（１．４ｋｂ）、ｐＡＧ１４２ｃ−ｐｅｌ
：：ＧＵＳ（０．９ｋｂ）、ｐＡＧ１５３−ＣｓＶＭＶ：：ＧＵＳ、ｐＡＧ１５
９−ＴＲＸ：：ＧＵＳおよびＰＢＩ２２１−３５Ｓ：：ＧＵＳ）のプロモーター
活性を、ＧＵＳ発現についての一過性アッセイにおいて評価した。

【０１０８】 分析を実施する際に、キャベンディッシュバナナを、地域の食料雑貨店（ｌｏ
ｃａｌ ｇｒｏｃｅｒｙ ｓｔｏｒｅ）から入手し、そしてエチレン処理前（「
非ガス処理（ｕｎｇａｓｓｅｄ）」）、標準的な商業的エチレン処理の２４時間
以内（「緑色、ガス処理（ｇｒｅｅｎ，ｇａｓｓｅｄ）」）またはエチレン処理
の約２〜３日後（このとき、バナナは皮色指数（ＰＣＩ）４〜５（大部分が黄色
の皮、「半成熟」）に到達した）に試験した。

【０１０９】 各々の構築物の金粒子懸濁物を調製し、そしてこれを用いて、実施例１および
実施例２において下記で詳述したように、滅菌した非ガス処理緑色バナナ果実、
軟化段階直前のガス処理バナナ果実（それほど黄色ではない）およびエチレンで
のガス処理２４時間後のガス処理バナナ果実をボンバード（ｂｏｍｂａｒｄ）し
た。図７は、緑色、皮色指数（ＰＣＩ）１（早期）およびＰＣＩ４（後期）の成
熟段階での食用バナナ果肉（皮と接触した果肉外面）におけるｐＡＧ１４２ａ−
ｐｅｌ：：ＧＵＳ（ＰＥＬ ２．０）プロモーター、ｐＡＧ１４２ｂ−ｐｅｌ：
：ＧＵＳ（ＰＥＬ １．４）プロモーター、ｐＡＧ１４２ｃ−ｐｅｌ：：ＧＵＳ
（ＰＥＬ ０．９）プロモーター、ｐＡＧ１５３−ＣｓＶＭＶ：：ＧＵＳ（Ｃｓ
ＶＭＶ）プロモーターおよびｐＡＧ１５９−ＴＲＸ：：ＧＵＳ（ＴＲＸ １．０
）プロモーターを用いたＧＵＳレポーターアッセイの結果を例示する。この結果
を、ＧＵＳフォーカス（ｆｏｃｕｓ）を有するバナナ果実スライスのパーセント
として報告する。

【０１１０】 （メロンアクチンプロモーターおよびメロンアクチン／ＴＲＸ融合プロモータ
ー） 本発明のメロンアクチン、ＴＲＸ−イントロンおよびＴＲＸ−アクチン融合プ
ロモーターの相対活性を、上記のように、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）レポ
ーター遺伝子を用いて一過性アッセイ系において評価した。

【０１１１】 種々の組織（バナナ胚性懸濁細胞、バナナ果実スライスならびにいくつかの型
のニンニクおよびタマネギ組織を含む）のパーティクルボンバードメントを、メ
ロンアクチンおよびＴＲＸ融合プロモーターを用いて実施した。異なるプロモー
ターの転写制御下でＧＵＳ遺伝子を含むいくつかのプラスミド構築物（ｐＡＧ１
３８ｍ−ＲＥ４：：ＧＵＳ；ｐＡＧ１４７−プロモーターなしのＧＵＳ（これは
、調節エレメントを含まないＧＵＳ遺伝子を含み、そしてネガティブコントロー
ルとして役立つ）；ｐＡＧ１５３−ＣｓＶＭＶ：：ＧＵＳ（これは、ＣｓＶＭＶ
プロモーターを含み、そしてポジティブコントロールとして役立つ）；ｐＡＧ１
６７−ｍＡＣＴＩＮ：：ＧＵＳ；ＰＢＩ２２１−３５Ｓ：：ＧＵＳ９（これは、
ＣａＭＶプロモーターを含み、そしてポジティブコントロールとして役立つ）；
ｐＡＧ７４９、ＴＲＸ−アクチン；およびｐＡＧ７５９、ＴＲＸ−Ｏ２イントロ
ンを含む）を、実施例３および実施例４にさらに記載されるように、パーティク
ルボンバードメントによって評価した。

【０１１２】 ボンバードメントおよび暗条件でのインキュベーション後、サンプルを、３７
℃にて１８時間Ｘ−ｇｌｕｃ溶液で処理した。青色のＧＵＳフォーカスを、倒立
顕微鏡を用いてスコア付けした。

【０１１３】 メロンアクチンプロモーターを、ニンニクおよびタマネギの両方における種々
のコントロールのプロモーターとともに、評価し、そしてネガティブコントロー
ル（プロモーターなしのＧＵＳ）はフォーカスを示さず、一方、ｐＡＧ１３８ｍ
−ＲＥ４：：ＧＵＳ；ｐＡＧ１５３−ＣｓＶＭＶ：：ｐＡＧ１６７−ｍＡＣＴＩ
Ｎ：：ＧＵＳ；およびＰＢＩ２２−１３５Ｓ：：ＧＵＳ（ＣａＭＶ ３５Ｓ）は
全て、実施例３に詳述したようにＧＵＳ発現を促進した。

【０１１４】 バナナ果実スライスのパーティクルボンバードメントを、改変したＴＲＸプロ
モーターを用いて実施した。ＧＵＳ発現の結果は、ＴＲＸ−イントロンおよびＴ
ＲＸ−アクチンの改変が、バナナ果実特異的ＴＲＸプロモーターと比較して改善
された性能をもたらしたことを示す。より詳細には、ＴＲＸ−アクチン融合プロ
モーターは、強力な構成性プロモーターＣｓＶＭＶとほぼ等しい一過性発現活性
を提示し、一方、ＴＲＸ−イントロン融合物は、平均してわずかに活性が低い。
さらに、ＴＲＸ−イントロンプロモーターおよびＴＲＸ−アクチンプロモーター
は、バナナの葉においてさらに低い活性を有し、このことは、このプロモーター
が、ＴＲＸプロモーターの組織特異性を保持したことを示す（実施例４）。

【０１１５】 （Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの安定な形質転換） ｍＡＣＴＩＮプロモーターをまた、モデル単子葉植物（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ ｔｈａｌｉａｎａ）において、ｍＡＣＴＩＮプロモーターの制御下でＧＵＳ
をコードするレポーター遺伝子を含む核酸構築物での形質転換後に活性について
試験した。以下の２つの発現カセットを含むプラスミドｐＡＧ４０１５：（１）
左のＴ−ＤＮＡボーダーに隣接して、ＣｓＶＭＶプロモーターの制御下でカナマ
イシン耐性を付与するｎｐｔＩＩ遺伝子をＧ７ターミネーターとともに含む選択
カセットが見出される；および（２）右のＴ−ＤＮＡボーダーに隣接して、ｍＡ
ＣＴＩＮプロモーターの制御下のＧＵＳレポーター遺伝子が、ｎｏｓターミネー
ターとともに見出される。

【０１１６】 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ植物を、植物内Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ媒介形質転換によってｐＡＧ４０１５で形質転換し、Ｔ１種子をこの
植物から採取し、発芽させ、そして形質転換された実生を、実施例３においてさ
らに記載されるように、カナマイシン耐性に基づいて同定した。

【０１１７】 ＧＵＳ活性についての組織化学的染色は、ｍＡＣＴＩＮプロモーターが、強力
なレポーター遺伝子発現を、葉、根、茎および花において指向することを示した
（実施例３）。

【０１１８】 （Ｂ．プロモーター駆動遺伝子発現の検出方法） トランスジェニック植物を、産物ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質を合成する能
力について、および／または抗生物質（例えば、アミノグリコシド抗生物質カナ
マイシン）に対する抵抗性についてアッセイし得る。アッセイを、代表的に、種
々の植物組織源（例えば、葉、茎または果実）を用いて実施する。

【０１１９】 遺伝子増幅および／または発現を、例えば、ｍＲＮＡの転写を定量するために
（Ｔｈｏｍａｓ，１９８０）、従来のサザンブロッティング、ノーザンブロッテ
ィング、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）によって、またはインサイチュハ
イブリダイゼーションにおいて、適切に標識されたプローブを用いて、本明細書
中に記載される種々のプロモーターの制御下で発現される配列もしくは導入遺伝
子に基づいて、サンプルにおいて直接測定し得る。

【０１２０】 （ＩＸ．有用性） 本明細書中に記載されるバナナ果実特異的プロモーターの用途および利点とし
ては、果実の特徴を改変または改善し得る遺伝子の果実特異的発現が挙げられる
。特に興味深いのは、成熟制御、果実の栄養含量の改変、および果実特異的様式
での有用なタンパク質の発現である。

【０１２１】 本明細書中に記載されるメロンアクチンプロモーターは、選択マーカーの発現
を制御するため、および目的の遺伝子の構成性発現に有用である。このプロモー
ターは、単子葉植物および単子葉植物の両方において機能し、そして通常用いら
れるウイルスプロモーターと類似するが、植物起源のものである活性を有する。

【０１２２】 本明細書中に記載されるメロン−アクチン融合プロモーターは、類似の特性を
有するが、さらに、これらのプロモーターは、バナナＴＲＸプロモーターの組織
特異性を保持していた。

【０１２３】 以下の実施例は、本発明の範囲を例示することを意図するが、本発明の範囲を
限定することを決して意図しない。

【０１２４】 （材料および方法） （ＤＮＡプラスミドおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍバイナリーベクター構
築） 生物学的試薬を代表的に、以下の販売業者から入手した：５’→３’Ｐｒｉｍ
ｅ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖ
ｅｒｌｙ，ＭＡ；Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ；Ｐｒ
ｏｍｅｇａ，Ｍａｉｓｏｎ，ＷＩ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃ
Ａ；およびＯｐｅｒｏｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ。

【０１２５】 パーティクルボンバードメントにおいて用いられる特定の試薬としては、以下
が挙げられる：ＢｉｏＲａｄ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ＰＤＳ−１０００／Ｈｅシ
ステム（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，
ＵＳＡ）、１．５〜３．０μｍの金粒子（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ
，ＷＩ，ＵＳＡ）、ラプチャーディスク（ｒｕｐｔｕｒｅ ｄｉｓｋ）：１，１
００ ＰＳＩ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，
ＣＡ，ＵＳＡ）、０．６８５メッシュの仕切りスクリーン（ｓｔｏｐ ｓｃｒｅ
ｅｎ）（Ｒｕｍｓｅｙ−Ｌｏｏｍｉｓ，Ｆｒｅｅｖｉｌｌｅ，ＮＹ）、マクロキ
ャリア（ｍａｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）：（Ｒｕｍｓｅｙ−Ｌｏｏｍｉｓ，Ｆｒｅ
ｅｖｉｌｌｅ，ＮＹ）およびＸ−Ｇｌｕｃ：５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリルβ−Ｄ−グルクロニドシクロヘキシルアミン塩（Ｒｏｓｅ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ，Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ａｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ）。

【０１２６】 標準的な組換えＤＮＡ技術を、全ての構築において用いた（Ａｄａｍｓおよび
Ｙａｎｇ，１９７７；Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９２；ＨｏｏｙｋａａｓおよびＳ
ｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔ １９８５；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９；ならびにＭ
ａｎｉａｔｉｓら，１９８９（これらの全ては明らかに、本明細書中に参考とし
て援用される））。

