JP2001352981A - ファイトスルフォカイン前駆体遺伝子のプロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモ
ーター以上のプロモーター活性を有する、新規なプロモ
ーターを得る。 【解決手段】 本発明により、イネのファイトスルフォ
カイン前駆体遺伝子に由来する、新規なプロモーターが
与えられた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、イネのファイトス
ルフォカイン前駆体遺伝子に由来するプロモーター及び
当該プロモーターを導入して外来の構造遺伝子の発現を
活性化させた形質転換植物に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物細胞工学の分野において、外来遺伝
子を植物に導入して過剰発現させるために、目的遺伝子
の前にプロモーター配列を繋げる事が一般的に行われて
いる。外来遺伝子の発現は、その様なプロモーターの存
在がなくては不十分であることが多いからである。本目
的のために種々のプロモーターが使用されているが、カ
リフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターを用
いた方法が、本技術分野において最も汎用されている。
ここでプロモーターとは、構造遺伝子の５’上流に存在
する制御的な遺伝子領域のことであり、ＲＮＡポリメラ
ーゼがプロモーターに結合することが、転写の開始シグ
ナルとなると言われている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記のカリフラワーモ
ザイクウイルス（ＣＡＭＶ）の３５Ｓプロモーターは、
遺伝子を過剰発現させるための優れた方法であるが、導
入する外来遺伝子や導入の対照である植物種によっては
必ずしも導入した遺伝子の発現が十分でない場合もあ
り、より活性の高いプロモーターが求められていた。そ
こで、ＣＡＭＶ３５Ｓプロモーターより活性の高い、新
規のプロモーターを得る事が本発明の課題である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ペプチド
性の植物の増殖因子であるファイトスルフォカイン（ｐ
ｈｙｔｏｓｕｌｆｏｋｉｎｅ：ＰＳＫ）に注目し、検討
を行ってきた。ＰＳＫは一度培養に使用したいわゆる
「馴化培地」中に含有される植物細胞の増殖因子の一つ
であり、いわゆるオートクライン的に作用することが知
られている。一般的に植物細胞を培養するには、既知の
ホルモンや種々の栄養素を培養液に添加することが行わ
れているが、培養そのものが困難である植物種や増殖が
非常に遅い植物種が存在する。また細胞密度が非常に低
い場合にも、培養が困難となるが、それらの場合に細胞
増殖を活性化する目的に、ＰＳＫが有効である。ＰＳＫ
−α及びＰＳＫ−βの本体は、翻訳後修飾によりそのチ
ロシン残基が硫酸化された、以下の構造から成るペプチ
ドであることが知られている。 ＰＳＫ−α：Tyr(SO₃H)-Ile-Tyr(SO₃H)-Thr-Gln ＰＳＫ−β：Tyr(SO₃H)-Ile-Tyr(SO₃H)-Thr

【０００５】上記のＰＳＫ−α及びＰＳＫ−βは、前駆
体の形で生合成されて、トランスゴルジネットワークを
経由する間に、硫酸化及びプロセシングを受けて、ＰＳ
Ｋが切り出されることが知られている。その様な前駆体
である、イネＰＳＫ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｐｈ
ｙｔｏｓｕｌｆｏｋｉｎｅ：ＯｓＰＳＫ）遺伝子のｃＤ
ＮＡ塩基配列は、ｃＤＮＡクローニングの手法により既
に解析されている。また、そのようにして得たｃＤＮＡ
及び当該ｃＤＮＡがコードするポリペプチドのアミノ酸
配列を特許出願し、それらにつき特許登録されている
（特許第３０３８３８１号、未公開）。当該遺伝子を植
物に導入することにより、植物細胞の増殖を促進させる
ことが可能であると思われる。

【０００６】本発明者は上記の知見に注目し、ＯｓＰＳ
Ｋ遺伝子の発現を制御しているプロモーターを得ること
を試みた。ところで、上記（特許第３０３８３８１号）
の遺伝子配列はｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素により
合成されたｃＤＮＡの塩基配列であるために、遺伝子の
転写されない領域やイントロンに対応する部分は含んで
いない。プロモーターの様な制御的な領域は転写されな
いことが一般的であるために、ＯｓＰＳＫのプロモータ
ーを得るためには、細胞の全ＤＮＡよりゲノムライブラ
リーを作製し、制御領域を含むＯｓＰＳＫのゲノム遺伝
子を得る必要がある。そこで本発明者らは、ＯｓＰＳＫ
のゲノムライブラリーを作製し、ｃＤＮＡをプローブと
してプラークハイブリダイゼーションによりクローニン
グを行い、転写されない領域やイントロンを含む、ＰＳ
Ｋ前駆体の全ゲノム配列を得た。当該ゲノム配列中にお
いて、読み枠（オープンリーディングフレーム）の上流
には、種々のコンセンサス配列を含むプロモーターが存
在することが判った。当該プロモーターによる、下流に
組み込まれているβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝
子の発現の活性化を検討したところ、当該プロモーター
は、ＣＡＭＶ３５Ｓプロモーター以上にＧＵＳ遺伝子の
発現を活性化した。よって、当該プロモーターは構成的
に外来遺伝子を発現させる有用なツールである事が示さ
れた。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明は、配列表の配列番号５に
示し、塩基番号（−３３５９）−（２０３３）で示され
る塩基配列からなることを特徴とする、ファイトスルフ
ォカイン前駆体をコードする遺伝子である。当該遺伝子
は、イネ培養Ｏｃ細胞よりゲノムＤＮＡライブラリーを
作製し、³²ＰラベルしたＯｓＰＳＫのｃＤＮＡを用い
て、プラークハイブリダイゼーションにより当該ゲノム
ライブラリーをスクリーニングすることにより得られ
た、ＰＳＫ前駆体をコードするゲノム遺伝子配列であ
る。既に得られている、ＰＳＫ前駆体をコードするｃＤ
ＮＡの塩基配列と比較すると、当該ゲノム遺伝子配列
は、２つのエクソンと１つの大きなイントロンより構成
されており、５つのアミノ酸より成るＰＳＫをコードす
る配列は、第二のエクソン中に存在していた。配列表の
配列願号５において、塩基番号（１）−（１８５８）は
転写領域である。そのうち、第一エクソンの部分は
（１）−（２４５）であり、アミノ末端シグナルペプチ
ドなどをコードしている。（２４６）−（１３９５）は
イントロンであり、（１３９６）−（１８５８）はＰＳ
Ｋコード領域を含む第二エクソンである。また、（１３
９６）−（１５２１）は、３’下流近隣配列である。塩
基番号−６８の位置にＴＡＴＡ ｂｏｘであろうと思わ
れる配列が見出され、更に本配列の上流に、いくつかの
調節因子と成り得るコンセンサス配列が見出された。即
ち、１つのＣＡＡＴ ｂｏｘ、２つのＣＣＡＡＴ ｂｏ
ｘ、３つの剪断応力反応因子（ＳＳＲＥ）、１つのエン
ハンサーコア様配列及び３つのＥｂｏｘが見出された。
これらの配列は多くの生物において共通に存在すると認
められているコンセンサス配列であり、転写制御に関与
していると言われている。即ち、これらコンセンサス配
列に各配列固有の蛋白質が結合すると、蛋白質とＤＮＡ
の相互作用により転写開始の頻度が調節される事が知ら
れている。

【０００８】下記の実施例で示す様に、ＯｓＰＳＫ遺伝
子の５’領域とβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子
とを融合させたプラスミドを構築した。ＯｓＰＳＫ遺伝
子の５’領域がＧＵＳ活性に及ぼす影響を検討したとこ
ろ、ＯｓＰＳＫ遺伝子の５’制御因子を含む領域は、Ｃ
ＡＭＶ３５Ｓプロモーター以上にＧＵＳ活性を促進す
る、という知見が得られた。ＯｓＰＳＫ遺伝子の５’領
域に由来する、その様なプロモーターの塩基配列は、配
列表の配列番号１に示す、塩基番号（−３３５９）−
（−１）で示される塩基配列により特定される。当該プ
ロモーターは、ＯｓＰＳＫ遺伝子の転写調節領域であ
り、後の実施例においてプラスミドｐＩＧ１２１−６
（図５参照）に組み込んだ配列に相当する。この配列
は、ＯｓＰＳＫ遺伝子においてプロモーター活性を示す
最長の領域であり、これ以上長い配列を使用するとプロ
モーター活性は顕著に低下する。

【０００９】ＯｓＰＳＫ遺伝子の５’領域は、配列表の
配列番号１記載の配列より短い配列においても、プロモ
ーターとしての活性を保持する。配列表の配列番号２に
示す、塩基番号（−１９１１）−（−１）で示される塩
基配列からなることを特徴とする配列により特定される
プロモーターは、その様なプロモーターの一つである。
この領域は、後の実施例においてプラスミドｐＩＧ１２
１−４（図５参照）に組み込んだ配列に相当する。この
配列は、ＯｓＰＳＫ遺伝子において、最大のプロモータ
ー活性を示す領域に相当する。

【００１０】また、配列表の配列番号３に示す、塩基番
号（−１０３４）−（−１）で示される塩基配列からな
ることを特徴とする配列により特定される領域も、プロ
モーターとしての活性を保持する領域の一つである。Ｏ
ｓＰＳＫ遺伝子に由来する当該領域は、後の実施例にお
いてプラスミドｐＩＧ１２１−３（図５参照）に組み込
んだ配列に相当する。

【００１１】また、配列表の配列番号４に示す、塩基番
号（−５６３）−（−１）で示される塩基配列からなる
ことを特徴とする配列により特定される領域も、プロモ
ーターとしての活性を保持する領域の一つである。Ｏｓ
ＰＳＫ遺伝子に由来する当該領域は、後の実施例におい
てプラスミドｐＩＧ１２１−２（図５参照）に組み込ん
だ配列に相当する。この配列は、ＯｓＰＳＫ遺伝子にお
いてプロモーター活性を示す最短の領域であり、これ以
上短い配列を使用するとプロモーター活性は顕著に低下
する。

【００１２】遺伝子組み換え技術によれば、基本となる
ＤＮＡの特定の部位に、当該ＤＮＡの基本的な特性を変
化させることなく、あるいはその特性を改善する様に、
人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供
される天然の塩基配列を有する遺伝子、あるいは天然の
ものとは異なる塩基配列を有する遺伝子に関しても、同
様に人為的に挿入、欠失、置換を行う事により、天然の
遺伝子と同等のあるいは改善された特性を有するものと
することが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子
を含むものである。即ち、配列表の配列番号１に示すプ
ロモーターの一部が欠失、置換若しくは付加されたプロ
モーターとは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の一
部が欠失、置換若しくは付加され、かつ下流に存在する
構造遺伝子の発現を活性化するプロモーターである。そ
の様なプロモーターは、配列番号１に示す塩基配列と比
較して７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好まし
くは９０％以上の相同性を有する。また、その様なプロ
モーターにおいては、配列番号１に示す塩基配列と比較
して、欠失、置換若しくは付加した塩基数は２０個以
下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下で
ある。また、その様なプロモーターにおいては、ストリ
ンジェントな条件下で、配列表の配列番号１に示す塩基
配列からなるポリヌクレオチドとハイブリッドの形成が
可能である。なお、配列表の配列番号２、配列番号３又
は配列番号４に示すプロモーターの一部が欠失、置換若
しくは付加されたプロモーターという記載も、本明細書
中においては同様の意味を有するものである。

