KR20000022215A

KR20000022215A - 식물의 오존유도 유전자 발현

Info

Publication number: KR20000022215A
Application number: KR1019980710635A
Authority: KR
Inventors: 로란트 슈베르트; 하인리히 산더만; 디트리히 에른스트; 뤼디거 하인; 레기나 피셔
Original assignee: 바이에르 아게; 메나케 게오르크; 게에스에프 포르슝스젠트룸 퓌르 움벨트 운트 게준드하이트게엠베하
Priority date: 1996-06-25
Filing date: 1997-06-18
Publication date: 2000-04-25
Also published as: PL186980B1; BR9709971A; WO1997049823A1; AU3260797A; AU728545B2; JP2000512503A; EP0910651A1; US6740749B1; US20050071899A1; PL330405A1; CA2257832A1; CN1235640A; DE19780592D2; NZ332928A; IL127123A0

Abstract

본 발명은 새로운 DNA 서열, 오존유도 후에 발현된 그의 코딩서열을 포함하는 DNA 서열, 새로운 식물을 생산하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 새로운 식물 및 식물 및 식물세포의 오존반응성 유전자 발현을 생성하기 위한 DNA 서열의 용도에 관한 것이다. 더욱이, 새로운 프로모터, 그의 오존 반응성능을 제거함으로서 증가되는 그의 특이성에 관한 것이다.

Description

식물의 오존유도 유전자 발현

본 발명은 새로운 DNA서열, 새로운 DNA서열을 함유하는 새로운 식물을 생산하는 방법, 오존유도 후에 발현된 그의 암호화서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 새로운 식물과 식물 및 식물 세포에서의 오존반응 유전자 발현을 일으키는 DNA서열의 사용에 관한 것이다. 더욱이, 새로운 프로모터, 그의 오존반응성 제거에 의해 증가하는 특성에 관한 것이다.

북반구 대륙 위의 더 낮의 대류권에서 오존 농도는 산업발전(볼츠 및 크레이(1988)Nature 332,240-242)의 결과로 과거 100년 전보다도 증가하고 있다. 오존값은 유럽 및 북아메리카에서 100nL/L까지의 간헐적인 피크 농도에 도달한다(쿠루파 등(1995) Environ. Pollut.87, 119-126).

공기 오염물질 오존의 식물에 해로운 독성이 예를 들면, Heagle(1989)Annu.Rev. Phytopathol.27, 397-423; Heath(1994): 런던의 Alscher,Wellburn(ed)"가스 환경에 대한 식물 반응", pp.121-145, Chapman & Hall,에서 테스트 및 기록되었다. 감소된 최종 광합성 및 증가된 빠른 노화가 식물 성장을 줄이고 수확량을 줄이는 결과를 가져오는 것이 오존효과의 일반적인 결과이다.

오존이 확산으로 열린 기공을 통해 식물세포를 투과하더라도, 잎의 세포내 공간의 오존 농도는 주위의 오존 농도에 상관 없이 거의 0이다(Lai나 et al.(1989) Plant Physiol. 90, 1163-1167). 오존은 세포벽과 플라즈마렘마의 성분과 빠르게 반응하고, 전자스핀공명분광기(Mehlhorn et al. (1990) Physiologia Plantarum 79, 377-383)를 사용하여 오존 처리된 식물 재료에서 검출된 과산화음이온, 히드록시 라디칼 및 과산화수소 등의 반응성 산소종으로 전환한다. 소위 "산화성 파열", 즉, 반응산소 종의 비교적 많은 양의 빠른 개선이 세포막의 투과성의 변화로 보통 세포작용의 극적인 장애가 일어날 수 있다.

오존 처리된 식물에서 이루어진 최근의 실험은 비특이적, 방어적인 효소의 증가된 생합성, 산화적 압력으로 인한 손상에 대해 살아있는 세포를 보호하기 위한 작용을 나타낸다(Kangasjarvi et al.(1994 Plant, Cell and Environment 17, 783-794)). 오존유도 유전자 활성에 대한 책임이 있는 신호변화 사슬이 프로플라스틱 형성에 관한 관련 정보를 세포 중심으로 전달하더라도, 반응산소종이 이제까지 이해되지 않고 있다. 시토졸에서의 칼슘 농도 증가(Price et al.(1994) The Plant Cell 6, 1301-1310), 시알산의 정보(Klessing and Malamy(1994) Plant Mol. Biol. 26, 1439-1458) 및 파이토호르몬자스몬산(Farmer(1994) Plant Mol. Bio. 26, 1423-1437) 및 에틸렌(Ecker(1995) Science 268, 667-674) 등의 다양한 인자들이 일반적으로 가능한 신호연결로서 논의되고 있고, 식물의 방어 반응의 부분을 일반적으로 작동시키는 산소의 압력에 의해 일어난다.

오존의 영향을 받은 담배 식물로 처리한 실험은 오존이 다양한 질병 저항성 유전자, 즉, 몇몇 PR-(발병관련)단백질(Ernst et al.(1992) Plant Mol. Biol. 20, 673-682; Ernst et al. (1996) J. Plant Physiol. 148, 215-221; Eckey-Kaltenbach et al. (1994) Plant Physiol. 104, 67-74)의 증가된 발현을 야기시키는 것을 나타낸다. 이들 결과는 오존에 의해 일어난 산소의 압력이 병원성 공격에 관해 설명한 것과 유사한 방법의 식물 방어 유전자의 발현 및 조절에 영향을 미친다는 것을 가리킨다. 다양한 환경의 영향에 대한 반응으로서 비특이적 방어 유전자의 유전자 발현을 조절하는 부분을 가능하게 작동시키는 cis-조절인자 및 전사인자의 매우 한정된 정보만이 현재 사용가능하다(Lee et al.(1994) Eur. J. Biochem. 226, 109-114). 그러나, 앞의 결과에 기초해서, PR-단백질에 대한 유전자 암호화에 대해서 분리 또는 신호 전달의 적어도 부분적으로만 중첩(overlapping)하는 방법이 존재한다는 것을 가정할 수 있다(Somssich (1994) in: Nover(ed) "Plant promoters and transcription factors", pp. 163-179, Springer Publishing House, Berlin; Dolferus et al. (1994) Plant Physiol. 105, 1075-1087).

스틸벤합성효소(stilbene synthase, STS)의 활성에 관해서, 피토알렉신 합성에 기여하고, 예를 들면, 병원성 공격(Langcake(1981) Physiol. Plant Pathol. 18, 213-226), 자외선광(Fritzemeier and Kindl (1981) Planta 151, 48-52) 및 오존(Rosemann et al. (1991) Plant Physiol. 97, 1280-1286) 등의 환경 압력 인자에 의해 성장한 식물에서 유도된다는 것이 알려져 있다. 이 구조의 발현 패턴과 반대되는 것이 배(embryo)에서 관찰된다(Sparvoli et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24, 743-755).

스틸벤합성효소 효소는 한 분자의 p-쿠마로일-CoA 또는 시나모일-CoA 및 세 단위의 말로닐-CoA로부터 레스베라트롤 또는 피노실빈 등의 스틸벤 합성을 촉매한다. 피노실빈 뿐 아니라 레스베라트롤도 포토알렉신 특성 및 항진균 활성을 가지고, 페닐프로판 대사로부터 유래된 또 다른 스틸벤과 결합한 피토알렉신으로서, 병원성 유전자(Hart(1981) Annu. Rev. Phytopathol. 19, 437-458)에 대한 방어의 중요한 작용을 수행한다.

STS 유전자는 땅콩(Schroder et al. (1988) Eur. J. Biochem. 172, 161-169), 포도덩굴(Hain et al. (1993) Nature 361, 153-156) 및 사과(Fliegmann et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18, 489-503) 등의 일부 무관한 식물종에서 발견되었고, 여섯 개 이상의 유전자를 포함하는 큰 유전자 단위를 조직한다(Lanz et al. (1990) Planta 181, 169-175; Wiese et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26, 667-677).

전이유전자의 담배 식물의 실험은 스틸벤합성효소의 발현이 전사 단계에서 주로 조절되고, 압력 유도된 신호전달 사슬이 진화 동안 다양한 식물 종에서 보호되었다는 것을 나타낸다(Hain et al.(1990) Plant Mol. Biol. 15, 325-335).

