MXPA00011156A

MXPA00011156A - Promotor de genes de plantas, y metodos para usar el mismo

Info

Publication number: MXPA00011156A
Application number: MXPA/A/2000/011156A
Authority: MX
Inventors: Misra Santosh
Original assignee: University Of Victoria Innovation And Development Corporation
Priority date: 2000-08-18
Filing date: 2000-11-13
Publication date: 2002-07-25

Abstract

La invención provee promotores provenientes de genes del abeto Douglas que codifican para proteínas del tipo metalotioneínas;también se proveen deleciones y variantes de tales promotores;entre otras cosas los promotores sonútiles para dirigir la expresión de transgenes específica de desarrollo.

Description

PROMOTOR DE GENES DE PLANTAS, Y MÉTODOS PARA USAR EL MISMO CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a un promotor aislado de genes de plantas, y a métodos para usar dicho promotor. Más específicamente, el promotor se obtuvo de un gen que codifica para una proteína tipo metalotioneína.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Genes similares a metalotioneína y sus patrones de expresión Los genes que codifican para proteínas similares a metalotioneína (es decir, "genes similares a metalotioneína" o "genes similares a MT"), pueden ser agrupados en dos clases con base en el patrón de distribución de cisteína dentro de sus productos de traducción predichos (Robinson et al., Biochem. J. 295:1-10, 1993). Las proteínas similares a MT clase I contienen dos dominios ricos en cisteína, como se encuentran en metalotioneínas de animales, y las proteínas similares a MT clase II incluyen un dominio adicional rico en cisteína dentro de la proteína. Las proteínas similares a MT clase I se clasifican además en tres tipos (tipos 1 a 3) distinguidos por las características de sus dominios que contienen cisteína. ttaMMÉ__MaMaa_M_HMMa?^^^_MMÍtfÍM^ Cada tipo de proteína tipo MT tiene también secuencias similares de aminoácidos dentro de las regiones separadoras entre los dominios ricos en cisteína. Hasta la fecha, Arabidopsis es la única especie vegetal en la cual se han identificado genes similares a metalotioneína de todas las categorías (clases I, II y tipos 1 a 3 de clase I). La presencia de representantes de cada categoría dentro de una especie individual (por ejemplo, Arabidopsis) o dentro de especies estrechamente relacionadas (por ejemplo, trigo, cebada y arroz) es significativa, y sugiere que las proteínas similares a MT pueden tener funciones distintas con relación a su estructura, patrones de expresión y respuesta a tensiones ambientales. Los datos publicados sobre la expresión de varios genes similares a MT de varias especies vegetales, se resumen en el cuadro 1.

CUADRO 1 Productos de genes similares a metalotioneína identificados en plantas y sus patrones de expresión. (+) indica sobrerregulación, (-) subregulación y (+/-) sin cambio en tejidos expresados preferencialmente, excepto como se cita entre paréntesis. ABA, ácido abscísico; GA3, ácido giberélico CUADRO 1 (contíuación) A partir de los datos del cuadro 1 , es claro que cada tipo de gen tipo MT exhibe patrones de expresión específicos de tejidos y de desarrollo característicos. La expresión de los genes de MT clase II, tales como para el trigo y el maíz AcMT, está restringida a embriones inmaduros (Kawashima et al., Euro. J. Biochem. 209:971-976, 1992; White y Rivin, Plant Physiol? 08:831 -832, 1995; Reynolds y Crawford, Plant Mol. Biol. 32:823-829, 1996). Transcritos similares a MT tipo 1 han sido detectados principalmente en raíces (de Miranda et al., FEBS Lett. 260:277-280, 1990; Evans et al., FEBS Lett. 262:29-32, 1990; Zhou y Goldsbrough, Plant Cell 6:875-884, 1994; Hsieh et al., Plant Mol. Biol. 32:525-529, 1996) y hojas senescentes (Buchanan-Wollaston, Plant Physiol. 105:839-846, 1994, Buchanan-Wollaston, Plant Mol. Biol. 33:821-834, 1997; Hsieh et al., Plant Mol. Biol. 32:525-529, 1996; Foley et al., Plant Mol. Biol. 33:583-591 , 1997). Los transcritos similares a MT tipo 2 se acumulan en porciones áreas tales como hojas, tallos y flores Snowden y Gardner, Plant Physiol. 103:855-861 , 1993; Foley y Singh, Plant *>*°-"* Mol. Biol. 26:435-444, 1994; Coupe et al., Planta 197:442-447, 1995; Zhou y Goldsbrough, Mol. Gen. Genet. 248:318-328, 1995; Choi et al., Plant Physiol. 112:353-359, 1996; Whitelaw et al., Plant Mol. Biol. 33:503-511 , 1997). Transcritos de genes similares a MT tipo 3 han sido detectados en frutos, y muestran expresión diferencial durante el desarrollo del fruto (Ledger y Gardner, Plant Mol. Biol. 25:877-886, 1994; Lam y Abu Baker, Plant Physiol. 112:1735, 1996; y Reid y Ross, Physiologia Plantarum 100:183-189, 1997). Transcritos similares a MT tipo 3 están también presentes en hojas (Dong y Dunstan, Planta 199:459-466, 1996; Bundithya y Goldsbrough, Plant Physiol. 114:S-251 ,1997; Clendennen y May, Plant Physiol. 115:463-469, 1997). Algunos genes de MT clase I muestran expresión programada durante la embriogénesis. Transcritos de genes pZE40 de cebada, Ose712 de arroz (ambos de tipo 2) y EMB30 de pícea blanca (tipo 3), se expresan temporalmente durante la maduración del embrión (Smith et al., Plant Mol. Biol. 20:255-266,1992; Chen y Chen, Plant Physiol. 114:1568, 1997; y Dong y Dunstan, Planta 199:459-466, 1996).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención provee, entre otras cosas, un promotor aislado (como se define en la presente) a partir de un gen tipo metalotioneína (es decir, el promotor "dfMTP"; SEQ ID NO: 17). El promotor es útil para expresar proteínas heterólogas ya sea transitoriamente en células hospederas o - — • •» - - transgénicamente en células establemente transformadas. El promotro dfMTP (SEQ ID NO: 17) puede permitir la expresión de genes específica del desarrollo puestos bajo su control. Otro aspecto de la invención provee fragmentos y deleciones del promotor, tales como los mostrados en SEQ ID NOS: 23, 24, 25, 26, y variantes de los mismos. Los promotores variantes se caracterizan por la retención de por lo menos 50% de identidad de secuencias con las secuencias de promotor descritas (SEQ ID NOS: 17, 23, 24, 25 y 26), o por la retención de por lo menos 20, 30, 40, 50 o 60 residuos de ácido nucleico consecutivos de las secuencias de promotor descritas (SEQ ID NOS: 17, 23, 24, 25 y 26). En cada caso, estos promotores retienen por lo menos actividad de promotor y, en algunos casos, estos promotores exhiben actividad nativa de promotor dfMTP. Se contempla también que promotores tales como el promotor 35S del CaMV, pueden ser alterados mediante la introducción de una o más secuencias presentes en el promotor dfMTP. El promotor resultante se caracteriza por la retención de por lo menos 20, 30, 40, 50 o 60 residuos de ácido nucleico consecutivos de las secuencias de promotor descritas (SEQ ID NOS: 17, 23, 24, 25 y 26). Otro aspecto de la invención provee vectores que contienen a los promotores descritos anteriormente y variantes de los mismos. Los vectores pueden ser transformados en células hospederas. En algunos casos, la célula hospedera resultante puede dar lugar a una planta transgénica.

La invención provee también transgenes. Estos transgenes incluyen una de las secuencias de promotor descritas anteriormente enlazada operablemente a uno o más marcos de lectura abierto (ORFs). Los transgenes pueden ser clonados en vectores, y usados subsecuentemente para transformar células hospederas, tales como células de bacterias, insectos, mamíferos, hongos, levaduras o plantas. Por consiguiente, la invención provee plantas transgénicas tales como maíz, trigo, arroz, mijo, tabaco, sorgo, centeno, cebada, Brassica, girasol, algas marinas, Lemna, avena, soya, algodón, leguminosas, colza/canola, alfalfa, lino, girasol, cártamo, cacahuate y trébol; lechuga, tomate, cucurbitáceas, mandioca, papa, zanahoria, rábano picante, chícharo, lenteja, col, coliflor, brócoli, coles de Bruselas, pimiento y otros vegetales; cítricos, manzanas, peras, duraznos, albaricoques, nogales y otros arboles frutales; orquídeas, claveles, rosas y otras flores; cacao; álamo, olmos y otros árboles deciduos; pino, abeto Douglas, pícea y otras coniferas; pastos para céspedes; cacao; y arboles de caucho y otros miembros del género Hevea. En otra modalidad más, la invención provee métodos para expresar ciertas proteínas en células hospederas, tales como células hospederas de plantas. Dichos métodos consisten en enlazar operablemente un promotor, tal como el descrito anteriormente, a por lo menos un ORF para producir un transgen, e introducir el transgen en una planta. Por consiguiente, la invención provee también proteínas que se producen mediante estos métodos.

•-•* •• * •"""' Los promotores se pueden caracterizar también analizando varios elementos de promotor presentes dentro de la secuencia de promotor. Por consiguiente, la invención provee también promotores que mantienen actividad de promotor, e incluyen por lo menos 8 elementos de promotor seleccionados del grupo que consiste de motivos de la caja E (SEQ ID NO: 1 ), elementos ERE (SEQ ID NO: 20), regiones ricas en AT (SEQ ID NO: 3), elementos MRE (SEQ ID NO: 21 ) y elementos del núcleo del ACGT (SEQ ID NO: 4), y duplicados de los mismos, en donde el promotor exhibe actividad de promotor. La invención provee también promotores que contienen los siguientes elementos de promotor en el orden siguiente: 3'-elemento ERE (SEQ ID NO: 20), región rica en AT (SEQ ID NO: 3), elemento ERE (SEQ ID NO: 20), elemento ERE (SEQ ID NO: 20), motivo de la caja E (SEQ ID NO: 1 ), elemento MRE (SEQ ID NO: 21), elemento del núcleo de ACGT (SEQ ID NO: 4), elemento del núcleo de ACGT (SEQ ID NO: 4) y elemento del núcleo de ACGT (SEQ ID NO: 4)-5\ La invención provee también vectores, células hospederas y plantas transgénicas que incluyen un promotor como se describió anteriormente, mediante la inclusión de varios elementos de promotor. La invención provee también métodos para conferir expresión de un gen a una planta, específica del desarrollo. El método consiste en enlazar operablemente un ORF a un promotor dfMTP o variante del mismo (resumido anteriormente) para producir un transgen. El transgen es transformado entonces en una célula hospedera, y la célula es regenerada en una planta. Estos y otros aspectos de la invención serán fácilmente evidentes después de leer la siguiente descripción detallada. 5 BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra la secuencia genómica de un gen tipo metalotioneína obtenido del abeto Douglas, y su promotor endógeno 10 (promotor dfMTP). La figura 2 es un diagrama esquemático del promotor dfMTP. Los elementos de promotor se identifican de la manera siguiente: I denota un elemento ERE; II denota una región rica en AT; lll denota una región de la caja E; IV denota un elemento MRE; y V denota una región del núcleo de 15 ACGT. Las flechas indican las posiciones aproximadas de los elementos de repetición. La línea que une a los elementos entre sí representa una cadena de ácido nucleico, y las regiones de la línea localizadas entre los elementos representan espacios entre elementos respectivos. La figura 3 muestra un diagrama esquemático de varios 20 mutantes de deleción del promotor dfMTP. <h-, ».tA«8i..> .a - i - . < . , - . . .... i . . .. .. . , .- . • -? . • . , ....aa^et^t-- Listado de secuencias Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos incluidas en el listado de secuencias acompañantes se muestran usando abreviaturas comunes en letras para bases de nucleótidos, y código de tres letras para aminoácidos. Sólo se muestra una cadena de cada secuencia de ácido nucleico, pero se entiende que la cadena complementaria será incluida mediante cualquier referencia a la cadena mostrada. SEQ ID NO: 1 es la secuencia de ácido nucleico de un motivo de la caja E. SEQ ID NO: 2 es la secuencia de ácido nucleico de un elemento repetido RY. SEQ ID NO: 3 es la secuencia de ácido nucleico de una región rica en AT. SEQ ID NO: 4 es la secuencia de ácido nucleico de un elemento del núcleo de ACGT. SEQ ID NO: 5 es la secuencia de ácido nucleico de un sitio de unión similar a opaque-2. SEQ ID NOs: 6 y 7 son las secuencias de ácido nucleico de "regiones similares a las presentes en gimnospermas" conservadas respectivas. SEQ ID NO: 8 es la secuencia de ácido nucleico de una caja TATA.