【００１３】更に、上記のイネＯｓＰＳＫ遺伝子由来の
プロモーターを導入したプラスミドも本発明の範囲内で
ある。実施例においては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター
とＧＵＳレポーター遺伝子を含有するｐＩＧ１２１プラ
スミドを使用したが、それに限定されるものではなく、
例えばｐＩＧ１２２プラスミド、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ
１２１、ｐＢＩ２２１、ｐＡｃｔ−ｎｏｓ／Ｈｍｚ、ｐ
ＭＡＴ０３７、ｐＴＡ７００１およびｐＴＡ７００２な
ど、本技術分野で汎用されている他のプラスミドを使用
することもまた可能である。

【００１４】また、本発明のプロモーターを導入して、
外来遺伝子の発現を活性化した形質転換植物もまた、本
発明の範囲内である。本発明のプロモーターを導入し
て、外来遺伝子を活性化させる植物の例としては、イ
ネ、ユリ、トウモロコシ、アスパラガス、コムギ等の単
子葉植物、またタバコ、シロイヌナズナ、ニンジン、ダ
イズ、トマト、ジャガイモ等の双子葉植物が挙げられ
る。原理的には、あらゆる植物に本発明のプロモーター
を導入して、外来遺伝子の発現を活性化することが可能
である。形質転換を行う際に、実施例においてはアグロ
バクテリウムツメファシエンスＬＢＡ４４０４株を用い
ているが、それに限定されるものではなく、遺伝子を導
入する植物の種に応じて本技術分野で一般的に使用され
ているアグロバクテリウム菌株を、適宜選択して用いる
ことができる。

【００１５】また、プロモーターの下流に位置する様に
導入して、その発現を活性化させる対象である外来の構
造遺伝子として、原理的にはあらゆる有用な構造遺伝子
を採用することが可能である。実施例ではＧＵＳ遺伝子
を導入しているが、それに限定されるものではない。導
入する外来遺伝子の好ましい例としては、植物の成長を
促進する因子をコードする遺伝子、各種の環境ストレス
に対する耐性遺伝子、植物の病害に対する耐性遺伝子、
除草剤耐性遺伝子および有用二次代謝産物の合成酵素遺
伝子などを挙げることができる。

【００１６】また、その様にして作製した外来遺伝子の
発現を活性化させた形質転換植物細胞より得られた植物
体、及び形質転換植物細胞を作製する方法も、本発明の
範囲内である。本発明を、イネ培養細胞を用いた実施例
で詳細に説明するが、上記の記載及び下記の実施例は本
発明の範囲を限定するものではない。

【００１７】

【実施例】（植物細胞培養）イネ培養Ｏｃ細胞（Baba e
t al.,1986）を、１２０ｒｐｍ、２５±２℃の暗条件下
で、１ｍｇ／Ｌのジクロロフェノキシ酢酸（２，４−
Ｄ）を添加した新鮮なＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓ
ｋｏｏｇ（ＭＳ：Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄＳｋｏｏ
ｇ，１９６２）培地中で、通常は２週間の間隔で継代培
養した。

【００１８】（ゲノムＤＮＡの抽出及びサザンブロット
解析）ＣＴＡＢ法（Murry and Thompson,1980 ）を用い
て、１４日培養したイネＯｃ培養細胞よりゲノムＤＮＡ
を抽出し、制限エンドヌクレアーゼにより分解し、０．
８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上での電気泳動により分
離した。アルカリ転写バッファー（０．４Ｎ ＮａＯＨ
／０．６Ｎ ＮａＣｌ）中で、そのゲルをビオダインナ
イロン膜（パル、ポートワシントン，ＮＹ，ＵＳＡ）上
に転写した。５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、５×デン
ハルト溶液及び５００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡの溶液
中で、ランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（タ
カラ、東京、日本）を用いて³²ＰラベルしたＯｓＰＳＫ
のｃＤＮＡを用いて、５０℃又は６０℃でサザンハイブ
リダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの
後、２×ＳＳＣを用いて２５℃で１５分間の条件で３
回、次いで０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣを用い
て５０℃又は６５℃で１５分の条件で３回洗浄した。

【００１９】（ゲノムライブラリーの構築及びスクリー
ニング）ゲノムＤＮＡ（５０μｇ）をＳａｕ３ＡＩで部
分的に制限分解して、９から２３ｋｂの範囲の大きさの
ＢａｍＨＩ感受性断片を作成した。ゲノム断片（０．３
μｇ）を、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ（ストラタジー
ン、ラホヤ、ＣＡ、ＵＳＡ）により分解しておいたＥＭ
ＢＬ３ベクターのＢａｍＨＩ部位へ挿入し、ギガパック
ＩＩＩゴールドパッケージングイクストラクト（ストラ
タジーン）により包み込んだ。³²ＰラベルしたＯｓＰＳ
ＫのｃＤＮＡを用いて、プラークハイブリダイゼーショ
ンによりゲノムライブラリーをスクリーニングした。ハ
イブリダイゼーション及び洗浄を、上述した通りの強い
条件下において、６５℃で行った。

【００２０】（サブクローニング及びＤＮＡ配列決定）
陽性ゲノムクローンの制限地図解析を、単独及び二重の
制限酵素消化により行った。ＯｓＰＳＫ遺伝子を有して
いる１シリーズの断片を、陽性ファージの一つから切り
出して、ゲルで精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ−
ＫＳ（ｐＢＳ）の、対応する部位の中へサブクローニン
グした。キロシークエンシングキット（タカラ）を用い
て、製造業者の推奨するプロトコールにより、ＤＮＡ配
列が欠損したクローンが生成した。欠損した断片を含む
プラスミドを大腸菌株ＪＭ１０９中へ導入し、両鎖につ
いて完全に配列決定した。ビッグダイターミネーターサ
イクルシークエンシングキット（アプライドバイオシス
テムズ、フォスター、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、二重鎖
ＤＮＡの配列を決定し、ＡＢＩプリズム３１０ジェネテ
ィックアナライザー（アプライドバイオシステムズ）を
用いて、製造業者のプロトコールに従ってＤＮＡ配列デ
ータの解析を行った。

【００２１】（転写開始部位の決定）プライマー伸長解
析及びＳ１マッピングにより、転写開始部位を確定し
た。２週齢のＯｃ培養細胞より抽出した全ＲＮＡ及び5'
-AGCAGGAGGAGAGCAAGGCATAGGAGGCAGAG-3'の配列を有する
３２塩基長のプライマーを両者の解析に用いた。このプ
ライマーはＯｓＰＳＫのｃＤＮＡ中において、ＡＴＧ開
始コドンの３２塩基下流の領域に相補的な配列を有す
る。当該オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端を、
１０ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラ）及び
３０μＣｉの［γ− ³²Ｐ］ＡＴＰ（３０００μＣｉ／ｍ
ｍｏｌ）によりラベル化した。末端をラベル化したプラ
イマーを、１０μｇの全ＲＮＡと、６０℃で１時間アニ
ールした。公知の方法（Sambrook et al.,1989）によ
り、２０Ｕのモロネイネズミ白血病ウイルス逆転写酵素
（ストラタジーン）を用いて、３０℃で１時間、プライ
マー伸長反応を行った。Ｓ１マッピングのために、Ｏｓ
ＰＳＫ遺伝子由来の３．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片及び末
端ラベルしたプライマーを、一本鎖ＤＮＡを合成する目
的で使用した。３１５ｂｐの断片を切り出して、Ｐｓｔ
Ｉにより合成したＤＮＡから精製し、Ｓ１プローブとし
て使用した。プローブを３０μｇの全ＲＮＡと６０℃で
ハイブリダイズし、その後にその混合液を３００ユニッ
ト／ｍｌのＳ１ヌクレアーゼ（タカラ）と３０℃で３０
分間インキュベートした。両実験における反応生成物
を、７Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲル上で、
同時に解析した。

【００２２】（キメラ遺伝子の構築）ｐＩＧ１２１プラ
スミドは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）
３５Ｓプロモーターとトウゴマのカタラーゼ遺伝子の改
変イントロン、及びＧＵＳレポーター遺伝子を含有して
いる（Akama et al.,1992 ）。このＣａＭＶ３５Ｓ−イ
ントロン−ＧＵＳレポーター遺伝子は植物細胞中で発現
するが、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａ．ｔ
ｕｍｅｇａｃｉｅｎｓ）の細胞内では発現しない（Ohta
et al.,1990）。ｐＩＧ１２１はカナマイシン耐性遺伝
子を有しており、それを用いて形質転換体を選抜するこ
とができる。ｐＩＧ１２１プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ
−ＸｂａＩにより分解することにより、ＣａＭＶ３５Ｓ
プロモーターを除去することができる。ＯｓＰＳＫ遺伝
子の５’領域由来の種々の断片を、バイナリーベクター
のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ領域に挿入する事により、
キメラ遺伝子を構築した。ＯｓＰＳＫ遺伝子の５’領域
由来の２４１ｂｐのＰｓｔＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、ｐＢ
Ｓの中のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ部位へサブクローニング
した。その断片を、ｐＢＳ−１からＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘ
ｂａＩにより切り出して、プロモーターを欠損した、ｐ
ＩＧ１２１の同様の部位の間へクローニングし、ｐＩＧ
１２１−１を構築した。ＥｃｏＲＶ−ＢｇｌＩＩ断片を
含む、ｐＢＳ−２由来の６６２ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−
ＸｂａＩ断片を、プロモーターを欠失したｐＩＧ１２１
の同様の部位に導入することにより、ｐＩＧ１２１−２
を作製した。ＯｓＰＳＫ遺伝子の５’領域の、１．１ｋ
ｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、ｐＢＳのＨｉ
ｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位へサブクローニングしてｐ
ＢＳ−３を作製した。ｐＢＳ−３に由来する１．１ｋｂ
断片を、プロモーターを欠失したｐＩＧ１２１のＨｉｎ
ｄＩＩＩ−ＸｂａＩ部位へ導入し、ｐＩＧ１２１−３プ
ラスミドを作製した。ＯｓＰＳＫ遺伝子の５’領域の２
ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、ｐＢＳのＢａｍ
ＨＩ部位へサブクローニングして、ｐＢＳ−４を作製し
た。８７７ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片
を、ｐＢＳ−４から切り出して、ｐＢＳ−３の同じ部位
へ可能な両方向において挿入し、ｐＩＧ１２１−４とｐ
ＩＧ１２１−５を作製した。ＯｓＰＳＫの３．７ｋｂの
ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を単離して、ｐＢＳの同様
の部位へクローニングし、ｐＢＳ−５を作製した。その
後ｐＢＳ−５プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩにより開裂
し、２．３ｋｂの断片をｐＩＧ１２１−３の同様の部位
へ可能な両方向において挿入し、ｐＩＧ１２１−６とｐ
ＩＧ１２１−７を構築した。

