PL186980B1 - Izolowany kwas nukleinowy, sposób wytwarzania roślin transgenicznych o indukowalnej ozonem ekspresji genów i transgeniczna komórka roślinna - Google Patents
Izolowany kwas nukleinowy, sposób wytwarzania roślin transgenicznych o indukowalnej ozonem ekspresji genów i transgeniczna komórka roślinnaInfo
- Publication number
- PL186980B1 PL186980B1 PL97330405A PL33040597A PL186980B1 PL 186980 B1 PL186980 B1 PL 186980B1 PL 97330405 A PL97330405 A PL 97330405A PL 33040597 A PL33040597 A PL 33040597A PL 186980 B1 PL186980 B1 PL 186980B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- ozone
- plant
- genes
- plants
- expression
- Prior art date
Links
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 124
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 58
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 87
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 claims abstract description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 189
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 87
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 54
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 claims description 43
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 claims description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 37
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 37
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 37
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 28
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 27
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 25
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 18
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 claims description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 14
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 13
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 12
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 claims description 12
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 12
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 12
- 108010076424 stilbene synthase Proteins 0.000 claims description 11
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 9
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 claims description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 9
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 claims description 8
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 claims description 8
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 101150096783 STS gene Proteins 0.000 claims description 5
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 claims description 5
- 235000002532 grape seed extract Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 101100437498 Escherichia coli (strain K12) uidA gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 claims description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 claims description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims 7
- 230000007123 defense Effects 0.000 claims 7
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 claims 4
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 claims 3
- IHPVFYLOGNNZLA-UHFFFAOYSA-N Phytoalexin Natural products COC1=CC=CC=C1C1OC(C=C2C(OCO2)=C2OC)=C2C(=O)C1 IHPVFYLOGNNZLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 241000219095 Vitis Species 0.000 claims 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims 3
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 claims 3
- 239000000280 phytoalexin Substances 0.000 claims 3
- 150000001857 phytoalexin derivatives Chemical class 0.000 claims 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims 3
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 claims 2
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 claims 2
- PYIXHKGTJKCVBJ-UHFFFAOYSA-N Astraciceran Natural products C1OC2=CC(O)=CC=C2CC1C1=CC(OCO2)=C2C=C1OC PYIXHKGTJKCVBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- NDVRQFZUJRMKKP-UHFFFAOYSA-N Betavulgarin Natural products O=C1C=2C(OC)=C3OCOC3=CC=2OC=C1C1=CC=CC=C1O NDVRQFZUJRMKKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- QNVSXXGDAPORNA-UHFFFAOYSA-N Resveratrol Natural products OC1=CC=CC(C=CC=2C=C(O)C(O)=CC=2)=C1 QNVSXXGDAPORNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N Trans-resveratrol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1\C=C\C1=CC(O)=CC(O)=C1 LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N 0.000 claims 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims 2
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 claims 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims 2
- ZNJFBWYDHIGLCU-HWKXXFMVSA-N jasmonic acid Chemical compound CC\C=C/C[C@@H]1[C@@H](CC(O)=O)CCC1=O ZNJFBWYDHIGLCU-HWKXXFMVSA-N 0.000 claims 2
- -1 peroxide anions Chemical class 0.000 claims 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims 2
- ODLMAHJVESYWTB-UHFFFAOYSA-N propylbenzene Chemical compound CCCC1=CC=CC=C1 ODLMAHJVESYWTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims 2
- 235000021283 resveratrol Nutrition 0.000 claims 2
- 229940016667 resveratrol Drugs 0.000 claims 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 235000021286 stilbenes Nutrition 0.000 claims 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims 2
- JVNVHNHITFVWIX-KZKUDURGSA-N (E)-cinnamoyl-CoA Chemical compound O=C([C@H](O)C(C)(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O1)N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1)OP(O)(O)=O)C)NCCC(=O)NCCSC(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 JVNVHNHITFVWIX-KZKUDURGSA-N 0.000 claims 1
- DMZOKBALNZWDKI-JBNLOVLYSA-N 4-Coumaroyl-CoA Natural products S(C(=O)/C=C/c1ccc(O)cc1)CCNC(=O)CCNC(=O)[C@@H](O)C(CO[P@@](=O)(O[P@@](=O)(OC[C@H]1[C@@H](OP(=O)(O)O)[C@@H](O)[C@@H](n2c3ncnc(N)c3nc2)O1)O)O)(C)C DMZOKBALNZWDKI-JBNLOVLYSA-N 0.000 claims 1
- 240000002470 Amphicarpaea bracteata Species 0.000 claims 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 claims 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 claims 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- JVNVHNHITFVWIX-WBHAVQPBSA-N Cinnamoyl-CoA Natural products S(C(=O)/C=C/c1ccccc1)CCNC(=O)CCNC(=O)[C@@H](O)C(CO[P@](=O)(O[P@@](=O)(OC[C@H]1[C@@H](OP(=O)(O)O)[C@@H](O)[C@H](n2c3ncnc(N)c3nc2)O1)O)O)(C)C JVNVHNHITFVWIX-WBHAVQPBSA-N 0.000 claims 1
- 238000004435 EPR spectroscopy Methods 0.000 claims 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 claims 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 claims 1
- 231100000674 Phytotoxicity Toxicity 0.000 claims 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 claims 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 claims 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 claims 1
- 206010063493 Premature ageing Diseases 0.000 claims 1
- 208000032038 Premature aging Diseases 0.000 claims 1
- 101000611441 Solanum lycopersicum Pathogenesis-related leaf protein 6 Proteins 0.000 claims 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 claims 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 claims 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 claims 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 claims 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 claims 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 claims 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims 1
- ZNJFBWYDHIGLCU-UHFFFAOYSA-N jasmonic acid Natural products CCC=CCC1C(CC(O)=O)CCC1=O ZNJFBWYDHIGLCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims 1
- 125000005637 malonyl-CoA group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 claims 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 claims 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 claims 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 claims 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 claims 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 claims 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 claims 1
- 230000000885 phytotoxic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 claims 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000019254 respiratory burst Effects 0.000 claims 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 claims 1
- 150000001629 stilbenes Chemical class 0.000 claims 1
- DMZOKBALNZWDKI-MATMFAIHSA-N trans-4-coumaroyl-CoA Chemical compound O=C([C@H](O)C(C)(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O1)N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1)OP(O)(O)=O)C)NCCC(=O)NCCSC(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 DMZOKBALNZWDKI-MATMFAIHSA-N 0.000 claims 1
- PJANXHGTPQOBST-VAWYXSNFSA-N trans-stilbene Chemical compound C=1C=CC=CC=1/C=C/C1=CC=CC=C1 PJANXHGTPQOBST-VAWYXSNFSA-N 0.000 claims 1
- 239000005436 troposphere Substances 0.000 claims 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 29
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 26
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 14
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 13
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 11
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 10
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 3
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 3
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 3
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 3
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 2
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N cefotaxime Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)/C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 101150016992 vat1 gene Proteins 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 101710179734 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase 2 Proteins 0.000 description 1
- 244000198134 Agave sisalana Species 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 244000099147 Ananas comosus Species 0.000 description 1
- 235000007119 Ananas comosus Nutrition 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 240000003133 Elaeis guineensis Species 0.000 description 1
- 235000001950 Elaeis guineensis Nutrition 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 101710138460 Leaf protein Proteins 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 101710186609 Lipoyl synthase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710122908 Lipoyl synthase 2, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 101710101072 Lipoyl synthase 2, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 244000070406 Malus silvestris Species 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101100293261 Mus musculus Naa15 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 1
- 101150082943 NAT1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150005851 NOS gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019093 NaOCl Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000209117 Panicum Species 0.000 description 1
- 235000006443 Panicum miliaceum subsp. miliaceum Nutrition 0.000 description 1
- 235000009037 Panicum miliaceum subsp. ruderale Nutrition 0.000 description 1
- 241000209046 Pennisetum Species 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005372 Plexiglas® Polymers 0.000 description 1
- 241000220324 Pyrus Species 0.000 description 1
- 244000061121 Rauvolfia serpentina Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000005775 Setaria Nutrition 0.000 description 1
- 241000232088 Setaria <nematode> Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 244000299461 Theobroma cacao Species 0.000 description 1
- 235000009470 Theobroma cacao Nutrition 0.000 description 1
- 241000530164 Volkameria aculeata Species 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000021016 apples Nutrition 0.000 description 1
- 235000021015 bananas Nutrition 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- WYXYBEOWQBGFQB-UHFFFAOYSA-N n-benzyl-7h-purin-2-amine Chemical compound N=1C=C2NC=NC2=NC=1NCC1=CC=CC=C1 WYXYBEOWQBGFQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021017 pears Nutrition 0.000 description 1
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 1
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 235000021251 pulses Nutrition 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical class OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 244000045561 useful plants Species 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8237—Externally regulated expression systems
- C12N15/8238—Externally regulated expression systems chemically inducible, e.g. tetracycline
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8237—Externally regulated expression systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
1. Izolowany kwas nukleinowy o se- kwencji nukleotydowej zidentyfikowanej jako SEQ ID NO: 1. Fig. 2 PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania roślin transgenicznych o indukowalnej ozonem ekspresji genów, polegający na tym, że a) wprowadza się do komórki roślinnej cząsteczkę kwasu nukleinowego o sekwencji nukleotydowej zidentyfikowanej jako SEQ ID NO: 1, połączoną operacyjnie z jednym lub większą ilością genów, b) integruje się ewentualnie sekwencję kwasu nukleinowego z etapu a) w genomie komórki roślinnej; i c) ewentualnie regeneruje się rośliny transgeniczne lub inny materiał do rozmnażania z tych roślin.
W korzystnej odmianie sposobu według wynalazku dodatkowo stosuje się geny, które w naturze nie są indukowalne ozonem lub zasadniczo nie są indukowalne ozonem.
W tym przypadku, w sposobie stosuje się jeden lub więcej genów kodujących produkty genowe, które są zdolne do detoksykacji w roślinach lub komórkach roślinnych reaktywnych tlenowo gatunków. Jeszcze bardziej korzystnie, stosuje się dodatkowo geny kodujące katalazę i/lub dysmutazę ponadtlenkową.
W sposobie można także korzystnie stosować jeden lub więcej genów reporterowych.
Przedmiotem wynalazku jest również transgeniczna komórka roślinna, charakteryzująca się tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego o sekwencji nukleotydowej zidentyfikowanej jako SEQ ID NO: 1.
Korzystnie komórka roślinna według wynalazku ma zawartą w niej sekwencję nukleotydową, która przenosi indukowalną ozonem ekspresję genów.
Jeszcze bardziej korzystnie, komórka roślinna według wynalazku ma zawartą w niej sekwencję nukleotydowę będącą częścią sekwencji promotora genu syntazy stilbenowej Vst1.
Komórka roślinna według wynalazku korzystnie zawiera sekwencję nukleotydową pochodzącą z winogron (Vitis vinifera).