SEQ ID NO: 9 es la secuencia de ácido nucleico de una caja CAAT. SEQ ID NO: 10 es la secuencia de ácido nucleico de un gen gPmMTa completo, incluyendo una región no traducida (UTR) y promotor. SEQ ID NO: 11 es una secuencia de ADNc derivada del gen gPmMTa. SEQ ID NO: 12 es la región 3' no traducida (UTR) del gen gPmMTa. SEQ ID NO: 13 es la secuencia predicha de aminoácidos de la proteína tipo metalotioneína (proteína tipo MT) del abeto Douglas. SEQ ID NOs: 14 y 15 son ejemplos específicos de sitios de unión similares a opaque-2 respectivos. SEQ ID NO: 16 es una secuencia de ácido nucleico presente 5' hacia el codón de inicio del gen gPM2S1. SEQ ID NO: 17 es la secuencia de ácido nucleico del promotor dfMTP que ocurre naturalmente. SEQ ID NOs: 18 y 19 son motivos similares a la caja G. SEQ ID NO: 20 es la secuencia de ácido nucleico de un elemento de respuesta a etileno (ERE). SEQ ID NO: 21 es la secuencia de ácido nucleico de un elemento de respuesta a metales (MRE). SEQ ID NO: 22 es la secuencia de ácido nucleico de la construcción de promotor pMTP0.9. aUaÉriM^aaaaBf?agaaM SEQ ID NO: 23 es la secuencia de ácido nucleico de la construcción de promotor pMTPO.7. SEQ ID NO: 24 es la secuencia de ácido nucleico de la construcción de promotor pMTPO.5. SEQ ID NO: 25 es la secuencia de ácido nucleico de la construcción de promotor pMTP0.2. SEQ ID NOs: 26 y 27 son las secuencias de ácido nucleico de dos repeticiones directas de 150 pb respectivas. SEQ ID NO: 28 es un sitio de unión a proteína nuclear del abeto Douglas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. Definiciones A menos que se indique otra cosa, los términos técnicos se usan de acuerdo a su uso convencional. Definiciones de términos comunes en biología molecular se pueden encontrar en Lewin, Genes Vil, Oxford University Press, 1999 (ISBN 0-19-879276-X); Kendrew et al. (eds.), Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science, Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc. 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Para facilitar la revisión de las diferentes modalidades de la invención, se proveen las siguientes definiciones: "ADNc (ADN complementario)". Un "ADNc" es una pieza de ADN que carece de segmentos internos (intrones) que no codifican y secuencias 5 reguladoras de la transcripción. El ADNc puede contener también regiones no traducidas (UTRs) que son responsables del control de la traducción en la molécula de ARN correspondiente. El ADNc es usualmente sintetizado en el laboratorio mediante transcripción inversa a partir de ARN mensajero extraído de células. 10 "Péptidos catiónicos". Los "péptidos catiónicos" son péptidos antimicrobianos endógenos producidos por plantas y animales y que consisten típicamente de 12 a 45 aminoácidos. Además, son moléculas anfipáticas que tiene una carga positiva neta (catiónica) a pH fisiológico. Aunque los péptidos antimicrobianos catiónicos (CAPs) son estructuralmente diversos, se sitúan en dos clases generales de estructuras: péptidos a-helicoidales, tales como las cecropinas y los magainanos, y los péptidos de lámina ß estabilizados por enlaces disulfuro intramoleculares, tales como las defensinas, protegrinas y taquiplesinas. Véase Hancock y Lehrer, Trends Biotechnol. 16:22-28, 1998; Zasloff, Curr. Opin. Immunol. 4:3-7, 1992; Cociancich et al., Biochem. J. 300:567-575 1994; y Piers y Hancock, Mol. Microbiol. 12:951-958, 1994. Los CAPs naturales varían ampliamente en sus espectros respectivos de actividades biológicas, incluyendo destrucción de bacterias (Gram-positivas y Gram-negativas), hongos, protozoaríos, e incluso virus. Los CAPs destruirán •j"* t~>- •- -*•• normalmente a los microorganismos susceptibles in vitro a concentraciones de 0.25 µg/ml a 4 µg/ml (Hancock y Lahrer, Trends Biotechnol. 16:22-28, 1998), proveyendo grandes posibilidades ante la eficiencia declinante de los antibióticos convencionales. Además, la expresión de los CAPs en plantas puede introducir resistencia de amplio espectro a microorganismos fitopatógenos. Véase Jaynes, Plant Science 89:43-53, 1993; y Misra y Zhang, Plant Physiol. 106:977-981 , 1994. Los péptidos catiónicos son un tipo de proteína que podría ser expresada bajo el control del promotor dfMTP descrito (SEQ ID NO: 17). Otras proteínas que confieren resistencia a enfermedades, resistencia a tensión ambiental, resistencia a infestación por insectos o resistencia a herbicidas, o que alteren características relacionadas con el consumidor tales como, por ejemplo, sabor, aroma o color, pueden ser expresadas bajo el control del promotor dfMTP (SEQ ID NO: 17) descrito en la presente. "Deleción". Una "deleción" es la remoción de uno o más residuos de ácido nucleico de una secuencia de ADN, las regiones en cualquier lado de la secuencia removida siendo unidas entre sí. "Promotor tipo metalotioneína del abeto Douglas (dfMTP)". La secuencia de ácido nucleico del promotor dfMTP se provee en SEQ ID NO: 17. Sin embargo, la invención abarca también variantes y fragmentos del promotor dfMTP que se caracterizan por su capacidad para exhibir por lo menos actividad de promotor, y en algunos casos exhiben adicionalmente actividad nativa de promotor dfMTP. Estas variantes tienen por lo menos 50%, 60%, 70%, 80% ó 90% de identidad de secuencias cuando se comparan con la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 17. Estas variantes pueden ser aisladas de la naturaleza usando las técnicas de hibridación o PCR descritas a continuación, o se pueden obtener manipulando la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 17. El promotor dfMTP mostrado en SEQ ID NO 17 contiene varios elementos de promotor distintos y espacios entre elementos que están dispuestos en serie en el fragmento de ADN. Uno más de estos elementos o espacios entre elementos pueden ser alterados, eliminados y/o duplicados sin pérdida de actividad de promotor. Asimismo, el experto en la técnica apreciará que existen otros elementos de promotor que se pueden añadir al promotor mostrado en SEQ ID NO: 17 sin perder actividad de promotor y/o actividad nativa del promotor dfMTP. Por consiguiente, la invención provee promotores que mantienen actividad nativa del promotor y/o actividad de promotor, e incluyen por lo menos 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 30 ó 35 de los elementos de promotor contenidos dentro del promotor dfMTP (SEQ ID NO: 17). Las variantes del promotor dfMTP se pueden caracterizar también por el número de residuos de ácido nucleico contiguos que comparten con el promotor dfMTP (SEQ ID NO: 17). Por ejemplo, una variante del promotor dfMTP puede compartir por lo menos 20, 25, 30, 40, 50 ó 60 residuos de ácido nucleico contiguos con el promotor dfMTP mostrado en SEQ ID NO: 17. Dichas variantes serán caracterizadas además por su "*- - * ' ^.-^. ^-- ~ capacidad para dirigir la expresión de un transgen que está enlazado operablemente a las mismas. "Inserción". Una "inserción" es la adición de un nucleótido o un residuo de aminoácido a una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos, respectivamente. "Aislado". Un componente biológico "aislado" (tal como ácido nucleico, proteína u organelo) ha sido sustancialmente separado o purificado de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el cual el componente ocurre naturalmente, es decir, otro ADN y ARN cromosómico y extracromosómico, proteínas y organelos. Los ácidos nucleicos y proteínas que han sido "aislados" incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificados mediante métodos de purificación estándar. El término abarca también ácidos nucleicos y proteínas preparados mediante la expresión recombinante en una célula hospedera, así como también mediante ácidos nucleicos sintetizados químicamente. "Actividad nativa del promotor dfMTP". La "actividad nativa del promotor dfMTP" se caracteriza por transcripción específica del desarrollo como se ilustra mediante los resultados mostrados en el cuadro 2. Se ha mostrado que el promotor dfMTP dirige en mayor grado la transcripción en tejido del megagametofito de etapa 5 del abeto Douglas que en tejido del megagametofito de etapa 6. Por consiguiente, el promotor dfMTP muestra actividad específica del desarrollo. dHÉMUÉMIiá La "actividad específica del desarrollo" se define como la capacidad de un promotor para dirigir un nivel de transcripción superior en un tejido durante el desarrollo de la etapa 1 comparativamente con la transcripción en el mismo tejido durante una diferente etapa de desarrollo. Además, la expresión específica del desarrollo se puede determinar creando plantas transgénicas y poniendo a prueba los tejidos transgénicos resultantes (por ejemplo, hojas, flores, semillas, raíces) para ARNm transgénico. La expresión específica del desarrollo se cuantifica comparando el nivel de ARNm expresado en un tejido en un punto de tiempo con el nivel expresado en el mismo tejido en un punto de tiempo posterior. El grado de expresión específica del desarrollo se expresa en términos de un porcentaje de expresión, es decir, el porcentaje de ARNm en un tejido en un tiempo específico, comparativamente con el mismo tejido en un punto de tiempo diferente. Por ejemplo, 100% (1x) de expresión refleja que una cantidad igual de expresión se observa en dos etapas de desarrollo distintas; y 200% (2x) denota que se expresa tanto como el doble de ARNm en una etapa comparativamente con otra etapa. La actividad nativa del promotor dfMTP es definida por lo tanto por la capacidad del promotor dfMTP para dirigir una expresión mayor del ARNm durante una etapa de desarrollo, comparativamente con otra etapa de desarrollo en tejidos derivada de la misma planta (es decir, por lo menos 101 %). En efecto, el promotor dfMTP puede mostrar una inclinación incluso mayor para expresión específica del desarrollo, tal como por lo menos 125%, 150%, 200%, 250% o 300% de expresión específica del desarrollo. "Oligonucleótido ("oligo"). Un "oligonucleótido" se refiere a una secuencia de polinucleótidos lineal de hasta aproximadamente 100 bases de nucleótidos de longitud. "Marco de lectura abierto (ORF)". Un "marco de lectura abierto" es una serie de tripletes de nucleótidos (codones) que codifican para aminoácidos sin codón de terminación interno alguno. Estas secuencias son usualmente traducibles en un péptido. "Enlazado operablemente". Una primera secuencia de ácido nucleico está "enlazada operablemente" a una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico está situada en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está enlazado operablemente a una secuencia de codificación si el promotor afecta la transcripción o expresión de la secuencia de codificación. Por lo general, las secuencias de ADN enlazadas operablemente son contiguas y, cuando es necesario para unir dos regiones de codificación de proteína, están en el mismo marco de lectura. "Ortólogas". Ortólogas" son secuencias de ácido nucleico o aminoácidos que comparten una secuencia ancestral común, pero que divergen cuando una especie que posee esa secuencia ancestral se separa en dos especies. Las secuencias ortólogas son usualmente también secuencias homologas. ^__i¿¿-¿i4é "Sondas e iniciadores". Se pueden preparar fácilmente "sondas e iniciadores" de ácido nucleico con base en las secuencias de ácido nucleico provistas por esta invención. Una "sonda" comprende una secuencia de ácido nucleico aislada adherida a una marca detectable o molécula de reportero. Las marcas típicas incluyen isótopos radiactivos, ligandos, agentes quimioluminiscentes y enzimas. Métodos para marcar y guiar la elección de marcas apropiadas para varios propósitos se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. ed., vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989; y Ausubel et al. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley-lnterscience, New York (con actualizaciones periódicas), 1987. Los "iniciadores" son ácidos nucleicos cortos, de preferencia oligonucleótidos de ADN de 15 nucleótidos o más de longitud, que son unidos a una cadena de ADN objetivo complementario mediante hibridación de ácido nucleico para formar un híbrido entre el iniciador y la cadena de ADN objetivo, y extendido entonces a lo largo de la cadena de ADN objetivo mediante una enzima ADN polimerasa. Se pueden usar pares de iniciadores para amplificar una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) u otros métodos de amplificación de ácido nucleico conocidos en la técnica. Según se indicó, las sondas e iniciadores son de preferencia de 15 nucleótidos o más de longitud pero, para incrementar su carácter específico, se pueden preferir sondas e iniciadores de 20 o más nucleótidos.

