JP3038381B1 - 植物の細胞増殖因子前駆体ポリペプチド、増殖因子前駆体ポリペプチドをコ―ドする遺伝子、植物の増殖促進方法 - Google Patents
植物の細胞増殖因子前駆体ポリペプチド、増殖因子前駆体ポリペプチドをコ―ドする遺伝子、植物の増殖促進方法Info
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Abstract
【要約】
【課題】 形質転換植物を作製するために必要な技術で
ある、植物細胞の増殖を促進する方法を開発する。 【解決手段】 本発明により、植物の植物細胞の増殖を
促進する作用を有するペプチドであるファイトスルフォ
カインの前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列、および当
該前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列が
与えられた。当該遺伝子を植物に導入する事により、植
物細胞の増殖を促進させる事が可能である。
ある、植物細胞の増殖を促進する方法を開発する。 【解決手段】 本発明により、植物の植物細胞の増殖を
促進する作用を有するペプチドであるファイトスルフォ
カインの前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列、および当
該前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列が
与えられた。当該遺伝子を植物に導入する事により、植
物細胞の増殖を促進させる事が可能である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、植物細胞の増殖を
促進する作用を有するペプチドであるファイトスルフォ
カインの前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列、および当
該前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子、更には当該
遺伝子を植物に導入する事による植物細胞の増殖促進方
法に関する。
促進する作用を有するペプチドであるファイトスルフォ
カインの前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列、および当
該前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子、更には当該
遺伝子を植物に導入する事による植物細胞の増殖促進方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、植物遺伝子工学の発達により、種
々の外来遺伝子を導入した植物の作製が盛んに行われて
いる。そのような技術は多くの植物に対して利用されて
いて、産業的にも重要な役割を果たしており、例えば植
物細胞が生産する２次代謝産物の生産性を高めたよう
な、有用な新種の植物を得る事が可能である。
々の外来遺伝子を導入した植物の作製が盛んに行われて
いる。そのような技術は多くの植物に対して利用されて
いて、産業的にも重要な役割を果たしており、例えば植
物細胞が生産する２次代謝産物の生産性を高めたよう
な、有用な新種の植物を得る事が可能である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ところで、外来遺伝子
を導入した形質細胞植物を作製するにあたり、遺伝子導
入した少数の遊離細胞を培養して植物体を再生する必要
があるが、外来遺伝子を導入した植物の細胞は成長が遅
く、植物個体まで分化させる事が困難である場合が多か
った。それは、植物細胞は細胞外に未知の増殖因子を分
泌するが、細胞密度が低い場合には、増殖因子が必要濃
度に達するのに時間がかかったり、培地中で分解する速
度の方が速くなってしまうためである。また、培養その
ものが困難であったり、増殖が非常に遅い植物種が多数
ある。よって、植物細胞を培養するにあたり、その増殖
を促進する事を可能とする手段が求められていた。
を導入した形質細胞植物を作製するにあたり、遺伝子導
入した少数の遊離細胞を培養して植物体を再生する必要
があるが、外来遺伝子を導入した植物の細胞は成長が遅
く、植物個体まで分化させる事が困難である場合が多か
った。それは、植物細胞は細胞外に未知の増殖因子を分
泌するが、細胞密度が低い場合には、増殖因子が必要濃
度に達するのに時間がかかったり、培地中で分解する速
度の方が速くなってしまうためである。また、培養その
ものが困難であったり、増殖が非常に遅い植物種が多数
ある。よって、植物細胞を培養するにあたり、その増殖
を促進する事を可能とする手段が求められていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】発明者らは、上記のペプ
チド性の植物の成長因子として、ファイトスルフォカイ
ン（ｐｈｙｔｏｓｕｌｆｏｋｉｎ：ＰＳＫ）を単離精製
した（Y.Matsubayashiand Y.Sakagami,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 93,p7623,1996）。ＰＳＫは一度培養に使用し
た、いわゆる「馴化培地」（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ
ｍｅｄｉｕｍ：ＣＭ）中に含有される植物細胞の増殖因
子の一つであり、細胞外部に分泌されて、いわゆるオー
トクライン的に作用する事が知られている。また、ＰＳ
Ｋは翻訳後修飾によりそのチロシン残基が硫酸化された
ぺプチドであり、ａｌｐｈａとｂｅｔａの２つの型が存
在している。以下にＰＳＫーａｌｐｈａとＰＳＫーｂｅ
ｔａの構造を示す。尚、ｂｅｔａ型はａｌｐｈａ型の酵
素的分解産物であり、ｂｅｔａ型の細胞増殖促進活性
は、ａｌｐｈａ型と比較して約１０分の１である。 ＰＳＫーａｌｐｈａ：Tyr(SO3H)-Ile-Tyr(SO3H)-Thr-Gl
n ＰＳＫーｂｅｔａ：Tyr(SO3H)-Ile-Tyr(SO3H)-Thr
チド性の植物の成長因子として、ファイトスルフォカイ
ン（ｐｈｙｔｏｓｕｌｆｏｋｉｎ：ＰＳＫ）を単離精製
