JP2000512503A - 植物におけるオゾン誘導性遺伝子発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規なDNA配列、新規なDNA配列を有する新規な植物を作製する方法に関するもので、そのコーディング配列がオゾン誘導によって発現するものに関する。本発明はまた、前記新規植物及び、植物及び植物細胞においてオゾン応答性遺伝子発現をひき起こすためのDNA配列の使用に関する。さらに、本発明は、オゾン応答能を除去することによって特異性が増大した新規なプロモーターに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 植物におけるオゾン誘導性遺伝子発現 本発明は新規なDNA配列、新規なDNA配列を有し、そのコーディング配列がオゾ ン誘導後に発現する新規植物を生産する方法に関する。本発明はまた前記新規植 物および、植物および植物細胞におけるオゾン応答性遺伝子発現を起こさせるた めのDNA配列の使用に関するものでもある。さらに、オゾン応答能を除去するこ とによってその特異性が増大する新規プロモーターに関する。 北半球の陸地上空の低高度対流圏におけるオゾン濃度は、工業活動の増大の結 果として過去100年問に常に増加してきた(VolzおよびKley(1988)Nature 332，24 0-242)。一方、オゾン値はヨーロッパと北アメリカにおいて断続的に100nL/Lか らZ00nL/Lのピークに達する(Krupaら(1995)Environ．Pollut．87，119-126)。 大気汚染物質であるオゾンの植物毒性はよくテストされ記録されてきた。例え ば、Heagle（1989）Annu．Rev．Phytopathol．27，397-423;Heath(1994)による 、Alscher，Wellburn編集、「Plant responses to the gaseous environment」p p．121-145,Chapman & Hall，Londonにおいて記載されている。正味の光合成量 低下および早期老化の増大はそのようなオゾン衝撃の通常の結果であり、これは 続いて植物成長を抑え収穫量を低下させる。 オゾンは拡散によって開いた気孔を通って植物細胞に侵入するが、葉の細胞間 隙中のオゾン濃度はほとんど０であり、環境のオゾン濃度とは関係がない(Laisk ら、（1989）Plant Physiol．90，1163-1167)。オゾンは細胞壁および原形質膜 の成分と素早く反応し、オゾン処理植物において電子スピン共鳴スペクトロスコ ピーによって検出されるパーオキシド陰イオン、ヒドロキシルラジカルおよび過 酸化水素のような活性酸素種に変換されると通常考えられている(Mehlhornら(19 90)Physiologia Plantarum 79，377-383)。いわゆる「酸化的バースト(oxidative burst)」、すなわち、かなり大量の活性酸素種の発生は、植物の膜透過性の変化 、酸化還元感受性タンパク質の不活性化および脂質過酸化のために正常な細胞機 能の著しい破壊につながる。 オゾン処理植物で行なわれた最近のテストでは、非特異的防御酵素の生合成の 増加が示されたが、その機能は酸化的ストレスによる損傷に対する生細胞を保護 4)。これまでのところ、オゾンに誘導される遺伝子活性化に関連し、アポプラス ト活性酸素種の形成についての関連情報を細胞中核へ伝達するシグナルトランス ダクション鎖はまだ分かっていない。サイトゾルにおけるカルシウム濃度の増加 (Priceら、（1994）The Plant Cell 6，1301-1310)、サリチル酸の形成(Klessig とMalamy（1994）Plant Mol．Biol．26，1439-1458)および植物ホルモンである ジャスモン酸の形成（Farmer（1994）Plant Mol．Bio．26，1423-1437）および エチレンの形成(Ecker（1995）Science 268，667-674)のような種々の因子が、 酸化ストレスによって引き起こされる、シグナル連結部の可能性として現在議論 されており、これらは植物の防御反応において一般に重要な役割をもつものであ る。 オゾンガスを与えたタバコ植物で行なったテストにより、オゾンは種々の耐病 性遺伝子、すなわち、いくつかのPR（病原体関連）タンパク質の発現を増大させ ることが示された(Ernstら(1992)Plant Mol．Biol．20，673-682;Ernstら、（19 96）J．Plant Physiol．148，215-221;Eckey-Kaltenbachら(1994)Plant Physiol ．104，67-74)。これらの結果は、オゾンによって引き起こされた酸化的ストレ スは、病原体の攻撃に関して記述されているのと同様な方法で植物の防御遺伝子 の発現及び制御に影響を与えることを示すものである。シス制御要素および転写 因子、これらはおそらく非特異的な防御遺伝子の遺伝子発現制御において種々の 環境的影響に対する応答として重要な役割を果たすものだが、これらについて現 在は非常に限られた情報しか得られていない(Leeら、（1994）Eur．J．Biochem ．226,109-114)。しかしながら、以前の結果に基づくと、PR-タンパク質をコー ドする遺伝子群に関しては、分断された、あるいは少なくとも一部だけオーバー ラップしたシグナルトランスダクション経路が存在すると考えることができる(S omssich(1994):Nover編集「Plant promoters and transcription factors」,pp. 163-179，Springer Publishing House，Berlin;Dolferusら、（1994）Plant Phy siol．105，1075-1087)。 スチルベンシンターゼ（STS）の活性に関して、これはフィトアレキシン合成 に関与するものだが、成体植物では例えば病原体の攻撃(Langcake（1981）Physi ol．Plant Pathol．18，213-226)、紫外光（FritzemeierとKindl(1981)Planta 1 51 ，48-52）およびオゾン（Rosemannら(1991)Plant Physiol．97，1280-1286） のような環境ストレス因子によって誘導されることが知られている。これと反対 に胚では構成的発現パターンが観察された(Sparvoliら(1994)Plant Mol．Biol．24 ，743-755)。 スチルベンシンターゼ酵素はp-クマロイル-CoAまたはシナモイル-CoAと３ユニ ットのマロニル-CoAからのレスベラトロールまたはピノシルビンのようなスチル ベンの合成を触媒する。レスベラトールおよびピノシルビンはフィトアレキシン 特性および抗真菌活性を有し、フェニルプロパン代謝由来の他のスチルベンと組 合わさってフィトアレキシンとして、病原体に対する防御において重要な機能を 果たす(Hart(1981)Annu．Rev．Phytopathol．19，437-458)。 169)、ブドウ（Hainら、（1993）Nature 361，153-156）およびマツ（Fliegmann ら、（1992）Plant Mol．Biol．18，489-503）のようないくつかの近縁でない植 物種で見つかっており、６以上の遺伝子を含む、より大きな遺伝子ファミリーを 構成している（Lanzら、（1990）Planta 181，169-175;Wieseら(1994)Plant Mol ．Biol．26，667-677)。 トランスジェニックタバコ細胞での実験は、スチルベンシンターゼの発現は主 として転写レベルで制御されており、ストレス誘導性シグナルトランスダクショ ン鎖は進化の過程で種々の植物種において保存されてきたことを示している(Hai nら、（1990）Plant Mol．Biol．15，325-335)。 落花生（Arachis hypogaea）およびブドウ（Vitis vinifera）のSTS遺伝子が 上述の文献）トランスジェニック植物において発現されている(Hainら、（1990 ）上述の文献、Hainら、(1993)上述の文献)。 スチルベンシンターゼをコードするDNA配列は知られており、例えば、欧州特 許EP 0 309 862、ドイツ特許出願DE-A-41 07 396、欧州特許出願0 464 461、お よび米国特許5,500,367による。これらの文献にはスチルベンシンターゼ遺伝子 の単離、およびトランスジェニック植物作製のためのその使用が記述されている 。得られたトランスジェニック植物は真菌、バクテリア、昆虫、ウイルス、線虫 のような種々の植物有害生物に対する、より強い抵抗性を示す。STS遺伝子を含 むプラスミドはドイツ微生物寄託機関((German Collecion of Microorganisms)( DSM))、Mascheroder Weg 1B,D-38124 Braunschweigに寄託されている。