MXPA00002755A - Promotor de planta hibrida sintetica - Google Patents

Abstract

La presente invención estádirigida a un promotor híbrido sintético compuesto de segmentos polinucleótidos derivados de los promotores del gen E8 y E4. El promotor híbrido tiene la capacidad de proporcionar una expresión de alto nivel de los genes heterólogos, particularmente en fruta transformada. Las construcciones de ADN que contiene el promotor E8-E4 enlazado en forma operable a un gen SAMasa heterólogo, son efectivas para conferir un fenotipo de maduración retrasada para una fruta transformada.

Description

PROMOTOR DE PLANTA HÍBRIDA SINTÉTICA Campo del Invento La presente invención se refiere a un promotor híbrido sintético E8-E4, compuesto de segmentos polinucleótidos derivados de los genes del tomate E8 y tomate E4 y para construcciones de ADN, genes quiméricos, vectores, equipos y métodos de transformación que emplean el promotor.

Referencias Adams, D.O., y Yang, S.F., Plant Physiology 70: 117-123 (1977). Ausubel, FM., y asociados, en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, Inc., Media, PA (1992). Ayub, R., y asociados, Nature Biotechnology 14:862-866 (1996). Balague, C, y asociados, Eur. J. Biochem. 212:27-34 (1993). Balazs, E., y asociados, Gene 19(3) :239-249 (1982). Becker, D., y asociados, Plant Mol. Bio. 20:1195-1197 (1997). Bellini, C, y asociados, Bio/Technology 7(5): 503-508 (1989). Brunke, K.J. and Wilson, S.L., Publicación de Patente Europea No. 0 559 603 A2, publicada el 08 de Septiembre de 1993. Comai, L., y Coning, A.J., Patente Norteamericana No. 5,187,267, emitida el 16 de Febrero de 1993. Cordes, S., y asociados, The Plant Cell 1:1025-1034 (1989). Coupe, S.A. and Deikman, J., The Plant Journal 11(6): 1207-1218 (1997).

Dayhoff, M. O , en el ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE Vol. 5 de National Biomedical Research Foundation, págs. 101-110 y Sup. 2, Vol. 5 pags. 1-10 (1972). Deikman, J., y asociados Plant Physiol. (100(4): 2013-2017 (1992) Deikman, J. And Fischer, R.L., EMBO J. 7:3315-3320 (1988). Dong, J. Z., y asociados, Bio/Technology 9:858-863 (1991 ). Fang, G., and Grumet, R., Plant Cell Rep. 9:160-164 (1990). Fraley, R., y asociados, Patente Norteamericana No. 5,352,605, emitida el 4 de Octubre de 1994. Gonsalves, C, y asociados, J. Amer, Soc. Hort. Sci. 119:345-355 (1994).

Good, X., y asociados, Plant Mol. Biol. 26:781-790 (1994). Guilley, H., y asociados, Cell 30(3):763-773 (1982). Hamilton, AJ., y asociados, Nature 346:284-287 (1990). Hood, E, y asociados, Transgenic Research 2:208-218 (1993). Hooykaas, P.J.J., y Schilperoot, R.A., en TRENDS IN BIOCHEMICAL SCIENCES, International Union of Biochemistry and Elsevier Science Publishers, v. 10(8):307-309 (1985). Houck, C.M. and Pear, J.R., Patente Norteamericana No. 4,943,674, emitida el 24 Julio de 1990. Jefferson, R.A., Plant Mol. Biol. Rep. 5:387 (1987b). Jefferson, R.A. y asociados, EMBO J. 6:3901 (1987 a) Jefferson, R .A., y asociados, EMBO J. 6:3901 (1987 a). Jefferson, R.a., Plant Mol. Biol. Rep. 5:387(1987b). Klee, H.J., y asociados, Plant Cell 3:1187-1193 (1991). Klein, T.M., y asociados, PNAS USA 85(22): 8502-8505 (1988).

Knessl, M.L. and Deikman, J., Plant Physiology 112:537-547 (1996). Kramer, M.G., y asociados, en BIOLQGY & BIOTECHNOLOGY OF THE PLANT HORMONE ETHYLENE, Kluwer Academic Publishers, The Netherlands (1996). Laemmli, E.K., Nature 227:680-685 (1970). Leisner, S.M. and Gelvin, S.B , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85(8): 2553-2557 (1988). Lin, E., y asociados, Plant Mol. Bio. 23:489-499 (1993). Lincoln, J.E., y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. US. A., 84:2793-2797 (1987). Lincoln, J.E. y Fischer, R.L, Mol. Gen. Genet. 212:71-75 (1988). Maniatis, T., y asociados, en MOLECULAR CLONING: A. LABORATORY MANUAL.

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). Mariani, C, y asociados, Nature 357:384-387 (1992). Mathews, H.V., asociados, In Vitro Cell Dev. Biol. 28P:172-178 (1992). Melchers, L.S., y asociados, Plant J. 5:469-489 (1994). Miki, B.L.A., y asociados, PLANT ADN INFECTIOUS AGENTS (Hohn, T., y asociados., Eds.) Springer-verlag, Vienna, Austria, pags. 249-265 (1987).

Montgomery, -i., y asociados, Plant Cell 5:1049-1062 (1993). Montgomery, J., y asociados, Proc. Nati Acad, Sci. U.S.A. 90:5939-5943 (1993). Mullis, K.B., y asociados, Patente Norteamericana No. 4,683,195, emitida el 28 de Julio 1987. Mullis, K.B., Patente Norteamericana No. 4,683,202, emitida el 28 de Julio de 1987.

Ni, M., y asociados, Plant J. 7:661-667 (1995). Odell, J.T., y asociados, Plant Mol Biol 10(3):263-272 (1988). Odell, J.T., y asociados, Nature 313:810-812 (1985) Odell, J.T., y asociados, J. Cell Biochem. (Supl. 11 BV60 (1987). Pearson, W.R., Methods in Enzymol. 183:63-98 (1990). Pearson, W.R. and Lipman, D.J., PNAS 85:2444-2448 (1988). Penarrubia, L, y asociados, Plant Cell 4:681-687 (1992). Picton, S., y asociados, Plant Physiology 103(4): 1471-1472 (1993). Ponstein, A.S., y asociados, Plant Physiol. 104:109-118 (1994). Rogers, S., Patente Norteamericana No. 5,378,619, emitido el 3 de Enero de 1995. Rogers, S., Patente Norteamericana 5,034,322, emitida el 23 de Julio de 1991. Saiki, R.K., y asociados, Science 239:487-491 (1988). Sambrook, J., y asociados, en MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Vol. 2 (1989). Sato, T., and Theologis, A., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:6621-6625 (1989).

Schuch, W., Euphytica. 79(3):287-291 (1994). Sheehy, R.E., y asociados, J. Bact. 173:5260-5265 (1991). Studier, F.W., y asociados, J. Virol 19:136 (1976). Tommerup, H., y asociados, Eur, Congr. Biotechnol. 5:916-918 (1990). Toubart, P., y asociados, Plant J. 3:367-373 (1992). Valles, M.P. and Lasa, J.M., Plant Cell Rep. 13:145-148 (1994) Van Haaren, M.J.J., y asociados, Plant Mol. Bio. 21:625-640 (1993).

Woloshuk, C.P., y asociados, J. Plant Cell 3:619-628 (1991). Xu, R., y asociados, Plant Mol. Biol. 31:1117-1127 (1996). Yoshioka, K., y asociados, Jpn, J. Breeding 42(2):278-285 (1992). Zhu, Q., y asociados, Plant Cell 7:1681-1689 (1995).

Antecedentes de la Invención Los promotores que regulan la expresión del gen en las plantas, son elementos esenciales en la ingeniería de la genética de la planta. En la actualidad están disponibles algunos ejemplos de promotores útiles para la expresión de genes seleccionados en las plantas (Zhu, y asociados., 1995; Ni, y asociados, 1995). Para ser expresado en una célula, un gen debe ser enlazado en forma operable a un promotor el cual sea reconocido por ciertas encimas en la célula. Las regiones 5' no codificadoras de un gen (por ejemplo, las regiones inmediatas a la 5' a la región codificadora), a las que nos referimos como promotores o regiones reguladoras de transcripción, inician la transcripción del gen para producir una transcripción mRNA. Posteriormente el mRNA es trasladado en los ribosomas de la célula para producir un polipéptido codificado. Normalmente los promotores contienen bases de desde aproximadamente 500 hasta 1500, y pueden proporcionar la expresión de genes reguladas bajo su control. La expresión de genes heterólogos o secuencias de genes seleccionados en las plantas transgénicas, normalmente comprenden el uso de promotores constitutivos, por ejemplo, promotores que conducen expresión de un producto a través de la planta en todo momento y en la mayoría de los tejidos.

Los promotores derivados de genes virales, son útiles para expresar genes seleccionados en las plantas. Los ejemplos de dichos genes virales que han sido identificados, incluyen aquellos descubiertos en la familia de viruses caulimovirus (un grupo de viruses de ADN de cadena doble) e incluyen los Virus de Mosaico de la Coliflor (CaMV) 35S (Balazs, y asociados, 1982; Guilley, y asociados, 1982; Odell, y asociados, 1985; Odell, y asociados, 1987; Odell, y asociados, 1988; Tommerup, y asociados, 1990; Jefferson, y asociados, 1987 a; Jefferson, 1987b) y promotores CAMV 19S (Fraley, y asociados, 1994), y el promotor del Virus de Mosaico de la Higuera (FMV) (Rogers, 1995). Los promotores son útiles durante la regulación de la expresión del gen en las plantas y obtenidos de fuentes bacterianas, por ejemplo, los promotores derivados de Agrobacterium han sido identificados y aislados. Dichos promotores incluyen aquellos derivados de los genes sintasa opina T-ADN Agrobacterium, e incluyen el promotor sintasa nopalina (nos) (Rogers, 1991), el promotor sintasa octopina (oes) (Leisner and Gelvin, 1988) y el promotor sintasa mannopina (mas).

Los promotores de la planta (promotores derivados de las fuentes de la planta) efectivos para proporcionar expresión constitutiva, son menos conocidos e incluyen Proteína de Choque Térmico hsp80 proveniente de la coliflor, (Brunke and Wilson, 1993) y el promotor ubicuitin del tomate (Picton, y asociados, 1993). Estos promotores pueden ser utilizados para dirigir la expresión constitutiva de las secuencias de ácido nucleico heterólogo en tejidos de plantas transformadas. Los métodos y resultados descritos en la presente invención, demuestran la capacidad para proporcionar regulación específica de tejido y/o altura de la expresión del gen en las plantas transgénicas. Los promotores específicos de tejido y/o altura de la presente invención, incluyen una región de ADN que regula la transcripción del gen adyacente inmediato (corriente descendente) para un tejido de la planta específico. De acuerdo con los métodos de la presente invención, los genes heterólogos están enlazados a los promotores de la presente invención. De manera ejemplar, el gen heterólogo durante la transformación de las plantas, incluye genes cuyos productos son efectivos para reducir la biosíntesis de etileno en tejidos específicos de aquellas plantas, por ejemplo las frutas. Un gen que afecta de manera ejemplar la maduración de las frutas es la hidrolasa S-adenosilmetionina de codificación del gen T3 bacteriófago (SaMase), Kramer, y asociados, (1996); Good, y asociados, (1994). Se conoce un número limitado de promotores específicos para inducción y/o de tejido. Los promotores que proporcionan la expresión específica de fruta, incluyen el promotor E4 y E8 del tomate (Cordes, y asociados, 1989; Bestwick, y asociados, 1995), y promotores correspondientes de otras plantas que tienen sustancialmente la misma actividad biológica. El promotor E4 del tomate, es específico tanto de altura como de tejido (Cordes, y asociados, 1989) y normalmente, E4 mRNA se encuentra en forma abundante en la maduración de la fruta del tomate y no se detecta en la hoja, raíz, tallo o en la fruta sin madurar. Los promotores E4 y E8, también son promotores sensibles al etileno, por ejemplo, la transcripción de genes colocados bajo su control es activada por el etileno El promotor E4, requiere de etileno para la activación, mientras que el promotor E8 es controlado por el etileno, así como por señales de desarrollo por separado (Deikman y asociados, 1997). Otro promotor específico de fruta es el promotor del gen 2AII del tomate. Se ha demostrado que las secuencias de ácido nucleico colocadas bajo el control de regulación de la región sin codificar 5' del gen 2AII del tomate (Van Haaren), son transcritas preferentemente en el desarrollo del tejido de la fruta. Se ha reportado la regulación específica de la fruta del promotor de actinidin del kiwi, para ser conservada en las plantas de petunia transgénicas (Lin, y asociados, 1993). En la actualidad se ha identificado un número relativamente pequeño de promotores constitutivos de la planta, particularmente, los promotores de la planta. El uso de dichos promotores en la ingeniería genética de la planta, ha sido más bien limitado actualmente, ya que normalmente la expresión del gen en las plantas es, en su mayor parte, tejido regulado en forma experimental o ambiental.

Existe la necesidad de promotores específicos del desarrollo del tejido y de la altura, que sean funcionales en las células de la planta y los cuales tengan la capacidad de proporcionar una expresión de los genes heterólogos de nivel superior.