した（Y.Matsubayashiand Y.Sakagami,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 93,p7623,1996）。ＰＳＫは一度培養に使用し
た、いわゆる「馴化培地」（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ
ｍｅｄｉｕｍ：ＣＭ）中に含有される植物細胞の増殖因
子の一つであり、細胞外部に分泌されて、いわゆるオー
トクライン的に作用する事が知られている。また、ＰＳ
Ｋは翻訳後修飾によりそのチロシン残基が硫酸化された
ぺプチドであり、ａｌｐｈａとｂｅｔａの２つの型が存
在している。以下にＰＳＫーａｌｐｈａとＰＳＫーｂｅ
ｔａの構造を示す。尚、ｂｅｔａ型はａｌｐｈａ型の酵
素的分解産物であり、ｂｅｔａ型の細胞増殖促進活性
は、ａｌｐｈａ型と比較して約１０分の１である。 ＰＳＫーａｌｐｈａ：Tyr(SO3H)-Ile-Tyr(SO3H)-Thr-Gl
n ＰＳＫーｂｅｔａ：Tyr(SO3H)-Ile-Tyr(SO3H)-Thr
【０００５】ところで、チロシン残基が硫酸化された構
造を有するペプチドやタンパク質が生理活性を有する例
は、植物ではＰＳＫが初めてであるが、動物においては
コレシストキニン、ガストリンなど約３０種類程が知ら
れている。これらはすべて細胞外分泌型のペプチドであ
り、前駆体の形で生合成されて、トランスゴルジネット
ワークを経由する間に硫酸化及びプロセシングを受け
て、ＰＳＫが切り出されるものと考えられている。細胞
外へ分泌される事から、このようなチロシン残基特異的
に硫酸化される前駆体ペプチドには、ある種のシグナル
配列が存在している事が予想される。そのような知見か
ら、ＰＳＫにも前駆体が存在している事が予想されるた
め、発明者らはイネ由来のＰＳＫ前駆体ぺプチドをコー
ドする遺伝子を単離して、その塩基配列を決定した。当
該遺伝子をイネＯｃ培養細胞に導入してその効果を検討
したところ、導入されたＰＳＫ遺伝子が過剰発現する事
により培養培地中へのＰＳＫの分泌が増加して、イネＯ
ｃ培養細胞の増殖が促進された。
造を有するペプチドやタンパク質が生理活性を有する例
は、植物ではＰＳＫが初めてであるが、動物においては
コレシストキニン、ガストリンなど約３０種類程が知ら
れている。これらはすべて細胞外分泌型のペプチドであ
り、前駆体の形で生合成されて、トランスゴルジネット
ワークを経由する間に硫酸化及びプロセシングを受け
て、ＰＳＫが切り出されるものと考えられている。細胞
外へ分泌される事から、このようなチロシン残基特異的
に硫酸化される前駆体ペプチドには、ある種のシグナル
配列が存在している事が予想される。そのような知見か
ら、ＰＳＫにも前駆体が存在している事が予想されるた
め、発明者らはイネ由来のＰＳＫ前駆体ぺプチドをコー
ドする遺伝子を単離して、その塩基配列を決定した。当
該遺伝子をイネＯｃ培養細胞に導入してその効果を検討
したところ、導入されたＰＳＫ遺伝子が過剰発現する事
により培養培地中へのＰＳＫの分泌が増加して、イネＯ
ｃ培養細胞の増殖が促進された。
【０００６】
【発明の実施の形態】ＰＳＫをコードする遺伝子を導入
する事により、植物細胞の増殖を促進させる事が可能で
ある。特に、外来遺伝子を導入したために増殖が遅くな
った植物細胞において、当該遺伝子の導入により細胞増
殖が可能となり、分化した植物個体が得られる。更に、
当該遺伝子を導入する事により、植物の成長を促進させ
る事が可能である。当該遺伝子を種々の植物に導入する
事が可能であるが、導入するのに特に適した植物の例と
しては、イネ、トウモロコシ、アスパラガス、コムギ等
の単子葉植物、また、シロイヌナズナ、タバコ、ニンジ
ン、ダイズ、トマト、ジャガイモ等の双子葉植物が挙げ
られる。形質転換体の作製方法としては、本技術分野に
おいて知られている通常の方法を用いる事ができる。使
用可能なベクターとしては、例えば、ｐＡｃｔ−ｎｏｓ
／Ｈｍｚ等が挙げられ、そのようなベクターを、例えば
アグロバクターに導入して、カルス又は幼植物に感染さ
せることにより、形質転換体を作製する事が可能であ
る。上述した例、及び下記に述べる実施例は、本発明の
実施の好ましい例であり、本発明の有効範囲を限定また
は制限する事を何ら意味するものではない。
する事により、植物細胞の増殖を促進させる事が可能で
ある。特に、外来遺伝子を導入したために増殖が遅くな
った植物細胞において、当該遺伝子の導入により細胞増
殖が可能となり、分化した植物個体が得られる。更に、
当該遺伝子を導入する事により、植物の成長を促進させ
る事が可能である。当該遺伝子を種々の植物に導入する
事が可能であるが、導入するのに特に適した植物の例と
しては、イネ、トウモロコシ、アスパラガス、コムギ等
の単子葉植物、また、シロイヌナズナ、タバコ、ニンジ
ン、ダイズ、トマト、ジャガイモ等の双子葉植物が挙げ
られる。形質転換体の作製方法としては、本技術分野に
おいて知られている通常の方法を用いる事ができる。使
用可能なベクターとしては、例えば、ｐＡｃｔ−ｎｏｓ
／Ｈｍｚ等が挙げられ、そのようなベクターを、例えば
アグロバクターに導入して、カルス又は幼植物に感染さ
せることにより、形質転換体を作製する事が可能であ
る。上述した例、及び下記に述べる実施例は、本発明の
実施の好ましい例であり、本発明の有効範囲を限定また
は制限する事を何ら意味するものではない。
【０００７】
【実施例】（ＰＳＫ−ａｌｐｈａのクローニング）ＰＳ
Ｋ−ａｌｐｈａのアミノ酸配列に相当する、混合した変
性オリゴヌクレオチドを用いて、イネＯｃ細胞由来のｃ
ＤＮＡライブラリーを、以下のようにスクリーニングし
た。１０日間培養したイネＯｃ細胞より、ポリ（Ａ）+
ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）カラムを用いて精製して、ＺＡ
Ｐ−ｃＤＮＡ合成キット（ストラタジーン、ラホヤ、カ
リフォルニア）よりｃＤＮＡを構築した。ＰＳＫーａｌ
ｐｈａの配列に相当する、１５ｍｅｒのオリゴヌクレオ
チドを９６種類合成して、［γ−32Ｐ］カイネーション
キット（東洋紡、大阪）によりラベル化して、プラーク
ハイブリダイゼーションによる、ｃＤＮＡライブラリー
のスクリーニングに用いた。６×クエン酸ナトリウム生
理食塩水（ＳＳＣ）、ＮａＨ2 ＰＯ4 （２０ｍＭ）、Ｓ
ＤＳ（０．４％）、５×デンハルト溶液及びサケ精子Ｄ
ＮＡ（５００μｇ／ｌ）を含む溶液中において、２５℃