【００２３】尚、ｐＩＧ１２１−１に導入した配列は、
イネファイトスルフォカイン前駆体遺伝子のゲノムＤＮ
Ａ配列である配列表の配列番号５において、塩基番号
（−１４８）−（−１）に相当する部分である。ｐＩＧ
１２１−２に導入した配列は、塩基番号（−５６３）−
（−１）に相当する部分である。ｐＩＧ１２１−３に導
入した配列は、塩基番号（−１０３４）−（−１）に相
当する部分である。ｐＩＧ１２１−４に導入した配列
は、塩基番号（−１９１１）−（−１）に相当する部分
である。ｐＩＧ１２１−５に導入した配列は、ｐＩＧ１
２１−４と同様であるが、塩基番号（−１９１１）−
（−１０３４）に相当する部分が逆方向となっている。
ｐＩＧ１２１−６に導入した配列は、塩基番号（−３３
５９）−（−１）に相当する部分である。ｐＩＧ１２１
−７に導入した配列は、ｐＩＧ１２１−６と同様である
が、塩基番号（−３３５９）−（−１０３４）に相当す
る部分が逆方向となっている。

【００２４】（イネＯｃ細胞のアグロバクテリウムによ
る形質転換）トリペアレンタルメイティングにより、ア
グロバクテリウムツメファシエンスＬＢＡ４４０４株中
へコンストラクトを導入した。アグロバクテリウムツメ
ファシエンス細胞を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含
むＡＢ寒天培地中で、暗条件下３０℃で３日間生育させ
た。その細菌を小さなスプーンで集め、ＯＤ₆₀₀ が０．
２の密度でＡＡＭ培地（Yang et al.,2000）中に懸濁し
た。感染に先だって１．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを添加
した新鮮なＭＳ培地上において、２５℃で３日間前培養
したＯｃ細胞を、９０ｍｍ×２０ｍｍのペトリ皿（テル
モ、東京、日本）の中で４ｍｌの細菌懸濁液に浸した。
プレートをパラフィルムで密閉し、２８℃で３日間、暗
条件で共培養を行った。３日後、培養物をファルコン２
０９７チューブに集めた。１０００ｒｐｍで１分間の遠
心分離（ＭＸ−１６０遠心機、ＴＭＡ−２７アングルロ
ーター：トミー）により、Ｏｃ細胞を回収した。Ｏｃ細
胞をＭＳ培地中に再懸濁し、穏やかに攪拌することによ
り混合し、その後１０００ｒｐｍで１分間遠心した。遠
心分離後、上清は廃棄した。この洗浄過程を３回から５
回繰り返して、アグロバクテリウムツメファシエンス細
胞を除外した。洗浄したＯｃ細胞を、１．０ｍｇ／ｍｌ
の２，４−Ｄ、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、及び２５
０ｍｇ／ｍｌのセフォタキシムを添加した、新鮮なＭＳ
培地上で培養し、形質転換した細胞を選抜した。

【００２５】（ＧＵＳ活性の定量的解析）それぞれのコ
ンストラクトにつき、５つ以上の独立した形質転換細胞
株を選抜培地上で７日間培養し、ＧＵＳ活性を測定する
のに用いた。ＧＵＳ抽出バッファー中において、形質転
換したＯｃ細胞から全ての可溶性蛋白質を単離した（Je
fferson et al.,1987 ）。４−ウンベリフェリル−β−
Ｄ−グルクロニド（シグマ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳ
Ａ）を用いた、Jefferson らの蛍光反応法により、ＧＵ
Ｓ活性を定量的にアッセイした。Bradford（1976）の方
法により、バイオラッドラボラトリーのキットにより、
蛋白質の量を決定した。

【００２６】（ＲＮＡの単離及びノザンブロット解析）
ｐＩＧ１２１−４プラスミドにより形質転換したＯｃ細
胞を、異なった組み合わせの植物ホルモンを添加したＭ
Ｓ培地中において、０、１２、２４、４８及び７２時間
培養した。即ち、２ｍｇ／Ｌの２、４−Ｄのみ、２ｍｇ
／Ｌの６−ＢＡのみ、又は１ｍｇ／Ｌの２、４−Ｄ及び
６−ＢＡのそれぞれを、ＭＳ培地に添加した。公知の方
法（Chomczynski,1993）によりサンプルから単離した全
ＲＮＡ（レーンあたり２０μｇ）を変性させて、２．２
Ｍフォルムアルデヒドを含む１．２％アガロースゲル上
で分画した。次いで、２０×ＳＳＣ中で、ビオダインナ
イロン膜（Ｐａｌｌ）にＲＮＡを転写した。上述したよ
うに、ｇｕｓＡ遺伝子のランダムにプライムしたプロー
ブを、そのフィルターとハイブリダイズさせた。

【００２７】（ＯｓＰＳＫ遺伝子のコピー数）本発明者
らは、植物から同定したペプチド成長因子であるＰＳＫ
−αの前駆体をコードする、イネにおけるＯｓＰＳＫの
ｃＤＮＡを過去に解析している。ＯｓＰＳＫのｃＤＮＡ
に相当するゲノムクローンの単離に先立ち、イネのゲノ
ム中におけるこの遺伝子のコピー数を、ゲノミックサザ
ンブロッティングにより検討した。全長のＯｓＰＳＫの
ｃＤＮＡをプローブとして用いた、緩和な条件下におけ
るＤＮＡブロット解析により、ＤＮＡ中の１つのバンド
のみが３つの異なった制限酵素により分解されることが
示された。ＥｃｏＲＩのみが例外であり、ＥｃｏＲＩ分
解により、強くハイブリダイズするバンドが２つ、及び
弱くハイブリダイズするバンドが１つ生成した（Yang e
t al.,1999）。サザンブロットがプローブと厳しい条件
下でハイブリダイズしたとき、ＥｃｏＲＩにより分解さ
れたＤＮＡの中で強いバンドだけが検出された。これら
の２つのバンドがハイブリダイズすることは、ＯｓＰＳ
ＫのｃＤＮＡのコーディング領域中において残っている
制限部位より予測された。この知見を証明するために、
ＯｓＰＳＫのｃＤＮＡ５’末端に由来する３００ｂｐの
断片を用いて、ブロッティングを再び行った。予想した
様に、３．６ｋｂの１つのバンドだけが、緩和な条件下
でも、厳しい条件下でもハイブリダイズした。図１に、
ＯｓＰＳＫ遺伝子のＤＮＡブロット解析を行った結果を
示す。図１において、Ｏｃ細胞より単離したゲノムＤＮ
Ａを、ＢａｍＨＩ（レーン１）、ＥｃｏＲＩ（レーン
２）、ＸｂａＩ（レーン３）、ＸｈｏＩ（レーン４）で
分解を行い、ＯｓＰＳＫのｃＤＮＡの５’末端由来の放
射標識プローブとハイブリダイズさせた。その結果は、
ＯｓＰＳＫは単一コピーの遺伝子であることを示してい
る。実際に、ゲノミックライブラリーのスクリーニング
を行ったところ、ゲノミッククローンが１種だけ単離さ
れた。

【００２８】（ＯｓＰＳＫ遺伝子の単離）λＥＭＢＬ３
ファージとイネＯｃ培養細胞より調製したＳａｕ３ＡＩ
で消化したＤＮＡ断片より、ゲノミックライブラリーを
構築し、ＯｓＰＳＫのｃＤＮＡをプローブとして用い
て、そのライブラリーをスクリーニングした。ＯｓＰＳ
Ｋ遺伝子より得られた断片を有する重複クローンが、Ｏ
ｓＰＳＫ遺伝子より得られた（図２Ｂ）。図２Ｂにおい
て、ＯｓＰＳＫ遺伝子断片を含む３つのゲノムクローン
を示す。それらのクローンを、λＥＭＢＬ３／３−１、
λＥＭＢＬ３／５−３及びλＥＭＢＬ３／７−１と名付
けた。これらのクローンは３つのサブグループに分類さ
れ、イネのゲノムＤＮＡの４５ｋｐ以上の領域にわたり
重複していた。ＯｓＰＳＫのゲノム構造及び制御領域の
解析を始めるのにあたって、サザンハイブリダイゼーシ
ョンのみでなく、単独及び二重の制限酵素分解により、
３つのλＥＭＢＬ３ファージクローンについて制限酵素
地図を作製した（図２Ｂ）。ＯｓＰＳＫ遺伝子について
のゲノム断片の制限酵素地図を図２Ａに示す。図２にお
いて、ＢａはＢａｍＨＩの制限酵素部位を、ＢｇはＢｇ
ｌＩＩの制限酵素部位を、ＥＩはＥｃｏＲＩの制限酵素
部位を、ＥＶはＲｃｏＲＶの制限酵素部位を、ＨはＨｉ
ｎｄＩＩＩの制限酵素部位を、ＰはＰｓｔＩの制限酵素
部位を、それぞれ示す。２２．８ｋｂのλＥＭＢＬ３／
７−１挿入部位が、５’−上流部位、ＯｓＰＳＫのｃＤ
ＮＡに相当する全長の転写配列、コードしないイントロ
ン及び３’下流領域を含む、全ＯｓＰＳＫ遺伝子を含ん
でいることが見出された。図２Ｃに、ＯｓＰＳＫ遺伝子
のゲノム構成を示す。図２Ｃにおいて、ＯｓＰＳＫ遺伝
子の転写方向を矢印で、イントロンを白抜き部分で、エ
キソンの非コード部分を陰影部分で、コード部位を縞模
様の部分で、第二エキソン中のＰＳＫ−αをコードする
部分を白色のバーで、それぞれ示す。図２Ｃの３２７ｂ
ｐと記載したバ−は、ゲノムＤＮＡハイブリダイゼーシ
ョンに用いたプローブを示す。

【００２９】（ＯｓＰＳＫ遺伝子の転写開始点の決定）
ＯｓＰＳＫ遺伝子の転写開始点を、プライマー伸長解析
及びＳ１マッピングにより決定した。図３において、Ｓ
１ヌクレアーゼの反応生成物（レーン１）とプライマー
伸長の生成物（レーン２）をポリアクリルアミドゲルで
電気泳動を行った。Ｓ１マッピングに用いたプローブの
大きさと両実験における生成物をｋｂで左に示す。Ｏｓ
ＰＳＫのｃＤＮＡの５’末端に相当する、３２塩基長の
オリゴデオキシリボヌクレオチドのうち一つをプライマ
ーとして用いて（図４）、プライマー伸長反応を行っ
た。Ｏｃ培養細胞より抽出された全ＲＮＡを鋳型として
用いて、ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動後のオー
トラジオグラフィーにより生成物を解析した。長さが約
１６２塩基である一つのバンドが、伸長生成物より検出
された（図３）。次に、ＯｓＰＳＫ遺伝子に由来する
３．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を用いて３１５ｂｐのプロ
ーブ及び³²Ｐでラベルしたプライマーを作製し、次いで
ＰｓｔＩ分解を行った。その後に³²Ｐでラベルした３１
５ｂｐの断片をプローブとしてＳ１ヌクレアーゼ解析を
行った。プローブを全ＲＮＡとハイブリダイゼーション
してからＳ１ヌクレアーゼで分解した後に、１６２塩基
の生成物が再び検出された（図３）。この大きさは、
５’末端残基からプライマーに対して相補的な位置まで
の大きさと同一であった。そのために、ＴＡＴＡ ｂｏ
ｘの下流６２塩基に位置する、ＯｓＰＳＫのｃＤＮＡの
最初のグアニジンを＋１とした。そしてそのグアニジン
は、ＯｓＰＳＫ転写産物の５’末端であると思われた
（図４）。