寄託には pVst1プラスミド中の、ブドウのVst1遺伝子が含まれ、寄託番号はDSM6002である (DE-A41 07 396、EP-A-0 464 461，米国特許5,500,367)。 一方、雄性不稔植物を作製するため、および花色を変化させるためにSTSコー ディング配列を使用することが記載されているが(ドイツ特許出願DE-A-44 40 20 0)、STS遺伝子発現とオゾン誘導とのあり得る関係はこれまで全く調べられてい ないままである。 一方、トランスジェニック植物おいて、STS遺伝子の発現に基づいて病気に対 してできるだけ耐性があるようにするためには、異種STS遺伝子（あるいは、異 種STS遺伝子群）の植物における発現が病原体の攻撃によって第1番に刺激される 場合に、すなわち、植物と病原体との相互作用によって最初に刺激される場合に 有利であることが種々に示されている(FishcerとHain(1994)Current Opinion in Biotechnology 5，125-130;Fischer（1994）「Optimization of the heterolog ical Expression of Stilbene-synthase Genes for the Protection of Plants 」Hohenheim University)。このことは、病原体に誘導されたSTS遺伝子発現は感 染した場所に限定されており一過性の性質、これはSTS発現が比較的早期に最大 に達し、４８時間未満で再び下がることを意味するが、これが観察されることに より特に支持される(Hainら、(1993)上述の文献)。また、トランスジェニックタ バコ植物で行われた実験、ここではSTS遺伝子がカリフラワーモザイクウイルス の構成的35S RNAプロモーター下で発現しているが、この実験は真菌感染後の前 記植物における病気に対する耐性は、病原体により誘導される同種STSプロモー ター下で同一の遺伝子を発現している植物におけるよりも低いことを示した(Fis cherとHain(1994)上述の文献；Fischer(1994)上述の文献)。ともかくも、トラン スジェニック栽培植物におけるSTS発現は、挿入されたSTS遺伝子のために これらは病気に対するより強い耐性を示すが、病原体の攻撃によって活性化され 制御され(かつ、それまでは起こらず)、オゾンのような望ましくない環境ストレ ス因子によって更に（または、それまでに）活性化および制御されないことが望 ましい。 従って、効果的で制御可能な様式で、より強い耐性の植物を作製するための分 子生物学的ストラテジーを具体化できるようにするために、植物における防御遺 伝子の、より特異的な発現を実現することは植物防御のバイオテクノロジー研究 の重要な仕事である。これを行なうに際して重要な側面は、例えばオゾン、紫外 光、重金属、異常温度および他の非生物的刺激によるある種の防御遺伝子の誘導 のような、望ましくない非特異的な環境刺激を除去することである。 このように、本発明の重要な目的は耐性遺伝子のオゾン誘導性発現における直 接的な役割を果たす新規なDNA配列を利用できるようにすることである。 本発明の他の目的は、オゾン誘導を除去する可能性を示すこと、すなわち、オ ゾンによる望ましくない遺伝子発現刺激を除去することである。 更に、本発明の重要な目的は、その助けによってトランスジェニック植物にお いてスチルベンシンターゼ遺伝子が、その植物と病原体の接触の後でのみ発現し 、オゾン刺激では発現しないようなDNA配列を提供することである。 最初に述べたように、恒常的なオゾン衝撃の増大を観察することができ、これ はまた植物生長に著しい影響を与える。大気中のオゾン濃度の観察および測定は 、今日既に化学的、物理的、生物学的環境調査の焦点を構成している。この関係 で重要な装置はいわゆるバイオモニターであり、この助けによりオゾン衝撃およ びその結果、特に植物障害性効果が定性的にも定量的にも容易に測定される。 従って、本発明のさらなる目的は、目的とするオゾン誘導性プロモーターを作 製するために使用できるDNA配列を供給することである。そのようなプロモータ ーの助けにより、いわゆるレポーター遺伝子、その発現が簡単な酵素的テストに よって分かり、バイオ技術研究においてよく知られたものだが、これがバイオモ ニターとして使用できるようになる。 本発明の他の目的は、その助けによりある種の遺伝子の−その遺伝子産物が細 胞内の酸素種を無毒化することができる−スイッチを入れる」ことができるよう なシステム、例えば大きなオゾン衝撃の場合のように必要であればこれができる ようなシステムを提供することである。言い換えれば、オゾン応答性遺伝子制御 に関与するDNA配列を提供することにより、例えばカタラーゼおよび／またはス ーパーオキシドジスムターゼ遺伝子のような、前記遺伝子のオゾン誘導性発現が 可能となるであろう。従って、オゾン誘導性の、細胞性「オゾン防御システム」 を作り出すために使用できるDNA配列を利用可能とすることは本発明の目的であ る。本発明のさらなる目的は以後の記述を進めるにつれて明らかにする。 これらの問題は、特に本発明による、植物におけるオゾン誘導性遺伝子発現に 直接関与するDNA配列の提供に基づき、従属請求項の主題によって解決されてい る。 驚いたことに、ある種の植物の核酸配列はオゾン応答性STS発現に直接関与し ていることを我々は発見した。トランスジェニックタバコ胚および植物体−常用 されるレポーター遺伝子である大腸菌uidA、すなわち、β-グルクロニダーゼを コードする大腸菌のuidAを、ブドウのVst1プロモーターの長い５'欠失をもつも のの支配下で発現している−で行った実験は、真菌誘導に関与する、少なくとも 数個のシス−要素が-140から-280番塩基対（転写開始点から計算）を含むプロモ ーターの範囲内に存在し(Fischer（1994）上述の文献)、-280から-430番塩基対 を含むVst1配列はオゾンによる遺伝子発現の強い活性化には必須であることを示 している。我々の実験に基づき、-280までの塩基対を残し、かつ、そこまでを含 むVst1プロモーター（従って、それ以上上流に位置するVst1プロモーター配列を 欠いている）はもはやオゾン誘導性ではないことを示すことができる。上述した ように、それにもかかわらず前記の短くしたプロモーターはなお、それにより制 御されるコーディング配列の病原体誘導性遺伝子発現を示すことができる(Fisch er(1994)上述の文献)。 また我々は解析により、オゾンによる植物処理と植物細胞におけるエチレンの 生合成または放出の増加との関係に気づいた。従って、オゾンに誘導される遺伝 子発現におけるエチレン応答性要素の関与を除外することはできない。このよう に、エチレン応答能との関連で今日議論されている、よく知られたシス要素（Se ssaら、（1995）Plant Mol．Biol．28，145-153;Shinshiら、（1995）Plant Mol ．27 ，923-932）を考慮すると、-283から-273番塩基対を含むVst1プロモーターの 配列範囲がオゾンに誘導されるSTS遺伝子発現に関与することを排除することは できない。 従って、オゾン応答性DNA配列範囲は、ここで初めて記載されるものだが、ブ ドウのVst1プロモーターの-270から-430番塩基対を含む。 このように、本発明は請求の範囲第１項で定義したような、DNA配列（配列番 号１）に関する： これは植物におけるオゾン誘導遺伝子発現に必須である。本発明によるDNA配 列の好ましい実施態様（version）はブドウに由来するDNA配列、特に好ましくは ブドウのスチルベンシンターゼ遺伝子Vst1に由来する（-270から-430番塩基対） DNA配列に関係するものである。 さらに、本発明はVst1遺伝子の少なくとも-270から-430番塩基対を含むDNA配 列を欠いているVst1遺伝子のプロモーター領域に関する。好ましい実施態様は、 Vst1遺伝子のプロモーター領域で、Vst1遺伝子の転写開始点から塩基対-270の配 列のみを含むものに関するものである。Vst1遺伝子の-270から-430の範囲の配列 を欠くプロモーター領域が植物において病原体誘導性遺伝子発現を伝達すること ができることは特に好ましい。 本発明はまたキメラ核酸分子に関するもので、その分子にはVst1遺伝子の-270 から-430番塩基対のDNA配列またはその少なくとも１つ配列範囲の断片が挿入さ れているものである。本発明のキメラ核酸分子が、Vst1遺伝子の-270から-430番 塩基対のDNA配列またはその少なくとも１つの断片が存在するために、これを含 む植物においてこのコーディング領域のオゾン誘導性発現を可能とすることが特 に好ましい。 核酸分子はどんな核酸分子でもよく、特にDNAまたはRNA、例えばcDNA、ゲノム DNA、mRNA等でよい。