の条件下でスクリーニングを行った。フィルターは、６
×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの溶液を数回交換しなが
ら、２５℃で１時間洗浄した。ハイブリダイゼーション
を行ったところ、３つのｃＤＮＡクローンがプローブと
ハイブリダイズした。
Ｋ−ａｌｐｈａのアミノ酸配列に相当する、混合した変
性オリゴヌクレオチドを用いて、イネＯｃ細胞由来のｃ
ＤＮＡライブラリーを、以下のようにスクリーニングし
た。１０日間培養したイネＯｃ細胞より、ポリ（Ａ）+
ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）カラムを用いて精製して、ＺＡ
Ｐ−ｃＤＮＡ合成キット（ストラタジーン、ラホヤ、カ
リフォルニア）よりｃＤＮＡを構築した。ＰＳＫーａｌ
ｐｈａの配列に相当する、１５ｍｅｒのオリゴヌクレオ
チドを９６種類合成して、［γ−32Ｐ］カイネーション
キット（東洋紡、大阪）によりラベル化して、プラーク
ハイブリダイゼーションによる、ｃＤＮＡライブラリー
のスクリーニングに用いた。６×クエン酸ナトリウム生
理食塩水（ＳＳＣ）、ＮａＨ2 ＰＯ4 （２０ｍＭ）、Ｓ
ＤＳ（０．４％）、５×デンハルト溶液及びサケ精子Ｄ
ＮＡ（５００μｇ／ｌ）を含む溶液中において、２５℃
の条件下でスクリーニングを行った。フィルターは、６
×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの溶液を数回交換しなが
ら、２５℃で１時間洗浄した。ハイブリダイゼーション
を行ったところ、３つのｃＤＮＡクローンがプローブと
ハイブリダイズした。
【０００８】ポジティブな挿入部分を含むｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔプラスミドを切り取り、大腸菌株ＳＯＬＲ株
に導入した。サブクローン化した挿入部分の配列を、ビ
ッグダイターミネーター サイクルシークエンシングキ
ットとＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０ジェネティックアナラ
イザー（アプライドバイオシステムズ、フォスター、カ
リフォルニア）を用いて、製造者のマニュアルに従い配
列を決定した。その結果、一つのクローンがＰＳＫ前駆
体ポリペプチドをコードしているという結果が得られ
た。そのようにして得られたｃＤＮＡを以下においてＯ
ｓＰＳＫと称する。
ｃｒｉｐｔプラスミドを切り取り、大腸菌株ＳＯＬＲ株
に導入した。サブクローン化した挿入部分の配列を、ビ
ッグダイターミネーター サイクルシークエンシングキ
ットとＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０ジェネティックアナラ
イザー（アプライドバイオシステムズ、フォスター、カ
リフォルニア）を用いて、製造者のマニュアルに従い配
列を決定した。その結果、一つのクローンがＰＳＫ前駆
体ポリペプチドをコードしているという結果が得られ
た。そのようにして得られたｃＤＮＡを以下においてＯ
ｓＰＳＫと称する。
【０００９】（ＰＳＫ前駆体遺伝子及びポリペプチドの
構造と特徴）配列を解析した結果、ＯｓＰＳＫ遺伝子の
塩基配列の長さは７２５塩基対であった。ＯｓＰＳＫ遺
伝子の塩基配列を図１の上段配列、及び配列表の配列番
号２に示す。当該遺伝子の５’−非翻訳領域に、１６の
ＧＡ反複配列が存在していた（図１点線）。当該遺伝子
の読み枠は２６７塩基対の長さであり、８９アミノ酸残
基より成るＰＳＫ前駆体ポリペプチドをコードしてい
る。ＰＳＫ前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列を、図１
の下段配列及び配列表の配列番号１に示す。図１の配列
より、ＰＳＫ前駆体ポリペプチドは、分子量は９．８ｋ
Ｄａ、等電点は６．４８であると推定される。ＰＳＫ前
駆体ポリペプチドのアミノ末端において、切断可能なリ
ーダーペプチドと類似した２２アミノ酸より成る、疎水
性領域が認められた。そのような疎水性領域の構造は、
動物の生物活性ペプチドの前駆体においても見出され
る。推定されるＰＳＫ前駆体ポリペプチドの成熟型は、
荷電したアミノ酸を高いパーセンテージで含有しており
（６％アスパラギン酸、７．５％グルタミン酸、６％リ
ジン）、そのような荷電アミノ酸が存在する事により、
ＰＳＫ前駆体ポリペプチドは親水性となっている。８９
アミノ酸より成るＰＳＫ前駆体ポリペプチドの中で、８
０から８４のアミノ酸が、ＰＳＫーａｌｐｈａをコード
している（図１二重下線）。
構造と特徴）配列を解析した結果、ＯｓＰＳＫ遺伝子の
塩基配列の長さは７２５塩基対であった。ＯｓＰＳＫ遺
伝子の塩基配列を図１の上段配列、及び配列表の配列番
号２に示す。当該遺伝子の５’−非翻訳領域に、１６の
ＧＡ反複配列が存在していた（図１点線）。当該遺伝子
の読み枠は２６７塩基対の長さであり、８９アミノ酸残
基より成るＰＳＫ前駆体ポリペプチドをコードしてい
る。ＰＳＫ前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列を、図１
の下段配列及び配列表の配列番号１に示す。図１の配列
より、ＰＳＫ前駆体ポリペプチドは、分子量は９．８ｋ
Ｄａ、等電点は６．４８であると推定される。ＰＳＫ前
駆体ポリペプチドのアミノ末端において、切断可能なリ
ーダーペプチドと類似した２２アミノ酸より成る、疎水
性領域が認められた。そのような疎水性領域の構造は、
動物の生物活性ペプチドの前駆体においても見出され
る。推定されるＰＳＫ前駆体ポリペプチドの成熟型は、
荷電したアミノ酸を高いパーセンテージで含有しており
（６％アスパラギン酸、７．５％グルタミン酸、６％リ
ジン）、そのような荷電アミノ酸が存在する事により、
ＰＳＫ前駆体ポリペプチドは親水性となっている。８９
アミノ酸より成るＰＳＫ前駆体ポリペプチドの中で、８
０から８４のアミノ酸が、ＰＳＫーａｌｐｈａをコード
している（図１二重下線）。
【００１０】硫酸化されたチロシン残基は、通常は分泌
ペプチドの酸性領域に位置しており、これまで動物中に
おいて同定された硫酸化チロシンの近傍には、アスパラ
ギン酸又はグルタミン酸残基が存在している。ＰＳＫ前
駆体ポリペプチド中において、ＰＳＫ−ａｌｐｈａに相
当する部位は前駆体ポリペプチドの酸性部位に位置して
