ES2337124T3 - Promotores de platano y melon para la expresion de transgenes en plantas. - Google Patents

Abstract

Molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a)la secuencia presentada como SEQ ID NO:4; y (b)secuencias que son al menos un 90% idénticas a la secuencia de SEQ ID NO:4 y que se caracterizan por la expresión constitutiva de un gen al que dichas secuencias están operativamente unidas.

Description

Promotores de plátano y melón para la expresión de transgenes en plantas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a promotores asociados a frutas de plátano novedosos, a un promotor de actina de melón y a un promotor de fusión de actina de melón/asociado a frutas de plátano. La invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico heterólogos, vectores, kits y métodos de transformación que emplean tales promotores. La invención se refiere además a plantas y células vegetales transgénicas transformadas con construcciones de ácido nucleico heterólogos que comprenden los promotores y a métodos para seleccionar promotores de plantas en diversos tipos de tejido vegetal usando un ensayo de expresión transitoria.

Bibliografía

Adams, D. O., y Yang, S. F., Plant Physiology 70:117-123 (1977).

Altschul, et al., Nucl. Acids Res. 25(17) 3389-3402 (1997).

An. G, et al., EMBO J. 4:277-284 (1985).

An. Y Q et al., Plant J. 10(1):107-21 (1996).

Ausubel, F M, et al., en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, Inc., Media, PA (1992).

Ayub, R., et al., Nature Biotechnology 14:862-866 (1996).

Becker, D., et al., Plant Mol. Biol. 20:1195-1197 (1992).

Bellini, C., et al., Bio/Technology 7(5):503-508 (1989).

Bestwick, R K, et al., publicación internacional PCT número WO 95/35387, publicada el 28 de diciembre de 1995.

Brunke, K J y Wilson, S L, publicación de patente europea número 0 559 603 A2, publicada el 08 de septiembre de 1993.

Clendennen, S K y May, Plant Physiol. 115:463-469 (1997).

Comai, L. y Coning, A. J., patente estadounidense número 5.187.267, expedida el 16 de febrero de 1993.

Cordes, S, et al., The Plant Cell 1:1025-1034 (1989).

Dominguez-Puigjaner et al., Plant Physiol. 114:1071-1076 (1997).

Dong, J.Z., et al., Bio/Technology 9:858-863, 1991.

Fang, G, y Grumet, R, Plant Cell Rep. 9:160-164 (1990).

Ferro, A, et al., patente estadounidense número 5.416.250, expedida el 16 de mayo de 1995.

Frisch et al., Plant Mol. Biol, 27:405-409, 1995.

Gonsalves, C, et al., J. Amer. Soc. Hort. Sci. 119:345-355 (1994).

Hooykaas, P J, y Schilperoot. R A, en TRENDS IN BIOCHEMICAL SCIENCES, International Union of Biochemistry and Elsevier Science Publishers, v.10(8):307-309 (1985).

Houck, C M y Pear, J R. patente estadounidense número 4.943.674, expedida el 24 de julio de 1990.

Hughes. J A, et al., J. Bact. 169:3625-3632 (1987).

Jefferson, R A, et al., EMBO J. 6:3901 (1987a).

Jefferson, R A, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387 (1987b).

Jefferson, R A, Nature 342(6251) 837-838, (1989).

Klein, T. M., et al., PNAS (USA) 85(22):8502-8505 (1988).

Leisner. S M, y Gelvin. S B, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2553-2557 (1988).

Lin, E et al., Plant Mol. Biol. 23:489-499 (1993).

Maniatis, T et al., en MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).

McCormick et al., Plant Cell Reports 5:81-84, 1986.

McElroy D, et al., Plant Mol Biol 15(2):257-68 (1990).

Medina-Escobar et al., Plant Mol Biol 34:867-877 (1997).

Medina-Suarez et al., Plant Physiol 115:453-461 (1997).

Miki, B. L. A., et al., PLANT DNA INFECTIOUS AGENTS (Hohn, T., et al., eds.) Springer-Verlag, Viena, Austria, págs. 249-265 (1987).

Ni, M et al., Plant J. 7:661-676 (1995).

Norelli et al., HortScience, 31:1026-1027, 1996.

Pearson y Meagher, Plant Mol Biol 14(4):513-26, 1990.

Picton, S, et al., Plant Physiology 103(4):1471-1472, 1993.

Ranier et al., Bio/Technology 8:33-38, 1990.

Robinson, H L y Torres, C A, Sem. Immunol. 9:271-282, 1997.

Rogers, S, patente estadounidense 5.034.322, expedida el 23 de julio de 1991.

Sagi et al., Bio/Technology 5:481-485, 1995.

Sambrook, J, et al., en MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, vol. 2(1989).

Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980).

Tommerup, H, et al., Eur. Congr. Biotechnol. 5:916-918 (1990).

Valles, M P y Lasa. J M, Plant Cell Rep. 13:145-148 (1994).

Van Haaren, M J J, et al., Plant Mol. Bio. 21:625-640 (1993).

Verdaguer et al., Plant Mol Biol. 37:1055-1067, 1998.

Wang et al., Mol Cell Biol. 12(8):3399-406 (1992).

Yoshioka, K, et al., Jpn. J. Breeding 42(2):278-285 (1992).

Zhu, Q, et al., Plant Cell 7:1681-1689 (1995).

Antecedentes de la invención

Las secuencias reguladoras de la transcripción o los promotores que regulan la expresión génica en plantas son elementos esenciales de la ingeniería genética de plantas. Varios ejemplos de promotores útiles para la expresión de genes heterólogos en plantas están ahora disponibles (Zhu, et al., 1995; Ni, et al., 1995).

La mayoría de los promotores son de aproximadamente 500-1500 bases. Los promotores para expresar una secuencia génica heteróloga en plantas pueden derivarse de ADN de plantas, por ejemplo, la proteína de choque térmico 80 de la coliflor (hsp 80, Brunke y Wilson. 1993; patente estadounidense número 5.612.472), u otras fuentes, por ejemplo, virus de plantas, por ejemplo, el promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S o bacterias que infectan plantas, por ejemplo, el promotor de nopalina sintasa (nos) (Rogers, 1991), el promotor de octopina sintasa (ocs) (Leisner y Gelvin, 1988) y el promotor de manopina sintasa (mas) de Agrobacterium.

La expresión de genes heterólogos o secuencias seleccionadas de genes en plantas transgénicas ha implicado normalmente el uso de promotores constitutivos, que dirigen la expresión de un producto en toda la planta en todo momento y en la mayoría de los tejidos (por ejemplo, hsp80), el promotor de ubiquitina del tomate (Picton, et al., 1993) y el promotor E4 de la frambuesa (patentes estadounidenses números 5.783.393; y 5.783.394).

Se conoce un número limitado de promotores inducibles y/o específicos de tejido. Los promotores que proporcionan expresión específica de fruta incluyen los promotores E4 y E8 del tomate (Cordes, et al., 1989: Bestwick, et al., 1995; patente estadounidense número 5.859.330). Otro promotor específico de fruta es el promotor del gen 2A11 del tomate. Se ha demostrado que las secuencias de ácido nucleico colocadas bajo el control regulador de la región no codificante en 5' del gen 2A11 del tomate (Van Haaren, 1993) se transcriben preferentemente en tejido de fruta en desarrollo. Se ha notificado que la regulación específica de fruta del promotor de actinidina del kiwi se conserva en plantas de petunia transgénicas (Lin, et al., 1993).

La pectato liasa (PEL) se ha identificado anteriormente como asociada a fruta y maduración en el plátano (Dominguez-Puigjaner et al., 1997; Medina-Suarez et al., 1997) y se ha asociado recientemente con la descomposición de componentes de la pared celular y el posterior ablandamiento de la fruta durante la maduración de fruta de fresa (Medina-Escobar et al., 1997).

El etileno es una hormona de plantas que influye en muchos aspectos del crecimiento y desarrollo de plantas, y se sabe que desempeña un papel principal en el proceso de maduración en frutas y vegetales. Se produce también una gran cantidad de etileno tras traumatismos provocados por productos químicos, temperaturas extremas, estrés hídrico, luz ultravioleta, daño por insectos, enfermedad o heridas mecánicas. En algunos tejidos, la exposición a sólo una pequeña cantidad de etileno puede provocar una avalancha de producción de etileno en tejidos vegetales o plantas adyacentes tal como recién producido. Este efecto autocatalítico puede ser muy pronunciado y conducir a una pérdida de calidad de la fruta durante el transporte y almacenamiento.

En plantas, la metionina se convierte en AdoMet, que se convierte en ACC, que se convierte en etileno. Se sintetiza AdoMet por medio de una reacción de condensación entre metionina y adenosina trifosfato (ATP). Una enzima bacteriana, AdoMet hidrolasa (AdoMetasa), que normalmente no está presente en tejido vegetal, hidroliza AdoMet para dar homoserina y MTA, ambas de las cuales se reciclan para dar metionina. Se han descrito vectores de transformación de plantas, promotores específicos de fruta de tomate y métodos de transformación de plantas con construcciones de ácido nucleico heterólogos eficaces para expresar AdoMetasa (también denominada "SAMasa") en células vegetales y modular de ese modo la expresión de etileno. véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses de titularidad conjunta números 5.416.250; 5.589.623; 5.723.746; 5.750.864; y 5.859.330, expresamente incorporadas como referencia al presente documento.

Existe una necesidad de promotores constitutivos de origen vegetal y de promotores de plantas que sean funcionales en fruta y puedan proporcionar un alto nivel de expresión de genes heterólogos en las células de fruta.

Sumario de la invención

Los solicitantes han identificado promotores asociados a frutas de plátano novedosos designados en la presente solicitud "TRX" y "PEL", un promotor de actina de melón, designado "mACTIN" y promotores de fusión actina de melón:TRX designados "TRX-intrón" y "TRX-actina".

En una realización, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que comprende un promotor TRX asociado a fruta de plátano o "G1A". En un aspecto de esta realización, el ácido nucleico aislado comprende los nucleótidos 13 a 990 de SEQ ID NO:1 (presentados como SEQ ID NO:2), o una parte funcional de la misma, o es complementario a la secuencia de ácido nucleico, y permanece unido de manera estable a la misma en condiciones de rigurosidad al menos moderadas y, opcionalmente, en condiciones de alta rigurosidad.

En otra realización, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que comprende un promotor PEL asociado a fruta de plátano. En un aspecto de esta realización, el ácido nucleico aislado comprende la secuencia presentada como SEQ ID NO:3 (figuras 3A y B), o una parte funcional de la misma (por ejemplo, nucleótidos 564-2010 o 1099-2010 de SEQ ID NO:3), o es complementario a la secuencia de ácido nucleico, y permanece unido de manera estable a la misma en condiciones de rigurosidad al menos moderadas y, opcionalmente, en condiciones de alta rigurosidad.

En otra realización, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que comprende un promotor de actina de melón designado "mACTIN". En un aspecto de esta realización, el ácido nucleico aislado comprende la secuencia de ADNc presentada como SEQ ID NO:4 (figura 4), o es complementario a la secuencia de ácido nucleico, y permanece unido de manera estable a la misma en condiciones de rigurosidad al menos moderadas y, opcionalmente, en condiciones de alta rigurosidad.

En una realización relacionada, la invención proporciona un promotor de fusión TRX-intrón de monocotiledóneas y un promotor de fusión TRX-actina, designados "TRX-intrón" y "TRX-actina", respectivamente. En un aspecto, el ácido nucleico aislado comprende la secuencia de promotor de fusión TRX-intrón presentada como SEQ ID NO:5 (figuras 5A-B), o es complementario a la secuencia de ácido nucleico, y permanece unido de manera estable a la misma en condiciones de rigurosidad al menos moderadas y, opcionalmente, en condiciones de alta rigurosidad. En otro aspecto, el ácido nucleico aislado comprende la secuencia de promotor de fusión TRX-actina presentada como SEQ ID NO:6 (figura 6), o es complementario a la secuencia de ácido nucleico, y permanece unido de manera estable a la misma en condiciones de rigurosidad al menos moderadas y, opcionalmente, en condiciones de alta
rigurosidad.

La invención también proporciona construcciones de ácido nucleico que tienen una secuencia codificante de ADN bajo el control transcripcional de un promotor asociado a fruta de plátano, un promotor de actina de melón, un promotor de fusión TRX-intrón o un promotor de fusión TRX de plátano-actina de melón. La secuencia codificante de ADN es normalmente heteróloga con respecto al promotor y está operativamente unida al promotor para permitir la expresión del producto codificado en células vegetales.

En un aspecto, los promotores asociados a fruta de plátano, TRX-intrón y TRX-actina de la presente invención pueden usarse para expresar genes heterólogos de una manera específica de fruta. En un aspecto relacionado de la invención, tales promotores pueden usarse para modular la producción de etileno en células de fruta transformadas y para alterar de ese modo el fenotipo de maduración de fruta transgénica que comprende tales células de fruta.

En otro aspecto, el promotor de actina de melón de la presente invención puede usarse para expresar genes heterólogos en células vegetales transformadas, de origen o bien dicotiledóneo o bien monocotiledóneo.

En un aspecto relacionado, el promotor de actina de melón puede usarse para expresar de manera constitutiva genes heterólogos en tejido de plantas dicotiledóneas o monocotiledóneas.

La invención incluye además un método para producir una planta transgénica tal como una planta que lleva fruta. En este método, el gen quimérico de la presente invención, portado normalmente en un vector de expresión que permite la selección en células vegetales, se introduce en células progenitoras de una planta seleccionada. Estas células progenitoras se han crecer entonces para producir una planta transgénica que lleva fruta.

En una realización relacionada adicional, la invención incluye una célula vegetal, un tejido vegetal, una planta transgénica, una célula de fruta, una fruta completa, semillas o callos que contienen cualquiera de los promotores descritos anteriormente, así como células vegetales que comprenden los promotores y/o productos génicos expresados bajo el control de los promotores.

En otra realización, la invención proporciona un método de expresión transitoria para evaluar la expresión de promotores en tejido vegetal. En un aspecto preferido de esta realización, se ensambla una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia promotora candidata operativamente unida a un gen indicador GUS, se prepara el tejido vegetal para la transformación, se introduce la construcción de ácido nucleido en el tejido vegetal preparado y se cultiva el tejido vegetal en condiciones eficaces y durante un tiempo suficiente para detectar la expresión del transgén.

Estos y otros objetos y características de la invención resultarán evidentes de manera más completa cuando se lea la siguiente descripción detallada conjuntamente con los ejemplos y las figuras adjuntos.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A-D muestran una secuencia de nucleótidos bicatenaria anotada, los nucleótidos 1-2453 (SEQ ID NO:1), del gen TRX (G1A) asociado a fruta de plátano, que contiene la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:2) del promotor TRX de plátano asociado a fruta. La figura presenta la secuencia completa del gen G1A, incluyendo la secuencia codificante (en letras mayúsculas), las regiones no traducidas en 5' y 3' e intrón/intrones (en letras minúsculas). Se indican los sitios de unión a cebador oligonucleotídico por encima de las secuencias, se identifica una supuesta caja TATA (nucleótido 884), se identifica el sitio de iniciación de la traducción (nucleótido 988), se identifica el codón de terminación de la traducción (nucleótidos 2319-2321) ya que son supuestas señales de
poliadenilación.