땅콩(Arachis Hypogaea) 및 포도덩굴(Vitis vinifera)로부터의 STS는 이미 단리되었고(Schroder et al.(1988) supra or Hain et al.(1993 supra)), 전이유전자 식물에서 발현되었다(Hain et al.(1990) supra or Hain et al.(1993) supra).

스틸벤합성효소에 대해 암호화하는 DNA서열은 미국특허5,500,367 뿐 아니라 유럽특허 EP0 309 862, 독일특허DE-A-41 07 396, 유럽특허출원 0 464 461에 나타난다. 이들은 스틸벤합성효소 유전자의 단리 및 전이유전자 식물을 생산하기 위한 용도를 기재하고 있다. 결과로 얻은 전이유전자 식물은 진균류, 박테리아, 곤충, 바이러스 및 선충류 등의 다양한 식물페스트에 대한 더 큰 저항성을 나타낸다. STS 유전자를 함유하는 플라스미드는 독일콜렉션의 거대조직(DSM), 마쉐로더벡1B, D-38124 브룬쉬바이히에 맡겨졌다. 또한, 기탁에 포함되는 것은 기탁번호 DSM6002(DE-A-41 07 396, EP-A-0 464 461, 미국특허 5,500,367) 하의 pVstl플라스미드의 포도덩굴로부터의 Vstl유전자이다.

그 사이 STS암호화 서열을 사용하여 웅성을 생성할 때, 중성식물 및 변종된 꽃 색깔이 기재되어 있고(독일특허출원 DE-A-44 40 200), STS 유전자 발현과 오존 유도 사이의 가능한 관계가 아직까지는 완전하게 밝혀지지 않고 있다.

그 동안 가능한한 효과적인 병에 대한 저항성을 생성시키기 위한 전이 유전자 식물의 STS 유존자발현에 기초한 다양한 지적은 식물의 헤테로로고스(heterologous) STS유전자(또는 헤테로로고스 STS 유전자류)발현이 병원체를 공격함으로서 자극받고, 즉, 식물과 병원체의 상호 작용에 의해 자극받게 되는 장점이 있다(Fisher and Hain (1994) Current Opinion in Biotechnology 5,125-130; Fischer(1994) "식물 보호에 대한 스틸벤합성효소 유전자 이성질구조 발현의 활용" 호헨하임대학). 이것은 병원체유도 STS유전자발현이 감염 위치에서 국부적으로 제한되고 일시적인 성질이라는 관찰에 의해서 특히 뒷받침되고, STS유전자는 48시간 이내에 최고점까지 비교적 빠르게 증가하고 다시 감소한다(하인 등(1993) supra). 또한, 전이유전자의 담배식물에서 행한 실험 역시, STS 유전자는 콜리플라워 보자이크 바이러스의 35S프로모터 구성 하에서 발현하게 되고, 균 감염 후의 병원체 유도성 상동의 STS 프로모터의 조절 하의 동일한 유전자를 발현하는 식물보다 낮은 상기 식물에 생기는 병에 대한 저항성을 보이게 된다(Fischer and Hain(1994) supra; Fischer(1994) supra). STS유전자 삽입으로 재배한 식물의 전이 유전자의 STS 발현이 병에 대한 더 큰 저항성을 보이고, 병원체의 공격에 의해 단독으로 조절되고 활성을 가지고, 오존 등의 원하지 않는 환경 스트레스 인자를 부가하지는 않는 것이 바람직하다.

그러므로, 효과적이고 조절 가능한 방법으로 더 큰 저항성의 식물 생성을 위해 분자생물학적 방법을 구체화하기 위해서 식물의 방어적인 유전자의 더욱 특별한 발현을 실현하여 식물보호의 생물학적 조사의 중요한 일이다. 그러한 작업의 중용한 관점은 원하지 않는, 비특이적 환경 자극, 예를 들면, 오존, 자와선, 중금속, 극도의 온도 및 그 밖의 비생물적인 자극을 통한 방어 유전자의 유도을 제거하는 것이다.

그러나, 저항 유전자의 오존유도된 발현의 직접적인 부분을 보이는 사용 가능한 새로운 DNA서열을 생성하는 것이 본 발명의 중요한 목적이다.

본 발명의 또 다른 목적은 오존 유도을 제거하기 위한 가능성, 즉, 오존을 통한 유전자 발현의 바람직하지 않은 자극을 제거하는 가능성을 나타내는 것이다.

더욱이, 본 발명의 중요한 목적은 스틸벤합성효소 유전자가 병원체를 가지는 식물의 접촉 및 오존자극을 통하지 않은 후에만 전이 유전자 식물에서 발현될 수 있다는 것의 도움으로 DNA서열을 제공하는 것이다.

처음에 이미 언급한 바와 같이, 오존 영향의 서서히 증가함이 초목의 큰 효과를 가지는 것을 관찰되어진다. 공기에서의 오존 농도의 관찰 및 결정은 화학, 물리학 생물학적, 환경 조사의 관점에서 구성된다. 이 배경의 중요한 방법은 오존 영향 및 그의 중요성, 특히 식물성독소의 효과가 질적 및 양적으로 쉽게 결정될 수 있다고 하는 치료로, 소위 바이오모니터라고 한다.

그러나, 본 발명의 더욱 큰 목적은 표적으로 된 오존유도성 프로모터를 생성하기에 사용할 수 있는 DNA서열을 제공하는 것이다. 소위 리포터 유전자에 대한 가능성이 있는 그러한 프로포터 유전자의 도움으로, 간단한 효소적인 실험에 의해 시험될 수 있고, 생물학적인 조사로 잘 알려진 발현이 바이오모니터로서 사용되어진다.

본 발명의 또 다른 목적은 유전자 생성물이 세포 산소종의 돗소를 제거할 수 있는 일부 유전자가 이를테면 큰 오존 영향의 경우에 있어서 시작할 수 있다고 하는 도움을 가지는 시스템을 제공하는 것이다. 환언하면, DNA서열을 제공하는 것에 의해 오존반응성 유전자 조절에 대응하는 예를 들면, 촉매효소 및/또는 과산화물디스뮤타아제효소 유전자 등의 상기 유전자의 오존유도성 발현이 가능하게 된다. 그러므로, 본 발명의 목적은 세포 내 "오존 보호시스템"의 오존유도성을 생성하기 위해 사용될 수 있는 사용 가능한 DNA서열을 만드는 것이다. 본 발명의 더욱 큰 목적은 후술하는 바에 의해 명백해 진다.

이들 문제점은 식물의 오존 유도된 유전자 발현을 직접 포함한 본 발명에 따라서 구체적으로 DNA서열의 분할에 기초해서 독립항의 목적물로서 해결되어진다.

식물 핵산서열이 직접적으로 오존반응성 STS발현을 포함한다는 놀라운 사실을 발견했다. 포도덩굴로부터 Vstl-프로모터의 다양하게 긴 5'삭제 조절 하에서 β-글루쿠로니다아제에 대한 암화화한 E.coli로부터의 리포터 유전자uidA를 발현하는 전이유전자 담배 배낭 및 식물을 가지고 한 실험은 균유도에 대해서 반응성이 있는 적어도 몇몇의 cis원소가 염기 쌍 140 내지 280(전사시작으로부터 계산)(Fischer(1994)supra)로 이루어지는 프로모터의 범위, 염기 쌍 280 내지 430으로 이루어진 Vstl서열 범위 이내인 것을 나타내고, 오존을 통해 유전자 발현의 강한활성에 대해서 필수적이다. 이 실험에 기초해서, 단지 염기쌍까지 남아있는 Vstl프로모터 및 280을 포함하는(더욱 상류에 위치한 Vstl프로모터서열이 없는 것) Vstl프로모터는 더 이상 오존유도성이 없음을 보여준다. 상술한 바와 같이 상기 짧게 된 프로모터는 역시 동일(Fischer(1994)supra)하게 조절된 암호화서열의 병원체 유도 유전자발현을 나타낼 수 있다.

오존을 가지고 한 식물의 처리와 증가된 생합성 또는 식물세포에서의 에틸렌의 방출 사이의 관계의 관점에서 분석한다. 그러므로, 오존 유도된 유전자 발현의 에틸렌반응성 원소의 포함이 제외될 수 없다. 그러나, 일반적인 cis-원소를 고려하여 에틸렌반응성능과 관련하여 일반적으로 밝혔고(Sessa et al. (1995) Plant Mol. Biol. 28,145-153; Shinshi et al.(1995) Plant Mol.27,923-932), 염기쌍 283 내지 273을 포함하는 Vstl프로모터의 서열 범위 포함을 오존 유도된 STS-유전자 발현에서 제외할 수 없다.