いる。図１において、酸性アミノ酸を丸印で囲む。ＰＳ
Ｋ−ａｌｐｈａの最初のチロシン残基のアミノ末端方向
の−１の位置に、アスパラギン酸残基が存在する。ま
た、ＰＳＫ−ａｌｐｈａの中の第１又は第２のチロシン
残基の−５から＋５の間に、２個又は３個の酸性の残基
が認められる。ＰＳＫ前駆体ポリペプチドのそのような
構造上の特徴は、当該ポリペプチドのチロシン残基がス
ルホトランスフェラーゼにより硫酸化される事を示して
いる。ＰＳＫの分泌時にプロセシングを受けるであろう
と推定される部位は、Ｖ８ペプチダーゼにより認識され
る部位であり、ＰＳＫが前駆体ポリペプチドにより蛋白
分解的に切断される可能性を示している。図１におい
て、Ｖ８ペプチダーゼ認識部位を、矢印で示す。ＤＮＡ
データバンクを検索して相同配列を検討したところ、機
能が知られていないイネ由来の配列タッグの発現を除い
て、ＯｓＰＳＫ遺伝子と他の配列の間には明らかな相同
性は認められなかった。
ペプチドの酸性領域に位置しており、これまで動物中に
おいて同定された硫酸化チロシンの近傍には、アスパラ
ギン酸又はグルタミン酸残基が存在している。ＰＳＫ前
駆体ポリペプチド中において、ＰＳＫ−ａｌｐｈａに相
当する部位は前駆体ポリペプチドの酸性部位に位置して
いる。図１において、酸性アミノ酸を丸印で囲む。ＰＳ
Ｋ−ａｌｐｈａの最初のチロシン残基のアミノ末端方向
の−１の位置に、アスパラギン酸残基が存在する。ま
た、ＰＳＫ−ａｌｐｈａの中の第１又は第２のチロシン
残基の−５から＋５の間に、２個又は３個の酸性の残基
が認められる。ＰＳＫ前駆体ポリペプチドのそのような
構造上の特徴は、当該ポリペプチドのチロシン残基がス
ルホトランスフェラーゼにより硫酸化される事を示して
いる。ＰＳＫの分泌時にプロセシングを受けるであろう
と推定される部位は、Ｖ８ペプチダーゼにより認識され
る部位であり、ＰＳＫが前駆体ポリペプチドにより蛋白
分解的に切断される可能性を示している。図１におい
て、Ｖ８ペプチダーゼ認識部位を、矢印で示す。ＤＮＡ
データバンクを検索して相同配列を検討したところ、機
能が知られていないイネ由来の配列タッグの発現を除い
て、ＯｓＰＳＫ遺伝子と他の配列の間には明らかな相同
性は認められなかった。
【００１１】（ＯｓＰＳＫ遺伝子の導入による形質転
換）ＯｓＰＳＫ遺伝子がＰＳＫをコードしている事を確
認をするために、変異したＯｓＰＳＫのｃＤＮＡにより
イネＯｃ細胞の形質転換を行った。ここで用いた変異ｃ
ＤＮＡは、ＰＳＫ−ａｌｐｈａ及びＰＳＫ−ｂｅｔａの
４番目のアミノ酸であるスレオニンを、セリンに置換し
たアミノ酸をコードする遺伝子である。以下、ＰＳＫ−
ａｌｐｈａのセリン置換体を［Ｓｅｒ4 ］ＰＳＫ−ａｌ
ｐｈａ、ＰＳＫ−ｂｅｔａのセリン置換体を［Ｓｅ
ｒ4 ］ＰＳＫ−ｂｅｔａと示す。 ［Ｓｅｒ4 ］ＰＳＫ−ａｌｐｈａ：Ｙ（ＳＯ3 Ｈ）ＩＹ
（ＳＯ3 Ｈ）ＳＱ ［Ｓｅｒ4 ］ＰＳＫ−ｂｅｔａ：Ｙ（ＳＯ3 Ｈ）ＩＹ
（ＳＯ3 Ｈ）Ｓ ２２−ｍｅｒのプライマー（5'-CATCTTGGGAGTAGATATAAT
C-3'）を合成し、インビトロミュータゲネシスキット
（宝、東京）を用いて、上記の変異ｃＤＮＡを得た。形
質転換体の選抜のためにカナマイシン及びハイグロマイ
シン耐性遺伝子を持つｐＡｃｔ−ｎｏｓ／Ｈｍｚを、Ｏ
ｃ細胞を形質転換させるためのバイナリーベクターとし
て用いた。野生型またはセリン置換型のｃＤＮＡをＳｍ
ａＩおよびＥｃｏＲＶより切り出して、ベクターのＳｍ
ａＩサイトに挿入した。キメラ遺伝子の発現は、バイナ
リーベクター中のイネアクチンプロモーターにより制御
される。キメラ遺伝子のベクターをアグロバクテリウム
ＬＢＡ４４０４株に導入して、アグロバクテリウム法に
よりＯｃ細胞の形質転換を行った。
換）ＯｓＰＳＫ遺伝子がＰＳＫをコードしている事を確
認をするために、変異したＯｓＰＳＫのｃＤＮＡにより
イネＯｃ細胞の形質転換を行った。ここで用いた変異ｃ
ＤＮＡは、ＰＳＫ−ａｌｐｈａ及びＰＳＫ−ｂｅｔａの
４番目のアミノ酸であるスレオニンを、セリンに置換し
たアミノ酸をコードする遺伝子である。以下、ＰＳＫ−
ａｌｐｈａのセリン置換体を［Ｓｅｒ4 ］ＰＳＫ−ａｌ
ｐｈａ、ＰＳＫ−ｂｅｔａのセリン置換体を［Ｓｅ
ｒ4 ］ＰＳＫ−ｂｅｔａと示す。 ［Ｓｅｒ4 ］ＰＳＫ−ａｌｐｈａ：Ｙ（ＳＯ3 Ｈ）ＩＹ
（ＳＯ3 Ｈ）ＳＱ ［Ｓｅｒ4 ］ＰＳＫ−ｂｅｔａ：Ｙ（ＳＯ3 Ｈ）ＩＹ
（ＳＯ3 Ｈ）Ｓ ２２−ｍｅｒのプライマー（5'-CATCTTGGGAGTAGATATAAT
C-3'）を合成し、インビトロミュータゲネシスキット
（宝、東京）を用いて、上記の変異ｃＤＮＡを得た。形
質転換体の選抜のためにカナマイシン及びハイグロマイ
シン耐性遺伝子を持つｐＡｃｔ−ｎｏｓ／Ｈｍｚを、Ｏ
ｃ細胞を形質転換させるためのバイナリーベクターとし
て用いた。野生型またはセリン置換型のｃＤＮＡをＳｍ
ａＩおよびＥｃｏＲＶより切り出して、ベクターのＳｍ
ａＩサイトに挿入した。キメラ遺伝子の発現は、バイナ
リーベクター中のイネアクチンプロモーターにより制御
される。キメラ遺伝子のベクターをアグロバクテリウム
ＬＢＡ４４０４株に導入して、アグロバクテリウム法に
よりＯｃ細胞の形質転換を行った。
【００１２】（ＰＳＫ類縁体の定量方法）野生型または
形質転換体の細胞により、培地中に放出されたＰＳＫ−
ａｌｐｈａ及びその類縁体の量を、液体クロマトグラフ
ィー／マススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ）解析によ
り定量した。野生型または形質転換したＯｃ細胞を１４
日培養して得られた馴化培地につき、ＤＥＡＥ Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘＡ−２５カラムによりクロマトグラフィーを
行った。８００ｍＭと１２００ｍＭのＫＣｌ画分中に含
まれているＰＳＫ−ａｌｐｈａ及びＰＳＫ−ｂｅｔａ
を、セップーパックバックカートリッジに吸着させ、
０．１％トリフルオロ酢酸を含む３０％アセトニトリル
により溶出して凍結乾燥した。ジャスコＰＵ９８０高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムに、ファ
イソンＶＧプラットフォームクアドラポールマススペク
トロメーターを接続させた装置を用いてＬＣ−ＭＳ解析