La figura 2 es una representación monocatenaria de una secuencia de promotor TRX modificada (SEQ ID NO:2), con sitios de restricción diseñados mediante ingeniería genética en los extremos 5' y 3', tal como se produce en la construcción del gen indicador pAG 159. Se ha diseñado mediante ingeniería genética un sitio BamHI (GGATCC) en el extremo 5', mientras que se ha diseñado mediante ingeniería genética un sitio NcoI (CCATGG) en el extremo 3'. El codón de iniciación de la transcripción consiste en el ATG contenido dentro del sitio NcoI en 3'. La supuesta caja TATA está subrayada. La figura 2 corresponde a los nucleótidos 13 a 990 de la secuencia de la figura 1, con la excepción de que los sitios de restricción para BamHI y NcoI no se han diseñado mediante ingeniería genética en la secuencia de la figura 2, en los extremos 5' y 3' terminales, respectivamente.

Las figuras 3A y B son una representación monocatenaria de la secuencia de promotor PEL1 de 2,0 kb (SEQ ID NO:5). Los extremos 5' de los truncamientos de 1,4 kb y 0,9 kb se indican en la figura en aproximadamente el nucleótido 564 y el nucleótido 1099, respectivamente. El sitio de iniciación de la traducción (ATG) que acaba en el nucleótido 2010 está en negrita.

La figura 4 representa la secuencia de nucleótidos completa del promotor de actina de melón ("mACTIN"), hasta e incluyendo el sitio de iniciación de la traducción. El sitio de iniciación de la transcripción, tal como se estima mediante la caracterización de productos de 5'RACE, se indica como + 1 en la secuencia, colocando la supuesta caja TATA en -47.

Las figuras 5A y 5B representan la secuencia de nucleótidos completa del promotor de fusión TRX de plátano/intrón de O2 ("TRX-intron" o "TRX-O2intron").

La figura 6 representa la secuencia de nucleótidos completa del promotor de fusión TRX de plátano:actina de melón ("TRX-actina"). La caja TATA (nt 890 a 896) está en negrita-subrayada. Los sitios de restricción usados en el subclonaje están subrayados, incluyendo el sitio NcoI en el extremo 3' del promotor que rodea el sitio de iniciación de la traducción (ATG).

La figura 7 ilustra los resultados de ensayos de indicador de GUS con los promotores PEL 2,0 kb (pAG142a), PEL 1,4 kb (pAG142b), PEL 0,9 kb (pAG142c), TRX 1.0 (pAG159) y CsVMV (pAG153), en pulpa de plátano comestible en fases de maduración verde, PCI 1 y PCI 4, presentados como el porcentaje de trozos de fruta con focos de
GUS.

Las figuras 8A y 8B ilustran la actividad promotora relativa de construcciones indicadores de GUS en ajo (exterior del diente, figura 8A) y cebolla (exterior del bulbo, cebolla blanca; y hojas de cebolla, cebolleta, figura 8B). Se introdujeron las construcciones con promotor RE4, de GUS sin promotor, con promotor CsVMV, mACTIN y CaMV 35S en fusión traduccional con el gen indicador GUS en tejido de ajo o cebolla mediante bombardeo con microproyectiles. Los resultados se notifican como el % de trozos con focos y como el número medio de focos por trozo.

Las figuras 9A-D ilustran los resultados de ensayos transitorios de GUS en ajo (exterior del diente) en los que la expresión de GUS está dirigida por (A) el promotor CaMV 35S; (B) el promotor CsVMV; (C) el promotor RE4; y (D) una construcción de GUS sin promotor.

Las figuras 10A - 10D ilustran los resultados de ensayos transitorios de GUS en cebolla (exterior del bulbo) en los que la expresión de GUS está dirigida por (A) el promotor CaMV 35S; (B) el promotor CsVMV; (C) el promotor RE4; y (D) una construcción de GUS sin promotor.

Las figuras 11A-D ilustran los resultados de la tinción histoquímica de tejido de Arabidopsis transformado y no transformado en diversas fases de desarrollo, en los que (A) representa Arabidopsis no transformada (ecotipo Col-0) en la fase roseta que no tiene tinción azul visible; (B) representa plantas de semillero de Arabidopsis transformadas con la construcción génica de promotor-indicador de mACTIN pAG4015, caracterizado por una tinción azul intensa en todos los tejidos, especialmente las raíces; (C) representa Arabidopsis transformada con pAG4015 en la fase roseta que tiene una tinción azul más intensa en los cotiledones, las hojas verdaderas tempranas y las raíces que en las últimas hojas en desarrollo; y (D) representa Arabidopsis transformada con pAG4015 en la fase de floración que tiene una tinción azul intensa en el tallo y una tinción azul menos intensa en las flores y silicuas que tienen tinción azul en la base y en la punta.

Las figuras 12A y 12B ilustran la actividad promotora relativa de construcciones indicadoras de GUS en trozos de fruta de plátano. Se introdujeron los promotores de fusión asociados a fruta TRX-intrón (pAG759) y TRX-actina (pAG749) en fusión traduccional con el gen indicador GUS en trozos de fruta de plátano mediante bombardeo con microproyectiles. Las muestras usadas fueron o bien fruta verde, no tratada con etileno (verde), fruta verde pero con 24 h de tratamiento con etileno (PCI 1), fruta amarilla con puntas verdes (PCI 4) o bien hoja. La actividad promotora relativa se expresa como tanto el porcentaje de trozos de fruta que muestran focos tras la tinción histoquímica (figura 11A) como el número medio de focos por trozo de fruta (figura 11B), para las 30 muestras sometidas a prueba por grupo. Se usó el promotor CsVMV constitutivo fuerte como control positivo para la comparación
(pAG153).

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

Tal como se usa en el presente documento, el término "polinucleótido" se refiere a una molécula polimérica que tiene una estructura principal que soporta bases que pueden formar puentes de hidrógeno con polinucleótidos típicos, en la que la estructura principal del polímero presenta las bases de una manera que permite tales puentes de hidrógeno de un modo específico de secuencia entre la molécula polimérica y un polinucleótido típico (por ejemplo, ADN monocatenario). Tales bases son normalmente inosina, adenosina, guanosina, citosina, uracilo y timidina. Las moléculas poliméricas incluyen ácidos ribonucleicos (ARN) y ácidos desoxirribonucleicos (ADN) mono y bicatenarios, y pueden incluir polímeros que tienen modificaciones de la estructura principal tales como enlaces metilfosfonato.

Un ácido nucleico puede ser bicatenario, monocatenario o contener partes de secuencia tanto bicatenaria como monocatenaria. La representación de una única cadena también define la secuencia de la otra cadena y por tanto incluye también el complemento de la secuencia que se representa.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "ácido nucleico recombinante" se refiere a ácido nucleico, formado originalmente in vitro, en general, mediante la manipulación de ácido nucleico por endonucleasas, en una forma no encontrada normalmente en la naturaleza.

Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "construcción génica quimérica" y "construcción de ácido nucleico quimérico" se usan de manera intercambiable y se refieren a secuencias de ácido nucleico recombinante que comprenden una secuencia codificante de ácido nucleico y secuencias control requeridas para la expresión de la secuencia codificante en una célula vegetal.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "promotor regulable" se refiere a cualquier promotor cuya actividad se vea afectada por condiciones de desarrollo o ambientales específicas (por ejemplo, un promotor E4 o E8 de tomate).

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "promotor constitutivo" se refiere a cualquier promotor que dirige la producción de ARN en muchos o todos los tejidos de un transformante de plantas la mayoría de las veces.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "promotor asociado a tejido" se refiere a cualquier promotor que dirige la síntesis de ARN a niveles superiores en tipos particulares de células y tejidos (por ejemplo, un promotor asociado a fruta).

Tal como se usa en el presente documento, el término "promotor" o la expresión "segmento de promotor" se refiere a una secuencia de ADN que actúa en un promotor dado a conocer en el presente documento para dirigir la transcripción de un gen en el sentido de 3'. Generalmente, el promotor será apropiado para la célula huésped en la que el gen diana está expresándose. El promotor junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras de la transcripción y traducción (también denominadas "secuencias control") son necesarias para expresar un gen dado. En general, las secuencias reguladoras de la transcripción y traducción incluyen, pero no se limitan a, secuencias promotoras, sitios de unión a ribosomas, secuencias de iniciación o terminación de la transcripción, secuencias de iniciación o terminación de la traducción y secuencias activadoras o potenciadoras.

Por "promotor de plantas" quiere decirse un promotor o una región promotora (tal como se definió anteriormente) que en su forma nativa se deriva de ADN genómico de plantas. Los promotores asociados a fruta de plátano de la presente invención son promotores de plantas.

Alternativamente, se obtiene un promotor TRX asociado a fruta a partir del gen que codifica para una proteína TRX de plátano, teniendo preferiblemente el gen que codifica para la proteína TRX asociada a fruta al menos aproximadamente un 70%, de manera más preferible aproximadamente un 80%, y de manera incluso más preferible aproximadamente del 85 al 90% de identidad de secuencia a lo largo de una longitud de secuencia de ácido nucleico que corresponde a la secuencia del gen TRX de plátano de SEQ ID NO:1. Usando técnicas rutinarias empleadas por los expertos en la técnica, una vez que el gen que codifica para una proteína TRX asociada a fruta se identifica basándose en la identidad de secuencia, el promotor TRX asociado a fruta asociado se identifica fácilmente usando técnicas de paseo genómico convencionales (es decir, el kit Universal Genome Walker, Clontech Laboratories. Inc., Palo Alto, CA).

Tal como se usa en el presente documento, "fuerza del promotor" se refiere al nivel de expresión regulada por promotor de un gen heterólogo en tejido o tejidos vegetales, en relación con un patrón adecuado (por ejemplo, un promotor asociado a fruta de una planta particular, por ejemplo, plátano, frente a un promotor génico patrón o control, por ejemplo el promotor de CaMV 35S o el promotor de CsVMV (promotor del virus del mosaico de la mandioca venosa, Verdaguer et al., 1998). Pueden medirse los niveles de expresión uniendo el promotor a un gen indicador adecuado tal como GUS (\beta-glucuronidasa). La expresión del gen indicador puede medirse fácilmente mediante ensayos fluorométricos, espectrofotométricos o histoquímicos (Jefferson, et al., 1987a; Jefferson, 1987b; Jefferson, RA, 1989).

Una construcción o una secuencia de ácido nucleico "heterólogo" tiene una parte de la secuencia que se ha introducido en la célula vegetal en la que se expresa. Heterólogo, con respecto a una secuencia control, puede referirse a una secuencia control (es decir, promotora o potenciadora) que no actúa en la naturaleza para regular el mismo gen cuya expresión está regulándose actualmente. Generalmente, se introduce ácido nucleico heterólogo en la célula o parte del genoma en el que están presentes, y se han añadido a la célula mediante transfección, microinyección, electroporación o similares. Las secuencias pueden contener una combinación de secuencia control/secuencia codificante que es igual que, o diferente de, una combinación de secuencia control/secuencia codificante encontrada en la planta nativa.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "operativamente unido" en relación con un vector o construcción de ADN recombinante significa que los componentes de nucleótidos del vector o construcción de ADN recombinante están en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está operativamente unido a una secuencia codificante si está colocada de modo que facilita la traducción. Generalmente, "operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas y, en el caso de una secuencia líder secretora, son contiguas y están en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos.

Tal como se usa en el presente documento, el término "gen" significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica, que puede incluir o no regiones que preceden y siguen a la región codificante, por ejemplo secuencias no traducidas en 5' (5' UTR) o "líder" y secuencias 3' UTR o "trailer", así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).

El término "gen" puede usarse de manera intercambiable en el presente documento con la expresión "secuencia codificante de ácido nucleico heteróloga", y la expresión "gen estructural" significa una región codificante de ADN.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "identidad de secuencia" significa identidad de la secuencia de aminoácidos o ácido nucleico en dos o más secuencias alineadas, alineadas usando un programa de alineación de secuencias. Las búsquedas de secuencias se llevan a cabo preferiblemente usando el programa BLASTN cuando se evalúa la de una secuencia de ácido nucleico dada en relación con las secuencias de ácido nucleico en las secuencias de ADN de GenBank y otras bases de datos públicas. Se prefiere el programa BLASTX para buscar secuencias de ácido nucleico que se han traducido en todos los marcos de lectura frente a secuencias de aminoácidos en las secuencias de proteínas de GenBank y otras bases de datos públicas. Se ejecutan tanto BLASTN como BLASTX usando parámetros por defecto de penalización por hueco abierto de 11,0 y una penalización por extensión de hueco de 1,0, y utilizan la matriz BLOSUM-62 [véase, Altschul, et al., 1997].

La expresión "% de homología" se usa de manera intercambiable con la expresión "% de identidad" en el presente documento y se refiere al nivel de identidad entre dos secuencias, es decir, un 70% de homología significa lo mismo que una identidad de secuencia del 70% tal como se determina mediante un algoritmo definido y, en consecuencia, un homólogo de una secuencia dada tiene al menos aproximadamente un 70%, de manera preferible aproximadamente un 80%, de manera más preferible aproximadamente un 85%, de manera incluso más preferible aproximadamente un 90% de identidad de secuencia a lo largo de una longitud de secuencia dada.

Una alineación preferida de secuencias seleccionadas con el fin de determinar el "% de identidad" entre dos o más secuencias, se realiza usando el programa CLUSTAL-W en MacVector versión 6.5, operado con parámetros por defecto, incluyendo una penalización por hueco abierto de 10,0, una penalización por extensión de hueco de 0,1 y una matriz de similitud BLOSUM 30.

Se considera que una secuencia de ácido nucleico es "selectivamente hibridable" con una secuencia de ácido nucleico de referencia si las dos secuencias se hibridan específicamente entre sí en condiciones de lavado e hibridación de rigurosidad moderada. Las condiciones a modo de ejemplo incluyen hibridación realizada tal como se describe en el manual ZetaProbe de Bio-Rad Labs (Bio-Rad Labs, Hercules. CA), incorporado expresamente al presente documento como referencia. Por ejemplo, se realiza la hibridación en EDTA 1 mM, Na_{2}HPO_{4} 0,25 M y SDS al 7% a 60ºC, seguido de lavado en EDTA 1 mM, NaPO_{4} 40 mM, SDS al 5% y EDTA 1 mM, NaPO_{4} 40 mM, SDS al 1%. Se mencionan adicionalmente condiciones de hibridación en Ausubel FM et al., 1993, incorporado expresamente al presente documento como referencia.

Tal como se usa en el presente documento, el término "expresión" se refiere al proceso mediante el cual se produce un polipéptido basándose en la secuencia de ácido nucleico de un gen. El proceso incluye tanto transcripción como traducción.

Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "transformado", "transformado de manera estable" o "transgénico" se refiere a una célula vegetal que tiene una secuencia de ácido nucleico no nativa (heteróloga) integrada en su genoma que se mantiene a través de dos o más generaciones.

Tal como se usa en el presente documento, el término "modular" se refiere a un cambio en la actividad biológica. La modulación puede referirse a un aumento o una disminución en la actividad biológica, las características de unión o cualquier otra propiedad biológica, funcional o inmunológica de la molécula.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "regulado por etileno", se refiere a una regulación que está inducida por cambios en la concentración de etileno en la planta. Por ejemplo, la actividad promotora que se produce o que se produce principalmente durante las fases tardías del desarrollo de la fruta y/o las fases tempranas de la maduración de la fruta, se dice que está regulada por etileno.

Tal como se usa en el presente documento, una "célula vegetal" se refiere a cualquier célula derivada de una planta, incluyendo tejido no diferenciado (por ejemplo, callo) así como semillas de plantas, polen, propágulos y embriones.

II. Aislamiento y caracterización de promotores asociados a fruta de plátano

Se identificaron varios fragmentos de ADNc como asociados a fruta y que se expresaban abundantemente en plátano mediante presentación diferencial. El análisis de fragmentos de presentación diferencial asociados a fruta junto con amplificación por PCR de ADN genómico con cebadores oligonucleotídicos complementarios a regiones conservadas de secuencias conocidas condujo a la caracterización e identificación final de las secuencias promotoras descritas en el presente documento.