Sumario del Invento La presente invención está dirigida a un promotor sintético compuesto de una combinación de elementos de actuación-cis derivados de las secuencias reguladoras de transcripción de los genes E8 y E4, tal como se ejemplificó con el tomate. El promotor híbrido sintético permite una expresión específica de la fruta de alto nivel de las secuencias de ácido nucleico colocadas bajo su control. En un aspecto, la presente invención, proporciona una construcción de ADN que contiene una secuencia de codificación del ADN bajo el control de transcripción de un promotor híbrido E8-E4. La secuencia de codificación de ADN normalmente es heteróloga para el promotor híbrido y está enlazada en forma operable con el promotor para hacer posible la expresión del producto. Los productos ejemplares ¡ncluyen, pero no están limitados a hidrolasa S- adenosilmetionina (SAMasa), deaminasa de ácido carboxílico-1-amino-ciclopropano (ACC), molécula antipercepción de oxidasa ACC, molécula antipercepción sintasa ACC, molécula de supresión conjunta de oxidasa ACC, molécula de supresión conjunta de sintasa ACC, taumatin, sintasa de fosfato de sacarosa y ciclasa de licopeno. El promotor híbrido de E8-E4 de la presente invención está compuesto de un segmento polinucleótido derivado de un promotor de gen E8 el cual está fusionado a un segmento polinucleótido derivado de un promotor de gen E4 colocado en la corriente descendente de un segmento del promotor E8. El segmento polinucleótido derivado del promotor E8, incluye por lo menos 30 nucleótidos contiguos seleccionados de la región que se extiende de desde las posiciones nucleótidas -2257 hasta -847 del promotor E8 del tomate, el cual corresponde aproximadamente a los nucleótidos del 1 hasta 1411 de la SEQ ID NO:7, o al equivalente funcional de los mismos. El segmento polinucleótido derivado de un promotor de gen E4 incluye por lo menos 200 nucleótidos contiguos seleccionados de la región que se extiende desde las posiciones nucleótidas-1150 hasta +16 del promotor E4 del tomate el cual corresponde a los nucleótidos aproximadamente del 271 hasta 1437 de la SEQ ID NO:8, o al equivalente funcional de los mismos. La combinación particular de los segmentos polinucleótidos E8 y E4, produce un promotor híbrido el cual es efectivo para conducir la expresión de un gen heterólogo (por ejemplo, un gen reportero) en un nivel de por lo menos aproximadamente el 75-300% del nivel de expresión obtenido utilizando un promotor de gen ya sea E4 o E8 sin modificarse. En una modalidad del promotor híbrido, la secuencia nucleótida del segmento del promotor E8 corresponde a los nucleótidos del -1529 hasta -847 del promotor E8 del tomate o al equivalente funcional de los mismos, los cuales corresponden aproximadamente a los nucleótidos del 3 hasta 686 de la SEQ ID NO:6 y nucleótidos del 729 hasta 1411 de la SEQ ID NO:7. El promotor híbrido también contiene un segmento del promotor E4 que corresponde a los nucleótidos del -315 hasta +16 del promotor E4 del tomate, o al equivalente funcional de los mismos, los cuales corresponden aproximadamente a nucleótidos del 693 hasta 1023 de SEQ ID 6 o a nucleótidos del 1107 hasta 1437 de la SEQ ID NO:8, al que nos referimos en la presente invención como el "promotor híbrido E8-E4 corto". En otra modalidad del promotor híbrido, la secuencia nucleótida del segmento del promotor E8 corresponde a los nucleótidos del -2257 hasta -1103 del promotor E8 del tomate o al equivalente funcional de los mismos, el cual corresponde aproximadamente a nucleótidos del 1 hasta 1160 de la SEQ ID N0.1 y nucleótidos del -1150 hasta +16 del promotor E4 del tomate o al equivalente funcional de los mismos, los cuales corresponden aproximadamente a nucleótidos del 1157 hasta 2323 de SEQ ID 1 o nucleótidos de desde 271 hasta 1437 de la SEQ ID NO:8, designados en la presente invención como el "promotor E8-E4 largo". En un aspecto, el promotor híbrido E8-E4 de la presente invención se puede utilizar para reducir la producción de etileno en células de frutas transformadas, para alterar de ese modo la maduración del fenotipo de fruta transgénica compuesta de dichas células de fruta. En otra modalidad, la secuencia de ADN puede corresponder a un gen relacionado con patogénesis, tal como proteína de inhibición de poligalacturonasa (PGIP), glucanasa y quitinasa.

La presente invención también incluye el uso de cualquier gen quimérico anteriormente mencionado construido para generar un vector de transformación de la planta. Dichos vectores pueden ser utilizados en cualquier método de transformación celular de la planta, incluyendo métodos basados en Agrobacterium, electroporación, microinyección y bombardeo de microproyectiles. Estos vectores pueden formar parte de un equipo de transformación de la planta. Otros componentes del equipo pueden incluir, pero no están limitados a, reactivos útiles para la transformación celular de la planta. En otra modalidad, la presente invención incluye una célula de la planta, tejido de la planta, planta transgénica, célula de la fruta, fruto completo, semillas o botones que contienen cualesquiera de los genes quiméricos anteriormente descritos y los productos de gen expresado correspondientes. Las plantas preferidas son dícotas tales como melón, fresa, frambuesa y tomate y particularmente Cucumis sp (por ejemplo Cucumis meló). En otro aspecto de la presente invención los promotores híbridos descritos en la presente invención se emplean en un método para retrasar la maduración de la fruta de una planta que contiene las frutas. En este método, una planta transgénica que contiene el gen quimérico de la presente invención, está creciendo para producir una planta transgénica que contiene las frutas. En una modalidad particular, el gen quimérico codifica un producto que tiene la capacidad para reducir la biosíntesis de etileno, cuando se expresa en células de la planta (por ejemplo, hidrolasa S-adenosil-metionina, deaminasa de ácido amino-ciclopropano-1 -carboxílico (ACC), molécula de anti percepción de oxidasa ACC, molécula antipercepción de sintasa ACC, molécula de supresión conjunta de oxidasa ACC, molécula de supresión conjunta de sintasa ACC).

Las frutas producidas por estas plantas transgénicas, tienen una maduración del fenotipo modificada. Una maduración del fenotipo modificada se refiere a una alteración del rango de maduración (por ejemplo, un curso de tiempo aumentado o retraso de la maduración) de una fruta transgénica relativa a la de la fruta silvestre correspondiente. Además, la presente invención incluye un método para producir una planta transgénica tal como una planta contiene los frutos. En este método, el gen quimérico de la presente invención, normalmente transportado en un vector de expresión que permite la selección en las células de las plantas, es introducido dentro de las células progenitoras de la planta seleccionada. Estas células progenitoras posteriormente crecen para producir una planta transgénica que contiene la fruta. Todavía un aspecto adicional de la presente invención, está dirigido a un método para conferir la actividad de la expresión mejorada a un promotor E4. En el método, un segmento polinucleótido de por lo menos 30 nucleótidos contiguos seleccionados de la región que se extiende a partir de las posiciones nucleótidas desde la -2257 hasta -847 del promotor E8 del tomate el cual corresponde aproximadamente a nucleótidos del 1 hasta 1411 de la SEQ ID NO:7, o al equivalente funcional de los mismos, está fusionado en una orientación de corriente ascendente para un segmento polinucleótido del promotor E4 de por lo menos 200 nucleótidos contiguos seleccionados a partir de la región que se extiende a partir de las posiciones nucleótidas desde la -1150 hasta +16 del promotor E4 del tomate el cual corresponde aproximadamente a nucleótidos del 271 hasta 1437 de la SEQ ID NO:8, o al equivalente funcional de los mismos para formar un promotor E-8E-4 híbrido que tiene la capacidad de regular la expresión de un gen heterólogo enlazado de manera operable al mismo. El promotor híbrido es efectivo para conducir la expresión del gen heterólogo a un grado superior al del promotor E4 sin modificar y preferentemente en un nivel de por lo menos aproximadamente el 75-300% del nivel de expresión obtenido, por medio de la utilización de un promotor del gen E4 sin modificar. Al promotor híbrido también se le puede inducir etileno y tiene la capacidad de dirigir la expresión específica de la fruta. Estos y otros objetos y características de la presente invención se volverán completamente aparentes cuando se lea la descripción detallada que se encuentra a continuación, junto con las figuras y ejemplos que la acompañan.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra una descripción esquemática de los detalles de la construcción del vector pAG-1762 (14.10 kb), Las Figura 2 A y 2B corresponden a la secuencia nucleótida de un promotor E8-E4 largo (grande) de la presente invención (SEQ ID NO:1); La Figura 3 muestra una representación esquemática de los detalles de la construcción de un vector intermedio pAG-7162 (14.80 kb); La Figura 4 muestra una representación esquemática de los detalles de la construcción de un vector de transferencia intermedio pAG-126 (4186 bp); La Figura 5 muestra una representación esquemática del plasma pAG-7182 (13.50 kb); La Figura 6 es una imagen generada por computadora de un marcado Oeste que indica una expresión de/ gen SAMasa en melones maduros transformados con vectores binarios pAG7142 (E4::SAMase del tomate) y pAG7152 (E8::SAMase del tomate); La Figura 7 es una imagen generada por computadora de un marcado Oeste que indica una expresión de/ gen SAMasa en melones maduros transformados con vectores binarios pAG7162 (E8-E4::SAMase del tomate largo o grande) y pAG7182 ( E8-E4::SAMase del tomate corto o pequeño); La Figura 8 es una gráfica de barra que representa los perfiles de biosíntesis de etileno durante un período de 4 días para tres casos transgénicos diferentes (pAG-7142 y control; pAG-7152 y control; y pAG-7162 y control); La Figura 9 es una representación esquemática de la construcción del vector pAG-7152 que contiene el promotor E4 del tomate (13.7 kb); La Figura 10 muestra la secuencia nucleótida del promotor E8-E4 corto (pequeño) de la presente invención (SEQ ID NO:6); La Figura 11 es una representación esquemática de segmentos polinucleótidos activos derivados de los promotores E8 y E4 del tomate los cuales fueron utilizados para preparar los promotores híbridos de la presente invención, y La Figura 12 es una representación esquemática de la construcción del vector pAG-7142 que contiene el promotor E8 del tomate (14.5 kb).

Descripción Detallada del Invento I. Definiciones El término "polinucleótido" tal como se usa en la presente invención, se refiere a una molécula polimérica que tiene un esqueleto que soporta bases que tienen la capacidad de pegar el hidrógeno a los polinucleótidos típicos, en donde el esqueleto del polímero presenta las bases en una forma que permite que dicho hidrógeno se pegue de un modo específico de secuencia entre la molécula polimérica y un polinucleótido típico (por ejemplo, ADN de trenzado simple). Normalmente dichas bases son inosina, adenosina, guanosina, citosina, uracil y tiamidina. Las moléculas poliméricas incluyen ácidos ribonucleicos de trenzado simple (RNA) y ácidos desoxiribonucleicos (ADN) y pueden incluir polímeros que tienen modificaciones en el esqueleto tales como enlaces de metilfosfonato. El término "ácido nucleico de recombinación" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un ácido nucleico, originalmente formado in vitro, en general, mediante la manipulación de ácido nucleico por endonucleasas, en una forma que normalmente no se encuentra en la naturaleza. Una secuencia de codificación de ADN "heterólogo" es una secuencia de codificación estructural que no nace de la planta que está siendo transformada, o una secuencia de codificación que ha sido construida para obtener características mejoradas de su producto de proteína. Heterólogo, con respecto al promotor, se refiere a una secuencia de codificación que no existe en la naturaleza, en el mismo gen con el promotor al cual está adherida actualmente. En la presente invención nos referimos a las subunidades de ácido nucleico por sus designaciones de base estándar; T, tiamina; A, adenosina; C, citosina; G, guanina, U, uracilo; a las posiciones variables nos referimos por sus abreviaturas IUPAC estándar: W, A o T/U; R, A o G; S, C o G; K: G o T/U (37 CFR. §1.822). El ácido nucleico puede ser trenzado doble, trenzado simple o contener porciones, tanto de secuencia trenzada doble como de secuencia trenzada simple. La descripción de un trenzado simple también define la secuencia del otro trenzado y por lo tanto, también incluye el complemento de la secuencia.