【００３０】（ＯｓＰＳＫ遺伝子のゲノム構成）ゲノミ
ッククローンλＥＭＢＬ３／７−１において、全ＯｓＰ
ＳＫ遺伝子に対応している７．４ｂｐ領域の核酸配列に
つき、両鎖の配列を完全に決定してその構造を解析し
た。図４に、ＯｓＰＳＫ遺伝子の塩基配列と、推定アミ
ノ酸配列を示す。図４において、転写開始点を＋１で示
し、ＴＡＴＡ ｂｏｘを四角で囲った。ＣＡＡＴ ｂｏ
ｘ、３つのＥｂｏｘ、３つのＣＣＡＡＴ ｂｏｘ、エン
ハンサーコア様配列、３つのＳＳＲＥを下線で示した。
制御的な核蛋白質であるＳＥＦ３の結合部位を配列の上
の縞模様の線で、ポリアデニレーションシグナルを、二
重下線で示した。プライマー伸長及びＳ１マッピングに
用いたプライマーに相補的な配列を点線で示す。矢印
は、種々のＯｓＰＳＫ−イントロン−ＧＵＳ融合プラス
ミドの構築に用いた部位を示す。アミノ酸配列は一文字
表記で示し、ＰＳＫ−αのアミノ酸配列は太文字で、翻
訳終止コドンを星印で示す。この断片とｃＤＮＡの配列
を比較すると、ＯｓＰＳＫ遺伝子は２つのエキソン（２
４５ｂｐと４６３ｂｐ）により構成されていることが判
明した。それらの２つのエキソンは、ｃＤＮＡ配列と完
全に一致し、１１５０ｂｐの大きなイントロンが挿入さ
れていた。そのイントロンには、高度に保存されたＧＴ
−ＡＧイントロンボーダー配列が認められた。フレーム
内のＴＧＡ終止コドンは、最初のエキソンのメチオニン
コドンの３３７ｂｐ上流に見出された。最初のエキソン
は５’非コード領域及びＰＰ−ＰＳＫ（ｐｒｅｐｒｏｐ
ｈｙｔｏｓｕｌｆｏｋｉｎｅ）の約半分に相当するコー
ド領域を含んでいた。ＰＰ−ＰＳＫの約半分に相当する
コード領域とは、開始メチオニンを含む、前駆体８９ア
ミノ酸残基中の４８アミノ酸残基である。２２アミノ酸
のアミノ末端疎水性領域が最初のエキソン中に見出さ
れ、その領域はシグナルとして作用すると考えられる。
第二のエキソンは３’非コード領域及びＰＰ−ＰＳＫの
残りの４１アミノ酸のコード領域より成り、その４１ア
ミノ酸中にはＰＳＫ−α配列が一度だけ見られ、カルボ
キシ末端で終了している。ＡＡＡＴＴＡＡの配列から成
るポリアデニル化シグナルが、１６２９から１６３５に
おいて見られる。

【００３１】（ＯｓＰＳＫ遺伝子の５’上流領域の特
性）ＯｓＰＳＫ遺伝子の５’上流領域が、他の遺伝子の
何らかの既知のモチーフ又は制御領域を有しているか、
検索を行った。その結果、５’上流領域には、制御領域
である可能性がある因子がいくつか含まれている事が示
された（図４）。ＴＡＴＡ ｂｏｘ（5'-TATAA-3' ）で
あろうと思われるコンセンサス配列が−６３から−６８
の位置に見出され、それは転写開始部位を示している。
この配列の上流に、−２６７から−２７０の位置に一つ
のＣＡＡＴ ｂｏｘがあり、そして−９０６から−９１
０、−９４９から−９５３および−１０７４から−１０
７８の位置に、３つのＣＣＡＡＴ ｂｏｘがあった。興
味深い事に、ＡＡＣＣＣＡ（−９０８において）配列
は、Ａ（Ａ／Ｃ／Ｇ）ＣＣＣＡコンセンサス配列に一致
した。そのコンセンサス配列は、制御的な核蛋白質ＳＥ
Ｆ３に対するダイズエンハンサーの結合部位である（Al
len et al.,1989 ）。また、８−ヌクレオチドエンハン
サーコアー様モチーフが、5'-GTGGAAAG-3'の配列でもっ
て−１１０５から−１１１２の位置に存在していた。加
えて、３つのＥｂｏｘ（コンセンサス配列：5'-CANNTG-
3':Pabo,1992）、３つの剪断応力反応因子（ＳＳＲＥ：
5'-GAGACC-3':Resnick et al.,1993）、およびいくつか
の繰り返し配列が、５’末端領域にあった。これらの発
見は、転写が種々の遺伝因子により影響されていること
を示している。

【００３２】（形質転換細胞内におけるＯｓＰＳＫ::Ｇ
ＵＳキメラ遺伝子の発現）ＯｓＰＳＫ配列の発現に必要
な５’上流配列を決定するために、ｐＩＧ１２１プラス
ミド中のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを、ＯｓＰＳＫ遺
伝子の５’領域に由来する種々の断片に置き換えた。図
５に、ＯｓＰＳＫ−イントロン−ＧＵＳコンストラクト
の構造を示す。図５において、一番上の図がＯｓＰＳＫ
の５’上流領域の模式図であり、制御因子の位置を示
す。その下に、ＧＵＳ遺伝子（白抜き）と融合した、種
々の領域の５’上流配列（太線）を含むコンストラクト
と、各コンストラクトの名前を示す。制限酵素部位の略
称は図２と同様である。ＢＳＳＥＦ３は、制御的核蛋白
質であるＳＥＦ３がダイズエンハンサーに結合する部位
であり、ＥＣＳはエンハンサーコア配列であり、ＳＳＲ
Ｅは剪断応力反応因子である。点線は、逆方向に挿入し
た断片を示す。陽性コントロールとして、ＣａＭＶ３５
Ｓプロモーターを含む、元のｐＩＧ１２１を用いた（Oh
ta et al.,1990）。アグロバクテリウムの感染により、
これらのコンストラクトをＯｃ懸濁細胞中へ導入し、形
質転換した細胞を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを添加
したＭＳ寒天培地上で選抜した（Yang et al.,1999）。
それぞれのコンストラクトに対して、５つ以上の独立し
た形質転換クローンにつき、ＧＵＳアッセイを行った
（Jefferson et al.,1987 ）。これらのアッセイの結果
を図６に示す。ＧＵＳ活性は、３回実験を行った平均値
と標準偏差で示す。

【００３３】ｐＩＧ１２１−１、ｐＩＧ１２１−２、ｐ
ＩＧ１２１−３、ｐＩＧ１２１−４、ｐＩＧ１２１−６
の、５つのＯｓＰＳＫ−イントロン−ＧＵＳプラスミド
を構築し、最大のＧＵＳ活性に必要とされる、ＯｓＰＳ
Ｋの５’上流配列の最短の長さを決定した。これらのプ
ラスミドを有する形質転換細胞は、全てＧＵＳ活性を示
した。陰性コントロールである非形質転換細胞では、Ｇ
ＵＳ活性の発現を検出できなかった。ＯｓＰＳＫ遺伝子
の、最も短い５’上流領域を有するｐＩＧ１２１−１プ
ラスミドは、ＴＡＴＡ ｂｏｘ以外には制御領域と思わ
れる因子を有しておらず、ＧＵＳ活性が最も低かった。
最大のＧＵＳ活性は、ｐＩＧ１２１−４プラスミドにお
いて発現した。ｐＩＧ１２１−４の中には、ＳＳＲＥを
含む５’の推定制御因子の殆どとエンハンサーコアモチ
ーフが存在している。それは、ＯｓＰＳＫ転写開始部位
の１．９ｋｂ上流領域は、形質転換したＯｃ細胞におい
て最大のＧＵＳ活性を示すのに必要な、最小部分である
ことを示している。最長のＯｓＰＳＫの５’領域を有す
るｐＩＧ１２１−６により形質転換した細胞は、ｐＩＧ
１２１−４により形質転換した細胞と同程度のＧＵＳ活
性を示した。

【００３４】ｐＩＧ１２１−３ではなく、ｐＩＧ１２１
−４内のＯｓＰＳＫ５’上流領域のＢｇｌＩＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片中において、エンハンサー様活性を有する
可能性を試験するために、ｐＩＧ１２１−４とは反対の
方向でＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含んでいる、
ｐＩＧ１２１−５プラスミドを構築した。このコンスト
ラクトにより形質転換した細胞のＧＵＳ活性は、ｐＩＧ
１２１−４で形質転換した細胞と比較して、顕著に活性
が低下していた（図６）。ｐＩＧ１２１−６中の２．３
ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＩＧ１２
１−３中に逆向きに挿入したｐＩＧ１２１−７もまた構
築した。ｐＩＧ１２１−７プラスミドは、ｐＩＧ１２１
−３およびｐＩＧ１２１−５と同等のＧＵＳ活性を示し
た。これらの結果は、エンハンサー因子が最大のＧＵＳ
活性の発現に関与しており、その促進が方向に依存して
いる可能性を示唆している。

【００３５】ＯｓＰＳＫ５’上流領域の制御下にあるＧ
ＵＳレポーター遺伝子のＧＵＳ活性は、形質転換したＯ
ｃ細胞中のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターにより制御され
るＧＵＳ遺伝子より得られる活性より約２倍から５倍高
かった。それは、その領域が、形質転換したイネＯｃ培
養細胞中において、外来遺伝子の構成的な発現を制御す
るのに十分なプロモーターを含んでいる事を示してい
る。