A. Aislamiento y caracterización de un promotor TRX asociado a fruta de plátano

Se realizó presentación diferencial usando ARN de plátano total de pulpa, raíz, cormo y hoja de plantas que se han hecho crecer en invernadero, y plántulas in vitro (raíz y brote), para identificar fragmentos de ARN que se expresan diferencial y abundantemente en plátano, tal como se describe en el ejemplo 1. El análisis de 36 fragmentos de presentación diferencial asociados a fruta condujo a la selección final de una secuencia para el aislamiento y la caracterización del promotor (G1A).

Uno de los fragmentos, G1A, se hibridaba con ARN de pulpa de plátano en diferentes fases de maduración. Se encontró que el transcrito de G1A aumentaba con la maduración de la fruta. Cuando se hibridó en una transferencia de tipo Southern genómica de plátano, se encontró que G1A estaba representado por una pequeña familia génica en el plátano.

Cuando se realizó presentación diferencial usando ARN de plátano total a partir de pulpa con el cebador anclado a G (H-T_{11}G, SEQ ID NO:15) usado para las amplificaciones, junto con cebadores arbitrarios, H-AP1 a H-AP8 (SEQ ID NOs:7-14; GenHunter Corp., Nashville, TN), se encontró que varios productos de presentación diferencial amplificados eran únicos para la pulpa y no podían detectarse en la raíz, cormo, hoja o tejido de plántula in vitro, tal como se describe en el ejemplo 1. Entre éstos estaba un producto de aproximadamente 400 pb usando el cebador H-AP1 (SEQ ID NO:7; GenHunter Corp., Nashville, TN).

Se usó el producto de presentación diferencial recuperado como sonda en transferencias de tipo Northern para confirmar la distribución tisular del transcrito asociado. Los resultados del análisis de transferencia de tipo Northern usando G1A como sonda indican que el transcrito nativo es de aproximadamente 600 nt, y está sumamente asociado a fruta (no detectado en ningún otro tejido analizado incluyendo raíz, cormo, hoja o plántula in vitro). Cuando se hibridó el transcrito de G1A con ARN de pulpa de plátano en diferentes fases de maduración, apenas podía detectarse en plátanos verdes no tratados con etileno, y la abundancia del transcrito aumentó drásticamente tras el tratamiento con etileno y durante la maduración.

Tras el clonaje, se secuenciaron los productos de presentación diferencial y se compararon con secuencias disponibles en GenBank, usando una búsqueda de BLASTN básica de bases de datos de secuencias de ácido nucleico no redundantes a través de NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/index.html), usando parámetros por defecto y se encontró que G1A (TRX) presentaba una similitud de secuencia significativa con otros genes de tiorredoxina de plantas.

Se encontraron las secuencias de muchos genes de tiorredoxina de plantas en GenBank. La secuencia codificante de G1A de plátano, designada en el presente documento como TRX, es un 58,6% (280 de 478 nucleótidos) idéntica al nivel de nucleótidos con su vecino más cercano, la tiorredoxina de trigo (TRX), número de registro AJ009762. Fuera de la secuencia codificante, que incluye el promotor TRX, no se detectaron apareamientos significativos entre la secuencia de plátano y ninguna otra secuencia en GenBank usando el programa BLASTN con parámetros por defecto.

Se sabe que la tiorredoxina existe en plantas superiores en varias formas. Las isoformas m y f son cloroplásticas, mientras que la isoforma h es citosólica y carece tanto de una secuencia señal como de una secuencia de tránsito. Se han caracterizado recientemente dos genes de tiorredoxina de trigo y parecen contener un dominio transmembrana en el extremo N-terminal, lo que indica una asociación a la membrana. La secuencia codificante asociada con la tiorredoxina de plátano descrita en el presente documento es lo más similar a la isoforma h, y carece de cualquier presecuencia aparente, lo que sugiere que es citosólica.

Los genes de tiorredoxina h existen generalmente como pequeñas familias génicas en plantas superiores, aunque se han caracterizado al menos cinco supuestas secuencias en Arabidopsis. Tanto el trigo como el tabaco tienen dos genes de tiorredoxina h estrechamente relacionados que se expresan de manera diferencial. Antes de la presente invención, no se había notificado una tiorredoxina asociada a fruta.

Se aislaron secuencias en el sentido de 5' asociadas con el producto de presentación diferencial de plátano TRX en una serie de etapas, tal como se detalla en el ejemplo 1. Se aislaron las secuencias en el sentido de 5' mediante paseo genómico y se ensamblaron en una secuencia contigua (figuras 1A-D).

Una búsqueda de BLASTN básica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) de bases de datos de secuencias de ácido nucleico no redundantes a través de NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/index.html) reveló que no había apareamientos significativos con el promotor TRX presentado en la figura 2.

Se construyó una secuencia promotora modificada, con sitios de restricción diseñados mediante ingeniería genética en los extremos 5' y 3' para su incorporación en la construcción génica indicadora pAG 159, tal como se describe más adelante en el ejemplo 1.

B. Aislamiento y caracterización de un promotor PEL asociado a fruta de plátano

Se asoció previamente la pectato liasa (PEL) con fruta y maduración en plátano (Dominguez-Puigjaner et al., 1997; Medina-Suarez et al., 1997) y con la descomposición de componentes de la pared celular y el posterior ablandamiento de la fruta durante la maduración de la fruta de fresa (Medina-Escobar et al., 1997). Pueden encontrarse dos secuencias de ADNc de pectato liasa de plátano y una de fresa en GenBank con los números de registro X92943, Z93106 y U63550, para PEL1, PEL2 y PEL de fresa, respectivamente.

La expresión pectato liasa en fruta de plátano está coordinada con la maduración y puede estimularse mediante etileno endógeno (Dominguez-Puigjaner et al, 1997). Sin embargo, la distribución tisular del transcrito de PEL no se ha notificado anteriormente.

La amplificación por PCR de ADN genómico de plátano con cebadores oligonucleotídicos complementarios a regiones conservadas de la secuencia codificante de PEL produjo dos productos de tamaño diferente (PEL1 y PEL2) que se clonaron, se secuenciaron y se usaron para diseñar cebadores oligonucleotídicos específicos de gen. Los resultados de la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa semicuantitativa (RT-PCR) usando ADNc de pulpa de plátano maduro como molde indicaron que el transcrito de PEL1 era más abundante en pulpa de plátano maduro que el transcrito de PEL2.

La alineación de las dos secuencias de PEL de plátano con las secuencias de PEL en GenBank indicó que PEL1 (número de registro de GenBank X92943) tiene la misma secuencia codificante tal como se describe por Dominguez-Puigjaner et al., 1997. y que PEL2 (número de registro de GenBank Z93106) tiene la misma secuencia codificante tal como se describe por Medina-Suarez et al, 1997. Una búsqueda en GenBank de secuencias relacionadas indicó una pectato liasa asociada a fruta adicional aislada de la fresa (Medina-Escobar et al., 1997).

La alineación de las dos secuencias codificantes de PEL de plátano y la secuencia codificante de PEL de fresa de GenBank usando MacVector versión 6.5 reveló regiones de secuencia que se conservan entre las tres pectato liasas asociadas a fruta. Se identificaron secuencias promotoras de PEL en un procedimiento de múltiples etapas, y antes de la presente invención no se había notificado la secuencia promotora de PEL.

Se generó una biblioteca de ADNc y adaptadores ligados a ADNc bicatenario con el fin de proporcionar una biblioteca accesible para PCR para una amplificación rápida de los extremos 5' y 3' del ADNc (5' o 3' RACE, respectivamente), tal como se detalla en el ejemplo 2, más adelante. Se amplificó un supuesto fragmento de promotor de aproximadamente 2,5 kb a partir de la biblioteca genómica de plátano digerida con ScaI, se clonó y se secuenció completamente.

Se subclonó el fragmento de promotor PEL1 de 2,5 kb como una fusión traduccional con GUS en una construcción del gen indicador, luego se truncó en el extremo 5' para generar fragmentos de promotor de 2,0 kb (SEQ ID NO:3) y truncamientos de los mismos de 1,4 kb, y 0,9 kb tal como se describe en el ejemplo 2. Véanse también las figuras 3A y 3B. Se incorporaron los diversos fragmentos de promotor PEL en construcciones indicadoras en fusión traduccional con una secuencia de GUS, también descrito en el ejemplo 2.

III. Promotor de actina de melón

La actina es una proteína expresada de manera ubicua que es un componente integral del citoesqueleto. Debido a su alto grado de conservación y abundante expresión en casi todos los tejidos eucariotas, la actina se ha convertido en un patrón común o gen control en el estudio de sistemas biológicos. Generalmente, se considera que la expresión de la actina es tanto ubicua como constitutiva y las secuencias de actina y la estructura del gen están bien conservadas entre las plantas. En las plantas, los genes de actina funcionales están compuestos comúnmente por cinco exones interrumpidos con cuatro intrones. Las posiciones de los intrones están bien conservadas entre las plantas y son bastante pequeños, aunque la longitud y secuencia de los intrones son variables. Véase, por ejemplo, Pearson y Meagher, 1990, actina de soja; An et al., 1996, actina de Arabidopsis; y McElroy et al., 1990, arroz.

El aislamiento y la caracterización de un fragmento de ADN genómico en el sentido de 5' de una secuencia codificante de actina de melón (Cucumis melo) se describe en el presente documento y se identifica como el promotor de actina de melón ("mACTIN", ejemplo 3). La secuencia de promotor de mACTIN (SEQ ID NO:4) se deriva de una dicotiledónea, sin embargo, presenta de manera sorprendente una fuerte actividad promotora constitutiva tanto en monocotiledóneas como dicotiledóneas. Aunque el promotor es de origen vegetal, presenta un nivel de actividad promotora que es similar a la del promotor viral de CaMV usado comúnmente.

IV. Promotores de fusión de actina de melón:TRX específico de fruta de plátano

El promotor TRX específico de fruta de plátano presentaba un nivel moderado de actividad tal como se determinó mediante la actividad transitoria del gen indicador en trozos de fruta de plátano. Se construyeron dos formas modificadas del promotor (1) añadiendo un intrón de monocotiledóneas al extremo 3' del promotor TRX de plátano y (2) fusionando el promotor TRX de plátano con el promotor de actina de melón en la caja TATA.

El promotor de actina de melón es un promotor constitutivo fuerte que es activo tanto en monocotiledóneas como dicotiledóneas y contiene un intrón en la secuencia líder no traducida en 5'. Aunque el mecanismo no es parte de la invención, se pronosticó que la adición de un intrón en la secuencia líder en 5' no traducida del promotor TRX de plátano aumentaría la actividad del promotor TRX de plátano, pero que la especificidad de fruta del promotor TRX permanecería sin cambios dado que se pronostica que los elementos funcionales que controlan la especificidad de tejido se producen en el sentido de 5' de la caja TATA.

La construcción y evaluación de un promotor de fusión TRX-actina de melón y TRX-intrón de monocotiledóneas se describe adicionalmente en el ejemplo 4. Según los resultados de ensayos de expresión transitoria usando los promotores TRX modificados, los promotores de fusión demuestran un rendimiento mejorado en relación con el promotor TRX específico de fruta de plátano en ensayos de expresión transitoria.

V. Vectores para transformar células vegetales

La presente invención proporciona vectores adecuados para la transformación de plantas. Los vectores, genes quiméricos y construcciones de ADN de la presente invención también son útiles para la expresión de genes heterólogos. Las plantas transgénicas, células vegetales transgénicas y fruta transgénica, que portan los genes quiméricos de la presente invención, pueden ser una fuente útil de material expresado de manera recombinante.

Los promotores de fusión TRX y asociados a fruta de plátano de la invención encuentran utilidad en construcciones génicas quiméricas para la expresión asociada a fruta de genes estructurales heterólogos operativamente unidos a un promotor. Los métodos y resultados descritos en el presente documento se refieren a la expresión génica asociada a fruta bajo el control de los promotores de fusión TRX y asociados a fruta de la invención, así como la expresión génica constitutiva bajo el control del promotor de actina de melón en células vegetales transgénicas. Los promotores de la invención incluyen una región de ADN que promueve la transcripción de un gen operativamente unido a la misma, en células vegetales transformadas.

Usando técnicas de manipulación de ADN conocidas, de rutina tales como las descritas en Sambrook et al. (1989), pueden prepararse construcciones génicas heterólogas mediante las cuales una secuencia de interés de ADN estructural foráneo, o gen, puede colocarse bajo el control regulador de un promotor asociado a fruta de plátano de la
invención.

Los expertos habituales en la técnica conocen la construcción de vectores de expresión o construcciones génicas heterólogas adecuadas para técnicas de transformación en plantas (véase, por ejemplo Houck y Pear, 1990, y Becker, et al., 1992).

Para la expresión en plantas, los vectores de expresión de la invención pueden construirse para que contengan un sitio de inserción para una secuencia codificante de ADN de interés. La transcripción de tal ADN insertado está entonces bajo el control de un promotor asociado a fruta de plátano de la invención.

Tales vectores de expresión pueden tener señales de terminación de la transcripción únicas o múltiples en el extremo 3' de la secuencia de ADN que está expresándose. El casete de expresión puede incluir también, por ejemplo, (i) una secuencia de ADN que codifica para una secuencia líder (por ejemplo, para permitir la secreción o el direccionamiento vacuolar), (ii) señales de terminación de la traducción, (iii) genes marcadores seleccionables para su uso en células vegetales, (iv) secuencias que permiten la selección y propagación en un huésped secundario, tal como un origen de replicación y una secuencia marcadora seleccionable.

Los genes marcadores seleccionables codifican para un polipéptido que permite la selección de células vegetales transformadas que contienen el gen haciendo que las células sean resistentes a una cantidad de un antibiótico que sería tóxica para las células vegetales no transformadas. Los genes marcadores seleccionables a modo de ejemplo incluyen el gen de resistencia a neomicina fosfotransferasa (nptII), higromicina fosfotransferasa (hpt), nitrilasa específica de bromoxilino (bxn), enzima fosfinotricina acetiltransferasa (BAR) y el gen de resistencia a espectinomicina (spt), en los que el agente selectivo es kanamicina, higromicina, geneticina, el herbicida glufosinato-amonio ("Basta") o espectinomicina, respectivamente.

Los huéspedes secundarios típicos incluyen bacterias y levaduras. En una realización, el huésped secundario es Escherichia coli, el origen de replicación es un tipo colE1 y el marcador seleccionable es un gen que codifica para resistencia a ampicilina. El origen de replicación y las secuencias marcadoras seleccionables operativas en huéspedes secundarios se conocen bien en la técnica y muchos están comercialmente disponibles (por ejemplo, Clontech, Palo Alto, CA; Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores de la presente invención son útiles para la expresión asociada a tejido de fruta (usando un promotor TRX o PEL de plátano, un promotor de fusión TRX-intrón o uno TRX-actina) o la expresión constitutiva (mACTIN) de secuencias codificantes de ácido nucleico en células vegetales. Por ejemplo, puede insertarse una secuencia que codifica para péptido o polipéptido seleccionado en un vector de expresión de la presente invención. El vector se transforma entonces en células huésped, y las células huésped se cultivan en condiciones que permiten la expresión de la secuencia que codifica para la proteína. En algunos casos, el péptido o polipéptido expresado se aísla de las células. También pueden usarse células progenitoras de plantas transformadas para producir plantas transgénicas que llevan fruta.

