CN116836981A - 一种大豆种子贮藏蛋白基因的启动子GmGy5P及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种能够在大豆种子特异表达的GmGy5的启动子GmGy5P及其应用。本发明启动子GmGy5P的核苷酸序列包括如下几种核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID NO：1所示序列；2)与序列表中SEQ ID NO.1所示序列具有90％以上同源性的序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该启动子GmGy5P可以驱动外源基因在植物种子中的表达。该序列可以驱动目的基因在大豆种子中特异表达，能够用于通过基因工程手段改良大豆种子品质，以大豆种子颜色作为筛选标记应用于进行大豆智能核不育系的创制，以及进行大豆分子设计育种等。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种大豆种子特异表达的大豆贮藏蛋白基因GmGy5的启动子GmGy5P及其应用。
背景技术
启动子是基因表达调控的重要顺式作用元件。根据基因的表达模式可以将启动子分为：组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子三大类。其中，组织特异性启动子可以精确调控基因在某些特定组织部位的表达。植物组织特异性启动子主要包括根特异性启动子、茎特异性启动子、叶特异性启动子、花特异性启动子以及种子特异性启动子等。
大豆(Glycine max(Linn.)Merr.)作为一种重要的粮油经济作物，其种子是主要的食用部位，为人类和动物提供了丰富的蛋白质和油脂来源。大豆种子中贮藏蛋白的含量最为丰富。种子贮藏蛋白基因启动子仅在种子成熟过程的中期至晚期调控下游基因的表达，在其他组织中不表达或少量表达，具有显著的组织和发育时期转录表达的特异性。该特性可以减少对其他重要农艺性状的影响，在植物基因工程育种中具有重要的应用价值。因此，深入研究大豆种子贮藏蛋白基因启动子及其应用在定向改良大豆种子品质性状以及大豆种子基因工程育种方面具有重要的理论和实践意义。
发明内容
一方面，本发明提供一种大豆种子贮藏蛋白基因GmGy5的启动子GmGy5P，其包括以下核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；
2)与序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列；
3)在高严谨条件下与序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
根据本发明的一个优选实施方案，其中启动子GmGy5P通过引物对来扩增，引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
根据本发明的一个优选实施方案，其中与序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有95％以上、优选98％以上、更优选99％以上、最优选100％同源性的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供启动子GmGy5P驱动外源基因在大豆种子中表达的应用，其中通过基因工程手段利用启动子GmGy5P来构建载体，转化大肠杆菌、农杆菌，然后利用农杆菌浸染大豆，进而驱动外源基因在大豆种子中表达。
根据本发明的另一个优选实施方案，其中载体包括大肠杆菌表达载体和农杆菌表达载体。
根据本发明的另一个优选实施方案，其中大肠杆菌包括利用启动子GmGy5P构建的载体转化的大肠杆菌菌株，农杆菌包括利用启动子GmGy5P构建的植物表达载体转化的农杆菌菌株。
根据本发明的另一个优选实施方案，其中驱动外源基因在大豆种子中表达包括通过基因工程手段改良大豆种子的品质，以大豆种子的颜色作为筛选标记进行大豆智能核不育系的创制，以及进行大豆分子设计育种。
根据本发明的一个特别优选的技术方案，其中启动子GmGy5P的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
优选地，扩增启动子GmGy5P的引物GmGy5P-F1和GmGy5P-R1的核苷酸序列为：
GmGy5P-F1：5′-TGACCACCCTTCAACAACCTGC-3′；
GmGy5P-R1：5′-ATTGAACTAAGGAAAGTGTTAA-3′。
优选地，外源基因为DsRed2基因。
优选地，植物表达载体为pCAMBIA3301-GmGy5P::DsRed2。
更优选地，上述植物表达载体的构建以pEASY-GmGy5P质粒为模板，以引物GmGy5P-F2和GmGy5P-R2进行PCR扩增，得到的片段经无缝克隆技术连接到经XmaI和HindIII酶切的植物表达载体pCAMBIA3301上，筛选阳性克隆并测序，测序正确后，获得植物表达载体pCAMBIA3301-GmGy5P::DsRed2。
进一步优选地，引物GmGy5P-F2和GmGy5P-R2的核苷酸序列为：
GmGy5P-F2：
5′-attcgagctcggtacccgggTGACCACCCTTCAACAACCTG-3′；
GmGy5P-R2：