【００３６】（外来性オーキシン及びサイトカイニンの
影響）形質転換したＯｃ細胞において外来性のファイト
ホルモンが、ＯｓＰＳＫ::ＧＵＳ遺伝子の発現にどの様
に作用するかを調べるために、ＲＮＡブロット解析を行
った。外来性オーキシン（１ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ）及
び／又はサイトカイニン（１ｍｇ／Ｌの６−ＢＡ）をＭ
Ｓ培地に添加して、ｐＩＧ１２１−４プラスミドにより
形質転換したＯｃ細胞を処理した。種々のサンプルから
全ＲＮＡを単離し、ノザンブロット解析を行った。図７
に、ｐＩＧ１２１−４を導入した形質転換Ｏｃ細胞にお
ける、外来性オーキシン及びサイトカイニンによるＯｓ
ＰＳＫプロモーターの制御を示す。図７において、定常
状態のｇｕｓＡ ｍＲＮＡレベルをノザンブロッティン
グにより検出し（左側）、リボゾーマルＲＮＡをエチジ
ウムブロマイド染色により検出した（右側）。形質転換
したＯｃ細胞をオーキシン及び／又はサイトなイニンに
よる処理後０時間後（レーン０）、１２時間後（レーン
１）、２４時間後（レーン２）、４８時間後（レーン
３）、７２時間後（レーン４）に回収した。図７は、全
ＲＮＡをそれぞれのサンプルから抽出し、ＧＵＳコード
領域を含むｐＩＧ１２１の、放射ラベル化したＸｂａＩ
−ＳａｃＩ断片とハイブリダイゼーションを行った結果
である。図７Ａは２ｍｇ／Ｌの２，４−ＤをＭＳ培地に
添加した結果であり、２，４−Ｄ処理を開始した後１２
時間後に、ＧＵＳのｍＲＮＡレベルは顕著に増加し、４
８時間で最大レベルに達した（図７Ａ）。図７Ｂは２ｍ
ｇ／Ｌの６−ＢＡをＭＳ培地に添加した結果であり、Ｏ
ｓＰＳＫ::ＧＵＳ遺伝子の発現は、６−ＢＡで２４時間
処理した後でも増強されたが、４８時間後にＧＵＳ転写
産物の減少が明らかに観察された（図７Ｂ）。図７Ｃは
１ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄと１ｍｇ／Ｌの６−ＢＡをＭＳ
培地に添加した結果であり、６−ＢＡと組み合わせて
２，４−Ｄによる処理を行うと、処理を行っている間を
通じて、ｍＲＮＡレベルの持続的な増加が引き起こされ
るという結果となった（図７Ｃ）。これらの結果は、外
来性のオーキシン及び外来性のサイトカイニンの両者
が、Ｏｃ培養細胞中においてＯｓＰＳＫの発現を増強す
る可能性を示唆している。

【００３７】本発明者らは、イネＯｃ培養細胞から、Ｏ
ｓＰＳＫのｃＤＮＡの単離を行っている（Yang et al.,
1999）。機能獲得及び機能欠損の研究より、ＯｓＰＳＫ
のｃＤＮＡは、植物より同定されたペプチド性増殖因子
であるＰＳＫ−αの前駆体をコードしていることを証明
した。本発明において、イネのＯｓＰＳＫ遺伝子を同定
し、特性解析を行った。サザンブロット解析より、Ｏｓ
ＰＳＫは単一コピーの遺伝子であることがわかった（図
１）。単離されたＯｓＰＳＫ遺伝子は、ｃＤＮＡに相同
する２つのエキソン、及び大きなイントロンより成る
（図２）。そのイントロンは、保存されたＧＴ−ＡＧイ
ントロンボーダー配列を有している。最初のエキソン
は、５’非コード領域及び、ＰＰ−ＰＳＫ（ｐｒｅｐｒ
ｏｐｈｙｔｏｓｕｌｆｏｋｉｎｅ）の約半分に当たるコ
ード領域から成り、そのコード領域はシグナルペプチド
（Von Heijne,1986 ）として作用すると思われる２２ア
ミノ酸残基を含む、疎水性アミノ末端領域を有してい
る。分泌経路に沿って蛋白質を保持させる基となるであ
ろうシグナル（Nakai and Kanehisa,1992 ）が、ＰＰ−
ＰＳＫの配列中において検出されなかった。それは、こ
の蛋白質が細胞外蛋白質であり、活性型のＰＳＫ−αが
レセプターのリガンドとして作用するかもしれない可能
性を示唆している。第二のエキソンは３’非コード領域
及びコード領域から成り、そのコード領域中にはＰＳＫ
−αの５つのアミノ酸配列が１回あり、カルボキシ末端
で終結している。

【００３８】イネＯｃ細胞は、１ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ
を添加したＭＳ培地上又はＭＳ培地中において、簡単に
維持が可能であり、通常は２週間の間隔で希釈する。過
去において、ＰＳＫ−αの合成及び生理学的機能の解析
において、イネＯｃ細胞が優れた素材であることを、本
発明者らは示してきた（Yang et al.,1999;Yang et a
l.,2000 ）。本研究において、ＯｓＰＳＫ遺伝子の５’
上流領域とイントロン−ＧＵＳレポーター遺伝子（Ohta
et al.,1990）とを融合させたプラスミドを構築した。
そのイントロン−ＧＵＳレポーター遺伝子は、ＧＵＳを
コードする配列のアミノ末端部分に、トウゴマカタラー
ゼ遺伝子の修飾されたイントロンを含んでいた。ＣａＭ
Ｖ３５Ｓプロモーターの制御下に置いたとき、イントロ
ン−ＧＵＳレポーター遺伝子は、ＧＵＳ活性を示した。
そのＧＵＳ活性の程度とパターンは、アグロバクテリウ
ム細胞ではなく、タバコ細胞においてＧＵＳ活性につき
元来得られたのと同様であった（Ohta et al.,1990）。
更に、イントロンによりＧＵＳ合成を刺激する顕著な効
果が、イネ細胞において認められており（Tanaka eta
l.,1991）、それはイントロン−ＧＵＳレポーター遺伝
子はイネ細胞において外来遺伝子の発現を検出するのに
有用であることを示している。ＯｓＰＳＫ遺伝子の種々
の長さの５’上流領域を融合することにより、最大のＧ
ＵＳ活性発現に必要な、最小のＯｓＰＳＫ５’上流配列
は、転写開始点から１．９ｋｂ上流に見出された（図
３）。この領域は、形質転換したＯｃ細胞においては、
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと比較して約５倍活性が高
く、その領域は形質転換したＯｃ培養細胞において外来
遺伝子の構成的な発現を制御できる、効果的なプロモー
ターを含んでいることを示唆している。

【００３９】ＯｓＰＳＫ遺伝子の５’上流領域中におい
て、制御因子である既知のモチーフがいくつか見出され
た（図３）。ＯｓＰＳＫプロモーターの最も顕著な特徴
は、ＣＣＡＡＴ ｂｏｘが３つ存在していることであ
る。ＣＣＡＡＴ ｂｏｘは、ＣＣＡＡＴ ｂｏｘ／エン
ハンサー結合蛋白質が結合する標的である（Ryden andB
eeemon,1989）。更に、３つのＳＳＲＥがＯｓＰＳＫの
５’上流領域に見出された。ＳＳＲＥは、内皮細胞にお
いて発現している、ヒト遺伝子のいくつかのプロモータ
ー中に存在するシス作動性の要素であり、その様な遺伝
子には血小板由来成長因子β鎖、及び形質転換成長因子
β１（Resnick et al.,1993 ）がある。このＳＳＲＥは
ＤＮＡ結合蛋白質と相互作用し、剪断応力反応性に必要
である。これらの制御因子を含んでいる領域を欠損する
ことにより、ＧＵＳの発現が低下する、という結果（図
６）となった。これは、それらの因子が実際にＯｓＰＳ
Ｋの発現に関与しているかもしれない、ということを示
唆している。加えて、３つのＥｂｏｘがＯｓＰＳＫの
５’末端領域に位置している。Ｅｂｏｘは、コンセンサ
ス配列である5'-CANNTG-3'を有しており、あるクラスの
転写因子の認識部位であると知られているが、制御機能
を発揮するためにホモ及びヘテロダイマーを形成するこ
とができる（Li and Capetanaki,1994）。Ｇｂｏｘ（5'
-CACGTG-3'）因子はシス作動性配列のファミリーを構成
しており、シス作動性配列のファミリーは、動物のみな
らず植物の種々の因子の反応において遺伝子発現の制御
に関与していることが示されてきている（Baker et a
l.,1997;Dolferus et al.,1994）。ＰＳＫ−αは、夜間
に高温の条件下において、シロイヌナズナの成長を促進
し、苗のクロロフィル含量を増加する（Yamakawa et a
l.,1999）。それは、ＰＳＫ−α前駆体遺伝子において
保存されているＥｂｏｘは、周囲の環境ストレスに反応
する制御機能を有している可能性を示唆している。

【００４０】８−ヌクレオチドエンハンサーコア様モチ
ーフであるGTGGAAAGが、ＯｓＰＳＫの５’上流領域（図
３）に存在している。そのエンハンサーコア様配列は、
既知のウイルスエンハンサーの間において最も共通した
配列であり、特定の遺伝子の転写活性を劇的に増加させ
る（Weiher et al.,1983）。エンハンサーコア様配列
は、ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子の
５’上流領域にもまた存在している（Hata et al.,198
7）。これらの発見は、そのエンハンサー配列は、ウイ
ルスから真核生物まで共通して保存されていることを示
している。エンハンサーコア様モチーフを含む、ＯｓＰ
ＳＫ遺伝子の１．９ｋｂの５’上流領域は、最大レベル
のＧＵＳ発現に必要でありかつ有効であった。そしてこ
の領域は、形質転換したＯｃ細胞（図５）中で、ＣａＭ
Ｖ３５Ｓプロモーターと比べても、より高い活性を示し
た。ＯｓＰＳＫ遺伝子中におけるエンハンサーコア様モ
チーフは、ＯｓＰＳＫ::ＧＵＳ遺伝子の高レベルの発現
において、何らかの機能的役割を有している可能性が考
えられ、この促進作用は、遺伝子の導入方向に依存して
いた。

【００４１】培地中に外植されたとき多くの植物組織は
脱分化し、分裂を回復して増殖するカルスを形成する。
細胞分裂の誘導及び引き続いてのカルス形成は通常、オ
ーキシン及びサイトカイニンの両者が同時に存在するこ
とを必要とする。それ故に細胞増殖は、オーキシン及び
サイトカイニンに対する直接的な反応かもしれず、又は
一定のレベルに達したＰＳＫ−αにより、オーキシン及
びサイトカイニンの制御下において引き起こされた間接
的な反応である可能性もある。懸濁液中で培養したアス
パラガスの葉肉細胞中において、１−ナフタレン酢酸及
び６−ＢＡの両者が存在しているときにだけ、ＰＳＫ−
αが生成した。これらの植物ホルモンのいずれか培地よ
り除かれたら、ＰＳＫ−αの明確な生産は認められなか
った。それは、ＰＳＫ−αの生産には、オーキシン及び
サイトカイニンの両者が通常必要であることを示してい
る（Matsubayashi et al.,1999a ）。本発明において、
外来のオーキシン及び外来のサイトカイニンの両者が、
形質転換したＯｃ細胞において、ＯｓＰＳＫ::ＧＵＳ遺
伝子の発現を増強することを示した（図７）。外来ホル
モンは、内在性のホルモンレベルの調節を反映しないか
もしれないから、外来ホルモンとの関わりについては、
更なる検討が必要である。

【００４２】（参考文献） (1) Akama, K., Shiraishi, H., Ohta, S., Nakamura,
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nctions, precursor and receptors. Plant Cell Physi
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【００４３】