따라서, 처음에 여기서 기재된 오존반응성 DNA서열 범위는 포도넝쿨로부터의 Vstl프로모터의 염기쌍 270 내지 430을 포함한다.

그러므로, 본 발명은 청구범위 제1항의 DNA서열에 관한 것이다.

이 DNA서열은 식물에서의 오존 유도된 유전자발현에 대해서 필수적이다. 본 발명에 따른 DNA서열의 바람직한 해석은 포도덩굴로부터 유래된 DNA서열을 다루는 것이고, 포도덩굴(염기쌍-270 내지 -430)로부터의 스틸벤 합성효소 유전자 Vstl이 바람직하다.

더욱이, 본 발명은 염기쌍 -270 내지 -430의 Vstl유전자를 포함하는 DNA서열이 없는 Vstl유전자의 프로모터 영역에 관한 것이다. 바람직한 해석은 Vstl 유전자와 관계되고, Vstl 유전자의 번역시작으로부터 염기쌍 -270까지의 서열범위를 포함한다. Vstl 유전자의 서열범위 -270 내지 -430이 없는 프로모터 영역이 식물에서의 병원체 유도된 유전자발현을 옮길 수 있는 것이 특히 바람직하다.

본 발명은 또한 Vstl 유전자의 염기쌍 -270 내지 -430의 DNA서열 또는 이 서열범위의 최소한의 단편이 삽입된 가상의 핵산분자에 관한 것이다. 본 발명에 따른 가상의 핵산 분자는 그 안에 포함된 식물의 암호화 영역의 오존 유도된 발현의 Vstl 유전자 염기쌍 -270 내지 -430 내지 그의 최소한의 단편으로 가능하게 되는 것이 특히 바람직하다.

핵산분자는 몇몇 핵산분자, 특히 DNA 또는 RNA분자, 예를들면 cDNA, m굼 등이 될 수 있다. 그들은 자연적으로 생성된 분자 또는 유전자 기술 또는 화학적 합성방법에 의해 생성될 수 있다.

본 발명에 따라 사용 가능하게 함으로서, DNA서열, 프로모터영역, 핵산분자 또는 벡터가 오존유도성 성질을 나타내는 방법과 같은 유전자기술에 의해 식물 세포의 돌연변이를 가능하게 하였다. 더욱이, 하나 이상의 유전자를 특징짖는 방법으로서 유전자 기술법에 의해 식물 세포를 돌연 변이시킬 수 있고, 청구범위 제1항의 DNA서열 또는 그것으로부터 변환가능한 DNA서열 또는 오존에 의해 더 이상 유도되지 않는 상기 DNA서열을 가지는 동종인 것의 존재로 자연적으로 오존유도 가능하지만, 바람직하게 주로 병원체에 의해 유도가능하다.

본 발명의 특별한 이점은 식물 및 식물세포에서의 자연적으로 오존유도성 유전자의 오존 유도가 이 DNA서열을 자연적으로 포함하거나 거기서 유도될 수 있는 DNA서열 또는 상기 DNA서열을 가지는 동종인 것인 유전자에서 청구범위 제1항에서의 DNA서열 또는 그의 최소한의 단편을 삭제함으로서 제거할 수 있다는 사실이다.

본 발명의 또 다른 장점은 오존을 통해 자연적으로 연속적으로 유도할 수 없는 유전자가 식물 및 식물세포에서의 발명된 핵산서열을 사용하여 오존 유도가능하다고 특징지워질 수 있다는 것이다. 바람직한 해석의 핵산서열에서, 오존유도성 발현 또는 그의 최소한의 단편에 대한 반응성이 있고, 유전자 발현을 조절하고, 유전자가 식물세포에서의 오존의 중요성으로서 그 밖의 물질 사이에서 발전할 수 있는 반응성 산소종의 독소를 제거할 수 있는 것을 생산한다. 특히 바람직한 해석에서, 핵산서열은 촉매효소 및/또는 과산화물디스뮤타제 유전자의 발현을 조절한다.

다른 쪽으로의 해석에서, 오존유도성 유전자 발현에 대한 반응성이 있는 DNA서열은 질적으로 및/또는 양적으로 오존 농도를 결정하고, 오존효과를 평가하기 위해 측정되는 리포터유전자의 발현을 조절한다.

그러한 리포터 유전자는 예를 들면, E.coli로부터의 uidA유전자이고, 식물생물학적 기술에서 효소 β-글루쿠로니다아제(현), 루시헤라아제 유전자 또는 그 밖의 유전자에 대해서 암호화한다. 생명공학, 생화학 또는 분자생물학에서의 모든 전문가는 적합한 리포터 유전자에 대해서 잘 알고 있다.

더욱이, 본 발명은 상술한 DNA서열 또는 프로모터 영역 또는 그의 단편을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명은 또한, 상술한 핵산분자를 포함하고, 본 발명에 따라서, 원한다면 식물 또는 식물세포에 상기 핵산분자를 전이하기 위해 사용될 수 있는 일반적인 유전자 기술에서의 벡터, 특히, 플라즈마, 코스미드, 바이러스, 박테이로파지 및 그 밖의 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산서열을 포함하는 박테리아, 바이러스 및 균류 등의 변형된 미생물에 관한 것이다.

본 발명의 목적은 오존을 통해 식물에서 자연적으로 유도된 유전자의 오존유도성 발현의 존재로서 특징지워지는 식물 및 식물세포를 제공하는 것이다.

이 문제점은 오존 유도에 대한 반응성이 있는 DNA서열을 제공하고, 상기 서열이 없고, 프로모터에 의해 조절된 식물 및 식물세포에서의 유전자의 오존유도성 유전자발현이 더 이상 가능하지 않은 사용 가능한 프로모터를 만드는 것에 의해 해결된다.

오존을 통해서 자연적으로 유도되지 않는 유전자의 번역 가능한 오존반응성 유전자발현의 문제점은 본 발명에 따른 DNA서열을 제공함으로서 해결된다. 그러나, 식물 및 식물세포는 오존의 존재하에서 몇몇 특성을 명확하게 규정하는 가능성을 만들어준다.

바람직한 해석은 유전자가 오존유도성으로 발현되고, 그의 유전자 생성물이 식물 세포에서 반응성 산소종의 독소를 제거할 수 있는 변형된 식물 및 식물세포에 관한 것이다. 특히 바람직한 것은 촉매효소 및/또는 과산화수소뮤타아제 유전자와 관련된다. 한편, 오존을 통해 유도 후 소위 리포터 유전자의 특성을 나타내고, 원할 때, 바이오모니터로서 사용할 수 있는 식물 및 식물 세포(유도성 원형질체)를 생산할 수 있다.

그러나, 본 발명의 목적 물질은 살술한 바와 같이, 식물 게놈에서 축합된 재조합 핵산분자를 포함하는 전이유전자 식물이다. 그러한 식물은 대체로 몇몇이 될 수 있다. 바람직하게 단자엽 또는 쌍자엽의 유용한 식물이다. 단자엽식물의 예는 아베나(귀리), 트리티쿰(밀), 시케일(호밀), 호데움(보리), 오리자(벼), 판쿰, 페니세툼, 세타리아, 소르굼(기장), 지(옥수수) 과에 속하는 식물이다. 쌍자엽의 유용한 식물은 예를 들면, 목화, 콩류 및 구체적으로 자주개자리, 대두, 평지, 토마토, 사탕수수, 감자, 장식용식물, 나무 등의 콩과 식물이다. 그 밖의 유용한 식물은 인도사목 및 디기탈리스 등의 약초식물 뿐만 아니라 과실식물(구체적으로 사과, 배, 체리, 포도, 감귤류 식물, 파이애플 및 바나나), 기름야자나무, 차나무 및 카카오 나무, 담배, 사이잘삼이다. 특히 바람직한 것은 밀, 호밀, 귀리, 보리, 벼, 옥수수 및 기장 사탕수수 평지 콩, 토마토 감자 및 담배 등의 곡류에서 제공된다.