Además, la invención incluye un método para producir una planta que lleva fruta transgénica, en la que la fruta producida por la planta tiene un fenotipo modificado. En este método, se introduce una construcción génica heteróloga (por ejemplo, mediante transformación) en células progenitoras de la planta. Una construcción génica heteróloga a modo de ejemplo está compuesta por (i) una secuencia de ADN que codifica para un producto génico eficaz para modificar una característica fenotípica de la planta, por ejemplo, para reducir la biosíntesis de etileno en fruta producida por la planta, operativamente unida a (ii) un promotor de fusión TRX o de plátano de la invención en el que la expresión está asociada a fruta. En otra realización, la invención incluye un método para producir una planta transgénica, en el que una construcción génica heteróloga a modo de ejemplo está compuesta por (i) una secuencia de ADN que codifica para un producto transgénico, operativamente unida a (ii) un promotor de actina de melón en el que la expresión es constitutiva.

La secuencia de ADN es heteróloga con respecto al promotor y el gen quimérico contiene los elementos reguladores apropiados necesarios para la expresión en una célula vegetal. El progenitor transformado se hace crecer para producir una planta transgénica que lleva fruta. El método incluye además transformar células progenitoras de la planta con un vector que contiene un marcador seleccionable y el gen heterólogo.

Se entenderá que los vectores descritos en el presente documento pueden formar parte de un kit de transformación de plantas. Otros componentes del kit pueden incluir, pero no se limitan a, reactivos útiles para la transformación de células vegetales.

VI. Métodos de transformación de células vegetales

Pueden transferirse genes quiméricos que contienen un promotor asociado a fruta de plátano de la invención, por ejemplo, TRX o PEL, un promotor de actina de melón de la invención, un promotor de fusión TRX:intrón o TRX:actina de melón de la invención, a células vegetales mediante cualquiera de varias metodologías de transformación de plantas, incluyendo métodos basados en Agrobacterium [Ranier et al., 1990 (arroz), McCormick et al., 1986 (tomate): Norelli et al., 1996 (manzana)], electroporación, microinyección y bombardeo con microproyectiles. (Véase, por ejemplo, Comai y Coning. 1993; Klein, et al., 1988; Miki, et al. 1987; Bellini. et al., 1989).

En una realización, se introducen genes quiméricos en plantas a modo de un plásmido Ti sin ADN-T portado por Agrobacterium tumefaciens, seguido por el cocultivo de las células de A. tumefaciens con células vegetales. En tales casos, los vectores para su uso en la invención contienen un gen marcador seleccionable, regiones límite de ADN-T de Agrobacterium tumefaciens, un gen heterólogo de interés y otros elementos según se desee. Vectores de transformación de Agrobacterium a modo de ejemplo están comercialmente disponibles de Clontech (Palo Alto, CA) y se describen adicionalmente por An, et al., 1985.

Pueden construirse otros vectores adecuados usando los promotores de la presente invención y vectores de transformación de plantas convencionales, que están ambos comercialmente disponibles (Clontech, Palo Alto, CA) y de fuentes académicas [Salk Institute, Plant Biology Labs; Texas A & M University (Frisch et al., 1995); Waksman Institute, Rutgers, The State University of New Jersey, Piscataway, NJ].

Otra realización se basa en el bombardeo con microproyectiles usando micropartículas cargadas con ADN que se bombardean al interior de las células usando la tecnología de "pistola génica", (véase, por ejemplo, Robinson, HL y Torres, CA, 1997.)

Cuando se utilizan técnicas de transformación por electroporación o bombardeo con microproyectiles, el vector de transformación contiene generalmente el gen heterólogo de interés y una construcción de un gen marcador seleccionable para determinar si el acontecimiento de transformación fue satisfactorio.

Se obtienen células vegetales transformadas como resultado de la transformación de las células vegetales con una construcción génica heteróloga que contiene un promotor de la invención operativamente unido a un gen heterólogo. Las células vegetales se cultivan en medio que contiene el agente de selección apropiado para identificar y seleccionar células vegetales que expresan el gen quimérico. Tras seleccionar células vegetales que expresan el gen quimérico, se regeneran plantas completas a partir de las células vegetales transgénicas. Se conocen en la técnica técnicas para regenerar plantas completas a partir de células vegetales transformadas. Se conocen también protocolos de regeneración de plantas adecuados.

La invención incluye además un método para producir una planta transgénica tal como una planta que lleva fruta. En este método, el gen quimérico de la presente invención, portado normalmente en un vector de expresión que permite la selección en células vegetales, se introduce en células progenitoras de una planta. Estas células progenitoras se hacen crecer entonces para producir una planta transgénica que lleva fruta.

Las plantas preferidas adecuadas para la transformación usando los promotores de fusión TRX y actina de melón, asociados a fruta de plátano de la invención, e incluyen pero no se limitan a, plátano, tomate, piña, uva, frambuesa, fresa, kiwi, aguacate, melón, mango, papaya, manzana, melocotón, pera, cereza, cítricos, palmera datilera, plátano macho, soja, algodón, alfalfa, colza, lino, remolacha azucarera, girasol, patata, tabaco, maíz, trigo, arroz, frutos de cáscara y lechuga.

En una realización a modo de ejemplo, se transforman explantes de cotiledón de una variedad de melón cantaloup (Cucumis Melo, melón bordado) según métodos conocidos (Fang y Grumet, 1990; Valles y Lasa, 1994: Dong, et al., 1991; Gonsalves, et al., 1994, Yoshioka, et al., 1992; Ayub, et al., 1996), usando la cepa de Agrobacterium desarmada para introducir los vectores binarios descritos anteriormente en plantas. La cepa de Agrobacterium desarmada se cocultiva con explantes de tejido de cotiledón de melón, y se seleccionan transformantes primarios basándose en su capacidad para regenerar y desarrollar raíces en medios que contienen el antibiótico, kanamicina.

En otras realizaciones a modo de ejemplo, se usan métodos de transformación de Agrobacterium tales como se describieron para plátano, arroz, tomate, manzana para transformar células vegetales usando un promotor de la invención. Se ha descrito anteriormente la transformación de Agrobacterium para arroz, tomate, manzana, almendra, espárrago, aguacate, brócoli, zanahoria, coliflor, apio, pepino, uva, caqui y espinaca. Véase, por ejemplo, Sagi et al., 1995 (plátano); Ranier et al., 1990 (arroz); McCormick et al., 1986 (tomate), Van Eck JM, et al., Plant Cell Reports 14: 299-304, 1995 (tomate); Norelli et al., 1996 (manzana); Miguel CM et al., Plant Cell Reports 18: 387-93, 1999 (almendra); Cabrera-Ponce JL et al., Plant Cell Reports 16: 255-260, 1997, Delbreil B et al., Plant Cell Reports 12:129-132, 1993 (espárrago); Mogilner N et al., Mol Plant Microbe Interact 6(5):673-5, 1993 (aguacate); Hosoki T et al., J. Japan Soc. Hort. Sci. 60: 71-75, 1991 (brócoli); Hardegger M et al., Molecular Breeding 4: 119-127, 1998 (zanahoria); Bhalla PL y Smith N, Molecular Breeding 4: 531-41, 1998 (coliflor); Catlin D et al., Plant Cell Reports 7: 100-103, 1988 (apio); Sarmento GG et al., Plant Cell Tissue and Organ Culture 31: 185-193, 1992 y Trulson AJ et al., Theor Appl Genet 73: 11-15, 1986 (pepino); Scorza R et al., Plant Cell Reports 14: 589-92, 1995 y Franks T et al., Molecular Breeding 4:321-33, 1998 (uva); Nakamura Y et al., Plant Cell Reports 17:435-440 (caqui); y Zhang HX y Zeevaart JAD, Plant Cell Reports 18: 640-45, 1999 (espinaca).

VII. Genes heterólogos

Cualquier gen estructural de interés puede colocarse bajo el control regulador de un promotor de la invención. El gen estructural puede codificar para un polipéptido de interés u otro producto génico.

Según los métodos de la presente invención, pueden unirse operativamente genes heterólogos a un promotor de fusión TRX, de actina de melón o asociado a fruta de plátano de la invención.

En un aspecto, los promotores asociados a fruta de plátano de la invención se usan para modular la producción de etileno en células de fruta transformadas, y de ese modo alterar la maduración y retrasar la senescencia de fruta transgénica compuesta por tales células de fruta.

En esta realización de la invención, los promotores descritos en el presente documento se emplean en un método para prolongar la maduración y retrasar la senescencia de la fruta de una planta que lleva fruta, por ejemplo, plátano. En este aspecto de la invención, se hacen crecer células vegetales transgénicas que contienen los promotores de la presente invención para producir una planta transgénica que lleva fruta.

En particular, se transforman células vegetales con una construcción de ácido nucleico heterólogo que codifica para un producto que puede reducir la biosíntesis de etileno cuando se expresa en células vegetales (por ejemplo, S-adenosil-metionina hidrolasa (SAMasa, Ferro et al., 1995: Hughes et al., 1987), ácido aminociclopropano-1-carboxílico (ACC) desaminasa, molécula antisentido de ACC oxidasa, molécula antisentido de ACC sintasa, molécula de cosupresión de ACC oxidasa, molécula de cosupresión de ACC sintasa), que está bajo el control de un promotor de plátano de la invención. La fruta producida por estas plantas transgénicas tienen un fenotipo de maduración modificada, tal como se describe en las patentes estadounidenses de titularidad conjunta 5.859.330; 5.783.394; 5.783.393: 5.723.746; 5.589.623; 5.416.250 y 5.750.864, expresamente incorporadas al presente documento como referencia.

Un fenotipo de maduración modificada se refiere a una alteración en la velocidad de maduración; caracterizado por un aumento en el transcurso de tiempo de la maduración, o maduración prolongada y la senescencia retrasada de una fruta transgénica en relación con una fruta de tipo natural correspondiente (es decir, no transgénica).

En otra realización, la secuencia codificante de ácido nucleico puede corresponder a un gen relacionado con patogénesis, tal como proteína inhibidora de poligalacturonasa (PGIP), glucanasa y quitinasa.

En realizaciones adicionales, la secuencia codificante de ácido nucleico incluye secuencias que afectan a: (i) el aroma (por ejemplo, taumatina; GenBank); (ii) la pigmentación (por ejemplo, productos que modifican la síntesis de licopeno, tales como licopeno ciclasa; GenBank); (iii) enzimas u otros productos catalíticos (tales como ribozimas o anticuerpos catalíticos) que modifican procesos de células vegetales; (iv) enzimas que inhiben la degradación de fruta madurada (por ejemplo, polifenol oxidasa antisentido y polifenol peroxidasa antisentido (para inhibir el pardeamiento) y pectato liasa antisentido (para inhibir el ablandamiento); (vi) péptidos antimicrobianos, (vii) genes de acumulación de sacarosa, tales como el gen de la sacarosa fosfato sintasa (GENBANK) y (viii) genes que afectan al metabolismo de la sacarosa (por ejemplo, invertasa).

VIII. Identificación y evaluación de transformantes

Tras la transformación, se someten a ensayo células vegetales transgénicas para detectar la expresión de un transgén que está operativamente unido a un promotor de fusión TRX, de actina de melón o asociado a fruta de plátano de la invención. Pueden seleccionarse inicialmente células vegetales transgénicas por su capacidad para crecer en presencia de un agente selectivo, tal como el antibiótico aminoglicósido, kanamicina.

La expresión de un transgén también puede determinarse mediante análisis de ADN, ARNm y proteína, asociados con la expresión del transgén. Los ensayos se realizan normalmente usando diversas fuentes de tejido vegetal, por ejemplo, hojas, tallo o fruta.

A. Construcción de vectores de transformación de plantas y evaluación de la expresión de indicador Promotores asociados a fruta de plátano

Se evaluó la actividad relativa de los promotores asociados a fruta de plátano de la invención en un sistema de ensayo transitorio usando un gen indicador, a modo de ejemplo GUS (\beta-glucuronidasa), eficaz para evaluar la expresión regulable asociada a tejido de los promotores. La expresión de proteína GUS se mide fácilmente mediante ensayos fluorométricos, espectrofotométricos o histoquímicos (Jefferson, 1987a).

Los resultados de los ensayos funcionales de los promotores PEL y TRX asociados a fruta en construcciones de un gen indicador de GUS sugieren que las secuencias de PEL y TRX actúan como promotores en tejido de fruta, son sensibles a etileno y están asociadas con la maduración.

Se prepararon construcciones de ácido nucleico recombinante que comprendían: pAG142a-pel::GUS (2,0 kb), pAG142b-pel::GUS (1,4 kb), pAG142c-pel::GUS (0,9 kb), pAG153-CsVMV::GUS, pAG159-TRX::GUS y pBI221-35S::GUS usando las secuencias promotoras aisladas y técnicas empleadas rutinariamente por los expertos en la técnica, se introdujeron entonces en células vegetales de plátano mediante bombardeo de partículas, tal como se describe más adelante en los ejemplos 1 y 2.

La actividad promotora de diversas construcciones de ácido nucleico recombinante, pAG142a-pel::GUS (2,0 kb), pAG142bpel::GUS (1,4 kb), pAG142c-pel::GUS (0,9 kb), pAG153-CsVMV::GUS, pAG159-TRX::GUS y PBI221-35S::GUS, se evaluó en ensayos transitorios para determinar la expresión de GUS.

Para llevar a cabo el análisis, se obtuvieron plátanos "cavendish" de una tienda de comestibles local y se sometieron a prueba antes del tratamiento con etileno ("no tratados con gas"), en el plazo de 24 horas de un tratamiento con etileno comercial convencional ("verde, tratados con gas") o aproximadamente de 2 a 3 días tras el tratamiento con etileno, cuando los plátanos habían alcanzado un índice de color de la piel (PCI) de 4 a 5 (la mayoría de las veces piel amarilla, "medio maduros").

Se prepararon suspensiones en partículas de oro de cada construcción y se usaron para bombardear fruta de plátano verde esterilizada no tratada con gas, fruta de plátano verde tratada con gas justo antes de la fase de maduración (no bastante amarilla) y fruta de plátano tratada con gas 24 horas tras tratar con gas con etileno, tal como se detalla más adelante en los ejemplos 1 y 2. La figura 7 ilustra los resultados de los ensayos de indicador de GUS con los promotores pAG142a-pel::GUS (PEL 2,0), pAG142b-pel::GUS (PEL 1,4), pAG142c-pel::GUS (PEL 0,9), pAG153-CsVMV::GUS (CsVMV) y pAG159-TRX::GUS (TRX 1,0) en pulpa de plátano comestible (superficie externa de la pulpa en contacto con la piel) en fases de maduración verde, de índice de color de la piel (PCI) 1 (tempranas) y PCI 4 (tardías). Los resultados se notifican como el tanto por ciento de trozos de fruta de plátano con focos de GUS.

Promotor de actina de melón y promotores de fusión actina de melón/TRX

La actividad relativa de los promotores de fusión TRX-actina, TRX-intrón y actina de melón de la invención se evaluó en un sistema de ensayo transitorio usando un gen indicador de GUS (\beta-glucuronidasa), tal como se describió anteriormente.

Se llevó a cabo el bombardeo de partículas de diversos tejidos incluyendo células embrionarias de plátano en suspensión, trozos de fruta de plátano y varios tipos de tejido de ajo y cebolla usando los promotores de fusión TRX y actina de melón. Se evaluaron varias construcciones de plásmidos que contenían el gen GUS bajo el control transcripcional de diferentes promotores mediante bombardeo de partículas incluyendo: pAG138m-RE4::GUS; pAG147-GUS sin promotor (que contiene el gen GUS sin elementos reguladores y sirve como control negativo); pAG153-CsVMV::GUS (que contiene el promotor de CsVMV y sirve como control positivo); pAG167-mACTIN::GUS; PBI221-35S::GUS 9 (que contiene el promotor de CaMV y sirve como control positivo); pAG749, TRX-actina; y pAG759, TRX-intrón de O2, tal como se describe adicionalmente en los ejemplos 3 y 4.