Sekwencja izolowanego kwasu nukleinowego według wynalazku, pochodząca z winogron, a zwłaszcza z genu Vst1 syntazy stilbenowej z winogron (pary zasad -270 do -430), jest bardzo istotna dla dalszych realizacji wynalazku, ponieważ można w oparciu o tą sekwencję utworzyć obszary promotora genu Vst1, któremu brakuje przynajmniej sekwencji DNA obejmującej pary zasad -270 do -430 genu Vst1. Odnosi się to głównie do obszaru promotora genu Vst1, obejmującego jedynie obszar sekwencji od początku translacji do pary zasad -270 genu Vst1. Szczególnie istotny w tym przypadku jest obszar promotora charakteryzujący się brakiem obszaru sekwencji od -270 do -430 genu Vst1 mogący pośredniczyć w indukowanej przez patogen ekspresji genów w roślinach.
Przez dostarczenie zgodnych z wynalazkiem sekwencji kwasu nukleinowego izolowanego, lub obszarów promotora, lub wektorów, istnieje obecnie możliwość zmiany komórek roślinnych za pomocą metod inżynierii genetycznej, wychodząc z faktu przejawiania przez nie cechy indukowalności przez ozon. Ponadto istnieje możliwość, by komórki roślinne zmieniać metodami inżynierii genetycznej dzięki temu, że jeden lub więcej genów, które w naturalny sposób wskutek obecności sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku, lub sekwencji wyprowadzonej z niej lub homologicznej z nią DNA są indukowane przez ozon, już nie są indukowane przez ozon, korzystnie są zasadniczo indukowane przez patogen.
Szczególna zaleta wynalazku polega na tym, że indukcję przez ozon genów w roślinach i komórkach roślinnych w naturalny sposób indukowanych przez ozon można wyłączyć za pomocą delecji sekwencji według wynalazku lub co najmniej jego fragmentu w genach, które zawierają w naturalny sposób tę sekwencję DNA lub pochodzącą z niej lub homologiczną z nią sekwencję DNA.
Dalsza zaleta wynalazku polega na tym, że geny, które naturalnie nie są indukowane lub nie są zasadniczo indukowane przez ozon można przy użyciu zgodnych z wynalazkiem sekwencji kwasu nukleinowego w roślinach i komórkach roślinnych uczynić indukowanymi przez ozon. W korzystnym wykonaniu sekwencja kwasu nukleinowego, odpowiedzialna za indukowaną przez ozon ekspresję, lub co najmniej fragment tej sekwencji, kontroluje ekspresję genów, których produkty genowe mogą unieszkodliwić, reaktywne ugrupowania tlenowe, które mogą powstawać w wyniku działania ozonu w komórkach roślin. W szczególnie korzystnym wykonaniu ta sekwencja kwasu nukleinowego kontroluje ekspresję genów katalazy i dysmutazy nadtlenkowej.
186 980
W alternatywnym wykonaniu sekwencja odpowiedzialna za ekspresję genów indukowaną przez ozon kontroluje ekspresję genów reportera, która jest mierzona w celu ilościowego i/lub jakościowego oznaczenia stężeń ozonu i do oceny działania ozonu. Takimi genami reporterami mogą być np. geny uidA z E. coli, kodujące enzym β-glukuronidazy (GUS), geny lucyferazy lub inne geny typowe dla biotechnologii roślin. Odpowiednie geny reportera są znane każdemu wykształconemu specjaliście w dziedzinie biotechnologii, biochemii lub biologii molekularnej.
Izolowany kwas nukleinowy według wynalazku może być zawarty w wektorach zawierających wyżej wspomniane sekwencje DNA lub obszary promotora lub ich części.
Izolowanym kwasem nukleinowym według wynalazku można także transformować mikroorganizmy takie jak bakterie, wirusy, grzyby.
Poprzez modyfikacje wynalazku można dostarczać nowych roślin i komórek roślinnych, charakteryzujących się brakiem indukowanej przez ozon ekspresji genów, które są w naturalny sposób w roślinach indukowane przez ozon.
Cel ten jest osiągnięty przez dostarczenie sekwencji DNA odpowiedzialnej za indukcję przez ozon i dostarczenie promotorów, w których brakuje tej sekwencji i które wskutek tego umożliwiają nie indukowaną już przez ozon ekspresję kontrolowanych przez nie genów w roślinach i komórkach roślinnych.
Umożliwia to reagującą na ozon ekspresje genów, które w naturalny sposób nie są przez ozon indukowane, co jest również osiągane przez dostarczenie zgodnej z wynalazkiem sekwencji DNA. Dzięki temu są dostarczone rośliny i komórki roślinne, które celowo wykazują określone cechy w obecności ozonu.
Dzięki zastosowaniu izolowanego kwasu nukleinowego według wynalazku wytwarza się transformowane rośliny i komórki roślinne, w których ulegają ekspresji indukowane przez ozon geny, których produkty genowe mogą unieszkodliwić reaktywne ugrupowania tlenowe w komórkach roślin. Zwłaszcza chodzi przy tym o geny katalazy i dysmutazy nadtlenkowej. Alternatywnie można wytworzyć rośliny i komórki roślinne (włączając w to protoplasty), wykazujące tzw. geny reportera po indukcji przez ozon i które w danym przypadku można zastosować jako biomonitory.
Przedmiotem wynalazku są także roślinne komórki transgeniczne zawierające wyżej opisane rekombinacyjne cząsteczki kwasu nukleinowego, wbudowane w genom tych komórek roślinnych. W przypadku tych roślin może w zasadzie chodzić o dowolną komórkę roślinną. Korzystnie jest to komórka rośliny jednoliściennej lub dwuliściennej rośliny użytkowej. Przykładami roślin jednoliściennych są rośliny należące do gatunków Avena (owies), Triticum (pszenica), Secale (żyto), Hordeum (jęczmień), Oryza (ryż), Panicum, pennisetum, Setaria, Sorghum (proso), Zea (kukurydza). W przypadku dwuliściennych roślin użytkowych należy wymienić m.in. bawełnę, leguminozy, jak np. rośliny strączkowe, a zwłaszcza Alfalfa, soja, rzepak, pomidory, burak cukrowy, ziemniaki, rośliny ozdobne, drzewa. Dalszymi roślinami użytkowymi mogą być owoce (zwłaszcza jabłka, gruszki, wiśnie, winogrona, cytrusy, ananasy i banany), palmy oleiste, krzewy herbaty, kakao i kawy, tytoń, sizal oraz w przypadku roślin leczniczych Rauwolfia i Digitalie.
Szczególnie korzystne są: pszenica, żyto, owies, jęczmień, ryż, kukurydza i proso, burak cukrowy, rzepak, soja, pomidory, ziemniaki i tytoń.
Może to być także materiał reprodukcyjny wspomnianej rośliny, np. nasiona, owoce, pędy, bulwy, kłącza itd., oraz części tych roślin, takie jak komórki roślin, protoplasty i kallus.
Komórki roślinne obejmują zróżnicowane i niezróżnicowane komórki roślinne (włączając protoplasty), oraz komórki roślinne (włączając protoplasty), w których są zgodne z wynalazkiem cząsteczki kwasu nukleinowego wbudowane w genom roślinny lub jako autonomiczne cząsteczki (włączając przejściową transformację).
Cel ten jest osiągnięty przez sposób, przy pomocy którego jest możliwe wytworzenie nowych roślin i komórek roślinnych, nie wykazujących naturalnie występującej indukowanej przez ozon ekspresji genów..
Sposób według niniejszego wynalazku umożliwia również wytwarzanie roślin i komórek roślinnych, będących wynikiem ekspresji po stymulacji ozonem, przez takie geny, których
186 980 ekspresja w naturalny sposób nie jest lub zasadniczo nie jest aktywowana przez ozon. Cel ten jest osiągnięty przez sposób, przy pomocy którego można wytworzyć rośliny i komórki roślinne, które po wprowadzeniu zgodnych z wynalazkiem sekwencji DNA lub przynajmniej części ich obszaru do genów naturalnie nieindukowanych lub są jedynie słabo indukowanych przez ozon umożliwiają ekspresję tych genów po stymulacji przez ozon.
Dla wytworzenia takich nowych roślin względnie komórek roślinnych istnieją różne metody. Np. można rośliny względnie komórki roślinne zmienić przy pomocy istniejących metod transformacji inżynierii genetycznej tak, że w genom roślinny zostaną wbudowane nowe cząsteczki kwasu nukleinowego, tzn. że wytworzy się stabilne transformanty.
Rośliny, względnie komórki roślinne, które wskutek braku zgodnej z wynalazkiem sekwencji kwasu nukleinowego lub co najmniej jej fragmentu nie wykazują indukowania przez ozon genu/ genów zawierających naturalnie tę sekwencję, wytwarza się sposobem, obejmującym następujące kroki:
a) delecja określonej w zastrz. 1 sekwencji DNA względnie sekwencji, którą można wyprowadzić z tej sekwencji lub która wykazuje homologię z tą sekwencją, lub co najmniej fragmentu tej sekwencji z genu, który po delecji zgodnej z wynalazkiem sekwencji DNA obejmuje elementy regulacyjne, dla których są niezbędne, w danym przypadku regulowane, transkrypcja i translacja w komórkach roślin, obejmuje co najmniej jedną sekwencję kodującą, jak również w danym przypadku sygnał zakończenia dla zakończenia transkrypcji i addycji ogona pola-A do odpowiedniego transkryptu;
b) transformacja komórek roślinnych przy użyciu wytworzonego w etapie a) genu względnie cząsteczki kwasu nukleinowego, i
c) w danym przypadku, regeneracja roślin transgenicznych i w danym przypadku, rozmnożenie roślin.
Alternatywnie w etapie a) w miejsce delecji sekwencji odpowiedzialnej za indukcję przez ozon, można tę sekwencję lub przynajmniej jej część inaktywować względnie blokować np. przez mutagenezę i pozostawić w inaktywowanej postaci w genie. Niezależnie od tego, w jaki sposób wyłącza się obszar genu reagujący na ozon, wszystkie czynności manipulacyjne można wykonać przy pomocy ogólnie stosowanych metod i środków pomocniczych techniki rekombinacyjnej inżynierii genetycznej (patrz np. Sambrook i in. (1969) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. wyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).
Cząsteczka kwasu nukleinowego przenoszona na rośliny względnie komórki roślinne w etapie b) zawiera elementy regulacyjne umożliwiające np. indukowaną przez patogen ekspresję genów kodującej sekwencji.
Zgodnie z wynalazkiem rośliny względnie komórki roślinne, które w oparciu o obecność zgodnej z wynalazkiem sekwencji kwasu nukleinowego zasadniczej dla względnie współodpowiedzialnej za indukowaną przez ozon ekspresję zawartych w nich genów, lub przynajmniej fragmentu tej sekwencji, wytwarza się sposobem obejmującym następujące etapy:
a) wprowadzenia co najmniej jednej zgodnej z wynalazkiem sekwencji DNA, która może w roślinach powodować indukowaną przez ozon ekspresję, sekwencji, którą można z niej wyprowadzić lub sekwencji homologicznej względem niej, lub przynajmniej fragmentu tej sekwencji do genu, którego sekwencja naturalnie nie jest lub zasadniczo nie jest indukowana przez ozon
b) transformacji komórek roślinnych wytworzonym w etapie a) genem względnie cząsteczką kwasu nukleinowego, dysponującą wszystkimi wymaganymi elementami dla naturalnej ekspresji w komórkach roślin, i
c) w danym przypadku, regeneracji roślin transgenicznych i w danym przypadku rozmnożenia roślin.