を行った。ＰＳＫ−ａｌｐｈａ及びＰＳＫ−ｂｅｔａを
含む画分を２００μｌの水に溶解し、０．１％トリフル
オロ酢酸を含む１０％アセトニトリルを用いて、１．０
ｍｌ／分の条件で、逆相ＨＰＬＣカラム（４．６×２５
０ｍｍ）により分離した。ＰＳＫ−ａｌｐｈａ及びＰＳ
Ｋ−ｂｅｔａの疑似分子イオンを、選択イオン検出モー
ドにおいて、１．９秒毎に走査することにより検出し
た。ペプチドのアミノ酸配列は、アプライドバイオシス
テム４９０型により決定した。
形質転換体の細胞により、培地中に放出されたＰＳＫ−
ａｌｐｈａ及びその類縁体の量を、液体クロマトグラフ
ィー／マススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ）解析によ
り定量した。野生型または形質転換したＯｃ細胞を１４
日培養して得られた馴化培地につき、ＤＥＡＥ Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘＡ−２５カラムによりクロマトグラフィーを
行った。８００ｍＭと１２００ｍＭのＫＣｌ画分中に含
まれているＰＳＫ−ａｌｐｈａ及びＰＳＫ−ｂｅｔａ
を、セップーパックバックカートリッジに吸着させ、
０．１％トリフルオロ酢酸を含む３０％アセトニトリル
により溶出して凍結乾燥した。ジャスコＰＵ９８０高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムに、ファ
イソンＶＧプラットフォームクアドラポールマススペク
トロメーターを接続させた装置を用いてＬＣ−ＭＳ解析
を行った。ＰＳＫ−ａｌｐｈａ及びＰＳＫ−ｂｅｔａを
含む画分を２００μｌの水に溶解し、０．１％トリフル
オロ酢酸を含む１０％アセトニトリルを用いて、１．０
ｍｌ／分の条件で、逆相ＨＰＬＣカラム（４．６×２５
０ｍｍ）により分離した。ＰＳＫ−ａｌｐｈａ及びＰＳ
Ｋ−ｂｅｔａの疑似分子イオンを、選択イオン検出モー
ドにおいて、１．９秒毎に走査することにより検出し
た。ペプチドのアミノ酸配列は、アプライドバイオシス
テム４９０型により決定した。
【００１３】（ＰＳＫ類縁体の分泌に対するＯｓＰＳＫ
遺伝子導入の効果）ｃＤＮＡで形質転換させたＯｃ細胞
の馴化培地より得た溶出液を、上記の方法によりＬＣ−
ＭＳ解析で定量した結果を図２に示す。図２において、
［Ｓｅｒ4］ＰＳＫ−ａｌｐｈａ（リテンションタイム
６．９分）、ＰＳＫ−ａｌｐｈａ（リテンションタイム
８．０分）［Ｓｅｒ4 ］ＰＳＫ−ｂｅｔａ（リテンショ
ンタイム９．０分）、及びＰＳＫ−ｂｅｔａ（リテンシ
ョンタイム１２．７分）が検出された。該当する画分に
含まれるペプチドの配列を決定することにより、各ピー
クがそれぞれ、［Ｓｅｒ4 ］ＰＳＫ−ａｌｐｈａ及びｂ
ｅｔａである事を確認した。即ち、導入したＰＳＫのセ
リン置換体の遺伝子に由来する生成物が確認され、Ｏｓ
ＰＳＫ遺伝子がＰＳＫ前駆体ポリペプチドをコードして
いる事が示された。また、ＰＳＫーｂｅｔａがＰＳＫー
ａｌｐｈａの酵素分解産物である事が裏付けられた。
遺伝子導入の効果）ｃＤＮＡで形質転換させたＯｃ細胞
の馴化培地より得た溶出液を、上記の方法によりＬＣ−
ＭＳ解析で定量した結果を図２に示す。図２において、
［Ｓｅｒ4］ＰＳＫ−ａｌｐｈａ（リテンションタイム
６．９分）、ＰＳＫ−ａｌｐｈａ（リテンションタイム
８．０分）［Ｓｅｒ4 ］ＰＳＫ−ｂｅｔａ（リテンショ
ンタイム９．０分）、及びＰＳＫ−ｂｅｔａ（リテンシ
ョンタイム１２．７分）が検出された。該当する画分に
含まれるペプチドの配列を決定することにより、各ピー
クがそれぞれ、［Ｓｅｒ4 ］ＰＳＫ−ａｌｐｈａ及びｂ
ｅｔａである事を確認した。即ち、導入したＰＳＫのセ
リン置換体の遺伝子に由来する生成物が確認され、Ｏｓ
ＰＳＫ遺伝子がＰＳＫ前駆体ポリペプチドをコードして
いる事が示された。また、ＰＳＫーｂｅｔａがＰＳＫー
ａｌｐｈａの酵素分解産物である事が裏付けられた。
【００１４】更に、ＯｓＰＳＫ遺伝子のｃＤＮＡを、同
じバイナリーベクターを用いてセンスまたはアンチセン
スの方向に導入して、馴化培地中におけるＰＳＫ−ａｌ
ｐｈａとＰＳＫ−ｂｅｔａの量をＬＣ−ＭＳにより定量
した。コントロールまたは形質転換したＯｃ細胞（０．
８ｇ）を１００ｍｌの新鮮な培地に植え込み、一週間培
養した後に、培地中におけるＰＳＫ−ａｌｐｈａまたは
その類縁体の濃度を定量した。結果を表１に示す。表１
において、３回の独立した実験の結果を標準偏差をつけ
て示す（濃度の単位：ｎＭ）。センス形質転換体の馴化
培地中に蓄積したＰＳＫ−ａｌｐｈａ及びＰＳＫ−ｂｅ
ｔａの濃度は、コントロールと比較して１．６倍であ
り、当該遺伝子の導入により、ＰＳＫの分泌が増加する
事が示された。また、アンチセンス形質転換体の馴化培
地中に蓄積したＰＳＫ−ａｌｐｈａおよびＰＳＫ−ｂｅ
ｔａの濃度は、コントロールの６０％以下であり、ＰＳ
Ｋの分泌が低下した。一方、セリン置換したＰＳＫ−ａ
ｌｐｈａ及びｂｅｔａの総量は、野生型ＰＳＫ−ａｌｐ
ｈａおよびＰＳＫ−ｂｅｔａの約３４％にすぎなかっ
た。セリン置換体の結果は、アミノ酸置換によりプロセ
シングまたは修飾の効率が低下する可能性を示してい
る。
じバイナリーベクターを用いてセンスまたはアンチセン
スの方向に導入して、馴化培地中におけるＰＳＫ−ａｌ
ｐｈａとＰＳＫ−ｂｅｔａの量をＬＣ−ＭＳにより定量
した。コントロールまたは形質転換したＯｃ細胞（０．
８ｇ）を１００ｍｌの新鮮な培地に植え込み、一週間培
養した後に、培地中におけるＰＳＫ−ａｌｐｈａまたは
その類縁体の濃度を定量した。結果を表１に示す。表１
において、３回の独立した実験の結果を標準偏差をつけ
て示す（濃度の単位：ｎＭ）。センス形質転換体の馴化
培地中に蓄積したＰＳＫ−ａｌｐｈａ及びＰＳＫ−ｂｅ
ｔａの濃度は、コントロールと比較して１．６倍であ
り、当該遺伝子の導入により、ＰＳＫの分泌が増加する
事が示された。また、アンチセンス形質転換体の馴化培
地中に蓄積したＰＳＫ−ａｌｐｈａおよびＰＳＫ−ｂｅ
ｔａの濃度は、コントロールの６０％以下であり、ＰＳ
Ｋの分泌が低下した。一方、セリン置換したＰＳＫ−ａ
ｌｐｈａ及びｂｅｔａの総量は、野生型ＰＳＫ−ａｌｐ
ｈａおよびＰＳＫ−ｂｅｔａの約３４％にすぎなかっ
た。セリン置換体の結果は、アミノ酸置換によりプロセ
シングまたは修飾の効率が低下する可能性を示してい
る。
【００１５】
【表１】