Métodos para preparar y usar sondas e iniciadores se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. ed., vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et al. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley-lnterscience, New York (con actualizaciones periódicas), 1987; e Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Los pares de iniciadores de PCR se pueden derivar de una secuencia conocida, por ejemplo, usando programas de computadora destinados para ese propósito, tales como Primer™ (Versión 0.5, 1991 , Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA). El experto en la técnica apreciará que el carácter específico de una sonda o iniciador en particular aumenta con la longitud de la sonda o iniciador. Por ejemplo, un iniciador que comprenda 20 nucleótidos consecutivos se unirá a un objetivo con mayor carácter específico que un iniciador correspondiente de apenas 15 nucleótidos. De esta manera, para obtener mayor carácter específico, se pueden seleccionar sondas e iniciadores que comprendan, a manera de ejemplo, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 50 o más nucleótidos consecutivos. "Actividad de promotor". La "actividad de promotor" se define como la capacidad de una secuencia de ADN para dirigir la transcripción (funciona como el sitio de inicio de la transcripción). La actividad de promotor varía con el número y la posición de los elementos de promotor (definidos más adelante). Por ejemplo, el promotor dfMTP puede ser alterado de modo que pierda su actividad específica del desarrollo (actividad naliva), y sin embargo mantenga su capacidad para dirigir la transcripción. "Elementos de promotor". Los "elementos de promotor", como se usan en la presente, se refieren a subdominios dentro del promotor que confieren expresión específica del desarrollo, incrementan la expresión e inhiben la expresión. Un promotor puede contener una multiplicidad de elementos de promotor. Además, algunos elementos pueden aparecer más de una vez dentro de un promotor individual. Ejemplos de dichos elementos son los motivos de la caja E (SEQ ID NO: 1 ), elementos repetidos RY (SEQ ID NO: 2), regiones ricas en AT (SEQ ID NO: 3), elementos del núcleo de ACGT (SEQ ID NO: 4), elementos similares a opaque-2 (SEQ ID NO: 5), y regiones conservadas similares a las presentes en gimnospermas (SEQ ID NOS: 6 y 7). Otros ejemplos de elementos de promotor se pueden encontrar en las patentes de E.U.A. Nos. 5,723,751 a Chua; 5,608,149 a Barry et al.; 5,589,615 a De Clercq et al.; 5,589,583 a Klee et al.; 5,677,474 a Rogers; 5,487,991 a Vandekerckhove et al.; y 5,530,194 a Knauf et al. Típicamente, una caja TATA se encuentra en el extremo 3' de la serie de elementos de promotor. Ejemplos de elementos de promotor específicos se proveyeron anteriormente, y se proveen en el listado de secuencias. Sin embargo, el experto en la técnica apreciará que los ejemplos específicos mostrados en el listado de secuencias se pueden modificar manteniendo aún su actividad de promotor. Por ejemplo, una base en un elemento repetido RY puede ser modificada mediante la sustitución de uno o más residuos de ácido nucleico . .. . . . ^ .. — „ .,.. „ .., .. , , .... , ,-, ?. ., -, t ( ?,?rwrtwrr, mientras se mantiene la funcionalidad del elemento repetido RY dentro de la secuencia de promotor general. Una vez que un promotor ha sido identificado, los elementos de promotor pueden ser caracterizados, tal como se describe a continuación para 5 el promotor dfMTP (SEQ ID NO: 17; véase figura 1 ). Este promotor contiene una serie de elementos de promotor identificables. Estos elementos aparecen en serie en el ADN genómico como se muestra esquemáticamente en la figura 2. El espacio entre los elementos es referido más adelante como "espacio entre elementos". Un espacio entre elementos puede ser modificado mediante la adición, deleción y/o sustitución de nucleótidos sin pérdida de la actividad de promotor. El promotor dfMTP puede ser modificado también eliminando elementos del promotor y/o duplicando elementos dentro del promotor. El experto en la técnica apreciará que dichas aplicaciones al promotor pueden incrementar la actividad del promotor, inhibir la actividad del promotor o alterar el nivel de expresión específica del desarrollo del promotor. El experto en la técnica apreciará que, modificando el orden de los elementos del promotor, el número de los elementos del promotor, y/o la longitud de los espacios entre los elementos, es posible modificar la actividad y/o la actividad nativa del promotor dfMTP. Sin embargo, en cada caso, el promotor dfMTP será capaz de dirigir la expresión del gen que está enlazado operablemente al mismo. Pruebas para cuantificar la actividad de dfMTP, así como también la actividad nativa de dfMTP, se proveen más adelante. m**mt^*¡¿¡Ém* Ju .

"Proteína". Se trata de una molécula biológica expresada por un gen y que comprende aminoácidos. "Purificado". El término "purificado" no requiere pureza absoluta; más bien, se usa como un término relativo. De esa manera, por ejemplo, una preparación de proteína purificada es una en la cual la proteína referida es más pura que la proteína en su ambiente natural dentro de una célula o dentro de una cámara de reacción para producción (según sea apropiado). "Recombinante". Un ácido nucleico "recombinante" incluye una secuencia que no ocurre naturalmente o que tiene una secuencia obtenida mediante una combinación artificial de dos secuencias de otra manera separadas. Esta combinación artificial se logra con frecuencia mediante sintesis química o, más comúnmente, mediante la manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética. "Identidad de secuencia". El término "identidad de secuencia" se usa para describir la similitud entre dos secuencias de ácido nucleico o entre dos secuencias de aminoácidos. La identidad de secuencia se expresa típicamente en términos de porcentaje de identidad; cuanto mayor es el porcentaje, más similares son las dos secuencias. Métodos para alinear secuencias para propósitos de comparación son bien conocidos en la técnica. Varios programas y algoritmos de alineación se describen en Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981 ; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444-2448, 1988; Higgins y Sharp, Gene 73:237-244, 1988; Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989; Corpet et al., Nucí. Acids. Res. 16:10881-10890, 1988; Huang et al., Comput. Applic. Biosciences 8:155-165, 1992; y Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-331 , 1994. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990, presenta una discusión detallada de métodos de alineación de secuencias y cálculos de homología. La herramienta de búsqueda de alineación local básica del NCBI (BLAST™, Altshul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990), está disponible de varias fuentes, incluyendo el National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) y en la Internet, para su uso en relación con los programas de análisis de secuencias blastp, blastn, blaslx, tblastn y tblastx. Se puede accesar a la BLAST™ en el sitio en la red mantenido por la NCBI. Una descripción de cómo determinar la identidad de secuencias usando este programa, está también disponible en el sitio en la red. Para comparaciones de secuencias de aminoácidos de más de aproximadamente 30 aminoácidos, se utiliza la función de "secuencias Blast 2" en el programa BLAST™ usando la matriz BLOSUM62 por omisión ajustada a parámetros por omisión (costo de existencia por espacio de 11 , y un costo de espacio por residuo de 1 ). Cuando se alinean péptidos cortos (menores de aproximadamente 30 aminoácidos), la alineación se debe llevar a cabo usando la función de secuencias Blast 2, utilizando la matriz PAM30 ajustada a parámetros por omisión (sanciones por espacio abierto de 9, y de espacio por extensión de 1 ). Las proteínas que tienen similitud incluso mayor con las secuencias de referencia, mostrarán porcentajes de identidad crecientes cuando se evalúan mediante este método, tales como por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, o por lo menos 95% de identidad de secuencia. Un primer ácido nucleico es "sustancialmente similar" a un segundo ácido nucleico si, cuando es alineado óptimamente (con inserciones o deleciones apropiadas de nucleótidos) con el otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), la identidad de secuencias de nucleótidos ocurre en por lo menos aproximadamente 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% de las bases de nucleótidos (como se usa en la presente, las secuencias "óptimamente alineadas" exhiben una identidad de secuencias máxima posible). La similitud de secuencias se puede determinar comparando las secuencias de nucleótidos de dos ácidos nucleicos usando el programa de análisis de secuencias BLAST™ (blastn) disponible de The National Center for Biotechnology Information. Dichas comparaciones se pueden hacer usando el programa ajustado a valores por omisión (expectativa = 10, filtro = por omisión, descripciones = 500 en pares, alineaciones = 500, vistas de alineación = estándar, costo de existencia por espacio = 11 , existencia por residuo = 1 , costo de espacio por residuo = 0.85). Asimismo, un primer polipéptido es sustancialmente similar a un segundo polipéptido si muestra identidad de secuencias de por lo menos aproximadamente 75% - 90% o más — ^ £ j£^ ^Ju^^ cuando es alineado óptimamente y comparado usando el programa BLAST™ (blastp) usando valores por omisión. "Transformada". Una célula "transformada" es una célula en la cual una molécula de ácido nucleico ha sido introducida mediante técnicas de biología molecular. Como se usa en la presente, el término "transformación" abarca todas las técnicas mediante las cuales una molécula de ácido nucleico podría ser introducida en dicha célula, incluyendo transfección con un vector viral, transformación con un vector plasmídico, e introducción de ADN desnudo mediante electroporación, lipofección y aceleración por bombardeo de partículas. "Planta transgénica". Como se usa en la presente, una "planta transgénica" se refiere a una planta que contiene material genético recombinante ("transgen") no normalmente presente en una planta de tipo silvestre de la misma especie. De esta manera, una planta que se desarrolla a partir de una célula vegetal en la cual se introduce ADN recombinante mediante transformación es una planta transgénica, como lo es toda la progenie de esa planta que contiene al transgen introducido (ya sea producida sexualmente o asexualmente). "Vector". Un "vector" es una molécula de ácido nucleico introducida en una célula hospedera, con la intención de producir una célula hospedera transformada. Un vector puede incluir una o más secuencias de ácido nucleico, tales como un origen de replicación, que le permita al vector replicarse en una célula hospedera. Un vector puede incluir también uno o _________mii_____m___M más genes de marcador seleccionables y otros elementos genéticos conocidos en la técnica. A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como lo entiende comúnmente el experto en la técnica a la cual esta invención pertenece. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente se pueden usar en la práctica o prueba de la presente invención, métodos y materiales adecuados se describen más adelante. En caso de conflicto, servirá de control la presente especificación, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos, y no se pretende que sean limitativos. Además, a lo largo de la especificación, los términos en singular "un", "una" y "la" ¡ncluyen referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente otra cosa.

II. Aislamiento y análisis de la actividad de promotor A. Clonación de un gen tipo metalotioneína del abeto Douqlas Se seleccionó una genoteca genómica del abeto Douglas construida en el bacteriófago ?EMBL3 con una sonda de ADNc PM2J (Chatthai et al., Plant Mol. Biol. 34:243-254, 1997). A partir de aproximadamente 1x106 clones genómicos, tres clones (?PMMTa, ?PMMTb, ?PMMTc, respectivamente) hibridaron fuertemente con la sonda PM2J . La ____________________________ hibridación Southern de ADN? aislado de estos clones con la sonda de ADNc PM2J , reveló que tenían diferentes mapas de restricción, y correspondían a diferentes genes similares a MT en el abeto Douglas. El clon genómico ?PMMTa, que contiene una inserción de aproximadamente 20 kb, se seleccionó para análisis posterior. Un fragmento Xbal de 4.5 kb de ?PMMTa fue subclonado en un plásmido pUC19, dando lugar al clon genómico gPmMTa.

B. Caracterización del gen pPmMTa del abeto Douqlas La secuencia de nucleótidos de 2.3 kb de gPmMTa (SEQ ID NO: ) y la estructura primaria deducida de una proteína tipo MT del abeto Douglas (proteína tipo MT; SEQ ID NO: 13), se muestran en la figura 1. La comparación de las secuencias de nucleótidos del gen gPmMTa (SEQ ID NO: ) y el ADNc de PM2J indicó que el gen gPmMTa incluye tres exones interrumpidos por dos intrones localizados respectivamente en las posiciones de aminoácidos 17 y 39. El primer y el segundo intrones son de 125 y 78 pb de longitud, respectivamente. Ambas regiones exhiben características de ¡ntrones putativos de plantas tales como la abundancia de A/T, el límite :GU...AG, y la secuencia concenso de punto de ramificación YUNAN (en donde Y es C o U, y N es cualquier nucleótido) (Brow et al., Plant Mol. Biol. 32:531-535, 1996). La región de codificación del gen gPmMTa (SEQ ID NO:10) no fue idéntica a la del ADNc de PM2J ; sin embargo, compartían altos grados de similitudes respectivas en los niveles de nucleótidos (94%) y aminoácidos (98.5%). Se llevó a cabo una prueba de extensión con iniciador usando ARN total de megagametofito de etapa 5 y un oligonucleótido de 23 elementos (PMMT 5'), complementario al extremo 5' de la secuencia de codificación de PM2J , para localizar al sitio de inicio de la transcripción. El transcrito más largo, deducido a partir de la escalera de secuencias producida con el mismo iniciador, se inició a partir de la citosina localizada 92 nucleótidos hacia el extremo 5' a partir del codón de inicio ATG.. Con base en pruebas de extensión con iniciador, el sitio de inicio de la transcripción en la citosina fue denotado como el sitio de inicio y designado como "+1 ". Existen ahora datos sobre la secuencia de promotor para genes para proteínas similares a MT clase I del chícharo (Evans et al., FEBS Lett. 262:29-32, 1990) tomate (Whitelaw et al., Plant Mol. Biol. 33:503-511 , 1996), Arabidopsis (Zhou y Goldsbrough, Mol. Gen. Genet. 248:318-328, 1995), cebada (Klemdal et al., Mol. Gen. Genet. 228:9-16, 1991 ), y para genes para proteínas similares a MT clase II del trigo (Kawashima et al , Euro. J. Biochem. 209:971-976, 1992) y maíz (de Framond, FEBS Lett. 290:103-106, 1991 ). Cuando el dfMTP fue comparado con las regiones análogas de estos genes usando el programa CLUSTALV (Higgin y Sharp, Computer App. Bio. Sci. 5:151-153, 1989), no se pudo detectar similitud significativa entre dfMTP y cualquier otra secuencia. Sin embargo, un número de motivos reguladores cis comunes a estos genes fue evidente en el dfMTP del abeto Douglas hacia el extremo 5' de la caja TATA putativa (figuras 1 y 2). Estos motivos incluyen una caja E (CANNTG; SEQ ID NO: 1 ; Stálberg et al., Planta 199: 515-519, 1996) en la posición -493, tres copias de motivos palíndromos similares a la caja G (AACGTT, CACGTG; SEQ ID NOs: 18 y 19, respectivamente, Foster et al., FASEB J. 8: 192-200, 1994) entre las posiciones -104 y -165, y tres copias de elementos putativos de respuesta a etileno (AWTTCAAA; SEQ ID NO: 20; Montgomery et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:1406-1410, 1993) alrededor de las posiciones -580, -590 y -745, respectivamente. El gen gPmMTa (SEQ ID NO: 10) contiene también un motivo similar al elemento central de respuesta a metales (MRE) (TGCRCNC; SEQ ID NO; 21 ; Thiele, Nucí. Acids Res. 20:1183-1192, 1992). El motivo MRE se ha encontrado únicamente en el PsMTA del chícharo (Fordham-Skelton et al., Plant Mol. Biol. 34:659-668, 1997). Una caracteristica única e interesante presente en la secuencia 5' proximal del gen gPmMTa del abeto Douglas (SEQ ID NO: 10), es la presencia de dos unidades de repetición directas de 150 pb (regiones -134/+20 y -34/-175, respectivamente; SEQ ID NOS: 26 y 27, respectivamente.). Ambas secuencias contienen la caja TATA putativa y secuencias idénticas que flanquean al sitio predicho de inicio de la transcripción. No se sabe si la transcripción se inicia a partir de la caja TATA distal.