これらは天然に存在する分子でも遺伝子工学または化学合 成法によって作られた分子でもよい。 本発明により、DNA配列、プロモーター領域、核酸分子またはベクターを利用 できるようになったことにより、今では遺伝子工学的方法によりオゾン誘導性特 性を示すように植物細胞を変異させることができる。さらに、今では遺伝子工学 的方法によって１またはそれ以上の遺伝子−それらの遺伝子は請求項１に記載し たDNA配列またはそれに由来するDNA配列または前記DNA配列に相同な配列が存在 するために本来はオゾン誘導性である−がもはやオゾンによって誘導されないが 主として病原体により好適に誘導されることを特徴とするように植物細胞を変異 させることができる。 本発明の特に有利な点は、請求項１のDNA配列またはこれに由来し得るDNA配列 または前記DNA配列に相同な配列を本来含む遺伝子中のこのDNA配列またはその少 なくとも１つの断片を欠失させることにより、植物および植物細胞において本来 はオゾン誘導性遺伝子のオゾン誘導を除去できることである。 本発明の他の利点は、オゾンによって本来は誘導され得ない、または実質的に 誘導され得ない遺伝子が、本発明の核酸配列を植物または植物細胞中で使用する ことによりオゾン誘導性であるとして特徴づけることができる点である。好まし い実施態様では、オゾン誘導性発現に関与する核酸配列または少なくともその１ つの断片が遺伝子の発現を制御し、その遺伝子の産物は、特に植物細胞中のオゾ ンの結果として発生し得る活性酸素種を無毒化することができるものである。特 に好ましい実施態様では、核酸配列はカタラーゼおよび／またはスーパーオキシ ドジスムターゼ遺伝子の発現を制御する。 また別の実施態様では、オゾン誘導性遺伝子発現に関与するDNA配列はオゾン 濃度を定量的および／または定性的に決定し、オゾンの影響を決定するために測 定されるレポーター遺伝子の発現を制御する。そのようなレポーター遺伝子は、 例えば、酵素β-グルクロニダーゼ(GUS)をコードする大腸菌（E．coli）のuidA 遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子または他の遺伝子でよく、植物バイオテクノロジ ーにおいて慣用されるものである。バイオテクノロジー、生化学、または分子生 物学に習熟した者は誰も適切なレポーター遺伝子に精通している。 さらに、本発明は上述のDNA配列またはプロモーター領域またはその断片を含 むベクターに関する。このように、本発明はまたベクター、特にプラスミド、コ スミド、ウイルス、バクテリオファージおよび他のベクターに関するものであり 、これらは遺伝子工学では一般的なものであるが、本発明による上述の核酸分子 を含み、必要であれば前記核酸分子を植物または植物細胞に導入するために使用 することができるものに関する。 本発明はまた、本発明の核酸配列を有する、バクテリア、ウイルスおよび真菌 のような形質転換された微生物に関する。 本発明の目的はまた、植物において本来オゾンにより誘導される遺伝子のオゾ ン誘導性発現が存在しないことを特徴とする植物および植物細胞を提供すること である。 この課題はオゾン誘導に関与するDNA配列を提供することにより、および、前 記配列を欠き、それ故このプロモーターに制御される植物および植物細胞の遺伝 子のオゾン誘導性遺伝子発現がもはや起こらない様にすることができるプロモー ターを利用可能とすることにより解決される。 本来オゾン誘導性でない遺伝子のオゾン応答性遺伝子発現を可能にするという 課題は、本発明のDNA配列を提供することにより同様に解決される。このように して、オゾン存在下である種の特徴を明瞭にした植物および植物細胞が利用可能 となる。 好ましい実施態様は、遺伝子がオゾン誘導性に発現している形質転換植物およ び植物細胞に関するもので、この遺伝子産物が植物細胞中の活性酸素種を無毒化 することができるものである。これとの関連では、カタラーゼおよび／またはス ーパーオキシドジスムターゼ遺伝子が特に好ましい。また、オゾンによる誘導後 にいわゆるレポーター遺伝子を特徴とし、必要であればバイオモニターとして使 用できる植物および植物細胞（プロトプラストを含む）を作製することができる 。 このように、本発明の主題は上述したように組換え核酸分子を植物ゲノム中に 組み込んで有するトランスジェニック植物である。そのような植物は原則として どのような植物でもあり得る。単子葉または双子葉の有用植物が好ましい。単子 葉植物の例はアベナ(Avena(カラスムギ))、トリチカム(Triticum(コムギ))、セ カレ(Secale(ライムギ))、ホルデウム(Hordeum(オオムギ))、オリザ(Ory za(コメ))、パニクム(Panicum)、チカラシバ(Pennisetum)、セタリア(Setaria) 、ソルガム(Sorghum(キビ))、ゼア（Zea(トウモロコシ)）属に属する植物である 。双子葉で有用な植物は例えば、ワタ、マメ（legume）のようなマメ科植物、特 にアルファルファ、ダイズ、ナタネ、トマト、テンサイ、ジャガイモ、観葉植物 、樹木である。他の有用な植物としては、結果植物(特にリンゴ、ナシ、チェリ ー、ブドウ、カンキツ類、パイナップルおよびバナナ)、アブラヤシ(oilpalm)、 茶およびカカオ潅木、タバコ、サイザル、およびインドジャボク（rauwolfia） およびジギタリスのような薬用植物でもよい。特に好ましいのは、コムギ、ライ ムギ、オオムギ、コメ、トウモロコシおよびキビ、テンサイ、ブドウ、ダイズ、 トマト、ジャガイモのような穀類およびタバコである。 さらに、本発明の主題は、例えば種子、果実、挿し木片(cuttings)、塊根，根 茎などのような、本発明による植物の増殖材料、および、植物細胞、プロトプラ ストおよびカルスのような、そのような植物の構成物である。 植物細胞には分化したおよび未分化の植物細胞(プロトプラストを含む)、およ び核酸分子が植物ゲノムに組み込まれ、または自律分子として（トランジェント 形質転換を含む）存在する植物細胞（プロトプラストを含む）が含まれる。 他の実施態様では、本発明は宿主細胞、特に、それらは上述のような組換え核 酸分子またはベクターで形質転換または接種された原核細胞または有核細胞、お よび、前記宿主細胞に由来し前記の核酸分子又はベクターを含む細胞に関する。 本発明の目的はまた、遺伝子のオゾン誘導性発現を欠き、植物および植物細胞 におけるその遺伝子の発現が本来はオゾンで刺激されるものであることを特徴と する植物および植物細胞の作製方法を示すことである。 この課題は、この本来的なオゾン誘導性遺伝子発現を有しない新規な植物およ び植物細胞の作製が可能である方法によって解決される。 既に上述したように、本発明の目的はまた、オゾン刺激後に遺伝子−その発現 はオゾンによって本来は活性化されない、または実質的に活性化されないもので ある−を発現する植物および植物細胞を作製する方法を提供することである。こ の課題は、その助けにより本発明のDNA配列またはその少なくとも１つの断片が 本来はオゾン誘導性でない遺伝子、または僅かにしかオゾン誘導性でない遺伝子 に挿入されると、オゾン刺激後にそのような遺伝子を発現するような植物および 植物細胞の作製が可能となる方法によって解決される。 そのような新規な植物または植物細胞を作製し得る種々の方法がある。ひとつ は、植物または植物細胞は新規な核酸分子が植物ゲノムに組み込まれるようなや り方で、通常の遺伝子工学的形質転換法によって変異されうるもので、このこと は安定形質転換体（stable transformant）が作製されることを意味する。 本発明により、本発明の核酸配列またはその少なくとも１つの断片が存在しな いために本来前記配列を含む遺伝子がもはやオゾン誘導を示さなくなっている植 物または植物細胞が以下のステップを含む方法によって作製される： ａ）DNA配列−請求項１に定義した配列、または前記配列に由来し得る配列、ま たは前記配列に相同な配列、または少なくともそのような配列の断片−の遺伝子 （この遺伝子は本発明のDNA配列を欠失させた後では、植物細胞において転写お よび翻訳が制御されるための必須の制御要素を含んでもよく、少なくとも１つの コーディング配列を含み、および、所望により転写終結のための終結シグナルお よび対応する転写物にポリＡテールを付加するためのシグナルをも含む）からの 欠失。 ｂ）ステップａ）で作製された遺伝子または核酸分子での植物細胞の形質転換、 および ｃ)所望によりトランスジェニック植物の再生および所望によりその植物の増殖 。 また、ステップａ）において、オゾン誘導に関与する配列を欠失させる代わり に、前記配列またはその少なくとも１つの断片を、例えば変異導入によって不活 性化またはブロックすることができ、そのようにして不活性化型で遺伝子中に残 すことが可能である。