【０１２７】 （ＧＵＳレポーターアッセイ） パーティクルボンバードメントにおいて用いられる特定の装置および試薬とし
ては、以下が挙げられる：ＢｉｏＲａｄ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ＰＤＳ−１００
０／Ｈｅシステム（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅ
ｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）、１．５〜３．０μｍの金粒子（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗ
ａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）、ラプチャーディスク：１，１００ ＰＳＩ（Ｂｉ
ｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）、０
．６８５メッシュの仕切りスクリーン（Ｒｕｍｓｅｙ−Ｌｏｏｍｉｓ，Ｆｒｅｅ
ｖｉｌｌｅ，ＮＹ）、マクロキャリア：（Ｒｕｍｓｅｙ−Ｌｏｏｍｉｓ，Ｆｒｅ
ｅｖｉｌｌｅ，ＮＹ）およびＸ−Ｇｌｕｃ：５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリルβ−Ｄ−グルクロニドシクロヘキシルアミン塩（Ｒｏｓｅ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ，Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ａｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ）。

【０１２８】 ＧＵＳアッセイにおいて使用するための溶液は、以下を含んでいた：５０％グ
リセロール（容量／容量）；２．５Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂、５０ｍｌの
無菌ｄｉＨ₂Ｏ中に溶解した１３．８７５グラムの無水ＣａＣｌ₂）；０．１Ｍス
ペルミジン（１０ｍｌの無菌ｄｉＨ₂Ｏ中に溶解した０．１４５２グラム）；７
０％ ＥｔＯＨ（容量／容量）、７ｍｌの２００標準濃度エチルアルコール（ｐ
ｒｏｏｆ ｅｔｈｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）中の３ｍｌの無菌ｄｉＨ₂Ｏ；Ｘ−ｇ
ｌｕｃ溶液（以下の表１に示した量で成分を、１９８ｍｌの蒸留Ｈ₂Ｏに添加し
、そして１０分間にわたってまたは溶解するまで攪拌し、ｐＨを７．０に調整し
、２ｍｌ ＤＭＳＯ中に１００ｍｇのＸ−ｇｌｕｃを溶解し、ｐＨ７．０の溶液
にＸ−ｇｌｕｃ／ＤＭＳＯ溶液を添加し、ｐＨ７．０の溶液を用いてＸ−ｇｌｕ
ｃのバイアルを２回リンスし、そして得られる溶液を濾過滅菌することにより調
製された２００ｍｌ）。

【０１２９】

【表１】 金粒子懸濁物を、３０μｌの金粒子（１．５μｍ〜３．０μｍ）を、高品質微
量遠心チューブに添加し、続いて１ｍｌの７０％ ＥｔＯＨを添加することによ
り調製する。この懸濁物を２０秒間ボルテックスし、そして２５分間静置して、
遠心分離した際に金粒子がチューブの側面に付着しないようにこのチューブの底
に粒子を沈澱させ、続いて微量遠心機中で１３，０００ｒｐｍにて６分間遠心分
離する。上清を丹念に除去し、捨て、そして５００μｌの無菌のｄｉＨ₂Ｏをこ
のチューブに添加し、これを１０秒間ボルテックスし、そしてさらに２５分間静
置し、続いて微量遠心機中で１３，０００ｒｐｍにて６分間遠心分離する。上清
を丹念に除去し、捨て、５００μｌの無菌の５０％グリセロールストックを添加
し、そしてこの混合物を、粒子が再懸濁するまでボルテックスする。

【０１３０】 ＧＵＳ組換え核酸構築物を含むＤＮＡ溶液を、５０μｌ（１μｇ／μｌ）ＤＮ
Ａを、金を含む微量遠心チューブに添加し、そして２〜３秒間穏やかにボルテッ
クスし、続いて５００μｌの冷ＣａＣｌ₂（２．５Ｍ）を添加し、そして２〜３
秒間穏やかにボルテックスし、２００μｌの冷スペルミジン（０．１Ｍ）を添加
し、そして４℃にて低速で穏やかにボルテックスし、５〜１０分間毎に２、３回
チューブを爪弾いて粒子が懸濁したままであることを確実にすることにより調製
した。ここで、合計のボルテックス時間は約４０分間であった。遠心チューブに
、微量遠心機中で４℃にて３回、最大１，５００ｒｐｍとなるようにパルスし、
上清を除去し、そして捨てた。次いで、１ｍｌの冷７０％を添加し、この溶液を
混合し、そしてパルス遠心分離工程を繰り返し、上清を除去し、そして捨てた。
冷１００％ ＥｔＯＨを用いてこのパルス遠心分離工程を繰り返し、続いて３５
０μｌの冷１００％ ＥｔＯＨを添加し、そして２秒間穏やかにボルテックスす
ることによって粒子を再懸濁した。

【０１３１】 バナナ果実を、９５％エチルアルコールに浸漬したタオルを用いて拭い、小果
柄茎（ｐｅｄｉｃｅｌ ｓｔａｌｋ）および果実の先端部を切り捨て、そしてビ
ーカー中に配置することにより、パーティクルボンバードメントのために調製し
た。果実を覆うに充分な量の水／石鹸混合物の量（４滴の抗微生物性石鹸／１０
００ｍｌ Ｈ₂Ｏ）を添加し、そして１５分間にわたって間欠的に振盪し、次い
で石鹸がなくなるまでｄｉＨ₂Ｏでリンスした。果実を覆うに充分な量の７５％ ＥｔＯＨを添加し、そして各分４分間穏やかに振盪し、ＥｔＯＨを排水し、そ
して果実を覆うに充分な量の１０％漂白剤／２滴のＴｗｅｅｎ ２０／１０００
ｍｌを添加し、そして１０分間にわたって間欠的に振盪した。漂白剤を排水し、
そして果実を無菌ｄｉＨ₂Ｏで３回リンスし、続いて無菌５００ｍｌ ｄｉＨ₂Ｏ
／２ｍｌ ＰＰＭ混合物（Ｐｌａｎｔ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ Ｍｉｘｔｕ
ｒｅ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，
ＤＣ）で１回リンスし、そして濾過滅菌した２００ｍｇ／ｌアスコルビン酸およ
び２００ｍｇ／ｌクエン酸からなる媒体中に、切断の準備が調うまで浸漬した。
切断の前に、果実を濾紙で吸い取って乾燥させた。

【０１３２】 非ガス処理緑色バナナ果実、軟化段階直前のガス処理バナナ果実（それほど黄
色ではない）およびガス処理２４時間後のガス処理バナナ果実を一般的に、一過
性アッセイにおいて用いた。用いた組織の型は、皮を含まない果実果肉（皮に接
触している部分）の外側の長手方向スライス、皮の内側のセグメント、皮の外側
のセグメント、皮を含む断面スライスおよび種子領域（果実の中央部分）の長手
方向スライスを含んでいた。

【０１３３】 切断後、果実をＰＡＣ１培地上に置いた。この培地は、以下を含む：ＭＳ塩、
Ｂ５ビタミン、グリシン２ｍｇ／ｌ、スクロース３％、カゼイン加水分解物１０
０ｍｇ／ｌ、ＢＡ ０．５ｍｇ／ｌ、２，４−Ｄ １．５ｍｇ／ｌ、ＰＰＭ ５
ｍｌ／ｌ、アスコルビン酸１００ｍｇ／ｌ、クエン酸１００ｍｇ／ｌ、セフォタ
キシム２００ ｍｇ／ｌ（ａａ）ｐＨ５．８およびＰｈｙｔａｇｅｌ ０．２５
。

【０１３４】 一過性アッセイは、上記のようなＤＮＡおよび金粒子の懸濁液での植物組織切
片のパーティクルボンバートメントに基づく。果実組織をＧＵＳレポーター構築
物でボンバードした（６ｃｍの飛距離、および１，１００のＰＳＩ）。飛距離は
、ＤＮＡコートしたマイクロキャリアーと標的細胞に対する仕切スクリーンとの
間の距離として規定される。ＰＳＩは、パーティクルボンバートメントのために
使用される気体加速管中のヘリウム圧をいう。果実組織をボンバードした後、そ
れをパラフィルムでシールし、そして２２時間２４℃にて暗所に放置し、次いで
、外植片を注意深く清浄な滅菌ペトリプレートに移し、そしてＸ−ｇｌｕｃ溶液
を添加し、果実を完全に覆った。プレートを１８時間３７℃にてインキュベータ
ー中に貯蔵し、次いで、Ｘ−ｇｌｕｃ溶液をドレインし、そして９５％ＥｔＯＨ
を添加して果実を覆った。顕微鏡を使用して観察し、そして各々の果実のスライ
ス上のＧＵＳフォーカスの数を計数した。

【０１３５】 （実施例１） （バナナ特異的転写物を同定するためのディファレンシャルディスプレイの使
用） 供給業者のプロトコールに従い、ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ ＲＮＡＩｍａｇｅ Ｋ
ｉｔ Ｎｕｍｂｅｒ １を使用して、温室生長植物からの果肉（黄色く熟したＰ
ＣＩ ４）、根、球茎および葉ならびにインビトロ植物（根および苗条）由来の
全バナナＲＮＡを使用して、ディファレンシャルディスプレイを実施した。ＲＮ
Ａｉｍａｇｅ（登録商標）Ｋｉｔｓ［カタログ番号：Ｇ５０１−Ｇ５１０］、Ｇ
ｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，６２４ Ｇｒａｓｓｍｅｒｅ Ｐ
ａｒｋ Ｄｒｉｖｅ，Ｓｕｉｔｅ １７／Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＮＴ ３７２１
１／ＵＳＡ，Ｔｅｌ：６１５−８３３−０６６５／ＦＡＸ：６１５−８３２−９
４６１，ｇｅｎｈｕｎｔ＠ｔｅｌａｌｉｎｋ．ｎｅｔ ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｎ
ａｓｈｖｉｌｌｅ．ｎｅｔ／￣ｇｅｎｈｕｎｔ／ｋｉｍａｇｅ，ｈｔｍｌ］。

【０１３６】 第１鎖ｃＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む一塩基アンカーオリゴ（ｄ
Ｔ）プライマー（Ｈ−Ｔ₁₁Ｇ、配列番号１５；Ｈ−Ｔ₁₁Ａ、配列番号１６；およ
びＨ−Ｔ₁₁Ｃ、配列番号１７）を使用して、５０μｇのＤＮａｓｅ処理した全Ｒ
ＮＡから合成した。次いで、ｃＤＮＡを放射性標識したヌクレオチド（この場合
、γ−［３３Ｐ］ｄＡＴＰ）の存在下で、複製して増幅し、得られた産物を変性
ポリアクリルアミドゲル上で分析した。特定の組織に特異的な産物を、分離およ
びオートラジオグラフィー後に同定した。所望の増幅産物を同定した後、それら
を乾燥したアクリルアミドゲルから直接回収し、最初のプライマーセットを用い
て再増幅し、次いでさらに特徴付けた。

【０１３７】 Ｇ−アンカープライマー（Ｈ−Ｔ₁₁Ｇ、配列番号１５）を、任意のプライマー
（Ｈ−ＡＰ１〜Ｈ−ＡＰ８（配列番号７〜１４；ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ
．，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ））と共に増幅に使用した場合、いくつかの増幅
されたディファレンシャルディスプレイ産物が、果肉に独特であり、そして根、
球茎、葉またはインビトロ植物組織においては検出不可能であることを見出した
。とりわけ、ＡＰ１プライマー（Ｇ１Ａ、配列番号２２、ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ
Ｃｏｒｐ．，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）を使用した約４００ｂｐの産物がそう
であった。