더욱이, 본 발명의 목적물은 식물세포, 원형질체 및 칼리(calli) 등의 식물 의 구성성분 뿐 만 아니라 종자, 열매, 커팅, 괴경근경 등의 식물의 증식물질이다.

식물세포는 핵산분자가 식물게놈에서 통합되거나 자발적인 분자(일시적인 변형을 포함)로서 존재하는 식물세포(원형질체 포함) 뿐 만 아니라 변이 및 변이되지 않은 식물세포(원형질체 포함)를 포함한다.

또 다른 해석은 본 발명은 숙주세포, 특히, 상술한 바와 같이 재결합된 핵산분자 또는 벡터로 변형 또는 접종된 원핵세포 또는 진핵세포 및 상기 술주세포로부터 나온 세포와 상술한 핵산분자 또는 벡터에 포함된 세포에 관한 것이다. 숙주세포는 식물 또는 동물세포 뿐 아니라 벡테리아 또는 진균류 세포일 수 있다.

본 발명의 목적은 오전유도성 발현 유전자의 부족으로 특징지워지고, 식물 및 식물세포에서 그의 발현이 자연적으로 오존에 의해 자극되어지는 식물 및 식물세포의 생산을 위한 방법을 보여주는 것이다.

이 문제는 자연적으로 발행한 오존 유도된 유전자 발현이 없는 새로운 식물 및 식물세포의 생산이 가능하게 한 방법을 통해서 해결된다.

이미 상술한 바와 같이, 본 발명의 목적은 오존 자극 후에 오존에 의해 자연적으로 또는 연속적으로 활성화되지 않는 발현의 유전자를 나타내는 식물 및 식물세포의 생산 방법을 제공하는 것이다. 이 문제는 식물 및 식물세포가 발명된 DNA서열 또는 최소의 단편이 오존유도성 유전자가 아닌 것으로 자연적으로 삽입한 후에, 또는 오존 자극 후에 그러한 유전자를 단지 작은 정도로 오존유도성인 유전자를 생산할 수 있도록 도움을 주는 방법에 의해 해결된다.

새로운 식물 또는 식물세포가 생산될 수 있는 다양한 방법이다. 그 한가지에 대하여, 식물 또는 식물세포는 새로운 핵산분자가 식물게놈에서 축합되는 방법, 안정한 변형물이 생산되는 방법인 종래의 유전자기술의 변형에 의해 돌연변이될 수 있다.

본 발명에 따라서, 발명된 핵산서열 또는 최소한의 단편의 존재로 자연적으로 상기 서열을 함유하는 유전자의 오존 유도를 더 이상 나타내지 않는 식물 또는 식물세포가 다음 단계을 포함하는 방법에 의해 생성된다:

a) 청구범위 제1항에 기재된 DNA서열 또는 상기 서열로부터 유도될 수 있는 서열 또는 발명된 DNA서열의 걸손 후에 식물세포에서 조절된 전사 및 번역에 대한 조절 요소를 포함하는 유전자로부터의 상기 서열을 가지는 동종이고, 전사의 종결에 대한 종결신호 및 반응성 전사의 poly-A-tail의 첨가 뿐 아니라, 하나 이상의 암호화서열을 가지는 서열의 결손.

b) 단계 a)에서 생산된 유전자 또는 핵산을 가지는 식물세포의 변형, 및

c) 유전자전이식물의 재생 및 식물의 증식을 가능하게 한다.

다른 한편, 오존 유도에 대한 반응성 서열을 삭제하는 것 대신데, 상기 서열 또는 그의 최소한의 단편을 예를 들면, 돌연변이를 통해 불활성화 또는 방해할 수 있으므로, 불활성형의 유전자로 남아있다. 오존반응성 유전자 범위가 삭제되는 방법과 상관없이, 모든 정교한 측정이 종래의 방법과 재조합 유전자 기술을 통한 방법(예를 들면, Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York)으로 이루어질 수 있다.

특히 바람직한 해석에서, 단계 b)에서 식물 또는 식물세포로 전이된 핵산분자는 예를 들면, 암호화서열의 병원체 유도된 유전자 발현을 제공하는 조절요소를 포함한다.

본 발명에 따라서, 유존자 함유된 오존 유도된 발현에 대한 필수적인 또는 상호 반응성인 발명의 핵산서열 또는 상기 서열의 최소한의 단편의 존재에 의해 식물 또는 식물세포가 다음 단계를 포함하는 방법으로서 생산된다.

a) 본 발명에 따라서, 오존유도성으로서 자연적으로 또는 연속적으로 발현되는 유전자에서의 식물에서 오존 유도된 유전자 발현을 생성할 수 있는 적어도 하나의 DNA서열 또는 상기 서열로부터 유도 가능하거나 상기 서열을 가지는 동종인 서열, 또는 상기 서열의 최소한의 단편의 삽입.

b) 식물세포에서 발현을 자연적으로 요구하는 모든 요소를 가지는 단계 a)에서 생성된 유전자 또는 핵산분자를 통한 식물세포의 형질전환.

c) 전이유전자식물의 재생 및 식물 증식.

바람직한 해석에서, 유전자와 관련된 것은 촉매효소 디스뮤타아제, 과산화물디스뮤타아제 또는 일반적인 리포터유전자이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 핵산서열의 유익한 사용을 나타내고 잇다.

본 발명은 새로운 DNA분자를 사용하여, 오존에 의해 일반적으로 영향을 받는 일부 표현형 식별부호로서 또는 오존유도성 특성에 의해 비전이성유전자식물 및 식물세포로부터 그들 스스로 본 발명의 DNA 서열을 식물하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 상술한 식물 및 식물세포를 생산한다.

더욱이, 본 발명은 발명된 핵산분자의 사용을 포함하여, 병에서 오존 유도된 저항성뿐 아니라 증가된 병원체 유도된 것으로 특징지워지는 식물을 생산한다.

본 발명은 또한 오존반응성 핵산요소를 검출하고, 인지하기 위한 본 발명의 핵산서열 또는 그의 단편의 용도에 관한 것이다. 전문가는 예를 들면, 혼성화실험 또는 DNA단백질 결합연구의 일반적인 분자생물학적 방법을 사용함으로서 오존 반응성 핵산 요소를 확인할 수 있다. 예를 들면, 첫 번째 단계와 같이, 폴리(A)RNA가 오존 처리된 조직으로부터 고립된다. 그 때, cDNA뱅크를 제공한다. 두 번째 단계에서와 cDNA클론의 도움으로 처리되지 않은 조직으로부터의 폴리(A)RNA에 기초한 첫 번째 뱅크로부터의 이들 클론은 대응하는 폴리(A)RNA분자가 오존처리에서 엄격하게 유도된 혼성화에 의해 확인된다. 이 방법에서 확인된 cDNA의 도움으로 오존방응성요소를 가지는 프로모터는 그 후에 고립된다. 핵산서열 및 분자는 이들 고립된 프로모터를 조사 및 특징지을 때, 유용한 도구가 될 수 있다.

또한, 본 발명의 하나의 상기 핵산 또는 본 발명의 하나의 DNA서열을 혼성화하는 핵산분자 또는 그의 단편을 포함한다. 본 발명의 범위에서 "혼성"은 종래의 혼성상태하, 바람직하게 예를 들면 Sambrook et al(1989)분자클로닝:A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Laboratiry Press, Cold Spring Harbor, New York에 기재된 바와 같은 엄격한 조건하에서의 혼성을 의미한다.

본 발명에 따라서 분자를 혼성하는 핵산분자는 예를 들면 게놈 또는 cDNA로부터 단리될 수 있다.

그러한 핵산분자의 확인 및 단리는 본 발명에 따른 핵산분자, 또는 상기 분자의 단편을 사용하거나 표준공정(Sambrook et al,supra)에 따라서 혼성화하는 방법에 의해 분자의 역보충에 의해 이루어질 수 있다.

따라서, 본 발명은 식물 또는 그 밖의 기관으로부터의 동종인 서열을 확인 및 단리시키기 위한 새로운 DNA서열 또는 그의 단편 용도에 관한 것이다.