Tras el bombardeo y la incubación en la oscuridad, se trataron las muestras con disolución de X-gluc a 37ºC durante 18 horas. Se puntuaron los focos de GUS azules usando un microscopio invertido.

Se evaluó el promotor de actina de melón junto con diversos promotores control tanto en ajo como en cebolla y el control negativo (GUS sin promotor) no mostró focos, mientras que los pAG138m-RE4::GUS; pAG153-CsVMV::pAG167-mACTIN::GUS; y PBI221-35S::GUS (CaMV 35S) promovían todos la expresión de GUS, tal como se detalla en el ejemplo 3.

Se llevó a cabo el bombardeo de partículas de trozos de fruta de plátano usando los promotores TRX modificados. Los resultados de la expresión de GUS indican que las modificaciones de TRX-intrón y TRX-actina dieron como resultado un rendimiento mejorado en relación con el promotor TRX específico de fruta de plátano. Más específicamente, el promotor de fusión TRX-actina presenta actividad de expresión transitoria aproximadamente igual al promotor constitutivo fuerte CsVMV, mientras que la fusión TRX-intrón es ligeramente menos activa en promedio. Además, los promotores TRX-intrón y TRX-actina tienen actividad inferior en hojas de plátano, lo que indica que los promotores han conservado la especificidad de tejido del promotor TRX (ejemplo 4).

Transformación estable de Arabidopsis

También se sometió prueba el promotor mACTIN para detectar su actividad en una dicotiledónea modelo (Arabidopsis thaliana) tras su transformación con una construcción de ácido nucleico que contenía el gen indicador que codifica para GUS bajo el control del promotor mACTIN. El plásmido pAG4015, que contiene dos casetes de expresión: (1) adyacente al límite izquierdo del ADN-T se encuentra el casete de selección que contiene el gen nptII que confiere resistencia a kanamicina bajo el control del promotor de CsVMV junto con el terminador G7; y (2) adyacente al límite derecho del ADN-T se encuentra el gen indicador GUS bajo el control del promotor mACTIN junto con el terminador nos.

Se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana con pAG4015 mediante transformación mediada por Agrobacterium in planta, se recogieron semillas T1 de las plantas, se germinaron y se transformaron en plantas de semillero identificadas basándose en la resistencia a kanamicina, tal como se describe adicionalmente en el ejemplo 3.

La tinción histoquímica para detectar la actividad de GUS indicó que el promotor mACTIN dirige la expresión del gen indicador fuerte en hojas, raíces, tallos y flores (ejemplo 3).

B. Métodos de detección de la expresión génica dirigida por promotor

Pueden someterse a ensayo plantas transgénicas para determinar su capacidad para sintetizar productos de ARNm, ADN, proteína y/o para determinar su resistencia a un antibiótico, por ejemplo, el antibiótico aminoglicósido, kanamicina. Los ensayos se realizan normalmente usando diversas fuentes de tejido vegetal, por ejemplo, hojas, tallos o frutas.

La expresión y/o amplificación génica puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia de tipo Northern, transferencia de tipo Southern convencionales para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas, 1980), transferencia puntual (análisis de ADN) o hibridación in situ, usando una sonda marcada de manera apropiada, basándose en la secuencia o el transgén que está expresándose bajo el control de los diversos promotores descritos en el presente documento.

IX. Utilidad

Los usos y beneficios de los promotores específicos asociados a fruta de plátano descritos en el presente documento incluyen la expresión específica de fruta de genes que pueden alterar o mejorar características de la fruta. De particular interés son el control de la maduración, la modificación del contenido nutricional de la fruta y la expresión de proteínas útiles de una manera específica de fruta.

El promotor de actina de melón descrito en el presente documento es útil para controlar la expresión de marcadores seleccionables y para la expresión constitutiva de genes de interés. Actúa tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas y tiene actividad similar a un promotor viral comúnmente usado, pero es de origen vegetal.

Los promotores de fusión de actina de melón descritos en el presente documento tienen propiedades similares, sin embargo, además han conservado la especificidad de tejido del promotor TRX de plátano.

Los siguientes ejemplos ilustran, pero en ningún modo pretenden limitar el alcance de la presente invención.

Materiales y métodos Construcción de vectores binarios de Agrobacterium y plásmidos de ADN

Los reactivos biológicos se obtuvieron normalmente de los siguientes vendedores: cebador 5' a 3', Boulder, CO: New England Biolabs, Beverly, MA; Gibco/BRL, Gaithersburg, MD; Promega, Madison, WI; Clontech, Palo Alto, CA; y Operon, Alameda, CA.

Los reactivos específicos empleados en el bombardeo de partículas incluyen el sistema biolístico PDS-1000/He de BioRad (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.), partículas de oro de 1,5 - 3,0 \mum (Aldrich, Milwaukee, WI, EE.UU.), un disco de ruptura: 1.100 PSI (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.), tamices de detención de 0,685 de malla (Rumsey-Loomis, Freeville, NY), macroportadores: (Rumsey-Loomis, Freeville, NY) y X-Gluc: sal de 5-bromo-4-cloro-3-indoil-\beta-D-glucurónido-ciclohexilamina (Rose Scientific, Edmonton, Alberta, Canadá).

Se emplearon técnicas de ADN recombinante convencionales en todas las construcciones (Adams y Yang, 1977; Ausubel, et al., 1992; Hooykaas y Schilperoot 1985; Sambrook, et al., 1989; y Maniatis, et al., 1989, todos los cuales se incorporan expresamente como referencia, al presente documento).

Ensayos de indicador de GUS

El equipo específico y los reactivos empleados en el bombardeo de partículas incluyen el sistema biolístico PDS-1000/He de BioRad (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.), partículas de oro de 1,5 - 3,0 \mum (Aldrich, Milwaukee, WI, EE.UU.), un disco de ruptura: 1.100 PSI (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.), tamices de detención de 0,685 de malla (Rumsey-Loomis, Freeville, NY), macroportadores: (Rumsey-Loomis, Freeville, NY) y X-Gluc: sal de 5-bromo-4-cloro-3-indoil-\beta-D-glucurónido-ciclohexilamina (Rose Scientific, Edmonton, Alberta, Canadá).

Las disoluciones para su uso en ensayos de GUS incluyen: glicerol al 50% (v/v); cloruro de calcio 2,5 M (CaCl_{2}, 13,875 gramos de CaCl_{2} anhidro disueltos en 50 ml de H_{2}O destilada estéril); espermidina 0,1 M (0,1452 gramos disueltos en 10 ml de H_{2}O destilada estéril); EtOH al 70% (v/v), 3 ml de H_{2}O destilada estéril en 7 ml de alcohol etílico 200 de la prueba USP; disolución de X-gluc (200 ml preparados añadiendo los componentes en las cantidades mostradas en la tabla 1, a continuación, a 198 ml de H_{2}O destilada, agitando durante 10 minutos o hasta que se disuelva, ajustando el pH a 7,0, disolviendo 100 mg de X-gluc en 2 ml de DMSO, añadiendo disolución de X-gluc/DMSO a la disolución de pH 7,0, enjuagando el vial de X-gluc dos veces usando la disolución de pH 7,0 y esterilizando por filtración la disolución resultante).

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TABLA 1 Disoluciones para el ensayo de GUS

1

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Se preparan suspensiones de partículas de oro añadiendo 30 \mul de partículas de oro (de 1,5 \mum a 3,0 \mum) a un tubo de microcentrífuga de alta calidad seguido de la adición de 1 ml de EtOH al 70%. Se agita con vórtex la suspensión durante 20 segundos y se deja reposar durante 25 minutos, dejando que las partículas se asienten en el fondo del tubo de manera que no se adhieren al lateral del tubo cuando se centrifuga, seguido de centrifugación en una microcentrífuga durante 6 minutos a 13.000 rpm. Se retira con cuidado el sobrenadante, se descarta y se añaden 500 \mul de H_{2}O destilada estéril al tubo que se agita con vórtex durante 10 segundos y se deja en reposo durante 25 minutos adicionales, seguido de centrifugación en una microcentrífuga durante 6 minutos a 13.000 rpm. Se retira con cuidado el sobrenadante, se descarta, se añaden 500 \mul de solución madre de glicerol al 50% estéril y se agita con vórtex la mezcla hasta que se resuspenden las partículas.

Se prepararon disoluciones de ADN que contenían las construcciones de ácido nucleico recombinante de GUS añadiendo 50 \mul (1 \mug/\mul) de ADN a un tubo de microcentrífuga que contenía el oro y agitando con vórtex con cuidado durante 2-3 segundos, seguido de añadir 500 \mul de CaCl_{2} (2,5 M) frío y agitar con vórtex con cuidado durante 2-3 segundos, añadir 200 \mul de espermidina (0,1 M) fría y agitar con vórtex con cuidado a baja velocidad a 4ºC, golpear el tubo un par de veces cada 5-10 minutos para asegurarse de que las partículas permanecen suspendidas, con un tiempo de agitación con vórtex total de aproximadamente 40 minutos. El tubo de centrífuga se pulsó hasta un máximo de 1.500 rpm en una microcentrífuga a 4ºC tres veces, se retiró el sobrenadante y se descartó. Se añadió entonces 1 ml de 70% frío, se mezcló la disolución y se repitió la etapa de centrifugación por pulsos con el sobrenadante retirado y descartado. Esta etapa de centrifugación por pulsos se repitió usando EtOH al 100% frío, seguido de añadir 350 \mul de EtOH al 100% frío y resuspender las partículas agitando con vórtex con cuidado durante 2
segundos.

Se preparó fruta de plátano para el bombardeo de partículas limpiando con una toalla empapada en alcohol etílico al 95%, separando por corte el tallo del pedículo y la punta de la fruta, y colocando en un vaso de precipitados. Se añadió una cantidad de una mezcla de agua/jabón (4 gotas de jabón antimicrobiano/1000 ml de H_{2}O) suficiente para cubrir la fruta y se agitó intermitentemente durante 15 minutos, entonces se enjuagó con H_{2}O destilada, hasta que se eliminó el jabón. Se añadió una cantidad de EtOH al 75% suficiente para cubrir la fruta y se agitó con cuidado cada minuto durante 4 minutos, se extrajo el EtOH y se añadió una cantidad de lejía al 10%/2 gotas de Tween 20/1000 ml suficiente para cubrir la fruta y se agitó intermitentemente durante 10 minutos. Se extrajo la lejía y se enjuagó la fruta 3 veces con H_{2}O destilada estéril, seguido de enjuagar una vez con 500 ml de H_{2}O destilada estéril/2 ml de mezcla PPM (mezcla conservadora de plantas, Plant Cell Technology, Washington, DC), y empapar en medios que consisten en ácido cítrico 200 mg/l y ácido ascórbico 200 mg/l esterilizados por filtración, hasta que esté lista para cortar. Antes del corte, la fruta se secó con papel secante sobre un papel de filtro.

Se usaron generalmente fruta de plátano verde no tratada con gas, fruta de plátano tratada con gas antes de la fase de ablandamiento (no suficientemente amarillo) y fruta de plátano tratado con gas 24 horas tras el tratamiento con gas en los ensayos transitorios. Los tipos de tejido usado incluían trozos longitudinales del exterior de la pulpa de la fruta sin piel (la parte que toca la piel), segmentos del interior de la piel, segmentos del exterior de la piel, trozos en sección transversal incluyendo la piel y trozos longitudinales de la región de la semilla (parte media de la
fruta).

Tras el corte, la fruta se colocó en placas sobre medio PAC1, que contiene: sales MS, vitamina B5, glicina 2 mg/l, sacarosa al 3%, hidrolizado de caseína 100 mg/l, BA 0,5 mg/l, 2,4-D 1,5 mg/l, PPM 5 ml/l, ácido ascórbico 100 mg/l, ácido cítrico 100 mg/l, cefotaxima 200 mg/l (aa) pH 5,8 y Phytagel 0,25.

El ensayo transitorio se basa en el bombardeo de partículas de secciones de tejido vegetal con una suspensión de ADN y partículas de oro tal como se describió anteriormente. El tejido de fruta se bombardeo usando construcciones indicadoras de GUS, una distancia de vuelo de 6 cm y una PSI de 1.100. Se define distancia de vuelo como la distancia entre el microportador recubierto de ADN y el tamiz de detención para las células diana. PSI se refiere a la presión de helio en el tubo de aceleración de gas usado para el bombardeo de partículas. Tras bombardear el tejido de fruta, se selló con parafilm y se dejó en la oscuridad a 24ºC durante 22 horas, entonces se transfirieron con cuidado explantes a placas Petri estériles, limpias y se añadió disolución de X-gluc para cubrir completamente la fruta. Se guardaron las placas en una incubadora a 37ºC durante 18 horas, entonces se extrajo la disolución de X-gluc y se añadió EtOH al 95% para cubrir la fruta. Se realizaron observaciones usando un microscopio y contando el número de focos de GUS en cada trozo de fruta.

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Ejemplo 1

Uso de presentación diferencial para identificar transcritos específicos de plátano

Se realizó la presentación diferencial usando ARN de plátano total de pulpa (PCI 4, madura amarilla), raíz, cormo y hoja de plantas que se hacen crecer en invernadero, y plántulas in vitro (raíz y brote), usando el kit RNAImage número 1 de GenHunter, según el protocolo del proveedor. Kits RNAimage® [n.º de catálogo: G501-G510], GenHunter Corporation, 624 Grassmere Park Drive, Suite 17/Nashville, TN 37211/EE.UU., Tel.: 615-833-0665/Fax: 615-832-9461, genhunt@telalink.net http://www.nashville.net/\simgenhunt/kimage.html].

Se sintetizó ADNc de cadena primaria a partir de 50 \mug de ARN total tratado con ADNasa usando cebadores oligo(dT) anclados a una única base que contienen un sitio de restricción HindIII (H-T_{11}G, SEQ ID NO:15; H-T_{11}A, SEQ ID NO:16; y H-T_{11}C, SEQ ID NO: 17). Entonces se amplificó el ADNc por duplicado en presencia de un nucleótido radiomarcado (en este caso, \gamma-[33P] dATP) y se analizaron los productos resultantes en un gel de poliacrilamida desnaturalizante. Se identificaron productos específicos para un cierto tejido tras la separación y autorradiografía. Tras identificar los productos de amplificación deseados, se recuperaron directamente del gel de acrilamida secado, se volvieron a amplificar con el conjunto de cebadores original, entonces se caracterizaron adicionalmente.

Cuando se usó el cebador anclado a G (H-T_{11}G, SEQ ID NO:15) para las amplificaciones, junto con cebadores arbitrarios, H-AP1 a H-AP8 (SEQ ID NOs:7-14; GenHunter Corp., Nashville, TN), se encontró que varios productos de presentación diferencial amplificados eran únicos para la pulpa y no pudieron detectarse en raíz, cormo, hoja o en tejido de plántula in vitro. Entre estos se encontraba un producto de aproximadamente 400 pb usando el cebador AP1 (G1A, SEQ ID NO:22, GenHunter Corp., Nashville, TN).

Aislamiento de un promotor G1a (TRX) asociado a fruta de plátano

Se recuperaron productos de amplificación asociados con la pulpa de plátano madura a partir de geles de acrilamida, se volvieron a amplificar con el conjunto de cebadores original, y se usaron los productos de presentación diferencial como sondas en transferencias de tipo Northern para confirmar la distribución tisular del transcrito asociado. Los resultados del análisis de transferencia de tipo Northern usando G1A (TRX) como sonda indican que el transcrito nativo es de aproximadamente 600 nucleótidos de longitud y está sumamente asociado a fruta.