【００１６】（ＯｓＰＳＫ遺伝子が細胞の増殖に及ぼす
効果）ＯｓＰＳＫ遺伝子が細胞増殖に及ぼす効果を検討
した。二週間培養した後の細胞増殖を検討したところ、
センスの形質転換細胞（図４）はコントロールの細胞
（図３）と比較して、約２倍の速度で増殖した。一方ア
ンチセンスの形質転換細胞（図５）においては増殖速度
が低下した。また、アンチセンスの形質転換体にＰＳＫ
−ａｌｐｈａを与えると、部分的（３８−６４％）にで
はあるが増殖活性が回復した。以上の結果により、Ｏｓ
ＰＳＫ遺伝子は植物の細胞増殖を促進する効果を有する
事が示された。
効果）ＯｓＰＳＫ遺伝子が細胞増殖に及ぼす効果を検討
した。二週間培養した後の細胞増殖を検討したところ、
センスの形質転換細胞（図４）はコントロールの細胞
（図３）と比較して、約２倍の速度で増殖した。一方ア
ンチセンスの形質転換細胞（図５）においては増殖速度
が低下した。また、アンチセンスの形質転換体にＰＳＫ
−ａｌｐｈａを与えると、部分的（３８−６４％）にで
はあるが増殖活性が回復した。以上の結果により、Ｏｓ
ＰＳＫ遺伝子は植物の細胞増殖を促進する効果を有する
事が示された。
【００１７】尚、形質転換細胞における導入遺伝子の存
在を、ポリメラーセ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った後に、
サザンブロッティングを行う事により確認した（図
６）。尚、図６において各レーンは、以下のサンプルを
示している。 Ｗ：水のみ Ｎ：形質転換していないイネＯｃ細胞 Ａ１−Ａ４：アンチセンス導入細胞 Ｓ１−Ｓ４：センス導入細胞 Ｐ：発現ベクターのみ 図６より、導入されたＯｓＰＳＫ遺伝子に由来する０．
５ｋｂのバンドがセンス導入細胞において認められた。
一方、アンチセンス導入細胞においては０．５ｋｂのバ
ンドが認められず、ＯｓＰＳＫ遺伝子の発現が抑制され
ていた。一方、イネアクチンｃＤＮＡ（ＯｓＲＡｃ１）
に由来する１．６ｋｂのバンドは、センス導入細胞とア
ンチセンス導入細胞において共に認められた。ＯｓＲＡ
ｃ１はイネＯｃ細胞が元来有している遺伝子であり、形
質転換により発現量が変化しないため、コントロールと
して用いた。
在を、ポリメラーセ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った後に、
サザンブロッティングを行う事により確認した（図
６）。尚、図６において各レーンは、以下のサンプルを
示している。 Ｗ：水のみ Ｎ：形質転換していないイネＯｃ細胞 Ａ１−Ａ４：アンチセンス導入細胞 Ｓ１−Ｓ４：センス導入細胞 Ｐ：発現ベクターのみ 図６より、導入されたＯｓＰＳＫ遺伝子に由来する０．
５ｋｂのバンドがセンス導入細胞において認められた。
一方、アンチセンス導入細胞においては０．５ｋｂのバ
ンドが認められず、ＯｓＰＳＫ遺伝子の発現が抑制され
ていた。一方、イネアクチンｃＤＮＡ（ＯｓＲＡｃ１）
に由来する１．６ｋｂのバンドは、センス導入細胞とア
ンチセンス導入細胞において共に認められた。ＯｓＲＡ
ｃ１はイネＯｃ細胞が元来有している遺伝子であり、形
質転換により発現量が変化しないため、コントロールと
して用いた。
【００１８】（ＯｓＰＳＫ遺伝子の発現の特性）イネＯ
ｃ培養細胞におけるＯｓＰＳＫ遺伝子発現量の培養日数
による変化を、ラベル化した全長ｃＤＮＡと６０℃にお
いてハイブリダイズしてノザンブロットを行う事により
解析した。図７において、レーン１は培養３日目、レー
ン２は培養７日目、レーン３は培養１０日目、レーン４
は培養１４日目の結果を示す。図７の結果より、ＯｓＰ
ＳＫ遺伝子はＯｃ細胞において持続的に発現していた。
特に、１０日から１４日後において最も大量に発現して
おり、継続してＰＳＫを与える事により、細胞増殖を速
める事が可能であると考えられる。図８において形質転
換細胞におけるＯｓＰＳＫ遺伝子の発現を確認したとこ
ろ、レーン１に示すセンス導入細胞は形質転換していな
い細胞（レーン３）と比較して発現量が増加しており、
導入遺伝子の発現が確認された。一方レーン２に示すア
ンチセンス導入細胞においては発現量が低下していた。
更に、イネの芽生えにおけるＯｓＰＳＫ遺伝子の発現パ
ターンを検討した（図９）。レーン１は第１葉、レーン
２は第２葉、レーン３は茎頂、レーン４は側根、レーン
５は種子根における解析結果を示す。図９より、茎頂及
び種子根において顕著な発現が認められ、葉における発
現量は少ないという結果となった。この結果は、成長が
盛んな部位においては、ＯｓＰＳＫ遺伝子の発現量が多
いという事を示唆している。
ｃ培養細胞におけるＯｓＰＳＫ遺伝子発現量の培養日数
による変化を、ラベル化した全長ｃＤＮＡと６０℃にお
いてハイブリダイズしてノザンブロットを行う事により
解析した。図７において、レーン１は培養３日目、レー
ン２は培養７日目、レーン３は培養１０日目、レーン４
は培養１４日目の結果を示す。図７の結果より、ＯｓＰ
ＳＫ遺伝子はＯｃ細胞において持続的に発現していた。
特に、１０日から１４日後において最も大量に発現して
おり、継続してＰＳＫを与える事により、細胞増殖を速
める事が可能であると考えられる。図８において形質転
換細胞におけるＯｓＰＳＫ遺伝子の発現を確認したとこ
ろ、レーン１に示すセンス導入細胞は形質転換していな
い細胞（レーン３）と比較して発現量が増加しており、
導入遺伝子の発現が確認された。一方レーン２に示すア
ンチセンス導入細胞においては発現量が低下していた。
更に、イネの芽生えにおけるＯｓＰＳＫ遺伝子の発現パ
ターンを検討した（図９）。レーン１は第１葉、レーン
２は第２葉、レーン３は茎頂、レーン４は側根、レーン
５は種子根における解析結果を示す。図９より、茎頂及
び種子根において顕著な発現が認められ、葉における発
現量は少ないという結果となった。この結果は、成長が
盛んな部位においては、ＯｓＰＳＫ遺伝子の発現量が多
いという事を示唆している。
【００１９】種々の制限酵素により処理を行った後に、
サザンブロット解析を行った（図１０）。図１０におい
て、ＢａはＢａｍＨＩ処理、ＥｃはＥｃｏＲＩ処理、Ｘ
ｂはＸｂａＩ処理、ＸｈはＸｈｏＩ処理を示す。その結
果、ＥｃｏＲＩ処理したサンプルおいて、いくつかのサ
イズの小さなバンドが認められた。その結果は、ＯｓＰ
ＳＫ遺伝子が多遺伝子のファミリーに属している可能性
を示唆している。しかしながら、ＥｃｏＲＩ分解により
得られた多くのバンドがハイブリダイズするという結果