- * - ' * -*^-. C. Análisis de actividad del gen quimérico promotor dfMTP-glucuronidasa en el abeto Douglas y en tabaco transqénico Se realizó el análisis funcional del promotor del gen tipo MT del abeto Douglas utilizando secuencias del promotor gPmMTa intactas y con deleción, fusionadas a la región de codificación de ß-glucuronidasa (uidA o GUS). Las construcciones del gen de fusión se probaron ya sea en semillas del abeto Douglas transformadas transitoriamente utilizando bombardeo de partículas o introducidas en forma estable en plantas de tabaco por medio de Agrobacterium tumefaciens. Utilizando el método de bombardeo de partículas, se suministraron la construcción quimérica promotor de gPmMTa/uidA (pMTP0.9; SEQ ID NO:22), de 0.9 kb, un gen reportero sin promotor (pBI101 ), y la construcción promotor de CaMV 35S/gen uidA (pBI221 ) en megagametofitos del abeto Douglas en desarrollo, en embriones cigóticos inmaduros y en embriones somáticos maduros. Se determinó la actividad GUS como unidades de expresión GUS (GEUs) apareciendo como manchas de color azul después de realizar la prueba GUS histoquímica dos días después del bombardeo. El bombardeo con pBI101 no produjo expresión transitoria de GUS visible. Por el contrario, la actividad de GUS fue evidente cada vez que los tejidos del abeto Douglas se bombardearon con uno o con el otro de pBI221 y pMTP0.9 (SEQ ID NO: 22). Se estimó la eficiencia del promotor gPmMTa de 0.9 kb en comparación con el promotor CaMV 35S constitutivo contando el número de GEUs por tejido. Como se muestra en el cuadro 2, el bombardeo con la construcción pMTP0.9 (SEQ ID NO: 22) produjo GEUs dos a tres veces más alta en ambos megagametofitos y embriones cigóticos que el plásmido pBI221. Aunque las GEUs individuales en embriones somáticos bombardeados con pMTP0.9 (SEQ ID NO: 22) estaban acomodados en forma bastante densa como para contarlos, los embriones somáticos bombardeados con pBI221 parecían tener una densidad más baja de GEUs. Los resultados indican que el dfMTP puede activar la expresión de GUS en megagametofitos, en embriones cigóticos y en embriones somáticos del abeto Douglas. Para localizar las regiones reguladoras responsables de la expresión de los genes tipo MT en el abeto Douglas, se construyeron una serie de mutantes de deleción del promotor del gen gPmMTa los cuales tenían longitudes variables de secuencias de promotor. Se enlazaron por separado cuatro fragmentos de promotor dfMTP con deleción en el extremo 5' al gen uidA (con el terminador nos) en vectores basados en pUC19 (pBI221 ). Las construcciones resultantes se denominaron pMTP0.9 (SEQ ID NO:22), pMTPO.7 (SEQ ID NO: 23), pMTPO.5 (SEQ ID NO:24), y pMTP0.2 (SEQ ID NO: 25) (figura 3). Todas las construcciones incluyeron la porción 5'-UTR del transcrito y el codón de iniciación de gPmMTa. Cada construcción se evaluó respecto a la expresión transitoria después del bombardeo de partículas en megagametofitos en la etapa 5 y la etapa 6, embriones cigóticos en la etapa 6 y embriones somáticos maduros del abeto Douglas. Los resultados de los tres ensayos por construcción se muestran en el cuadro 2 siguiente.

CUADRO 2 Construcción GEUs por tejido (media ± SE) Megagametofito en etapa 5 Megagametofito en etapa 6 Embriones cigóticos en etapa 6 pBI221 24 ± 5 a 16 ± 2 a 4 ± 0.6 a pMTPO.9 80 + 3 c 33 ± 1 b 9 ± 0.9 b pMTPO.7 84 ± 2 c 33 ± 3 b 19 + 1.0 C pMTPO.5 37 + 3 a 13 ± 2 a 3 ± 0.0 a pMTPO.2 44 ± 4 13 ± 2 a 9 ± 0.3 b pBI101 nulo nulo nulo El cuadro 2 indica los resultados provenientes de las pruebas que implican diez megagametofitos o embriones en cada uno de los tres bombardeos. Para cada repetición, el número de unidades de expresión transitorias de GUS (GEUs) se marcaron y promediaron como GEUs por tejido. Los números promedios de GEUs por tejido se calcularon a partir de bombardeos independientes. Se indican los errores estándar de las medias respectivos. Los efectos de tratamiento significativo (P < 0.05) entre las construcciones se calcularon mediante ANOVA en un solo sentido por separado. Para los experimentos que utilizan el mismo tipo de tejido, las letras idénticas (por ejemplo, a, b, o c) indican que no hay diferencia significativa entre las dos construcciones con respecto al efecto sobre la actividad transitoria de GUS. La construcción pMTP0.9 (SEQ ID NO: 22; -856/+88; figura 3) generó aproximadamente 80 y 33 GEUs por tejido en megagametofitos en etapa 5 y en etapa 6, respectivamente. No se observó diferencia significativa en la actividad GUS cuando los tejidos se bombardearon con la construcción pMTP0.7 (SEQ ID NO: 23; -677/+88; figura 3). Las construcciones de deleción de conformidad con pMTPO.5 (SEQ ID NO: 24; pMTPO.5; figura 3) y mMTP0.2 (SEQ ID NO: 25; pMTP0.2; figura 3) produjeron en forma consistente únicamente 50% de la expresión de GUS generada por pMTP0.9 (SEQ ID NO: 22) y pMTP0.7 (SEQ ID NO: 23), respectivamente. La región -677A453 del gen gPmMTa contiene un elemento o elementos reguladores positivos para la expresión en megagametofitos. En los embriones cigóticos en la etapa 6, la construcción pMTPO.7 (SEQ ID NO: 23) produjo la actividad de GUS más alta (19 GEUs por embrión), lo cual explica la actividad 2 veces más alta que la observada con la construcción pMTP0.9 (SEQ ID NO: 22). La construcción pMTPO.5 (SEQ ID NO: 24) generó únicamente 3 GEUs por embrión; sin embargo, la construcción pMTP0.2 causó un incremento de 3 veces en la actividad de GUS con relación a la construcción pMTPO.5 (SEQ ID NO: 24). Esto es opuesto a lo que se descubrió en los megagametofitos, las eficiencias respectivas de pMTPO.5 (SEQ ID NO: 24) y pMTP0.2 (SEQ ID NO: 25) fueron similares. Estas observaciones indican que la región -677/6453 del promotor del gen gPmMTa es esencial para la expresión del gen a alto nivel en embriones cigóticos. Por el contrario, las regiones -853/-677 y -453/-190 podrían contener elementos reguladores negativos. La actividad de GUS fue evidente en los embriones somáticos de todas las construcciones estudiadas; sin embargo, con la excepción de pMTPO.5 (SEQ ID NO:24), las GEUs generadas estaban arregladas en forma bastante densa como para ser contadas. En estudios de transformación estable, se fusionaron cuatro fragmentos con deleción en el extremo 5' del promotor dfMTP (SEQ ID NO: 17) 5 a la región de codificación para GUS en el vector binario pBI121. Los genes quiméricos se introdujeron en plantas de tabaco mediante transformación mediada por Agrobacterium. La integración del gen quimérico y el número de copias del gen uidA en tabaco transformado se verificaron utilizando amplificación PCR y análisis Southern blot, respectivamente. La tinción 10 histoquímica para actividad de GUS en semillas en desarrollo del tabaco transgénico, XBY3-118 (el cual contiene la construcción pMTP0.9 (SEQ ID NO: 22) reveló una actividad muy baja o ninguna actividad de GUS. También se observo poca o ninguna actividad de GUS en embriones, endosperma, hojas y raíces de tabaco transgénico. Sin embargo, es probable que al 15 modificar la estructura del promotor se incremente la actividad de transcripción. lll Implicaciones de los resultados En un intento para identificar las regiones de promotor 20 responsables de la expresión regulada del gen gPmMTa (SEQ ID NO: 10), se construyeron genes quiméricos que contienen una serie de deleciones de promotor fusionadas al gen reportero uidA y se introdujeron en células de semillas inmaduras y en embriones somáticos del abeto Douglas mediante Mi?AiimiÉMMK ^¡^^^UÜbiíatki bombardeo de partículas. La actividad de promotor se examinó en pruebas de expresión de GUS transitoria. Los resultados (resumidos en el cuadro 2) mostraron que una secuencia de 190 pares de bases hacia el extremo 5' del sitio de inicio de transcripción de gPmMTa es suficiente para dirigir la expresión de GUS en tejido de megagametofito, embriones cigóticos y en embriones somáticos del abeto Douglas. La secuencia próxima de 190 pares de bases, además de una secuencia de caja TATA putativa, contiene una repetición invertida del motivo del núcleo ACGT (SEQ ID NO: 4). La secuencia del núcleo es parte de la caja G (CACGT; SEQ ID NOJ 9), la cual parece ser que se conserva en los promotores de los genes del tipo MT activos identificados hasta ahora, incluyendo MT1a de Arabidopsis (Zhou y Glodsbrough, Mol. Gen. Genet. 248:318-328, 1995), PsMTa de chícharo (Fordham-Skelton et al., Plant Mol. Biol. 34:659-668, 1997), LeMTB de jitomate (Whitelaw et al., Plant Mol. Biol. 33:503-511 , 1997), y rgMT úe arroz (Hsieh et al., Plant Mol. Biol. 28:381-389, 1995). En el trigo, se ha implicado la presencia de la secuencia del núcleo (como parte de ABRE) en la región de flanqueo 5' del gen EcMT en la expresión génica inducida por ABA en embriones en germinación (Kawashima et al., Euro. J. Biochem. 209:971-976, 1992). La secuencia de núcleo está ausente en el promotor de MT1b no funcional de Arabidopsis (Zhou y Goldsbrough, Mol. Gen. Genet. 248:318-328, 1995). La caja G y las secuencias relacionadas son necesarias para la expresión diferencial de genes por medio de estrés, luz, ácido abscísico (Busk y Pagé, Plant Cell 9:2261-2270, 1997; Guilfoyle, Genetic Engineering, Setlow, ^á_^^^^^ J ^¡? ^?ll^ É^u J.K. (ed), Plenum Press, Nueva York, 1997; Shen y Ho, Physiologia Plantarum 101 :653-664, 1997), y etileno (Sessa et al., Plant Mol. Biol. 28:145-13, 1995). Se han caracterizado varias proteínas de la familia bZIP de factores de transcripción, las cuales se unen al motivo que contiene al núcleo ACGT (Foster et al., FASEB J. 8:192-200, 1994; Guiltinan et al., Science 250:267-271 , 1990; Kawagoe y Murai, Plant Science 116:47-57, 1996; y Schindler et al., Plant Cell 4:1309-1319, 1992a). Una interacción de un motivo de núcleo ACGT con otro elemento regulador (también llamado un elemento de acoplamiento), encontrado en una distancia próxima o distal al motivo del núcleo ACGT, define un complejo regulador que confiere un carácter específico señal-respuesta de un gen (Shen y Ho, Physiologia Plantarum 101 :653-664, 1997). Como resultado, los motivos de núcleo ACGT (SEQ ID NOS: 18 y 19) están implicados en respuestas hacia diferentes estímulos fisiológicos y ambientales tales como la expresión inducida por ABA de HVA2 de cebada (Shen y Ho, Physiologia Plantarum 101 :653-664, 1997) de los genes del tipo lea de Arabidopsis inducidos por ABA y agua-estrés (Hull et al., Plant Science 114:181-192, 1996), arroz (Mundy et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:1406-1410, 1990), y trigo (Marcotte et al., Plant Cell 1 :969-976, 1989), la respuesta a luz-UV del promotor chs de perejil (Block et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:5387-5391 , 1990); y la respuesta a la luz del gen rbcS-1A de Arabidopsis (Donald y Cashmore, EMBO J. 9:1717-1726, 1990). El enlace in vitro de extractos nucleares provenientes de extractos nucleares de semilla del abeto Douglas mostraron que las proteínas nucleares se unen a los sitios de unión (subrayado) de la secuencia ATTGCAATTTCCAACGTTG (SEQ ID NO:28) putativa, sugiriendo de esta manera que el motivo del núcleo puede ser un componente regulador de la expresión del gen gPmMTa (SEQ ID NO: 10). El segundo dominio funcional identificado en el promotor gPmMTa se extiende desde las posiciones -677 a -453. Esta región confiere un alto nivel de expresión del gen uidA tanto en megagametofitos como en embriones. Al análisis de secuencia de esta región reveló la presencia de varios elementos reguladores putativos, incluyendo dos copias del elemento de respuesta a etileno (ERE; SEQ ID NO:20), una región rica en A T (SEQ ID NO:3) y un motivo de caja E (SEQ ID NOJ ). En un número de plantas, el etileno está implicado en la regulación de la expresión de genes del tipo MT específico de desarrollo y regulados en cuanto a desarrollo. Por ejemplo, las moléculas de ADNc del tipo MT se indujeron durante la senescencia de las hojas en Brassica napus (Buchanan-Wollaston, Plant Phsiol. 105:839-846, 1994) y en Arabidopsis (Zhou y Goldsbrough, Plant Cell. 6:875-884, 1994); durante la abscisión de las hojas estimuladas por etileno en Sambucus nigra (Coupe et al., Planta 197:442-447, 1995); y durante la maduración de frutas en kiwi (Ledger y Gardner, Plant Mol. Biol. 25:877-886, 1995), manzana (Reid y Ross, Physiologia Plantarum 100:183-189, 1997); papaya (Lam y Abu Baker, Plant Physiol, 112:1735, 1996), y cereza (Wiersma et al., Plant Physiol. 116:867, 1998). También se ha demostrado que la activación del gen glutation-S-transferasa se presenta en respuesta al etileno durante la senescencia de los pétalos, y que tal activación implica al elemento promotor (ERE ATTTCAAA; SEQ ID NO:20) Itzhaki et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:8925-8929, 1994. En forma interesante, el elemento ERE putativo es altamente conservado en los genes del tipo MT de chícharo (Fordham-Skelton al., Plant Mol. Biol. 34:659-668, 1997), jitomate (Whitelaw et al., Plant Mol. Biol. 33:503-511 , 1997), Arabidopsis (Zhou y Goldsbrough, Mol Gen. Genet. 248:318-328, 1995), y abeto Douglas (descrito en la presente invención). En estudios de transferencia de genes, la deleción del fragmento promotor PsMTA que contiene tres copias del elemento ERE ocasionó deficiencia en la expresión de un gen reportero dentro de las raíces y los tejidos aéreos senescentes de Arabidopsis transgénico (Fordham-Skelton et al., Plant Mol. Biol. 34:659-668, 1997). Como se describe en la presente invención, las pruebas de expresión transitorias mostraron que las construcciones de deleción que carecen de dos copias de ERE (SEQ ID NO:20) presentaron una disminución significativa en actividad de GUS en las semillas en desarrollo. Además, la existencia de los tres ERE (SEQ ID NO:20) en el promotor descrito indica que es probable que el promotor también sea inducido mediante etileno. La segunda secuencia CATTTG (SEQ ID NOJ ), en la posición -493 se parece a la caja E putativa (CANNTG; (SEQ ID NOJ). Se demostró que este motivo es un sitio de reconocimiento para las proteínas que se unen a ADN en el promotor del gen ß-faseolina de frijol (Kawagoe y Murai, The Plant J. 2:927-936, 1992), y es responsable de la expresión cuantitativa y correcta específica de semillas de los genes napin (Ellerstróm et al., Plant Mol. Biol. 32:1019-1027, 1996; y Stálberg et al., Planta 199:515-519, 1996). Por último, se identificó una secuencia de 39 pb rica en A/T que se extiende desde -637 hasta -604. Los estudios anteriores de genes específicos de semilla han demostrado que las secuencias ricas en A/T en el promotor pueden actuar como incrementadores generales de expresión (Stálberg et al., Planta 199:515-519, 1996). La región de flanqueo 5' de gPmMTa contiene un elemento regulador con metal (MRE), que sugiere la posibilidad de transcripción de este gen regulada con metal. Esto está en concordancia con los resultados provenientes de análisis northern que muestran la acumulación inducida por metal (es decir, zinc, hierro, cobre y manganeso) de los transcritos PM2J en semillas y en brotes jóvenes del abeto Douglas. Hasta la fecha, existen únicamente dos reportes sobre la existencia de MRE, en genes vegetales tipo MT. El gen PsMTA de chícharo (Fordham-Selkton et al., Plant Mol. Biol. 34:659-668, 1997) y el gen LeMTB de jitomate (Whitelaw et al., Plant Mol. Biol. 33:503-511 , 1997) contiene cada uno un MRE putativo en la región de flanqueo 5' de los genes, sin embargo, no existe evidencia de que la secuencia sea funcional. Las secuencias que igualan con exactitud la secuencia de consenso para cualquiera de los MRE del núcleo o las secuencias de activación hacia el extremo 5' (UASs) de levadura CUP1 no están presentes dentro de los genes tipo MT de maíz (de Framond, FEBS Lett. 290:103-106, 1991 ), Arabidopsis (Zhou y Goldsbrough, Mol. Gen. Genet. 248:318-328, 1995), y algodón (Hudspeth et al., Plant Mol. Biol. 31 :801-705, •• - * '—- rfM^^ uMi 1996), a pesar de la evidencia de que su expresión es modulada por ¡ones metálicos. La UAS de CUP1 se colocó hacia el extremo 5' de un gen reportero y se introdujo en tabaco (Mett et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:4567-4571 , 1993). La transcripción de este gen fue dependiente de la introducción de ACE1 (factor de transcripción de levadura; (de Framond, FEBS Lett. 290:103-106, 1991), Kawashima et al., Euro. J. Biochem. 209:971-976, 1992; y Zhou y Goldsbrough, Mol. Gen. Genet. 248:318-328, 1995), el cual se une a las UAS, lo que indica que el tabaco carece de proteínas que puedan estimular la transcripción a partir de las UAS fúngicas. Los MRE diferentes de aquellos de animales y hongos tienen que ser descritos dentro de los genes del tipo MT. Los estudios sobre los promotores para genes vegetales del tipo MT que utilizan transformación estable han sido limitados. El promotor del gen PsMTA tipo 1 del tipo MT de chícharo dirigió la expresión de GUS en tejidos de raíz de Arabidopsis excepto en el ápice de la raíz (Fordham Skelton et al., Plan Mol. Biol. 34:659-668, 1997). En el algodón, la GUS fusionada al promotor MT1-A mostró la actividad de GUS más elevada en la punta de la raíz (Hudspeth et al., Plant Mol. Biol. 31 :701-705, 1996). Los análisis de expresión de GUS en Arabidopsis transgénico mostró que el promotor del gen LSC54 de Brassica napus se indujo en forma elevada durante la senescencia de la hoja y en respuesta a la lesión y a infección por patógeno (Butt et al., Plant J. 16:209-221 , 1998). La secuencia del promotor del gen B22EL8 de cebada dirigió la expresión de un gen reportero en embriones de cebada pero no fue funcional en tabaco transgénico (Klemsdal et al., Mol. Gen. Genet. _J-_l_m_?_ _t?_ta_ _?t_?_tl_ _m _ll_t?_t_^ 228:9-16, 1991 ). Los datos descritos en la presente invención demuestran que el promotor gPmMTa es activo en el abeto Douglas, pero no expresa GUS a un nivel detectable en tabaco transgénico. Aunque la extinción de gen no se puede excluir, ésta parece poco probable debido a que todas las líneas de 5 tabaco transgénicas fueron afectadas de igual manera. Por lo tanto la ausencia de actividad de GUS detectable podría deberse a una carencia o a un nivel muy bajo de transcripción del gen quimérico promotor gPmMta-uidA. Sin embargo, se predice que, a través de la modificación (es decir, deleción y/o adición) de los elementos de promotor en el promotor dfMTP, se observará 10 expresión en tabaco. Sin embargo, esta expresión podría no ser específica de desarrollo.