Se aislaron en una serie de etapas secuencias en el sentido de 5' asociadas con el producto de presentación diferencial de plátano TRX. Se diseño el primer cebador oligonucleotídico complementario al extremo 5' del fragmento de presentación diferencial y se usó para pasear en el sentido de 5' en una biblioteca genómica de plátano accesible para PCR (kit Universal Genome Walker, n.º de catálogo K1807, Clontech Laboratories, Inc., 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA 94303-4230). Se construyeron bibliotecas genómicas de plátano accesibles para PCR y se examinaron según el protocolo del proveedor, usando las cinco endonucleasas de restricción incluidas en el kit (EcoRV, Sca I, Dra I, Pvu II y Ssp I) y tres cortadores de extremos romos adicionales que se usaron para digerir ADN genómico antes del ligamiento del adaptador: HpaI, MscI y PshAI. Tras dos ciclos de amplificación de las bibliotecas de plátano usando cebadores thrdx 3'R (SEQ ID NO:18) y H-AP1 (SEQ ID NO:7, GenHunter Corp., Nashville, TN) en la reacción primaria y cebadores thrdx3'R (SEQ ID NO:18) y H-AP2 (SEQ ID NO:8, GenHunter Corp., Nashville, TN) en la reacción secundaria, se amplificaron un fragmento de 600 pb (n.º 13) y uno de 620 pb (n.º14) a partir de la biblioteca DraI.

Los fragmentos consistían cada uno en un intrón I parcial, seguido de un exón II e intrón II y un exón III parcial. La secuencia de nucleótidos del exón II y el exón III parcial era idéntica entre fragmentos n.º 13 y n.º 14. Sin embargo, las diferencias de secuencia en los intrones eran evidentes. En el fragmento n.º 13, el tamaño del intrón II pronosticado es de 90 pb, mientras que el tamaño del intrón pronosticado en el fragmento n.º 14 es de 96 pb, debido a una inserción de 6 nucleótidos. Se diseñaron dos cebadores oligonucleotídicos anidados complementarios a la secuencia exacta del intrón I del fragmento n.º 14; trx 3'R-2 (SEQ ID NO: 19) y trx 3'R-3 (SEQ ID NO:20), que contiene un apareamiento erróneo de una única base entre la secuencia del cebador y la secuencia del fragmento n.º
13.

Usando estos dos cebadores específicos de genes para pasear en el sentido de 5' en las bibliotecas accesibles para PCR, se amplificó un fragmento de 1,2 kb a partir de la biblioteca PshAI. El fragmento contenía el resto del intrón I, el exón I completo y la secuencia en el sentido de 5', incluyendo una supuesta caja TATA. La secuencia de nucleótidos de este fragmento de 1,2 kb era idéntica a la secuencia del intrón I del fragmento n.º 14 descrito anterior-
mente.

Se amplificó un producto de 5'RACE de una biblioteca de ADNc accesible para PCR preparada a partir de ARN de pulpa de plátano (PCI 4) (Kit de amplificación de ADNc Marathon, Clontech) usando el cebador thrdx3'R (SEQ ID NO:18). El producto de 300 pb se apareó con la secuencia de los exones en el fragmento de 1,2 kb, que a su vez era contiguo al fragmento n.º 14.

Se diseñaron varios cebadores oligonucleotídicos específicos de genes y se usaron en amplificaciones por PCR para verificar que el fragmento de 1,2 kb y el fragmento n.º 14 eran contiguos a los fragmentos genómicos que codifican para el fragmento de 5'RACE y el producto G1A de presentación diferencial y que el fragmento de ADN contiguo era único en el genoma de plátano (es decir, que representa un único gen).

Se obtuvieron productos sencillos tras RT-PCR y amplificación de ADN genómico con cebadores específicos de genes, y se verificó adicionalmente la identidad de los productos mediante digestiones de restricción.

Se realizó un paseo adicional en el sentido de 5', usando los cebadores TRX14A (SEQ ID NO: 23) y TRX14B (SEQ ID NO: 24) diseñados a partir de la secuencia del fragmento de 1,2 kb contiguo al fragmento n.º 14 original, y se obtuvo un fragmento de 800 pb.

Toda la secuencia de nucleótidos del gen TRX de plátano se muestra en la figura 1 (SEQ ID NO:1), que representa la secuencia de nucleótidos anotada completa, incluyendo la secuencia codificante y el/los intrón/intrones. Los nucleótidos 13 a 990 de SEQ ID NO:1 corresponden al promotor TRX asociado a fruta de plátano de la invención, presentado en el presente documento como SEQ ID NO:2.

Se diseñaron mediante ingeniería genética sitios de restricción en los cebadores usados para amplificar el promotor TRX directamente a partir del ADN genómico de plátano con el fin de clonar la secuencia. Se diseñaron mediante ingeniería genética un sitio BamHI y un sitio NcoI en los cebadores 5' y 3', TRXP-F (SEQ ID NO:25) y TRXP-R (SEQ ID NO:26), respectivamente, con el fin de incorporar sitios de clonaje para su uso en la preparación de construcciones de ácido nucleico recombinante, tal como se describe adicionalmente a continuación.

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Vectores de transformación de plantas y actividad del promotor TRX de plátano usando construcciones indicadoras

Se diseñaron mediante ingeniería genética los sitios de restricción en los cebadores usados para amplificar el promotor TRX directamente a partir del ADN genómico de plátano, para facilitar el clonaje. Se diseñaron mediante ingeniería genética un sitio BamHI y un sitio NcoI en los cebadores 5' y 3', TRXP-F (SEQ ID NO:25) y TRXP-R (SEQ ID NO:26), respectivamente. Se amplificó el promotor TRX a partir de ADN genómico de plátano, se digirió para producir los extremos cohesivos apropiados y se clonó en sitios compatibles en una construcción del gen indicador, compuesto por el promotor fusionado de manera traduccional con GUS (\beta-glucuronidasa) y que contiene el terminador nos. La construcción resultante se denominó pAG159. La secuencia de nucleótidos del promotor TRX, tal como existe en pAG159, se presenta en SEQ ID NO:2 (figura 2). La secuencia del promotor TRX en pAG 159 (figura 2) difiere de la secuencia de nucleótidos ensamblada a partir de amplificaciones genómicas (figura 1) porque se han diseñado mediante ingeniería genética un sitio BamHI (GGATCC) y un sitio NcoI (CCATGG) en los extremos 3' y 5' de la secuencia, respectivamente. El codón de iniciación de la traducción consiste en ATG contenido dentro del sitio NcoI en 3'. Se ha demostrado que la secuencia de la figura 2 (SEQ ID NO:2) codifica para un promotor
funcional.

Se introdujeron individualmente las construcciones de ácido nucleico recombinante pAG159-TRX::GUS,
pAG142a-pel::GUS (2,0 kb), pAG142b-pel::GUS (1,4 kb), pAG142c-pel::GUS (0,9 kb), pAG153-CsVMV::GUS y pBI221-35S::GUS en el tejido de plátano mediante bombardeo de partículas.

Las construcciones pBI221-35S::GUS y pAG153-CsVMV:GUS contienen los promotores de CaMV 35S y
CsVMV, respectivamente, que dirigen la expresión de GUS. Ambos son promotores constitutivos fuertes que sirven como controles positivos para la expresión.

Se determinó la actividad relativa de los promotores asociados a fruta de plátano mediante un sistema de ensayo transitorio usando el gen indicador GUS.

El ensayo transitorio se basa en el bombardeo de partículas de secciones de tejido vegetal con una suspensión de ADN y partículas de oro tal como se describió anteriormente.

Tras bombardear el tejido de fruta, se selló con parafilm y se dejó en la oscuridad a 24ºC durante 22 horas, entonces se transfirieron con cuidado explantes a placas Petri estériles, limpias y se añadió disolución de X-gluc para cubrir completamente la fruta. Se guardaron las placas en una incubadora a 37ºC durante 18 horas, se extrajo la disolución de X-gluc y se añadió EtOH al 95% para cubrir la fruta. Se realizaron observaciones usando un microscopio y contando el número de focos de GUS en cada trozo de fruta. La figura 7 ilustra los resultados de ensayos de indicador de GUS, presentados como el porcentaje de trozos de fruta de plátano con focos de GUS.

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Ejemplo 2

Aislamiento de un promotor PEL asociado a fruta de plátano

Se generó una biblioteca de ADNc usando ARN aislado de pulpa de plátano en maduración. Se extrajo el ARN de plátano total del tejido de pulpa de plátano (PCI 4) usando el protocolo en Clendennen y May, 1997, y se aisló ARN de poli(A)+ a partir de 17 \mug de ARN total tratado con ADNasa usando el kit de sistema de aislamiento de ARNm Straight A's [Novagen, Inc., Madison, Wisconsin]. Se preparó la biblioteca usando el kit de amplificación de ADNc Marathon de Clontech [Clontech Laboratories, Inc.: kit de amplificación de ADNc Marathon, Palo Alto, California 94303-4230], siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, tras la síntesis de ADNc de cadena primaria y secundaria, se ligaron adaptadores a los extremos pulidos del ADNc bicatenario. Esta biblioteca de ADNc sirvió como biblioteca accesible para PCR para la amplificación rápida de extremos 5' ó 3' de ADNc.

Se realizó una reacción de amplificación rápida de extremos 5' de ADNc (5'RACE) con cebadores oligonucleotídicos específicos de adaptor y específicos del gen PEL1 (PEL 3'R-2, SEQ ID NO:27). Se amplificó el extremo 5' del ADNc de PEL1 de plátano usando las condiciones sugeridas por el fabricante para las amplificaciones RACE (Clontech). Se aisló un producto de 5'RACE de aproximadamente 900 pb, se clonó y se secuenció. Se identificó un supuesto sitio de iniciación de la traducción y se diseñaron oligonucleótidos específicos de genes para pasear en el sentido de 5' en una biblioteca genómica de plátano.

Se asiló el promotor asociado a fruta de pectato liasa (PEL) en una serie de etapas. Se preparó una biblioteca genómica accesible para PCR a partir de ADN genómico de plátano usando el kit Universal GenomeWalker de Clontech [Clontech Laboratories, Inc, Palo Alto, California]. Siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante, se usaron cinco enzimas de restricción cortadoras de extremo romos por separado para digerir el ADN genómico de plátano: DraI, EcoRV, PvuII, ScaI y StuI. Una vez purificados, se ligaron los fragmentos de ADN digeridos a los extremos de adaptador suministrados en el kit. Esto sirvió como biblioteca accesible para PCR para la amplificación de la secuencia genómica en el sentido de 5' del codón de iniciación de PEL1.

Se usaron dos oligonucleótidos específicos de genes (PFBAN3'R, SEQ ID NO:28 y PF Pec 3'R, SEQ ID NO:29) en reacciones de cebadores anidados, y se amplificó un supuesto fragmento de promotor de aproximadamente 2,5 kb a partir de la biblioteca genómica de plátano digerida con ScaI. Se clonó el fragmento y se secuenció comple-
tamente.

Se subclonó el fragmento de promotor de 2,5 kb de PEL1 como fusión traduccional con GUS en una construcción génica indicadora. Se modificó mediante ingeniería genética con un sitio PstI en el extremo 5' y un sitio SnaBI en el extremo 3'. Además de someter a ensayo la función promotora del fragmento del promotor PEL1 de 2,5 kb, se generó una serie de deleciones en 5' a partir de la secuencia en el sentido de 5' de PEL1 de 2,5 kb. Se realizaron deleciones de PEL1 mediante restricción del fragmento clonado con enzimas de restricción Sph1 y Spel, dejando intacta una proyección en 5' susceptible a la digestión enzimática mediante exonucleasa III de E. coli [New England Biolabs, Beverly, MA]. Siguiendo un protocolo publicado proporcionado en el kit de deleción Exo-Size de New England BioLab, [New England Biolabs, Beverly, MA], se detuvo la digestión a intervalos de 20 segundos eliminado 2 \mul de la mezcla de ADN/exonucleasa de E. coli a 37ºC. Se transfirieron alícuotas a tubos que contenían nucleasa Mung Bean [New England Biolabs, Beverly, MA] y se incubaron a 37ºC durante 15 minutos. Se eliminó cualquier proyección residual mediante digestión con nucleasa Mung Bean dejando los extremos romos. Entonces se autoligó el fragmento truncado con ADN ligasa de T4 para regenerar un plásmido circular. Se generaron mediante este método fragmentos de promotor PEL1 truncados de 2,0, 1,4 y 0,9 kb en una fusión traduccional con GUS. La secuencia de nucleótidos completa del promotor PEL de 2,0 kb, tal como existe en la construcción indicadora de GUS pAG142a, se muestra en las figuras 5A y B. El extremo 5' de los truncamientos de 1,4 y 0,9 kb también se indica en la figura. La secuencia de promotor PEL de 2,0 kb se presenta en las figuras 3A y B y como SEQ ID NO:3. Los promotores PEL de 1,4 kb y 0,9 kb corresponden a los nucleótidos 564 a 2010 y 1099 a 2010, respectivamente, de la secuencia de promotor PEL de 2,0 kb presentada como SEQ ID NO:3.

Vectores de transformación de plantas y actividad de promotor PEL de plátano usando construcciones indicado- ras

Se generó el fragmento de promotor PEL1 de 2,5 kb, descrito anteriormente, se truncó como fragmentos de promotor PEL1 de 2,0, 1,4 y 0,9 kb, se digirió para producir los extremos cohesivos apropiados y se clonó en sitios compatibles en una construcción génica indicadora, compuesta por el promotor fusionado de manera traduccional con GUS (\beta-glucuronidasa) y que contiene el terminador nos. Las construcciones resultantes que comprenden los fragmentos del promotor PEL1 de 2,0, 1,4 y 0,9 kb de denominaron pAG142a-pel::GUS (2,0 kb), pAG142b-pel::GUS (1,4 kb) y pAG142c-pel::GUS (0,9 kb), respectivamente. Los fragmentos de PEL1 (2,0, 1,4 y 0,9 kb) corresponden a los nucleótidos 1 a 2010, 564 a 2010 y 1099 a 2010, respectivamente, de SEQ ID NO:3.

Se preparó fruta de plátano para el bombardeo de partículas tal como se describió anteriormente. Se introdujeron individualmente las construcciones de ácido nucleico recombinante pAG142-pel::GUS (2,5 kb); pAG142a-pel::GUS (2,0 kb), pAG142b-pel::GUS (1,4 kb), pAG142c-pel::GUS (0,9 kb), pAG153-CsVMV::GUS, pAG159-TRX::GUS y pBI221-35S::GUS en tejido de plátano mediante bombardeo de partículas. Se determinó la actividad relativa del promotor asociado a fruta de plátano en las diversas construcciones mediante ensayo transitorio basado en la expresión del indicador de GUS. La figura 7 ilustra los resultados de los ensayos de indicador de GUS, presentados como el porcentaje de trozos de fruta de plátano con focos de GUS.

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Ejemplo 3

Aislamiento y caracterización de un promotor de actina de melón

Se seleccionaron varias secuencias de nucleótidos de actina de plantas a partir de GenBank incluyendo las encontradas con los números de registro de GenBank: D88414, algodón: D78206, gloria de la mañana: AB002819, menta; X67666, guisante: U60483, patata; U60496, soja: U60489, tabaco y U60478, tomate, se alinearon usando el programa Clustal-W con parámetros por defecto y se conservaron las regiones dentro de la secuencia codificante identificada. Se sintetizaron cebadores oligonucleotídicos complementarios a las regiones conservadas y se usaron para amplificar fragmentos de actina a partir tanto de moldes ADN genómico (genADN) como ADNc de plantas. Los cebadores, ACTIN 5'F (SEQ ID NO:30) y ACTIN 3'R (SEQ ID NO:31) abarcan el intrón 3, que se produce en el extremo 5' del producto de PCR resultante, y han amplificado de manera eficaz moldes de ADNgen y ADNc de muchas monocotiledóneas y dicotiledóneas diferentes, incluyendo manzana, plátano, cereza, uva, lechuga, maíz, melón, guisante, frambuesa, tabaco y tomate.