W korzystnym wykonaniu chodzi w przypadku genu o gen katalazy, dysmutazy nadtlenkowej lub typowy gen-reporter.
Reagujące na ozon składniki kwasu nukleinowego może specjalista zidentyfikować przy pomocy zwykłych metod biologii molekularnej np. eksperymenty hybrydyzacji lub badania wiązania DNA-proteina. np. w pierwszym etapie z tkanki, poddanej działaniu ozonu, wyod186 980 rębnia się poli(A)+ RNA, a następnie przykłada bank cDNA. W drugim etapie przy pomocy klonów cDNA, opierających się na cząsteczkach poli(A)+ RNA z tkanki nie poddanej działaniu, z pierwszego banku za pośrednictwem hybrydyzacji identyfikuje się te klony, których odpowiadające cząsteczki poli(A)+RNA są indukowane wyłącznie przy działaniu ozonem. Następnie wyodrębnia się przy pomocy tak zidentyfikowanych cDNA promotory dysponujące elementami reagującymi na ozon. Przy badaniu i charakteryzowaniu tych wyizolowanych promotorów przydatne mogą być sekwencje i cząsteczki kwasu nukleinowego.
Cząsteczki kwasu nukleinowego lub ich fragmenty, hybrydy zują z jedną z wyżej opisanych cząsteczek kwasu nukleinowego lub jedną z wyżej opisanych sekwencji dNa według wynalazku. Termin „hybrydyzacja” oznacza w ramach niniejszego wynalazku hybrydyzację w typowych warunkach hybrydyzacji, korzystnie w ścisłych warunkach, jak np. opisane w Sambrook i in. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. wydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Cząsteczki kwasu nukleinowego hybrydyzujące z cząsteczkami zgodnymi z wynalazkiem mogą być np. wyizolowane z bibliotek genomowych lub cDNA.
Identyfikacja i wyizolowanie takich cząsteczek kwasu nukleinowego może nastąpić przy użyciu zgodnych z wynalazkiem cząsteczek kwasu nukleinowego lub części tych cząsteczek względnie odwrotnych komplementów tych cząsteczek, np. przez hybrydyzację wg procedury standardowej (patrz np. Sambrook i in., supra).
Jako sondę hybrydyzacyjną można użyć np. cząsteczki kwasu nukleinowego, o dokładnie lub zasadniczo zgodnych z wynalazkiem sekwencjach nukleotydowych lub częściach tych sekwencji. W przypadku fragmentów użytych jako sonda hybrydyzacyjna może chodzić także o fragmenty syntetyczne, wytworzone przy użyciu zwykłych technik syntetycznych i ich sekwencje zasadniczo zgodnej z cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku. Po identyfikacji i wyizolowaniu genów hybrydyzujących z sekwencjami kwasu nukleinowego według wynalazku, należy wyznaczyć sekwencję i przeprowadzić analizę właściwości. Specjalista dysponuje szeregiem standardowych metod biologii molekularnej, biochemii i biotechnologii.
Cząsteczki hybrydyzujące ze zgodnymi z wynalazkiem cząsteczkami kwasu nukleinowego obejmują także fragmenty, pochodne i allelowe odmiany wyżej opisanych cząsteczek DNA, zawierających reagującą na ozon sekwencję, w formie aktywnej lub inaktywowanej lub które właśnie wyróżniają się przez to, że nie mają już tej sekwencji. Wyrażenie „pochodna” oznacza w związku z tym, że sekwencje tych cząsteczek różnią się od sekwencji wyżej opisanych cząsteczek kwasu nukleinowego w jednej lub więcej pozycjach i wykazują wysoki stopień homologii do tych sekwencji. Homologia oznacza tu identyczność sekwencji co najmniej 40%, a zwłaszcza identyczność co najmniej 60%, korzystnie ponad 80%, a zwłaszcza korzystnie ponad 90%. Odchylenia od wyżej opisanych cząsteczek kwasu nukleinowego mogą przy tym powstać przez delecję, addycję, podstawienie, wstawienie lub rekombinację.
W przypadku cząsteczek kwasu nukleinowego, które są homologiczne względem wyżej opisanych cząsteczek i stanowią pochodne tych cząsteczek, chodzi z reguły o odmiany tych cząsteczek, które stanowią modyfikacje o tych samych funkcjach biologicznych. Może także chodzić o naturalnie występujące odmiany, np. sekwencje z innych organizmów lub o mutacje, przy czym te modyfikacje mogą występować w naturalny sposób lub mogą być wprowadzone przez celową mutagenezę. Ponadto może chodzić przy odmianach o syntetycznie wytworzone sekwencje. W przypadku odmian allelowych może także chodzić o odmiany naturalnie występujące, syntetycznie wytworzone lub wytworzone technikami rekombinacji DNA.
Istnieje wiele wektorów klonowania do dyspozycji przy przygotowaniu wprowadzenia obcych genów do wyższych roślin względnie ich komórek, które to wektory zawierają sygnał replikacji dla E. coli i gen-marker dla selekcji transformowanych komórek bakteryjnych. Przykładami takich wektorów sąpBR322, seria pUC, seria M13mp, pACYClB4 itd. Żądaną sekwencję można wprowadzić do wektora w odpowiednim miejscu cięcia enzymami restrykcyjnymi. Uzyskany plazmid stosuje się do transformacji komórek E. coli. Transformowane komórki E. coli hoduje się w odpowiedniej pożywce, a następnie zbiera i poddaje lizie. Pla10
186 980 zmid odzyskuje się. Jako metody analityczne do scharakteryzowania uzyskanego DNA plazmidu stosuje się zasadniczo analizy restrykcyjne, elektroforezy na żelu i inne metody biochemii i biologii molekularnej. Po każdej manipulacji można DNA plazmidu rozszczepić i uzyskany fragment DNA związać z innymi sekwencjami DNA. Każda sekwencja DNA plazmidu może być klonowana w tych samych lub innych plazmidach.
Istnieje szereg znanych technik służących do wprowadzania DNA do roślinnych komórek gospodórza, przy czym specjalista może bez trudu dobrać odpowiednią w danym przypadku metodę. Techniki te obejmują transformację komórek roślinnych za pomocą T-DNA przy użyciu Agrobacterium tumefaciens lub Agrobacterium rhizoaenes jako środków transformacji, fuzję protoplastów, bezpośredni transfer genu iizolowanego DNA w protoplastach, elektroporację DNA, wprowadzenie DNA za pomocą metody biolistycznej oraz dalsze możliwości. Można wytworzyć zarówno trwałe jak i przejściowe transformanty.
Przy iniekcji i elektroporacji DNA do roślinnej komórki gospodarza nie ma per se szczególnych wymagań co do stosowanych plazmidów. Podobnie jest w przypadku bezpośredniego transferu genu. Można stosować proste plazmidy jak np. pochodne pUC. Jeśli jednak z tak transformowanych komórek mają być regenerowane całe rośliny, niezbędna jest obecność selekcjonowanego genu-markera. Specjalista zna typowe markery selekcji i nie stanowi dla niego problemu, by wybrać odpowiedni marker. Typowe markery selekcji to takie, które nadają transformowanym komórkom roślinnym odporność na biocyd lub antybiotyk taki jak ranamycyna, G418, bleomycyna, hygromycyna, metotreksat, glifosat, streptomycyna, sulfonylo-mocznik, gentamycyna lub fosfinotrycyna itp.
Stosownie do metody wprowadzania żądanych genów do komórek roślinnych mogą okazać się niezbędne dalsze sekwencje DNA. Jeśli np. stosuje się do transformacji komórki roślinnej plazmid Ti- lub Ri, musi być przynajmniej prawe ograniczenie, często jednak prawe i lewe ograniczenie zawartego w plazmidzie Ti- i Ri- T-DNA jako obszar flanki być połączony z wprowadzonymi genami.
Jeśli do transformacji stosuje się agrobakterie, wprowadzany DNA musi być klonowany w specjalnych plazmidach, a mianowicie w wektorze pośrednim lub binarnym. Wektory pośrednie mogą wskutek sekwencji, które są homologiczne do sekwencji w T-DNA, być wbudowane w Ti- lub Ri-plazmid Agrobakterii przez homologiczną rekombinację. Zawiera on ponadto obszar vir niezbędny dla transferu T-DNA. Wektory pośrednie nie mogą replikować w Agrobakteriach. Za pośrednictwem plazmidu-pomocnika może wektor pośredni być przeniesiony na Agrobacterium tumefaciens (koniugacja). Wektory binarne mogą replikować zarówno w E. coli jak i w agrobakteriach. Zawierają one gen markera selekcji i linker lub polilinker, które są obramowane przez prawy i lewy obszar graniczny T-DNA. Można je bezpośrednio transformować do agrobakterii (Holsters i in. (1978) Molecular and General Genetics 163, 161-187). Agrobakteria służąca jako komórka gospodarza powinna zawierać plazmid, mający obszar vir. Obszar vir jest niezbędny dla transferu T-DNA do komórek roślinnych. Mogą być dostępne dodatkowe T-DNA. Tak transformowaną agrobakterię stosuje się do transformacji komórek roślinnych.
Zastosowanie T-DNA do transformacji komórek roślinnych jest intensywnie badane i zostało wyczerpująco opisane w EP 120 515; Hoekema w: The Binary Plant Vector System, Offsetdrokkerij Kanters H.V., Alblasserdam (1985) Chapter V; Fraley i in. (1993) Crit. Rev. Plant. Sei., 4, 1-46 i An i in. (1985) EMBO J. 4, 277-287.
W celu przeniesienia DNA do komórek roślinnych można hodować roślinne eksplanaty celowo z Agrobacterium tumefaciens lub Agrobacterium rhizogenes. Z infekowanego materiału roślinnego (np. części liści, elementy łodygi, korzenie, lecz także protoplasty lub komórki roślinne hodowane w zawiesinie) można następnie znów w odpowiedniej pożywce, mogącej zawierać antybiotyki lub biocydy dla selekcji transformowanych komórek, regenerować całe rośliny. Regeneracja roślin następuje według typowych metod regeneracji przy użyciu znanych pożywek. Tak uzyskane rośliny względnie komórki roślinne można następnie badać na obecność wprowadzonych DNA. Znane są inne możliwości wprowadzenia obcych DNA przy użyciu sposobów biolistycznych lub przez transformację protoplastów, (por. np. Willmitzer L. (1993) Transgenic Plants, w: Biotechnology, A Multi-Volume Compreheneive Treatise
186 980 (H.J. Rehm, G. Reed, A. Puhler, P. Stadler, red.) tom 2, 627-659, V.C.H. Weinheim - New York - Basel - Cambridge).
Podczas gdy transformacja roślin dwuliściennych względnie ich komórek przez układy wektorowe plazmidu Ti przy pomocy Agrobacterium tumefaciens jest dobrze ugruntowane, z nowszych prac wynika, że także rośliny jednoliścienne względnie ich komórki są łatwo dostępne dla transformacji za pomocą wektorów opartych na Agrobacterium (Chan i in. (1993) Plant Mol. Biol. 22, 491-506; Hiei i in. (1994) Plant J. 6, 271-282; Deng i in. (1990) Science in China 33, 28-34; Wilmink i in. (1992) Plant i Celi Reports 11, 76-80; May i in. (1995) Bio/Technology 13, 486-492; Conner i Domiss (1992) Int. J. Plant Sei. 153, 550-555; Ritchie i in. (1993) Transgenic Res. 2, 252-265).