5′-ctcggaggaggccatATTGAACTAAGGAAAGTGTTAATAAGTTTGAA-3′。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种大豆种子贮藏蛋白基因GmGy5的启动子GmGy5P，该启动子可以驱动外源基因在大豆种子中表达。本发明对大豆种子基因工程育种或以大豆种子颜色作为筛选标记应用于大豆智能核不育的培育以及大豆分子设计育种等具有重要的应用价值。
附图说明
图1为半定量PCR检测GmGy5基因在大豆根、茎、叶、花、豆荚及成熟种子中的表达情况，GmActin是内标基因。
图2为本发明实施例1中的大豆贮藏蛋白启动子GmGy5P片段电泳图。
图3为大豆贮藏蛋白GmGy5启动子GmGy5P的核苷酸序列分析。
图4为构建大豆种子贮藏蛋白启动子GmGy5P与DsRed2融合的重组载体pCAMBIA3301-GmGy5P::DsRed2简图。
图5为野生型吉育93和pCAMBIA3301-GmGy5P::DsRed2转基因大豆植株种子的颜色观察，其中图A代表野生型吉育93种子；图B代表pCAMBIA3301-GmGy5P::DsRed2-T2代纯合转基因种子。
图6为野生型吉育93和pCAMBIA3301-GmGy5P::DsRed2转基因大豆植株种子在红色荧光蛋白激发光下的观察结果，其中图A代表野生型吉育93种子分别在明场和红色荧光蛋白激发光下的观察结果；图B代表pCAMBIA3301-GmGy5P::DsRed2-T2代纯合转基因种子分别在明场和红色荧光蛋白激发光下的观察结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为植物分子生物学研究的常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1大豆贮藏蛋白基因GmGy5的表达分析
1.大豆各组织总RNA的提取
取适量的大豆的根、茎、叶、花、豆荚和成熟种子等各组织样品，将其装入已标记好的RNase-free EP管中，并放入3粒高温灭菌的钢珠于液氮中速冻，然后取出置于冷冻混合球磨仪中以最大频率打碎1min；向其中加入1.2ml已预冷的的Trizol，剧烈振荡，使样品充分混匀，涡旋震荡20s；将样品放入小型冷冻离心机中，4℃、12,000rpm离心10min，吸取上清液，将上清液移入新的RNase-free EP管中；向样品中加入200μL氯仿，快速混匀15s后，置于冰上静置5min；待样品分层后，将离心管放入小型冷冻离心机中，4℃、12,000rpm离心15min；吸取600μL上清液于新的RNase-free EP管中，再加入一倍体积已预冷的异丙醇溶液(-20℃预冷)，轻轻混匀，然后放入-20℃冰箱沉降，放置20～30min；将样品从-20℃冰箱中取出，放入小型冷冻离心机中，4℃、12,000rpm离心15min，倒掉上清液；配置70％的乙醇溶液清洗沉淀物，每次加入500μL70％的乙醇，清洗两次后，轻离，用移液器吸出多余的液体后放置超净台上吹干，然后加入10～20μL不含RNA酶的无菌水吹打混匀沉淀，使RNA充分溶解；取1μL RNA溶液，用紫外分光光度计检测所提取RNA的浓度，并记录A260/A280的数值；取2ug的RNA溶液进行1％的琼脂糖凝胶电泳，检测所提取的RNA的完整性。
2.第一链cDNA的合成和gDNA的去除
参照One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)的使用说明进行。按以下步骤操作：
按以下条件加入样品：
(1)按上述列表依次加入试剂，轻轻混匀样品，42℃孵育15min；
(2)85℃加热5s，失活RT/RI与gDNA清除剂；
(3)取1μL cDNA溶液，用紫外分光光度计检测cDNA的浓度，并记录A260/A280的数值；
3.半定量PCR反应：
根据种子贮藏蛋白基因GmGy5的CDS序列设计如下引物，GmGy5-F：5′-ATGGGGAAGCCCTTCTTCACTC-3′；
GmGy5-R：5′-CTCCGAAGGGATTGCCCTAAAC-3′。
将上述反转录得到的产物稀释5倍，进行PCR扩增。大豆GmActin基因作为内参，并用1％琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物片段大小。结果如图1所示，该基因只在种子中有很强的表达信号，在根、茎、叶片、花、豆荚中均不表达，该结果表明该基因仅在种子中特异表达。
实施例2大豆贮藏蛋白GmGy5启动子的获得与鉴定
1.种子贮藏蛋白GmGy5启动子的克隆
利用CTAB法提取大豆基因组DNA，并设计引物扩增GmGy5启动子序列(SEQ IDNO.1)，扩增引物为：
GmGy5P-F1：5′-TGACCACCCTTCAACAACCTGC-3′；
GmGy5P-R1：5′-ATTGAACTAAGGAAAGTGTTAA-3′。
扩增序列大小为1604bp。经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，扩增片段长度大约为1604bp，与预计相符。将克隆产物与克隆载体pEASY-Blunt Simple(购自北京全式金生物技术有限公司)连接，转化大肠杆菌，通过抗生素筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，摇菌，提取质粒并测序。测序鉴定结果正确的菌株保存于-80℃冰箱中。
2.种子贮藏蛋白GmGy5的启动子核苷酸序列分析