En el melón, el fragmento de PCR genómico era ligeramente más grande que el correspondiente producto de RT-PCR, lo que concuerda con la presencia de un intrón pequeño en el fragmento genómico. Se secuenciaron los fragmentos de RT-PCR y genómicos de melón y se determinó que las secuencias eran idénticas excepto por la presencia de un único intrón, correspondiente a un intrón designado anteriormente "intrón 3". En el melón, el intrón tiene 87 nt de longitud y no se conserva entre el melón y otras especies vegetales.

Usando tanto las secuencias codificantes como la de intrón, se sintetizaron oligonucleótidos anidados complementarios que amplifican un fragmento en el sentido de 5' de la secuencia que codifica para actina de melón. Los cebadores amplificaron un fragmento de 1,6 kb de la biblioteca detectora de promotor DraI de melón. Se clonó y se secuenció el fragmento. El fragmento genómico de actina de melón contiene aproximadamente 540 pb de la secuencia flanqueante en 5' en el sentido de 5' del sitio de iniciación de la traducción y 1 kb de la secuencia transcrita, que contiene los exones 1, 2 y una pequeña parte de 3, y los intrones 1 y 2. Se estimó el sitio de iniciación de la traducción amplificando y secuenciando un fragmento de 5'RACE del transcrito de actina a partir de ADNc de melón. También se han identificado elementos en sentido 5' con homología con motivos funcionales caracterizados en otros promotores de actina de plantas.

Los cebadores oligonucleotídicos usados para amplificar un fragmento de gen de actina de melón que contiene regiones reguladoras en el sentido de 5' incluían PF1 (SEQ ID NO:32), PF2 (SEQ ID NO:33), Actin PFb (SEQ ID NO:34), Actin PFc (SEQ ID NO:35) y MACTP int1 (SEQ ID NO:36).

La secuencia de nucleótidos completa del promotor de actina de melón, hasta e incluyendo el sitio de iniciación de la traducción, se presenta en la figura 4. El sitio de iniciación de la transcripción, tal como se estimó mediante la caracterización de productos de 5'RACE, se indica como + 1 en la secuencia, colocando la supuesta caja TATA en -47. Las características indicadas como subrayadas en la figura 4 incluyen la supuesta caja TATA en -47, los nucleótidos -251 a -205 en el promotor de actina de melón que es una región rica en A similar a la región de poli(dA-dT) identificada entre las posiciones de nt -190 y -140 en el promotor de actina de arroz. Se mostró que poli(dA-dT) de actina de arroz actuaba como una región reguladora positiva fuerte para la expresión constitutiva (Wang et al., 1992). Los nucleótidos -185 a -146 constituyen una región similar a la región entre -150 y la caja TATA en las secuencias flanqueantes en 5' ACT2 y ACT8 de Arabidopsis (An et al., 1996). Esta región está sumamente conservada entre los dos miembros de la familia de genes de actina de Arabidopsis y puede indicar la posición de elementos funcionales. La región subrayada de nucleótidos -119 a -96 indica una corta repetición directa [4X(GCATTT)], un motivo de secuencia que está presente dentro de un ORF de Sacchromyces cerevisiae y en regiones no codificantes de los genomas de Drosophila melanogaster y Arabidopsis thaliana. El motivo (-84 a -51) es una región que contiene una repetición de dinucleótidos [18X(CT)], motivo que también está presente en la región flanqueante en 5' del gen Ac7 de soja. Las repeticiones (-119 a -96) y (-84 a -51) tienen una función desconoci-
da.

La secuencia de promotor de actina de melón muestra similitudes con promotores de actina constitutivos fuertes tanto de arroz (monocotiledónea modelo) como de Arabidopsis (dicotiledónea modelo) y también con la secuencia flanqueante en 5' del gen de actina Ac7 de soja. El promotor de actina de melón no contiene el supuesto elemento de expresión asociado a la raíz (repetición CCCAA) presente en el promotor de actina de arroz y también contiene motivos de secuencia únicos. Las similitudes en el nivel de la secuencia de nucleótidos se resumen en la tabla 2, que presenta la distribución de motivos de secuencia en los promotores de actina constitutivos de arroz (monocotiledónea), Arabidopsis y soja (dicotiledónea) en comparación con el promotor de actina de melón. La posición aproximada del motivo de secuencia, si está presente, se indica con respecto al sitio de iniciación de la transcrip-
ción.

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TABLA 2 Motivos de secuencia de promotor de actina

2

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Actividad promotora de mACTIN

Se subclonó el fragmento de actina de melón amplificado a partir de ADN genómico hasta el sitio de iniciación de la traducción ("mACTIN") para someter a prueba su capacidad para promover la expresión de genes heterólogos operativamente unidos. La construcción pAG167 contiene el fragmento genómico en el sentido de 5' de actina de melón de longitud completa (1,5 kb) clonado como fusión traduccional con el gen indicador uidA que codifica para GUS. La construcción del gen indicador de GUS pAG167 está contenido en un vector pUC. La construcción pAG4015 contiene el promotor de actina de melón de longitud completa operativamente unido (como fusión traduccional) con el gen indicador que codifica para GUS, junto con un casete de selección compuesto por el promotor de CsVMV que controla la expresión del gen nptII y confiere resistencia a kanamicina. Esta construcción está contenida dentro del vector binario pPZP2000.

Vectores de transformación de plantas y actividad de promotor de actina de melón usando construcciones indicado- ras Plátano

Se sometió a prueba la actividad promotora de mACTIN en células embrionarias de plátano en suspensión usando la construcción designada "pAG 167" (mACTIN-GUS). Se realizaron ensayos en el Boyce Thompson Institute for Plant Research BTI (Ithaca, NY), en los que se usó pAG167 para bombardear las células embrionarias de plátano en suspensión y se midió la actividad de GUS relativa en extractos de proteína a partir de tejido bombardeado tal como se describe a continuación. Los resultados de estos ensayos indicaron que el nivel de GUS mediante pAG167 era comparable al del control CaMV35S.

Nicole Higgs proporcionó dos células embrionarias en suspensión GN de 7 días de edad (Musa acuminata cv Grand Nain; ES23 y ES35). Se combinaron las suspensiones celulares y se filtraron a través de un tamiz grueso y se diluyeron hasta un volumen de células empaquetadas:volumen de líquido de aproximadamente 1:6. Se dispersó un volumen de 400 \mul de células resuspendidas sobre discos de filtro Whatman en medios sólidos y se almacenaron durante dos días en condiciones de crecimiento convencionales (total: 66 placas). Los plásmidos de prueba usados para el bombardeo incluían pAG167 (mACTIN-GUS) y los plásmidos control incluían pCaMV35S-GUS y pmaizeUbi-GUS, que contienen el gen uidA que codifica para GUS bajo el control transcripcional del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor y el promotor de ubiquitina de maíz, respectivamente. Para los bombardeos, se recubrieron partículas de oro con 2 \mug de ADN de plásmido puro de QIAGEN de cada construcción de prueba. Se bombardearon seis placas de células GN (10 \mul de mezcla Au:ADN, 800 psi) por construcción. Se mantuvieron aparte seis placas de GN como controles negativos no bombardeados. Dos días tras el bombardeo, se sometió a ensayo de manera histoquímica una placa por construcción para detectar la actividad GUS (X-gluc). Tres días tras el bombardeo, se extrajo la proteína total de las 5 placas restantes por construcción (total: 55 placas). Se estimó la concentración de proteínas para cada extracto usando el ensayo Bradford y se usaron 50 \mug de proteína total para ensayos fluorométricos de GUS (4-MU) que permiten comparaciones cuantitativas directas de la actividad promotora. Se midió la fluorescencia usando un instrumento Fluorolite 1000 de Dynex Technologies (valor de ref. 3: 1770, voltaje de la lámpara 6,9). Los resultados se muestran en la tabla 3 como unidades de señal fluorescente promedio y la desviación estándar. Los resultados de la tinción de GUS se correlacionaban bien con los ensayos fluorométricos, es decir, sólo pAG167 demostró expresión de GUS significativa en comparación con los controles ubi y
CaMV35S.

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TABLA 3 Actividad GUS en células embrionarias de plátano en suspensión

3

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Métodos con Allium y resultados

Además, se sometió a ensayo el promotor mACTIN para detectar la actividad promotora en Allium spp. (ajo, Allium sativum y cebolla, Allium cepa). El bombardeo de tejidos diana de cebolla y ajo con diversas construcciones indicadoras se siguió mediante tinción histoquímica de GUS.

Se usaron variedades comerciales locales de ajo y cebolla como tejidos diana para los estudios de expresión génica. Con el fin de preparar tejidos para el bombardeo de partículas, se eliminaron las pieles exteriores secas de los bulbos de cebolla y los dientes de ajo. Se esterilizaron en la superficie mediante un protocolo de esterilización modificado usando etanol y lejía, en el que se pela el ajo o la cebolla, se limpia con una toalla empapada en alcohol etílico al 95%, se coloca en un vaso de precipitados al que se le añade una cantidad de mezcla de agua/jabón suficiente para cubrir las muestras, se agita intermitentemente durante 10 minutos, entonces se enjuaga con H_{2}O destilada hasta que se elimina el jabón. Entonces se añade EtOH al 75% para cubrir la muestra de ajo o cebolla que se agita con cuidado cada minuto durante 4 minutos, entonces se extrae el EtOH seguido de la adición de suficiente lejía al 10%/2 gotas de Tween 20/1000 ml para cubrir las muestras seguido de agitación intermitente durante 10 minutos. Se extrajo entonces la lejía, se enjuagaron las muestras 3 veces con H_{2}O destilada estéril y una vez con 500 ml de H_{2}O destilada estéril/2 ml de mezcla PPM (mezcla conservadora de plantas, Plant Cell Technology, Washington, DC). Se cortaron las muestras y se bombardearon en el mismo día.

El procedimiento de esterilización específico para hojas in vivo de cebolleta incluía las etapas de agitar las hojas con cuidado en EtOH al 70% durante 30 segundos, extraer el EtOH, agitar las hojas con cuidado en lejía al 10% con Tween20 durante 1 minuto, extraer la lejía, enjuagar 3 veces con agua estéril y enjuagar 1 vez con 2 ml de PPM en 500 ml de agua estéril. A esto le seguía cortar las hojas en segmentos y colocarlos en placa con el lado abaxial hacia arriba (el lado exterior hacia arriba) en medio PAC 1. Se cortaron las muestras y se bombardearon en el mismo
día.

Tras cortar, se colocaron en placa las muestras de ajo o cebolla en medio PAC 1 que contiene: sales MS, vitaminas B5, glicina 2 mg/l, sacarosa al 3%, hidrolizado de caseína 100 mg/l, BA 0,5 mg/l, 2,4-D 1,5 mg/l, PPM 5 ml/l, ácido ascórbico 100 mg/l, ácido cítrico 100 mg/l, cefotaxima 200 mg/l (aa) pH 5,8 y Phytagel 0,25.

Los tipos de tejido de ajo sometidos a prueba incluían: (1) el exterior de un diente de ajo, cortado por la mitad de manera longitudinal; (2) una trozo en sección transversal del diente; y (3) el interior de un diente de ajo, cortado por la mitad de manera longitudinal. Se bombardearon 14-22 piezas de ajo para cada construcción sometida a prueba excepto pAG167 (mACTIN) para el que sólo se bombardearon 6 piezas.

Los tipos de tejido de cebolla sometidos a prueba incluían: (1) el exterior de los anillos del bulbo de una cebolla blanca grande; (2) el interior de los anillos del bulbo de una cebolla blanca grande; (3) un trozo en sección transversal del bulbo de una cebolla blanca grande; (4) el exterior del bulbo de cebolleta, cortado por la mitad de manera longitudinal; (5) el interior del bulbo de cebolleta, cortado por la mitad de manera longitudinal; (6) un trozo en sección transversal de un bulbo de cebolleta; (7) segmentos de hojas adaxiales (interiores) de cebolleta y (8) segmentos de hojas abaxiales (exteriores) de cebolleta. Se bombardearon 14-20 piezas de cebolla para todas las construcciones excepto pAG 167 (mACTIN) para el que sólo se bombardearon 4 piezas.

Se llevó a cabo el bombardeo de partículas usando una pistola de microproyectiles PDS 1000/He (Bio-Rad) y partículas de oro, tal como se describió anteriormente para el plátano. Se evaluaron cuatro construcciones de plásmido diferentes que contenían el gen GUS bajo el control transcripcional de diversos promotores incluyendo: pAG138m-RE4::GUS, pAG147-GUS sin promotor (que contiene el gen GUS sin elementos reguladores y sirve como control negativo), pAG153-CsVMV::GUS (que contiene el promotor de CsVMV y sirve como control positivo), pAG167-mACTIN::GUS y PBI221-35S::GUS (que contiene el promotor de CaMV y sirve como control positivo). (Véase el ejemplo 3).

Tras el bombardeo y la incubación en la oscuridad, se trataron las muestras con disolución de X-gluc a 37ºC durante 18 horas. Se puntuaron los focos de GUS azules usando un microscopio invertido. El resumen de resultados del bombardeo de tejidos de ajo y cebolla se presenta en las figuras 8A y B, respectivamente. Se observaron focos azules en todos los tejidos tratados con X-gluc excepto en el control negativo bombardeado con GUS sin promotor. Pudieron puntuarse fácilmente los focos azules en el exterior del diente de ajo y el bulbo de cebolla (anillos de cebolla). El problema del azul intrínseco descrito anteriormente con respecto a la especie Allium (Barandiaran et al., 1998) no planteó un problema en la investigación. Sin embargo, los focos azules debidos a la expresión de GUS eran claramente diferentes del tono azul circundante, tal como puede observarse en las figuras 9A-D y las figuras 10A-D para resultados de ensayos de GUS a modo de ejemplo con promotores control en ajo y cebolla, respectiva-
mente.

En el ajo, el control negativo (GUS sin promotor) no mostró ningún foco, mientras que todos los otros promotores sometidos a prueba si lo hicieron (figura 8A). El tejido bombardeado con una construcción que comprende GUS bajo el control del promotor mACTIN mostró el porcentaje más alto de trozos con focos de GUS (100%). El tejido bombardeado con una construcción que comprende GUS bajo el control de los promotores de CsVMV, de CaMV35S y de RE4 mostró el 86%, 68% y 31% de trozos con focos, respectivamente.

En la cebolla, el control negativo (GUS sin promotor) no mostró ningún foco en bulbos de cebolla u hojas de cebolleta, mientras que todos los otros promotores sometidos a prueba si lo hicieron (figura 8B). El tejido bombardeado con una construcción que comprende GUS bajo el control del promotor mACTIN mostró el porcentaje más alto de trozos con focos (100%), basándose en el número de muestras sometidas a prueba. El promotor de CaMV35S control positivo mostró el 90% de trozos con focos, seguido de CsVMV con el 88% y RE4 con el 81% de trozos con
focos.

El bombardeo de segmentos de hojas de cebolleta dio como resultado el 100% de segmentos con focos de GUS para los promotores tanto mACTIN como CaMV35S, el 93% de segmentos con focos de GUS para el promotor de CsVMV y el 31% de segmentos con focos de GUS para el promotor de RE4 (figura 8B).

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En resumen, pAG153 (CsVMV) y pAG167 (mACTIN) demostraron una expresión más fuerte de GUS que el promotor de CaMV 35S (pBI221) en dientes de ajo y bulbos de cebolla. En hojas de cebolleta, la expresión de GUS bajo el control de pAG153 (CsVMV) y pAG167 (mACTIN) era similar a la del promotor de CaMV 35S
(pBI221).