Alternatywnymi układami dla transformacji roślin jednoliściennych względnie ich komórek są transformacje za pośrednictwem zestawu biolistycznego (Wan i Lemaux (1994) Plant Physiol. 104, 37-48; Vaeil i in. (1993) Bio/Technology 11, 1553-1558; Ritala i in. (1994) Plant Mol. Biol. 24, 317-325; Spencer i in. (1990) Theor. Appl. Genet. 79, 625-631), transformacji protoplasty, elektroporacji komórek częściowo permeabilizowanych oraz wprowadzenia DNA za pomocą włókien szklanych.
Transformowane komórki wzrastają w obrębie rośliny w zwykły sposób (patrz także McCormick i in. (1986) Plant Cell Reports 5, 81-84). Uzyskane rośliny mogą być normalnie uprawiane, a mogą być skrzyżowane z roślinami mającymi takie same transformowane cechy dziedziczne lub inne cechy dziedziczne. Powstałe w wyniku tego hybrydy mają odpowiednie cechy fenotypowe.
Należy wyhodować dwa lub więcej pokolenia, aby się upewnić, że cecha fenotypowa jest trwale zachowana i dziedziczona. Należy także zbierać nasiona, aby się upewnić że jest zachowany odpowiedni fenotyp lub inne cechy charakterystyczne.
Można również zwykłymi metodami określić linie transgeniczne, które są homozygotowe dla nowych cząsteczek kwasu nukleinowego i badać ich fenotypowe zachowanie względem istniejącego bądź nieistniejącego reagowania na ozon i porównywać z liniami hemizygotowymi.
Komórki roślinne zawierające zgodne z wynalazkiem cząsteczki kwasu nukleinowego mogą oczywiście być nadal hodowane także jako komórki roślinne (włączając w to protoplasty, kallus, hodowle w zawiesinie).
Dalszym przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie zgodnych z wynalazkiem cząsteczek kwasu nukleinowego lub części tych cząsteczek względnie odwrotnych komplementów tych cząsteczek do identyfikacji i wyizolowania cząsteczek homologicznych, obejmujących reagujące na ozon elementy z roślin lub innych organizmów. Co się tyczy definicji terminu „homologia” patrz wyżej.
Poniższe przykłady są ilustracją wynalazku.
Przykłady
Przykład 1
Konstrukcja delecji 5' promotora Vat1 jako konstruktów fuzji GUS w wektorze binarnym pPCV002
Określany poniżej jako promotor 5'-nie-kodujący obszar sekwencji genu Vst1 z winogron składa się z 1570 par zasad. Promotor ten, którego sekwencja znana jest m.in. z niemieckiego DE 41 07 396 i z: Fischer (1994) supra amplifikowano za pomocą konwencjonalnej reakcji łańcuchowej polimerazy przy użyciu następującego oligonukleotydu jako primera i plazmidu pVst1 zawierającego pełny gen Vat1 (DE-A-41 07 396; Fischer (1994) supra) jako szablonu:
-5'- CCCCAAGCTT CCCCGGATCA CATTTCTATG AGT -3' (Primer 1, SEQ ID NO: 2)
-5'- CGCGGATCCT CAATTGAAGC CATTGATCCT AGCT -3' (Primer 2, SEQ ID NO: 3).
Reakcję PCR przeprowadzono wg protokołu Perkin Elmer (Norwalk, USA) przy użyciu polimerazy DNA rodzimego Taq (Perkin Elmer). Amplifikowany w typowych wa-runkach PCR fragment DNA wytrawiono następnie enzymami restrykcyjnymi HindIII (to miejsce cięcia jest zawarte na końcu 5' primera 1) i BamHI (to miejsce cięcia jest zawarte na końcu 5' primera 2) i wraz z fragmentem BamHI/EcoRI z wektora pBI101.2 (Jefferson (1987) Plant
186 980
Mol. Biol. Reporter 5, 387-405), zawierającym gen-reporter β-glukuronidazy (GUS, uidA) z E. coli wraz z sygnałem zakończenia genu nos z A. tumefaciens, przez miejsca restrykcyjne HindIII i EcoRI polilinkera pUC18 w plazmidzie pUClB (Yanisch-Perron i in. (1985) Gene 33, 103-119; dostępny np. z Boehringer Mannheim). Wszystkie etapy klonowania wykonano przy użyciu zwykłych technik biologii molekularnej i środków pomocniczych (np. Sambrook i in. (1989) supra); enzymy restrykcyjne inne enzymy użyte dla klonowania sprowadzono z Boehringer Mannheim. Uzyskany klon pUC (pUC-Vstl/GUS) zawiera fuzję translacyjną promotora Vstl z genem GUS, w którym pierwsze pięć kodonów STS w ramce odczytu jest połączone poprzez miejsce cięcia BamHI z genem GUS. Obszar sekwencji przejścia fuzyjnego jak również sekwencję promotora Vst1 sprawdzono pod względem prawidłowości przy pomocy enzymatycznej metody rozrywania łańcucha (Sanger i in. (1977) Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) przy użyciu zestawu do sekwencjonowania T7 firmy Pharmacia (Freiburg). Poniżej objaśniono klonowanie mutantów delecji 5' w wektorze binarnym pPCV002 (Koncz i Schell (1986) Mol. Gen. Genet. 204. 383-396). W większości przypadków zastosowano subklony pUC18 jako wektory pośrednie, ponieważ łatwiej się posługiwać mniejszym plazmidem pUC w porównaniu ze stosunkowo dużymi wektorami binarnymi.
Określenia plazmidów wynikają z przybliżonej długości każdorazowego fragmentu promotora, licząc od początku transkrypcji, znajdującego się w odległości 73 par zasad od kodonu startowego (Hain i in. (1993) supra; Fischer (1994) supra). Miejsca trawienia restrykcyjnego użyte dla stopniowego skracania promotora Vst1 także przedstawiono schematycznie na rys. 1.
P1500GUS: Fragment HindIII/EcoRI zawierający pełny promotor STS wraz z genem GUS wyizolowano z wyżej opisanego plazmidu pUC-Vst1/GUS i wstawiono między miejsca trawienia restrykcyjnego HindIII i EcoRI w polilinker pPCV002.
- pl060GUS: fragment promotora o 1130 bp wyizolowano przez miejsca trawienia restrykcyjnego BamHI i Sspl z pUC-Vst1/GUS i klonowano w linearyzowany przez BamHI/HincII pUC18 ( -> pUC1130). Następnie wyizolowano gen GUS jako fragment BamHI/EcoRI z pUC-Vstl/GUS i klonowano między miejsca trawienia BamHI i EcoRI pUC1130. Na koniec wyizolowano fuzję przez podwójne trawienie HindIII/EcoRI i wstawiono przez jednakowe miejsca trawienia w polilinker pPCV002.
- p930GUS: fragment promotora o 1,0 kb wyizolowano przez enzym restrykcyjny BamHI i HincII z pUC-Vst1/GUS i wstawiono przez jednakowe miejsca trawienia restrykcyjnego w polilinker pUClB (-> pUC1000). Następnie wykonano klonowanie analogicznie do p1060GUS.
- p740GUS: fragment promotora HindIII/HamHI o długości około 1,6 kb wyizolowano z plazmidu pUC-Vstl/GUS i trawiono enzymem restrykcyjnym DraI. Uzyskany fragment BamHI/DraI o długości 810 bp klonowano następnie przez miejsca trawienia restrykcyjnego BamHI i HincII w pUC18 (-> pUC810). Następnie wyizolowano gen GUS jako fragment BamHI/EcoRI z pUC-Vstl/GUS i klonowano między miejscami trawienia BamHI i w EcoRI pUC810. Na koniec wyizolowano fuzję przez podwójne trawienie Hindlll/EcoRI i wstawiono przez te same miejsca trawienia w polilinker pPCV002.
- p550GUS: pUC-Vstl/GUS wytrawiono enzymem restrykcyjnym AfIII, a sterczące końce 5' uzupełniono enzymem Klenowa (z 1 Boehringer Mannheim; dNTP również z Boehringer Mannheim) według danych producenta. Następnie przecięto enzymem restrykcyjnym BamHI i powstały fragment promotora o 620 bp ligowano w linearyzowanym przez BamHI/HincII pUC18 (-> pUC620). Następnie wykonano klonowanie jak np. w przypadku dla pl060GUS.
- p550GUS: fragment promotora o długości 570 bp wyizolowano przez podwójne trawienie BamHI/HaelII z pUC-Vstl/GUS i ligowano w linearyzowany przez HamHI/HincII wektor pUC19 (-> pUC570). Po tym nastąpiło dalsze klonowanie jak przy wytwarzaniu m.in. pl060GUS.
- p430GUS: wyżej opisany plazmid pUC1000 zlinearyzowano przy użyciu enzymu restrykcyjnego SnaBI i potem wytrawiono HincII. Następnie zlinearyzowany wektor poddano
186 980 powtórnej ligacji, przy czym 500 par zasad promotora między -930 i -430 uległo delecji (-> pUC500). Dalsze klonowanie przebiegło jak dla pUC1060GUS.
- p280GUS: pUC-Vstl/GUS trawiono enzymem restrykcyjnym BanII, sterczące końce wypełniono przy użyciu enzymu Klenowa i zlinearyzowany wektor wytrawiono enzymem restrykcyjnym BamHI. Po wyizolowaniu fragmentu promotora BamHI o długości 350 bp o tępych końcach klonowanie kontynuowano przez analogię do p1060GUS.
- pl40GUS: wyżej opisany subklon pUC z pUC620 wytrawiono enzymem restrykcyjnym NsiI i PstI i zlinearyzowany wektor następnie oczyszczono oraz poddano powtórnej ligacji. Doprowadziło to do delecji sekwencji promotora od -550 do -140 (-> pUC210). Następnie wyodrębniono z pUC-Vst1/GUS gen GUS jako fragment BamHI/EcoRI i klonowano między miejsca cięcia BamHI- i EcoRI pUC1130. Na koniec wyizolowano fuzję przez podwójne trawienie HindIII/EcoRI i wstawiono przez te same miejsca trawienia w polilinker pPCV002.
- p40GUS: fragment promotora o 110 bp. wyizolowano z pUC-Vstl/GUS razem z genem GUS przez podwójne trawienie NheI/EcoRI i następnie fragment klonowano w pPCV002 zlinearyzowany przez XbaI/EcoRI.
- pAGUS : konstrukt p1500GUS wytrawiono enzymem restrykcyjnym BamHI i oczyszczony wektor poddano następnie powtórnej ligacji. Przez miejsce cięcia BamHI, zawierające naturalnie wektor pPCV002 w swoim miejscu wielokrotnego klonowania obok miejsca cięcia HindIII (Koncz i Schell (1986) supra). wyeliminowano w ten sposób cały fragment promotora.
- p35SGUS: fuzję promotora RNA 35S z wirusa mozaiki kalafiora z genem GUS, służącym do kontroli pozytywnej, wyodrębniono jako fragment HindIII z wektora ekspresji pRT99GUS (Tópfer i in. (1988) Nucleic Acida Research 16, 8725) i wstawiono w miejsce wielokrotnego klonowania pPCV002.