IV Alteración de la estructura del promotor A. Modificaciones del promotor de proteína tipo metalotioneína del abeto Douqlas (dfMTP) La estructura de un promotor determinado determina el nivel de expresión de ARNm así como la especificidad de tejido/desarrollo del promotor. Sin embargo, los niveles de expresión y la especificidad de tejido/desarrollo pueden mantenerse cuando se hacen deleciones, sustituciones y/o adiciones a la secuencia del promotor. Por lo tanto el campo de la invención abarca los promotores dfMTP que han sido modificados a través de la incorporación de deleciones, sustituciones y/o adiciones. Sin ^aaimm ?AAm embargo, sin tomar en cuenta el número de mutaciones que se incorporen en el promotor dfMTP, los promotores continúan manteniendo la actividad de promotor de dfMTP, o la actividad de promotor de dfMTP original, como se describió anteriormente. Un método posible para modificar al promotor de dfMTP es insertar elementos de promotor adicionales en la secuencia de promotor. Por ejemplo, el promotor se puede modificar de tal manera que se agregue un motivo de caja E (SEQ ID NO: 1 ), un elemento repetido RY (SEQ ID NO: 2), una región rica en AT (SEQ ID NO: 3), un elemento de núcleo ACGT (SEQ ID NO: 4), un sitio de unión del tipo opaque-2 (SEQ ID NO: 5), un MRE (SEQ ID NO: 21 ); un elemento ERE (SEQ ID NO: 20), un motivo de caja G (SEQ ID NOS: 18 y 19), y/o una región tipo gimnosperma conservada (SEQ ID NOS: 5 y 6). Un experto en la técnica apreciará que se pueden utilizar técnicas de biología molecular estándar para insertar uno o más de estos elementos en la secuencia del promotor. El promotor modificado puede después ser transfectado en forma transitoria en el gimnosperma, en el tejido monocotiledóneo o dicotiledóneo y el tejido probado en cuanto a expresión del transgen. En forma similar, se pueden suprimir uno o más elementos promotores a partir de las secuencias promotoras objetivo. El promotor modificado resultante se puede probar en cuanto a la actividad de transcripción y especificidad de desarrollo. Dada la descripción del promotor de dfMTP en la presente invención, también es posible elaborar ambas adiciones y deleciones y probar la actividad del promotor. Por último, el promotor de dfMTP también puede ser modificado de tal manera que los espacios entre elementos contengan una o más deleciones, inserciones y/o sustituciones. Un experto en la técnica puede utilizar técnicas de biología molecular estándar para insertar uno o más residuos de ácido nucleico adicionales en los espacios entre elementos, suprimir uno o más residuos de ácido nucleico a partir de los espacios entre elementos y/o sustituir una o más de otras secuencias en los espacios entre elementos. Sin embargo, sin tomar en cuenta el número y combinación de inserciones, deleciones y sustituciones, la secuencia continúa mostrando actividad de promotor o actividad de promotor dfMTP original como la provista anteriormente.

B. Métodos para producir promotores del tipo metalotioneína del abeto Douqlas. variantes y mutantes de deleción de los mismos 1. Clonación de secuencias de ácido nucleico que codifican para el promotor dfMTP Provisto con la secuencia de ácido nucleico del promotor (SEQ ID NO: 17), un experto en la técnica apreciará que pueden utilizarse diferentes métodos para aislar el promotor dfMTP del abeto Douglas (SEQ ID NO: 17). Un ejemplo de un método como tal es la reacción en cadena de polimerasa (PCR) (patente E.U.A. No. 4,683,202 para Mullís; y Saiki et al., Science 239: 487-491 , 1988). Una vez aislada, la secuencia del promotor de dfMTP (SEQ ID NO: 17) es útil para controlar la expresión de los transgenes. Cuando se utiliza PCR para aislar una secuencia que codifica para el gen, se puede diseñar un primer iniciador que se dirija al extremo 5'-final de la secuencia, y se puede diseñar un segundo iniciador que se dirija al extremo 3'-final de la secuencia. Estos iniciadores pueden ser utilizados de forma tal que ellos generen copias múltiples de la secuencia del promotor. Las copias se aislan mediante separación en un gel de agarosa. El fragmento de interés después se retira del gel y se liga a un vector apropiado. En forma alternativa, se puede crear el promotor diseñando genéticamente cadenas sintéticas de ADN que se traslapan parcialmente una con otra (Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859-1869, 1981 ; y Matthes et al., EMBO J. 3:801-805, 1984). Las cadenas sintéticas se templan, y se utiliza una ADN polimerasa para llenar las regiones de una sola cadena. La molécula sintética de ADN de doble cadena resultante puede ser clonada en un vector. Para que sean utilizadas como iniciadores y sondas, las secuencias de ácido nucleico pueden contener por lo menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 60 residuos de ácido nucleico contiguos de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 17 o de la cadena complementaria de la molécula mostrada en SEQ ID NO: 17. Las secuencias de ácido nucleico son útiles para realizar protocolos de hibridación, tales como Northern blots o Southern blots tal como se a¿*¿?*iiáißÉ¡ÜW describe en Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed., vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Estos protocolos de hibridación pueden ser utilizados para identificar secuencias de ácido nucleico que son sustancíalmente similares a la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 17. Una hibridación exitosa para tal secuencia indica que la secuencia de ácido nucleico análoga que se hibrida con la sonda de oligonucleótídos comprende por lo menos un fragmento de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 17. En general, las condiciones de hibridación se clasifican en categorías, por ejemplo astringencia muy alta, astringencia alta y astringencia baja. Las condiciones correspondientes a estas categorías para sondas de aproximadamente 600 pb se proveen a continuación. Astringencia muy alta (detecta secuencias que comparten el 90% de identidad de secuencia) Hibridación en 5x SSC a 65°C 16 horas Lavar dos veces en 2x SSC a temp. amb. 15 minutos cada uno Lavar dos veces en 0.2x SSC a 65°C 20 minutos cada uno Astringencia alta (detecta secuencias que comparten el 80% de o más de identidad de secuencia) Hibridación en 3x SSC a 65°C 16 horas Lavar dos veces en 2x SSC a temp. amb. 15 minutos cada uno Lavar dos veces en 0.5x SSC a 55°C 20 minutos cada uno Astringencia baja (detecta secuencias que comparten más del 50% de identidad de secuencia) Hibridación en 3x SSC a 65°C 16 horas Lavar dos veces en 2x SSC a temp. amb. 20 minutos cada uno - ^??^¿? i?át?m? Las secuencias de promotor de dfMTP variantes (SEQ ID NO: 17) se pueden producir mediante técnicas de mutagénesis de ADN estándar, por ejemplo, mutagenesis del iniciador M13. Los detalles de estas técnicas se proveen en Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, Cap. 15, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; y Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley-lnterscience, New York (con actualizaciones periódicas), 1987. Mediante el uso de tales técnicas, se pueden crear variantes que difieren ligeramente de las secuencias de promotor dfMTP descritas en forma específica, aunque aún siguen codificando a un promotor que tiene actividad de promotor. Las moléculas de ADN y la secuencia de nucleótidos que son derivados de aquéllas específicamente descritas en la presente invención y que difieren de aquéllas descritas por la deleción, adición o sustitución de nucleótidos mientras sigan manteniendo su actividad de promotor y/o la actividad de promotor de dfMTP original están abarcadas por esta invención. 2. Transformación Las construcciones de ADN de la invención, que contienen un promotor de dfMTP (SEQ ID NO: 17) enlazadas en forma operable a uno o más transgenes, pueden ser o bien homologas o heterólogas para una célula hospedera. Si es homologa para la célula hospedera, es decir, si el transgen es producido por la célula hospedera en la naturaleza, la construcción se ^^^^??^^HHÉaM ^ puede conectar en forma operable a una secuencia de señal de secreción y/o una secuencia terminadora diferente a la del ambiente natural. En este contexto, el término "homologa" pretende incluir una secuencia de ADNc que codifica para un transgen nativo a la célula hospedera. El término "heteróloga" pretende incluir un transgen que no es expresado por la célula hospedera en la naturaleza. Por lo tanto, la secuencia de ADN puede provenir de un organismo diferente, o está puede ser una secuencia sintélica. Una célula hospedera de conformidad con la invención, en la cual la construcción de ADN o el vector de expresión recombinante de la invención se va introducir, puede ser cualquier célula que pueda controlar la expresión del promotor dfMTP (SEQ ID NO: 17). Tales células incluyen células de bacteria, células de levadura, células fúngicas, células de insectos, células vegetales y otras células eucariontes superiores. Se conocen en la técnica varios métodos para introducir la construcción de ADN en las células hospederas. Por ejemplo, en algunas especies, el plásmido Ti de A. tumefaciens puede ser utilizado para transformar las células hospederas (Gouka et al., Nature Biotech. 6:598-602, 1999). La célula hospedera también puede ser transformada utilizando técnicas de bombardeo de gen (gene blasting) (descrita anteriormente) y tratamientos químicos normales.