オゾン応答性遺伝子範囲が欠失される方法にかかわらず、 全ての操作測定は常法により、および組換え遺伝子技術の助けにより行なうこと ができる(Sambrookら(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第２版、 Cold Spring Harbour Laboratory Press，Cold Spring Harbour，New York)。 特に好ましい実施態様では核酸分子、ステップｂ）で植物体または植物細胞に 導入されるものだが、この分子が例えばコーディング配列の病原体誘導遺伝子発 現を許すような制御要素を含んでいる。 本発明により、本発明の配列または前記配列の少なくとも１つの断片を含む遺 伝子のオゾン誘導性発現のために必須な、または協働的に関与する本発明の核酸 配列が存在する植物体または植物細胞が以下のステップを含む方法により作製さ れる： ａ）植物内でオゾン誘導性遺伝子発現を生じさせ得る少なくとも１つの本発明の DNA配列、または前記配列から誘導し得る配列、または前記配列と相同な配列ま たは前記配列の少なくとも１つの断片の、本来オゾン誘導性でない、または実質 的にオゾン誘導性でない遺伝子中への挿入。 ｂ）植物細胞における発現に通常必要な全ての要素を有する、ステップａ）で作 製された遺伝子または核酸分子による植物細胞の形質転換、および ｃ）所望によりトランスジェニック植物の再生および所望により植物の増殖。 好ましい実施態様では、関係する遺伝子はカタラーゼ、ジスムターゼ、スーパ ーオキシドジスムターゼまたは一般的なレポーター遺伝子である。 本発明の他の目的は、本発明の核酸配列の有利な使用を示すことである。 従って、本発明は、通常はオゾンによって影響される表現型のある種の顕著な 標識が存在しないこと、または、本発明のDNA配列が存在することによりそのオ ゾン誘導性特性によって非-トランスジェニック植物または植物細胞から明確に 区別される前述の植物および植物細胞を作製するための、本発明による新規DNA 分子の使用を含む。 さらに、本発明は、病原体誘導性であって、かつオゾン誘導性でない強化され た耐病性を特徴とする植物を作製するための、本発明による新規DNA分子の使用 を含む。 本発明はまた、オゾン応答性核酸要素を検出および同定するための、本発明の 核酸配列またはその断片の使用に関する。 熟練した者は通常の分子生物学的方法、例えば、ハイブリダイゼーション実験 またはDNA−タンパク質結合検査を利用することによりそのようなオゾン応答性 核酸要素を同定できる。例えば、まず最初のステップでポリ-(A)⁺RNAがオゾンで 処理された組織から単離される。次に、cDNAバンクが用意される。２番目のス テップで、未処理の組織のポリ-(A)⁺RNA分子に基づくcDNAクローンの助けにより 、そのポリ-(A)⁺RNA分子がオゾン処理で厳密に誘導される、第１のバンクからの クローンが同定される。この方法で同定されたcDNAの助けにより、オゾン応答性 要素を含むプロモーターが続いて単離される。本核酸配列および分子はこれらの 単離プロモーターを調べ、および特徴づけるときに有用な道具となり得る。 本発明の主題はまた上述の核酸分子の１つ、または上述の本発明のDNA配列の １つにハイブリダイズする核酸分子またはその断片を含む。本発明の範囲におい て、「ハイブリダイズする」の語は通常のハイブリダイゼーション条件、好まし くは、例えばSambrookら(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第２ 版、Cold Spring Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New Yorkに記載され ているようなストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味す る。 本発明の分子にハイブリダイズする核酸分子は、例えばゲノムまたはcDNAバン クから単離することができる。 そのような核酸分子の同定及び単離は本発明による核酸分子または前記分子の 断片またはそのような分子の相補分子を用いて、例えば標準的な手法によるハイ ブリダイゼーションにより（Sambrookら、上述の文献）行なうことができる。 このように、本発明は、本発明のDNA配列またはその断片の、植物または他の 生物の相同な配列の同定および単離のための使用に関する。 例えば、本発明の配列そのものまたは実質的にそうである配列、またはそのよ うな配列の断片を有する核酸分子はハイブリダイゼーションプローブとして使用 できる。ハイブリダイゼーションプローブとして使用する断片はまた、通常の合 成技術の助けにより作製された合成断片でもよく、その配列は本発明の核酸分子 の配列と本質的に一致するものである。本発明の核酸配列とハイブリダイズする 遺伝子が同定され単離されると、その配列を決定し特性を解析することが必要に なる。これを行なうため、多数の分子生物学的、生化学的、バイオテクノロジー 的に標準的な方法が熟練者に利用可能である。 本発明の核酸分子とハイブリダイズする分子はまた、オゾン応答性配列を活性 または不活性な形で含む、または、もはやそのような配列を有しないことを特徴 とする、上述のDNA分子の断片、由来物およびアレル変異型を含む。ここで「由 来物」の語は、これらの分子の配列が上述の核酸分子の配列と１または幾つかの 位置で区別されるが、大部分は前記配列と相同であることを意味する。ここで、 相同とは少なくとも40％の配列同一性、特に少なくとも60％の同一性、好ましく は80％を越え、特に好ましくは90％を越える配列同一性を意味する。上述の核酸 分子からの偏位は欠失、付加、置換、挿入または組換えによって起こされたもの であり得る。 上述の分子と相同な、および、そうした分子からの由来物を構成する核酸分子 に関しては、通常、同じ生物学的機能を果たす変異を構成する、分子の変異型が 関連する。これらは自然に生じる変異、例えば他の生物由来の配列、またはそれ らの変化が自然に生じたかもしれない、または特異的変異誘発によって導入され た変異に関係するかもしれない。さらに、変異型は合成的に作られた配列に関係 するかもしれない。アレル変異型に関しては、これらは合成的に作られた変異型 であるだけでなく自然に生じるかもしれず、または、組換えDNA法によって作ら れた変異型かもしれない。 外来遺伝子の高等植物またはその細胞への挿入を行なうため、大腸菌の複製シ グナルおよび形質転換されたバクテリア細胞を選択するためのマーカー遺伝子を 有する沢山のクローニングベクターが利用可能である。そのようなベクターの例 は、pBR322、pUCシリーズ、M13mpシリーズ、pACYC184などである。望みの配列は 適当な制限酵素切断部位に挿入され得る。得られたプラスミドは大腸菌細胞の形 質転換に使用される。形質転換された大腸菌細胞は適当な培地で培養され、続い て集められ溶菌される。プラスミドが回収される。通常、制限解析、ゲル電気泳 動および他の生物学的、分子生物学的方法が得られたプラスミドDNAの特性を明 らかにするために解析方法として利用される。各操作の後、プラスミドDNAは切 断され、得られたDNA断片は他のDNA配列と結合され得る。各プラスミドDNA配列 は同一または別のプラスミドにクローン化することができる。 DNAを植物細胞に導入するために多くのよく知られた方法が利用できる。熟練 者はそれぞれに適切な方法を容易に決定することができる。これらの技術は以下 を含む：すなわち、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tu mefaciens ）またはアグロバクテリウム リゾゲネス（Agrobacterium rhizogene s）を形質転換仲介物として用いることによるT-DNAでの形質転換、プロトプラス ト融合、単離DNAのプロトプラストへの直接遺伝子導入、DNAのエレクトロポレー ション、遺伝子銃法（biolistic method）によるDNA導入、および他の可能な方 法である。これを行なうに際して、安定なおよび一過性の形質転換体を作製する ことができる。 植物細胞にDNAを注入およびエレクトロポレーションするときに、使用するプ ラスミド自体について特定の要求はない。同じものが直接遺伝子導入に適用され る。例えばｐＵＣ由来物のような単純なプラスミドを使用することができる。し かしながら、完全な植物体がこのように形質転換された細胞から再生されなけれ ばならないときは、選択マーカー遺伝子の存在が必要とされる。熟練者は通常の 選択マーカーに精通しており、適切なマーカーを選択するのに問題はない。一般 に使用される選択マーカーは、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロ マイシン、メトトレキセート、グリホセート、ストレプトマイシン、スルホニル 尿素、ゲンタマイシンまたはホスフィノトリシン（phosphinotricin）などのよ うな、殺生物剤または抗生物質に対して形質転換植物細胞を耐性にするものであ る。 