Una secuencia de gen o ADN "heteróloga", codifica un producto del gen que normalmente no está contiguo o asociado con el promotor (por ejemplo, un promotor híbrido E8-E4 adyacente a las secuencias de ADN que codifican la enzima de adhesión de S-adenosilmetionina). En el contexto de la presente invención un gen heterólogo es cualquier secuencia de ADN diferente a la secuencia del gen E8 ó E4. "El promotor regulable" es cualquier promotor cuya actividad se ve afectada por un factor de actuación "cis o trans" (por ejemplo un promotor inducible de etileno tal como un promotor E8 del tomate. "El promotor constitutivo" es cualquier promotor que dirige la mayoría de las veces la producción de ARN en muchos o todos los tejidos de una planta transformada. Un "promotor específico de tejido" es cualquier promotor que dirige la síntesis de ARN en niveles altos en tipos particulares de células y tejidos (por ejemplo, un promotor específico de fruta); "Promotor" o "segmento del promotor" (por ejemplo un segmento del promotor E8 o E4 del tomate) significa una secuencia de ADN que funciona en un promotor híbrido descrito en la presente invención, para dirigir la transcripción de un gen heterólogo de corriente descendente e incluye un promotor o segmentos del promotor derivados por medio de una ligación con regiones de operación, mutagénesis al azar o controlada, adición o duplicación de secuencias aumentadoras, adición o modificación con enlazadores sintéticos, y similares, teniendo actividad promotora el equivalente funcional del promotor híbrido E8-E4 descrito en la presente invención o regiones pertinentes del mismo. "planta promotora" significa un promotor o región del promotor (tal como se definió anteriormente), el cual en su forma natal, es derivado del DNA genómico de la planta. El promotor híbrido de la presente invención es un promotor de la planta. Un promotor de gen E8 o E4 significa un promotor obtenido de un gen E8 o E4 considerado para compartir la identidad de secuencia con las secuencias del gen E8 o E4 del tomate descritas en la presente invención, o una región o regiones particulares de las mismas, o de un gen que tiene una identidad de secuencia de por lo menos aproximadamente el 70%, preferentemente aproximadamente el 80%, más preferentemente de aproximadamente el 85%, aún más preferente de aproximadamente el 90% sobre una longitud de secuencia polinuceótida correspondiente a las secuencias del gen E8 del tomate o E4 del tomate, descritas en la presente invención. De manera alternativa, un promotor de gen E4 o E8 es obtenido de un gen que codifica una proteína E8 o E4 en donde la secuencia de aminoácido de la proteína E4 o E8, tiene una identidad de secuencia de por lo menos aproximadamente el 70%, preferentemente aproximadamente el 80%, más preferentemente aproximadamente el 85%, aún más preferentemente aproximadamente el 90% sobre una longitud de secuencia polipéptida correspondiente a las secuencias polipéptidas E8 del tomate o E4 del tomate de la SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO:9, respectivamente. El término "homología" u "homólogo" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere al nivel de identidad entre dos secuencias, por ejemplo homología al 70% significa la misma cosa que identidad de secuencia al 70%, tal como es determinado por los algoritmos descritos más adelante y de acuerdo al homólogo de una secuencia determinada que tiene identidad de secuencia de por lo menos el 70%, preferentemente aproximadamente el 80%, más preferentemente aproximadamente el 85%, aún más preferentemente aproximadamente el 90% sobre una longitud de secuencia determinada. "La resistencia del promotor" se refiere a un nivel de expresión de un gen heterólogo regulada por el promotor en un tejido o tejidos de la planta, relativa a un estándar adecuado (por ejemplo un promotor E8-E4 híbrido de una planta en particular, por ejemplo, tomate contra ya sea, el gen E8 del tomate solo o el promotor del gen E4 del tomate solo). Los niveles de expresión pueden ser medidos enlazando el promotor a un gen reportero adecuado tal como GUS (ß-glucuronidasa), reductasa de dihidrofolato o nptll (fosfotransferasa de neomicina II). La expresión del gen reportero pueden ser medida fácilmente mediante ensayos fluorométricos, espectrofotométricos o histoquímicos (Jefferson, y asociados, 1987 a; Jefferson, 1987b). Para los propósitos de la presente invención, un promotor híbrido E4/E8 del nivel superior es uno que conduce la expresión de un gen particular, tal como un gen reportero, en aproximadamente el 75-300% de los niveles obtenidos con, ya sea el promotor del gen E4 no híbrido o el promotor del gen E8 no híbrido derivado de la misma fuente. La "identidad de secuencia de ácido nucleico" está determinada esencialmente como se indica a continuación. Se consideran dos secuencias polinucleótidas de la misma longitud para ser idénticas una con la otra, si, cuando dichas secuencias están alineadas utilizando el programa ALIGN, sobre una secuencia del 60%, preferentemente aproximadamente del 70%, preferentemente aproximadamente del 80%, más preferentemente aproximadamente del 85%, aún más preferentemente aproximadamente del 90%, están determinadas para ser idénticas cuando al alinearse utilicen los parámetros programados y la matriz PAM programada (Dayhoff, 1972). El programa ALIGN, se encuentra en la versión FASTA 1.7 adecuada a los programas de comparación de secuencia (Pearson and Lipman, 1988; Pearson, 1990; programa disponible de William R. Pearson, Department of Biological Chemistry, Box 440, Jordán Hall, Charlottesville, VA). La "identidad de secuencia de aminoácido" con respecto a las secuencias de aminoácido identificadas en la presente invención, se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que es idéntica a los residuos de aminoácido en la secuencia natal, después de alinear las secuencias e introducir las brechas, en caso necesario, para lograr una identidad de secuencia de porcentaje máximo y no considerando substituciones de conservación algunas como parte de la identidad de secuencia. Dicha identidad de secuencia de aminoácido, puede ser determinada utilizando el programa ALIGN, con los parámetros programados tal como se describe anteriormente. "Equivalente funcional", significa la secuencia de ácido nucleico que corresponde a un promotor E4 o E8 activo en donde el producto del gen E4 o E8 expresado por el promotor E4 o E8 activo, tiene una identidad de secuencia de aminoácido de por lo menos aproximadamente el 80% con el producto del gen E4 o E8 que tiene la secuencia del aminoácido mostrada en la SEQ ID NOs: 10 ó 9 respectivamente. El equivalente funcional de un promotor E4 o E8 incluye, por ejemplo, un promotor E4 o E8 el cual tiene una secuencia de ácido nucleico que es la misma como parte de, pero no el total de, la secuencia de ácido nucleico del promotor E4 o E8 y el cual retiene esencialmente ya sea una o más funciones o actividades biológicas como un promotor E4 o E8' de longitud completa, por ejemplo, el promotor E4 o E8 del tomate, tal como se describe anteriormente. Se consideran dos fragmentos de ácido nucleico para ser "hibridizables selectivamente" a un polinucleótido de referencia, si tienen la capacidad de hidribizar en forma específica al polinucleótido o variantes de los mismos o de aparejar específicamente una reacción de amplificación de cadena de polimerasa: (i) bajo condiciones de hibridización moderadamente estricta o de lavado, tal como se describe anteriormente, por ejemplo, en Maniatis, y asociados (1982), páginas 320-328 y 382-389, (ii) utilizando condiciones de lavado de rigor reducido que permiten cuando mucho, pares de base emparejados al 25-30%, por ejemplo: 2 x SSC (contiene 3.0 M de sodio NaCI y 0.3 M de citrato de sodio de Ph 7.0), solución de sulfato dodecilo de sodio al 0.1% (SDS) al doble de la temperatura ambiente, 30 minutos cada uno; posteriormente 2 x SSC, SDS al 0.1 %, 37°C una vez, durante 30 minutos; posteriormente 2 x SSC en temperatura ambiente dos veces, durante 10 minutos cada uno, o (iii) selección de aparejadores para utilizarse en reacciones de cadena de polimerasa típica (PCR) bajo condiciones estándar (por ejemplo, en Saiki, y asociados, 1988), las cuales dan como resultado una amplificación de secuencias específica, de la secuencia del objetivo deseado o sus variantes. Tal como se utiliza en la presente invención, una "célula de la planta" se refiere a cualquier célula derivada de una planta, incluyendo tejido no diferenciado (por ejemplo, callo), así como semillas de la planta, progagules y embriones.

II Promotores Inducibles para la Expresión de Genes en Plantas y la Función del Etileno La presente invención está dirigida a los descubrimientos de los solicitantes acerca del promotor híbrido preparado mediante una combinación de regiones derivadas de un promotor E8 y un promotor E4 que tienen la capacidad de dirigir una expresión de genes heterólogos de alto nivel. Una característica deseable en la preparación de las plantas transgénicas, es la capacidad de expresar un transgen introducido en respuesta a estímulos particulares, o para localizar su expresión para ciertos tejidos. En un esfuerzo para desarrollar nuevos promotores específicos de tejido y/o activados en forma experimental que tengan la capacidad de dirigir una expresión de un gen heterólogo de alto nivel en las plantas, se descubrió que cuando una combinación de regiones derivadas de los promotores E8 y E4 del tomate, están ligadas en una modalidad de desde 5' hasta 3', tuvieron la capacidad de proporcionar dicho promotor. En resumen, la presente invención está basada en el sorprendente descubrimiento de un promotor híbrido E8-E4 de alto nivel, que (i) tiene la capacidad de conducir la expresión de un gen heterólogo en niveles significativamente más altos que en cualquiera de los promotores E8 o E4 solos sin modificar, (ii) retiene la fruta y la función específica de maduración de las regiones reguladoras centrales y (iii) que es efectivo en la planta de la cual fueron derivadas las secuencias del promotor E4 y E8 (por ejemplo, el tomate), así como en otras plantas (por ejemplo, melón, manzana y pera). Los promotores centrales de los cuales se deriva el promotor híbrido, fueron seleccionados debido a un número de características, y en particular, a su capacidad de regular la expresión del gen SAMasa en la maduración de la fruta del tomate (Lincoln and Fischer, 1988; Lincoln, y asociados, 1987). El gen SAMasa, codifica la enzima de hidrolasa S-Adenosil-metionina. El aislamiento, clonación y secuencia del gen SAMasa, se describen en la Patente Nortemericana No. 5,589,623 y en la Publicación Internacional PCT No. WO 95/35387. Esta enzima, codificada por el bacteriófago E. coli T3, hidroliza el AdoMet a homoserina y MTA. A la enzima nos referimos como hidrolasa AdoMet (AdoMetasa), o por su otro nombre, enzima de adhesión S-adenosilmetionina (SAMase) (Studier, y asociados). Cuando se expresa en células de las plantas, la AdoMetasa es efectiva para hacer "corto circuito" en una ramificación de la trayectoria biosintética que produce etileno, por lo cual se reduce la producción de etileno en las plantas transgénicas que expresan el gen. Son numerosos y de considerable importancia comercial, los efectos de la existencia de etileno en las plantas, si es producida por la planta o si se aplica en forma exogénea. Entre los diversos efectos fisiológicos se encuentran la absición de la hoja, la decoloración y marchitado de las flores, el amarillamiento de la hoja, la apariencia desagradable de la hoja y la estimulación de maduración en frutas y vegetales. De significado aún mayor, es el hecho de que el etileno promueve la senectud (un proceso natural degenerativo controlado genéticamente, el cual conduce normalmente a la muerte) en las plantas, tanto en los grupos de células seleccionados como en los órganos completos, tales como frutas, hojas o flores. Normalmente, es baja la producción de etileno del tejido de la planta. Sin embargo, se producen grandes cantidades de etileno, durante los procesos de maduración y senectud y también se producen después del trauma. La estimulación de producción de etileno en frutas y vegetales mediante cortes o contusiones, puede ayudar considerablemente a la efectividad del almacenamiento. El oscurecimiento de la hoja inducido por el etileno, es una base común de pérdida en muchas plantas, incluyendo la lechuga y el tabaco. En algunos tejidos, la exposición a una pequeña cantidad de etileno únicamente, puede causar una gran producción de etileno en plantas adyacentes o tejidos de las plantas, tales como las producidas recientemente. Este efecto autocatalítico puede ser muy pronunciado y conducir a la pérdida de calidad de la fruta durante la transportación y almacenaje. Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para regular la expresión de la célula de la planta de cualquier gen en una forma de tejido o de desarrollo específico de la etapa, en particular, genes cuyos productos reducen la síntesis de etileno en las células de la planta, utilizando un promotor híbrido del tipo descrito en la presente invención. Regresando ahora a los genes E8 y E4 del tomate, de los cuales se derivan los segmentos del promotor híbrido ejemplar, a los promotores centrales intactos, al promotor E8 del tomate y el promotor E4 del tomate se les puede inducir etileno (Deikman, y asociados, 1992; Xu, y asociados, 1996). Los promotores E4 y E8 del tomate, pueden ser utilizados para aislar los promotores de función equivalente de otras plantas. Por ejemplo, el promotor E4 de frambuesa puede ser obtenido de un homólogo de frambuesa del gen E4 del tomate. Por lo tanto, los promotores E4 y E8 del tomate, pueden ser utilizados para aislar promotores de función equivalente o secuencia parciales de los mismos, de otros tipos de plantas adicionales y aquellas secuencias del promotor que se utilizan para hacer promotores híbridos E4/E8. lll Construcción de un Promotor Híbrido E8-E4 El promotor híbrido E8-E4, contiene una combinación de segmentos nucleótidos tal como se ejemplificó por aquellos derivados de los genes E8 y E4 del tomate. Estos segmentos, cuando están combinados en una modalidad de desde 5' hasta 3', tienen la capacidad de proporcionar un promotor que tiene ciertas características, tal como se describirá más adelante. Los segmentos polinucleótidos del componente del promotor híbrido, fueron determinados en las bases de experimentos conducidos en apoyo de la invención, tal como se describió en los Ejemplos 1-7. El promotor híbrido E8-E4 está compuesto de un segmento polinuceótido derivado de un promotor del gen E8, el cual está fusionado a un segmento polinucleótido derivado de un promotor del gen E4 colocado en la corriente descendente del segmento del promotor E8. El segmento polinucleótido derivado del promotor E8, incluye por lo menos 30 nucleótidos contiguos seleccionados de la región que se extiende desde las posiciones -2257 hasta -847 del nucleótido del promotor E8 del tomate, el cual corresponde aproximadamente a los nucleótidos del 1 al 1411 de la SEQ ID NO:7, o al equivalente funcional de los mismos. La secuencia del promotor E8 de la SEQ ID NO:7, consiste del promotor E8 descrito por Deikman y Fischer, 1988 y Deikman y asociados, 1992, extendida en el extremo de 5', tal como se describe en el Ejemplo 1. El segmento polinucleótido derivado de un promotor del gen E4, incluye preferentemente por lo menos 200 nucleótidos contiguos seleccionados de la región que se extiende desde las posiciones de desde -1150 hasta +15 del nucleótido del promotor E4 del tomate, que corresponde aproximadamente a los nucleótidos del 271 al 1437 de la SEQ ID NO:8, o al equivalente funcional de los mismos.

La construcción de vectores ejemplares que contienen el promotor híbrido, normalmente se lleva a cabo tal como se describe en los Ejemplos del 1 al 6. Para el uso de la presente invención, la secuencia del promotor E8 del tomate se proporciona en la SEQ ID NO:7 y la secuencia de regiones de ADN relevante para los ejemplos de la presente invención, se proporciona en las Figuras 2A y 2B (SEQ ID NO:1 ) y en la Figura 10 (SEQ ID NO:6), respectivamente. La secuencia del promotor E4 del tomate, también ha sido publicada (Cordes, y asociados, 1989) y las secuencias de ADN correspondientes a los segmentos pertinentes a la invención, se proporcionan de manera similar en las Figuras 2A y 2B (SEQ ID NO:1) y en la Figura 10 (SEQ ID NO:6) respectivamente. Los segmentos polinucleótidos utilizados para construir el promotor híbrido, pueden ser obtenidos mediante la amplificación PCR del ADN genómico del tomate, utilizando los preparadores designados en las bases de la información presentada en la presente invención, acoplados con un programa de análisis de secuencia multifuncional, por ejemplo, OLIGO versión 5.0 para Macintosch de National Biosciences, Inc. (Plymouth, MN), tal como se detalla en el Ejemplo 3. En la Publicación Internacional PCT WO 95/35387, se describen los métodos representativos para aislar y caracterizar un promotor E4 y/o E8 el cual puede ser aplicado para el propósito de obtener un segmento del promotor de la presente invención. Los segmentos polinucleótidos que componen el promotor híbrido, fueron determinados en base a los resultados de la expresión para los transgenes conducidos por dos promotores híbridos representativos (Figura 11 ), por el promotor híbrido E8-E4 largo (SEQ ID NO:1 ) y por el promotor híbrido E8-E4 corto (SEQ ID N0:6). Ambas versiones del promotor híbrido fueron altamente efectivas al conducir la expresión de un transgen que codifica el gen SAMasa, tal como se indica en los resultados de marcado del Oeste mostrados en las Figuras 6 y 7, las cuales ilustran los resultados de los estudios de expresión del gen SAMasa conducido por los promotores E4/E8 derivados del tomate en el melón. Los promotores híbridos fueron significativamente más activos en la conducción de la expresión que el promotor del tomate ya sea el E8 o el E4. El promotor híbrido E8/E4 largo ejemplar, contienen un segmento polinucleótido E8 que corresponde a los nucleótidos del aproximadamente el -2257 al -1103 de un promotor E8 del tomate, mientras que el promotor híbrido E8/E4 corto contiene un segmento polinucleótido E8 que corresponde a los nucleótidos de aproximadamente el -1529 al -847 del promotor E8. En experimentos de expresión llevados a cabo en apoyo de la invención, el segmento del promotor E8 corto fue descubierto de manera general para funcionar tan efectivamente como el segmento del promotor E8 largo, para mejorar la actividad general del promotor híbrido. Esto fue sorprendente en vista de los reportes previos que indican que las secuencias de ADN necesarias, tanto para dar respuesta de etileno como para los niveles de mARN general que residen en la región del promotor E8 comprendida por el promotor híbrido E8/E4 más largo y no en la versión más corta (Deikman, y asociados, 1992). La región polinucleótida E8 comprendida en ambas versiones del promotor híbrido, se extienden sobre las posiciones desde aproximadamente la -2257 a la -847 del promotor E8 del tomate. En base a estos resultados, los promotores híbridos de la presente invención, contendrán un segmento polinucleótido derivado del promotor E8 que incluye preferentemente por lo menos 30 nucleótidos contiguos seleccionados de esta región. En una modalidad particular de la presente invención, el segmento incluirá por lo menos aproximadamente 40 nucleótidos seleccionados de esta región. Aún en otra modalidad, el segmento incluirá por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos contiguos. Se apreciará por supuesto, que el polinucleótido derivado de E8 puede contener menos de 30 nucleótidos contiguos, y en algunos casos, pueden contener aproximadamente desde 15 hasta 25 nucleótidos contiguos. La conveniencia de utilizar un segmento E8 en particular, en construcciones que emplean el promotor híbrido, puede ser evaluada en experimentos de expresión que emplean un gen reportero heterólogo. Un segmento E8 en particular, seleccionado de acuerdo con los lineamientos anteriormente descritos, está ligado a un segmento de promotor E4 de corriente descendente utilizando los métodos descritos en la presente invención. Los niveles de expresión de un gen reportero adecuado conducido por el promotor E8/E4 híbrido resultante, posteriormente son comparados con los niveles de expresión para el mismo gen regulado por el promotor E8 o E4 solo correspondiente. Un segmento polinucleótido E8 adecuado para formar un promotor híbrido, es el que cuando está combinado con un segmento polinucleótido del promotor E4 que corresponde a aquellos descritos en la presente invención y colocado en un promotor híbrido, conduce una expresión de un gen reportero en un nivel de por lo menos aproximadamente el 75-300% del nivel de expresión obtenido utilizando ya sea un promotor del gen E4 sin modificar o uno del E8 sin modificar, enlazado en forma operable a dicho reportero.