大豆贮藏蛋白GmGy5的启动子GmGy5P序列中包含多种与种子特异性表达相关的顺式作用元件，如图3所示。该核苷酸序列中存在种子成熟阶段不可缺少的G-box(GACGTG)和B-box(ACGTGG)元件；胚特异蛋白SEF1-基序(ATATTTAWW)，该基序能够增强启动子的转录活性；胚特异蛋白SEF4的结合位点SEF4-基序(RTTTTTC)；胚乳表达顺式作用元件Skn-1_基序(GTCAT)；参与三酰甘油合成的E-box(CANNTG)元件；广泛存在于双子叶和单子叶植物种子特异表达基因启动子中的RY-基序[CATGCA(TG)]；还有一些与种子特异表达有关的元件，如AACA-基序、ACGT-基序，以及启动子常见的元件TATA-box、CAAT-box等。
3.GmGy5P启动子驱动DsRed2基因表达的植物表达载体构建
以pEASY-GmGy5P质粒为模板，用GmGy5P-F2和GmGy5P-R2引物进行扩增，扩增引物序列为：
GmGy5P-F2：
5′-attcgagctcggtacccgggTGACCACCCTTCAACAACCTG-3′；
GmGy5P-R2：
5′-ctcggaggaggccatATTGAACTAAGGAAAGTGTTAATAAGTTTGAA-3′。
回收扩增目的片段。将得到的片段经无缝克隆技术连接到经XmaI和HindIII酶切的植物表达载体pCAMBIA3301上，将连接产物转入DH5α感受态细胞中，37℃振荡培养1小时后涂板，过夜培养。挑取单克隆，进行菌落PCR验证，将验证结果正确的质粒送去测序。将测序结果正确的质粒命名为pCAMBIA3301-GmGy5P::DsRed2(图4)。将测序正确的质粒转入农杆菌EHA105感受态中，挑取单克隆，并接种于含有50μg/mL Kan和25μg/mL Rif的液体YEB培养基中，28℃震荡培养2-3天，然后进行农杆菌菌液PCR扩增鉴定。PCR鉴定结果正确的菌液保存于-80℃冰箱中。
4.农杆菌介导的大豆遗传转化、筛选及鉴定
利用农杆菌介导的大豆子叶节浸染法将pCAMBIA3301-GmGy5P::DsRed2重组质粒转入大豆吉育93品种中。T0代共获得30株转基因植株，对其叶片涂抹bar试剂检测转基因bar抗性，共检测到8株具有bar抗性的转基因植株。提取其叶片DNA，以DsRed2-F和DsRed2-R为引物，对DsRed2基因进行PCR检测，筛选阳性转基因植株。
DsRed2-F：5′-ATGGCCTCCTCCGAGAAC-3′；
DsRed2-R：5′-CTACAGGAACAGGTGGTGG-3′。
5.DsRed2荧光信号检测
收获8株T0代阳性转基因植株种子，观察其种子颜色和检测DsRed2荧光信号。共有3个株系的种子颜色出现分离比。将T1代纯合转基因大豆种子种植于人工气候室内，收获T2代纯合转基因大豆种子用于检测种子颜色和DsRed2荧光信号。种子颜色观察结果如图5所示，与野生型相比，纯合转基因大豆植株的成熟期的种子呈现红色，肉眼可以直接看出区别。将其置于荧光图像分析仪中观察种子荧光信号，结果如图6所示，与野生型相比，T2代纯合转基因大豆种子在红色荧光蛋白激发光下显示出很强的荧光信号。该观察结果表明大豆GmGy5P启动子可以驱动外源基因DsRed2在大豆种子中的特异表达，可以作为筛选标记用于大豆智能核不育系的创制和培育。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种大豆种子贮藏蛋白基因GmGy5的启动子GmGy5P，其特征在于包括以下核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；
2)与序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列；
3)在高严谨条件下与序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的启动子GmGy5P，其特征在于，所述启动子GmGy5P通过引物对来扩增，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的启动子GmGy5P，其特征在于，与序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有95％以上、优选98％以上、更优选99％以上、最优选100％同源性的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的启动子GmGy5P驱动外源基因在大豆种子中表达的应用，其特征在于，通过基因工程手段利用所述启动子GmGy5P来构建载体，转化大肠杆菌、农杆菌，然后利用所述农杆菌浸染所述大豆，进而驱动所述外源基因在所述大豆种子中表达。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述载体包括大肠杆菌表达载体和农杆菌表达载体。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌包括利用所述启动子GmGy5P构建的载体转化的大肠杆菌菌株，所述农杆菌包括利用所述启动子GmGy5P构建的植物表达载体转化的农杆菌菌株。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述驱动外源基因在大豆种子中表达包括通过基因工程手段改良所述大豆种子的品质，以所述大豆种子的颜色作为筛选标记进行大豆智能核不育系的创制，以及进行大豆分子设计育种。
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