は、ＯｓＰＳＫのｃＤＮＡ中に制限部位が存在している
事に拠る可能性がある。そこで、ＯｓＰＳＫのｃＤＮＡ
の５’末端由来の３００塩基対の断片を用いて、再ブロ
ットを行った。その結果、一つのバンドのみが（３．７
キロベース塩基対）ハイブリダイズした。よって、ＰＳ
Ｋ前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子は単一の遺伝
子によりコードされており、多遺伝子ではないと示され
た。
サザンブロット解析を行った（図１０）。図１０におい
て、ＢａはＢａｍＨＩ処理、ＥｃはＥｃｏＲＩ処理、Ｘ
ｂはＸｂａＩ処理、ＸｈはＸｈｏＩ処理を示す。その結
果、ＥｃｏＲＩ処理したサンプルおいて、いくつかのサ
イズの小さなバンドが認められた。その結果は、ＯｓＰ
ＳＫ遺伝子が多遺伝子のファミリーに属している可能性
を示唆している。しかしながら、ＥｃｏＲＩ分解により
得られた多くのバンドがハイブリダイズするという結果
は、ＯｓＰＳＫのｃＤＮＡ中に制限部位が存在している
事に拠る可能性がある。そこで、ＯｓＰＳＫのｃＤＮＡ
の５’末端由来の３００塩基対の断片を用いて、再ブロ
ットを行った。その結果、一つのバンドのみが（３．７
キロベース塩基対）ハイブリダイズした。よって、ＰＳ
Ｋ前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子は単一の遺伝
子によりコードされており、多遺伝子ではないと示され
た。
【００２０】更に、ＯｓＰＳＫの相同遺伝子が他の植物
種においても見られるか、検討を行った。図１０と同様
に、制限酵素により処理を行った後に、ブロッティング
による解析を行った。図１１において、ＢａはＢａｍＨ
Ｉ処理、ＥｃはＥｃｏＲＩ処理を示す。ＰＳＫを生成す
ると知られている、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐ
ｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ：レーン１）、アスパラガス
（Ａｓｐａｒａｇｕｓｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ：レーン
２）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ：レーン
３）、ヒャクニチソウ（Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎ
ｓ：レーン４）由来のゲノミックＤＮＡについて、サザ
ンブロットを行った。図１１においてＯｓＰＳＫ遺伝子
の相同物は４種の植物すべてにおいて検出され、ＯｓＰ
ＳＫ遺伝子は単子葉類と双子葉類の両者において保存さ
れている事が示された。よって、ＯｓＰＳＫ遺伝子の導
入は、種々の植物において有効であろうと思われる。
種においても見られるか、検討を行った。図１０と同様
に、制限酵素により処理を行った後に、ブロッティング
による解析を行った。図１１において、ＢａはＢａｍＨ
Ｉ処理、ＥｃはＥｃｏＲＩ処理を示す。ＰＳＫを生成す
ると知られている、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐ
ｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ：レーン１）、アスパラガス
（Ａｓｐａｒａｇｕｓｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ：レーン
２）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ：レーン
３）、ヒャクニチソウ（Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎ
ｓ：レーン４）由来のゲノミックＤＮＡについて、サザ
ンブロットを行った。図１１においてＯｓＰＳＫ遺伝子
の相同物は４種の植物すべてにおいて検出され、ＯｓＰ
ＳＫ遺伝子は単子葉類と双子葉類の両者において保存さ
れている事が示された。よって、ＯｓＰＳＫ遺伝子の導
入は、種々の植物において有効であろうと思われる。
【００２１】
【発明の効果】本発明により、植物の増殖因子であるフ
ァイトスルフォカインの前駆体ポリペプチドのアミノ酸
配列、および当該遺伝子をコードする塩基配列が与えら
れた。また、当該遺伝子をイネＯｃ細胞に導入したとこ
ろ、ファイトスルフォカインの培地中への分泌が増加し
て、細胞増殖が促進される事が示された。
ァイトスルフォカインの前駆体ポリペプチドのアミノ酸
配列、および当該遺伝子をコードする塩基配列が与えら
れた。また、当該遺伝子をイネＯｃ細胞に導入したとこ
ろ、ファイトスルフォカインの培地中への分泌が増加し
て、細胞増殖が促進される事が示された。
【００２２】
【配列表】 ＜１１０＞出願人氏名：名古屋大学長 ＜１２０＞発明の名称：植物の細胞増殖因子前駆体ポリペプチド、増殖因子前駆 体ポリペプチドをコードする遺伝子、植物の増殖促進方法 ＜１６０＞配列の数：２ ＜２１０＞配列番号：１ ＜２１１＞配列の長さ：８９ ＜２１２＞配列の型：アミノ酸 ＜２１３＞起源：イネＯｃ細胞 ＜４００＞配列 MVNPGRTARA LCLLCLALLL LGQDTHSRKL LLQEKHSHGV GNGTTTTQEP SRENGGSTGS 60 NNNGQLQFDS AKWEEFHTDY IYTQDVKNP 89 ＜２１０＞配列番号：２ ＜２１１＞配列の長さ：７２５ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：イネＯｃ細胞 ＜４００＞配列 GAAGAAGCAG CAGCAAAAAA GTTGATCAGT TAATTAGCAA GTGTGTTCTT CTTTCTTTTG 60 GTGAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGATCTCAG AATGGTGAAT CCAGGAAGAA 120 CAGCTAGGGC ACTCTGCCTC CTATGCCTTG CTCTCCTCCT GCTAGGTCAA GATACCCATT 180 CCAGGAAGCT CCTGTTGCAG GAGAAGCACA GCCATGGCGT CGGCAACGGC ACAACCACCA 