Przykład 2:
Materiał roślinny, transformacja roślin i regeneracja roślin transgenicznych.
Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1 (Maliga i in. (1973), Nature New Biol. 244, 29-30) hodowano jako sterylną hodowlę pędu na pozbawionej hormonów pożywce 1/2 LS (Linsmaier i Skoog (1965) Physiol. Plant 18, 100-127) z 1% sacharozy w 26°C, 3000 luksów przy 16-godz. fotookresie. W odstępach 6-8 tygodni wymienia się odcinki pędu na świeżej pożywce LS. W celu transformacji krążków liści przy użyciu Agrobacterium tumefaciens (Horsch i in. (1985) Science 227, 1229- L5 1231) wytłoczono liście (o długości 2-3 cm) sterylnych kultur pączków jako krążki o średnicy 1 cm i inkubowano przez 5 min przy użyciu zawiesiny agrobakterii (ok. 10*9 komórek/ml pożywki YEB), zawierającej jeden z wyżej wspomnianych konstruktów plazmidu. Infekowane kawałki liści utrzymywano na pozbawionej hormonów pożywce LS przez 2-3 dni w 26°C. Przez ten czas bakterie pokryły segmenty liści, które następnie wyrosły w płynnej pożywce LS bez hormonu i umieszczono je na pożywce LS zawierającej kanamycynę (75 pg/ml; Sigma, Munchen), cefotaxim (500 pl/ml; Hoechst, Frankfurt) i benzyloaminopurynę (BAP, 0,5 mg/l; Duchefa, Haarlem, Holandia). Po 2-3 tygodniach były widoczne transformowane pędy, ukorzenione na nie zawierającej hormonu pożywce LS zawierającej 75 pg/ml kanamycyny i 100 p g/ml cefotaximu.
Kultury agrobakterii użyte dla transformacji kawałków liści tytoniu wytworzono jak następuje. Najpierw wprowadzono wyżej opisane pochodne pPCV002 do szczepu mobilizującego E. coli SI7-1 (Simon i in. (1983) Bio/Technology 1, 784-790). Nastąpiło wytworzenie kompetentnych komórek SI7-1 E. coli oraz transformacja kompetentnych komórek z odpowiednimi plazmidami według Taketo (1988) Biochem. Biophys. Acta 949, 318-324 względnie Hanahan (1983) J. Mol. Biol. 166, 557-580. Następnie hodowano szczep E. coli S17-1, zawierający każdorazowy wektor binarny i szczep Agrobactermm tumefaciens GV3101 C58C1 Rif pMP90RK (Koncz i Schell (1986) supra) w odpowiednich pożywkach do OD580 = 1/0. W przypadku hodowli bakterii E. coli użyto konwencjonalnej pożywki YT (Miller (1972), Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Bacto-Tryptone 0,8% (wag./obj.), ekstraktu drożdży 0,5% (wag./obj.), NaCl 0,5% (wag./obj.), pH 7,0) w 37 °C, a dla hodowli bakterii A. tumefaciens użyto pożywki YEH (ekstrakt bydlęcy 0,5% (wag./obj.), ekstrakt drożdży 0,1% (wag./obj.), Bacto-Pepton 0,5%
186 980 (wag./obj.), sacharozę 0,5% (wag./obj.), MgSOą 2 mM, pH 7,2) w 28°C. W celu następującej po tym koniugacji odwirowano bakterie przy 1500 x g przez 5 min. i dwukrotnie przemyto świeżo przyrządzonym roztworem 10 mM MgSOą. Następnie donor (E. coli) i akceptor (A. tumefaciens) zmieszano w stosunku 1:1 i wkraplano na płytkę agarową YEB. Po 16 godz. inkubacji w 28°C wypłukano krople bakterii przy użyciu 10 mM roztworu MgSOą i rozcieńczenia 10'2, 10'3 i 1t)4 YEB umieszczono na płytkach do selekcji. Z pojedynczej hodowli wyhodowano w 28°C kulturę agrobakterii użytą dla transformacji N. tabacum. Transgeniczne pędy tytoniu, zawierające w każdym przypadku jedną z wyżej opisanych fuzji promotor Vstl/GUS, rozmnożono sterylnie przez hodowlę pędu, przeprowadzono częściowo do gleby i hodowano w szklarni w normalnych warunkach (22°C, 60%o wilgotność względna, ok. 15000 luks) aż do kwitnienia. Kwiaty chroniono za pomocą torebek z pergaminu przed obcym zapyleniem i po 4-6 tygodniach zebrano dojrzałe torebki nasienne z nasionami pokolenia F1. W celu testów biologicznych w szklarni nasiona pokolenia F1 położono na pożywce LS zawierającej 75 pg/ml ranamycyny. Nastąpiło to w warunkach sterylnych bezpośrednio na torebce lub po sterylizacji powierzchniowej (1. krótkie przemycie sterylną wodą; 2. 2 min. inkubacji w 70% etanolu; 3. 10 min. inkubacji w 3% NaOCl (13% aktywnego chloru); 4. trzykrotne mycie wodą; 5. suszenie w strumieniu laminarnym na stole roboczym bezpieczeństwa). Po ok. 2 tygodniowej hodowli na pożywce LS zawierającej 75 pg/ml ranamycyny w 25-26°C, 2000-3000 luks i 60% wilgotności powietrza jednoznacznie można było rozróżnić odporne na kanamycynę
-2Bpędy tytoniu i wrażliwe na kanamycynę pędy tytoniu. Pędy odporne wykazały w przeciwieństwie do pędów wrażliwych wyraźny wzrost korzeni pierwotnych. Ponadto, jedynie w tym przypadku można było po 2 tygodniach oprócz liścieni stwierdzić także liście pierwotne. W tym stadium „czterolistnym” przeniesiono odporne zarodki F1 do gleby, zahartowano i hodowano dalej w odpowiednich warunkach.
Przykład 3:
Hodowla roślin, działanie ozonem i zbieranie liści
W celu następującego po tym działania ozonem przeniesiono transgeniczne, odporne na kanamycynę zarodki tytoniu z płytek agarowych do doniczek z mieszaniną 2:1 podłoża standardowego (Typ T /Fruhatorfer/Lauterbach) z perlitem i przez 3 tygodnie inkubowano w komorze klimatycznej przy 12 godzinnym cyklu dzień / noc, 15.000 luksów, w temperaturze dziennej 25°C i w temperaturze nocnej 20°C, przy wilgotności powietrza 65-70% i filtrowanym powietrzu. Następnie tytoń wystawiono na 10 h na działanie pojedynczego impulsu ozonu, a potem inkubowano w wolnym od szkodliwych substancji, przefiltrowanym powietrzu przez 2-14 h. Wszystkie eksperymenty z gazowaniem wykonano w zamkniętych pudełkach z pleksiglasu wstawionych do komory klimatycznej w podanych warunkach klimatycznych. Działanie ozonem rozpoczynano zawsze o 9.00 rano przez cały cykl dzienny. Ozon otrzymywano przez elektryczne wyładowania w suchym tlenie. Dawkowanie i analizy przeprowadzano pod kontrolą komputerową (Langebartels i in. (1991) Plant Physiol. 95, 882-889). Liście tytoniu rośliny zliczono od czubka rośliny do dołu i sklasyfikowano pod względem liczby liści 1-10, przy czym pierwszy liść miał wielkość co najmniej 8 cm. Liście tytoniu (klasyfikowane od 1 do 10) zamrażano pojedynczo w różnych punktach czasowych po rozpoczęciu działania ozonem w ciekłym azocie i składowano w -80°C.
Przykład 4:
Próba aktywności β-glukuronidazy
Analizę fluorymetryczną aktywności enzymu GUS przeprowadzono ściśle według: Jefferson (1987) supra względnie Jefferson i in. (1987) EMHO J. 6, 3901-3907 przy użyciu 4metyloumbeliferyloglukuronidu (MUG, Sigma, Munchen). Stężenie produktu 4-metyloumbeliferonu (MU) zmierzono przy użyciu fotometru fluorescencyjnego (Fluorymetr z filtrem Perkin Eimer LS-2 B) w kwarcowej kuwecie przepływowej. Aktywność GUS w ekstraktach roślin obliczono w pmol MU x mg’1 x min'1 stężenie protein w ekstraktach tytoniu oznaczono według: Bradford (1976) Analyt. Biochem. 72, 248-254.
186 980
W równolegle przeprowadzonych eksperymentach z poddawanymi działaniu ozonu winoroślami i następnie analizach Northern Biot wykazano, że gazowanie przy użyciu 0,2 μΐ/ΐ i 0,4 μΐ/ΐ ozonu prowadzi do znacznej iindukcji ekspresji genów STS na poziomie mRNA. Z tego powodu geny STS z winogron powinny się szczególnie dobrze nadawać do identyfikacji reagujących na ozon składników DNA. Należy tu wspomnieć, że dotychczas nie dysponuje się takimi genami, umożliwiającymi wykrycie znacznej, dobrze mierzalnej indukcji przez ozon w roślinach poddanych działaniu ozonu w porównaniu z roślinami nie poddanymi działaniu. Aby móc zanalizować wpływ ozonu na poziomie promotora, zastosowano w eksperymentach z gazowaniem ozonem rośliny tytoniu F1 (11 tygodniowe) trwale transformowanej linii tytoniu, zawierającej konstrukt fuzji promotor Vst 1/GUS z pełnym obszarem promotora (pl500GUS). Aktywność enzymu GUS oznaczono fluorometrycznie w surowych ekstraktach liści zebranych w różnych punktach czasowych podczas 10 godzinnego gazowania ozonem przy różnych stężeniach ozonu (0,1 μΐ/ΐ ozonu, 0,2 μΐ/ΐ ozonu względnie 0,4 μΐ/l ozonu) i w 14 godzinnej fazie postinkubacyjnej w powietrzu bez szkodliwych subtancji. Wyniki przedstawione na rys. 2 pokazują szybki indukowany przez ozon wzrost aktywności GUS w porównaniu z roślinami kontrolnymi, utrzymywanymi jedynie w powietrzu bez szkodliwych substancji. Następnie działanie 0,1 μΐ/ΐ ozonu wywołało 11-krotną indukcję, a działanie 0,2 względnie 0,4 μΐ/ΐ ozonu nawet aż do 25-krotnej indukcji ekspresji genu GUS kontrolowanej przez promotor STS 12 h po rozpoczęciu działania ozonem.
W celu identyfikacji sekwencji cis-regulatorowych, odpowiedzialnych za zaobserwowaną silną indukcję ozonem promotora STS, zanalizowano transgrnicznr linie tytoniu, zawierające wyżej opisane delecje 5' promotora Vst1 w fuzji z bakteryjnym genem-reporterem GUS, jako niezależne rośliny F0 w eksperymentach gazowania ozonem. Regeneraty pierwotne hodowano przez szereg miesięcy w sterylnej kulturze i rozmnożono przez hodowlę pędu. Badano również rośliny tytoniu F1 (11 tygodniowe) tych stabilnych transformant na indukowaną przez ozon ekspresję GUS.