【配列表】 ＜１１０＞出願人氏名：名古屋大学長 ＜１２０＞発明の名称：ファイトスルフォカイン前駆体遺伝子のプロモーター ＜１６０＞配列の数：５ ＜２１０＞配列番号：１ ＜２１１＞配列の長さ：３３５９ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：イネＯｃ細胞 ＜４００＞配列 -3359 GAATTCCTGG TTTAGTTTTC TATTAGTTGG GCACAAGATC ATAACTGCAG TATTGTATTT -3300 AAGATTCAAC ACAGGTTCAA TTTGTCACAC CCTGTAATTT GGCATCTACA ATCTGAAAAT -3240 GAATGGCTAA TCAAAAGGCT CTGAGCACAC AAATGGCTAA TTTCTTCCAT CTAGTTGAGA -3180 AACCTTTCAA TTATACAAAT GGAAAAGATA TGGATGTGAT TTGTGGGCTG AAAACCCTTT -3120 GATAATCAAC AATTGTTAGT GCCTTCAACT TTCAATGCAC CCATGTTTTC TTGTTACGTT -3060 TGCAAGATCA AAACAATGTT GGAAACGTCA TCTCGCCAGG TAAAGCAATG AATGACGACA -3000 ATTAAGAAGA TTTTTGCTCC TGAAGACTAC TAATGATGGA TATTAAGGGT ATAATAACCT -2940 ATCCAGGATT GTGATGTTCA ATCCCCTTGT AGCATACCTG ATAAGTGTGG TGAGTTAAAA -2880 GCAGTCCCAT TTACAAAAAG AAAAAGGAAG GCCCATATCT AGCAAAAAAA ATAGACTGCA -2820 TACGTATAGT TGTTTGTGAA AAAGTTCAAG ATGCATACAA GCCGCAGTTT TCTTCAGATA -2760 GTGTGGCATC TTCTTACTTC AAGGAAAAAA ACATTATGCT AGTTTGGAAA TAACTTCAAA -2700 TTTGTCCCTG TGATGGAAAT TAAACCATTG GTAAGTAGTC TAGCAATATC AAACTTAAGG -2640 TGTGTGTTGC ATATGAATTA GGAAAAACCA TGTCAAACCA ACTGAAACCA AGGAAAATCC -2580 ACCATACTAA CATACTTAAA TACCTTGAGG TGAGAAACAT ATAAAGCATA CAGAGAACAT -2520 GATTAGTAAG AATGACGAAG ATAAAATACA CTAAGGTAAT TAGGGAAAAC AGCAAAGTTC -2460 ATTTGGACAT TTGATATCAT GGAAAGCTAT AGAAAAATGT GTACCTTACA GACCGAAATG -2400 GAAAGAGTCC ACGATAAAAA GTCATTTTTG CACCATTTTC CATTGTAATA CTTATCGAGA -2340 CAAATTTATG CGCGCACCTT TTTTCCCCCA TCCATCCAAA TAAATTTTTA TTGGTAAAAC -2280 TTGTTGCTTT ATGACAGCAG GAAGTATCTT TTACAATCTA ATGTACCCAT CAGTACAATA -2220 TTCTAGTAGT ATATCTACAA CAAAAATAAA GATCAAGGGC ATGCTTGGCA CATAGAATTT -2160 TGTATGGAAT TAGTTCAAGT CATTTGTTAA GCACATAAAT TTGGCAAAAC TCTCATCTTC -2100 CAAATTAACC TTGCAAAATT TAACCAAGAA AAACTATATA CTATCATCCC GTTCCATGTC -2040 CTTCCTAGTA GCAAACTTTT TATGCAACCA TTTTTTTTTC TCGACAGGGC ATTATTCGTG -1980 GTTACTGTGT GCATTAATAG CATTAATAAC AGCTAGCATG TGAGCCTGTT ATTAGGGGTA -1920 GGCAGAAAGA TCTGAACCGA AAAGACCGAC ACCGAGTAAA TTTGGTCATC AATTCGGTCC -1860 TATATAGTGA AAGACCGAAC TTTATTCGGT CAATTCGGTT AGTCTCCTCG GTTAACCGAA -1800 TAGACGAAAG ACCAAATTAA CAAAAAAAAA ATCTAAATGC AACCTACAAT CCACCAAGTT -1740 CAATATAATT AAACTCTAAT TTTCACAGCC CTACTTCTTC TAGGCATGCA ACGTAATAAG -1680 AGTCTTTAGT CATACGTGCT TATGGATTTG TTTTGTGATT TTTGTGTTAA AAATTTCCAT -1620 TATTTCTTTG CATATATGAA AATGTTGCTG AATTTCGGTC AGACCGAGAC CGAGACCGAA -1560 TTTGTCGGTC ATGATATTTT TTGCGTTGAA ATTTGGTCTT TACTTTTCGA AGATCGAGAC -1500 CGAATATTTC GGTCAGACCG AATGCCCACC CCTACTTGTT CTCTCTATAC CCATATGTCA -1440 ATAATAATTA TTATTATACT CACTCCGTTC TAAACTATGA GGCACTTCCT TTTTAATGAA -1380 AAATCAAACT CGATAACTTT TAATTAAAAA TAATACTAAT ATATACTAAA TATTATGCAT -1320 GTTATATCAC TATATTTATA TTTTAAAGTA CTTTCATGTA ATGCTAATTT CATATTCGTT -1260 AAAATATAGA TATTATAATT CAAGATGGAG GAGTACAACC AAACAGTAGA GGATCCACTT -1200 CCTCTTTATT TATGCCAAGT TATTTTAGAA CCATGCTCCA CACAAGACAC GCACACATCG -1140 CATTGACATG TGTTAATTTT GTTTCGTGTG GAAAGGCATG GAGGCCGGTT CCCCACAATG -1080 TCCAATCGCT GCCAACTCTG CGAGTAGAGA AGGGGGAGGA ATGGAAGCTT GTGCATGGCC -1020 TAAACACACA CTTTGACACT TGACTTTGTG TTGGAATCCA TTGATTAGCC GCTCAATGCA -960 GCATCCCCAA TGCAGAGGTC TCCCCTCTAC TCCTAGCTCT TTGCAAAACC CAATGTCCAC -900 CATTGACTTC AATTTCTCAG TCTTCCTTGC TCATGTCTCC CTTGCCCTTC TCTCAACTTG -840 GGTCAACTTC ATTAAATTTC TCCCTTGGTA TGTGCAAAGG CTTTGAAGGT GTAGGCCTGG -780 TGCAAACATT GCAAAGTCAA AATGTACGGT ACGATGCATC GATTTACTGA CATGGTAATC -720 TTCCCGATTC CCGTGTAAAT AAACTACTAT TTCATTCGTT TCATTTATAA GATGTTTTAA -660 TTTTGTTATG GGCCAAAACT TGCTTAACTT TGACATAGTT TATTGAAAAA AAATAGGTTA -600 GAAAACTTAA ATTCAGGAAA AAAAGATAGG TGAGATATCC TAGTATAACC ATCTTGGTTT -540 GGTTAAGACA TGCCTTAGAA TAGACGAGTC GGTCGAAACG GTCAGAATCG GTAGCGTCCC -480 TTTAGAAACG ACGCTCAATC GACCTGTAAT TGACCGTATT TATCATTTAC AACATTAATA -420 CAATGCAAAA AGAAATTAGA AATTTTTTTA TAAATAGTCA AAAATGGTAC GCCAGTCTAT -360 CGGGAATTTA TGTGACCGTT TTCACCCCTA TTCGAGTGCA TGGGCACTTG AGTTGTAAAA -300 TTGACTTGAT CGAGATACCA ACGTATATAC AATTTACACA TCGAATTGCC GGGAAATTGG -240 ACTTTGAGAT CATTTTAGCT CCCCAAGGCG ATCCACACGT ACTCTACCAC AAAACTTTGG -180 TTGTTTTTGC TATCATCTCA AGGCCACTGC AGCATGCGCA TTGCGCACGT ACGAGATGCT -120 ACTCTTTCCA AGGAACCGAT GTCTCTCTCT CTCTCTCCAG CCTCCATTGC TTATAAATAT -60 GTTCCTCCTT CCTATACTGG TAATGGCAGC AAAGCAAAGA AACAAAGAAG AAGAAGAAA -1 ＜２１０＞配列番号：２ ＜２１１＞配列の長さ：１９１１ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：イネＯｃ細胞 ＜４００＞配列 -1911 GA TCTGAACCGA AAAGACCGAC ACCGAGTAAA TTTGGTCATC AATTCGGTCC -1860 TATATAGTGA AAGACCGAAC TTTATTCGGT CAATTCGGTT AGTCTCCTCG GTTAACCGAA -1800 TAGACGAAAG ACCAAATTAA CAAAAAAAAA ATCTAAATGC AACCTACAAT CCACCAAGTT -1740 CAATATAATT AAACTCTAAT TTTCACAGCC CTACTTCTTC TAGGCATGCA ACGTAATAAG -1680 AGTCTTTAGT CATACGTGCT TATGGATTTG TTTTGTGATT TTTGTGTTAA AAATTTCCAT -1620 TATTTCTTTG CATATATGAA AATGTTGCTG AATTTCGGTC AGACCGAGAC CGAGACCGAA -1560 TTTGTCGGTC ATGATATTTT TTGCGTTGAA ATTTGGTCTT TACTTTTCGA AGATCGAGAC -1500 CGAATATTTC GGTCAGACCG AATGCCCACC CCTACTTGTT CTCTCTATAC CCATATGTCA -1440 ATAATAATTA TTATTATACT CACTCCGTTC TAAACTATGA GGCACTTCCT TTTTAATGAA -1380 AAATCAAACT CGATAACTTT TAATTAAAAA TAATACTAAT ATATACTAAA TATTATGCAT -1320 GTTATATCAC TATATTTATA TTTTAAAGTA CTTTCATGTA ATGCTAATTT CATATTCGTT -1260 AAAATATAGA TATTATAATT CAAGATGGAG GAGTACAACC AAACAGTAGA GGATCCACTT -1200 CCTCTTTATT TATGCCAAGT TATTTTAGAA CCATGCTCCA CACAAGACAC GCACACATCG -1140 CATTGACATG TGTTAATTTT GTTTCGTGTG GAAAGGCATG GAGGCCGGTT CCCCACAATG -1080 TCCAATCGCT GCCAACTCTG CGAGTAGAGA AGGGGGAGGA ATGGAAGCTT GTGCATGGCC -1020 TAAACACACA CTTTGACACT TGACTTTGTG TTGGAATCCA TTGATTAGCC GCTCAATGCA -960 GCATCCCCAA TGCAGAGGTC TCCCCTCTAC TCCTAGCTCT TTGCAAAACC CAATGTCCAC -900 CATTGACTTC AATTTCTCAG TCTTCCTTGC TCATGTCTCC CTTGCCCTTC TCTCAACTTG -840 GGTCAACTTC ATTAAATTTC TCCCTTGGTA TGTGCAAAGG CTTTGAAGGT GTAGGCCTGG -780 TGCAAACATT GCAAAGTCAA AATGTACGGT ACGATGCATC GATTTACTGA CATGGTAATC -720 TTCCCGATTC CCGTGTAAAT AAACTACTAT TTCATTCGTT TCATTTATAA GATGTTTTAA -660 TTTTGTTATG GGCCAAAACT TGCTTAACTT TGACATAGTT TATTGAAAAA AAATAGGTTA -600 GAAAACTTAA ATTCAGGAAA AAAAGATAGG TGAGATATCC TAGTATAACC ATCTTGGTTT -540 GGTTAAGACA TGCCTTAGAA TAGACGAGTC GGTCGAAACG GTCAGAATCG GTAGCGTCCC -480 TTTAGAAACG ACGCTCAATC GACCTGTAAT TGACCGTATT TATCATTTAC AACATTAATA -420 CAATGCAAAA AGAAATTAGA AATTTTTTTA TAAATAGTCA AAAATGGTAC GCCAGTCTAT -360 CGGGAATTTA TGTGACCGTT TTCACCCCTA TTCGAGTGCA TGGGCACTTG AGTTGTAAAA -300 TTGACTTGAT CGAGATACCA ACGTATATAC AATTTACACA TCGAATTGCC GGGAAATTGG -240 ACTTTGAGAT CATTTTAGCT CCCCAAGGCG ATCCACACGT ACTCTACCAC AAAACTTTGG -180 TTGTTTTTGC TATCATCTCA AGGCCACTGC AGCATGCGCA TTGCGCACGT ACGAGATGCT -120 ACTCTTTCCA AGGAACCGAT GTCTCTCTCT CTCTCTCCAG CCTCCATTGC TTATAAATAT -60 GTTCCTCCTT CCTATACTGG TAATGGCAGC AAAGCAAAGA AACAAAGAAG AAGAAGAAA -1 ＜２１０＞配列番号：３ ＜２１１＞配列の長さ：１０３４ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：イネＯｃ細胞 ＜４００＞配列 -1034 AGCTT GTGCATGGCC -1020 TAAACACACA CTTTGACACT TGACTTTGTG TTGGAATCCA TTGATTAGCC GCTCAATGCA -960 GCATCCCCAA TGCAGAGGTC TCCCCTCTAC TCCTAGCTCT TTGCAAAACC CAATGTCCAC -900 CATTGACTTC AATTTCTCAG TCTTCCTTGC TCATGTCTCC CTTGCCCTTC TCTCAACTTG -840 GGTCAACTTC ATTAAATTTC TCCCTTGGTA TGTGCAAAGG CTTTGAAGGT GTAGGCCTGG -780 TGCAAACATT GCAAAGTCAA AATGTACGGT ACGATGCATC GATTTACTGA CATGGTAATC -720 TTCCCGATTC CCGTGTAAAT AAACTACTAT TTCATTCGTT TCATTTATAA GATGTTTTAA -660 TTTTGTTATG GGCCAAAACT TGCTTAACTT TGACATAGTT TATTGAAAAA AAATAGGTTA -600 GAAAACTTAA ATTCAGGAAA AAAAGATAGG TGAGATATCC TAGTATAACC ATCTTGGTTT -540 GGTTAAGACA TGCCTTAGAA TAGACGAGTC GGTCGAAACG GTCAGAATCG GTAGCGTCCC -480 TTTAGAAACG ACGCTCAATC GACCTGTAAT TGACCGTATT TATCATTTAC AACATTAATA -420 CAATGCAAAA AGAAATTAGA AATTTTTTTA TAAATAGTCA AAAATGGTAC GCCAGTCTAT -360 CGGGAATTTA TGTGACCGTT TTCACCCCTA TTCGAGTGCA TGGGCACTTG AGTTGTAAAA -300 TTGACTTGAT CGAGATACCA ACGTATATAC AATTTACACA TCGAATTGCC