Para este propósito, se puede utilizar un gen reportero, tal como un GUS (ß-glucoronidasa). La expresión la proteína GUS puede ser fácilmente medida mediante ensayos fluorométricos, espectrofotométricos o histoquímicos (Jefferson, 1987). Regresando ahora al segmento del polinucleótido E4 del promotor híbrido, un examen del promotor híbrido E8/E4 largo, revela un segmento polinucleótido E4 que corresponde esencialmente al promotor E4 de longitud completa, mientras que el promotor híbrido E8/E4 corto contiene un segmento E4 que se expande desde las posiciones -315 a la +16 del nucleótido del promotor E4. Tal como se comentó anteriormente, ambas versiones ilustrativas del promotor E8/E4 híbrido, fueron efectivas en la dirección de un gen heterólogo (por ejemplo, los Ejemplos 5 y 6). La gran actividad del híbrido E8/E4 corto, fue sorprendente ya que los estudios sobre el promotor E4 solo, indican que los elementos, tanto de corriente ascendente como de corriente descendente, se requieren para la transcripción de la respuesta de etileno (Xu, y asociados, 1996). La región polinucleótida E4 comprendida en ambas versiones del promotor híbrido, se extiende sobre las posiciones nucleótidas desde aproximadamente la -1150 hasta + 16 del promotor E4 del tomate. Basados en estos resultados, los promotores híbridos de la presente invención, contendrán un segmento polinucleótido derivado del promotor E4 que incluye preferentemente por lo menos 200 nucleótidos contiguos seleccionados de esta región. En una modalidad particular de la presente invención, el segmento incluirá por lo menos aproximadamente 220 nucleótidos seleccionados de esta región. Aún en otra modalidad, se contempla que el segmento incluirá por lo menos aproximadamente 270 nucleótidos contiguos. Se apreciará por supuesto, que el polinucleótido derivado de E4 puede contener menos de 200 nucleótidos contiguos, y en algunos casos, pueden contener aproximadamente desde 150 hasta 200 nucleótidos contiguos. Los segmentos derivados del gen E4, serán seleccionados y evaluados, esencialmente tal como se describió anteriormente para el componente E8. Más aún, se apreciará que los segmentos descritos anteriormente se refieren a los equivalentes funcionales de los mismos y comprenden promotores o segmentos del promotor derivados mediante la ligación con regiones operadoras, mutagénesis al azar o controlada, adición o duplicación de secuencias aumentadoras, adición o modificación con enlazadores sintéticos, y similares, teniendo una actividad del promotor similar a la del promotor híbrido E8-E4 descrito en la presente invención o en las regiones pertinentes de la misma.

IV. Construcción del Vector, Genes Quiméricos y Transformación de la Planta El promotor híbrido E8/E4 de la presente invención, puede ser utilizado para regular la expresión de genes heterólogos. En apoyo a la presente invención, se construyeron dos genes quiméricos ejemplares que contienen una secuencia del promotor híbrido E8/E4 enlazada en forma operable a una secuencia de ADN heteróloga, E8/E4: SAMasa largo (pAG-7162) y E8/E4:SAMase corto (Ejemplos del 1 al 3). El gen SAMasa ha sido dirigido previamente para funcionar en forma más eficiente si se expresa (i) en niveles altos y (ii) en una forma específica de tejido. Por consiguiente, el promotor híbrido descrito en la presente invención, representa un promotor ideal para satisfacer este objetivo y puede ser utilizado para expresar cualquier gen heterólogo que se ajuste a la descripción anterior.

A. Vectores de Transformación de la Planta Los vectores de transformación de la planta, que contienen una secuencia reguladora del promotor/transcripción híbrido E8/E4, son construidos de acuerdo a los métodos conocidos en el arte (ver, por ejemplo, Houck and Pear, 1990, y Becker, y asociados, 1992). La presente invención proporciona vectores adecuados para la transformación de plantas. Los vectores genes quiméricos y constructores de ADN de la presente invención, también son útiles para la expresión de genes heterólogos. Las plantas transgénicas, y sus frutas, que transportan los genes quiméricos de la presente invención, pueden ser una fuente útil para el material expresado en una nueva combinación. En una modalidad, los genes quiméricos de la presente invención tienen dos componentes: (i) un promotor E8/E4 híbrido y (ii) una secuencia de codificación de ADN heterólogo. Los vectores de la presente invención pueden ser construidos para transportar un cassette de expresión que contiene un sitio de inserción para las secuencias de codificación de ADN de interés. Posteriormente, la transcripción de dicho ADN insertado, está bajo el control de un promotor híbrido E8/E4 adecuado (por ejemplo, correspondiente a la SEQ ID Nos: 1 ,6). Dichos cassettes de expresión pueden tener señales de terminación de transcripción simple o múltiple en el extremo 3' de codificación de la secuencia de ADN que está siendo expresada. También puede ser incluido el cassette de expresión, por ejemplo secuencias ADN que codifican (i) una secuencia conductora (por ejemplo, para permitir la concentración de secreción o vacuolar) y (ii) la traducción de señales de terminación.

Adicionalmente los vectores de la presente invención, pueden incluir marcadores de selección, para utilizarse en células de plantas (tales como el gen de resistencia de canamicina nptll). Los vectores también pueden incluir secuencias que permitan su selección y propagación en un hospedero secundario, tal como, secuencias que contienen un origen de réplica y un marcador de selección. Los hospederos secundarios típicos incluyen bacteria y levadura. En una modalidad, el hospedero secundario es Escherichia coli, el origen de réplica es un colE1-tipo, y el marcador de selección es un gen que codifica la resistencia a la ampicilina. Dichas secuencias son bien conocidas en el arte y están disponibles comercialmente (por ejemplo, Clontech, Palo Alto, CA; Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores de la presente invención, también pueden ser modificados para los plasmas de transformación de la planta intermedia, que contienen una región de homología para un vector Agrobacterium tumefaciens, una región limitadora de T-ADN de Agrobacterium tumefaciens y genes quiméricos o cassettes de expresión. Adicionalmente, los vectores de la invención pueden comprender un tumor de la planta desarmada que induce el plasma de Agrobacterium tumefaciens. Se pueden construir otros vectores adecuados, utilizando los promotores de la presente invención y los vectores de transformación de la planta estándar, los cuales están disponibles tanto comercialmente (Clontech, Palo Alto CA), como en fuentes académicas (Waksman Institute, Rutgers, The State University of New Jerwey, Piscataway, NJ). Los vectores de la presente invención son útiles para la expresión de ácido nucleico específica de tejido y/o etapa que codifica las secuencia en las células de la planta. Por ejemplo, se puede insertar una secuencia de péptido o polipéptido seleccionada, en un cassette de expresión de un vector de la presente invención. Posteriormente, el vector es transformado en células hospederas, las células hospederas cultivadas bajo condiciones que permitan la expresión de las secuencias de codificación de proteína y el péptido o polipéptido expresado aislado de las células. Las células progenitoras transformadas, también pueden ser utilizadas para producir plantas transgénicas que contienen la fruta. Adicionalmente, la presente invención incluye un método para la producción de una planta transgénica que contiene fruta en donde la fruta producida por la planta tiene un fenotipo modificado. En este método se introduce un gen quimérico (por ejemplo, mediante transformación) dentro de las células progenitoras de la planta. Un gen quimérico ejemplar está compuesto de (i) una secuencia de ADN que codifica un producto de gen efectivo para modificar una característica de fenotipo de la planta, por ejemplo, reducir la biosíntesis de etileno en la fruta producida por la planta, enlazada en forma operable a (ii) un promotor cuya expresión es ¡nducible, por ejemplo, durante la maduración de la fruta, mediante una citoquina de la planta, o mediante la síntesis de etileno de la fruta. Tal como se menciona anteriormente, la secuencia de ADN es heteróloga al promotor y el gen quimérico contiene los elementos reguladores adecuados que se necesitan para la expresión en una planta. El progenitor transformado son células de crecimiento para producir una planta transgénica que contiene a la fruta. El método adicional, incluye la transformación de células progenitoras de la planta con un vector para selección que contiene el gen quimérico. Las secuencias y promotores de ADN, pueden ser utilizadas tal como se describe anteriormente.

En un aspecto de la presente invención, la fruta producida por dichas plantas transgénicas, tiene un nivel reducido de síntesis de etileno de la fruta. Posteriormente, la fruta demuestra un fenotipo de maduración modificada en la cual se retrasa el tiempo de maduración. Los vectores, genes quiméricos y constructores de ADN de la presente invención, pueden ser vendidos individualmente o en equipos, para utilizarse en la transformación de la célula de la planta y en la generación subsecuente de plantas transgénicas.

B. Aislamiento de los Promotores E4 y E8 El promotor E4 y/o E8, puede ser obtenido de un homólogo del gen E4 o E8 del tomate. Para detectar la presencia de un gen E4 o E8 en varias especies de plantas, por ejemplo, fresa, melón, clavel, coliflor o frambuesa, se lleva a cabo un experimento de marcado del sur. Los homólogos E4 o E8, son identificados en un marcado del Sur del ADN genómico de una planta de interés, muestreada con un fragmento de ADN etiquetado que contiene la secuencia de codificación por ejemplo, el gen E4 o E8 del tomate. Preferentemente, se selecciona una muestra que contiene la secuencia de codificación del gen E4 o E8 del tomate, en lugar de la secuencia del promotor, ya que las secuencias de codificación normalmente son más conservadas de especies a especies que lo que son las secuencias del promotor. Las muestras son generadas a partir del ADN genómico del tomate, utilizando la amplificación específica del preparador (Mullis, 1987; Mullis, y asociados, 1987). Los preparadores oligonucleótidos son seleccionados de manera que la región amplificada incluye la secuencia de codificación completa del gen E4 o E8 del tomate. Los preparadores pueden ser seleccionados para amplificar únicamente una región seleccionada del gen E4 o E8. Un promotor también puede ser aislado mediante (i) la selección del primer y segundo preparador oligonucleótido que corresponden a una región de corriente ascendente y a una región de corriente descendente, respectivamente, de un gen E4 o E8, (ii) la amplificación de una región del ADN del gen E4 o E8, entre el primer y segundo preparador, para generar moléculas de muestra, (iii) el contacto de moléculas de muestra con una pluralidad de moléculas de ADN objetivo derivadas del genoma de una planta que contiene fruta seleccionada, bajo condiciones que favorecen la hibridización específica entre la molécula de muestra y un homólogo de molécula objetivo a la molécula de muestra. De manera alternativa, se puede realizar una prueba aislando fragmentos de digestión por restricción que contienen la secuencia de interés del ADN del plasma. Dicha muestra es etiquetada con una porción detectable para hacer posible la identificación subsecuente de moléculas objetivo homologas. Las porciones de etiquetado ejemplares, incluyen nucleótidos radioactivos, tales como nucleótidos etiquetados 32P, nucleótidos etiquetados digoxigenin, nucleótidos biotinilados y similares disponibles en fuentes comerciales. En el caso de una muestra amplificada por el preparador, los nucleótidos etiquetados pueden ser incorporados directamente en la muestra durante el proceso de amplificación. Las moléculas de la muestra derivadas del ADN que ya ha sido aislado, tales como fragmentos de digestión por restricción del ADN del plasma, normalmente son etiquetadas en el extremo (Ausubel, y asociados, 1992). Las moléculas objetivo, tales como fragmentos de ADN Hind\\\ provenientes de los genomas de las plantas descritas anteriormente, son electroforesadas en un gel, manchado, e inmobilizadas sobre un filtro de nylon o nitrocelulosa. Posteriormente, las moléculas de muestra etiquetadas se ponen en contacto con las moléculas objetivo bajo condiciones que favorecen la hibridización específica entre las moléculas de muestra y las moléculas objetivo homologas a las moléculas de muestra, identificando, por lo tanto, una molécula de objetivo que tiene una secuencia de ADN homologa (que tiene esencialmente la misma identidad de secuencia) al gen E4 o E8 del tomate, y aislando las secuencias promotoras asociadas con la molécula objetivo. Las condiciones que favorecen la hibridización específica, nos referimos como de moderada a altamente estrictas y se ven afectadas principalmente por la concentración de sal y temperatura del regulador de lavado (Ausubel, y asociados, 1992, Sambrook, y asociados, 1989). Las condiciones de hibridización, normalmente son clasificadas como moderadamente estrictas, debido a la baja concentración de sal y se espera que conserven únicamente interacciones de hibridización específicas, permitiendo la identificación y aislamiento de genes homólogos en diferentes especies de plantas. Después del contacto, hibridización y lavado, las moléculas de objetivo con secuencias substancialmente idénticas a la muestra, son identificadas detectando la etiqueta en la muestra. La etiqueta puede ser detectada directamente, por ejemplo, como en una etiqueta radioactiva detectada en autoradiogramas o pueden ser detectada con una porción secundaria, por ejemplo estreptavidin etiquetado en forma fluorescente enlazado a una muestra biotinilizada. Siguiendo la identificación de plantas que contienen genes E4 y/o E8, el ADN que codifica los genes, incluyendo las regiones reguladoras 5', puede ser aislado a partir de las especies respectivas, seleccionando una biblioteca de ADN genómico; por ejemplo una biblioteca derivada de una planta que contiene fruta. La biblioteca de interés es seleccionada con una muestra que contiene las secuencias correspondientes a la secuencia de codificación de un gen E4 conocido, tal como el gen E4 del tomate. La selección se lleva a cabo, utilizando métodos conocidos (Ausubel, y asociados, 1992; Sambrook, y asociados, 1989).