【０１３８】 （バナナ果実関連Ｇ１ａ（ＴＲＸ）プロモーターの単離） 熟したバナナ果実に関連する増幅産物を、アクリルアミドゲルから回収し、最
初のプライマーセットを使用して再増幅し、そしてディファレンシャルディスプ
レイ産物をノーザンブロットのプローブとして使用し、関連する転写物の組織分
布を確認した。プローブとしてＧ１Ａ（ＴＲＸ）を使用したノーザンブロットか
らの結果は、ネイティブな転写物が、約６００ヌクレオチド長であり、そして高
度に果実に関連することを示す。

【０１３９】 バナナのディファレンシャルディスプレイ産物ＴＲＸと関連する上流配列を、
一連の工程において単離した。第１のオリゴヌクレオチドプライマーをディファ
レンシャルディスプレイフラグメントの５’末端に相補的であるように設計し、
そしてこれを使用して、ＰＣＲアクセス可能なバナナゲノムライブラリー（Ｕｎ
ｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ Ｋｉｔ，カタログ番号Ｋ１８０
７、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，１０２０ Ｅａ
ｓｔ Ｍｅａｄｏｗ Ｃｉｒｃｌｅ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ ９４３０３−
４２３０）の上流にウォーキングした。ＰＣＲアクセス可能なバナナゲノムライ
ブラリーを、キットに含まれる５つの制限エンドヌクレアーゼ（ＥｃｏＲＶ、Ｓ
ａｃＩ、ＤｒａＩ、ＰｖｕＩＩおよびＳｓｐＩ）、およびアダプター連結の前に
ゲノムＤＮＡを消化するために使用される３つのさらなる平滑カッター（Ｈｐａ
Ｉ、ＭｓｃＩおよびＰｓｈＡＩ）を使用して、製造業者のプロトコールに従って
構築し、そしてスクリーニングを行った。第１の反応においてｔｈｒｄｘ ３’
Ｒ（配列番号１８）プライマーおよびＨ−ＡＰ１（配列番号７、ＧｅｎＨｕｎｔ
ｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）プライマー、ならびに第２の反
応においてプライマー（ｔｈｒｄｓ３’Ｒ（配列番号１８）およびＨ−ＡＰ”（
配列番号８、ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ））
を使用するバナナライブラリーの２週の増幅後、６００ｂｐ（＃１３）フラグメ
ントおよび６２０ｂｐ（＃１４）フラグメントを、ＤｒａＩライブラリーから増
幅した。

【０１４０】 これらのフラグメントは、各々、部分的イントロンＩ、続いてエキソンＩＩお
よびイントロンＩＩならびに部分的エキソンＩＩＩからなる。エキソンＩＩおよ
び部分的エキソンＩＩＩのヌクレオチド配列は、フラグメント＃１３とフラグメ
ント＃１４との間で同一であった。しかし、イントロンにおける配列の差異は、
明らかであった。フラグメント＃１３において、推定イントロンＩＩのサイズは
、９０ｂｐであり、一方フラグメント＃１４における推定イントロンのサイズは
、６ヌクレオチド挿入に起因して、９６ｂｐであった。フラグメント＃１４イン
トロンＩの正確な配列に相補的な２つのネスト化オリゴヌクレオチドプライマー
を、設計した；ｔｒｘ３’Ｒ−２（配列番号１９）およびｔｒｘ３’Ｒ−３（配
列番号２０）（これらは、プライマー配列とフラグメント＃１３の配列との間に
一塩基の不一致を含む）。

【０１４１】 これらの２つの遺伝子特異的プライマーを使用して、バナナＰＣＲアクセス可
能なライブラリーの上流にウォーキングし、１．２ｋｂのフラグメントをＰｓｈ
ＡＩライブラリーから増幅した。このフラグメントは、残りのイントロンＩ、完
全エキソンＩおよび上流配列（推定ＴＡＴＡボックスを含む）を含む。この１．
２ｋｂのフラグメントのヌクレオチド配列は、先に記載したフラグメント＃１４
のイントロンＩ配列と同一であった。

【０１４２】 ５’ＲＡＣＥ産物を、ｔｈｒｄｘ３’Ｒプライマー（配列番号１８）を使用し
て、バナナ果肉（ＰＣＩ ４）ＲＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から作製されたＰＣＲアクセ
ス可能なｃＤＮＡライブラリーから増幅した。３００ｂｐの産物が１．２ｋｂの
フラグメント中のエキソンの配列に一致し、これは、次にフラグメント＃１４に
近接した。

【０１４３】 いくつかの遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを設計し、そしてＰＣ
Ｒ増幅において使用し、１．２ｋｂのフラグメントおよびフラグメント＃１４が
５’ＲＡＣＥフラグメントをコードするゲノムフラグメントおよびディファレン
シャルディスプレイ産物Ｇ１Ａに近接すること、ならびに近接するＤＮＡフラグ
メントがバナナゲノムに独特であること（すなわち、単一の遺伝子を表す）を検
証した。

【０１４４】 単一の産物を遺伝子特異的プライマーを用いるゲノムＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲお
よび増幅後に得た。そしてその産物の同一性を、制限消化により、さらに検証し
た。

【０１４５】 ＴＲＸ１４Ａ（配列番号２３）およびＴＲＸ１４Ｂ（配列番号２４）（最初の
フラグメント＃１４に近接する１．２ｋｂのフラグメントの配列から設計された
プライマー）を使用して、さらなる上流ウォーキングを行い、そして８００ｂｐ
のフラグメントを得た。

【０１４６】 バナナＴＲＸ遺伝子の全ヌクレオチド配列を、図１（配列番号１）に示す。こ
れは、コード配列およびイントロンを含む注釈を付けた完全ヌクレオチド配列を
示す。配列番号１のヌクレオチド１３〜９９０は、本発明のバナナ果実関連ＴＲ
Ｘプロモーターに一致し、本明細書中で配列番号２として表される。

【０１４７】 制限部位を、この配列をクローニングするために、バナナゲノムＤＮＡから直
接的にＴＲＸを増幅するために使用されるプライマー中へ操作した。以下にさら
に記載するように、組換え核酸構築物の調製における使用のためにクローニング
部位を組み込むために、各々、ＢａｍＨＩ部位およびＮｃｏＩ部位を、５’プラ
イマーおよび３’プライマー（ＴＲＸＰ−Ｆ（配列番号２５）およびＴＲＸＰ−
Ｒ（配列番号２６））中へ操作した。

【０１４８】 （植物形質転換ベクターおよびレポーター構築物を使用するバナナＴＲＸプロ
モーター活性） 制限部位を、クローニングの簡易化のために、バナナゲノムＤＮＡからＴＲＸ
プロモーターを直接的に増幅するために使用されるプライマー中へ操作した。Ｂ
ａｍＨＩ部位およびＮｃｏＩ部位を、各々５’プライマーおよび３’プライマー
（ＴＲＸＰ−Ｆ（配列番号２５）およびＴＲＸＰ−Ｒ（配列番号２６））中へ操
作した。ＴＲＸプロモーターをバナナゲノムＤＮＡから増幅し、適切な突出末端
を生成するように設計し、そしてレポーター遺伝子構築物（ＧＵＳ（β−グリク
ロニダーゼ）と翻訳的に（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）融合されたプロモ
ーターから構成され、ｎｏｓターミネーターを含む）中の適合部位へクローン化
された。得られた構築物を、ｐＡＧ１５９と命名した。ｐＡＧ１５９中に存在す
る場合のＴＲＸプロモーターのヌクレオチド配列を、配列番号２（図２）におい
て表す。ｐＡＧ１５９（図２）中のＴＲＸプロモーター配列は、ＢａｍＨＩ部位
（ＧＧＡＴＣＣ）およびＮｃｏＩ部位（ＣＣＡＴＧＧ）を、各々、その配列の３
’末端および５’末端へ操作した、ゲノム増幅物から構築されるヌクレオチド配
列（図１）とは異なる。翻訳開始コドンは、３’ＮｃｏＩ部位中に含まれるＡＴ
Ｇからなる。図２（配列番号２）における配列は、機能的プロモーターをコード
することが示されている。

【０１４９】 ｐＡＧ１５９−ＴＲＸ：：ＧＵＳ，ｐＡＧ１４２ａ−ｐｅｌ：：ＧＵＳ（２．
０ｋｂ），ｐＡＧ１４２ｂ−ｐｅｌ：：ＧＵＳ（１．４ｋｂ），ｐＡＧ１４２ｃ
−ｐｅｌ：：ＧＵＳ（０．９ｋｂ），ｐＡＧ１５３−ＣｓＶＭＶ：：ＧＵＳおよ
びｐＢＩ２２１−３５Ｓ：：ＧＵＳの組換え核酸構築物を、パーティクルボンバ
ートメントにより、バナナ組織中に、個々に導入した。

【０１５０】 ｐＢＩ２２１−３５Ｓ：：ＧＵＳおよびｐＡＧ１５３−ＣｓＶＭＶ：：ＧＵＳ
構築物は、各々ＣａＭＶ３５ＳおよびＣｓＶＭＶプロモーターを含み、これは、
ＧＵＳ発現を駆動する。両方とも発現についてのポジティブコントロールとして
機能する強力な構成的なプロモーターである。

【０１５１】 バナナ果実関連プロモーターの相対活性を、ＧＵＳレポーター遺伝子を使用す
る一過性アッセイ系により決定した。

【０１５２】 一過性アッセイは、上記のように、ＤＮＡおよび金粒子の懸濁液での植物組織
の切片のパーティクルボンバートメントに基づく。

【０１５３】 果実組織をボンバードした後、それをパラフィルムでシールし、そして２２時
間２４℃にて暗所に放置し、次いで、外植片を注意深く清浄な滅菌ペトリプレー
トに移し、そしてＸ−ｇｌｕｃ溶液を添加し、果実を完全に覆った。プレートを
１８時間３７℃にてインキュベーター中に貯蔵し、Ｘ−ｇｌｕｃ溶液をドレイン
し、そして９５％ＥｔＯＨを添加して果実を覆った。顕微鏡を使用して観察し、
そして果実の各々のスライス上のＧＵＳフォーカスの数を計数した。図７は、Ｇ
ＵＳレポーターアッセイの結果を示し、ＧＵＳフォーカスを有するバナナ果実の
スライスの割合として表す。

【０１５４】 （実施例２） （バナナ果実関連ＰＥＬプロモーターの単離） ｃＤＮＡライブラリーを、熟したバナナ果肉から単離したＲＮＡを使用して作
製した。全バナナＲＮＡを、Ｃｌｅｎｄｅｎｎｅｎ ａｎｄ Ｍａｙ（１９９７
）におけるプロトコールを使用して、バナナ果肉組織（ＰＣＩ ４）から抽出し
、そして、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、Ｓｔｒａｉｇｈｔ Ａ’ｓ ｍＲＮＡ Ｉｓ
ｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ［Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉ
ｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ］を使用して、１７μｇのＤＮａｓｅ処理した全Ｒ
ＮＡから単離した。ライブラリーを、製造業者のプロトコールに従って、Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ’ｓ Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．：Ｍａｒａｔ
ｈｏｎ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ
，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９４３０３−４２３０］を使用して作製した。簡潔に
は、第１鎖ｃＤＮＡおよび第２鎖ｃＤＮＡ合成後、アダプターを、二本鎖ｃＤＮ
Ａの平滑末端へ連結した。このｃＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡの５’末端ま
たは３’末端高速増幅のためのＰＣＲアクセス可能なライブラリーとして機能し
た。

【０１５５】 ｃＤＮＡ５’末端高速増幅（５’ＲＡＣＥ）反応を、アダプター特異的および
ＰＥＬ１遺伝子特異的（ＰＥＬ ３’Ｒ−２、配列番号２７）オリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いて行った。バナナＰＥＬ１ ｃＤＮＡの５’末端を、製造業
者が示唆するＲＡＣＥ増幅についての条件（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して増幅
した。約９００ｂｐの５’ＲＡＣＥ産物を単離し、クローニングし、そして配列
決定した。推定転写開始部位を同定し、そして遺伝子特異的オリゴヌクレオチド
をバナナゲノムライブラリーの上流にウォーキングするように設計した。