GGGAAATTGG -240 ACTTTGAGAT CATTTTAGCT CCCCAAGGCG ATCCACACGT ACTCTACCAC AAAACTTTGG -180 TTGTTTTTGC TATCATCTCA AGGCCACTGC AGCATGCGCA TTGCGCACGT ACGAGATGCT -120 ACTCTTTCCA AGGAACCGAT GTCTCTCTCT CTCTCTCCAG CCTCCATTGC TTATAAATAT -60 GTTCCTCCTT CCTATACTGG TAATGGCAGC AAAGCAAAGA AACAAAGAAG AAGAAGAAA -1 ＜２１０＞配列番号：４ ＜２１１＞配列の長さ：５６３ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：イネＯｃ細胞 ＜４００＞配列 -563 ATCC TAGTATAACC ATCTTGGTTT -540 GGTTAAGACA TGCCTTAGAA TAGACGAGTC GGTCGAAACG GTCAGAATCG GTAGCGTCCC -480 TTTAGAAACG ACGCTCAATC GACCTGTAAT TGACCGTATT TATCATTTAC AACATTAATA -420 CAATGCAAAA AGAAATTAGA AATTTTTTTA TAAATAGTCA AAAATGGTAC GCCAGTCTAT -360 CGGGAATTTA TGTGACCGTT TTCACCCCTA TTCGAGTGCA TGGGCACTTG AGTTGTAAAA -300 TTGACTTGAT CGAGATACCA ACGTATATAC AATTTACACA TCGAATTGCC GGGAAATTGG -240 ACTTTGAGAT CATTTTAGCT CCCCAAGGCG ATCCACACGT ACTCTACCAC AAAACTTTGG -180 TTGTTTTTGC TATCATCTCA AGGCCACTGC AGCATGCGCA TTGCGCACGT ACGAGATGCT -120 ACTCTTTCCA AGGAACCGAT GTCTCTCTCT CTCTCTCCAG CCTCCATTGC TTATAAATAT -60 GTTCCTCCTT CCTATACTGG TAATGGCAGC AAAGCAAAGA AACAAAGAAG AAGAAGAAA -1 ＜２１０＞配列番号：５ ＜２１１＞配列の長さ：５３９２ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：イネＯｃ細胞 ＜４００＞配列 -3359 GAATTCCTGG TTTAGTTTTC TATTAGTTGG GCACAAGATC ATAACTGCAG TATTGTATTT -3300 AAGATTCAAC ACAGGTTCAA TTTGTCACAC CCTGTAATTT GGCATCTACA ATCTGAAAAT -3240 GAATGGCTAA TCAAAAGGCT CTGAGCACAC AAATGGCTAA TTTCTTCCAT CTAGTTGAGA -3180 AACCTTTCAA TTATACAAAT GGAAAAGATA TGGATGTGAT TTGTGGGCTG AAAACCCTTT -3120 GATAATCAAC AATTGTTAGT GCCTTCAACT TTCAATGCAC CCATGTTTTC TTGTTACGTT -3060 TGCAAGATCA AAACAATGTT GGAAACGTCA TCTCGCCAGG TAAAGCAATG AATGACGACA -3000 ATTAAGAAGA TTTTTGCTCC TGAAGACTAC TAATGATGGA TATTAAGGGT ATAATAACCT -2940 ATCCAGGATT GTGATGTTCA ATCCCCTTGT AGCATACCTG ATAAGTGTGG TGAGTTAAAA -2880 GCAGTCCCAT TTACAAAAAG AAAAAGGAAG GCCCATATCT AGCAAAAAAA ATAGACTGCA -2820 TACGTATAGT TGTTTGTGAA AAAGTTCAAG ATGCATACAA GCCGCAGTTT TCTTCAGATA -2760 GTGTGGCATC TTCTTACTTC AAGGAAAAAA ACATTATGCT AGTTTGGAAA TAACTTCAAA -2700 TTTGTCCCTG TGATGGAAAT TAAACCATTG GTAAGTAGTC TAGCAATATC AAACTTAAGG -2640 TGTGTGTTGC ATATGAATTA GGAAAAACCA TGTCAAACCA ACTGAAACCA AGGAAAATCC -2580 ACCATACTAA CATACTTAAA TACCTTGAGG TGAGAAACAT ATAAAGCATA CAGAGAACAT -2520 GATTAGTAAG AATGACGAAG ATAAAATACA CTAAGGTAAT TAGGGAAAAC AGCAAAGTTC -2460 ATTTGGACAT TTGATATCAT GGAAAGCTAT AGAAAAATGT GTACCTTACA GACCGAAATG -2400 GAAAGAGTCC ACGATAAAAA GTCATTTTTG CACCATTTTC CATTGTAATA CTTATCGAGA -2340 CAAATTTATG CGCGCACCTT TTTTCCCCCA TCCATCCAAA TAAATTTTTA TTGGTAAAAC -2280 TTGTTGCTTT ATGACAGCAG GAAGTATCTT TTACAATCTA ATGTACCCAT CAGTACAATA -2220 TTCTAGTAGT ATATCTACAA CAAAAATAAA GATCAAGGGC ATGCTTGGCA CATAGAATTT -2160 TGTATGGAAT TAGTTCAAGT CATTTGTTAA GCACATAAAT TTGGCAAAAC TCTCATCTTC -2100 CAAATTAACC TTGCAAAATT TAACCAAGAA AAACTATATA CTATCATCCC GTTCCATGTC -2040 CTTCCTAGTA GCAAACTTTT TATGCAACCA TTTTTTTTTC TCGACAGGGC ATTATTCGTG -1980 GTTACTGTGT GCATTAATAG CATTAATAAC AGCTAGCATG TGAGCCTGTT ATTAGGGGTA -1920 GGCAGAAAGA TCTGAACCGA AAAGACCGAC ACCGAGTAAA TTTGGTCATC AATTCGGTCC -1860 TATATAGTGA AAGACCGAAC TTTATTCGGT CAATTCGGTT AGTCTCCTCG GTTAACCGAA -1800 TAGACGAAAG ACCAAATTAA CAAAAAAAAA ATCTAAATGC AACCTACAAT CCACCAAGTT -1740 CAATATAATT AAACTCTAAT TTTCACAGCC CTACTTCTTC TAGGCATGCA ACGTAATAAG -1680 AGTCTTTAGT CATACGTGCT TATGGATTTG TTTTGTGATT TTTGTGTTAA AAATTTCCAT -1620 TATTTCTTTG CATATATGAA AATGTTGCTG AATTTCGGTC AGACCGAGAC CGAGACCGAA -1560 TTTGTCGGTC ATGATATTTT TTGCGTTGAA ATTTGGTCTT TACTTTTCGA AGATCGAGAC -1500 CGAATATTTC GGTCAGACCG AATGCCCACC CCTACTTGTT CTCTCTATAC CCATATGTCA -1440 ATAATAATTA TTATTATACT CACTCCGTTC TAAACTATGA GGCACTTCCT TTTTAATGAA -1380 AAATCAAACT CGATAACTTT TAATTAAAAA TAATACTAAT ATATACTAAA TATTATGCAT -1320 GTTATATCAC TATATTTATA TTTTAAAGTA CTTTCATGTA ATGCTAATTT CATATTCGTT -1260 AAAATATAGA TATTATAATT CAAGATGGAG GAGTACAACC AAACAGTAGA GGATCCACTT -1200 CCTCTTTATT TATGCCAAGT TATTTTAGAA CCATGCTCCA CACAAGACAC GCACACATCG -1140 CATTGACATG TGTTAATTTT GTTTCGTGTG GAAAGGCATG GAGGCCGGTT CCCCACAATG -1080 TCCAATCGCT GCCAACTCTG CGAGTAGAGA AGGGGGAGGA ATGGAAGCTT GTGCATGGCC -1020 TAAACACACA CTTTGACACT TGACTTTGTG TTGGAATCCA TTGATTAGCC GCTCAATGCA -960 GCATCCCCAA TGCAGAGGTC TCCCCTCTAC TCCTAGCTCT TTGCAAAACC CAATGTCCAC -900 CATTGACTTC AATTTCTCAG TCTTCCTTGC TCATGTCTCC CTTGCCCTTC TCTCAACTTG -840 GGTCAACTTC ATTAAATTTC TCCCTTGGTA TGTGCAAAGG CTTTGAAGGT GTAGGCCTGG -780 TGCAAACATT GCAAAGTCAA AATGTACGGT ACGATGCATC GATTTACTGA CATGGTAATC -720 TTCCCGATTC CCGTGTAAAT AAACTACTAT TTCATTCGTT TCATTTATAA GATGTTTTAA -660 TTTTGTTATG GGCCAAAACT TGCTTAACTT TGACATAGTT TATTGAAAAA AAATAGGTTA -600 GAAAACTTAA ATTCAGGAAA AAAAGATAGG TGAGATATCC TAGTATAACC ATCTTGGTTT -540 GGTTAAGACA TGCCTTAGAA TAGACGAGTC GGTCGAAACG GTCAGAATCG GTAGCGTCCC -480 TTTAGAAACG ACGCTCAATC GACCTGTAAT TGACCGTATT TATCATTTAC AACATTAATA -420 CAATGCAAAA AGAAATTAGA AATTTTTTTA TAAATAGTCA AAAATGGTAC GCCAGTCTAT -360 CGGGAATTTA TGTGACCGTT TTCACCCCTA TTCGAGTGCA TGGGCACTTG AGTTGTAAAA -300 TTGACTTGAT CGAGATACCA ACGTATATAC AATTTACACA TCGAATTGCC GGGAAATTGG -240 ACTTTGAGAT CATTTTAGCT CCCCAAGGCG ATCCACACGT ACTCTACCAC AAAACTTTGG -180 TTGTTTTTGC TATCATCTCA AGGCCACTGC AGCATGCGCA TTGCGCACGT ACGAGATGCT -120 ACTCTTTCCA AGGAACCGAT GTCTCTCTCT CTCTCTCCAG CCTCCATTGC TTATAAATAT -60 GTTCCTCCTT CCTATACTGG TAATGGCAGC AAAGCAAAGA AACAAAGAAG AAGAAGAAAG 1 AAGAAGCAGC AGCAAAAAAG TTGATCAGTT AATTAGCAAG TGTGTTCTTC TTTCTTTTGG 61 TGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGATCTCAGA ATGGTGAATC CAGGAAGAAC 121 AGCTAGGGCA CTCTGCCTCC TATGCCTTGC TCTCCTCCTG CTAGGTCAAG ATACCCATTC 181 CAGGAAGCTC CTGTTGCAGG AGAAGCACAG CCATGGCGTC GGCAACGGCA CAACCACCAC 241 CCAGGTCAGC AGAATTAGTT CAGTATCGTT TCTTCAGCTT ATTAACCGTG GCCAAATTTG 301 AATTCTATAA CTTAATTTTA GAGTTGATGT GGATGTGTTA TTAATCATAG ATTATTTCTC 361 AACATTGGGT TTTATGCCGC TAATAACACA TATGTAAAAC CTTTACAAAC AAATTATTTT 421 TCGGTCGCTA ATAAGCGTTA CGGCTTATAA TTTTCCTAGT GAACAGTGCA TGCATTTTGC 481 AAACTTCTTG TTGGCTCTGG TTGCAACTTG CAAGCACGCA TATGCATTGA GAGAAGAGTT 541 CATACACACA CTGTATTATA TATATGTACA TTTGGGGTAT AAGATACTAA AATGAAACAG 601 GAGCATCGTG TTCTGAAATG GCGTGGCGTT CTTGTTTATT TTCAGCTTGT GTAATTGCTG 661 GAGGGCAATA GCATGGGAAA ACACTCTAAT CTGAATCTGT GACACCTGGA ACAGTAGCAC 721 CATTCTTGAT GGCATAATCA TGTCTTAACC ACATGTCTAT CGTTGGAATC CTGGTACAAT 781 GCTCCGAGCT GCATCGATCC ATCCATGCAT GTTACCTCCA TGTGTTCGAA GATGCTATAT 841 ATTTGCATAC GACAGGCACA GCTTCATGAA TGTACTTCGG CACTGTCTTA CCAAACTCCC 901 CTCCGTTTCA TATTATAAGT CATTTGATTT TTTTTTCCTA GTCAAGTATG ACCAAGCTTA 961 TAGAAAAAAT TAGAAACATC TAAAATAACA AACTAGTTTC AGAAAATCTA ACATTGAATA 1021 TATTTTGATA ATATATTTGT TTTGGGTTGA AAATACTAGT ATATTTTTCA ATAAACTTGG 1081 TCCAACTTAA CTAGAAAAAA AATCAAACGA CTTATAATAT GAAACGGAGG GAGAACTTTC 1141 GTTTTGATTT TCCAAAGAAC GACATTATCT TAATTTTAAG ACATCGTTAT TGTTTTTAAA 1201 ATAATAATAG GATCACTAGT TTCTATTACA ATATATTTGT AAAACACAAT AATATGACAA 1261 TATTATAGAG GTAGTACTAC TTTTTGATAT TTCCATACAC CCAATCTATA AATTGATCAA 1321 AGTTTCTGCT TCCACTCTGT TTCGTTCGTT CTTGAAAGTT TTCTTCTAAC AGTATGATGA 1381 TCTTGATCAA TCAGGAACCA AGCAGAGAGA ATGGAGGAAG TACAGGTTCC AATAACAATG 1441 GGCAGCTGCA GTTTGATTCA GCCAAATGGG AAGAATTCCA CACGGATTAT ATCTACACCC 1501 AAGATGTCAA AAACCCATAA TGGCTGTTCA TTTATGATTT GAACTAGTAC TAGTAGCTTA 1561 TACCTTCTGC GCGTCTTTTG TTCGTTTGGA GAGGGGATTT TCTTGGGATT TAGCATATGA 1621 ACTAATTAAA TTAAATCCCA GGCAAATCCC ACTCAGCCCA TTTTGTGCAG AAGTTGTCAG 1681 TGTGCACTGT ATAATTATTT AGTCATACAC AACTACTCCT GGTAACTACT CCTATCTTCG 1741 ATGAATTTTC TGGTTTTGCC AGACGTGACA ATAGTCCAGT AGCATGCAGT ACCCTCTCAG 1801 AATCCCTGTA ATTTTTAGCA AAAAAAAAAG GAAGAAAAGA AAAGAAGCTT CCCTACTTTC 1861 TCCGTTTCAC AATGTAAGTC ATTCTAGCAT TTTCTACATT CATATTGATG TTAATGAATC 1921 TGGATAGATA TATACTCCCT CCGTCGAAAA AAAAAAAGGC AAACTGTGGG TTCCGTGCTA 1981 ACGTTTGACT GTCCGCTTAT ATGAAATTTT TTTATAATTA GGATTTTCAT TG 2033