Las placas o colonias positivas están aisladas y el ADN de inserto es secuenciado y comparado con las secuencias E4 conocidas. Se identifican los clones que contienen insertos con las secuencias correspondientes a los genes con identidad de secuencias substancial al E4 del tomate, y si es necesario, son utilizados para obtener clones adicionales hasta que la región promotora de interés sea identificada y aislada en forma adicional. Un fragmento de ADN que contiene un promotor E4 o E8, o una secuencia parcial del mismo, puede ser aislado digiriendo uno de los clones lambda con enzimas de restricción seleccionadas, por ejemplo, Hind\\\ y Sacl. Estos resultados pueden ser utilizados posteriormente en la generación de varios fragmentos, con el fin de obtener el promotor de longitud completa del gen E4 o E8 objetivo mediante el uso de técnicas de rutina conocidas por los expertos en el arte.

C. Genes Heteróloqos Los métodos y resultados descritos en la presente invención, demuestran la capacidad de proporcionar la expresión del gen específico de tejido y/o etapa de nivel alto en las plantas transgénicas, en donde la expresión está regulada por un promotor híbrido E8/E4. El promotor híbrido E8/E4 de la presente invención, incluye una región o regiones de ADN que regula la transcripción del gen inmediatamente adyacente (corriente descendente) para un tejido específico de la planta. De acuerdo con los métodos de la presente invención, los genes heterólogos están ligados a los promotores de la presente invención. Los genes heterólogos ejemplares para la transformación de las plantas, incluyen genes cuyos productos son efectivos para reducir la biosíntesis de etileno en tejidos específicos de dichas plantas, por ejemplo las frutas. Anteriormente se mencionaron algunos de estos genes, incluyendo AdoMetasa, e incluyen hidrolasa S-adenosilmetionina, deaminasa de ácido carboxílico-aminociclopropano-1 (ACC), molécula de anti percepción de oxidasa ACC, molécula de antipercepción de sintasa ACC, molécula de supresión conjunta de oxidasa ACC, molécula de supresión conjunta de sintasa ACC. Otros genes de interés que podrían ser utilizados junto con el promotor E8/E4 híbrido incluyen, pero no están limitados a, otros genes de modificación de maduración además de la AdoMetasa. Los ejemplos representativos de dichos genes, incluyen deaminasa de ácido carboxílico-aminociclopropano-1 (ACC) (Klee, y asociados, 1991 ; Sheehy, y asociados, 1991), la cual degrada los precursores de biosíntesis de etileno. También se puede lograr la modificación de maduración, a través del uso de los métodos de desactivación del gen. Tales métodos pueden emplear genes que afectan la antipercepción o supresión conjunta de la trayectoria biosintética de etileno, por ejemplo, la sintasa ACC (Sato y Theologis, 1989) y la oxidasa ACC (Hamilton, y asociados, 1990). Los genes adicionales para usarse en las construcciones de ADN de la presente invención, incluyen genes involucrados en conferir la resistencia a los hongos, por ejemplo, proteína de inhibición de poligalacturonasa, PGIP, proveniente de Phaseolus vulgaris (Toubart, y asociados, 1992). También se contempla el uso de formas modificadas de la glucanasa, citinasa y otras patogénesis de la planta relacionadas con los genes (PR) (Melchers, y asociados, 1993, 1994; Ponstein, y asociados, 1994; Woloshuk, y asociados, 1991 ). Los genes involucrados en conferir la resistencia a los insectos, también pueden ser incorporados dentro de las construcciones de ADN de la presente invención. La expresión de estos productos, podría ser mejorada cuando se utilicen con un promotor específico de fruta de alto nivel, tal como el promotor híbrido de la presente invención. Además, los genes de antipercepción o supresión conjunta que codifican las proteínas responsables del proceso de degradación en la fruta, también pueden ser utilizados en conjunto con los promotores de la presente invención. Los ejemplos de los genes de este tipo incluyen poligalacturonasa, celulasa y esterasa de metil pectina (Schuch, 1994). De esta forma, la inhibición del proceso de degradación específica se enfoca únicamente a la maduración de la fruta. Otros productos del gen que pueden ser útiles para expresar la utilización de promotores híbridos de la presente invención, incluyen productos del gen que son efectivos para modular; (i) el florecimiento, (ii) el sabor (por ejemplo, taumatina; GENBANK) o modificación de color (por ejemplo, productos que modifican la síntesis de licopeno, por ejemplo ciclasa de licopeno arabidopsis; GENBANK), (iii) enzimas u otros productos catalíticos tales como ribozimas o anticuerpos catalíticos que modifican los procesos celulares de la planta, (iv) producción de etileno, tal como moléculas de anti-percepción, enzimas que degradan a los precursores de la biosíntesis de etileno, otros productos catalíticos o moléculas de supresión conjunta, (v) control de hongos, por ejemplo genes alternativos de control de hongos, (vi) producción o niveles de las hormonas de la planta, (vii) el ciclo de la célula o la división de la célula, y (vii) acumulación de sacarosa, tal como el gen de sintasa de fosfato de sacarosa (GENBANK) proveniente del maíz. Adicionalmente, es útil para modular la expresión constitutiva de algunos genes en tejidos específicos, tal como la expresión de cualquier gen que pudiera ser perjudicial para la fruta si este fuera expresado en forma constitutiva, por ejemplo, genes que codifican las enzimas de degradación que agoten las metabolizaciones necesarias. Los derivados del promotor E4/E8, pueden ser usados como interruptores de encendido/apagado para la expresión de genes de tejido y/o etapa específica, cuya expresión está bajo su control. D. Métodos de Transformación de las Plantas Para provocar la transformación de las células progenitoras de la planta, tal como electroporación, microinyección y bombardeo de microproyectiles, se pueden emplear un número de métodos, además de los métodos basados en Agrobacterium. Estos métodos son bien conocidos en el arte (Comai and Coning, 1993; Klein, y asociados, 1988; Miki, y asociados, 1987; Bellini y asociados, 1989) y proporcionan los medios para introducir el ADN seleccionado dentro de los genomas de las plantas. Dicho ADN puede incluir un cassette de ADN el cual consiste de un promotor híbrido E8/E4 funcionalmente adyacente a las secuencias heterólogas que codifican un producto deseado, por ejemplo, secuencias de codificación de AdoMetasa. Los métodos representativos para la transformación del tomate están descritos en la Publicación Internacional PCT WO 95/35387. Los métodos representativos para la transformación de fresa o frambuesa, están descritos en la Publicación Internacional PCT WO 95/85388. Los protocolos convencionales para la transformación de Cucumis sp. se describen en Fang and Grumet, 1990; Valles and Lasa, 1994; Dong, y asociados, 1991 ; Gonsalves, y asociados, 1994; Yoshioka, y asociados, 1992; Ayub, y asociados, 1996. Los transformadores y células, y plantas transgénicas resultantes, son identificados y evaluados por medio de métodos estándar (Mathews, y asociados, 1995).

E. Expresión en los Sistemas de Plantas Heterólogas Los experimentos llevados a cabo en apoyo a la presente invención, demuestran la versatilidad y las construcciones del gen quimérico de la presente invención (Ejemplos 6, 7). Las construcciones del vector de la presente invención puede ser usada para transformación y expresión de alto nivel de secuencias heterólogas en las plantas transgénicas. Adicionalmente, la expresión mediada por los promotores descritos en la presente invención parecen ser de un tejido y/o etapa específico aún en las plantas heterólogas. Al verlo ahora en experimentos llevados a cabo en apoyo a la presente invención, se condujo una evaluación de diferentes promotores. Los experimentos ilustrativos de transformación de la planta, fueron llevados a cabo en melón (Cucumis meló), utilizando el gen SAMasa en el gen heterólogo ejemplar. Los melones transgénicos fueron generados utilizando la transformación mediada de Agrobacterium y los vectores binarios que contienen series de fruta y promotores específicos de maduración del tomate (Tabla 2). Se prepararon promotores híbridos sintéticos ejemplares que contienen diferentes campos de promotores de respuesta al etileno y específicos de fruta (por ejemplo, los promotores híbridos E8/E4 largo y corto) para determinar su capacidad para mejorar la expresión del gen específico de fruta y de maduración. Se identificaron los melones transgénicos que contienen el gen SAMasa, utilizando PCR. Se analizaron algunos casos transgénicos para cada uno de los vectores binarios utilizando técnicas de marcación del oeste para determinar la expresión del gen SAMasa en la maduración de la fruta del melón. Las Figuras 6 y 7 indican que ninguno de los promotores E8 o E4 solos (Figura 6) son equivalentes a los promotores híbridos E8/E4, en particular el híbrido E8/E4 largo (Figura 7), en su capacidad para conducir la expresión del gen SAMasa en la maduración de la fruta de melón. Aunque se observó que la expresión E4 y E8 en las construcciones conducidas será de débil a moderada, los niveles de expresión para los promotores híbridos correspondientes fueron significativamente mayores, tal y como fueron determinados por la intensidad de la banda de AdoMetase kd 17 sobre la marca. Para confirmar y comparar adicionalmente la expresión de los transgenes introducidos, fueron determinados los perfiles representativos de biosíntesis de etileno durante un período de 4 días, para las muestras de melón transformadas con cada una de las construcciones representativas mostradas en la Tabla 2.

En la Figura 8, se muestra la síntesis de etileno de los tres diferentes casos (pAG-7142, pAG-7152, pAG-7162), en donde las entradas seguidas por una designación (-), representa controles negativos. Al ver ahora los resultados mostrados en la Figura 8, el caso derivado de pAG-7162 (promotor híbrido E8/E4) se ve claramente reducido en su capacidad para producir etileno durante la maduración, para una extensión significativamente mayor que el de cualquiera de los casos conducidos del promotor E4 o E8. La síntesis de etileno reducida y la maduración retrasada correlacionada con los niveles de expresión del gen SAMasa determinados por la marcación del Oeste Los casos conducidos del promotor híbrido E8/E4 largo, demuestran una biosíntesis de etileno reducida cuando son comparados, tanto con los controles negativos como con los otros casos conducidos del promotor no híbrido. Esta es una indicación de la actividad de expresión mayor del promotor híbrido de la presente invención, cuando se compara con varios promotores no híbridos derivados de diferentes tipos de genes de la planta. El uso de los promotores híbridos E4/E8, no puede ser considerado limitado para el melón y el tomate. Las construcciones y métodos de la presente invención son aplicables a todas las plantas mayores, particularmente las frutas.

Tal como se demostró en la presente invención, las secuencias del promotor híbrido E4/E8 pueden ser aisladas de un tipo de planta al otro al que será transformada dicha planta. Lo anterior se ejemplifica mediante la actividad de un promotor híbrido E4/E8 compuesto de secuencias derivadas del tomate, las cuales son efectivas para expresar un gen heterólogo, por ejemplo, el gen SAMasa en el melón. De manera alternativa, las secuencias del promotor híbrido E4/E8 pueden ser aisladas del mismo tipo de planta que la planta que es transformada mediante un vector que contiene un promotor híbrido E4/E8 y una secuencia de codificación heteróloga, por ejemplo el gen SAMasa. Por ejemplo, una promotor híbrido E4/E8 de frambuesa, puede ser enlazado en forma operable a un gen heterólogo, tal como el gen SAMasa y utilizado para transformar frambuesas.

Los siguientes ejemplos son ilustrativos, pero de ninguna manera tienen la intensión de limitar el alcance de la presente invención.

Materiales y Métodos Construcciones del Vector Binario de Plasmas de ADN y Aprobacterium Se obtuvieron generalmente reactivos biológicos de los siguientes proveedores: Preparador de desde 5' hasta 3', Boulder, CO; New England Biolabs, Beverly, MA; Gibco/BRL, Gaithersburg, MD; Promega, Madison, Wl; Clontech, Palo Alto, CA; y Operon, Alameda, CA. En todas las construcciones se emplearon las técnicas de ADN de recombinación estándar (Adams and Yang, 1977; Ausubel, y asociados, 1992; Hooykaas and Schilperoot 1985; Sambrook, y asociados, 1989).