【０１５６】 ペクチン酸リアーゼ（ＰＥＬ）果実関連プロモーターを、一連の工程において
単離した。ＰＣＲアクセス可能なゲノムライブラリーをＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｕｎ
ｉｂｅｒｓａｌ ＧｅｍｏｎｅＷａｌｋｅｒ Ｋｉｔ［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ］
を使用して、バナナゲノムＤＮＡから作製した。製造業者から示唆されたプロト
コールに従って、５つの平滑カッター制限酵素を、別々に使用して、ゲノムバナ
ナＤＮＡを消化した：ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩ、ＳｃａＩおよびＳｔ
ｕＩ。一旦精製して、消化したＤＮＡフラグメントを、キット中に供給されるア
ダプター末端へ連結した。これは、ＰＥＬ１開始コドンのゲノムの上流配列の増
幅のためのＰＣＲアクセス可能なライブラリーとして機能する。

【０１５７】 ２つの遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＰＦＢＡＮ３’Ｒ、配列番号２８お
よびＰＦ Ｐｅｃ ３’Ｒ、配列番号２９）を、ネスト化プライマー反応におい
て使用し、そして約２．５ｋｂの推定プロモーターフラグメントをＳａｃＩ消化
したゲノムバナナライブラリーから増幅した。このグフラグメントをクローニン
グし、そして完全に配列決定した。

【０１５８】 ＰＥＬ１の２．５ｋｂプロモーターフラグメントを、レポーター遺伝子構築物
中のＧＵＳと翻訳的融合物としてサブクローン化した。これを、５’末端Ｐｓｔ
Ｉおよび３’末端ＳｎａＢＩ部位で操作した。２．５ｋｂのＰＥＬ１プロモータ
ーフラグメントのプロモーター機能をアッセイすることに加えて、一連の５’欠
失を、２．５ｋｂのＰＥＬ１の上流配列から生成した。ＰＥＬ１欠失を、Ｓｐｈ
ＩおよびＳｐｅＩ制限酵素でクローン化したフラグメントを制限することにより
作成し、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼ ＩＩＩ［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ］により酵素消化に対して感受性なイン
タクトな５’突出を残した。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ’ｓ Ｅｘ
ｏ−Ｓｉｚｅ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ，［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ］において提供される刊行されたプロトコール
に従って、消化を、２μｌの３７℃のＤＮＡ／Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼ
混合物を除去することにより、２０秒の間隔で停止した。アリコートを、リョク
トウヌクレアーゼを含む管に移し、そして１５分間３７℃でインキュベートした
。リョクトウヌクレアーゼ［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖ
ｅｒｌｙ，ＭＡ］で消化することにより、任意の残渣の突出を除去し、平滑末端
を残した。次いで、切断されたフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで自己連
結し、環状プラスミドを再生した。ＧＵＳとの翻訳的融合における２．０、１．
４および０．９ｋｂの切断されたＰＥＬ１プロモーターフラグメントを、この方
法により生成した。ＧＵＳレポーター構築物ｐＡＧ１２４ａに存在する場合の２
．０ｋｂのＰＥＬプロモーターの完全ヌクレオチド配列を図５Ａおよび図５Ｂに
示す。１．４および０．９ｋｂの切断物の５’末端もまた、その図に示す。ＰＥ
Ｌ２．０ｋｂのプロモーターの配列を図３Ａおよび図Ｂならびに配列番号３とし
て表す。ＰＥＬの１．４および０．９ｋｂのプロモーターは、各々、配列番号３
として表されるＰＥＬの２．０ｋｂのプロモーター配列のヌクレオチド５６４〜
２０１０および１０９９から２０１０に対応する。

【０１５９】 （植物形質転換ベクターおよびレポーター構築物を使用するバナナＰＥＬプロ
モーター活性） 上記の２．５ｋｂのＰＥＬ１プロモーターフラグメントを生成し、２．０、１
．４および０．９ｋｂのＰＥＬ１プロモーターフラグメントとして切断し、適切
な突出末端を生成するように設計し、そしてＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）と
反訳的に融合されたプロモーターからなるレポーター遺伝子構築物中の適合する
部位へクローン化した。このレポーター遺伝子構築物は、ｎｏｓターミネーター
を含む。２．０、１．４および０．９ｋｂのＰＥＬ１プロモーターフラグメント
を含む、得られた構築物を、各々、ｐＡＧ１４２ａ−ｐｅｌ：：ＧＵＳ（２．０
ｋｂ），ｐＡＧ１４２ｂ−ｐｅｌ：：ＧＵＳ（１．４ｋｂ）およびｐＡＧ１４２
ｃ−ｐｅｌ：：ＧＵＳ（０．９ｋｂ）と命名した。ＰＥＬ１フラグメント（２．
０、１．４および０．９ｋｂ）は、各々、配列番号３のヌクレオチド１〜２０１
０、５６４〜２０１０および１０９９から２０１０と一致した。

【０１６０】 バナナ果実を、上記のようにパーティクルボンバートメントのために調製した
。ｐＡＧ１４２−ｐｅｌ：：ＧＵＳ（２．５ｋｂ）、ｐＡＧ１４２ａ−ｐｅｌ：
：ＧＵＳ（２．０ｋｂ）、ｐＡＧ１４２ｂ−ｐｅｌ：：ＧＵＳ（１．４ｋｂ）、
ｐＡＧ１４２ｃ−ｐｅｌ：：ＧＵＳ（０．９ｋｂ）、ｐＡＧ１５３−ＣｓＶＭＶ
：：ＧＵＳ、ｐＡＧ１５９−ＴＲＸ：：ＧＵＳおよびｐＢＩ２２１−３５Ｓ：：
ＧＵＳの組換え核酸構築物を、パーティクルボンバートメントにより、バナナ組
織中に別々に導入した。種々の構築物中のバナナ果実関連プロモーターの相対活
性を、ＧＵＳレポーター発現に基づく一過性アッセイ系により決定した。図７は
、ＧＵＳレポーターアッセイの結果を示し、ＧＵＳフォーカスを有するバナナ果
実のスライスの割合として表す。

【０１６１】 （実施例３） （メロンアクチンプロモーターの単離および特徴付け） ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｄ８８４１４、ワタ：Ｄ７８２０６、アサガオ：Ａ
Ｂ００２８１９、ハッカ：Ｘ６７６６６、エンドウ：Ｕ６０４８３、ジャガイモ
：Ｕ６０４９６、ダイズ：Ｕ６０４８９、タバコおよびＵ６０４７８、トマトに
おいて見出されるヌクレオチド配列を含む、ＧｅｎＢａｎｋからのいくつかの植
物アクチンヌクレオチド配列を選択し、初期パラメータでのＣｌｕｓｔａｌ−Ｗ
プログラムを用いて整列し、そしてこのコード配列中の保存領域を同定した。オ
リゴヌクレオチドプライマーを、この保存領域に対して相補的に合成し、そして
植物ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ（ｇｅｎＤＮＡ）テンプレートの両方に由来の
アクチンフラグメントを増幅するために使用した。これらのプライマー、ＡＣＴ
ＩＮ ５’Ｆ（配列番号３０）およびＡＣＴＩＮ ３’Ｒ（配列番号３１）はイ
ントロン３にまたがり、これは得られたＰＣＲ産物の５’末端に存在し、そして
多くの異なる単子葉植物および双子葉植物（リンゴ、バナナ、サクランボ、ブド
ウ、レタス、トウモロコシ、メロン、エンドウ、キイチゴ、タバコ、およびトマ
トが挙げられる）由来のｇｅｎＤＮＡおよびｃＤＮＡテンプレートを効果的に増
幅した。

【０１６２】 メロンにおいて、ゲノムＰＣＲフラグメントは対応するＲＴ−ＰＣＲ産物より
もわずかに大きく、ゲノムフラグメント中の小さなイントロンの存在と一致する
。メロンのゲノムＰＣＲフラグメントおよびＲＴ−ＰＣＲフラグメントを配列決
定し、そしてこの配列が、単一イントロンの存在を除いて同一であり、以前「イ
ントロン３」と命名したイントロンに一致することを決定した。メロンにおいて
、イントロンは８７ｎｔ長であり、そしてメロンと他の植物種との間で保存され
ていない。

【０１６３】 コード配列およびイントロン配列の両方を使用して、相補的なネスト化（ｎｅ
ｓｔｅｄ）オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、メロンアクチンコード配列
の上流のフラグメントを増幅する。このプライマーは、メロンＤｒａＩプロモー
ターファインダ（ｆｉｎｄｅｒ）ライブラリーから、１．６ｋｂのフラグメント
を増幅した。このフラグメントをクローニングし、そして配列決定した。このメ
ロンアクチンゲノムフラグメントは、翻訳開始部位の上流の５’隣接配列の約５
４０ｂｐ、および１ｋｂの転写配列を含み、この転写配列はエキソン１、２、お
よび３の一部分、ならびにイントロン１および２を含む。翻訳開始部位を、メロ
ンｃＤＮＡからのアクチン転写物の５’ＲＡＣＥフラグメントの増幅および配列
決定によって推定した。他の植物アクチンプロモーターにおいて特徴付けられた
機能的モチーフと相同性を有する上流エレメントもまた同定した。

【０１６４】 上流調節領域を含むメロンアクチン遺伝子フラグメントを増幅するために使用
されるオリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＦ１（配列番号３２）、ＰＦ２（配
列番号３３）、アクチンＰＦｂ（配列番号３４）、アクチンＰＦｃ（配列番号３
５）およびＭＡＣＴＰ ｉｎｔｌ（配列番号３６）を含んだ。

【０１６５】 翻訳開始部位までおよび翻訳開始部位を含む、メロンアクチンプロモーターの
完全ヌクレオチド配列を、図４に示す。５’ＲＡＣＥ産物の特徴付けによって推
定される転写開始部位は、配列において＋１と示され、−４７に推定ＴＡＴＡボ
ックスを配置する。図４において下線で示される特徴は、−４７で推定ＴＡＴＡ
ボックス、イネアクチンプロモーターにおいてｎｔ位置−１９０と−１４０との
間に同定されたポリ（ｄＡ−ｄＴ）領域に類似した、メロンアクチンプロモータ
ー中のＡ富化領域であるヌクレオチド−２５１〜−２０５を含む。このイネアク
チンポリ（ｄＡ−ｄＴ）は、構成的発現のための強力な正の調節領域として作用
することが示された（Ｗａｎｇら、１９９２）。ヌクレオチド−１８５から−１
４６は、Ａｒａｂｉｄｏｐｉｓｉｓ ＡＣＴ２およびＡＣＴ８の５’隣接配列中
の−１５０とＴＡＴＡボックスとの間の領域と類似した領域を構成する（Ａｎら
、１９９６）。この領域は、２つのＡｒａｂｉｄｏｐｉｓｉｓアクチン遺伝子フ
ァミリーメンバーの間で高度に保存され、そして機能性エレメントの位置を示し
得る。ヌクレオチド−１１９〜−９６の下線領域は、短い直列反復［４Ｘ（ＧＣ
ＡＴＴＴ）］、Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＲＦ内、
ならびにＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＡｒａｂｉｄ
ｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａゲノムの非コード領域に存在する配列モチーフを
示す。モチーフ（−８４〜−５１）は、ジヌクレオチド反復［１８Ｘ（ＣＴ）］
を含む領域であり、このモチーフはまた、ダイズＡｃ７遺伝子の５’隣接領域に
も存在する。（−１１９〜−９６）および（−８４〜−５１）の反復は、機能は
未知である。