植物細胞への選択された遺伝子導入方法に依存して、追加のDNA配列が必要と されるかもしれない。例えば、もし、TiまたはRiプラスミドが植物細胞の形質転 換に使用されるならば、TiおよびRiプラスミド中にフランキング領域として含ま れている、T-DNAの少なくとも右境界領域、しかし、しばしば右および左境界領 域が導入される遺伝子に結合されなければならない。 アグロバクテリウムが形質転換に使用されるときは、導入されるべき遺伝子は 特殊なプラスミド、すなわち中間ベクター（intermediary vector）かバイナリ ーベクター（binary vector）にクローン化されなければならない。T-DNA中の配 列と相同な配列のために、中間ベクターは相同組換えによってアグロバクテリウ ムのTiまたはRiプラスミド中に組み込まれる。さらに、これらはT-DNAの移入に 必要なvir領域を含む。中間ベクターはアグロバクテリウム中では複製できない 。中間ベクターはヘルパープラスミドによってアグロバクテリウム ツメファシ エ ンス に導入することができる(接合)。バイナリーベクターは大腸菌およびアグロ バクテリウム中で複製することができる。これらは選択マーカー遺伝子とT-DNA 右および左境界領域に挟まれたリンカーまたはポリリンカーを有している。これ らは直接アグロバクテリウムに形質転換できる(Hosterら、(1978)Molecular and General Genetics 163，181-187)。宿主細胞として機能するアグロバクテリウ ムはvir領域を有するプラスミドを含んでいなければならない。vir領域はT-DNA を植物細胞に移送するのに必要である。記述した方法で形質転換されたアグロバ クテリウムは植物細胞の形質転換に使用される。 植物細胞の形質転換のためのT-DNAの使用はよく研究されており、EP 120 515; HoekemaのThe Binary Plant Vector System，Offsetdrokkerij Kanters B.V.，A lblasserdam(1985)第Ｖ章、Fraleyら(1993)Crit．Rev．Plant Sci.，4，1-46お よび油ら(1985)EMBO J．4，277-287に十分に記述されている。 DNAの植物細胞への導入のために、植物体外植片はアグロバクテリウム ツメ ファシエンス またはアグロバクテリウム リゾゲネスと適切に培養される。感染 した植物体材料（葉片、茎切片、根、しかしまたプロトプラストまたは懸濁培養 植物細胞も）から、形質転換細胞の選抜のために抗生物質または殺生物剤を含み 得る適切な培地中で完全な植物体を再生させることができる。植物体の再生は、 よく知られた培地を用いて通常の再生方法に従って行なわれる。上述の方法で得 られた植物体または植物細胞は次に、導入したDNAの存在について調べられる。 遺伝子銃法を利用することによりまたはプロトプラスト形質転換による、外来DN Aを導入するための別の可能性が知られている(例えば、Willmitzer L．（1993） Transgenic Plants：Biotechnology，A Multi-Volume Comprehensive Treatise Weinheim‐New York‐Basel‐Cambridgeを参照せよ)。 Tiプラスミド系による、かつ、アグロバクテリウム ツメファシエンスの助け を借りた双子葉植物またはその細胞の形質転換はよく確立されているが、新しい 研究により単子葉植物またはその細胞もアグロバクテリウムベースのベクターに よって形質転換を非常に受けやすいことが示された(Chanら(1993)Plant Mol．Bi ol．22，491-506;Hieiら(1994)Plant J．6，271-282;Dengら(1990)Science in China 33，28-34;Wilminkら(1992)Plant Cell Reports 11，76-80;Mayら（19 95）Bio/Technology 13，486-492;ConnerとDomiss（1992）Int．J．Plant Sci．153 ，550-555;Ritchieら(1993)Transgenic Res．2，252-265)。 単子葉植物またはその細胞を形質転換するための別の系は遺伝子銃（WanとLem aux(1994)Plant Physiol．104，37-48;Vasilら(1993)Bio/Technology 11，1553- 1558;Ritalaら(1994)Plant Mol．Biol．24，317-325;Spencerら(1990)Theor．Ap pl．Genet．79，625-631）、プロトプラスト形質転換、部分的に透過性になった 細胞のエレクトロポレーションおよびガラス線維によるDNA導入である。 形質転換した細胞は通常の様式で植物内で増殖する(McCormickら(1986)Plant Cel Reports 5，81-84もまた参照せよ)。得られた植物は普通に栽培することが でき、形質転換した同じ遺伝的特徴を有する、または他の遺伝的特徴を有する植 物を接木することができる。得られたハイブリッド植物はそれぞれの表現型特性 を有している。 表現型の特徴が強固に維持され遺伝することを確かめるために２または３世代 を栽培しなければならない。それぞれの表現型または他の特徴が維持されている ことを確かめるため種子も収穫しなければならない。 通常の方法を利用して新規な核酸分子に関してホモ接合であるトランスジェニ ック系統を決定することができ、さらに、それらの表現型の振舞いはオゾン応答 能の有無について調べることができ、ヘミ接合系統の応答能に比較することがで きる。 本発明の核酸分子を含む植物細胞は、通常、植物細胞（プロトプラスト、カル ス、懸濁培養物その他を含む）としても更に培養することができる。 本発明の他の目的は、本発明の核酸分子またはそのような分子の断片またはそ のような分子の相補物の、植物または他の生物のオゾン応答性要素を含む相同分 子を同定および単離するための使用である。「相同性」の語の定義に関しては、 本明細書の前の方で示した定義を参照せよ。 以下の実施例は本発明の説明を目的としている。 実施例実施例１： バイナリーベクターpPCV002に入った、GUS融合構造としてのVst1プロモーターの 5'欠失物の構築 ブドウのVst1遺伝子の5'非コーディング領域（以後プロモーターと称する）は 1570塩基対からなる。このプロモーターを、この配列はドイツ特許出願DE 41 07 396およびFischer(1994)の上述の文献から知られているが、以下のオリゴヌク レオチドをプライマーとして、完全なVst1遺伝子（DE-A-41 07 396;Fishcer(199 4)上述の文献）を含むプラスミドpVst1を用いて通常のポリメラーゼ連鎖反応の テンプレートとして増幅した： PCRはPerkin Elmerのプロトコルに従い、Perkin Elmerの天然Taqポリメラーゼ を用いて行なった。通常のPCR条件で増幅されたDNA断片は続いて制限酵素HindII I（この制限切断はプライマー１の5'端に見られる）およびBamHI（この制限切断 はプライマ−２の5'端に見られる）で再切断し、大腸菌のβグルクロニダーゼレ ポーター遺伝子（GUS、uidA）およびA.tumefaciensのnos-遺伝子の終結シグナル を含むベクターpBI101.2（Jefferson(1987)Plant Mol．Biol．Reporter 5，387- 405）のBamI HI/EcoRI断片とともに、pUC18ポリリンカーのHindIIIおよびEcoRI 制限酵素切断部位によってpUC18プラスミド（Yanisch-Perronら、（1985）Gene 33 ，103-119:例えばBoehringer Mannheimから入手可能）にサブクローン化した 。全てのクローニングステップは通常の分子生物学的方法とその助け（例えば、 Sambrook(1989)らの上述の文献）によって行なった；制限酵素およびクローニン グに用いた他の酵素はBoehringer Mannheimから入手した。得られたクローン（p UC-Vst1/GUS）は、こうしてVst1プロモーターとGUS遺伝子との翻訳融合を含み、 リーディングフレーム内の初めの５つのSTSコドンはBamHI切断部位によりGUS遺 伝子と結合している。融合移行配列範囲およびVst1プロモーターの配列は、Phar maci a（Freibuerg）のT7シーケンシングキットを用いた酵素的鎖停止法（Sangerら(1 977)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74，5436-5467）によって、その正しさをチェ ックした。 