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Transformación estable de Arabidopsis

También se sometió a prueba el promotor mACTIN para detectar la actividad en una dicotiledónea modelo (Arabidopsis thaliana) tras la transformación con una construcción de ácido nucleico que contiene el gen indicador que codifica para GUS bajo el control del promotor mACTIN. La construcción pAG4015 contiene dos casetes de expresión: adyacente al límite izquierdo del ADN-T se encuentra el casete de selección que contiene el gen nptII que confiere resistencia a kanamicina bajo el control del promotor de CsVMV y el terminador G7; y adyacente al límite derecho del ADN-T se encuentra el gen indicador de GUS bajo el control del promotor mACTIN y el terminador
nos.

Se hicieron crecer plantas de Arabidopsis thaliana (ecotipo Col-0) en suelo en condiciones de día largo (16 h de luz). Se recortaron las inflorescencias primarias de las plantas para fomentar el crecimiento de inflorescencia lateral, y se transformaron las plantas 6 días tras el recorte. Se transformó la cepa GV3101 de Agrobacterium que contenía el plásmido auxiliar pMP90RK con pAG4015 mediante electroporación. Se transformaron las plantas siguiendo el método de transformación in planta descrito por Clough y Bent, Plant Journal 16:735-743, 1998. En resumen, se hizo crecer el cultivo de Agrobacterium que contenía pAG4015 hasta una DO_{600} de 1,5 a 2,5. Se recogieron las células mediante centrifugación y se resuspendieron hasta una DO_{600} de aproximadamente 0,80 en medios de inmersión que contenían sacarosa al 5%, Silwet L-77 al 0,04%, MgCl 10 mM y 6-bencilaminopurina 44 nM. Se invirtieron las plantas en la suspensión celular durante 15 minutos, entonces se colocaron las plantas sobre sus lados bajo una campana durante 16-24 horas para mantener alta la humedad. Se hicieron crecer las plantas durante 5 semanas hasta que las silicuas fueron marrones y estaban secas. Se recogió la semilla T1 de las plantas, se esterilizó en la superficie y se hizo germinar en placas que contenían medio 1/2MS, agar al 0,7% y monosulfato de kanamicina 50 \mug/ml. Se identificaron plantas de semillero transformadas como las resistentes al monosulfato de kanamicina. Se realizó la tinción histoquímica para detectar la actividad de GUS en los transformantes a diferentes fases de desarrollo. Se sometieron a ensayo plantas de semillero tras la formación de las dos primeras hojas verdaderas (10 días). También se tiñeron plantas tras la formación de la roseta (6 a 8 hojas) y tras el florecimiento (aproximadamente 4 semanas). Para la tinción, se colocaron plantas en 1 ml de X-gluc (EDTA 10 mM, sal de disodio; NaH_{2}PO_{4}\cdot3H_{2}O 100 mM; K_{4}Fe(CN_{6})\cdot3H_{2}O 0,5 mM; Triton X-100 al 0,1%; x-gluc al 0,05%; DMSO al 1%) y se incubaron a 37ºC durante 18-24 horas. Tras la incubación, se enjuagaron las plantas 3 veces con EtOH al 95% hasta que se aclaró la tinción residual y los pigmentos vegetales, y entonces se fotografió el tejido
teñido.

Los resultados de la tinción para detectar la actividad del gen indicador de GUS en Arabidopsis transformada de manera estable con la construcción pAG4015, presentados en las figuras 11A-D indican que el promotor mACTIN dirige la expresión del gen indicador fuerte en plantas de semillero tal como se determina mediante tinción histoquímica, con tinción de GUS especialmente evidente en raíces (figura 11B). Tras la formación de la roseta, era evidente una tinción azul más intensa en los cotiledones, las hojas verdaderas tempranas y las raíces que en las hojas en desarrollo tardío (figura 11C). En hojas maduras, el promotor mACTIN también es activo, con tinción histoquímica fuerte en las hojas así como en las flores (figura 11D).

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Ejemplo 4

Construcción de promotores de fusión actina de melón/TRX modificados

Se construyeron dos formas modificadas del promotor TRX específico de fruta de plátano (1) añadiendo un intrón de monocotiledónea al extremo 3' del promotor TRX de plátano y (2) fusionando el promotor TRX de plátano con el promotor de actina de melón en la caja TATA.

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Promotor TRX con intrón de monocotiledónea añadido

La primera modificación del promotor TRX implicaba la adición de un fragmento de ADN que contenía el intrón 3 del gen O2 de maíz al sitio NcoI diseñado mediante ingeniería genética en el extremo 3' del promotor TRX específico de fruta de plátano. Se obtuvo la secuencia de nucleótidos completa del gen O2 de maíz a partir del número de registro de GenBank X15544, en la que el intrón 3 está entre los nucleótidos 3020 a 3105. El intrón 3 de O2 de maíz es un intrón de monocotiledónea típico: es corto, sólo 83 nt; rico en A+U (60%); y contiene sitios de corte y empalme de secuencia consenso apropiados. Se diseñaron oligonucleótidos para amplificar el intrón 3 de O2 de maíz y entonces subclonarlo en el sitio NcoI en el extremo 3' del promotor TRX. Los cebadores oligonucleotídicos usados para amplificar el intrón de O2 de maíz se enumeran a continuación. Se clonó el producto de amplificación que contenía el intrón de O2 en un vector intermedio, se secuenció para confirmar su identidad, entonces se subclonó en la orientación correcta en el sitio NcoI diseñado mediante ingeniería genética en el extremo 3' del promotor TRX. Tras la adición del intrón, existen dos posibles codones de iniciación ATG asociados con cualquier gen unido, uno en cada extremo del intrón. La construcción se diseñó de manera que si el intrón de O2 añadido se somete a corte y empalme de manera apropiada, el ATG en el sentido de 5' en el transcrito resultante está en marco con el ATG en el sentido de 3'. En tales casos, si la traducción se inicia a partir del ATG en el sentido de 5', la proteína de fusión resultante contendrá cuatro aminoácidos adicionales (MEKA) en el extremo N-terminal. Si el intrón no se somete a corte y empalme de manera apropiada, el ATG en el sentido de 5' no estará en marco con el gen unido, pero la traducción puede iniciarse todavía a partir del ATG en el sentido de 3'. En este caso, la proteína resultante no contendrá ningún aminoácido adicional. El promotor TRX modificado con el intrón de O2 fusionado al gen indicador de GUS se designó pAG759. La secuencia de nucleótidos completa del promotor de fusión TRX-intrón de O2 aparece en las figuras 5A-B (SEQ ID
NO:5).

Los oligonucleótidos O2intF (SEQ ID NO:37) y O2intR (SEQ ID NO:38) usados para amplificar el intrón 3 del gen O2 de maíz para el subclonaje en el sitio NcoI en el extremo 3' del promotor TRX de plátano se presentan a continuación con el sitio NcoI diseñado mediante ingeniería genética en la secuencia para el subclonaje indicada como subrayada en la tabla 5.

En una modificación separada para el promotor TRX específico de fruta, se fusionó el promotor TRX de plátano promotor con el promotor de actina de melón en la caja TATA, dando como resultado un promotor de fusión que tiene la secuencia presentada como SEQ ID NO:6. Ambos promotores contenían una caja TATA (TATAAA) de planta canónica, idéntica que se usó para realizar una fusión perfecta entre los mismos en ese sitio. Se diseñaron cebadores oligonucleotídicos quiméricos (mostrados a continuación) que eran complementarios a ambas de las secuencias promotoras. Se amplificó un fragmento que contenía el promotor TRX de plátano desde el extremo 5' hasta la caja TATA a partir de pAG159 usando 1233 (SEQ ID NO:42) y (Act)TRX_R (SEQ ID NO:40). El producto era de aproximadamente 0,8 kb. Se amplificó el fragmento de actina de melón para su fusión con el fragmento de promotor Thi a partir de pAG167 usando GUS5'R (SEQ ID NO:41) y (TRX)Act_F (SEQ ID NO:39) y un ciclador térmico PE480: 25 ciclos (94ºC, 30 segundos; 60ºC, 30 segundos; 72ºC, 90 segundos), 1 ciclo (72ºC, 10 min.). El fragmento de 1,2 kb del promotor de actina de melón contenía el sitio de iniciación de la transcripción, el intrón de la región no traducida en 5' y el sitio de iniciación de la traducción que se había modificado mediante ingeniería genética para que contuviera un sitio NcoI para facilitar el subclonaje de genes unidos. Los fragmentos contenían una región solapante complementaria de 21 nucleótidos, incluyendo la caja TATA. Los dos fragmentos se fusionaron combinándolos en una segunda reacción de amplificación y usando los cebadores terminales (1233 y GUS5'R) para la amplificación y un ciclador térmico PE480: 25 ciclos (94ºC, 30 segundos; 60ºC, 30 segundos; 72ºC, 150 segundos), 1 ciclo (72ºC durante 10 min.). Se separaron los productos de reacción resultantes en un gel de agarosa, y el fragmento del tamaño pronosticado correcto se purificó en gel, se digirió con HinDIII y NcoI, se ligó en un vector que contenía el gen indicador de GUS y se le dio la designación pAG749.

Los cebadores oligonucleotídicos usados para amplificar y ensamblar el promotor de fusión TRX-actina de melón incluían (TRX)Act_F (SEQ ID NO:39), (Act)TRX_R (SEQ ID NO:40), GUS5'R (SEQ ID NO:41) y 1233 (SEQ ID NO:42).

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Vectores de transformación de plantas y actividad de promotor de fusión de actina de melón/TRX usando construcciones indicadores

Se clonaron los promotores TRX modificados en construcciones de expresión (como fusión traduccional) con el gen indicador que codifica para GUS, dando como resultado construcciones designadas pAG749 (TRX-actina::GUS) y pAG759 (TRX-intrón::GUS). Se sometieron a prueba los promotores TRX modificados para detectar la expresión de GUS en el ensayo de expresión transitoria de trozos de fruta de plátano descrito anteriormente.

Las muestras usadas fueron o bien fruta verde, no tratada con etileno (verde), fruta verde pero en el plazo de 24 h de tratamiento con etileno (PCI 1), fruta amarilla con puntas verdes (PCI 4) o bien hoja. La actividad relativa de los promotores de fusión asociados a fruta TRX-intrón, TRX-actina y el promotor viral de CsVMV en para promover la expresión de GUS se expresa tanto como en porcentaje de trozos fruta que muestran focos tras la tinción histoquímica (figura 12A) como en número medio de focos por trozo de fruta (figura 12B), en trozos de fruta de plátano. El promotor de CsVMV constitutivo fuerte se usó como control positivo.

Según los resultados de expresión transitoria para los promotores TRX modificados, las modificaciones TRX-intrón y TRX-actina tienen rendimiento mejorado con respecto al promotor TRX específico de fruta de plátano.

En particular, el promotor de fusión TRX-actina presenta actividad de expresión transitoria aproximadamente igual al promotor de CsVMV constitutivo fuerte, mientras que la fusión TRX-intrón es ligeramente menos activa en promedio. Además, los promotores TRX-intrón y TRX-actina tienen actividad inferior en hojas de plátano, lo que indica que los promotores han conservado la especificidad de tejido del promotor TRX.

TABLA 4 Construcciones de ácido nucleico que contienen el promotor de actina de melón y plátano

4

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TABLA 5 Secuencias proporcionadas en apoyo de la invención

5

6

7

<110> Agritope, Inc.

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<120> Promotores de plátano y melón para la expresión de transgenes en plantas

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<130> 4257-0019.41

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<140> Aún no asignado

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<141> Presentado con el mismo documento

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<150> US 60/125.310

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<151> 19/03/1999

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<160> 42

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<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

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<210> 1

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<211> 2453

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<212> ADN

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<213> Plátano

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)...(2453)

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<223> n = A,T,C o G

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<400> 1

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

8

\hskip0,8cm

80

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<210> 2

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<211> 979

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Promotor TRX

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\hskip0,8cm

9

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<210> 3

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<211> 2010

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Promotor PEL1 de 2,0 kb

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip0,8cm

10

\hskip0,8cm

11

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<210> 4

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<211> 1541

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> promotor de actina de melón

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip0,8cm

12

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<210> 5

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<211> 1074

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> promotor

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip0,8cm

13

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<210> 6

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<211> 1925

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> promotor

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\hskip0,8cm

14

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> cebador oligonucleotídico

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

15

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 13

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

18

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

50

Claims (19)

1. Molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

la secuencia presentada como SEQ ID NO:4; y

(b)

secuencias que son al menos un 90% idénticas a la secuencia de SEQ ID NO:4 y que se caracterizan por la expresión constitutiva de un gen al que dichas secuencias están operativamente unidas.

2. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que la secuencia de (b) tiene actividad promotora en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas.

3. Promotor híbrido que comprende, en dirección de 5' a 3': un primer segmento de nucleótidos que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

la secuencia presentada como SEQ ID NO:2;

(b)

secuencias que son al menos un 90% idénticas a la secuencia de SEQ ID NO:2 y que se caracterizan por la expresión asociada a frutas, regulada por etileno de un gen al que dicha secuencia está operativamente unida; y

(c)

la secuencia promotora de un gen cuya secuencia es al menos un 70% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO:1

hasta e incluyendo la caja TATA fusionada a un segundo segmento de nucleótidos que comprende al menos una parte de la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 que está en 3' con respecto a la caja TATA.

4. Promotor híbrido según la reivindicación 3, que comprende la secuencia de ácido nucleico presentada como SEQ ID NO:6.

5. Vector de expresión de plantas que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2 o el promotor híbrido según la reivindicación 3 ó 4.

6. Vector de expresión de plantas según la reivindicación 5, en el que dicha molécula de ácido nucleico o dicho promotor híbrido están operativamente unidos a un gen.

7. Vector de expresión de plantas según la reivindicación 6, en el que el gen es heterólogo con respecto al promotor.

8. Vector de expresión de plantas según la reivindicación 6 ó 7, en el que el gen codifica para un marcador seleccionable.

9. Vector de expresión de plantas según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que dicho gen está operativamente unido a secuencias control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.

10. Célula vegetal que comprende el vector de expresión de plantas según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9.

11. Célula vegetal según la reivindicación 10, que es dicotiledónea o monocotiledónea.

12. Método para producir una planta transgénica, que comprende: introducir en una célula vegetal el vector de expresión de plantas según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 y hacer crecer la célula vegetal transformada para producir una planta transgénica.

13. Método de expresión transitoria para evaluar la expresión de promotores en tejido vegetal, que comprende:

(i)

ensamblar una construcción de ácido nucleico que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2 o el promotor híbrido según la reivindicación 3 ó 4 operativamente unidos a un gen;

(ii)

preparar tejido vegetal para la transformación;

(iii)

introducir la construcción de ácido nucleico en el tejido vegetal preparado;

(iv)

cultivar el tejido vegetal en condiciones eficaces y durante un tiempo suficiente para dar como resultado la expresión detectable del gen; y

(v)

detectar la expresión del gen.

14. Método según la reivindicación 13, en el que dicha preparación significa esterilizar y cortar el tejido vegetal.

15. Método según la reivindicación 13 ó 14, en el que dicha introducción es mediante bombardeo de partículas de un tejido vegetal con una suspensión de ADN y partículas de oro.

16. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que dicho tejido vegetal es dicotiledóneo o monocotiledóneo.

17. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que dicho tejido vegetal se selecciona del grupo que consiste en ajo, cebolla y trozos de plátano.

18. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en el que el gen codifica para un marcador seleccionable.

19. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en el que dicho gen es \beta-glucuronidasa (GUS) y la detección es por medios visuales.