【０１６６】 このメロンアクチンプロモーター配列は、イネ（単子葉植物モデル）およびＡ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（双子葉植物モデル）の両方の強力な構成的アクチンプロ
モーターに対する類似性を示し、そしてまたダイズＡｃ７アクチン遺伝子の５’
隣接配列とも類似性を示す。メロンアクチンプロモーターは、イネアクチンプロ
モーターに存在する推定根関連発現エレメント（ＣＣＣＡＡ反復）を含まず、そ
してまた独特の配列モチーフを含む。ヌクレオチド配列レベルでのこの類似性を
表２に要約し、これは、メロンアクチンプロモーターと比較した、構成的なイネ
（単子葉植物）、Ａｒｂｉｄｏｐｓｉｓおよびダイズ（双子葉植物）アクチンプ
ロモーターにおける配列モチーフの分布を示す。存在する場合、配列モチーフの
おおよその位置は、転写開始部位と相対的に示される。

【０１６７】

【表２】 （ｍＡＣＴＩＮのプロモーター活性） ゲノムＤＮＡから翻訳開始部位（「ｍＡＣＴＩＮ」）まで増幅されたメロンア
クチンフラグメントを、作動可能に連結された異種遺伝子の発現を促進するその
能力を試験するために、サブクローニングした。構築物ｐＡＧ１６７は、ＧＵＳ
をコードするｕｉｄＡレポーター遺伝子との翻訳融合物としてクローンされる全
長（１．５ｋｂ）メロンアクチン上流ゲノムフラグメントを含む。このｐＡＧ１
６７ＧＵＳレポーター遺伝子構築物は、ｐＵＣベクターに含まれる。この構築物
ｐＡＧ４０１５は、ｎｐｔＩＩ遺伝子の発現を制御し、そしてカナマイシン耐性
を与えるＣｓＶＭＶプロモーターからなる選択カセットと共に、ＧＵＳをコード
するレポーター遺伝子に作動可能に連結された（翻訳融合物として）全長メロン
アクチンプロモーターを含む。この構築物は、ｐＰＺＰ２０００バイナリーベク
ター内に含まれる。

【０１６８】 （レポーター構築物を使用する植物形質転換ベクターおよびメロンアクチンプ
ロモーターの活性） （バナナ） ｍＡＣＴＩＮのプロモーター活性を、「ｐＡＧ１６７」と示された構築物（ｍ
ＡＣＴＩＮ−ＧＵＳ）を使用して、バナナ胚形成懸濁細胞中で試験した。Ｂｏｙ
ｃｅ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ＢＴＩ（Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ）でアッセイを行い、ここで、ｐＡＧ１
６７を、バナナの胚形成懸濁細胞をボンバードメントするために使用し、そして
以下に記載のボンバードされた組織からのタンパク質抽出物において、相対的Ｇ
ＵＳ活性を測定した。これらのアッセイの結果が、ｐＡＧ１６７によるＧＵＳの
レベルが、ＣａＭＶ３５５コントロールのレベルに匹敵することを示した。

【０１６９】 ２つの７日齢ＧＮ胚形成懸濁細胞（Ｍｕｓａ ａｃｕｍｉｎａｔａ ｃｖ Ｇ
ｒａｎｄ Ｎａｉｎ：ＥＳ２３およびＥＳ３５）は、Ｎｉｃｏｌｅ Ｈｉｇｇｓ
によって提供された。細胞懸濁液をプールし、そして粗い篩を通して濾過し、そ
して充填されたセルの容量（約１：６の液体容量）まで希釈した。再懸濁された
細胞の４００μｌの容量を、固体培地上のＷｈａｔｍａｎフィルターディスク上
に分散し、そして２日間標準増殖条件下で保存した（合計６６プレート）。ボン
バードに使用された試験プラスミドは、ｐＡＧ１６７（ｍＡＣＴＩＮ−ＧＵＳ）
およびコントロールプラスミド（ｐＣａＭＶ３５Ｓ−３５Ｓおよびｐｍａｉｚｅ
Ｕｂｉ−ＧＵＳを含む）を含み、それらはカリフラワーモザイクウイルス３５
Ｓプロモーターおよびｍａｉｚｅユビキチンプロモーターの転写制御下で、それ
ぞれＧＵＳをコードするｕｉｄＡ遺伝子を含んだ。ボンバードについて、金粒子
を２μｇの各試験構築物のＱＩＡＧＥＮ ｐｕｒｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡで
コーティングした。６プレートのＧＮ細胞を構築物ごとにボンバードした（１０
μｌ Ａｕ：ＤＮＡ混合物、８００ｐｓｉ）。６のＧＮプレートを、ボンバード
しないネガティブコントロールとしてわきにおいた。ボンバードの２日後、ＧＵ
Ｓ活性（Ｘ−ｇｌｕｃ）について構築物あたり１枚のプレートを組織化学的に分
析した。ボンバードの３日後、タンパク質の全体を、構築物あたり残りの５枚の
プレートより抽出した（合計５５プレート）。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏ
ｒｄアッセイを使用して各抽出物について評価し、そしてタンパク質の全体の５
０μｇをＧＵＳ蛍光アッセイ（４−ＭＵ）に使用した。ＧＵＳ蛍光アッセイは、
プロモーター活性の直接の定量的な比較を可能にする。Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ Ｆｌｕｏｒｏｌｉｔｅ １０００（Ｒｅｆ値３：１７７０、ラ
ンプ電位６．９）を使用して蛍光を測定した。この結果を、平均蛍光シグナルユ
ニットおよび標準偏差として表３に示す。蛍光定量的アッセイと非常に相関する
ＧＵＳ染色の結果、すなわちｐＡＧ１６７のみが、有意なＧＵＳ発現を示した（
ｕｂｉおよびＣａＭＶ３５Ｓコントロールと比較して）。

【０１７０】 （表３．バナナ胚形成懸濁細胞におけるＧＵＳ活性）

【０１７１】

【表３】 （Ａｌｌｉｕｍでの方法および結果） さらに、ｍＡＣＩＮプロモーターを、Ａｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．（ニンニク、Ａ
ｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍおよびタマネギ、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）におけ
るプロモーター活性についてアッセイした。組織化学的ＧＵＳ染色に続いて、種
々のレポーター構築物でタマネギおよびニンニク標的組織をボンバードした。

【０１７２】 ニンニクおよびタマネギの地域市場品種を遺伝子発現の研究のための標的組織
として使用した。パーティクルボンバードメントのための組織を調製するために
、乾燥外皮（ｐｕｔｅｒ ｐｅｅｌｓ）をタマネギ鱗茎、およびニンニク小鱗茎
（ｃｌｏｖｅ）より除去した。それらは、エタノールおよび漂白剤を使用して変
更された滅菌手順によって表面を滅菌され、ここでニンニクおよびタマネギは皮
を剥がれ、９５％エチルアルコールに浸されたタオルでふき取られ、ビーカー内
に置かれる。ビーカーにこれらのサンプルを覆うのに十分な量の水／セッケン混
合物を添加し、直ぐに１０分間振盪し、次いでｄｉＨ₂Ｏでセッケンがなくなる
までリンスする。次いで、７５％のＥｔＯＨを添加し、ニンニクまたはタマネギ
サンプルをカバーし、サンプルは各４分間穏やかに振盪され、次いでＥｔＯＨを
排出し、続いてサンプルをカバーするために十分量の１０％漂白剤／２滴のＴｗ
ｅｅｎ２０／１０００ｍｌを添加し、続いて１０分間の断続的に振盪する。次い
で、漂白剤を排出し、サンプルを滅菌したｄｉＨ₂Ｏで３回リンスし、そして一
度滅菌した５００ｍｌのｄｉＨ₂Ｏ／２ｍｌのＰＰＭ ｍｉｘ（Ｐｌａｎｔ Ｐ
ｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ Ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ）でリンスした。これらのサンプルを
同日にカットし、ボンバードした。

【０１７３】 インビボで青ネギの葉に特異的な滅菌手順は、７０％ＥｔＯＨ中で３０秒間、
葉を穏やかに攪拌する工程、そのＥｔＯＨを排出する工程、Ｔｗｅｅｎ２０を含
む１０％漂白剤中で１分間、葉を穏やかに攪拌する工程、漂白剤を排出する工程
、滅菌水で３回リンスする工程、そして２ｍｌのＰＰＭ（５００ｍｌの滅菌水中
）で１回リンスする工程を包含する。この前に、葉をセグメントにカットし、そ
してそれらをＰＡＣ１培地上で反対軸側に（ａｂａｘｉａｌ ｓｉｄｅ ｕｐ）
（外側に（ｅｘｔｅｒｉｏｒ ｓｉｄｅ ｕｐ））プレートした。サンプルをカ
ットし、そして同日にボンバードした。

【０１７４】 カッティングの後、ニンニクまたはタマネギサンプルを以下：ＭＳ塩、ビタミ
ンＢ５、グリシン ２ｍｇ／ｍｌ、スクロース３ ％、カゼイン加水分解産物
１００ｍｇ／ｌ、ＢＡ ０．５ｍｇ／ｌ、２，４−Ｄ １．５ｍｇ／ｌ、ＰＰＭ ５ｍｇ／ｌ、アスコルビン酸 １００ｍｇ／ｌ、クエン酸 １００ｍｇ／ｌ、
セフォタキシム ２００ｍｇ／ｌ（ａａ）ｐＨ ５．８およびファイタゲル（Ｐ
ｈｙｔａｇｅｌ）０．２５を含むＰＡＣ培地上にプレートした。

【０１７５】 試験されたニンニク組織の型としては、以下：（１）長軸方向で半分にカット
されたニンニク小鱗茎の外側；（２）小鱗茎の断面スライス；および（３）長軸
方向で半分にカットされたニンニク小鱗茎の内側、が挙げられる。１４〜２２片
のニンニクを試験された各構築物についてボンバードした（ｐＡＧ１６７（ｍＡ
ＣＴＩＮ）を除いて）。ｐＡＧ１６７（ｍＡＣＴＩＮ）については、６片のみが
ボンバードされた。

【０１７６】 試験されたタマネギ組織の型としては、以下：（１）大きな白色タマネギの鱗
茎のリング（ｒｉｎｇ）の外側；（２）大きな白色タマネギの鱗茎のリングの内
側；（３）大きなタマネギの鱗茎の断面スライス；（４）長軸方向で半分にカッ
トされた青ネギの鱗茎の外側；（５）長軸方向で半分にカットされた青ネギの鱗
茎の内側；（６）青ネギの鱗茎の断面スライス；（７）青ネギの向軸性葉セグメ
ント（内側）および；（８）青ネギの向軸性葉セグメント（外側）が挙げられる
。１４〜２０片のタマネギを、全ての構築物についてボンバードした（ｐＡＧ１
６７（ｍＡＣＴＩＮ）を除いて）。ｐＡＧ１６７（ｍＡＣＴＩＮ）については、
４片のみがボンバードされた。

【０１７７】 ＰＤＳ １０００／Ｈｅ ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｇｕｎ（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ）および金粒子を使用して（バナナについて上記されるように）パーテ
ィクルボンバードメントを行った。種々のプロモーターの転写制御下でのＧＵＳ
遺伝子を含む４つの異なるプラスミド構築物は以下：ｐＡＧ１３８ｍ−ＲＥ４：
：ＧＵＳ、ｐＡＧ１４７−プロモーターなし（ｐｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓ）ＧＵ
Ｓ（制御エレメントを含まないＧＵＳ遺伝子を含み、そしてネガティブコントロ
ールとして役立つ）、ｐＡＧ１５３−ＣｓＶＭＶ：：ＧＵＳ（ＣｓＶＭＶプロモ
ーターを含み、そしてポジティブコントロールとして役立つ）、ｐＡＧ１６７−
ｍＡＣＴＩＮ：：ＧＵＳおよびＰＢＩ２２１−３５Ｓ：：ＧＵＳ（ＣａＭＶプロ
モーターを含み、ポジティブコントロールとして役立つ）を含むと評価された（
実施例３を参照のこと）。