バイナリーベクターpCV002（KonczとSchell（1986）Mol．Gen．Genet．204，3 86-396）の5'欠失変異体のクローニングを以下に説明する。大部分の場合にpUC1 8サブクローンを中間ベクターとして用いた。なぜなら、より小さなpUCプラスミ ドは比較的大きなバイナリーベクターに比べて扱いがより容易だからである。 プラスミドの名称は、開始コドンから73塩基対の距離に位置する転写開始点(H ainら(1993)上述の文献；Fischer(1994)上述の文献)から計算した、それぞれの プロモーター断片のおよその長さによるものである。Vst1プロモーターを段階的 に短くするために用いた制限切断部位は、図１に模式的に示した。 ―p1500GUS：完全なSTSプロモーターをGUS遺伝子とともに含むHindIII/EcoRI 断片を上述のプラスミドpuC-Vst1/GuSから単離し、pCV002のポリリンカー中に、Hin dIIIとEcoRI制限切断部位の間に挿入した。 ―p1060GUS：1130bpのプロモータ断片を、BamHIおよびSspI制限切断によってp uC-Vst1/GUSから単離し、BamHI/HincII-直線化pUC18にクローン化した(->pUC113 0)。続いてGUS遺伝子をBamHI/EcoRI断片としてpUC-Vst1/GUSから単離して、pUC1 130のBamHI切断部位とEcoRI切断部位の間にクローン化した。最後に、HindIII/E co RIの二重消化により融合物を単離し、同じ切断部位によってpPCV002のポリリ ンカー中に挿入した。 ―p930GUS：制限酵素BamHIとHincIIによってpuC-Vst1/GUSから1.0kbのプロモ ーター断片を単離し、同じ切断部位によってpUC18のポリリンカー中に挿入した( ->pUC1000)。続いてこれをp1060GUSと同様にしてクローニングした。 ―p740GUS：プラスミドpUC-Vst1/GUSから1.6kb長のHindIII/BamHIプロモータ ー断片を単離し、制限酵素DraIで消化した。続いて、生じた810bp長のBamHI/Dra I断片をBamHIおよびHincII制限切断部位によりpUC18にクローン化した(->pUC810 )。次にGUS遺伝子をBamHI/EcoRI断片としてpUC-Vst1/GUSから単離し、pUC810のB am HI切断部位とEcoRI切断部位の間にクローン化した。最後に、HindIII/EcoRIの 二重消化によって融合物を単離し、同じ切断部位によってpPCV002のポリリン カーに挿入した。 ―p550GUS：pUC-Vst1/GUSを制限酵素AflIIIで消化し、突出5'端をKlenow酵素（B oehringer Mannheimより；dNTPsも同様にBoehringer Mannheimから）でメーカー の説明書に従って埋めた。続いて、制限酵素BamHIで再切断し、生じた620bpのプ ロモーター断片をBamHI/HincII−直線化pUC18に結合した(->pUC620)。次にp1060 GUSのクローニングと同様にクローニングを続けた。 ―ｐ500GUS：570bp長のプロモーター断片をBamHI/HaeIII二重消化によりpUC-Vst 1/GUSから単離して、BamHI/HincII-直線化pUC19ベクターに結合した(->pUC570) 。続いてp1060GUSの作製と同様にして更にクローニングした。 ―p430GUS：上述したプラスミドpUC1000を制限酵素SnaBIを用いて直線状にし、 続いてHincIIで消化した。直線状になったベクターを続いて再結合し、これによ り-930と-430の間の500bpがプロモーターから欠失した(->pUC500)。pUC106GUSと 同様にして更にクローニングを行なった。 ―p280GUS：pUC-Vst1/GUSを制限酵素BanIIで消化し、突出端をKlenow酵素で埋め 、直線状にしたベクターを続いて制限酵素BamHIで消化した。350bp長の平滑末端 BamHIプロモーター断片を単離した後、p1060GUSと同様にしてクローニングを続 けた。 ―p140GUS：上述のpUCサブクローンpUC620を制限酵素NsiIとPstIで消化し、直線 状になったベクターを精製し再結合した。これによりプロモーター配列-550から -140の欠失を生じる(->pUC210)。BamHI/EcoRI断片としてGUS遺伝子をpUC-Vst1/G USから単離しpUC1130のBamHI切断部位とEcoRI切断部位の間にクローン化した。 最後に、融合物をHindIII/EcoRI二重消化によって単離し、同じ切断部位によりp PCV002のポリリンカー中に挿入した。 ―p40GUS：100bpプロモーター断片をGUS遺伝子と一緒にNheI/EcoRI二重消化によ ってpUC-VSt1/GUSから単離し、この断片を続いてXbaI/EcoRI-直線化pPCV002にク ローン化した。 ―pΔGUS：構築物p1500GUSを制限酵素BamHIで消化し、続いて精製したベクター を再結合した。こうして、pPCV002が本来マルチクローニング部位のHindIII切断 部位の側に有するBamHI切断部位（KonczとSchell(1986)上述の文献）によって プロモーター断片全体が除去される。 ―p35SGUS：カリフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーターとGUS遺伝 (1988)Nucleic Acid Research 16，8725）からHindIII断片として単離し、pPCV0 02のマルチクローニング部位に挿入した。実施例２： 植物材料、植物の形質転換および形質転換植物体の再生 ニコチアナ タバカムcv．プチハバナ（Nicotiana tabacum cv．Petit Havana） SR1(Maligaら(1973)Nature New Biol．244,29-30)を１％ショ糖を含むホルモン フリー1/2LS-培地（LinsmaierとSkoog(1965)Physiol．Plant 18，100-127）上で 、26℃、3000luxおよび16時間光周期で無菌挿穂培養として栽培した。６〜８週 間の間隔でシュート片を新しいLS培地に移した。アグロバクテリウム ツメファ シエンス による葉片の形質転換のため(Horschら(1985)Science 227 1229-1231) 、無菌挿し穂培養物の２〜３ｃｍ長の葉を直径１ｃｍの切片に打ち抜き、上述の プラスミド構築物の１つを有するアグロバクテリウムの懸濁液（およそ１０⁹細 胞/ml YEB培地）とともに５分間インキュベーションした。接種した葉片をホル モンフリーのLS培地で２日から3日26℃で維持した。この期間の間、バクテリア は葉片に覆いかぶさって増殖するが、次にホルモンフリーを含まない液体LS培地 で洗浄し、カナマイシン(75μｇ/ml；Sigma，Munich)、セフォタキシム（500μ ｌ/ml;Hoechst，Frankfurt）およびベンジルアミノプリン(BAP、0.5mg/l；Duche f，Haarlem，The Netherlands)を含むLS-培地上に置いた。２から３週間後、形 質転換したシュートが見えるようになり、75μｇ/mlカナマイシンおよび100μｇ /mlセフォタキシムを含むホルモンフリーのLS培地上で発根した。 タバコ葉片の形質転換に使用したアグロバクテリウム培養物は以下のようにし て作製した：まず、上述のpPCV002由来物を伝達能のある株S17-1（Simonら(1983 )Bio/Technology 1，784-790）に導入した。これは、S17-1大腸菌コンピテント 細胞および、Taketo(1988)BioChem．Biophys.Acta 949，318-324またはHanaha n(1983)J．Mol．Biol．166，557-580に従って、それぞれのプラスミドによるそ の受容細胞の形質転換を生み出す。続いて、それぞれのバイナリーベクターを有 する大腸菌株およびアグロバクテリウム ツメファシエンス株GV3101 C58C1 Rif^r pMP90RK(KonczとSchell(1986)上述の文献)を適切な培地でＯＤ₅₈₀＝1.0まで培養 した。以下のものを大腸菌の培養に使用した：通常のＹＴ培地(Miller(1972)Exp eriments in Molecuar Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；バクトトリプトン0.8％(w/v)、イーストエキスと ラクト0.5％(w/v)、NaCl 0.5％(w/v ｐＨ7.0)、37℃。