IV. EJEMPLOS Se proveen los siguientes ejemplos no limitantes para ilustrar las características particulares de la presente invención. El campo de la presente invención no queda limitado a esas características ejemplificadas.

Materiales y métodos Preparación de ADN qenómico del abeto Douqlas Se utilizaron las agujas de los extremos de las ramas del abeto Douglas para aislar el ADN genómico de alto peso molecular de conformidad con De Verno et al., (De Verno et al., Canadian Forestry Service Publication PI-X-88, 1989) con algunas modificaciones. Se esterilizó la superficie de cincuenta gramos de agujas, se molieron hasta un polvo fino en nitrógeno líquido, y se mezclaron con 400 mL de solución reguladora fría para extracción (Tris-HCl 50 mM, pH 8.0, 5 mM de EDTA, sorbitol 0.35 M, BSA 0.1 %, PEG 10%, espermina 0.1 %, espermidina 0.1 % y ß-mercaptoetanol 0.1 %). La mezcla se filtró a través de manta de cielo y miracloth. La pastilla se recuperó mediante centrifugación a 9000 rpm durante 15 minutos y se volvió a suspender en 50 mL de solución reguladora para lavado (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM EDTA, 0.35 M sorbitol, 0.1 % ß-mercaptoetanol). La solución se mezcló con 10 mL de sarcosil al 5%, 7 mL de NaCI 5M y 5 mL de bromuro de cetiltrimetilamonio al 8.6% (CTAB) en NaCI 0.7 M, y se incubó a 60°C durante 15 minutos. La mezcla se extrajo con cloroformo:alcohol isoamílico (24:1 , v/v). El ADN se precipitó con 2 volúmenes de etanol frío y se colectó mediante centrifugación. La pastilla de ADN se lavó con etanol frío al 70% y se disolvió suavemente en solución reguladora TE.

Construcción de una genoteca qenómica del abeto Douqlas Se construyó una genoteca genómica del abeto Douglas de conformidad con el protocolo para el estuche de vector lambda EMBL3/Sam Hl (Stratagene, La Jolla, CA). En breve, el ADN genómico del abeto Douglas se aisló de las agujas de los extremos de las ramas tal como se describió anteriormente, y se purificó mediante ultracentrifugación a través de un gradiente de CsCl (Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). El ADN se digirió parcialmente con Sau3A\, y los fragmentos de ADN en el intervalo de 9 a 20 kb se purificaron a partir de un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 0.7%. Los fragmentos de ADN seleccionados en cuanto a tamaño se trataron con fosfatasa alcalina de intestino de bovino (CIAP), se ligaron en el sitio de SamHI a la mitad de los brazos de ?EMBL3 de conformidad con las instrucciones del fabricante (Stratagene), y se empacaron in vitro en partículas de fago utilizando el sistema de empaque Gigapack II® (Stratagene). Un título para la genoteca genómica del abeto Douglas almacenada fue 6 x 1010 pfu/mL.

Selección de la qenoteca genómica del abeto Douqlas La genoteca de ADN genómico del abeto Douglas se sembró en placas con células XL1-Blue MRA de E. coli (600 µL de D06oo = 0.5 en MgS04 mM) sobre placas NZY aproximadamente a 5 x 104 pfu por cada placa de 150 x 15 mm. El levantamiento de la placa, la preparación de membranas, la hibridación previa, la hibridación y el lavado de membrana se realizaron utilizando un inserto de ADNc PM2J como una sonda para aislar al gen de proteína del tipo metalotioneína. Después de una selección secundaria, los clones lambda genómicos recombinantes se amplificaron y almacenaron como reservas de fago a 4°C.

Análisis de la secuencia de ADN Se determinaron las secuencias de ADN a partir de ambas cadenas mediante el método de determinación de cadena de didesoxinucleotido utilizando Sequenase™ versión 2 0 (United States Biochemical, Cleveland, OH). Se utilizaron iniciadores comercialmente disponibles y sintetizados a la medida. Para cada reacción, se desnaturalizaron 5 µg de ADN de plásmido agregando 0J volúmenes de NaOH 2M, EDTA 2 mM e incubando 30 minutos a 37°C. La mezcla se neutralizó agregando 0J volúmenes de acetato de sodio 3M a pH 5.2. El ADN se precipitó con dos volúmenes de etanol a -80°C durante 30 minutos. Después de centrifugar, el ADN convertido en pastilla se lavó con etanol a 70% y se almacenó a -20°C hasta tMd*-^ -• • uso posterior. El templado del iniciador a la plantilla de ADN se realizó en 10 µL (40 mM Tris-HCl pH 7.5, 20 mM MgCI2> 50 mM NaCI, 10% DMSO, 1 pmol de iniciador) a 37°C durante 30 minutos. Después de templar, se agregaron 3 µM de cada uno de dGTP, dCTP, y dTTP, 10 mM DTT, 5 µCi de (a-35S) dATP 5 (1000 Ci/mmol, DuPont), y 1 unidad de polimerasa de ADN Sequenase™ versión 2.0 T7 ADN. La mezcla se incubó durante 2-5 minutos a temperatura ambiente. Se agregaron alícuotas de 3.5 µL de la mezcla a cuatro tubos que contenían 2.5 µL de la reacción de terminación respecliva (G, A, T o C), conteniendo cada una 80 µM de cada uno de dGTP, dATP, dTTP y dCTP, 50 mM NaCI, y 8 µM de cualquiera de ddGTP, ddATP, ddTTP or ddGTP. Los cuatro tubos se incubaron a 37°C durante 5 minutos. Las reacciones se detuvieron con 4 µL de solución de detención (95% de formamida, 20 mM de EDTA, 0.5% de azul de bromofenol y 0.5% de xilencianol). La reacción de secuenciamiento se calentó a 80°C durante dos minutos y se cargaron 2.5 µL de cada reacción sobre un gel de secuenciamiento (6% acrilamida/bis- acrilamida (19:1 , p/p), 7 M de urea, 1X de solución reguladora en gel de tolerancia a glicerol, 1 % de persulfato de amonio, 0.025% de TEMED). La electroforesis se realizó a 50 wats en solución reguladora en gel de tolerancia a glicerol (0J M de Tris, 30 mM de taurina, 0.5 mM de EDTA). Después de la electroforesis, el gel se transfirió a papel Whatman (Maidstone, England) 3MM y se secó al vacío durante 2 horas a 80°C. El gel se expuso a película X-Omat (Kodak, Rochester, N.Y.) a temperatura ambiente durante un período que varía desde toda la noche hasta 3 días.

^^^M^^iüiK^^M *-— - fc ' " ~ ^^¿_^_^i_ Transformación de la planta Las semillas inmaduras correspondientes a etapas de desarrollo inicial y medio del cotiledón se recogieron en días separados. Las esterilizó la superficie de las semillas con hipoclorito de sodio al 1% durante 5 minutos y 5 se enjuagaron 3 veces en agua esterilizada antes de separar los megagametocitos y los embriones cigóticos. Se utilizaron brotes de 4 semanas de edad, que se germinaron en forma aséptica, como la fuente de agujas y raíces. Todas las muestras se colocaron en medio BM-3 (Gupta y Pullman, patente E.U.A. No. 5,036,007, 1991 ) en una caja Petri de 60 mm de 10 diámetro y se utilizaron para el bombardeo de partículas.

Construcción de los vectores de expresión de GUS Se construyeron construcciones quiméricas de promotor de gen- GUS del abeto Douglas tal como se muestra en las figuras 30 y 38. Para la construcción de pMTP0.9-GUS, el fragmento de 0.9 kb de la secuencia de flanqueo 5' del gen gPmMTa se amplificó mediante PCR a partir del plásmido gPMMTa-Exo1.2 utilizando un par de iniciadores, creando sitios Pst\/Sal\ en el extremo 5' y sitios X£>a//ßamHI en el extremo 3' del fragmento de promotor. Después de digestión parcial con Xbal/Pst\, el producto de 0.96 kb proveniente de PCR se clonó en el vector pBI221 (Clontech, Palo Alto, California) en lugar del fragmento Xbal/Pst\ de la región de promotor 35S CaMV. Para la construcción de pMTP0.2, se digirió parcialmente el plásmido pMTP0.9 con Hind\\\IXba\, y el fragmento de 0.28 kb aislado se clonó en el •Ba^iíil vector pBI221 , con lo cual se reemplaza el fragmento Hind\\\IXba\ de la región de promotor 35S CaMV. Se utilizó PCR para crear las construcciones promotor-deleción, pMTPO.7 (SEQ ID NO:24) y pMTPO.5 (SEQ ID NO:25), seleccionando los iniciadores hacia el extremo 5'. En ambos casos, los iniciadores hacia el extremo 5' (5'SSP21 y 5'SSP22) contenían secuencias que crearon un sitio Sal\ en el extremo 5' de la región de promotor, y el iniciador hacia el extremo 3' (3'-iniciador) contenía secuencias que crearon un sitio Xba\IBam \ en el extremo 3' de la región de promotor. Después de digerir con Sal\IXba\, cada producto de PCR se clonó en el vector pBI101 que carece de un promotor. Los plásmidos resultantes se digirieron con Hindlll/Xbal, y los fragmentos de promotor liberados se clonaron en el vector pBI221 en lugar del promotor 35S CaMV. Para la construcción de p2SSP1.2, se amplificó mediante PCR un fragmento de 1 J6 kb de la secuencia de flanqueo 5' del gen gPM2S1 a partir del plásmido gPM2S1-EK .3 utilizando un par de iniciadores que contienen los sitios de reconocimiento Hindlll y Xbal en el extremo 5' y el extremo 3' del fragmento de promotor, respectivamente. El producto de PCR se clonó entre los sitios HindIll yXbal de pBI 221 , con lo cual se reemplaza al promotor 35S CaMV. Para construir los genes quiméricos que se utilizan en tabaco transformado en forma estable, cada uno de los cuatro fragmentos de promotor aislados del plásmido recombinante pBI221 se clonó entre los sitios , . ...» * % í tíA*- m .

Hindlll y Xbal del vector binario pBI121 (Clontech), dando origen a las construcciones quiméricas pMTP121-0.9 (SEQ ID NO: 22), pMTP121-0.7 (SEQ ID NO: 23), pMTP121-0.5 (SEQ ID NO: 24), y pMTP121-.02 (SEQ ID NO: 25). Cada una de estas construcciones contiene una serie de deleciones del promotor del gen gPmMTa.