【０１７８】 ボンバードおよび暗所でのインキュベーションの後、サンプルを３７℃で１８
時間、Ｘ−ｇｌｕｃ溶液で処理した。青いＧＵＳフォーカスを、倒立顕微鏡を使
用してスコアした。ニンニクおよびタマネギの組織のボンバードからまとめた結
果を図８ＡおよびＢにそれぞれ表す。青いフォーカスを全てのＸ−ｇｌｕｃ処理
された組織において観察した（プロモーターなしＧＵＳでボンバードされたネガ
ティブコントロールを除いて）。青いフォーカスは、ニンニクの小鱗茎およびタ
マネギの鱗茎（タマネギのリング）の外側で容易にスコアされ得る。Ａｌｌｉｕ
ｍ種に関連して以前に記載された内因性の青の問題（Ｂａｒａｎｄｉａｒａｎら
、１９９８）は、本研究の問題を引き起こさなかった。しかし、ＧＵＳの発現に
起因する青いフォーカスは、周囲の青い影とは明確に異なった。それぞれニンニ
クおよびタマネギにおけるコントロールプロモーターを用いた例示的なＧＵＳア
ッセイの結果についての図９Ａ〜Ｄおよび図１０Ａ〜Ｄに見られるように、明確
に異なった。

【０１７９】 ニンニクにおいて、ネガティブコントロール（プロモーターの無いＧＵＳ）は
、フォーカスを示さなかったが、他の試験された全てのプロモーターは、フォー
カスを示した（図８Ａ）。ｍＡＣＴＩＮプロモーターの制御下のＧＵＳを含む構
築物でボンバードされた組織は、最も高い割合（１００％）のＧＵＳフォーカス
を有するスライスを示した。ＣｓＶＭＶプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモー
ターおよびＲＥ４プロモーターの制御下のＧＵＳを含む構築物でボンバードされ
た組織は、それぞれ８６％、６８％、および３１％のフォーカスを有するスライ
スを示した。

【０１８０】 タマネギにおいて、ネガティブコントロール（プロモーターの無いＧＵＳ）は
、タマネギ球根または青ネギ葉において全くフォーカスを示さなかったが、試験
された他の全てのプロモーターは、フォーカスを示した（図８Ｂ）。ｍＡＣＴＩ
Ｎプロモーターの制御下のＧＵＳを含む構築物でボンバードされた組織は、試験
されたサンプルの数に基づいて、最も高い割合（１００％）のＧＵＳフォーカス
を有するスライスを示した。ポジティブコントロールＣａＭＶ３５Ｓプロモータ
ーは、９０％のフォーカスを有するスライスを示し、続いてＣｓＶＭＶは８８％
のフォーカスを有するスライス、そしてＲＥ４は８１％のフォーカスを有するス
ライスを示した。

【０１８１】 青ネギの葉部分のボンバードは、ｍＡＣＴＩＮプロモーターおよびＣａＭＶ３
５Ｓプロモーターの両方について１００％のＧＵＳフォーカスを有する部分を生
じ、ＣａＶＭＶプロモーターについては９３％のＧＵＳフォーカスを有する部分
を生じ、そしてＲＥ４プロモーターについては、３１％のＧＵＳフォーカスを有
する部分を生じた（図８Ｂ）。

【０１８２】 要約すると、ｐＡＧ１５３（ＣｓＶＭＶ）およびｐＡＧ１６７（ｍＡＣＴＩＮ
）は、ニンニク小球根およびタマネギ球根において、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ
ー（ｐＢＩ２２１）よりもＧＵＳの発現が強いということを実証した。青ネギ葉
において、ｐＡＧ１５３（ＣｓＶＭＶ）およびｐＡＧ１６７（ｍＡＣＴＩＮ）の
制御下でのＧＵＳ発現は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（ｐＢＩ２２１）の発現
と同様であった。

【０１８３】 （安定なＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの形質転換） ｍＡＣＴＩＮプロモーターをまた、ｍＡＣＴＩＮプロモーターの制御下で、Ｇ
ＵＳをコードするレポーター遺伝子を含む核酸構築物を用いて形質転換した後に
、モデル双子葉植物（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）における活
性について試験した。構築物ｐＡＧ４０１５は、２つの発現カセットを含む：選
択カセットは、Ｔ−ＤＮＡの左縁に隣接して見出され、ＣｓＶＭＶプロモーター
およびＧ７ターミネーターの制御下の、カナマイシン耐性を与えるｎｐｔＩＩ遺
伝子を含み；そしてｍＡＣＴＩＮプロモーターおよびｎｏｓターミネーターの制
御下のＧＵＳレポーター遺伝子は、Ｔ−ＤＮＡの右縁に隣接して見出される。

【０１８４】 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｃｏｌ−０生態型）植物は、日
長条件（１６時間日長）下で土壌において生長した。最初の花序を、側生花序の
生長を促進するために、植物から刈り取り、そして植物をこの刈り取りの６日後
に形質転換した。ヘルパープラスミドｐＭＰ９０ＲＫを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ株ＧＶ３１０１を、エレクトロポレーションによりｐＡＧ４０１５で形
質転換する。これらの植物を、ＣｌｏｕｇｈおよびＢｅｎｔ（Ｐｌａｎｔ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ １６：７３５−７４３，１９９８）により記載される植物内（ｉｎ
ｐｌａｎｔａ）形質転換方法に従って形質転換した。簡単には、ｐＡＧ４０１
５を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物を、１．５〜２．５のＯＤ₆₀₀まで
増殖させた。この細胞を遠心分離により収集し、そして再懸濁して５％のスクロ
ース、０．０４％のＳｉｌｗｅｔ Ｌ−７７、１０ｍＭ ＭｇＣｌおよび４４ｎ
Ｍ ６−ベンジルアミノプリンを含む浸水培地中で約０．８０のＯＤ₆₀₀とした
。これらの植物を、細胞懸濁物中に１５分間倒置し、次いでこれらの植物を鐘形
おおいの下でその脇に置いて高湿度を維持した。これらの植物を、長角果が、褐
色になり、乾燥するまで、５週間生長させた。Ｔ１種子を植物から採取し、表面
を滅菌し、そして１／２ＭＳ培地、０．７％Ａｇａｒおよび５０μｇ／ｍｌカナ
マイシン一硫酸を含むプレート上で発芽させた。形質転換された実生苗を、カナ
マイシン一硫酸に対する耐性として同定した。ＧＵＳ活性についての組織化学的
染色を、発生の異なる段階における形質転換体に対して行った。実生苗を最初の
２つの本葉の形成の際（１０日）にアッセイした。植物をまた、ロゼット（６〜
８枚の葉）の形成後、および開花（約４週間）の際に染色した。染色については
、植物を１ｍｌのＸ−ｇｌｕｃ（１０ｍＭ ＥＤＴＡ二ナトリウム塩；１００ｍ
Ｍ ＮａＨ₂ＰＯ₄・３Ｈ₂Ｏ；０．５ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ６）・３Ｈ₂Ｏ；０．
１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；０．０５％ ｘ−ｇｌｕｃ；１％ ＤＭＳＯ）
中に置き、そして３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。インキュベート
の後、これらの植物を残余の染料および植物色素を取除くまで、９５％ＥｔＯＨ
で３回リンスし、次いで染色された組織を写真に撮った。

【０１８５】 ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるＧＵＳレポーター遺伝子活性についての染色
の結果（図１１Ａ〜Ｄに示される）は、ｍＡＣＴＩＮプロモーターが、組織化学
的染色により決定されたように、ＧＵＳ染色が根において特に明らかであり（図
１１Ｂ）、実生苗において強力なレポーター遺伝子発現させるということを示す
。ロゼットの形成後、後期発生葉よりも子葉、初期本葉および根においてより強
く青い染色が明らかであった（図１１Ｃ）。成熟葉において、ｍＡＣＴＩＮプロ
モーターはまた活性であり（図１１Ｄ）、葉ならびに花において強く組織化学的
染色される。

【０１８６】 （実施例４） （改変メロンＡｃｔｉｎ／ＴＲＸ融合プロモーターの構築） バナナ果実特異的ＴＲＸプロモーターの２つの改変形態を、（１）単子葉植物
イントロンをバナナＴＲＸプロモーターの３’末端に付加すること、および（２
）バナナＴＲＸプロモーターとメロンアクチンプロモーターとをＴＡＴＡボック
スにおいて融合させることににより、構築した。

【０１８７】 （付加した単子葉植物イントロンを有するＴＲＸプロモーター） ＴＲＸプロモーターに対する第１の改変は、トウモロコシＯ２遺伝子からバナ
ナ果実特異的ＴＲＸプロモーターの３’末端に操作されたＮｃｏＩ部位までのイ
ントロン３を含むＤＮＡフラグメントの付加を含む。このイントロン３がヌクレ
オチド３０２０〜３１０５の間にある、トウモロコシＯ２遺伝子の完全ヌクレオ
チド配列を、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ１５５４４から得た。トウモロコシＯ２
イントロン３は、代表的な単子葉植物イントロンであり：このイントロンは、わ
ずか８３ｎｔと短く；Ａ＋Ｕに富み（６０％）；そして適切なコンセンサススプ
ライス部位を含む。オリゴヌクレオチドを、トウモロコシＯ２イントロン３を増
幅するように設計し、次いでこれをＮｃｏＩ部位にＴＲＸプロモーターの３’末
端においてサブクローニングする。トウモロコシＯ２イントロンを増幅するため
に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを、以下に列挙する。Ｏ２イントロ
ンを含む増幅産物を、中間ベクターにクローニングして、その同一性を確かめる
ために配列決定し，次いでＴＲＸプロモーターの３’末端へ操作されたＮｃｏＩ
部位に正しい方向でサブクローニングした。イントロンの付加の後、連結された
任意の遺伝子と関連する２つの潜在的なＡＴＧ開始コドンが存在し、１つはイン
トロンの各末端に存在する。この構築物を、付加されたＯ２イントロンが正確に
スプライスされる場合に、生じた転写物における上流ＡＴＧが、下流ＡＴＧとイ
ンフレームであるように設計した。このような場合、翻訳が上流ＡＴＧから開始
される場合、生じた融合タンパク質は、４つのさらなるアミノ酸（ＭＥＫＡ）を
Ｎ末端に含む。イントロンが正確にスプライスされない場合、上流ＡＴＧは、連
結された遺伝子とインフレームではないが、翻訳は、なお下流ＡＴＧから開始さ
れ得る。この場合、生じたタンパク質は、いかなるさらなるアミノ酸も含まない
。ＧＵＳレポーター遺伝子に融合されたＯ２イントロン改変ＴＲＸプロモーター
を、ｐＡＧ７５９と名付けた。ＴＲＸ−Ｏ２イントロン融合プロモーターの完全
ヌクレオチド配列を、図５Ａ〜Ｂ（配列番号５）に表す。

【０１８８】 バナナＴＲＸプロモーターの３’末端におけるＮｃｏＩ部位へのサブクローニ
ングのために、トウモロコシＯ２遺伝子のイントロン３を増幅するために使用さ
れる、Ｏ２ｉｎｔ Ｆ（配列番号３７）オリゴヌクレオチドおよびＯ２ｉｎｔ Ｒ（配列番号３８）オリゴヌクレオチドを、表５において下線を付して示される
サブクローニングのために配列に操作されるＮｃｏＩ部位と共に以下に示す。