A. tumefaciensバクテ リアの培養については、YEB培地（ビーフエキストラクト0.5％(w/v)、イースト エキストラクト0.1％(w/v)、バクトペプトン0.5％(w/v)、ショ糖0.5％(w/v)、Mg SO₄ 2mM、ｐＨ7.2）を28℃で使用した。続く接合のために、バクテリアを1500ｘ ｇで5分間の遠心により分離し、新しく調製した10mM MgSO₄溶液で２回洗浄した 。次に、供与体（大腸菌）および受容体（A. tumefaciens）を１：１の割合で混 合し、YEB寒天培地上に滴下した。28℃にて16時間のインキュベーション後、こ のバクテリア滴を10mM MgSO₄溶液でリンスし、１０^-2、１０^-3および１０^-4希釈 をYEB選択プレート上にプレーティングした。単一培養物からアグロバクテリウ ム培養物を28℃で培養し、N.tabacumの形質転換に用いた。 上述したそれぞれのVst1プロモーター/GUS融合物を含む形質転換タバコのシュ ートを挿穂培養によって増殖させ、一部を土壌に移し通常の条件で（22℃、60％ 相対空中湿度、およそ15,000lux）温室内で花が咲くまで栽培した。花は袋がけ により外来花粉から保護し、F1-世代の種子が入った熟したさく果を４から６週 間後に集めた。温室内の生物学的テストのため、F1-世代の種子を75μｇ/mlのカ ナマイシンを含むLS培地上に置いた。これは、直接さく果から出して無菌条件下 で行ない、またはさく果の表面を滅菌した後に行なった(１．滅菌水で簡単に洗 浄する；２．70％エタノールで2分間インキュベーション；３．3％ NaOCl（有効 塩素13％）で10分間インキュベーション；４．水で３回洗浄；５．安全キャビネ ットの層状空気流の中で乾燥)。75μｇ/mlのカナマイシンを含むLS培地で25〜26 ℃、2000〜3000 lux、空中湿度60％で約２週間培養すると、カナマイシン耐性タ バコ胚とカナマイシン感受性タバコ胚を明瞭に区別することができた。感受性 胚に比べ、耐性胚は明白な１次根の生長を示した。双葉は別として、１次葉は２ 週間後に耐性胚にのみ見られた。この４葉期（four-leaf stage）においてF1-胚 を土壌に移し、硬化させ適当な条件下でさらに栽培した。実施例３： 植物体の栽培、オゾン処理および葉の収穫 続くオゾン処理のために、まずカナマイシン耐性トランスジェニックタバコ胚ライトの２：１混合物を入れたフラワーポットに移し、３週間、人工気象室にて 15,000lux，12時間昼／夜周期、昼間温度25℃、夜間温度20℃、空中湿度65から7 0％で、フィルターを通した空気のもとでインキュベーションした。 続いてタバコ植物体を１回の１０時間オゾンパルスにさらし、次に、汚染して いない、フィルターを通した空気中で２〜14時間インキュベーションした。全て のガス処理実験は人工気象室内に設置した密閉プレキシガラスボックス中で一定 の気候条件下で行なった。オゾン処理は常に９：００amに開始し、昼間サイクル の間中にわたった。オゾンは乾燥酸素中の放電によって生成した。注入量と分析 はコンピュータ制御で行なった(Langebartelsら(1991)Plant Physiol．95，882- 889)。植物体のタバコの葉を植物体の上から下へ数え、葉番号１〜１０に分類し た。１番葉は８cm大であった。タバコの葉（１から10番に分類されたもの）を、 オゾン処理の開始から色々な時点で別々に液体窒素中で凍結し、-80℃に保存し た。実施例４： β-グルクロニダーゼ活性テスト GUS-酵素活性の蛍光分析を4-メチル-ウンベリフェリル-グルクロニド（MUG、S igma、Munich）を用いてJefferson(1987)の上述の文献またはJeffersonら(1987) EMBO J．6，3901-3907に厳密に従って行なった。生成物4-メチルウンベリフェロ ン（MU）の濃度を石英フローキュベット中で蛍光測定器（Perkin Elmer LS-2Bフ ィルター蛍光計(filterfluorimeter)）で測定した。植物体抽出物中のGUS活性は pmol MU x mg^-1 x min^-1として計算した。タバコ葉抽出物中のタンパク質濃度は Bradford(1976)Analyt．Biochem．72，248-254に従って決定した。 オゾン処理したブドウ植物体で並行して行なった実験および続くノーザンブロ ット解析は0.2μｌ/lおよび0.4μｌ/lオゾンでガス処理するとmRNAレベルでSTS 遺伝子発現のかなりの誘導を起こすことを示した。このため、ブドウのSTS遺伝 子はオゾン応答性DNA要素を同定するのに特に適しているであろう。この点に関 して、ここで示された、未処理の植物に比べてオゾン処理した植物において信頼 性のある測定が可能な有意なオゾン誘導を示す遺伝子は利用可能でないことを述 べておく必要があろう。 プロモーターレベルでのオゾンの影響を解析できるようにするため、完全なプ ロモーター領域を持つVst1プロモーター/GUS融合構造（p1500GUS）を有する確立 した形質転換植物系統のF1-タバコ植物体（11週齢）をオゾンガス処理の実験に 使用した。種々のオゾン濃度（0.1μｌ/lオゾン、0.2μｌ/lオゾン、または0.4 μｌ/lオゾン）で10時間のオゾンガス処理にさらし、非汚染空気中での14時間の ポスト-インキュベーションにかけている間の種々の時点で収穫した葉の粗抽出 物中のGUS-酵素活性を測定した。図２に示した結果は汚染のない空気中に維持し た対照植物と比較したオゾン誘導性のGUS活性の急速な増加を示している。この ように0．1μｌ/lのオゾン処理は11倍の誘導、0.2または0.4μｌ/lのオゾン処理 はSTSプロモーターに制御されるGUS遺伝子発現の25倍までもの誘導をオゾン処理 の開始後12時間において生じさせる。 観察されているSTSプロモーターの強いオゾン誘導に関与するcis制御配列の同 定のために、上述のバクテリアGUSレポーター遺伝子と融合した5'欠失Vst1プロ モーターを有するトランスジェニックタバコ系統を、オゾンガス処理において独 立のF0植物として解析した。初代再生植物を数ヶ月間無菌栽培し、挿穂培養によ って増殖させた。またこれらの安定形質転換体のF1タバコ植物体（11週齢）をオ ゾン誘導GUS発現について調べた。 トランスジェニックタバコ植物体を0.1μｌ/lのオゾンで10時間処理し、続い て 非汚染空気中で更に２時間インキュベーションした。GUS活性を中程度の齢の葉 の粗抽出物で測定し、未処理の対照植物における酵素活性と比較した。GUS酵素 活性の蛍光分析の結果を表１に示した。GUS活性は、プロモーター範囲が-1500か ら-430まで順次短くなると、オゾン処理テスト植物および未処理の対照植物にお いてオゾン誘導性が僅かに低下するが(誘導係数が約12（-1500）から約10(-430) )、-430と-280の間のプロモーター範囲の更なる欠失は、オゾン処理テスト植物 におけるGUS発現を著しく低下させる。GUS遺伝子が-430-5'欠失プロモーターの 制御下にある稙物においては対照植物に比べて10倍のオゾン誘導を示すが、GUS 遺伝子がより短い-280-5'欠失プロモーターに制御されている植物は、オゾンに よって最大２倍のGUS発現の誘導しか示さない。従って、-430から-280番塩基対 を含むブドウのVst1遺伝子のプロモーター範囲はSTS遺伝子の著しいオゾン誘導 発現に必須なcis作用性要素を含んでいる。 これらの結果は上述の構造を有し、植物細胞培養で培養された植物細胞によっ て確かめられた。 図と表 図１： プラスミドpUC-Vst1/GUS中のVst1/GUS-翻訳融合の制限地図。このプラスミド はブドウのVst1プロモーターと大腸菌のGUS遺伝子の翻訳融合を含んでいる。5' 欠失変異体のクローニングに用いた制限部位を標記した。nos ter＝アグロバク テリウム ツメファシエンスのノパリンシンターゼ遺伝子の終結シグナル。 図２： GUS遺伝子とブドウの完全なVst1プロモーターの翻訳融合（p1500GUS）を有す るトランスジェニックF1-タバコ植物における、種々のオゾン濃度による、Vst1 プロモーターに制御されるGUS発現誘導のカイネティクス。 GUS活性はJefferson(1987)の上述の文献に従って、タバコの葉（第４番葉）の 粗抽出物で蛍光分析的に測定した。種々の収穫時点は図から確かめられる。10時 間のオゾン処理に続いて14時間の非汚染空気中でのタバコのポスト-インキュベ ーションを行なった。対照植物は非汚染空気中でのみ維持した(オゾンガス処理 無し)。ｎ＝３または４；平均値士標準誤差；全てのテストは重複実験としてお こなった。 表１： GUS酵素活性をオゾン処理（＋）および未処理（−）の独立したタバコ形質転 換体の中齢葉のタンパク質抽出物において蛍光分析的に決定した。トランスジェ ニックタバコ系統は、バクテリアのGUS-レポーター遺伝子と融合したVst1プロモ ーターの種々の5'欠失を有している。F0形質転換体およびF1植物体（11週齢）を 100nl/lのオゾンで10時間ガス処理し、続いて非汚染空気中で2時間ポスト-イン キュベーションした。平均値±標準誤差；全ての解析は重複実験として行なった 。 表１． Vst1プロモー 調査した独立 Gus酵素活性 誘導 ターの5'欠失 のトランスジ 係数 位置 ェニックタバ ［pmol MU min^-1 mg^-1タンパク質］ コ系統 ＋オゾン −オゾン -1500 1(F1) 735±100 63±7 11.7 -740 2(F1) 388±59 30±5 12.9 -550 3(F0) 126±13 12±3 10.5 2(F1) 173±25 15±3 11.5 -500 5(F0) 148±52 15±6 9.9 -430 6(F0) 141±38 14±4 10.0 -280 6(F0) 22±4 13±3 1.7 2(F1) 30±3 15±3 2.0 -140 2(F0) 12±0.2 8±3 1.5 3(F1) 24±3 15±3 1.6 -40 3(F1) 24±2 15±3 1.6 +70 1(F1) 3.5±1 3.5±1 1.0