예를 들면, 정확하게 또는 연속적으로 발명된 핵산서열 또는 상기 서열의 단편을 가지는 핵산분자가 혼성프로브로서 사용될 수 있다. 혼성프로브로서 사용된 단편은 종래의 합성 기술의 도움으로 생성된 합성단편 및 본 발명에 따른 핵산분자와 기본적으로 결합하는 서열이 될 수 있다. 발명된 핵산서열과 혼성하는 유전자를 동정 및 단리할 때, 반드시 서열을 결정하고 특성을 분석해야 한다. 그렇게 하기 위해서, 많은 분자의 생물학적, 생화학적 및 생명과학적인 표준방법이 전문가에게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 핵산분자와 혼성하는 분자는 활성 또는 불활성형의 오존 반응성 서열을 포함하거나, 상기 서열을 더 이상 가지지 않는 특징을 가지는 단편, 유도체 및 알레산 변형물을 포함한다. 유도체는 이들 분자의 서열이 하나 또는 여러 위치에서 상기 핵산분자의 서열로부터 구별되고 상기 서열을 가지는 연장된 동종으로 되는 것을 의미한다. 이 관계에서 동종은 적어도 서열 동정의 40%, 특히 동정의 적어도 60%, 바람직하게 80%, 특히 바람직하게 90%를 의미한다. 상기 핵산분자로부터의 이탈은 결손, 첨가, 치환, 삽입 또는 재조합에 의해 일어날 수 있다.

상기 분자를 가지는 동종 및 상기 분자의 유도체로 이루어진 핵산분자에 관해서, 동일한 생물학적 기능을 행하는 변형을 가지는 분자의 일반적인 변형체에 관한 것이다. 이들은 다른 기관으로부터의 서열의 변이 또는 이들 변형이 자연적으로 일어나고 특이한 돌연변이체를 통해 도입되는 돌연변이를 자연적으로 발생시킨다. 더욱이, 변이가 합성으로 형성된 서열이라고 여겨진다. 알레산 변이물과 관련하여, 이들은 합성으로 생성된 변이물 또는 재합성 DNA법에 의해 생성된 변형물 뿐 만 아니라 자연적으로도 일어난다.

고등 식물 또는 그의 세포로 이질의 유전자 삽입 위해, 많은 클로닝벡터가 E.coli 및 변형된 박테리아 세포를 선택하기 위한 표식유전자를 위한 복제신호를 포함하는 것이 가능하다. 그러한 벡터의 예는 pBR322, pUC열, M13mp열, pACYC184등이다. 바람직한 서열은 적당한 제한의 절단으로 벡터로 삽입될 수 있다. 얻어진 플라스미드는 E. coli세포의 형질전환을 위해 사용된다. 형질전환된 E. coli세포는 적당한 배지에서 배양되어 계속적으로 형성된다. 플라스미드는 회수된다. 사용가능하게 제한하는 분석, 겔전기영동 및 그 밖의 생화학적, 분자행물학적 방법이 얻어진 플라즈미드 DNA의 특성을 나타내기 위한 분석방법으로서 사용된다. 각 처리 후, 플라스미드 DNA가 분열되고, 얻어진 DNA 단편이 또 다른 DNA서열과 연결된다. 각 플라스미드 DNA서열은 동일한 것 또는 또 다른 플라스미드에 클론된다.

공지의 방법으로 식물숙주세포로 DNA를 도입할 수 있다. 전문가는 각각 적당한 방법을 어려움 없이 결정할 수 있다. 이들 기술은 다음을 포함한다: 형질전환 매체로서 아크로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefacience) 또는 아그로박테리움 리조제네스(Agrobacterium rhizogenes), 원형질체의 융해, 원형질체에서 단리된 DNA의 직접적인 유전자 전이, DNA의 전기영동, 바이오리스트의 방법에 의한 DNA의 도입을 사용함으로서 T-DNA를 가지는 식물세포의 형질전환. 일시적인 형질전환체 뿐 아니라 안정성이 생길 수 있다.

세포로 DNA를 주입 및 전기영동시킬 때, per se가 사용된 플라스미드에 만들어진다. 동일한 것이 직접 유전자 전이에 사용된다. 간단한 플라드스미 예를 들면, pUC 유도체가 사용될 수 있다. 그러나 식물이 이 방법으로 변형된 세포로부터 재생산될 경우, 표식유전자의 존재가 요구되어진다. 전문가는 일반적인 선택 마커(maker)를 잘 알고 있고, 적당한 마커을 선택하기 위한 문제를 나타내지 않는다. 일반적인 용도의 석택마커는 카나마이신, G418, 블레오마이신, 메톡트레사이트, 글리포세이트, 스트렙토마이신, 술포닐우레아, 젠타마이신 또는 포스피노트리신 등의 비이오사이드 또는 안티바이오틱에 전이된 식물세포 저항체를 만드는 것이다.

식물세포로 유전자를 유도하기 위해 선택된 방법에 따라서, 예를 들면, Ti 또는 Ri-플라스미드는 적어도 오른쪽 경계에서 식물세포의 변형을 위해 사용되지만, 종종 측면 영역으로서의 Ti 또는 Ri-플라스미드에 함유된 T-DNA의 오른쪽 및 왼쪽 경계가 유도된 유전자로 연결된다.

아그로박테리아가 변형에 사용된 경우, 유도된 DNA은 매개체 또는 이원벡터 중 하나의 특별한 플라스미드에 클론된다. T-DNA의 서열과 동일한 서열로, 중간벡터가 동종 재조합을 통해 아그로박테리아의 Ti- 또는 Ri-플라스미드에 통합시킬 수 있다. 첨가로, 후자는 T-DNA의 전이를 위해 필요한 vir-영역을 포함한다. 중간백터는 아그로박테리아에 복사할 수 없다. 중간벡터는 헬퍼플라스미드에 의해 아그로박테리움투메하시엔스(결합)에 전이될 수 있다. 이원벡터는 아그로박테리아뿐 아니라 E.coli에 복사될 수 있다. 그들은 선택마커 유전자 및 오른쪽과 왼쪽의 T-DNA 이원 영역에 의해 구성된 링커 또는 폴리링커를 포함한다. 그들은 직접적으로 아그로박테리아(홀스터 등(1978))분자 및 일반적인 유전자(163, 181-187)로 변형된다. 숙주세포로서 제공된 아그로벡테리아는 vir-영역을 가지는 플라스미드를 포함한다. vir-영역은 식물세포로 T-DNA를 전이하기 위해 필수적이다. 첨가된 T-DNA가 존재하여야 한다. 상기 방법으로 변형된 아그로박테리아는 식물세포의 변형에 사용된다.

식물세포의 변형을 위한 T-DNA의 용도는 철저하게 연구되었고, EP120 515; Hoekema: 이원식물벡터시스템, Offsetdrokkerij Kanters B.V.,Alblasserdam(1985)Chapter V;Fraley et al(1993) Crit.Rev.Plant.S챠., 4, 1-46 및 An et al(1985)EMBO J.4,277-287에 충분하게 기재되어 있다.

식물세포로의 DNA 전이를 위해서, 식물 이식체가 아그로막테리운투메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조게네스로 적당하게 배양될 수 있다. 식물이 변형된 세포의 선택을 위해 안티바이오틱 또는 비이오사이드를 함유할 수 있는 적당한 배지에서 재생산될 수 있는 감염된 식물체(남은 단편, 줄기단편, 뿌리 뿐 아니라 원형질체 또는 현탁배양 식물세포)가 밖으로 나간다. 식물의 재생산은 잘 알려진 배양배지를 사용하는 일반적인 재생산 방법에 따라서 완성된다. 상기 방법으로 얻어진 식물 또는 식물세포는 도입된 DNA의 존재를 위해 조사되어진다. 바이오리스틱방법 또는 원형질체 변형을 통해서 사용함으로서 외래 DNA를 도입하기 위한 또 다른 가능성이 알려지고 있다(예를 들면, Willmitzer L.(1993) 전이유전자식물: 새명과학, A Multi-Volume Comprehensive Treatise(H.J.Rehm,G.Reed,A.Puhler,P.Stadler eds.)Vol.2,627-659,V.C.H.Weinheim-New York-Basel-Cambridge).