【０１８９】 ＴＲＸ果実特異的プロモーターへの別個の改変において、バナナＴＲＸプロモ
ーターをメロンアクチンプロモーターとＴＡＴＡボックスで融合して、配列番号
６として示される配列を有する融合プロモーターを得た。両方のプロモーターは
、同じ、植物規定ＴＡＴＡボックス（ＴＡＴＡＡＡ）を含んだ。このＴＡＴＡボ
ックスを使用して、両方のプロモーター間でその部位で完全な融合を実施した。
このプロモーター配列の両方に相補的なキメラオリゴヌクレオチドプライマー（
下記）を設計した。５’末端からＴＡＴＡボックスまでにバナナＴＲＸプロモー
ターを含むフラグメントを、１２３３（配列番号４２）および（Ａｃｔ）ＴＲＸ
＿Ｒ（配列番号４０）を使用してｐＡＧ１５９から増幅した。その産物は、約０
．８ｋｂであった。Ｔｈｉプロモーターフラグメントへの融合のために、メロン
アクチンフラグメントをｐＡＧ１６７から増幅した。この増幅には、ＧＵＳ５’
Ｒ（配列番号４１）および（ＴＲＸ）Ａｃｔ＿Ｆ（配列番号３９）およびＰＥ４
８０サーマルサイクラー：２５サイクル（９４℃、３０秒；６０℃、３０秒；７
２℃、９０秒）、１サイクル（７２℃、１０分）を使用した。メロンアクチンプ
ロモーター由来の１．２ｋｂフラグメントは、転写開始部位、５’非翻訳領域イ
ントロン、および連結された遺伝子のサブクローニングを容易にするためにＮｃ
ｏＩを含むように操作された翻訳開始部位を含んだ。これらのフラグメントは、
２１ヌクレオチドの相補的な重複領域（ＴＡＴＡボックス）を含んだ。この２つ
のフラグメントを、第２の増幅反応において組み合わせ、そして増幅用のエンド
プライマー（１２３３およびＧＵＳ５’Ｒ）ならびにＰＥ４８０サーマルサイク
ラー：２５サイクル（９４℃、３０秒；６０℃、３０秒；７２℃、１５０秒）、
１サイクル（７２℃、１０分）を使用することによって、融合した。生じた反応
産物をアガロースゲル上で分離し、そして正しい推定サイズのフラグメントをゲ
ル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏＩで消化し、ＧＵＳレポーター遺伝子を
含むベクターに連結し、そして名称ｐＡＧ７４９を得た。

【０１９０】 ＴＲＸ−メロンアクチン融合プロモーターを増幅およびアセンブルするために
使用したオリゴヌクレオチドは、（ＴＲＸ）Ａｃｔ＿Ｆ（配列番号３９）、（Ａ
ｃｔ）ＴＲＸ＿Ｒ（配列番号４０）、ＧＵＳ５’Ｒ（配列番号４１）および１２
３３（配列番号４２）を含んだ。

【０１９１】 （レポーター構築物を使用する、植物形質転換ベクターおよびメロンアクチン
／ＴＲＸ融合プロモーター活性） これらの改変されたＴＲＸプロモーターを、ＧＵＳをコードするレポーター遺
伝子を含む発現構築物中に（翻訳融合物として）クローン化し、ｐＡＧ７４９（
ＴＲＸ−アクチン：：ＧＵＳ）およびｐＡＧ７５９（ＴＲＸ−イントロン：：Ｇ
ＵＳ）と称する構築物を得た。これらの改変されたＴＲＸプロモーターを、上記
のバナナ果実スライス一過性発現アッセイにおいて、ＧＵＳ発現について試験し
た。

【０１９２】 使用したサンプルは、緑色の非エチレン処理果実（緑色）、２４時間のエチレ
ン処理した緑色の果実（ＰＣＩ １）、緑色の先端を有する黄色の果実（ＰＣＩ ４）または葉のいずれかであった。ＧＵＳ発現を促進する際のＴＲＸ−イント
ロン、ＴＲＸ−アクチン果実関連融合プロモーターおよびＣｓＶＭＶウイルスプ
ロモーターの相対活性を、組織化学的染色後にフォーカスを示す果実スライス（
図１２Ａ）およびバナナ果実スライスにおける果実スライスあたりのフォーカス
の平均数（図１２Ｂ）の両方のパーセントとして表現した。強力な構成的ＣｓＶ
ＭＶプロモーターを、ポジティブコントロールとして使用した。

【０１９３】 これらの改変されたＴＲＸプロモーターについての一過性発現の結果によると
、ＴＲＸ−イントロン改変物およびＴＲＸ−アクチン改変物は、バナナ果実特異
的ＴＲＸプロモーターに対して、改善された性能を有する。

【０１９４】 特に、ＴＲＸ−アクチン融合プロモーターは、強力な構成的プロモーターＣｓ
ＶＭＶとほぼ等しい一過性発現活性を示すが、ＴＲＸ−イントロン融合物は、平
均してわずかにより少ない活性である。さらに、ＴＲＸ−イントロンプロモータ
ーおよびＴＲＸ−アクチンプロモーターは、バナナの葉においてより少ない活性
を有する。このことは、これらのプロモーターがＴＲＸプロモーターの組織特異
性を保持したことを示す。

【０１９５】 表４．バナナおよびメロンのアクチンプロモーター含有核酸構築物

【０１９６】

【表４】 表５．本発明を支持して提供される配列

【０１９７】

【表５】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 図１Ａは、果実関連バナナＴＲＸプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号
２）を含む、バナナ果実関連ＴＲＸ（Ｇ１Ａ）遺伝子の注釈を付けた二本鎖ヌク
レオチド配列ヌクレオチド１〜２４５３（配列番号１）を示す。図は、コード配
列（大文字）、５’および３’非翻訳領域ならびにイントロン（小文字）を含む
、Ｇ１Ａ遺伝子の完全な配列を示す。オリゴヌクレオチドプライマー結合部位は
、配列の上部に示され、推定ＴＡＴＡボックスは、（ヌクレオチド８８４）に同
定され、翻訳開始部位は、（ヌクレオチド９８８）に同定され、翻訳停止コドン
は、推定ポリアデニル化シグナルと同様に（ヌクレオチド２３１９〜２３２１）
に同定される。

【図１Ｂ】 図１Ｂは、果実関連バナナＴＲＸプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号
２）を含む、バナナ果実関連ＴＲＸ（Ｇ１Ａ）遺伝子の注釈を付けた二本鎖ヌク
レオチド配列ヌクレオチド１〜２４５３（配列番号１）を示す。図は、コード配
列（大文字）、５’および３’非翻訳領域ならびにイントロン（小文字）を含む
、Ｇ１Ａ遺伝子の完全な配列を示す。オリゴヌクレオチドプライマー結合部位は
、配列の上部に示され、推定ＴＡＴＡボックスは、（ヌクレオチド８８４）に同
定され、翻訳開始部位は、（ヌクレオチド９８８）に同定され、翻訳停止コドン
は、推定ポリアデニル化シグナルと同様に（ヌクレオチド２３１９〜２３２１）
に同定される。

【図１Ｃ】 図１Ｃは、果実関連バナナＴＲＸプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号
２）を含む、バナナ果実関連ＴＲＸ（Ｇ１Ａ）遺伝子の注釈を付けた二本鎖ヌク
レオチド配列ヌクレオチド１〜２４５３（配列番号１）を示す。図は、コード配
列（大文字）、５’および３’非翻訳領域ならびにイントロン（小文字）を含む
、Ｇ１Ａ遺伝子の完全な配列を示す。オリゴヌクレオチドプライマー結合部位は
、配列の上部に示され、推定ＴＡＴＡボックスは、（ヌクレオチド８８４）に同
定され、翻訳開始部位は、（ヌクレオチド９８８）に同定され、翻訳停止コドン
は、推定ポリアデニル化シグナルと同様に（ヌクレオチド２３１９〜２３２１）
に同定される。

【図１Ｄ】 図１Ｄは、果実関連バナナＴＲＸプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号
２）を含む、バナナ果実関連ＴＲＸ（Ｇ１Ａ）遺伝子の注釈を付けた二本鎖ヌク
レオチド配列ヌクレオチド１〜２４５３（配列番号１）を示す。図は、コード配
列（大文字）、５’および３’非翻訳領域ならびにイントロン（小文字）を含む
、Ｇ１Ａ遺伝子の完全な配列を示す。オリゴヌクレオチドプライマー結合部位は
、配列の上部に示され、推定ＴＡＴＡボックスは、（ヌクレオチド８８４）に同
定され、翻訳開始部位は、（ヌクレオチド９８８）に同定され、翻訳停止コドン
は、推定ポリアデニル化シグナルと同様に（ヌクレオチド２３１９〜２３２１）
に同定される。

【図２】 図２は、レポーター遺伝子構築物ｐＡＧ１５９において生じるように、制限部
位を５’末端および３’末端に操作した、改変ＴＲＸプロモーター配列（配列番
号２）の一本鎖の描画である。ＢａｍＨＩ部位（ＧＧＡＴＣＣ）を５’末端に操
作し、そしてＮｃｏＩ部位（ＣＣＡＴＧＧ）を３’末端に操作した。翻訳開始コ
ドンは、３’ＮｃｏＩ部位に含まれるＡＴＧからなる。推定ＴＡＴＡボックスに
下線を付す。図２は、ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩの制限部位を図２の配列におい
て、それぞれ５’最末端および３’最末端に操作したことを除いて、図１の配列
のヌクレオチド１３〜９９０に対応する。

【図３Ａ】 図３Ａは、２．０ｋｂのＰＥＬ１プロモーター配列（配列番号５）の一本鎖の
描画である。１．４ｋｂおよび０．９ｋｂ短縮物（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）の５
’末端を、この図において、それぞれおよそヌクレオチド５６４および、およそ
ヌクレオチド１０９９に示す。ヌクレオチド２０１０の翻訳開始部位（ＡＴＧ）
終末は、太字である。

【図３Ｂ】 図３Ｂは、２．０ｋｂのＰＥＬ１プロモーター配列（配列番号５）の一本鎖の
描画である。１．４ｋｂおよび０．９ｋｂ短縮物（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）の５
’末端を、この図において、それぞれおよそヌクレオチド５６４および、およそ
ヌクレオチド１０９９に示す。ヌクレオチド２０１０の翻訳開始部位（ＡＴＧ）
終末は、太字である。

【図４】 図４は、翻訳開始部位までおよび翻訳開始部位を含む、メロンアクチンプロモ
ーター（「ｍＡＣＴＩＮ」）の完全なヌクレオチド配列を示す。５’ＲＡＣＥ産
物の特徴付けによって測定される翻訳開始部位を、この配列において＋１位とし
て示し、推定ＴＡＴＡボックスを−４７位に配置する。

【図５Ａ】 図５Ａは、バナナＴＲＸ／Ｏ２イントロン融合プロモーター（「ＴＲＸ−イン
トロン」または「ＴＲＸ−Ｏ２イントロン」）の完全なヌクレオチド配列を示す
。

【図５Ｂ】 図５Ｂは、バナナＴＲＸ／Ｏ２イントロン融合プロモーター（「ＴＲＸ−イン
トロン」または「ＴＲＸ−Ｏ２イントロン」）の完全なヌクレオチド配列を示す
。

【図６】 図６は、バナナＴＲＸ：メロンアクチン融合プロモーター（「ＴＲＸ−アクチ
ン」）の完全なヌクレオチド配列を示す。ＴＡＴＡボックス（ｎｔ ８９０〜８
９６）に太線を付す。サブクローニングに使用された制限部位に下線を付す。こ
れは、翻訳開始部位（ＡＴＧ）を囲むプロモーターの３’末端にＮｃｏＩ部位を
含む。