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 １９６３５５６９．９ (32)優先日 平成８年９月２日(1996．9．2) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９６５４５７４．９ (32)優先日 平成８年12月27日(1996．12．27) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 シューベルト ローラント ドイツ連邦共和国 デー80993 ミュンヘ ン ダッハウアー シュトラーセ 479 (72)発明者 ザンデルマン ハインリッヒ ドイツ連邦共和国 デー81377 ミュンヘ ン ローテンブッヒャーシュトラーセ 36 (72)発明者 エルンシュト ディートリッヒ ドイツ連邦共和国 デー82131 ガウティ ング アム シュロッスパーク 28 (72)発明者 ハイン リューディガー ドイツ連邦共和国 デー40764 ランゲン フェルト タルシュトラーセ 53アー (72)発明者 フィッシャー レジーナ ドイツ連邦共和国 デー81475 ミュンヘ ン シュトックドルファーシュトラーセ 50

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下の植物DNA配列： ２．ブドウ（Vitis vinifera）起源である、請求項１に記載のDNA配列。 ３．スチルベンシンターゼ遺伝子Vst1に本来含まれ、塩基対番号-270から-430に 相当する、請求項１または２に記載のDNA配列。 ４．少なくとも請求項１に記載のDNA配列を欠く、ブドウのスチルベンシンター ゼ遺伝子Vst1のプロモーター領域。 ５．翻訳開始点から-270番塩基対までの配列範囲のみを含む、請求項４に記載の プロモーター領域。 ６．植物細胞に病原体誘導性遺伝子発現をもたらす、請求項４または５に記載の プロモーター領域。 ７．請求項１に記載のDNA配列またはその少なくとも１つの配列断片が導入され ているキメラ核酸分子。 ８．請求項７に記載のキメラ核酸分子であって、植物において前記分子に含まれ るコーディング領域のオゾン誘導性発現を可能にする前記分子。 ９．請求項１〜８のいずれか１項に記載のプロモーター領域またはキメラ核酸分 子のDNA配列、またはその断片を含むベクター。 １０．請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロモーター領域またはキメラ核酸 分子のDNA配列、または前記DNA配列に由来するDNA配列を含むトランスジェニ ック植物、および、プロトプラスト、植物細胞、カルス、種子、塊茎または挿 穂のような、前記植物の構成物およびその増殖材料。 １１．本来の状態では存在している下記のDNA配列を欠いているため、または、 その少なくとも１つの断片を欠いているため、本来オゾンに誘導される遺伝子 がもはやオゾン誘導性発現を示さないトランスジェニック植物：１２．耐病性遺伝子のオゾン誘導性発現が大きく低下している、請求項１１に記 載の植物。 １３．スチルベンシンターゼ遺伝子のオゾン誘導性発現、特にブドウのVst1遺 伝子のオゾン誘導性発現が大きく低下している、請求項１１または１２に記載 の植物。 １４．請求項１に記載のDNA配列またはその少なくとも１つの断片が導入されて いるため、本来前記DNA配列が現れない遺伝子のオゾン誘導性遺伝子発現が起 こり得る、請求項項１０に記載の植物。 １５．オゾン誘導性の遺伝子発現が起こり、植物細胞中のその遺伝子産物が活性 酸素種を無毒化することができるものである、請求項１４に記載の植物。 １６．カタラーゼまたはスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子のオゾン誘導性発 現が起こる、請求項１４または１５に記載した植物。 １７．レポーター遺伝子のオゾン誘導性発現が起こる、請求項１４に記載の植物 。 １８．請求項１０〜１７のいずれか１項に記載した、双子葉植物、特にダイズ、 ナタネ、トマト、テンサイ、ジャガイモ、ワタ、タバコ、および観葉植物また は樹木のような有用植物。 １９．請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の単子葉植物、特にエンバク、コ ムギ、ライムギ、オオムギ、コメ、キビまたはトウモロコシなどの穀物。 ２０．請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロモーター領域又はキメラ核酸分 子のDNA配列またはこれらに由来するDNA配列を有する、プロトプラストを含め たトランスジェニック植物細胞。 ２１．本来の状態では存在している下記のDNA配列、または、その少なくとも１ つの断片を欠くため、本来はオゾン誘導性である遺伝子のオゾン誘導性発現を もはや示さない、プロトプラスを含む植物細胞： ２２．請求項１に記載のDNA配列またはその少なくとも１つの断片が導入されて いるため、本来は前記DNA配列が現れない遺伝子のオゾン誘導性遺伝子発現が 起こり得る、請求項２０に記載の植物細胞。 ２３．請求項１に記載のDNA配列またはその少なくとも１つの断片を、本来は前 記DNA配列またはそれに由来するDNA配列を含んでいる防御遺伝子において欠失 させることにより、本来はオゾン誘導性である防御遺伝子のオゾン誘導性発現 を著しく低下させまたは除去したトランスジェニック植物または植物細胞を作 製するための方法。 ２４．スチルベンシンターゼ遺伝子のオゾン誘導性発現が大きく低下しまたは除 去されている、請求項２３に記載の方法。 ２５．ブドウのVst1遺伝子のオゾン誘導性発現が大きく低下しまたは除去されて いる、請求項２３または２４に記載の方法。 ２６．１または幾つかの遺伝子−これらの発現は本来はオゾンによって誘導され ない、または実質的に誘導されない−が、請求項１に記載のDNA配列または少 なくともこの１つの断片が導入されているためにオゾン誘導性である、トラン スジェニック植物または植物細胞の作製方法。 ２７．１または幾つかのカタラーゼおよび／またはスーパーオキシドジスムター ゼ遺伝子がオゾンによって誘導され得る、請求項２６に記載の方法。 ２８．１または幾つかのレポーター遺伝子がオゾンによって誘導され得る、請求 項２６に記載の方法。 ２９.請求項１に記載のDNA配列またはこれに由来するDNA配列を本来含んでいる 、本来はオゾン誘導性の防御遺伝子のオゾン誘導性を、請求項１に記載のDNA 配列またはその少なくとも１つの断片を欠失若しくは不活性化することによっ て除去する方法。 ３０．遺伝子がスチルベンシンターゼ遺伝子である、請求項２９に記載の方法。 ３１.遺伝子がブドウのVst1遺伝子である、請求項２９または３０に記載の方法 。 ３２．本来はオゾンによって誘導されない、または実質的にオゾンによって誘導 されない遺伝子に請求項１のDNA配列またはその少なくとも1つの断片を挿入す ることによって、トランスジェニック植物または植物細胞にオゾン誘導性特性 を生じさせる方法。 ３３．植物の遺伝子におけるオゾン応答配列範囲を検出するための、請求項１に 記載のDNA配列またはその断片の使用。 ３４．トランスジェニック植物または植物細胞にオゾン誘導特性を生じさせるた めの、請求項１に記載のDNA配列またはその断片の使用。 ３５．オゾン濃度の定量的および／または定性的測定のためのバイオモニターと して利用できる請求項１７の植物を作製するための、請求項１に記載のDNA配 列またはその断片の使用。 ３６．トランスジェニック植物において、より強い病原体誘導性であるがオゾン 誘導性でない耐病性を生じさせるための、請求項４〜６に記載のプロモーター 領域の使用。