Bombardeo de partículas El bombardeo de partículas se realizó con el sistema de suministro de partículas PDS-1000/He (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) de conformidad con las instrucciones provistas por el fabricante. El ADN se precipitó sobre partículas de oro (1.5-3.0 µm de diámetro; Aldrich Chemicals) tal como se describe por Klein et al. (Klein et al., Proc. Nat. Acad. Sci USA 85:4305-4309, 1988). Se preparó una suspensión de oro (60 mg/mL) en glicerol al 50%. Una alícuota de 50 microlitros de la suspensión se transfirió a un tubo de microcentrifuga al cual se agregaron 8 µg de ADN de promotor-GUS, 50 µL de CaCI2 2.5 M y 20 µL de espermidina 0J M. Todas las adiciones se realizaron mientras se sometía el tubo en forma continua a acción de remolino. Se dejó que las partículas de oro sedimentaran, y se convirtieron en pastilla mediante una centrifugación breve. El sobrenadante se desecho y se trató por separado con 140 µL de etanol al 70% frío y 140 µL de etanol absoluto frío. Las fases líquidas se eliminaron inmediatamente. Las partículas de oro revestidas con ADN se volvieron a suspender en 100 µL de ' ^— -^- " etanol absoluto y se suministraron alícuotas de 10 µL (0.8 µg de ADN asociado con 0.3 mg de partículas de oro) a cada disco y se secaron al aire. Se utilizaron los siguientes parámetros para cada bombardeo: la distancia del espacio entre la membrana de ruptura y el disco volador fue de 0.6 cm, el disco viajó 1.6 cm antes de chocar con una malla de detención de acero, y los tejidos objetivo se colocaron 6.0 cm a partir de la pantalla de detención y se bombardearon una vez a 91.4 kg/cm2 o 109.0 kg/cm2. La cámara de la muestra se evacuó hasta 508 mm de mercurio y el tubo de aceleración de gas se presurizó con una presión de gas de helio seleccionada. Cada experimento se repitió tres a cuatro veces, en días diferentes, y con lotes nuevos recién preparados de partículas de oro revestidas con ADN. Los datos indicados son las medias de los resultados obtenidos a partir de estas repeticiones.

Transformación de tabaco Cada uno de los plásmidos recombinantes pBIH 21 se transfirió de células DH5a de E. coli a Agrobacterium tumefaciens. Se esterilizaron las superficies de hojas jóvenes de Nicotiana tabacum cv. Xanthi con hipoclorito de sodio al 1 % (v/v) durante 2-5 minutos, y se enjuagaron completamente con agua estéril. Los discos foliares se cultivaron conjuntamente con A. tumefaciens, cultivado durante toda la noche, se transíieron a medio de Murashige y Skoog (MS) y se incubaron durante 2 días a 25°C. Los discos foliares co-cultivados fueron después transferidos a un medio inductor de >«Mu¿«u?A? brote (medio MS que contiene 0.01 µg/mL de NAA (ácido naftalenacético), 2.0 µg/mL de 6-BA (benciladenina), 100 µg/mL de kanamicina y 200 µg/mL de carbenicilina). Los brotes jóvenes se transfieron a un medio inductor de raíz (medio MS que contiene 100 µg/mL de kanamicina y 200 µg/mL de carbenicilina). Las plantas regeneradas de evaluaron en cuanto a la presencia de construcciones de gen quimérico utilizando amplificación de PCR del ADN genómico. Las plantas de tabaco transgénicas se transfirieron después al suelo, y se recogieron las semillas en desarrollo.

Prueba histoquímica para la expresión transitoria de GUS Los explantes bombardeados permanecieron sobre las mismas placas durante 24-48 horas antes de que estos se sometieran a la prueba de GUS (Jefferson et al., EMBO J. 6:3901-3907,1987). Los tejidos se sumergieron en 500 µL de solución de tinción X-gluc (X-gluc 2 mM, solución reguladora de fosfato de sodio 50 M, pH 7.0, EDTA 10 mM, ferricianuro de potasio 0.5 mM, ferrocianuro de potasio 0.5 mM y Tritón X-100 al 0.1 %) durante toda la noche a 37°C. Se contó el número de manchas de color azul y se fotografiaron bajo un microscopio de disección estereoscópico. Habiendo ¡lustrado y descrito los principios de la invención en modalidades y ejemplos múltiples, deberá ser evidente a los expertos en la técnica que la invención puede ser modificada en arreglo y detalle sin alejarse de tales principios. Por lo tanto, la invención incluye todas las modificaciones que surgan dentro del alcance y campo de las siguientes reivindicaciones.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Misra, Santosh <120> Promotor de genes de plantas, y métodos para usar el mismo <130> 54358 <140> <141> <160>28 <170>PatentlnVer.2.1 <210> 1 <211>6 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> <221> variación <222> (3)..(4) <223> N = A, C, G, o T <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: ELEMENTO PROMOTOR <400> 1 canntg <210> 2 <211> 6 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: ELEMENTO PROMOTOR <400> 2 gcatgc <210> 3 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: ELEMENTO PROMOTOR <400> 3 aaaaattaat atttaatgtt aatattaat 29 <210> 4 <211 > 4 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: ELEMENTO PROMOTOR <400> 4 acgt <210>5 <211>9 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> <221> variación <222> (3).. (4) <223>N=A, C, G, yT <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: ELEMENTO PROMOTOR <400>5 ttnntcatc <210>6 <211> 13 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: ELEMENTO PROMOTOR <400> 6 aagattcctc taa 13 <210> 7 10 <211> 10 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> 15 <223> Descripción de Secuencia Artificial: ELEMENTO PROMOTOR <400> 7 gttgttgaga 10 <210> 8 <211> 4 -*""-"*«-•- -*«- <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: ELEMENTO PROMOTOR <400> 8 tata <210> 9 <211> 4 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: ELEMENTO PROMOTOR <400> 9 caat 4 <210> 10 <211> 2322 <212> ADN <213> Pseudotsuga menziesii <400> 10 cccctagaga gttctgaatg atccagaaag tttagtatga aaatgagcaa tcccacaatt 60 cttccaaaaa aaaatgaagg gataagggat ggtttggatg gcaagggatt tcaacattgg 120 aagatccttt gaggttttta tttggaagat gatttgaagt tttcactaaa taattgatat 180 gatgataatg acaaagataa tagttactac attgaaacca attttagttt aataatttct 240 taaaaaaata taagccccaa tctaattttg aaatttgaaa gatatatgat tattcaacct 300 aaagagataa gataagatcc aactccttcg agtgcttttg gtgacataaa tatagggttt 360 atccatttgc gacgatgata tacaatggac gatccagaaa gttccctata aaatgaggat 420 ttcacgaaag aatcccattg tacggctcag gatttcgaca ttgaaagatc cattaatgag 480 atgcttggca ggggctcagc actgaatgcg ccctgtccca cttcgaagag aitccaccgg 540 ccgtcttgcg cctttcattg ttgttttgga ttctcatggc gggtctgtgg acaatacctg 600 cagcttcggc catctataat tgccacggaa ggctgctctt cttctcaaca atcaaagcaa 660 aagcaaagct tattctgtgt attgcaattt ccaacgttga aagatccatt attgagatgc 720 cctgtcccac ttcgatgaga ttccaccacg tgtcttgcgc ctttcattgt tgtttggatt 780 ctaatggcgg gtctgtgggc cataccttca gcttcggcca cttataaatg ccacggaagg 840 ctgctcttct tctcaacaat caaagcaaaa tcagagagaa ttctgtgtat tgcggtttcc 900 cgacgtttgt atcagtttct tgtgtttgtt aacgatctgc aaacatgtct tctgacggca 960 aagactgtgg ctgtgccgac ccaacccaat gcgagtaagt cctctcttta tttcaggttt 1020 ^»a¿A. cctcctcacc tcaattcatt atcacgatcc tgtaaattat ttcagttttt aatggctgat 1080 atcagttttt gtgtgtgtta ctgctattaa taatggcagc aagaagggca actccttggg 1140 agtggagatg gttgaaacca gctacgacta caacatgaac atgaggtgag ttttgggcat 1200 tatttgtttt aaagattgaa acatgcaatg aatctaatct ggtttccaat tttgcgtctg 1260 cagcttcggc ttcgactacg agatggaaac tgtggctgct gagaacggct gcaaatccgg 1320 agcaagctcc aagtactcca accgctgcaa ctgaattatg gaggacataa aagacttgct 1380 acatattata tatatagaaa ataagtgttg tgtgatgctg agggatctca cgatgttatt 1440 gatgtcatgt ctggtgttgt tattctaccc gtgtcactgt tgtaatgccg gccttcctct 1500 tttattaact atgatatgat attttagagt aatttgtgtt atatgattat gtgcttttct 1560 atcttattaa ctatgttatt agtccctgct ttgaggagtt ggcagggact ctatgaaagg 1620 gcttgcaatc gtttcattag tcctgcacgc aaatcaaaga tatatatttt tattaglcct 1680 gcacgcaaat taaagatatt tttttttttg aatgtaggga ctgtatgaaa gggcttgtag 1740 tggtttcatt agtcctgtac acaaaccaaa gatatatatt tcacatgtat cctaagtctt 1800 tactcacctt aaagttatta tgacatgtat actaagttta aagcactatg tcacacgtat 1860 ctagttagtt ttactattta ccatcaaaag ttgagtcttg ttggcctggt atcgaggcaa 1920 aggcaagaaa gggcagctat actttcatac atttgaaata ttaattcatg gtatcgaaca 1980 tatttgaaat attaattcat ggtattgaac atatgttata ctttttgaat aatgctaaca 2040 atcctcgtag cattacttcc cttacattta gtatgattgc aaatcaaaaa ttatagtatg 2100 attgtaacta aaaaattata ttctatcaat gcatgtagca caagccgcct tcacacctgc 2160 caagaaactt ctgcatgcaa cacatgcctt cttcacacct accaagaaac ttctaggtgt 2220 taatttgctc aagctagttc tacgtgtaga tttacacaag ctgaaacaat gcagtgtgca 2280 tgccttatgt taacacctgc ctagaacttc tactaggaat tc 2322 <210> 11 <211> 207 <212> ADN <213> Pseudotsuga menziesii <400> 11 atgtcttctg acggcaaaga ctgtggctgt gccgacccaa cccaatgcga caagaagggc 60 aactccttgg gagtggagat ggttgaaacc agctacgact acaacatgaa catgagcttc 120 ggcttcgact acgagatgga aactgtggct gctgagaacg gctgcaaatc cggagcaagc 180 tccaagtact ccaaccgctg caactga 207 <210> 12 <211> 968 <212> ADN <213> Pseudotsuga menziesii <220> <221> promotor <222>(1 ) (856) <400> 12 attatggagg acataaaaga cttgctacat attatatata tagaaaataa gtgttgtgtg 60 atgctgaggg atctcacgat gttattgatg tcatgtctgg tgttgttatt ctacccgtgt 120 cactgttgta atgccggcct tcctctttta ttaactatga tatgatattt tagagtaatt 180 tgtgttatat gattatgtgc ttttctatct tattaactat gttattagtc cctgctttga 240 ggagttggca gggactctat gaaagggctt gcaatcgttt cattagtcct gcacgcaaat 300 caaagatata tatttttatt agtcctgcac gcaaattaaa gatatttttt tttttgaatg 360 tagggactgt atgaaagggc ttgtagtggt ttcattagtc ctgtacacaa accaaagata 420 tatatttcac atgtatccta agtctttact caccttaaag ttattatgac atgtatacta 480 agtttaaagc actatgtcac acgtatctag ttagttttac tatttaccat caaaagttga 540 gtcttgttgg cctggtatcg aggcaaaggc aagaaagggc agctatactt tcatacattt 600 gaaatattaa ttcatggtat cgaacatatt tgaaatatta attcatggta ttgaacatat 660 gttatacttt ttgaataatg ctaacaatcc tcgtagcatt acttccctta catttagtat 720 gattgcaaat caaaaattat agtatgattg taactaaaaa attatattct atcaatgcat 780 gtagcacaag ccgccttcac acctgccaag aaacttctgc atgcaacaca tgccttcttc 840 acacctacca agaaacttct aggtgttaat ttgctcaagc tagttctacg tgtagattta 900 cacaagctga aacaatgcag tgtgcatgcc ttatgttaac acctgcctag aacttctact 960 aggaattc 968 <210> 13 <211> 68 <212> PRT <213> Pseudotsuga menziesii <400> 13 Met Ser Ser Asp Gly Lys Asp Cys Gly Cys Ala Asp Pro Thr Gln Cys 1 5 10 15 Asp Lys Lys Gly Asn Ser Leu Gly Val Glu Met Val Glu Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Tyr Asn Met Asn Met Ser Phe Gly Phe Asp Tyr Glu Met Glu Thr 35 40 45 Val Ala Ala Glu Asn Gly Cys Lys Ser Gly Ala Ser Ser Lys Tyr Ser 50 55 60 Asn Arg Cys Asn 65 <210> 14 <211> 9 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: ELEMENTO PROMOTOR <400> 14 ttcgtcatc 9 <210>15 <211>9 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: ELEMENTO PROMOTOR <400>15 tttatcatc <210> 16 <211> 13 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: ELEMENTO PROMOTOR <400> 16 cgaaagagca atg 13 <210> 17 <211> 853 <212> ADN <213> Pseudotsuga menziesii <400> 17 cccctagaga gttctgaatg atccagaaag tttagtatga aaatgagcaa tcccacaatt 60 cttccaaaaa aaaatgaagg gataagggat ggtttggatg gcaagggatt tcaacattgg 120 aagatccttt gaggttttta tttggaagat gatttgaagt tttcactaaa taattgatat 180 gatgataatg acaaagataa tagttactac attgaaacca attttagttt aataatttct 240 taaaaaaata taagccccaa tctaattttg aaatttgaaa gatatatgat tattcaacct 300 aaagagataa gataagatcc aactccttcg agtgcttttg gtgacataaa tatagggttt 360 atccatttgc gacgatgata tacaatggac gatccagaaa gttccctata aaatgaggat 420 ttcacgaaag aatcccattg tacggctcag gatttcgaca ttgaaagatc cattaatgag 480 atgcttggca ggggctcagc actgaatgcg ccctgtccca cttcgaagag aitccaccgg 540 ccgtcttgcg cctttcattg ttgttttgga ttctcatggc gggtctgtgg acaatacctg 600 cagcttcggc catctataat tgccacggaa ggctgctctt cttctcaaca atcaaagcaa 660 aagcaaagct tattctgtgt attgcaattt ccaacgttga aagatccatt attgagatgc 720 cctgtcccac ttcgatgaga ttccaccacg tgtcttgcgc ctttcattgt tgtttggatt 780 ^ ? ctaatggcgg gtctgtgggc cataccttca gcttcggcca cttataaatg ccacggaagg 840 ctgctcttct tet 853 <210> 18 <211> 6 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: ELEMENTO PROMOTOR <400> 18 aacgtt <210> 19 <211 > 6 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: ELEMENTO PROMOTOR <400> 19 cacgtg <210>20 <211>8 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: ELEMENTO PROMOTOR <220> <221> variación <222>(1)..(8) <223> W = A o T <400> 20 awttcaaa 8 <210> 21 <211> 7 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> <221> variación <222>(1)..(7) <223> n = a, t, c, o g 10 <220> <221> variación <222>(1)..(7) <223> r = g o a 15 <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: ELEMENTO PROMOTOR <400> 21 tgcrcnc ^ÍMr¿b??é ¿ <210> 22 <211> 944 <212> ADN <213> Pseudotsuga menziesii <400> 22 cccctagaga gttctgaatg atccagaaag tttagtatga aaatgagcaa tcccacaatt 60 cttccaaaaa aaaatgaagg gataagggat ggtttggatg gcaagggatt tcaacattgg 120 aagatccttt gaggttttta tttggaagat gatttgaagt tttcactaaa taattgatat 180 gatgataatg acaaagataa tagttactac attgaaacca attttagttt aataatttct 240 taaaaaaata taagccccaa tctaattttg aaatttgaaa gatatatgat tattcaacct 300 aaagagataa gataagatcc aactccttcg agtgcttttg gtgacataaa tatagggttt 360 atccatttgc gacgatgata tacaatggac gatccagaaa gttccctata aaatgaggat 420 ttcacgaaag aatcccattg tacggctcag gatttcgaca ttgaaagatc cattaatgag 480 atgcttggca ggggctcagc actgaatgcg ccctgtccca cttcgaagag attccaccgg 540 ccgtcttgcg cctttcattg ttgttttgga ttctcatggc gggtctgtgg acaatacctg 600 cagcttcggc catctataat tgccacggaa ggctgctctt cttctcaaca atcaaagcaa 660 aagcaaagct tattctgtgt attgcaattt ccaacgttga aagatccatt attgagatgc 720 cctgtcccac ttcgatgaga ttccaccacg tgtcttgcgc ctttcattgt tgtttggatt 780 ctaatggcgg gtctgtgggc cataccttca gcttcggcca cttataaatg ccacggaagg 840 ctgctcttct tctcaacaat caaagcaaaa tcagagagaa ttctgtgtat tgcggtttcc 900 cgacgtttgt atcagtttct tgtgtttgtt aacgatctgc aaac 944 . . . ... . .... .— i . —. .. ,,.. -.- , r | , ,t 1 | - t l t " Ai' l í-fP <210> 23 <21 1 > 765 <212> ADN <213> Pseudotsuga menziesii 5 <400> 23 tgatgataat gacaaagata atagttacta cattgaaacc aattttagtt taataatttc 60 ttaaaaaaat ataagcccca atctaatttt gaaatttgaa agatatatga ttattcaacc 120 taaagagata agataagatc caactccttc gagtgctttt ggtgacataa atatagggtt 180 tatccatttg cgacgatgat atacaatgga cgatccagaa agttccctat aaaatgagga 240 tttcacgaaa gaatcccatt gtacggctca ggatttcgac attgaaagat ccattaatga 300 gatgcttggc aggggctcag cactgaatgc gccctgtccc acttcgaaga gattccaccg 360 gccgtcttgc gcctttcatt gttgttttgg attctcatgg cgggtctgtg gacaatacct 420 gcagcttcgg ccatctataa ttgccacgga aggctgctct tcttctcaac aatcaaagca 480 aaagcaaagc ttattctgtg tattgcaatt tccaacgttg aaagatccat tattgagatg 540 ccctgtccca cttcgatgag attccaccac gtgtcttgcg cctttcattg ttgtttggat 600 tctaatggcg ggtctgtggg ccataccttc agcttcggcc acttataaat gccacggaag 660 gctgctcttc ttctcaacaa tcaaagcaaa atcagagaga attctgtgta ttgcggtttc 720 ccgacgtttg tatcagtttc ttgtgtttgt taacgatctg caaac 765 <210> 24 <211> 547 <212> ADN <213> Pseudotsuga menziesii <400> 24 aaagttccct ataaaatgag gatttcacga aagaatccca ttgtacggct caggatttcg 60 acattgaaag atccattaat gagatgcttg gcaggggctc agcactgaat gcgccctgtc 120 ccacttcgaa gagattccac cggccgtctt gcgcctttca ttgttgtttt ggattctcat 180 ggcgggtctg tggacaatac ctgcagcttc ggccatctat aattgccacg gaaggctgct 240 cttcttctca acaatcaaag caaaagcaaa gcttattctg tgtattgcaa tttccaacgt 300 tgaaagatcc attattgaga tgccctgtcc cacttcgatg agattccacc acgtgtcttg 360 cgcctttcat tgttgtttgg attctaatgg cgggtctgtg ggccatacct tcagcttcgg 420 ccacttataa atgccacgga aggctgctct tcttctcaac aatcaaagca aaatcagaga 480 gaattctgtg tattgcggtt tcccgacgtt tgtatcagtt tcttgtgttt gttaacgatc 540 tgcaaac 547 <210> 25 <211> 278 <212> ADN <213> Pseudotsuga menziesii <400> 25 agcttattct gtgtattgca atttccaacg ttgaaagatc cattattgag atgccctgtc 60 ccacttcgat gagattccac cacgtgtctt gcgcctttca ttgttgtttg gattctaatg 120 gcgggtctgt gggccatacc ttcagcttcg gccacttata aatgccacgg aaggctgctc 180 ttcttctcaa caatcaaagc aaaatcagag agaattctgt gtattgcggt ttcccgacgt 240 ttgtatcagt ttcttgtgtt tgttaacgat ctgcaaac 278 <210> 26 <211> 150 <212> ADN <213> Pseudotsuga menziesii <400> 26 tgtcccactt cgaagagatt ccaccggccg tcttgcgcct ttcattgttg ttttggattc 60 tcatggcggg tctgtggaca atacctgcag cttcggccat ctataattgc cacggaaggc 120 tgctcttctt ctcaacaatc aaagcaaaag 150 <210> 27 <211 > 150 <212> ADN <213> Pseudotsuga menziesii <400> 27 ' *- -«•--' tgtcccactt cgatgagatt ccaccacgtg tcttgcgcct ttcattgttg tttggattct 60 aatggcgggt ctgtgggcca taccttcagc ttcggccact tataaatgcc acggaaggct 120 gctcttcttc tcaacaatca aagcaaaatc 150 <210> 28 <211 > 19 <212> ADN <213> Pseudotsuga menziesii <400> 28 attgcaattt ccaacgttg 19