Na rośliny transgrnicznr działano przez 10 h 0,1 μΐ/ΐ ozonu, a następnie przez dalsze 2 h inkubowano w powietrzu bez szkodliwych substancji. Aktywność GUS oznaczono w surowych ekstraktach liści o średnim wieku i porównano z aktywnością enzymu w roślinach kontrolnych nie poddanych działaniu. Wyniki analizy fluorometrycznej aktywności enzymu GUS podano w tabeli 1. Podczas gdy aktywność GUS z większym skróceniem obszaru promotora od -1500 do -430 zarówno w roślinach badanych poddawanych działaniu ozonu jak i w roślinach kontrolnych nie poddawanych działaniu prowadzi do słabego spadku indukcji przez ozon (czynnik indukcji spada od ca. 12 (-1500) do ok. 10 (-430)), dodatkowa delecja obszaru promotora między -430 i -280 działa na drastyczne zmniejszenie ekspresji GUS u roślin badanych poddawanych działaniu ozonu. Podczas gdy rośliny, w których geny GUS są pod kontrolą promotora delecji 5'-430, wykazują 10-krotną indukcję przez ozon względem roślin kontrolnych, w roślinach, w których ekspresja genów GUS jest kontrolowana przez krótszy promotor delecji 5'-280, obserwuje się maksymalnie jedynie 2-krotną indukcję ekspresji GUS przez ozon. Zatem obszar promotora genów Vst1 z winogron obejmujący pary zasad -430 do -280 zawiera składniki cis-aktywne zasadnicze dla przejawianej indukowanej przez ozon ekspresji genów STS.
Wyniki te potwierdzono w komórkach roślin zawierających powyższe konstrukty i hodowanych w roślinnych hodowlach komórkowych.
Rysunki i tabele.
Rysunek 1:
Mapa restrykcyjna fuzji translacyjnej promotor Vstl/GUS w plazmidzie pUCVstl/GUS. Plazmid zawiera fuzję translacyjną promotora Vst1 z winogron z genem GUS z E. coli. Zaznaczono miejsca restrykcyjne wykorzystane dla klonowania mutantów delecji 5'. nos ter = sygnał zakończenia genu syntazy nopalinowej z Acrrobacterium tumefaciens.
Rysunek 2
Kinetyka kontrolowanej przez promotor Vst1 indukcji ekspresji GUS w transgrnicznych roślinach tytoniu F1 zawierających fuzję translacji genu GUS z pełnym promotorem Vst1 z winogron (p1500GUS), przez różne stężenia ozonu. Aktywności GUS oznaczono fluoro16
186 980 metrycznie w surowych ekstraktach liści tytoniu (Arkusz Nr. 4) wg: Jefferson (1987), supra. Na rysunku można zauważyć różne punkty czasowe zbiorów. Po 10-godz. działaniu ozonem nastąpiła 14-godz. postinkubacja roślin tytoniu w powietrzu pozbawionym szkodliwych składników. Rośliny kontrolne trzymano jedynie w powietrzu pozbawionym szkodliwych składników (bez gazowania ozonem), n = 3 lub 4; wartości średnie ± błąd standardowy; wszystkie testy przeprowadzono jako podwójne próby.
Tabela 1:
Aktywności GUS oznaczono fluorometrycznie w ekstraktach proteinowych liści o średnim wieku niezależnych transformant tytoniu poddanych (+) i nie poddanych (-) działaniu ozonu. Transgeniczne linie tytoniu zawierają różne delecje 5' promotora Vstl w fuzji z bakteryjnym genem-reporterem GUS. Transformanty F0 i rośliny F1 (11 tygodniowe) gazowano ozonem przez 10 h (100 nl/1 ozonu), a następnie przez 2 h postinkubowano w powietrzu pozbawionym szkodliwych składników Wartości średnie ± błąd standardowy; wszystkie analizy przeprowadzono jako podwójne próby.
Tabela 1
| Promotor Vst1 dele- | Badane niezależne | Aktywność enzymu GUS | Czynnik indukcji | |
| [pmol MU min-1 | mg-1 proteinyl | |||
| towany 5' do pozycji | transgeniczne linie tytoniu | |||
| + Ozon | - Ozon | |||
| -1500 | 1(F1) | 735 ± 100 | 63 ±7 | 11.7 |
| -740 | 2(F1) | 388 ±59 | 30 ±5 | 12.9 |
| -550 | 3(F0) | 126 ± 13 | 12 ± 3 | 10.5 |
| 2(F1) | 173 ±25 | 15 ± 3 | 11.5 | |
| -500 | 5(F0) | 148 ±52 | 15 ± 6 | 9.9 |
| -430 | 6(F0) | 141 ±38 | 14 ±4 | 10.0 |
| -280 | 6(F0) | 22 ±4 | 13 ± 3 | 1.7 |
| 2(F1) | 30 ±3 | 15 ± 3 | 2.0 | |
| -140 | 2(F0) | 12 ±0.2 | 8 ± 3 | 1.5 |
| 3(F1) | 24 ±3 | 15 ± 3 | 1.6 | |
| -40 | 3(F1) | 24 ±2 | 15 ± 3 | 1.6 |
| +70 | KF1) | 3.5 ± 1 | 3.5 ± 1 | 1.0 |
PROTOKÓŁ SEKWENCJI 1) DANE OGÓLNE:
(i) ZGŁASZAJĄCY:
(A) NAZWA: GSF - Forschungszentrum fuer Umwelt i Gesundheit GmbH (B) ULICA: Ingolstaedter Landstr. 1 (C) MIEJSCOWOŚĆ: Oberschleissheim (E) KRAJ: Niemcy (F) KOD POCZTOWY: 85764 (A) NAZWA: Bayer AG (B) ULICA: Bayerwerk (C) MIEJSCOWOŚĆ: Leverkusen (E) KRAJ: Niemcy (F) KOD POCZTOWY: 51368
186 980 (ii) OKREŚLENIE WYNALAZKU: Indukowana przez ozon ekspresja genów w roślinach (iii) LICZBA SEKWENCJI: 3 (iv) FORMA CZYTELNA PRZEZ KOMPUTER:
(A) NONK DANYCH : Dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM! OPEIACCYNYY: PC-DOSMSS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE : PaeenIln Reeaaee 1.0 , Version #1.30 EEPA)
2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
DŁUGOŚĆ: 161 pary zasad TYP: Nukleotyd NICIOWOŚĆ: podwójna nić TOPOLOGIA: liniowa (□) TYP CZĄSTECZKI: DNA genomowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 1:
ACTTTTCGAG CCCCTTGAAC TGGAAATTAA TACATTTTCC ACTTGACTTT - TGAAAAGGAG 60
GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAA CCTTCGTAAT GTTAATGAAA - TCAAAGTCAC 120
TCAATGTCCG AATTTCAAAC CTCANCAACC CAATAGCCAAT 161 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO: 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad
TYP: Nukleotyd NICIOWOŚĆ: pojedyncza nić TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: dalszy kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 2:
CCCCAAGCTT CCCCGGATCA CATTTCTATG AGT 33 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
DŁUGOŚĆ: 34 pary zasad
TYP: Nukleotyd NICIOWOŚĆ: pojedyncza nić TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: dalszy kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 3:
CGCGGATCCT CAATTGAAGC CATTGATCCT AGCT 34
186 980
186 980
Aktywność GUS [pmol MU min'1 mg*1 Proteiny?
A 100 nL L4 Oxonu Δ próbka kontrolna 200 nL L4 Οχοηι α próbka kontrolna • 400 nL L4 Οχοηι
O próbka kontrolna
Gazowanie ozonem
Czas [hj
Fig. 2
186 980
Sspl -1060 Hindll -930
Dral-740 Aflll .550
Haelll -500 SnaBI -430
BanII .280 Nsll -140
HindIII -1500 | Nhel -40
Promotor vsti
GUS nos ter
Fig. 1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.
Claims (13)
- Zastrzeżenia patentowe1. Izolowany kwas nukleinowy o sekwencji nukleotydowej zidentyfikowanej jako SEQ ID NO: 1.
- 2. Izolowany kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że przenosi indukowalną ozonem ekspresję genów.
- 3. Izolowany kwas nukleinowy według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jest częścią sekwencji promotora genu syntazy stilbenowej Vstl.
- 4. Izolowany kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że pochodzi z winogron (Vitis vinifera).
- 5. Sposób wytwarzania roślin transgenicznych o indukowalnej ozonem ekspresji, znamienny tym, że a) wprowadza się do komórki roślinnej cząsteczkę kwasu nukleinowego o sekwencji nukleotydowej zidentyfikowanej jako SEQ ID NO: 1, połączoną operacyjnie z jednym lub większą ilością genów, b) integruje się ewentualnie sekwencję kwasu nukleinowego z etapu a) w genomie komórki roślinnej; i c) ewentualnie regeneruje się rośliny transgeniczne lub inny materiał do rozmnażania z tych roślin.
- 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że dodatkowo stosuje się geny, które w naturze nie są indukowalne ozonem lub zasadniczo nie są indukowalne ozonem.
- 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stosuje się jeden lub więcej genów kodujących produkty genowe, które są zdolne do detoksykacji w roślinach lub komórkach roślinnych reaktywnych tlenowo gatunków.
- 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się dodatkowo geny kodujące katalazę i/lub dysmutazę ponadtlenkową.
- 9. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się ponadto jeden lub więcej genów reporterowych.
- 10. Transgeniczna komórka roślinna, znamienna tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego o sekwencji nukleotydowej zidentyfikowanej jako SEQ ID NO: 1.
- 11. Komórka roślinna według zastrz. 10, znamienna tym, że zawarta w niej sekwencja nukleotydowa przenosi indukowalną ozonem ekspresję genów.
- 12. Komórka roślinna według zastrz. 10 albo 11, znamienna tym, że zawarta w niej sekwencja nukleotydowa jest częścią sekwencji promotora genu syntazy stilbenowej Vst1.