Eiemplo 1 Promotor Híbrido E8/E4 Largo y Preparación del Vector Intermedio pAG-1762 A. Construcción del vector intermedio pAG-1762 Se preparó un vector intermedio pAG-1762, que ensambló todos los elementos necesarios en un cassette movible, de la manera siguiente. Para obtener una parte del promotor E8 del tomate para usarse en la preparación de un promotor híbrido, se digirió un plasma que contiene el promotor E8 del tomate 2.0 kb, pAG-1742, con Xbal y BamHI utilizando los protocolos de biología molecular estándar (Sambrook, y asociados, 1989). La secuencia de la región de flanqueo del gen E8 del tomate correspondiente a desde 1 hasta -1098 y desde -2181 hasta -1098, ha sido previamente descrita por Deikman, y asociados, 1988 y Deikman, y asociados, 1992, respectivamente. Se seleccionó una biblioteca genómica lambda del tomate, por medio de métodos estándar con una muestra del gen E8 del tomate basada en la secuencias descritas por Deikman y asociados. Se identificó y plaqueó en forma purificada y consecutiva un clon lambda el cual fue hibridizado a la muestra. El clon genómico E8 fue utilizado como una fuente del fragmento Hind\\\ que es la región de corriente ascendente de desde -2257 hasta -1103 bp del promotor E8/E4 híbrido de la presente invención, correspondiente a los nucleótidos del 1 hasta -1155 de la SEQ ID NO:7. A este fragmento se le insertaron 5' del promotor E8 de aproximadamente 1122 bp en pAG-532 en los sitios Hind\\\ y Xbal (Figura 4). En la presente invención se muestra la secuencia de ADN de la región de pares de base de desde -2257 hasta -1103, como los nucleótidos desde el 1 hasta el 1160 de las Figuras 2A y 2B. Después de la digestión, el fragmento del promotor E8 del tomate extirpado, fue purificado mediante electro-elución después de la electroforesis de gel de agarosa. Se determinó que el fragmento purificado contiene la secuencia de* corriente ascendente del promotor E8 correspondiente a los nucleótidos del -2257 hasta el -1098. La secuencia correspondiente a los nucleótidos del -2257 hasta el -1098 del promotor E8 del tomate, es presentada como los nucleótidos del 1 hasta el 1160 de la SEQ ID NO:1 y 7. Para aislar un promotor E4 de longitud completa en la construcción de un promotor híbrido, se extirpó un fragmento 10.6 kb que contiene el promotor E4 del tomate a partir de un segundo plasma, pAG-1752, mediante un tratamiento con Xba\ y BamHI. La secuencia del promotor E4 del tomate, ha sido publicada (Cordes, y asociados, 1989) y la secuencia de ADN de la región base de desde menos 1150 hasta más 16 es presentada como los nucleótidos del 271 al 1437 de la SEQ ID NO:8; la cual comprende el gen E4 completo. El fragmento 10.6 kb extirpado, contenía una construcción de promotor E4:SAMase. La secuencia del gen SAMase, está descrito en la Patente Norteamericana 5,589,623. La clonación y aislamiento del gen SAMase se describe en la Publicación Internacional No. WO 95/35387. En dicha Publicación Internacional también se describieron los métodos representativos para aislar y caracterizar un promotor E4 y/o E8 y los detalles para la preparación de los constructores del vector del tipo empleado en la presente invención. El fragmento extirpado, que contiene las secuencias necesarias para la selección y réplica bacteriana, fue purificado sobre gel de agarosa. Estos dos fragmentos fueron combinados siguiendo el protocolo de ligación de Gibco/BRL para producir el plasma pAG-1762. Este plasma se muestra en forma esquemática en la Figura 1.

Eiemplo 2 Preparación del Vector Binario, pAg-7162 que Contiene El Promotor Híbrido E8/E4 Largo El cassette del gen/promotor del vector intermedio, pAG-1762, fue transferido dentro de un vector binario, tal como se indica a continuación. El plasma pAG-1762 (Ejemplo 1), fue digerido con Hind\\\ y Kpnl, dando como resultado un fragmento de 2.8 kb que contiene el promotor E8/E4 largo (Figuras 2A, 2B; SEQ ID NO:1) y el gen SAMasa. El fragmento extirpado fue purificado por gel mediante por electroforesis sobre agarosa. Un segundo plasma, pAG-7142 (Figura 12) fue digerido con Hind\\\ y Kpnl, para proporcionar un fragmento de 12 kb que contiene una secuencia exterminadora y un cassette marcador de selección (por ejemplo, el gen de resistencia de canamicina npfll conducido por el promotor E4 de frambuesa), así como las secuencias necesarias para la selección y réplica bacteriana. El aislamiento, caracterización y secuencia del promotor E4 de frambuesa (RE4), junto con las construcciones ilustrativas que se describen para el uso de este promotor, se describen en la Publicación Internacional PCT WO 95%35388. El fragmento de 12 kb fue purificado mediante electroforesis sobre agarosa. Posteriormente, el fragmento de 2.8 kb purificado que contiene la construcción de promotor E4/E8::SAMasa, fue ligado al fragmento purificado de 12 kb anteriormente descrito, para formar el plasma pAG-7162, tal como se ilustra esquemáticamente en la Figura 3.

Ejemplo 3 Preparación de un Promotor Híbrido E8/E4 Corto y un Vector de Transferencia Intermedio, pAG-126 Se preparó un vector intermedio que combina segmentos polinucleótidos truncados derivados de los promotores del gen E4 y (del tomate para formar un promotor híbrido E8/E4 corto, fusionado a la secuencia de codificación para el gen SAMasa, tal como se indica a continuación. Un segmento promotor E4 correspondiente a los nucleótidos desde -315 hasta +16, fue aislado del ADN del tomate, utilizando PCR. En una forma similar, se designaron los preparadores PCR para amplificar un segmento del promotor E8 desde -1529 hasta -847. Para incorporar la restricción de los sitios de endonucleasa en los extremos de los fragmentos del promotor amplificado, se designaron preparadores oligonucleótidos, para la lectura de subclonación. El diseño de los preparadores estuvo basado en las secuencias publicadas de los genes E8 y E4 tal como se describió anteriormente, utilizando la versión OLIGO 5.0 para Macintosh, un programa de análisis de secuencia multifuncional de National Biosciences, Inc. (Plymouth, MN).

Tabla 1 El PCR fue realizado de acuerdo con el procedimiento del fabricante, utilizando Amplitaq (Perkin Elmer, Applied Biosystems División, Foster City, CA), utilizando, el regulador PCR, ADN genómico del tomate y cualquiera de los pares de los preparadores anteriores, las siguientes condiciones (arranque rápido) 1 ciclo de 97°C durante 5 minutos siguiendo la adición de Amplitaq; 2 ciclos de 97°C durante 1 minuto, 52°C durante 1 minuto y 72°C durante 1 minuto 25 ciclos de 94°C durante 1 minuto, 52°C durante 1 minuto y 72°C durante 1 minuto 1 ciclo de 72°C durante 5 minutos; seguido por enfriamiento hasta 5°C Los fragmentos amplificados por PCR fueron digeridos cada uno por separado con Earl. Posteriormente, estos dos fragmentos amplificados fueron combinados en una reacción de ligación siguiendo el protocolo convencional (Gibco/BRL), utilizando el regulador y ligasa obtenida del Gibco/BRL. Los productos de reacción de ligasa fueron purificados y el ADN recuperado fue sometido a digestión con enzimas de restricción Ncol y HincfíW (?ew England Biolabas, Beverly, MA). Posteriormente el fragmento del promotor E8/E4 corto resultante, fue purificado y ligado dentro de un vector del plasma adecuado. El vector, que contiene el gen SAMsa, fue digerido con H/'naílll y Ncol, a fin de orientar el promotor híbrido inmediatamente a la corriente ascendente del gen SAMasa, con tanto el promotor como el gen colocado en la misma dirección de desde 5' hasta 3'. El plasma intermedio resultante que contiene un constructor del promotor híbrido E8/E corto::SAMsa, fue diseñado pAG-126 y se muestra en la Figura 4.

Ejemplo 4 Preparación de un Vector Binario que Contiene un Promotor Híbrido E8/E4 El cassette del promotor/gen anteriormente descrito, fue transferido a adentro de un vector binario, tal como se indica a continuación. El plasma pAG-126 fue digerido con H/ndlII y Kpnl, para producir un fragmento de 1.5 kb que contiene el promotor híbrido E8/E4 acoplado al gen SAMasa. El fragmento extirpado fue gel purificado. Un vector de plasma binario, pAG-7142, que contiene un cassette del gen marcador de selección y una secuencia exterminadora orientada hacia la corriente descendente del gen SAMase, fue tratado en forma similar con HindW y Kpnl. En la Figura 12 se muestra una representación esquemática del vector pAG-7142.

Posteriormente, un fragmento promotor híbrido E8/E4 corto de 1.5 kb::SAMasa, fue ligado al vector binario para producir el plasma, pAG-7182, tal como se muestra en la Figura 5.

Ejemplo 5 A. Construcción de Vectores Binarios que Contienen Promotores Conocidos Los vectores binarios pAG-7142 (E4::SAMasa) y pAG-7152 (E8::SAMasa) fueron construidos siguiendo los protocolos convencionales. Los mapas de restricción circular de estos vectores de plasma, se muestran en las Figuras 12 y 9 respectivamente. Los elementos contenidos en cada uno de los vectores fueron idénticos, con la excepción de la expresión de conducción del promotor del gen SAMasa. B. Transformación de Cucumis Meló (Melón) Las plantas cotiledóneas de una variedad de cantalope comercial, fueron transformadas de acuerdo con métodos conocidos (Fang y Grumet, 1990; Valles and Lasa, 1994; Dong y asociados; Gonsalves, y asociados, 1994; Yoshioka, y asociados, 1992; Ayub, y asociados, 1996). La deformación EHA105 del Agrobacterium desarmado (Hood, y asociados, 1993), fue utilizada para introducir dentro de las plantas los vectores binarios anteriormente descritos. La deformación de Agrobacterium desarmada, fue cultivada en conjunto con las plantas del tejido de cotiledón de melón. Los transformadores principales fueron seleccionados en base a su capacidad para regenerar y desarrollar raíces en medios que contienen el antibiótico canamicina.

La presencia del gen SAMasa en las plantas transgénicas putativas, fue confirmada utilizando la reacción en cadena de polimerasa y los preparadores específicos para el gen SAMasa. Las plantas transgénicas crecieron en un invernadero. La fruta de melón individual fue cosechada en una etapa en la que había iniciado el proceso de absición de la fruta. La fruta cosechada fue almacenada durante 7 días bajo refrigeración. Posteriormente las muestras fueron congeladas a -70°C para almacenarse antes de los estudios de expresión del gen.

Ejemplo 6 Análisis de Marcado del Oeste de la Expresión del Gen SMAasa Se prepararon lisatos de proteína a partir del tejido de la fruta pericarpa de melón de cada muestra y estuvieron libres de cualquier costra del tejido. Utilizando nitrógeno líquido y un mortero y maja, se molió un gramo de muestras de tejido hasta obtener un polvo fino, mezclado con el regulador de la muestra SDS Laemmli (Laemmli, 1970) y calentado a una temperatura de 95 a 100°C para desnaturalizar las proteínas. Las concentraciones de proteína fueron determinadas precipitando las proteínas del lisato de melón con ácido tricloroacético, volviendo a solubilizar las proteínas, seguido por una cuantificación de la concentración de proteínas utilizando un equipo de ensayo Pierce-s BCA (ácido bicinconinico),de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La electroforesis de gel sódico de poliacrilamida de sulfato dodecilo (SDS PAGE), se llevó a cabo utilizando el método de electroforesis de gel discontinuo de desnaturalización (SDS) (Laemmli, 1970).

Las proteínas resueltas mediante SDS PAGE, fueron marcadas durante 2 horas en la membrana Immobilion-P PVDF de Millipore en el regulador de metanol al 15% Tris-glicine en 100 volts durante 2 horas. Posteriormente, las membranas fueron tratadas con leche en polvo al 5% (p/v) en salina regulada de fosfato (PBS) que contiene Tween 20 durante 2 horas a temperatura ambiente. El tratamiento de anticuerpos principal se llevó a cabo utilizando 1 µg/ml de un anticuerpo monoclonal de ratón anti-SAMasa en leche en polvo al 3.5%/PBS-Tween 20 durante 2 horas a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario, un anticuerpo policlonal de cabra anti-ratón etiquetado como peroxidasa de rábano lgG+lgM(H + L) (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersberg, MD), fue utilizado para tratar la membrana en 0.1 µg/ml en leche en polvo al 3.5%/PBS-Tween 20 durante 2 horas a temperatura ambiente. El anticuerpo de la orilla de la membrana, fue detectado utilizando el reactivo de quimioluminiscencia Renaissance de NEN/Du Pont, en una incubación de 1 minuto, tal como lo indican las instrucciones del fabricante. Posteriormente la marca fue expuesta a la película de rayos-X BioMax de Kodak, durante por lo menos una hora.

Tabla 2 Resumen de los Vectores Aprobacterium Utilizados para Transformar el Melón Todas las construcciones del vector binario son idénticas con excepción a la expresión de control del promotor del gen SAMasa ejemplar. Se analizaron algunos casos transgénicos para cada uno de los vectores binarios, utilizando marcados del Oeste para determinar la expresión del gen SAMasa en la maduración del melón. Las Figuras 6 y 7, indican que ninguno de los promotores E8 o E4 solos, son equivalentes a los promotores híbridos E8/[E4, en particular el híbrido E8/E4 largo, en su capacidad para conducir la expresión del gen SAMasa en la maduración del melón.

Ejemplo 7 Producción de Etileno en los Transformantes del Melón Se determinaron los perfiles representativos de biosíntesis de etileno, durante un período de 4 días. En el día cero, el melón transformado estuvo en una etapa de maduración fisiológica conocida como desprendimiento de %. El "desprendimiento" en la terminología de maduración del melón, se refiere a la absición de la fruta desde la región del pedúnculo del tallo, el cual sujeta el melón a la vid. Por lo tanto, el desprendimiento de ?A significa la iniciación del proceso de maduración. El ensayo para la evolución de etileno en el fruto del melón transgénico, se lleva a cabo colocando un tazón de plástico en el extremo del tallo de la fruta individual y tomando muestras de 0.25 ml de alícuotas para el análisis cromatográfico de gas aproximadamente después de cuatro horas (Ayub, y asociados, 1996). Para las medidas de etileno, se utilizó un cromatógrafo de gas Hewlett Packard 6890 (Hewlett Packard, Palo Alto, CA) con un detector de ionización de flama y una columna Haysep-D de 6 pies. Este sistema, cuando se utiliza en combinación con una computadora Vectra HP y con la versión actual de "CHEMSTATION" (Hewlett Packard), permite medir concentraciones de etileno tan bajas como 0.1 ppm. En la Figura 8 se muestra la síntesis de etileno de los tres diferentes casos (pAG-7142, pAG-7152, pAG-7162), en donde las entradas seguidas de una designación(-) representan los controles negativos. Los resultados son los normales de otros casos transgénicos que han sido analizados hasta la fecha. Al observar ahora los resultados mostrados en la Figura 8, el evento derivado de pAG-7162 (promotor híbrido E8/E4 largo) se establece que es claramente reducida su capacidad para producir etileno durante la maduración por una extensión significativamente mayor a la de los casos conducidos del promotor E4 o E8. Los eventos conducidos del promotor híbrido E8/E4, demuestran una biosíntesis de etileno reducida, cuando se compara tanto con los controles negativos como con los otros casos conducidos del promotor no híbrido.