240 CCCAGGAACC AAGCAGAGAG AATGGAGGAA GTACAGGTTC CAATAACAAT GGGCAGCTGC 300 AGTTTGATTC AGCCAAATGG GAAGAATTCC ACACGGATTA TATCTACACC CAAGATGTCA 360 AAAACCCATA ATGGCTGTTC ATTTATGATT TGAACTAGTA CTAGTAGCTT ATACCTTCTG 420 CGCGTCTTTT GTTCGTTTGG AGAGGGGATT TTCTTGGGAT TTAGCATATG AACTAATTAA 480 ATTAAATCCC AGGCAAATCC CACTCAGCCC ATTTTGTGCA GAAGTTGTCA GTGTGCACTG 540 TATAATTATT TAGTCATACA CAACTACTCC TGGTAACTAC TCCTATCTTC GATGAATTTT 600 CTGGTTTTGC CAGACGTGAC AATAGTCCAG TAGCATGCAG TACCCTCTCA GAATCCCTGT 660 AATTTTTAGC AAAAAAAAAA GGAAGAAAAG AAAAGAAGCT TCCCTACTAA AAAAAAAAAA 720 AAAAA 725
【図１】 図１は、ＯｓＰＳＫ遺伝子の塩基配列及びア
ミノ酸配列を示す図である。
ミノ酸配列を示す図である。
【図２】 図２は、形質転換したイネＯｃ細胞の馴化培
地中に存在するＰＳＫ類似体を、ＬＣ−ＭＳスペクトル
により解析した結果の図である。
地中に存在するＰＳＫ類似体を、ＬＣ−ＭＳスペクトル
により解析した結果の図である。
【図３】 図３は、形質転換していないイネＯｃ細胞を
２週間培養した後の、細胞の写真である。
２週間培養した後の、細胞の写真である。
【図４】 図４は、センスＯｓＰＳＫ遺伝子を導入した
イネＯｃ細胞を２週間培養した後の、細胞の写真であ
る。
イネＯｃ細胞を２週間培養した後の、細胞の写真であ
る。
【図５】 図５は、アンチセンスＯｓＰＳＫ遺伝子を導
入したイネＯｃ細胞を２週間培養した後の、細胞の写真
である。
入したイネＯｃ細胞を２週間培養した後の、細胞の写真
である。
【図６】 図６は、センス及びアンチセンスＯｓＰＳＫ
遺伝子を導入したイネＯｃ細胞における当該遺伝子の発
現を示す、ブロッティングの写真である。
遺伝子を導入したイネＯｃ細胞における当該遺伝子の発
現を示す、ブロッティングの写真である。
【図７】 図７は、培養３日目、７日目、１０日目、１
４日目における、イネＯｃ細胞におけるＯｓＰＳＫ遺伝
子の発現を示す、ブロッティングの写真である。
４日目における、イネＯｃ細胞におけるＯｓＰＳＫ遺伝
子の発現を示す、ブロッティングの写真である。
【図８】 図８は、センス及びアンチセンスＯｓＰＳＫ
遺伝子を導入したイネＯｃ細胞における当該遺伝子の発
現を示す、ブロッティングの写真である。
遺伝子を導入したイネＯｃ細胞における当該遺伝子の発
現を示す、ブロッティングの写真である。
【図９】 図９は、イネ芽生えにおけるＯｓＰＳＫ遺伝
子の発現を、植物体の種々の部位において検討した、ブ
ロッティングの写真である。
子の発現を、植物体の種々の部位において検討した、ブ
ロッティングの写真である。
【図１０】 図１０は、イネにおけるＯｓＰＳＫ遺伝子
の発現を、種々の制限酵素で処理して検討した、ブロッ
ティングの写真である。
の発現を、種々の制限酵素で処理して検討した、ブロッ
ティングの写真である。
【図１１】 図１１は、シロイヌナズナ、アスパラガ
ス、ニンジン及びヒャクニチソウにおけるＯｓＰＳＫ遺
伝子の発現を検討した、ブロッティングの写真である。
ス、ニンジン及びヒャクニチソウにおけるＯｓＰＳＫ遺
伝子の発現を検討した、ブロッティングの写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中村 研三 愛知県日進市香久山２丁目1118番地 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，1996，Ｖｏｌ．93，Ｎｏ. 15，ｐ．7623−7627 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12P 1/00 - 41/00 C07K 14/415 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ
Claims (5)
- 【請求項１】 イネ由来のファイトスルフォカインの前
駆体ポリペプチドであり、以下の（ａ）または（ｂ）に
示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプ
チド。 （ａ）配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号１−８
９で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、
ポリペプチド。 （ｂ）ファイトスルフォカインをその配列内に含有して
おり、植物細胞内でプロセシング及びファイトスルフォ
カインのチロシン残基の硫酸化を受け、チロシン硫酸化
されたファイトスルフォカインを分泌して植物細胞の増
殖促進活性を発現する事が可能な、（ａ）の一もしくは
複数のアミノ酸が欠損、置換若しくは付加された、ポリ
ペプチド。 - 【請求項２】 請求項１記載のポリペプチドをコードす
る、遺伝子。 - 【請求項３】 イネ由来のファイトスルフォカインの前
駆体ポリペプチドをコードし、以下の（ｃ）または
（ｄ）に示す塩基配列からなることを特徴とする、遺伝
子。 （ｃ）配列表の配列番号２に示す、塩基番号１−７２５
で示される塩基配列からなることを特徴とする、遺伝
子。 （ｄ）（ｃ）の一もしくは複数の塩基が欠損、置換若し
くは付加された、遺伝子。 - 【請求項４】 請求項２又は３記載の遺伝子を植物細胞
に導入する事により、植物細胞の増殖を促進させる方
法。 - 【請求項５】 請求項２又は３記載の遺伝子を植物細胞
に導入する事により、植物の成長を促進させた、形質転
換植物。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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