- 13. Komórka roślinna według zastrz. 10, znamienna tym, że zawarta w niej sekwencja nukleotydowa pochodzi z winogron (Vitis vinifera).Niniejszy wynalazek dotyczy izolowanego kwasu nukleinowego, sposobu wytwarzania roślin transgenicznych o indukowanej ozonem ekspresji i transgenicznej komórki roślinnej.Stężenia ozonu w dolnej troposferze nad kontynentami północnej półkuli w ostatnim stuleciu stale wzrastały wskutek bardziej intensywnych działań przemysłu (Volz, Kley (1988) Nature 332, 240-242). W międzyczasie najwyższe stężenia ozonu osiągnęły od 100 nl/1 do 200 nl/1 w Europie i w Ameryce Płn. (Krupa i in., (1995) Environ. Pollut. 87, 119-126).Fitotoksyczność szkodliwego składnika w powietrzu - ozonu jest dobrze zbadana i udokumentowana; np. w: Heagle (1989) Annu. Rev. Phytopathol. 27, 397-423; Heath (1994) w: Alecher, Wellburn (red.) „Plant responses to the gaseous environment,s”. 121-145, Chapman & Hall, London. Zasadniczo wynikiem takiego obciążenia ozonem jest obniżona fotosynteza netto i zwiększone przedwczesne starzenie, którego wynikiem jest mniejszy wzrost roślin oraz niższe zbiory.186 980Chociaż ozon dzięki dyfuzji wnika przez otwory do komórek roślinnych, stężenie ozonu w przestrzeniach międzykomórkowych liścia jest prawie równe zeru, niezależnie od stężenia ozonu w otoczeniu (Laisk i in. (1989) Plant Physiol. 90, 1163-1167). Przyjmuje się obecnie, że ozon szybko reaguje ze składnikami ściany komórkowej oraz błony plazmatycznej i ulega przemianie w reaktywne ugrupowania tlenowe, takie jak aniony nadtlenków, grupy hydroksylowe i nadtlenek wodoru, które są wykrywane w materiale roślinnym po działaniu ozonu przy użyciu elektronowego rezonansu spinowego (Mehlhom i in. (1990) Physiologia Plantarum 79, 377-383). Tzw. „oxidative burst”, tzn. szybkie powstawanie stosunkowo dużych ilości reaktywnych ugrupowań tlenowych może przez zmianę przepuszczalności błony plazmatycznej, inaktywację protein wrażliwych na reakcje utleniania i redukcji i zwiększone utlenianie lipidów prowadzić do drastycznego zakłócenia normalnego funkcjonowania komórki.Ostatnie badania wskazują, że w roślinach, na które działał ozon zachodzi zwiększona biosynteza niespecyficznych enzymów obronnych, których zadanie polega na ochronie żywych komórek przed uszkodzeniem przez stres utleniający. (Kangasjarvi i in. (1994) Plant, Celi and Environment 17, 783-794). Pomimo to nie jest do dziś zrozumiały łańcuch transdukcji sygnałów odpowiedzialny za aktywowanie genów indukowane przez ozon, który jest nośnikiem odpowiedniej informacji o tworzeniu apoplastycznych reaktywnych ugrupowań tlenowych w jądrze komórkowym. Obecnie dyskutuje się nad rolą różnych czynników, takich jak gradient stężenia wapnia w cytosolu (Price i in. (1994) The Plant Celi 6, 1301-1310), tworzenie kwasu salicylowego (Klessig i Malamy (1994) Plant Mol. Biol. 26, 1439-1458), fitohormonów kwasu jasmonowego (Farmer (1994) Plant Mol. Biol. 26, 1423-1437) i etylenu (Ecker (1995) Science 268, 667-674), jako możliwych połączeń sygnałowych wywołanych przez stres utleniający, które zasadniczo uczestniczą w roślinnych reakcjach obronnych.W badaniach roślin tytoniu, na które podziałano ozonem, można było wykazać, że ozon powoduje wzmocnioną ekspresję różnych genów odpornych na choroby, mianowicie pewnych protein PR (Pathogenesis-rełated tzn. związanych z patogenezą) (Ernst i in. (1992) Plant Mol. Biol. 20, 673-682; Ernst i in. (1996) J. Plant Physiol. 148, 215-221; Eckey-Raltenbach i in. (1994) Plant Physiol. 104, 67- 74). Wyniki te wykazują, że wywołany przez ozon stres oksydacyjny w podobny sposób wpływa na ekspresję i regulację roślinnych genów obronnych jak opisano dla przypadku ataku patogenów. Obecnie dostępna jest ograniczona ilość informacji dotyczących elementów ęis-regulacji i czynników transkrypcji, uczestniczących przypuszczalnie w kontroli ekspresji niespecyficznych genów obronnych jako odpowiedzi na różne wpływy środowiska (Lee i in. (1994) Eur. J. Biochem. 226, 109-114). Jednak dotychczasowe wyniki pozwalają na przypuszczenia, że w przypadku genów kodujących proteiny PR istnieją oddzielne lub co najmniej jedynie częściowo nakładające się drogi transdukcji sygnałów (Somssich (1994) w; Nover (red.) „Plant promoters and transcription factors”, s.163-179, Springer-Verlag, Berlin; Dolferus i in. (1994) Plant Physiol. 105, 1075-1087).Co się tyczy aktywności syntazy stilbenowej (STS) uczestniczącej w syntezie fitoaleksynowej wiadomo również, że, w dorosłych roślinach jest ona indukowana przez czynniki stresu środowiska, jak np. atak patogenu (Langcake (1981) Physiol. Plant Pathol. 18, 213226), promieniowanie UV (Fritzemeier i Rindl (1981) Planta 151, 48-52) i ozon (Rosemann i in. (1991) Plant Physiol. 97, 1280-1286). Natomiast u zarodków zaobserwowano konstytutywny wzorzec ekspresji (Sparvoli i in. (1994) Plant Mol. Biol. 24, 743-755).Enzymy syntazy stilbenowej katalizują syntezę stilbenów, takich jak resweratrol oraz pinosylwin z cząsteczki p-kumaroilo-CoA względnie cinnamoilo-CoA i trzech jednostek malonylo-CoA. Zarówno resweratrol jak i pinosylwin mają właściwości fitoaleksynowe oraz aktywność przeciwgrzybiczą i jako fitoaleksiny wraz z innymi stilbenami pochodzącymi z przemiany materii fenylopropanu pełnią ważną funkcję w obronie przed czynnikami chorobowymi (Hart (1981) Annu. Rev. Phytopathol. 19, 437-458).Geny STS występują w pewnych wzajemnie nie związanych gatunkach roślin, takich jak np. orzech ziemny (Schróder i in. (1988) Eur. J. Biochem. 172, 161-169), winogrona (Hain i in. (1993) Naturę 361, 153-156) i sosna (Fliegmann i in. (1992) Plant Mol. Biol. 18, 489-503), i są zorganizowane w większych rodzinach genów, składających się z sześciu lub więcej genów (Lanz i in. (1990) Planta 181, 169-175; Wiese i in. (1994) Plant Mol. Biol. 26,667-677).186 980Eksperymenty z transgenicznymi komórkami tytoniu wskazały, że ekspresja syntazy stilbenowej jest regulowana głównie na poziomie transkrypcji i łańcuch transdukcji sygnału został u różnych gatunków roślin zachowany w czasie ewolucji (Hain i in. (1990) Plant Mol. Biol. 15,325-335).Geny STS z orzecha ziemnego (Arachis hypogaea) i winogron (Vitis vinifera) już wyizolowano (Schróder i in. (1988) supra) względnie Hain i in. (1993) supra) i doprowadzono u roślin transgenicznych do ekspresji (Hain i in. (1990) supra względnie Hain i in. (1993) supra).W przypadku syntazy stilbenowej sekwencje kodujące DNA są np. znane z Europejskiego Opisu Patentowego EP 0 309 862, Niemieckiego Zgłoszenia Patentowego DE-A-41 07 396, Europejskiego Zgłoszenia Patentowego 0 464 461 oraz Opisu Patentowego USA 5 500 367. W dokumentach tych opisano wyizolowanie genów syntazy stilbenowej i ich zastosowanie do wytwarzania roślin transgenicznych. Uzyskane rośliny transgeniczne wykazują zwiększoną odporność względem różnych szkodników roślinnych, takich jak grzyby, bakterie, owady, wirusy i nicienie. Plazmidy zawierające geny STS złożono w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) (Niemiecki Zbiór Mikroorganizmów). Maacheroder Weg 1H, D-38124 Braunschweig, tak np. również gen Vstl z winogron w plazmidzie pVst1 pod numerem złożenia DSM 6002 (DE-A-41 07 396, EP-A-0 464 461, Patent USA 5500367).Podczas gdy w międzyczasie opisano zastosowanie sekwencji kodujących STS do wytwarzania roślin sterylnie męskich i zmienionej barwy kwiatów (Niemieckie Zgłoszenie Patentowe DE-A-44 40 200), do dziś nie zbadano w pełni możliwego związku między ekspresją genów STS i indukcją przez ozon.Istnieją różne przesłanki wskazujące na to, że dla możliwie skutecznej odporności na chorobę w oparciu o ekspresję genów STS w roślinach transgenicznych jest korzystne, gdy ekspresja heterologicznego STS (względnie heterologicznych genów STS) w roślinie jest najpierw stymulowana przez atakujący patogen tzn. przez oddziaływanie rośliny i czynnika chorobotwórczego (Fischer i Hain (1994) Current Opinion in Biotechnology 5, 125-130; Fischer (1994) w „Optimierung der heterologen Expression von Stilbensynthasegenen fur den Pflanzenschutz” (Optymalizacja heterologicznej ekspresji genów syntazy stilbenowej w ochronie roślin), Universitat Hohenheim). Na rzecz tego przemawia zwłaszcza obserwacja, że wywołana przez patogen ekspresja genów STS jest ograniczona lokalnie do miejsca infekcji i jest przejściowa, tzn. ekspresja STS stosunkowo szybko wzrasta do maksimum i znów obniża się w ciągu mniej niż 48 h (Hain i in. (1993) supra). Również badania przy użyciu transgenicznych roślin tytoniu, w których geny STS doprowadzono do ekspresji przy konstytutywnym promotorze 35S RNA z wirusa mozaiki kalafiorowej, tak że uzyskana w tych roślinach odporność na choroby jest mniejsza niż w roślinach, które te same geny poddawały ekspresji pod kontrolą indukowanego przez patogen homologicznego promotora STS po ataku grzyba (Fischer i Hain (1994) supra; Fischer (1994) supra). W każdym przypadku jest pożądane, by ekspresja STS w transgenicznych roślinach (uprawnych), wykazujących wskutek wprowadzonych genów STS zwiększoną odporność na choroby, była aktywowana i kontrolowana sama (i dopiero) przez atak patogenów, a nie dodatkowo (względnie już przedtem) przez niepożądane czynniki stresu środowiska, takie jak ozon.Zatem ważnym celem biotechnologicznego badania roślin, jest zrealizowanie bardziej specyficznej ekspresji roślinnych genów obronnych w roślinach, aby w ten sposób sprawić, by strategie biologii molekularnej odnoszące się do wytwarzania roślin o większej odporności były kontrolowalne i skuteczne. Ważnym aspektem jest wyłączenie niepożądanych niespecyficznych bodźców środowiska, jak np. indukcja określonych genów obronnych przez ozon, promieniowanie UV, metale ciężkie, skrajne temperatury i inne bodźce abiotyczne.Zatem ważnym celem niniejszego wynalazku, jest dostarczenie nowych sekwencji DNA, bezpośrednio indukowanej przez ozon ekspresji genów odporności.Dalszy cel wynalazku polega na tym, by pokazać możliwości eliminacji indukcji przez ozon, tzn. wyłączenia niepożądanej stymulacji ekspresji genów przez ozon.Dalszym ważnym celem wynalazku, jest