LISTA DE SECUENCIA <110> Agritope, Inc . <120> Promotores sintéticos de planta hibrida <130> 4257-0016.41 <140> sin asignar <141> 1998-09-18 <150> 60/059, 234 <151> 1997-09-18 <160> 10 <170> FastSEQ for Windows Versión 3.0 <210> 1 <211> 2327 <212> DNA <213> Secuencia Aetificial <220> <22l> Promotor <222> (1) ...(2327) , . _. ._ ,,« <223> Secuencia sintética de promotor de ADN <400> • 1 aagctttaat tggttgagat tgaacgtaat tcaaattatt ctgagcccaa acccttaaaa 60 ttctaggcgg ttatctttgt ttgaattcat ttttgacatc cctaatgata ttgttcacgt 120 aattaagttt tgtggaagtg agagagtcca attttgataa gaaaagagtc agaaaacgta 180 atattttaaa agtctaaatc tttctacaaa taagagcaaa tttatttatt ttttaatcca 240 ataaatatta a ggaggaca aattcaattc acttggttgt aaaataaact taaaccaata 300 accaaagavc taataaatct gaagtggaat tattaaggat aatgtacata gacaatgaag 360 aaataatagg ttcgatgaat taataataat taaggatgtt acaatcatca tgtgccaagt 420 atatacacaa tattctatgg gatttataat ttcgttactt cacttaactt ttgcgtaaat 480 aaaacgaatt atctgatatt ttataataaa acagttaatt aagaaccatc atttttaaca 540 acatagatat attatttcta atagtttaat gatactttta aatcttttaa attttatgtt 600 tcttttagaa aataaaaatt caaaaaaatt aaatatattt acaaaaacta caatcaaaca 660 caacttcata tattaaaagc aaaatatatt ttgaaaattt caagtgtcct aacaaataag 720 acaagaggaa aatgtacgat gagagacata aagagaacta ataattgagg agtcctataa 780 tatataataa agtttattag taaacttaat tattaaggac tcctaaaata tatgatagga 840 gaaaatgaat ggtgagagat attggaaaac ttaataatta aggatnttaa aatatatggt 900 aaaagatagg caaagtatcc attatcccct tttaacttga agtctaccta ggcgcatgtg 960 aaaggttgat tttttgtcac gtcatatagc tataacgtaa aaaaagaaag taaaattttt 1020 aatttttttt aatatatgac atattttaaa cgaaatatag gacaaaatgt aaatgaatag 1080 taaaggaaac aaagattaat acttactttg taagaattta agataaattt aaaatttaat 1140 agatcaactt tacgttaaag taaacttggg tgggtcaaga cccaactcga tttctgttca 1200 acccatttta atatttctat tttcaaccta acccgctcat ttgatacccc tacaaatatc 1260 atatttgtgt gtgaaatatt ttttgggctg gagagagagg ccccgagggg agtggagggg 1320 tggggtgggg agagagagcg agaaagagtg gagagagaaa tttgatatga aatcctacat 1380 atattacaga ttgtaatgtt ctaaactata acgatttgtc ataaacacat atcatggatt 1440 tgtctttttg tgtaattttc ccaattgtaa ataggacttc gttatttgaa acttgaaagt 1500 gaagtcacat agattaagta caaacattaa ttaaagaccg tggtggaatg ataaatattt 1560 atttatcttt aattagttat ttttttggga gctctttatt ccaatgtgag acttttgcga 1620 catatattca aatttaatcg aatcacaata tgtattagat tgataaaaaa ataatttttt 1680 tacaatgtta gttgagactc ataacttact gcctattggt aatctatgac tcctaattcc 1740 ttaattattt aaatatatca tcttgatcgt taacaaagta atttcgaaag accacgagta 1800 agaagacaaa cgagaatacc aaaaaattca aaaatttaat gtgatttggt caatcgatct . 1860 acgtccataa aggagatgag taatctacta taaatatgag agtacaaaat acagagagaa 1920 acaacctcaa ctaattcact cggaatacat gagaagttca cacaagtgat aacgtatcaa 1980 acttgtgacc cacacttttc cctctaacca aagctcttaa aactatattg tgaatgctga 2040 ttaagttaaa cgaaacagtc ctaaatcttt tccgtcctat gagaaacaag attaatcaat 2100 tcacaatttt tttaaaaaga aaaacctgta agaaatttag gcaaacaaaa cctaacacaa 2160 gtttgttttt gtttttacta ccaacaagaa attcaaatgg caaatgtata acgcatctta 2220 gctaattata tgaccagatt cagattaata tacatcttca cccatgcaat ccatttctat 2280 ataaagaaac atacacgaac ttgatattat tagagattga gccatgg 2327 <210> 2 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial ' <220> <221> p imer_bind <222> (1)...(23) <223> Aligonucleotido sintético <400> 2 actcttccac acttttccct cta 23 <210> 3 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <22l> primer_bind <222> (l) . . . (2p) <223 > aligonucleotido sintético <400> 3 cccatggctc aatctctaat 20 <210> 4 <211> 24 <212> ADN <213 > Secuencia Artificial <220> <221> primer_bind <222> (1)...(24,) <223> aligonucleotido sintético <400> 4 caagcttaaa atgtacgatg agag 24 <210> 5 <211> 28 <212> AEN <213> Secuencia Artificial <220> <221> primer_bind <222> (1)...(28) <223> aligonucleotido sintético <400> 5 agtgtcgaag aggactaaac ccgaaaat 28 <210> 6 <211> 1028 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <221> Promotor <222> (1) ... (1028) , <223> secuencia sintética de promotor ADN <400i . 6 cttaaaatgt acgatgagag acataaagag aactaataat tgaggagtcc tataatatat 60 aataaagttt attagtaaac ttaattatta aggactccta aaatatatga taggagaaaa 120 tgaatggtga gagatattgg aaaacttaat aattaaggat nttaaaatat atggtaaaag 180 ataggcaaag tatccattat ccccttttaa cttgaagtct acctaggcgc atgtgaaagg 240 ttgatttttt gtcacgtcat atagctataa cgtaaaaaaa gaaagtaaaa tttttaattt 300 tttttaatat atgacatatt ttaaacgaaa tataggacaa aatgtaaatg aatagtaaag 360 gaaacaaaga ttaatactta ctttgtaaga atttaagata aatttaaaat ttaatagatc 420 aactttacgt ctagaaagac ccatatctag aaggaatttc acgaaatcgg cccttattca 480 aaaataactt ttaaataatg aattttaaat tttaagaaat aatatccaat gaataaatga 540 catgtagcat tttacctaaa tatttcaact attttaatcc aatattaatt tgttttattc 600 ccaacaatag aaagtcttgt gcagacattt aatctgactt ttccagtact aaatattaat 660 tttctgaaga ttttcgggtt tagtcctctt cgacactttt ccctctaacc aaagctctta 720 aaactatatt gtgaatgctg attaagttaa acgaaacagt cctaaatctt ttccgtccta 780 tgagaaacaa gattaatcaa ttcacaattt ttttaaaaag aaaaacctgt aagaaattta 840 ggcaaacaaa acctaacaca agtttgtttt tgtttttact accaacaaga aattcaaatg 900 gcaaatgtat aacgcatctt agctaattat atgaccagat tcagattaat atacatcttc 960 acccatgcaa tccatttcta tataaagaaa catacacgaa cttgatatta ttagagattg 1020 agccatgg 1028 <210> 7 <211> 2298 <212> AEN <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia sintética de hibrido de ADN <400> • 7 aagctttaat tggttgagat tgaacgtaat tcaaattatt ctgagcccaa acccttaaaa 60 ttctaggcgg ttatctttgt ttgaattcat ttttgacatc cctaatgata ttgttcacgt 120 aattaagttt tgtggaagtg agagagtcca attttgataa gaaaagagtc agaaaacgta 180 atattttaaa agtctaaatc tttctacaaa taagagcaaa tttatttatt ttttaatcca 240 ataaatatta atggaggaca aattcaattc acttggttgt aaaataaact taaaccaata 300 accaaaganc taataaatct gaagtggaat tattaaggat aatgtacata gacaatgaag 360 aaataatagg ttcgatgaat taataataat taaggatgtt acaatcatca tgtgccaagt 420 atatacacaa tattctatgg gatttataat ttcgttactt cacttaactt ttgcgtaaat 480 aaaacgaatt atctgatatt ttataataaa acagttaatt aagaaccatc atttttaaca 540 acatagatat attatttcta atagtttaat gatactttta aatcttttaa attttatgtt 600 tcttttagaa aataaaaatt caaaaaaatt aaatatattt acaaaaacta caatcaaaca 660 caacttcata tattaaaagc aaaatatatt ttgaaaattt caagtgtcct aacaaataag 720 acaagaggaa aatgtacgat gagagacata aagagaacta ataattgagg agtcctataa 780 tatataataa agtttattag taaacttaat tattaaggac tcctaaaata tatgatagga 840 gaaaatgaat ggtgagagat attggaaaac ttaataatta aggatnttaa aatatatggt 900 aaaagatagg caaagtatcc attatcccct tttaacttga agtctaccta ggcgcatgtg 960 aaaggttgat tttttgtcac gtcatatagc tataacgtaa aaaaagaaag taaaattttt 1020 aatttttttt aatatatgac atattttaaa cgaaatatag gacaaaatgt aaatgaatag 1080 taaaggaaac aaagattaat acttactttg taagaattta agataaattt aaaatttaat 1140 agatcaactt tacgtctaga aagacccata tctagaagga atttcacgaa atcggccctt 1200 attcaaaaat aacttttaaa taatgaattt taaattttaa gaaataatat ccaatgaata 1260 aatgacatgt agcattttac ctaaatattt caactatttt aatccaatat taatttgttt . 1320 tattcccaac aatagaaagt cttgtgcaga catttaatct gacttttcca gtactaaata 1380-: ttaattttct gaagattttc gggtttagtc cacaagtttt agtgagaagt tttgctcaaa 1440 attttaggtg agaaggtttg atatttatct tttgttaaat taatttatct aggtgactat 1500 tatttattta agtagaaatt catatcatta cttttgccaa cttgtagtca taataggagt 1560 aggtgtatat gatgaaggaa taaacaagtt cagtgaagtg attaaaataa aatataattt 1620 aggtgtacat caaataaaaa ccttaaagtt tagaaaggca ccgaataatt ttgcatagaa 1680 gatattagta aatttataaa aataaaagaa atgtagttgt caagttgtct tctttttttt 1740 ggataaaaat agcagttggc ttatgtcatt cttttacaac ctccatgcca cttgtccaat 1800 tgttgacact taactaatta gtttgattca tgtatgaata ctaaataatt ttttaggact 1860 gactcaaata tttttatatt atcatagtaa tatttatcta atttttagga ccacttatta 1920 ctaaataata aattaactac tactatatta ttgttgtgaa acaacaacgt tttggttgtt 1980 atgatgaaac gtacactata tcagtatgaa aaattcaaaa cgattagtat aaattatatt 2040 gaaaatttga tatttttcta ttcttaatca gacgtattgg gtttcatatt ttaaaaaggg 2100 actaaactta gaagagaagt ttgtttgaaa ctacttttgt ctctttcttg ttcccatttc 2160 tctcttagat ttcaaaaagt gaactacttt atctctttct ttgttcacat tttattttat 2220 tctattataa atatggcatc ctcatattga gatttttaga aattattcta atcattcaca 2280 gtgcaaaaga ccatggaa 2298 <210> 8 <211> 2796 <212>ADN <213> Solanum esculentum <400> 8 gaattctcaa ttgagcccaa ttcaatctcc aatttcaacc cgttttaaaa ctttttatta 60 agatatgttt ctatattgaa agtatgaatt attatctatt taacatcttt taggatttat 120 ctatccattt gctacttttt taacaaaaaa ttcttgagtg aaaattcaaa ttgtgattat 180 aaaagttaaa tatcaatatg ttaaattatt aagattaatc gggtcaaatt ggcgggtcaa 240 ggcccaattc ttttttagcc catttaagct caaagtaaac ttgggtgggt caagacccaa 300 ctcgatttct gttcaaccca ttttaatatt tctattttca acctaacccg ctcatttgat 360 acccctacaa atatcatatt tgtgtgtgaa atattttttg ggctggagag agaggccccg 420 aggggagtgg aggggtgggg tggggagaga gagcgagaaa gagtggagag agaaatttga 480 tatgaaatcc tacatatatt acagattgta atgttctaaa ctataacgat ttgtcataaa 540 cacatatcat ggatttgtct ttttgtgtaa ttttcccaat tgtaaatagg acttcgttat 600 ttgaaacttg aaagtgaagt cacatagatt aagtacaaac attaattaaa gaccgtggtg 660 gaatgataaa tatttattta tctttaatta gttatttttt tgggagctct ttattccaat 720 gtgagacttt tgcgacatat attcaaattt aatcgaatca caatatgtat tagattgata 780 aaaaaataat ttttttacaa tgttagttga gactcataac ttactgccta ttggtaatct 840 atgactccta attccttaat tatttaaata tatcatcttg atcgttaaca aagtaatttc 900 gaaagaccac gagtaagaag acaaacgaga ataccaaaaa attcaaaaat ttaatgtgat 960 ttggtcaatc gatctacgtc cataaaggag atgagtaatc tactataaat atgagagtac 1020 aaaatacaga gagaaacaac ctcaactaat tcactcggaa tacatgagaa gttcacacaa 1080 gtgataacgt atcaaacttg tgacccacac ttttccctct aaccaaagct cttaaaacta 1140 tattgtgaat gctgattaag ttaaacgaaa cagtcctaaa tcttttccgt cctatgagaa 1200 acaagattaa tcaattcaca atttttttaa aaagaaaaac ctgtaagaaa tttaggcaaa 1260 caaaacctaa cacaagtttg tttttgtttt tactaccaac aagaaattca aatggcaaat 1320 gtataacgca tcttagctaa ttatatgacc agattcagat taatatacat cttcacccat 1380 gcaatccatt tctatataaa gaaacataca cgaacttgat attattagag attgagcaat 1440 ggagggtaac aacagcagta gcaagtcaac caccaatcca gcattggatc cggatctgga 1500 cagcccggat cagccgggtc tggagtttgc ccaatttgct gccggctgct tttggggagt 1560 cgaattggct ttccagaggg ttggaggagt agtgaagacg gaggttgggt actctcaggg 1620 gaatgtccat gacccgaact acaagcttat ttgctccgga acaaccgaac atgccgaggc 1680 cattcggatc cagtttgacc cgaatgtctg cccgtattcc aatctccttt ctctattttg 1740 gagtcgccat gacccgacca ctctaaatcg ccaggtatca aattcctttg gtgtttcatt 1800 ttatgtgatt aatattaaaa attttttata taaatgtcat gatgatggtt gttgctaggg 1860 taatgatgtg ggaaagcaat accgctcagg aatatattac tataatgatg ctcaggctca 1920 actggcaagg gagtcgttag aagctaagca gaaggaattt atggataaga aaattgtcac 1980 tgaaattctt cctgctaaga gattttatag agctgaagag tatcaccagc aatatctaga 2040 gaagggtggg ggcagaggtt gtaagcagtc ggctgcaaag ggctgcaatg acccaataag 2100 gtgctacggt tgacagcaga tctttgaatg tcatagcaac tacaaaagaa cttgttagac 2160 atttgctgtc ttgcttcttt aaatttgaat aaacatgaca atgattctta taactacttg 2220 ctctcttgga tggaataact agttgtcgta aagtattctc ctcttgctaa ttattatctc 2280 tctttatatg gtacctgcaa tttgttgctt tagttacaga ataatggacg tcaattctat 2340 atcttaattt gttttaagtc ttaaatgagg tggtttgtgt ttgaaagcaa tatcaagcat 2400 agtaatacca atgatttagt agatgaactt aatcaaatca aattccaaaa tgcagtctac 2460 aaattgacaa catgaagtta agtgtatctt atgtaaattg acatctttcc tagtagatgc 2520 ctaatacttt tgtaaagact aaaataagca cagatgaggc ttgtgcattt aacttagagt 2580 tcatccttag gtgtggctgc aggagaccct gtagggttgc ttgaagtctt gatggggtag 2640 gagggttgca ttgctatacc acacaacccc tcttcagcgt caaccttgcg ctgcattcta 2700 atgtatcctt tttctcccca ttcagctccc catgagttct tcacaatcca gtatttggtt 2760 ccatcgacgg ttgtgccata ccccacaata gccaca 2796 <210> 9 <211> 363 <212> PRT <213> Solanum lycopersicum <400> 9 Met Glu Ser Pro Arg Val Glu Glu Ser Tyr Asp Lys Met Ser Glu Leu 1 5 10 15 Lys Ala Phe Asp Asp Thr Lys Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Asp Ser 20 25 30 Gly lie Thr Lys Val Pro Gln lie Phe Val Leu Pro Pro Lys Asp Arg 35 40 45 Ala Lys Lys Cys Glu Thr His Phe Val Phe Pro Val lie Asp Leu Gln 50 55 60 Gly lie Asp Glu Asp Pro lie Lys His Lys Glu lie Val Asp Lys Val 65 70 75 80 Arg Asp Ala Ser Glu Lys Trp Gly Phe Phe Gln Val Val Asn His Gly 85 90 95 He Pro Thr Ser Val Leu Asp Arg Thr Leu Gln Gly Thr Arg Gln Phe 100 105 110 Phe Glu Gln Asp Asn Glu Val Lys Lys Gln Tyr Tyr Thr Arg Asp Thr 115 120 125 Ala Lys Lys Val Val Tyr Thr Ser Asn Leu Asp Leu Tyr Lys Ser Ser 130 135 140 Val Pro Ala Ala Ser Trp Arg Asp Thr He Phe Cys Tyr Met Ala Pro 145 150 155 160 Asn Pro Pro Ser Leu Gln Glu Phe Pro Thr Pro Cys Gly Glu Ser Leu 165 170 175 He Asp Phe Ser Lys Asp Val Lys Lys Leu Gly Phe Thr Leu Leu Glu 180 185 190 Leu Leu Ser Glu Gly Leu Gly Leu Asp Arg Ser Tyr Leu Lys Asp Tyr 195 200 205 Met Asp Cys Phe His Leu Phe Cys Ser Cys Asn Tyr Tyr Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Gln Pro Glu Leu Thr Met Gly Thr He Gln His Thr Asp He Gly 225 230 235 240 Phe Val Thr He Leu Leu Gln Asp Asp Met Gly Gly Leu Gln Val Leu 245 250 255 His Gln Asn His Trp Val Asp Val Pro Pro Thr Pro Gly Ser Leu Val 260 265 270 Val Asn He Gly Asp Phe Leu Gln Leu Leu Ser Asn Asp Lys Tyr Leu 275 280 285 Ser Val Glu His Arg Ala He Ser Asn Asn Val Gly Ser Arg Met Ser 290 295 300 He Thr Cys Phe Phe Gly Glu Ser Pro Tyr Gln Ser Ser Lys Leu Tyr 305 310 315 320 Gly Pro He Thr Glu Leu Leu Ser Glu Asp Asn Pro Pro Lys Tyr Arg 325 330 335 Ala Thr Thr Val Lys Asp His Thr Ser Tyr Leu His Asn Arg Gly Leu 340 345 350 Asp Gly Thr Ser Ala Leu Ser Arg Tyr Lys He 355 360 <210> 10 <211> 196 <212> PRT <213> Solanum esculentum <400> 10 Met Glu Gly Asn Asn Ser Ser Ser Lys Ser Thr Thr Asn Pro Ala Leu 1 5 10 15 Asp Pro Asp Leu Asp Ser Pro Asp Gln Pro Gly Leu Glu Phe Ala Gln 20 25 30 Phe Ala Ala Gly Cys Phe Trp Gly Val Glu Leu Ala Phe Gln Arg Val 40 45 Gly Gly Val Val Lys Thr Glu Val Gly Tyr Ser Gln Gly Asn Val His 50 55 60 Asp Pro Asn Tyr Lys Leu He Cys Ser Gly Thr Thr Glu His Ala Glu 65 70 75 80 Ala He Arg He Gln Phe Asp Pro Asn Val Cys Pro Tyr Ser Asn Leu 85 90 95 Leu Ser Leu Phe Trp Ser Arg His Asp Pro Thr Thr Leu Asn Arg Gln 100 105 110 Gly Asn Asp Val Gly Lys Gln Tyr Arg Ser Gly He Tyr Tyr Tyr Met 115 120 125 Asp Ala Gln Ala Gln Leu Ala Arg Glu Ser Leu Glu Ala Lys Gln Lys 130 135 140 Glu Phe Met Asp Lys Lys He Val Thr Glu He Leu Pro Ala Lys Arg 145 150 155 160 Phe Tyr Arg Ala Glu Glu Tyr His Gln Gln Tyr Leu Glu Lys Gly Gly 165 170 175 Gly Arg Gly Cys Lys Gln Ser Ala Ala Lys Gly Cys Asn Asp Pro He 180 185 190 Arg Cys Tyr Gly 195