쌍자엽식물 또는 Ti-플라스미드벡터시스템을 통한 세포 및 아그로박테리운투메파시엔스를 가지는 변형이 잘 성립되어도, 새로운 연구는 단지 단자엽식물 또는 그들의 세포가 아그로박테리아 기초한 벡터에 의해 변형을 매우 잘 받아들인다는 것을 나타낸다(Chan et al(1993)Plant. Mol.22,491-506; Hiei et al(1994)Plant J.6,271-282; Deng etal(1990)Seicnce in China33,28-34;Wilmink et al(1992)Plant Cell Peport11, 76-80; May et al(1995)Bio/Technology 13,486-492; zhsj 및 도미스(1992)Int.J.Plant S챠.153, 550-555; Ritchie et al(1993)Transgenic Res.2,252-265).

단자엽식물 또는 그들의 세포를 변형시키기 위한 또 다른 시스템은 바이오리스틱 셋업에 의한 변형(반 및 레마우스(1994)Plant Physiol.104, 37-48; Vasil et al(1993)(Bio/Technology11, 1553-1558; 리타라 등(1994)Plant Mol.Bio.24,317-325; 스펜서 등(1990)Theor. Appl.Genet. 79,625-631)), 원형질체 변형, 부분적으로 투과된 세포의 전기영동 및 유리섬유에 의한 DNA의 도입이다.

변형된 세포는 일반적인 방법(McCormick et al(1986)식물세포리포트5, 81-84)으로 식물 내에서 성장한다. 결과로 생긴 식물은 변형된 유전적 특성 또는 그 밖의 유전적 특성을 가지는 식물로 배양 및 이식될 수 있다. 결과로 생신 혼성의 각각의 식물은 각각의 표현평의 특성을 가진다.

2세대 이상이 표현형 특성이 확실하게 유지되고 증식되기 위해 배양된다. 본자가 각각의 표현형 또는 그 밖의 특성을 유지하기 위해 생산된다.

일반적인 방법을 사용함으로서, 전이유전자 라인을 결정할 수 있고, 핵산분자에 대해 상동이고, 더욱이 그들의 표현형 반응이 존재 또는 존재하지 않는 오존 방응성 및 상동라인과 비교해서 실험될 수 있다.

자연적으로 본 발명에 따른 핵산분자를 포함하는 식물세포는 식물세포(원형질체, 칼리 현탁배지 등을 포함)로서 더욱 배양된다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 핵산분자 또는 그러g나 분자의 단편, 또는 식물 또는 또 다른 기관으로부터의 오존반응성 원소를 포함하는 동종분자를 동정 및 단리하기 위한 분자의 역보충의 용도이다. "동종"의 의미는 상기에서 주어진 의미와 관련된다.

다음 실시예는 발명을 설명하기 위한 목적을 제공한다.

(실시예 1)

이원벡터 pPCV002의 GUS혼성구조로서의 Vstl프로모터 5'-삭제 구조

이하, 프로모터라고 부르는 포도덩굴로부터의 Vstl유전자의 5'비암호화 서열 영역은 1570염기쌍으로 이루어진다. 독일특허 DE 41 07 396 및 피셔(1994)supra로부터 알려진 서열인 프로모터가 완전한 Vstl유전자(DE-A-41 07 396; 피셔(1994)supra)를 포함하는 개시인자 및 플라스미드pVstl로서 다음의 올리고뉴클레오타이드를 사용함으로서 일반적인 중합효소 사슬 반응으로 주형으로서 증폭된다.

PCR은 퍼킨엘머에 의해 원래 TaqDNA중합효소를 사용하여 퍼킹엘머(Norwalk, 미국)의 프로토콜에 따라서 완료된다. 보통의 PCR조건 하에서 증폭된 DNA단편은 HindⅢ(이 제한 절단은 프라이머1의 5'-말단에서 발견) 및 BamHI(이 제한 절단은 프라이머2의 5'-말단에서 발견) 및 벡터pBL101.2(제퍼슨(1987)Plant Mol.Biol.Reporter 5,387-405)로부터의 BamHI/EcoRI-단편으로 재절단되고, pUC18-폴리링커의 HindⅢ 및 EcoRI-제한절단을 통해 pUC18플라스미드(야니쉬퍼론 등(1985))로 서브클론된 A.Tumefaciens로부터의 nos유전자의 종결신호뿐 아니라 E.coli로 부터의 β-글루쿠로니다아제리포터 유전자(GUS, uidA)를 포함한다. 모든 클로닝 단계는 종래의 분자생물학적 방법 및 보조자(예를 들면, 샘브록 등(1989)supra)를 사용함으로서 완성되고; 제한효소 및 그 밖에 클로닝을 위해 사용된 효소는 보이히링커 맨하임으로부터 얻어진다. 결과로서 생성된 클론(pUC-Vstl/GUS)은 GUS유전자를 가지는 Vstl프로모터 번역 혼선을 포함하고, 리딩구조의 다섯 개의 STS코돈이 BamHI 절단을 통해 GUS유전자와 연결된다. Vstl프로모터 서열 뿐 아니라 혼성 번역의 서열범위는 파마시아(프라이버그)의 T7시퀀싱을 사용함으로서 효소의 사슬 종결법(상거 등(1977) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74, 5463-5467)에 의해 그들의 정확성을 위해 체크된다.

이원벡터 pPCV002(Koncz 및 Schell(1986)Mol.Gen.Genet.204,383-396)의 5'-삭제 돌연변이체의 클로닝이 후술된다. 대부분의 경우에, 더 작은 pUC18플라스미드가 비교적 큰 이원벡터와 비교해서 일찍이 다루어지고 있기 때문에, pUC18-서브클론이 중간벡터로서 사용된다.

플라스미드 지정은 전사시작으로부터 계산하고, 개시코돈(하인 등(1993)supra;피셔(1994)supra)으로부터의 73염기쌍의 거리에 위치한 각각의 프로모터 단편의 대략의 길이로부터 유래한다. Vstl프로모터의 단계적인 제한을 위해 사용된 제한 절단이 보기1에 개략적으로 나타난다.

-p1500GUS: GUS유전자와 함께 완전한 STS프로모터를 함유하는 HindⅢ/EcoRⅠ단편이 상술한 플라스미드pUC-Vstl/GUS로부터 단리되고, HindⅢ와 EcoRⅠ를 제한 절단한 사이에 폴리링커의 pPCV002로 삽입한다.

-p1060GUS: 1130Bp-프로모터 단편이 BamHI 및 Sspl제한절단을 통해 pUC-Vstl/GUS로부터 단리되어, BamHI/HincⅡ-선형화 pUC18(pUC1130)에 클론된다. HindⅢ/EcoRⅠ단편으로서의 GUS유전자가 연속적으로 pUC-Vstl/GUS로부터 단리되고, pUC1130의 BamHI 절단 및 EcoRI절단 사이에 클론된다.

마지막으로, 융합이 HindⅢ/EcoRⅠ 이중 침지를 통해 단리 되고, 동일한 절단을 통한 pPVC002의 폴리링커로 삽입된다.

-p930GUS: 1.0kb-프로모터 단편이 제한효소 BamHI 및 HincⅡ를 통해 pUC-Vstl/GUS로부터 단리되고, 동일한 절단을 통해 pUC18(pUC1000)의 폴리링커로 삽입된다. 이것은 p1060GUS의 유사하게 클로닝에 의해 뒤따른다.

-p740GUS: 대략 1.6kb-길이 HindⅢ/BamHI 프로모터 단편이 플라스미드 pUC-Vstl/GUS로부터 단리되고, 제한효소Dral로 침지된다. 결과로 생긴 810Bp길이 BamHT/Dral단편이 계속적으로 제한절단 BamHI 및 HincⅡ(pUC810)을 통해 pUC18에 클론된다. HindⅢ/EcoRⅠ단편으로서의 GUS유전자는 pUC-Vstl/GUS로부터 단리되고, pUC810의 BamHI절단 및 EcoRI절단 사이에 클론된다. 마지막으로 융합이 HindⅢ/EcoRⅠ이중 침지를 통해 단리되고, 동일한 방법을 통해 pPCV002의 폴리링커로 삽입된다.

-p550GUS: pUC-Vstl/GUS는 제한효소 AF1Ⅱ로 소화되고, 생산자의 지시에 따라서 돌출한 5'단편이 클레노우효소(Klenow enzyme)(모이링커 만하임; dNTP)로 채워진다. 이는 제한효소 BamHI/HincⅡ로 재절단되고, 결과적으로 620Bp-프로모터 단편이 BamHI/HincⅡ선형화 pUC18벡터(pUC620)으로 소화된다. 그리고 클로닝이 p1060GUS과 유사하게 계속된다.