dostarczenie sekwencji DNA, z pomocą której gen syntazy stilbenowej dopiero po kontakcie rośliny z patogenem, a nie przez stymulację ozonem w roślinach transgenicznych może być doprowadzony do ekspresji.186 980Jak już wspomniano na wstępie, obserwuje się stały wzrost obciążenia ozonem, który wywiera także drastyczny wpływ na wegetację. Obserwacja i oznaczenie stężeń ozonu w powietrzu jeszcze dziś stanowi punkt ciężkości chemicznych, fizycznych i biologicznych badań środowiska. W związku z tym ważny instrument stanowią tzw. biomonitory, z których pomocą można łatwo jakościowo i ilościowo oznaczyć obciążenie ozonem i jego następstwa, zwłaszcza efekty fitotoksyczne.Zgodnie z powyższym, dalszy cel wynalazku polega na dostarczeniu sekwencji DNA, które można zastosować celowo do wytwarzania promotorów indukowanych przez ozon. Przy pomocy takich promotorów tzw geny-reportery, których ekspresję można udowodnić za pomocą prostych testów enzymatycznych i które są dobrze znane w badaniach biotechnologicznych, mogą w bardzo prosty i niezawodny sposób znaleźć zastosowanie jako biomonitory.Dalszym celem wynalazku jest dostarczenie systemu, przy pomocy którego można „włączyć” pewne geny, których produkty genowe są zdolne do unieszkodliwienia reaktywnych ugrupowań tlenowych w komórkach, a zatem w razie potrzeby także przy dużym obciążeniu ozonem. Ściśle mówiąc, przez dostarczenie sekwencji DNA, odpowiedzialnych za regulację genów reagujących na ozon, powinna być możliwa indukowana przez ozon ekspresja takich genów, jak np. genów katalazy i/lub dysmutazy nadtlenkowej. Zatem celem wynalazku jest dostarczenie sekwencji DNA, które mogą być użyte do wytwarzania indukowanego przez ozon komórkowego „systemu ochrony przed ozonem”.Nieoczekiwanie stwierdzono, że określona roślinna sekwencja kwasu nukleinowego bezpośrednio uczestniczy w reagującej na ozon ekspresji STS. Podczas gdy eksperymenty z transgenicznymi zarodkami i roślinami tytoniowymi, które zwykły gen reporter uidA z E. coli, kodujący β-glukuronidazę, ekspresjonuje pod kontrolą różnych długich delecji 5' promotora Vstl z winogron, wskazują na to, że przynajmniej niektóre odpowiedzialne za indukcję grzybów elementy cis leżą w obszarze promotora, obejmującego pary zasad -140 do -280 (licząc od początku transkrypcji) (Fischer (1994) supra). obszar sekwencji Vst1 obejmujący pary zasad -280 do -430 jest zasadniczy dla silnego aktywowania ekspresji genu przez ozon. W oparciu o nasze eksperymenty można było wykazać, że promotor Vst1, zawierający pary zasad tylko do -280 włącznie (i w którym zatem brakuje dalszych sekwencji promotora Vst1 leżących „w górę”) nie jest indukowany przez ozon. Jak wspomniano wyżej, ten skrócony promotor pomimo to może pośredniczyć w indukowanej przez patogen ekspresji genów kontrolowanej przez niego sekwencji kodującej (patrz Fischer (1994) supra).Nasze analizy pozwalają na ponadto na dociekanie związku między działaniem na rośliny ozonem i zwiększoną biosyntezą względnie uwolnieniem etylenu w komórkach roślinnych. Zatem nie można wykluczyć współdziałania elementów reagujących na etylen przy indukowanej przez ozon ekspresji genów. Zgodnie z tym nie można wykluczyć przy uwzględnieniu znanych elementów cis, omawianych w związku reakcją na etylen (Seesa i in. (1995) Plant Mol. Biol. 28, 145-153; Shinshi i in. (1995) Plant Mol. Biol. 27, 923-932), udziału obszaru sekwencji promotora Vst1, obejmującego pary zasad -283 do -273, w indukowanej przez ozon ekspresji genu STS.Zatem opisany tu po raz pierwszy reagujący na ozon obszar sekwencji DNA obejmuje pary zasad -270 do -430 promotora Vst1 z winogron.Niniejszy wynalazek dotyczy izolowanego kwas nukleinowy o sekwencji nukleotydowej zidentyfikowanej jako SEQ ID NO: 1. sekwencja ta: ACTTTTCGAG CCCCTTGAAC TGGAAATTAA TACATTTTCC ACTTGACTTT TGAAAAGGAG GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAA CCTTCGTAAT GTTAATGAAA TCAAAGTCAC TCAATGTCCG AATTTCAAAC CTCANCAACC CAATAGCCAA T, jest zasadnicza dla indukowanej przez ozon ekspresji genów w roślinach.W korzystnym wykonaniu, izolowany kwas nukleinowy przenosi indukowalną ozonem ekspresję genów.Korzystnie izolowany kwas nukleinowy jest częścią sekwencji promotora genu syntazy stilbenowej Vst1.Korzystnie izolowany kwas nukleinowy według wynalazku pochodzi z winogron (Vitis vinifera).186 980
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19625330 | 1996-06-25 | ||
| DE19625347 | 1996-06-25 | ||
| DE19635569 | 1996-09-02 | ||
| DE19654574A DE19654574A1 (de) | 1996-06-25 | 1996-12-27 | Ozon-Induzierte Genexpression in Pflanzen |
| PCT/EP1997/003187 WO1997049823A1 (de) | 1996-06-25 | 1997-06-18 | Ozon-induzierte genexpression in pflanzen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL330405A1 PL330405A1 (en) | 1999-05-10 |
| PL186980B1 true PL186980B1 (pl) | 2004-04-30 |
Family
ID=27438391
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL97330405A PL186980B1 (pl) | 1996-06-25 | 1997-06-18 | Izolowany kwas nukleinowy, sposób wytwarzania roślin transgenicznych o indukowalnej ozonem ekspresji genów i transgeniczna komórka roślinna |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6740749B1 (pl) |
| EP (1) | EP0910651A1 (pl) |
| JP (1) | JP2000512503A (pl) |
| KR (1) | KR20000022215A (pl) |
| CN (1) | CN1235640A (pl) |
| AU (1) | AU728545B2 (pl) |
| BR (1) | BR9709971A (pl) |
| CA (1) | CA2257832A1 (pl) |
| DE (1) | DE19780592D2 (pl) |
| IL (1) | IL127123A0 (pl) |
| NZ (1) | NZ332928A (pl) |
| PL (1) | PL186980B1 (pl) |
| WO (1) | WO1997049823A1 (pl) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999045129A1 (en) * | 1998-03-06 | 1999-09-10 | Mogen International N.V. | Method for the induction of pathogen resistance in plants |
| KR100893144B1 (ko) * | 2007-06-20 | 2009-04-16 | 한국생명공학연구원 | 감자 유래의 스트레스에 의해 유도되어지는 ＳｔＧＲＸ２유전자 |
| WO2011074959A1 (en) | 2009-12-15 | 2011-06-23 | Edwin Henricus Antonius Holman | Transgenic ozone-resistant plants |
| KR101451834B1 (ko) | 2013-05-14 | 2014-10-16 | 한국원자력연구원 | 이온화에너지원 표지 유전자 OsUNP2 및 이를 이용한 형질전환 지표식물 |
| CN116161626B (zh) * | 2021-11-24 | 2025-06-17 | 北京科胜美科技有限公司 | 用于超氧水生成装置的储液罐以及超氧水生成装置 |
| CN116406590B (zh) * | 2023-03-31 | 2023-12-22 | 东北农业大学 | 一种利用片段化番茄esDNA提高番茄植株抗性、防治灰霉病的方法及应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US750386A (en) * | 1904-01-26 | Jacob neinens and hubert iojeinbielen | ||
| CA2112999C (en) * | 1991-10-04 | 2007-04-24 | Mark A. Conkling | Pathogen-resistant transgenic plants |
| DE4234131C2 (de) * | 1992-10-09 | 1995-08-24 | Max Planck Gesellschaft | Transgener pathogen-resistenter Organismus |
| AU4438499A (en) * | 1998-06-12 | 1999-12-30 | Pennsylvania State University, The | Expression control elements from genes encoding starch branching enzymes |
-
1997
- 1997-06-18 AU AU32607/97A patent/AU728545B2/en not_active Ceased
- 1997-06-18 WO PCT/EP1997/003187 patent/WO1997049823A1/de not_active Ceased
- 1997-06-18 CN CN97195837A patent/CN1235640A/zh active Pending
- 1997-06-18 BR BR9709971A patent/BR9709971A/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-06-18 IL IL12712397A patent/IL127123A0/xx unknown
- 1997-06-18 CA CA002257832A patent/CA2257832A1/en not_active Abandoned
- 1997-06-18 EP EP97928238A patent/EP0910651A1/de not_active Withdrawn
- 1997-06-18 NZ NZ332928A patent/NZ332928A/xx unknown
- 1997-06-18 US US09/202,634 patent/US6740749B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-06-18 PL PL97330405A patent/PL186980B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-06-18 JP JP10502280A patent/JP2000512503A/ja not_active Ceased
- 1997-06-18 DE DE19780592T patent/DE19780592D2/de not_active Ceased
- 1997-06-18 KR KR1019980710635A patent/KR20000022215A/ko not_active Ceased
-
2004
- 2004-01-08 US US10/754,846 patent/US20050071899A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ332928A (en) | 2000-01-28 |
| AU3260797A (en) | 1998-01-14 |
| IL127123A0 (en) | 1999-09-22 |
| DE19780592D2 (de) | 1999-09-23 |
| EP0910651A1 (de) | 1999-04-28 |
| US20050071899A1 (en) | 2005-03-31 |
| WO1997049823A1 (de) | 1997-12-31 |
| CN1235640A (zh) | 1999-11-17 |
| AU728545B2 (en) | 2001-01-11 |
| CA2257832A1 (en) | 1997-12-31 |
| KR20000022215A (ko) | 2000-04-25 |
| BR9709971A (pt) | 1999-08-10 |
| PL330405A1 (en) | 1999-05-10 |
| US6740749B1 (en) | 2004-05-25 |
| JP2000512503A (ja) | 2000-09-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20140173781A1 (en) | Methods and compositions for producing and selecting transgenic wheat plants | |
| US7138273B2 (en) | Method of identifying non-host plant disease resistance genes | |
| EP2465933A2 (en) | Disease-inducible promoters | |
| US20140041073A1 (en) | Trait improvement in plants expressing myb-related proteins | |
| US20170275644A1 (en) | Plants with enhanced tolerance to multiple abiotic stresses | |
| US20140366219A1 (en) | Increasing Soybean Defense Against Pests | |
| US20140137277A1 (en) | Trait improvement in plants expressing ap2 proteins | |
| WO2023073383A1 (en) | Error prone dna polymerase for organelle mutation | |
| US8962916B2 (en) | Viral promoter, truncations thereof, and methods of use | |
| PL186980B1 (pl) | Izolowany kwas nukleinowy, sposób wytwarzania roślin transgenicznych o indukowalnej ozonem ekspresji genów i transgeniczna komórka roślinna | |
| WO2014004983A1 (en) | Inducible plant promoters and the use thereof | |
| US20140123331A1 (en) | Trait improvement in plants expressing ap2 proteins ii | |
| WO2002006490A1 (en) | Lipoxygenase genes, promoters, transit peptides and proteins thereof | |
| WO2020030783A2 (en) | Means and methods for drought tolerance in crops | |
| US7230159B2 (en) | Isolated BOS1 gene promoters from arabidopsis and uses thereof | |
| US20120167250A1 (en) | Viral promoter, truncations thereof, and methods of use | |
| WO2000078944A1 (en) | Methods to design and identify new plant resistance genes | |
| AU2013381386A1 (en) | Methods and compositions for producing and selecting transgenic plants | |
| DE19654574A1 (de) | Ozon-Induzierte Genexpression in Pflanzen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20050618 |