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un promotor recombinante, que comprende una secuencia de ácido nucleico que se selecciona del grupo que consiste de: a) las secuencias de ácido nucleico mostradas en SEQ ID NOS: 17, 22, 23, 24 y 25; b) una secuencia de ácido nucleico que comparte por lo menos el 50% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de (a); y c) una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos 20 residuos de ácido nucleico consecutivos de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de (a), caracterizado porque el promotor puede activar la expresión de un transgen unido en forma operable al promotor.

2.- El promotor recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 17.

3.- El promotor recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 22.

4.- El promotor recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 23.

5.- El promotor recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 24.

6.- El promotor recombinante de conformidad con la 5 reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 25.

7.- Un vector, que comprende un promotor recombinante de conformidad con la reivindicación 1.

8.- Una célula hospedera, que comprende un vector de 10 conformidad con la reivindicación 7.

9.- Una planta transgénica, que comprende una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 8.

10.- Un transgen, que comprende un promotor de conformidad con la reivindicación 1 y por lo menos un ORF unido en forma operable al 15 promotor.

11.- Un vector, que comprende un transgen de conformidad con la reivindicación 10.

12.- Una célula vegetal, que comprende un transgen de conformidad con la reivindicación 10. 20

13.- El transgen de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el ORF codifica para un péptido catiónico.

14.- La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque la célula vegetal se obtiene a partir de plantas - **" • ^^^^^^& ..... ....... . . j .am^ seleccionadas del grupo que consiste de maíz, trigo, arroz, mijo, tabaco, sorgo, centeno, cebada, brassica, girasol, algas marinas, lemma, avena, frijol de soya, algodón, leguminosas, colza/canola, alfalfa, lino, girasol, cártamo, brassica, algodón, lino, cacahuate, y trébol; lechuga, jitomate, cucurbitáceas, mandioca, papa, zanahoria, rábano, chícharo, lenteja, col, coliflor, brócoli, col de Bruselas, pimientos y otros vegetales; cítricos, manzanas, peras, duraznos, chabacanos, nueces y otros árboles frutales; orquídeas, claveles, rosas y otras flores; cacao, álamo, olmos y otros árboles deciduos; pino, abeto Douglas, pícea y otras coniferas; pastos para césped; cacao; y árboles de hule y otros miembros del género Hevea.

15.- Un método para expresar por lo menos una proteína en una célula hospedera, que comprende: proveer un transgen, que comprende un ORF y un promotor recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ; introducir el transgen en una célula hospedera; y permitir que la célula hospedera produzca una proteína a partir de ORF.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque la célula hospedera es una célula hospedera de vegetal.

17.- Una proteína, expresada de conformidad con el método de la reivindicación 15.

18.- La proteína de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque la proteína es un péptido catiónico.

19.- El promotor recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el promotor es específico de desarrollo.

20.- El promotor de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el promotor se induce con etileno o un metal.

21.- El promotor recombinante de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el promotor se puede expresar en tejido gametofítico.

22.- Un promotor recombinante, que comprende por lo menos 8 elementos de promotor que se seleccionan del grupo que consiste de motivos de caja E (SEQ ID NO: 1 ), elementos ERE (SEQ ID NO: 20), regiones ricas en AT (SEQ ID NO: 3), elementos MRE (SEQ ID NO: 21), elementos del núcleo ACGT (SEQ ID NO: 4), y duplicados de los mismos, caracterizado además porque el promotor presenta actividad de promotor.

23.- El promotor recombinante de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el promotor comprende por lo menos 10 elementos de promotor.

24.- El promotor recombinante de conformidad con la reivindicación 22, que comprende los siguientes elementos de promotor: elemento 3'-ERE (SEQ ID NO: 20), región rica en AT (SEQ ID NO: 3), elemento ERE (SEQ ID NO: 20), elemento ERE (SEQ ID NO: 20), motivo de caja E (SEQ ID NO: 1 ), elemento MRE (SEQ ID NO: 21 ), elemento de núcleo ACGT (SEQ ID NO: 4), elemento de núcleo ACGT (SEQ ID NO: 4) y elemento de núcleo ACGT (SEQ ID NO: 4)-5'.

25.- Un vector, que comprende al promotor de conformidad con la reivindicación 22 unido en forma operable a un ORF.

26.- Una célula hospedera, que comprende un vector de conformidad con la reivindicación 25.

27.- Una planta transgénica, que comprende un vector de conformidad con la reivindicación 25.

28.- La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 27, que se selecciona a parir del grupo que consiste de maíz, trigo, arroz, mijo, tabaco, sorgo, centeno, cebada, brassica, girasol, algas marinas, lemma, avena, frijol de soya, algodón, leguminosas, colza/canola, alfalfa, lino, girasol, cártamo, brassica, algodón, lino, cacahuate, y trébol; lechuga, jitomate, cucurbitáceas, mandioca, papa, zanahoria, rábano, chícharo, lenteja, col, coliflor, brócoli, col de Bruselas, pimientos y otros vegetales; cítricos, manzanas, peras, duraznos, chabacanos, nueces y otros árboles frutales; orquídeas, claveles, rosas y otras flores; cacao, álamo, olmos y otros árboles deciduos; pino, abeto Douglas, pícea y otras coniferas; pastos para césped; cacao; y árboles de hule y otros miembros del género Hevea.

29.- El vector de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque el ORF codifica para un péptido catiónico. J_^4¿-ÉÍÉI^?>