Claims (24)

R E I V I N D I C A C I O N E S Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES

1. Una construcción de ADN que comprende, una dirección de desde 5' hasta 3': (i) un promotor híbrido que comprende un segmento de por lo menos 30 nucleótidos contiguos seleccionados de la región que se extiende desde los nucleótidos 1 hasta 1395 de la SEQ ID NO:7 del promotor del gen E8 del tomate o equivalente funcional del mismo, fusionado a un segmento polinucleótido de por lo menos 200 nucleótidos contiguos seleccionados de la región que se extiende desde los nucleótidos 271 hasta 1437 de la SEQ ID NO:8, o equivalente funcional de los mismos y una secuencia de ADN heteróloga enlazada en forma operable a dicho promotor híbrido, por lo que dicho promotor híbrido es efectivo para conducir la expresión de un gen reportero en un nivel de por lo menos aproximadamente 75-300% del nivel de expresión obtenido, utilizando ya sea un promotor del gen E4 del tomate sin modificar o E8 sin modificar, enlazado en forma operable a dicho reportero.

2. La construcción de ADN tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho segmento del promotor E4 del tomate, comprende nucleótidos desde el 729 hasta el 1411 de la SEQ ID NO:7 55

3. La construcción de ADN tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho segmento del promotor E4 del tomate, comprende nucleótidos desde el 1107 hasta el 1437 de la SEQ ID NO:7.

4. La construcción de ADN tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho promotor híbrido comprende un segmento del promotor E8 del tomate que consiste esencialmente de nucleótidos desde el 720 hasta el 1411 de la SEQ ID NO:7 y un segmento del promotor E4 del tomate que consiste esencialmente de nucleótidos desde el 1107 hasta el 1437 de la SEQ ID NO:8.

5. La construcción de ADN tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho segmento del promotor E4 del tomate, comprende nucleótidos desde el 1 hasta el 1156 de la SEQ ID NO:7.

6. La construcción de ADN tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho segmento del promotor E4 del tomate, comprende nucleótidos desde el 271 hasta el 1437 de la SEQ ID NO:7.

7. La construcción de ADN tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho promotor híbrido comprende un segmento del promotor E8 del tomate que consiste esencialmente de nucleótidos desde el 1 hasta el 1156 de la SEQ ID NO:7 y un segmento del promotor E4 del tomate que 56 consiste esencialmente de nucleótidos desde el 271 hasta el 1437 de la SEQ ID NO:8.

8. Una construcción de ADN tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizada además dicha secuencia de ADN heteróloga codifica un producto efectivo para reducir de la biosíntises de etileno o retrasar la maduración cuando se expresa en frutas de una planta que contiene fruta.

9. Una construcción de ADN tal y como se describe en la reivindicación 8, caracterizada además porque dicha secuencia de ADN heteróloga codifica un producto seleccionado del grupo que consiste de hidrolasa S-adenosilmetionina (SAMasa), sintasa fitoena, desaminasa de ácido carboxílico-1-aminociclopropano (ACC), molécula de antipercepción de oxidasa ACC, molécula de antipercepción de sintasa ACC, molécula de supresión conjunta de oxidasa ACC, y molécula de supresión conjunta de sintasa ACC.

10. Una construcción de ADN tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho ADN heteróloga que codifica la secuencia que corresponde a un gen de resistencia por patogénesis.

11. La construcción de ADN tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho promotor híbrido es un promotor de respuesta al etileno. 57

12. La construcción de ADN tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho promotor híbrido es un promotor específico de fruta.

13. Un vector de transformación de la planta que contiene la construcción de ADN tal y como se describe en cualesquiera de las Reivindicaciones del 1 al 12.

14. Una célula de la planta dicotiledónea transformada con la construcción ADN tal y como se describe en cualesquiera de las Reivindicaciones del 1 al 12.

15. Un equipo para usarse en la transformación de la planta que comprende el vector tal y como se describe en la Reivindicación 13.

16. Un método para la producción de una planta transgénica que comprende las etapas de: (i) introducir dentro de las células del progenitor de dicha planta una construcción de ADN tal y como se describe en cualesquiera de las Reivindicaciones del 1 al 12 para producir células de la planta transformada, y (ii) hacer crecer las células de la planta del progenitor transformada para producir una planta transgénica que tiene la capacidad de expresar dicha secuencia de codificación ADN heteróloga. 58

17. Un método tal y como se describe en la Reivindicación 16, caracterizado además porque (i) dicha planta transgénica es una planta que contiene fruta, (ii) dicho crecimiento produce una fruta que contiene la planta transgénica, y (iii) dicha secuencia que codifica el ADN heterólogo es expresada preferentemente en la fruta de dicha planta.

18. Un método tal y como se describe en la Reivindicación 16, caracterizado además porque dicha planta es seleccionada del grupo que consiste de Cucumis sp., frambuesa, fresa y tomate.

19. Un método tal y como se describe en la Reivindicación 16, caracterizado además porque dicha planta es Cucumis sp.

20. Un método para inhibir la maduración de la fruta proveniente de una planta que contiene fruta, el cual comprende: (i) introducir dentro de las células del progenitor de dicha planta una construcción de ADN tal y como se describe en la Reivindicación 8 para producir células de plantas transformadas, (ii) hacer crecer las células de la planta del progenitor transformadas para producir una fruta que contiene la planta transgénica, en donde dicha secuencia de ADN heteróloga se expresa en dicha fruta para formar un producto efectivo para retrasar el tiempo de maduración de la fruta en relación con la fruta no transformada. 59

21. El método tal y como se describe en la Reivindicación 20, caracterizado además porque, (i) el fragmento del promotor E8 del tomate comprende nucleótidos del 1 al 1156 de la SEQ ID NO:7, (ii) el segmento del promotor E4 del tomate comprende nucleótidos del 271 al 1437 de la SEQ ID NO:8, y (iii) dicha secuencia de codificación de ADN heteróloga codifica el gen SAMasa.

22. El método tal y como se describe en la Reivindicación 20, caracterizado además porque, (i) el fragmento del promotor E8 del tomate comprende nucleótidos del 712 al 1395 de la SEQ ID NO:7, (ii) el segmento del promotor E4 del tomate comprende nucleótidos del 1107 al 1437 de la SEQ ID NO:8, y (iii) dicha secuencia de codificación de ADN heteróloga codifica el gen SAMasa.

23. El método tal y como se describe en la Reivindicación 20, caracterizado además porque dicha fruta es melón.

24. Un método para conferir la actividad de la expresión mejorada a un promotor E4 del tomate que comprende: la fusión en una orientación de corriente ascendente hacia un segmento polinucleótido promotor E4 del tomate de por lo menos 200 nucleótidos contiguos seleccionados de la región que se extiende desde las posiciones nucleótidas de la 271 a la 1437 de la SEQ ID NO:8, un segmento polinucleótido de por lo menos 30 nucleótidos contiguos seleccionados de la región que se extiende desde las 60 posiciones nucleótidas 1 a la 1395 de la SEQ ID NO:7 del promotor del gen E8 del tomate, para formar de este modo un promotor E8-E4 híbrido que tiene la capacidad de regular la expresión de un gen heterólogo enlazado en forma operable al mismo. En donde dicho promotor híbrido es efectivo para conducir la expresión de dicho gen heterólogo en un nivel de por lo menos aproximadamente el 75-300% del nivel de expresión obtenido, utilizando un promotor del gen E4 del tomate sin modificar, enlazado en forma operable a dicho gen heterólogo. 61