【図７】 図７は、ＧＵＳフォーカス（ｆｏｃｉ）を有する果実スライスのパーセンテー
ジとして示される、緑色食用バナナ果肉、成熟のＰＣＩ １およびＰＣＩ ４ス
テージにおけるＰＥＬ２．０ｋｂ（ｐＡＧ１４２ａ）、ＰＥＬ１．４ｋｂ（ｐＡ
Ｇ１４２ｂ）、ＰＥＬ０．９ｋｂ（ｐＡＧ１４２ｃ）、ＴＲＸ１．０（ｐＡＧ１
５９）およびＣｓＶＭＶプロモーター（ｐＡＧ１５３）を用いたＧＵＳレポータ
ーアッセイの結果を例示する。

【図８Ａ】 図８Ａは、ニンニク（小鱗茎の外側、図８Ａ）およびタマネギ（鱗茎の外側、
白色タマネギ；および、タマネギ葉、青ネギ、図８）におけるＧＵＳレポーター
構築物の相対的プロモーター活性を例示する。ＲＥ４プロモーター、プロモータ
ーなしのＧＵＳ、ＣｓＶＭＶ、ｍＡＣＴＩＮおよびレポーター遺伝子ＧＵＳとの
翻訳融合物にあるＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター構築物を、マイクロプロジェク
タイルボンバードメントによって、ニンニクおよびタマネギの組織に導入した。
結果を、フォーカス（ｆｏｃｉ）を有するスライスの％として、および１スライ
スあたりのフォーカスの平均数として報告する。

【図８Ｂ】 図８Ｂは、ニンニク（小鱗茎の外側、図８Ａ）およびタマネギ（鱗茎の外側、
白色タマネギ；および、タマネギ葉、青ネギ、図８）におけるＧＵＳレポーター
構築物の相対的プロモーター活性を例示する。ＲＥ４プロモーター、プロモータ
ーなしのＧＵＳ、ＣｓＶＭＶ、ｍＡＣＴＩＮおよびレポーター遺伝子ＧＵＳとの
翻訳融合物にあるＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター構築物を、マイクロプロジェク
タイルボンバードメントによって、ニンニクおよびタマネギの組織に導入した。
結果を、フォーカス（ｆｏｃｉ）を有するスライスの％として、および１スライ
スあたりのフォーカスの平均数として報告する。

【図９】 図９Ａ〜Ｄは、ニンニク（小鱗茎の外側）におけるＧＵＳ一過性アッセイの結
果を例示する。ここでＧＵＳ発現は、（Ａ）ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター；（
Ｂ）ＣｓＶＭＶプロモーター；（Ｃ）ＲＥ４プロモーター；および（Ｄ）プロモ
ーターなしのＧＵＳ構築物によって駆動される。

【図１０】 図１０Ａ〜Ｄは、タマネギ（鱗茎の外側）におけるＧＵＳ一過性アッセイの
結果を例示する。ここでＧＵＳ発現は、（Ａ）ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター；
（Ｂ）ＣｓＶＭＶプロモーター；（Ｃ）ＲＥ４プロモーター；および（Ｄ）プロ
モーターなしのＧＵＳ構築物によって駆動される。

【図１１】 図１１Ａ〜Ｄは、生育の種々の段階における非形質転換および形質転換Ａｒａ
ｂｉｄｏｐｓｉｓ組織の組織化学染色の結果を例示する。ここで（Ａ）は、ロゼ
ット段階の非形質転換Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ｃｏｌ−０生態型）を示し、こ
こでは全く可視的な青色染色は有さず；（Ｂ）は、ｍＡＣＴＩＮプロモーター−
レポーター遺伝子構築物ｐＡＧ４０１５で形質転換されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ実生を示し、これは、すべての組織（特に、根）の強い青色染色によって特徴
付けられ；（Ｃ）は、ロゼット段階のｐＡＧ４０１５形質転換Ａｒａｂｉｄｏｐ
ｓｉｓを示し、これは、後期発生葉よりも子葉、初期本葉および根において強い
青色染色を有し；そして（Ｄ）は、開花期のｐＡＧ４０１５形質転換Ａｒａｂｉ
ｄｏｐｓｉｓを示し、これは、茎において強い青色染色を有し、そして基部およ
び先端部で青色染色を有する花および長果においては、さほど強くない青色染色
を有する。

【図１２】 図１２Ａおよび１２Ｂは、バナナ果実スライスにおけるＧＵＳレポーター構築
物の相対的プロモーター活性を例示する。ＴＲＸ−イントロン（ｐＡＧ７５９）
およびＴＲＸ−アクチン（ｐＡＧ７４９）、レポーター遺伝子ＧＵＳを有する翻
訳融合物における果実関連融合プロモーターを、マイクロプロジェクタイルボン
バードメントによって、バナナ果実スライスに導入した。用いたサンプルは、緑
色非エチレン処理果実（緑色）、緑色果実（ただし、エチレン処理の２４時間以
内）（ＰＣＩ １）、緑色先端を有する黄色果実（ＰＣＩ ４）または葉のいず
れかであった。相対的なプロモーター活性を、一群あたり試験された３０個体の
サンプルについて、組織化学的染色後のフォーカス（ｆｏｃｉ）を示す果実スラ
イスのパーセンテージ（図１２Ａ）および果実スライスあたりのフォーカスの平
均数（図１２Ｂ）の両方として表す。強力な構成的ＣｓＶＭＶプロモーターを、
比較のためのポジティブコントロールをして使用した（ｐＡＧ１５３）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ケロッグ， ジル エイ． アメリカ合衆国 オレゴン 97210， ポ ートランド， エヌ．ダブリュー． アリ エル テラス 2816 (72)発明者 ファン， シャウ ビー． アメリカ合衆国 オレゴン 97206， ポ ートランド， エス．イー． 66ティーエ イチ アベニュー 3417 (72)発明者 マシューズ， ヘレナ ブイ． アメリカ合衆国 オレゴン 97229， ポ ートランド， エヌ．ダブリュー． ジョ セフ コート 14546 (72)発明者 ウェブ， ナンシー エム． アメリカ合衆国 オレゴン 97236， ポ ートランド， エス．イー． 147ティー エイチ アベニュー 3201 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AA03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 4B024 AA20 BA12 CA04 DA01 EA04 FA02 GA11 HA01 HA20 4B063 QA01 QQ43 QR32 QR55 QS34 4B065 AA89X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA31 CA53

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バナナ果実関連プロモーターをコードする単離された核酸分
   子であって、該バナナ果実関連プロモーター配列が作動可能に連結された遺伝子
   のエチレン調節性果実関連発現によって特徴付けられる、単離された核酸分子。
2. 【請求項２】 前記プロモーターがＴＲＸプロモーターである、請求項１に
   記載のバナナ果実関連プロモーター。
3. 【請求項３】 前記プロモーターが配列番号２として示される配列を有する
   、請求項２に記載のバナナ果実関連ＴＲＸプロモーター。
4. 【請求項４】 前記プロモーターがＰＥＬプロモーターである、請求項１に
   記載のバナナ果実関連プロモーター。
5. 【請求項５】 前記プロモーターが、配列番号３、配列番号３のヌクレオチ
   ド５６４〜２０１０、および配列番号３のヌクレオチド１０９９〜２０１０とし
   て示される配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項４
   に記載のバナナ果実関連ＰＥＬプロモーター。
6. 【請求項６】 Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ（メロン）アクチン遺伝子由来の
   プロモーター領域をコードする単離された核酸分子であって、該プロモーター配
   列が作動可能に連結された遺伝子の構成的発現によって特徴付けられる、単離さ
   れた核酸分子。
7. 【請求項７】 前記核酸分子が、単子葉植物および双子葉植物においてプロ
   モーター活性を有する、請求項６に記載のメロンプロモーター。
8. 【請求項８】 前記核酸分子が配列番号４として示される配列を有する、請
   求項６に記載のメロンプロモーター。
9. 【請求項９】 バナナＴＲＸ／単子葉植物イントロンハイブリッドプロモー
   ターであって、５’から３’方向で、以下： 単子葉植物イントロンからなる第１ヌクレオチドセグメント、および該第１ヌ
   クレオチドセグメントに融合した、配列番号２として示されるバナナＴＲＸプロ
   モーター配列からなる第２ヌクレオチドセグメント を含む、バナナＴＲＸ／単子葉植物イントロンハイブリッドプロモーター。
10. 【請求項１０】 トウモロコシＯ２遺伝子由来のイントロン３を含む第１ヌ
    クレオチドセグメント、および該第１ヌクレオチドセグメントに融合した、配列
    番号２として示されるバナナＴＲＸプロモーター配列を有する、請求項９に記載
    のバナナＴＲＸ／単子葉植物イントロンハイブリッドプロモーターであって、該
    ハイブリッドプロモーターが配列番号５として示される核酸配列を有する、バナ
    ナＴＲＸ／単子葉植物イントロンハイブリッドプロモーター。
11. 【請求項１１】 バナナＴＲＸ／メロンアクチンハイブリッドプロモーター
    であって、５’から３’方向で、以下： ＴＡＴＡボックスまでおよびＴＡＴＡボックスを含むバナナＴＲＸプロモータ
    ーからなる第１ヌクレオチドセグメント、ならびに該第１ヌクレオチドセグメン
    トに融合した、ＴＡＴＡボックスの下流のメロンアクチンプロモーター配列から
    なる第２ヌクレオチドセグメント を含む、バナナＴＲＸ／メロンアクチンハイブリッドプロモーター。
12. 【請求項１２】 前記ハイブリッドプロモーターが、配列番号６として示さ
    れる核酸配列を有する、請求項１１に記載のバナナＴＲＸ／メロンアクチンハイ
    ブリッドプロモーター。
13. 【請求項１３】 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプロモーター構築
    物を含む、植物発現ベクター。
14. 【請求項１４】 異種核酸コード配列に作動可能に連結された、請求項１３
    に記載の植物発現ベクター。
15. 【請求項１５】 前記ベクターで形質転換される宿主細胞によって認識され
    るコントロール配列に作動可能に連結された、請求項１４に記載の植物発現ベク
    ター。
16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の植物発現ベクターを含む、植物細胞。
17. 【請求項１７】 トランスジェニック植物を作製する方法であって、以下： 請求項１５に記載の植物発現ベクターを植物の前駆細胞に導入する工程、およ
    び形質転換した該前駆細胞を生育させて、トランスジェニック植物を作製する工
    程 を包含する、方法。
18. 【請求項１８】 植物組織におけるプロモーター発現を評価するための一過
    性発現方法であって、以下： （ｉ）導入遺伝子に作動可能に連結された候補プロモーター配列を含む核酸構
    築物をアセンブルする工程； （ｉｉ）形質転換のための植物組織を調製する工程； （ｉｉｉ）該調製された植物組織に該核酸構築物を導入する工程； （ｉｖ）該導入遺伝子の検出可能な発現を生じるために有効な条件下および十
    分な時間にわたって該植物組織を培養する工程；ならびに （ｖ）該導入遺伝子の発現を検出する工程、 を包含する、方法。
19. 【請求項１９】 前記調製する工程が、前記植物組織を滅菌する工程および
    該植物組織を切断する工程を意味する、請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記導入する工程が、金粒子ＤＮＡ懸濁物での植物組織の
    パーティクルボンバードメントによる、請求項１８に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記植物組織が、バナナスライス、タマネギおよびニンニ
    クからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記導入遺伝子がβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）であり
    、そして検出がウイルス手段による、請求項１８に記載の方法。