-p500GUS: 570Bp긴 프로모터 단편이 BamHI/HaeⅢ 이중 소화를 통해 pUC-Vstl/GUS로부터 단리되고, BamHI/HincⅡ선형화 pUC19벡터(pUC570)에 소화된다. 더욱이 p1060GUS의 생성을 위해 유사체를 더욱 클로닝한다.

-p430GUS: 상술한 플라스미드 pUC1000은 제한효소 SnaBI를 사용함으로서 선형화되고, 계속해서 HincⅡ으로 소화된다. 선형화된 벡터는 계속적으로 잡아서 프로모터의 500염기쌍이 -930과 -430(p-uc500) 사이에서 삭제된다. 더욱이 클로닝은 pUC106GUS와 유사하게 실행된다.

-p280GUS: pUC-Vstl/GUS는 제한효소 BanⅡ로 소화되고, 돌출단이 크레노우효소로 채워지고, 선형화벡터가 계속적으로 제한효소 BamHI로 소화된다.350-Bp-긴 부딘 끝/BamHI-프로모터 단편을 단리시킨 후에, 클로닝이 p1060GUS와 유사하게 계속된다.

-p140GUS: 상기한 pUC서브클론 pUC620이 제한효소 Nsil 및 Pstl로 소화되고, 선형화벡터가 계속적으로 클린 및 재결합된다. 이것은 프로모터 서열 -550 내지 -140(pUC210)의 삭제로 생긴다. HindⅢ/EcoRⅠ단편으로서의 GUS유전자는 계속적으로 pUC-Vstl/GUS로부터 단리되고, pUC1130의 BamHI절단과 EcoRI 절단 사이에 클론된다. 마지막으로 융합이 HindⅢ/EcoRⅠ 이중소화를 통해 단리되고 동일한 절단을 통해 pPCV의 폴리링커로 삽입된다.

-p40GUS: GUS 유전자와 함께, 110Bp-프로모터단편이 Nhel/EcoRI 이중소화에 의해 pUC-Vstl/GUS로부터 단리되고, 단편이 계속적으로 Xbal/EcoRI 선형화 pPCV002에 클론된다.

-pΔGUS: 구조p1500GUS는 제한효소BamHI로 소화되고, 클린된 벡터는 계속적으로 재결합된다. 따라서, 완전한 프로모터 단편이 벡터 pPCV002가 HindⅢ절단(크톡 및 쉘(1986)supra)에 비해 다중클로닝 스팟을 자연적으로 함유하는 BamHI를 통해 제거한다.

-p40GUS: 양성의 조절로서 제공된, GUS 유전자를 가지는 콜리플라워 모자이크 바이러스로부터의 35S RAN 프로모터 융합이 발현벡터 pRT99GUS(토퍼 등(1988) 핵산조사 16,8725)로부터 HindⅢ 단편으로서 단리되고, pPCV002의 다중 클로닝스팟으로 삽입된다.

(실시예 2)

전이유전자식물의 식물 물질, 식물변형 및 재생성

니코티아나타바쿰 cv.페티트 하바나 SR1(마리가 등(1973) Nature New Biol.244, 29-30)이 26℃의 1% 사카로오스, 3000럭스 및 16rtlrks의 광주기로 호르몬이 없는 1/2 LS-배지(린스마이어 및 스쿡(1965) Physiol. Plant 18,100-127)의 불모의 사이언(scion)으로서 배양된다. 6 내지 8주의 간격으로, 싹 조각이 신선한 LS배지로 전이된다. 불모의 사이언 배지의 2 내지 3㎝ 긴 잎의 아그로박테리아 투메파시엔스(호쉬 등(1985) 사이언스227 1229-1231)를 가지는 잎조각의 변형을 위해 직경 1㎝의 조각으로 각인하여, 상기한 플라스미드 구조 중 하나를 함유하는 아그로박테리아(대략 109세포/mL YEB 배지)의 현탁액으로 5분 동안 배양한다. 배양된 잎 단편은 26℃에서 2 내지 3일 동안 호르몬이 없는 LS배지에서 놓아둔다. 그 동안, 박테리아는 잎단편을 너무 크게 하고, 계속적으로 호르몬이 없는 액체의 LS배지로 씻고, 카나마이신(75㎍/㎖; 시그마, 무니치), 세포탁심(500㎕/㎖;호에히스트, 프랑크프루트) 및 벤질아미노류린(BAP, 0.5㎎/ℓ; 두체프, 할렘, 네델란드)가 있는 LS배지에 놓아둔다. 2 내지 3주 후에, 변형된 싹을 볼 수 있고, 75㎍/㎖ 카나마이신 및 100㎍/㎖ 세포탁심을 가지는 호르몬이 없는 LS배지에 뿌리를 내린다.

담배잎 단편의 변형을 위_해사용된 아그로박테리아 배양균이 다음과 같이 생성된다: 상술한 모든 pPCV002 유도체의 첫 번째가 E.coli 유동 사슬 S17-1(사이몬 등(1983)바이오/테크날러지 1,784-790)으로 삽입된다. 이것은 타케토(1988)바이오케미스트리, Biophys. Acta 949, 318-324 또는 하나한(1983) J.Mol.Biol.166, 557-580에 따른 각각의 플라스미드를 가지는 충분한 세포의 형질전환 뿐 만아니라, 완전한 S17-1 E.coli를 생성한다. 계속적으로, 각각 이원젝터, 및 아그로박테리아투메파시엔스-사슬 GV3101 C58C1 RiF pM90가(콘크 및 쉘(1986)supra)를 포함하는 E.coli가 OD₅₈₀=1.0까지의 관련된 배지에서 배양된다. 다음은 E.coli 박테리아의 배양에 사용된다: 종래의 YT 배지(New York, Molecure Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor의 밀러(1972)실험); 37℃에서의 박토트립톤0.8%(w/v), 효모추출물 0.5%(w/v), NaCl 0.5%(w/v, pH7.0). A.투메파시엔스 박테리아, YEB 배지(쇠고기 추출물 0.5(w/v), 효모추출물 0.1%(w/v), 박토펩톤(w/v), 사카로오즈 0.5%(w/v), MgSO₄2mM, pH7.2)의 배양을 위해서 28℃에서 사용된다. 이어서 일어나는 결합을 위해서, 박테리아가 5분 동안 1500×g에서 원심분리에 의해 분리되고, 새롭게 준비한 10mM MgSO₄용액에 두 번 씻는다. 공여체(E.coli) 및 수용체(A.투메파시엔스)가 1:1의 비율로 혼합되고, YEB 아가 판으로 담그어진다. 28℃에서 16시간 배양 후, 박테리아 방울이 10mM MgSO₄용액으로 헹구어지고, 10^-2, 10^-3및 10^-4희석액이 YEB 선택판에 덮여진다. 단일 배양으로부터 아그로박테리아 배양은 28℃에서 배양되어 N.타바컴의 형질전환을 위해서 사용된다.

상술한 Vstl 프로모터/GUS 융합 중 하나를 함유하는 전이유전자 담배 싹은 싹배양을 통해 증식되고, 부분적으로 땅에 옮겨지고, 개화까지의 보통 상태(22℃, 60%, 비교적 대기가 습윤하고, 대략 15,000럭스) 하의 온실에서 배양된다. 꽃이 양피지에 의해 외래 수분에 대항하여 보호되고, F-1 세대 종자인 다 익은 종자 켑슐은 4 내지 6주 후에 생산된다. 온실에서의 생물학적 실험을 위해서, F-1세대의 종자를 카나마이신 75㎍/㎖을 가지는 LS배지에 놓는다. 이것은 직접 켑슐 바깥의 불모의 상태하 또는 표면의 살균 후에 행해진다(1. 살균수로 간단하게 씻는다; 2. 70% 에탄올에서 2분 동안 배양한다. 3. 3%의 NaOCl(13% 활성 염소)에서 10분 동안 배양한다. 4. 물로 세 번 씻는다. 5. 안전한 작업환경의 엷은 대기류에거 건조한다.). 25∼26℃, 2000∼3000럭스 및 60%의 대기 수분의 75㎍/㎖ 카나마이신을 가지는 LS배지에서 약 2주 동안 배양 후, 카나마이신 저항 담배 배낭 및 카나마이신 민감성 담배 배낭을 명확하게 구분할 수 있다. 민감한 배낭, 저항성 배낭과 비교한 것을 두드러진 제1 뿌리 성장으로 나타낸다. 떡잎 외에, 일차잎이 저합배낭에서 단지 2주 후에 인지 가능하다. 네잎단에서, 저항 F1배낭이 땅으로 전이되어, 단단해지고 더욱이 적당한 조건하에서 배양된다.