【発明の効果】本発明により、イネのファイトスルフォ
カイン前駆体遺伝子に由来する、新規なプロモーターが
与えられた。本発明のプロモーターは、カリフラワーモ
ザイクウイルス３５Ｓプロモーター以上のプロモーター
活性を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＯｓＰＳＫのｃＤＮＡをプローブと
して、イネＯｃ細胞のゲノムＤＮＡについて、ブロッテ
ィングで解析を行った結果を示す写真である。

【図２】 図２は、ＯｓＰＳＫ遺伝子のゲノム遺伝子の
制限酵素地図及びＯｓＰＳＫ遺伝子のゲノム構成を示
す、模式図である。

【図３】 図３は、プライマー伸長反応及びＳ１マッピ
ングを行った結果を示す写真である。

【図４】 図４は、ＯｓＰＳＫ遺伝子の塩基配列及び推
定アミノ酸配列を示す図である。

【図５】 図５は、ＯｓＰＳＫ−イントロン−ＧＵＳコ
ンストラクトの構造を示した模式図である。

【図６】 図６は、各ＯｓＰＳＫ−イントロン−ＧＵＳ
コンストラクトを導入して形質転換したＯｃ細胞のＧＵ
Ｓ活性を示す図である。

【図７】 図７は、オーキシンとサイトカイニンによ
る、ＯｓＰＳＫ::ＧＵＳ遺伝子の制御を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 松林 嘉克 愛知県名古屋市千草区唐山町３丁目34 フ ォーブルＹ105 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB03 CD03 CD06 CD09 4B024 AA08 CA01 CA09 CA11 DA01 DA06 EA03 EA04 FA02 FA13 GA11 GA17 HA12 4B065 AA11X AA88X AA88Y AA98X AB01 BA02 BA24 BD34 BD35 CA53

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配
   列からなることを特徴とする、プロモーター。 （ａ）配列表の配列番号１に示す、塩基番号（−３３５
   ９）−（−１）で示される塩基配列からなることを特徴
   とする、プロモーター。 （ｂ）（ａ）の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付
   加され、下流に存在する構造遺伝子の発現を活性化する
   作用を有する、プロモーター。
2. 【請求項２】 以下の（ｃ）または（ｄ）に示す塩基配
   列からなることを特徴とする、プロモーター。 （ｃ）配列表の配列番号２に示す、塩基番号（−１９１
   １）−（−１）で示される塩基配列からなることを特徴
   とする、プロモーター。 （ｄ）（ｃ）の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付
   加され、下流に存在する構造遺伝子の発現を活性化する
   作用を有する、プロモーター。
3. 【請求項３】 以下の（ｅ）または（ｆ）に示す塩基配
   列からなることを特徴とする、プロモーター。 （ｅ）配列表の配列番号３に示す、塩基番号（−１０３
   ４）−（−１）で示される塩基配列からなることを特徴
   とする、プロモーター。 （ｆ）（ｅ）の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付
   加され、下流に存在する構造遺伝子の発現を活性化する
   作用を有する、プロモーター。
4. 【請求項４】 以下の（ｇ）または（ｈ）に示す塩基配
   列からなることを特徴とする、プロモーター。 （ｇ）配列表の配列番号４に示す、塩基番号（−５６
   ３）−（−１）で示される塩基配列からなることを特徴
   とする、プロモーター。 （ｈ）（ｇ）の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付
   加され、下流に存在する構造遺伝子の発現を活性化する
   作用を有する、プロモーター。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号５に示す、塩基番号
   （−３３５９）−（２０３３）で示される塩基配列から
   なることを特徴とする、ファイトスルフォカイン前駆体
   をコードする遺伝子。
6. 【請求項６】 請求項１ないし４のプロモーターを導入
   した、プラスミドベクター。
7. 【請求項７】 請求項１ないし４のプロモーターを植物
   細胞に導入した、形質転換植物細胞。
8. 【請求項８】 請求項１ないし４のプロモーターを植物
   体に導入した、形質転換植物体。
9. 【請求項９】 請求項１ないし４のプロモーターを植物
   に導入することにより、当該植物に導入した外来の構造
   遺伝子又は当該植物に内在する構造遺伝子の発現を活性
   化する方法。