(실시예 3)

식물배양, 오존처리 및 잎의 수확

그 후의 오존처리를 위해서, 전이유전자, 카나마이신 저항성 담배 배낭을 아가판으로부터 표준기질(타입T/프룬스토퍼/라우터바흐) 및 펄라이트의 2:1 혼합물을 가지는 화분으로 첫째로 전이되고, 12 시간-낮/밤 주기를 가지는 기후상의 방에서 , 15,000럭스에서 3주 동안, 낮시간 온도 20℃ 및 65 내지 70% 대기의 습도 및 여과된 공기에서 배양한다.

담배식물이 계속적으로 10시간 동안 단일 오존펄스에 사용되고, 오염이 없는 여과된 공기에서 2 내지 14시간 동안 배양된다. 모든 가스처리 실험이 기후상 방에 놓은 닫혀진 플렉시글래스박스의 특별한 기후 조건에서 처리된다. 오존처리를 항상 오전 9시에 시작하고, 하루 주기로 연장된다. 오존은 건조 산소의 전기방전에 의해 생산된다. 적량으로 나누고 분석한 것은 컴퓨터 조절 하에서 완성된다(랑게바텔 등(1991) Plant Physiol. 95, 882-889). 식물의 담배잎을 식물 꼭대기부터 시작해서 바닥까지 세어서, 첫 번째 잎이 적어도 8㎝의 잎수 1-10으로 분류한다. 담배잎(1개 내지 10개로 분류)을 오존처리 시작 후에 다양한 점에서 액체질소에서 각각 얼려서 -80℃에서 저장한다.

(실시예 4)

β-글루쿠로니다이제 활성실험

GUS-효소 활성의 형광 분석이 4-메틸-움벨리페릴-글루쿠로니드(MUG, 시그마, 무니히)를 사용함으로서 제퍼슨(1987)supra 또는 제퍼슨 등(1987)EMBO J.6,3901-3907에 따라서 정확하게 만들어진다. 생성물 4-메틸움벨리페론(MU)의 농도는 석영 플로우 큐베트에서 형광광도계(퍼킨엘머 LS-2B 필터형광계)로 측정된다. 식물 추출물에서의 GUS활성이 pmol MU×㎎^-1×min^-1에서 계산된다. 담배잎 추출물에서의 단백질 농도가 브래드포드(1976)Analyt.Biochem.72,248-254에 따라서 결정된다.

오존 처리한 포도덩굴 식물을 가지고 행한 실험과 비교해서, 0.2㎕/ℓ와 0.4㎕/ℓ 오존을 가지고 가스처리한 것이 mRNA 단계에서 STS유전자 발현의 실질적인 유도를 가져온다는 것을 노던블랏 분석이 보여준다. 이러한 이유 때문에, 포도덩굴로부터의 STS 유전자가 특히 오존반응성 DNA원소를 확인하기 위해 연구된다. 이제까지 보여준 유전자가 처리되지 않은 식물과 비교해서 오존 처리된 식물의 측정가능한 오존유도를 사용할 수 없다고 점을 말하고 있다.

프로모터 단계에서의 오존의 영향을 분석할수 있게 하기 위해 완전한 프로모터 영역(p1500GUS)을 가지는 Vstl/GUS융합 구조를 함유하는 정확하게 형질전환된 담배선의 F1-담배식물(11주령)을 오존 처리한 실험에 사용한다. GUS효소활성을 10시간 오존의 다양한 농도(0.1㎕/ℓ오존, 0.2㎕/ℓ오존 또는 0.4㎕/ℓ오존)로 오존처리하고, 14시간 오염되지 않은 공기의 후배양을 단계적으로 끌어내는 동안, 여러번 수확하는 잎의 원래 추출물의 형광계로 결정한다. 보기2에서 나타낸 결과는 오염된 공기가 없는 조절식물과 비교해서 GUS활성의 빠른 오존 유도 증가를 나타낸다. 따라서, 11폴드 유도를 일으키는 0.1㎕/ℓ의 오존 처리, 및 0.2 또는 0.4㎕/ℓ의 오존 처리는 오존처리의 시작 후 12시간, STS 프로모터에 의해 조절된 GUS유전자의 발현의 25폴드유도까지 일어난다.

관찰된 STS프로모터의 큰 오존유도에대해 반응하는 cis-조절 서열의 확인을 위해서, 박테리아 GUS-리포터 유전자와 융합된 Vstl프로모터의 상기 5'-삭제를 포함하는 전이유전자 담배선이 오존처리된 식물인 독립 FO0식물로서 분석된다. 최초의 재생식물이 카이온배지를 통해 몇 달 동안 불모의 배지에서 배양되고 증식된다. 또한, 이들 안정한 형질전환체의 F1담배식물(11주령)을 오존유도된 GUS발현에 대해 실험한다.

전이유전자 밤배식물을 10시간 동안 0.1㎕/ℓ의 오존으로 처리하고, 2시간 동안 오염되지 않은 공기에서 배양한다. GUS활성은 배지의 오래된 잎의 원래 추출물에서 결정되고, 처리되지 않은 조절 식물에서 효소활성과 비교된다. GUS효소활성의 형광분도계 분석 결과를 표1에 나타낸다. GUS활성이 처리되지 않은 조절식물 뿐 아니라 오존처리된 테스트식물에서 -1500 내지 -430으로 짧게 한 프로모터 영역으로서의 오존 유도(약12(-1500) 내지 약10(-430)의 유도인자를 떨어뜨린다)의 약간 감소를 가져올 경우, -430 및 -280 사이의 프로모터 범위의 첨가된 삭제가 어존처리된 실험식물에서 GUS발현의 많은 감소를 낳게 된다. GUS유전자가 -430-5'삭제 프로모터의 조절 하에 있는 식물이 조절식물에 비해 10폴드 오존유도를 나타내는 경우, GUS 유전자가 더 짧은 -280-5'-삭제 프로모터에 의해 조절된 식물이 오존을 통해 GUS발현의 단지 최대 2-폴드유도를 나타낸다. 결과적으로, 염기쌍 -430 내지 -280을 포함하는 포도덩굴로부터의 Vstl 유전자의 프로모터 범위는 STS유전자의 두드러진 오존유도된 발현에 대해 필수적인 cis-활성요소를 포함한다.

이들 결과를 상술한 구조를 포함하고, 식물세포배지에서 배양된 식물세포에 의해 증명한다.

(보기 및 표)

(보기 1)

플라스미드 pUC-Vstl/GUS에서 Vstl-프로모터/GUS 번역 융합의 제한카드.

플라스미드는 E.coli로부터의 GUS유전자를 가지는 포도덩굴로부터 Vstl프로모터의 번역융합을 포함한다. 5'-삭제 돌연변이체의 클로닝을 사용한 제한절단이 작성된다. nos ter=아그로박테리아 쿠메파시엔스로부터의 노파린신다아제 유전자의 종결신호

(보기 2)

오존의 다양한 농도를 통한 포도덩굴(p1500GUS)로부터의 완전한 Vstl-프로모터가 있는 GUS유전자의 번역 융합을 포함하는 전이유전자 F1-담배식물의 GUS 발현의 Vstl-프로모터조절된 유도 속도.

GUS 활성을 제퍼슨(1987)supra에 따라서 담배잎(잎번호 4)의 원래 추출물에서 형광계로 결정한다. 다양한 수확을 보기에 의해 확인할 수 있다. 10시간의 오존처리는 오염되지 않은 공기에서 담배식물의 14시간의 후배양이 뒤따른다. 조절식물은 오염되지 않은 공기(오존처리 없음)에 놓여진다. n=3 또는 4; 평균값±표준에러; 모든 실험이 이중실험으로 완성된다.

5'-삭제된 Vstl프로모터	실험된 독립 전이유전자 담배라인	GUS-효소 활성
		[pmol MU min^-1mg^-1단백질]
		+오존	-오존	유도인자
-1500-470-550-500-430-280-140-40+70	1(F1)2(F1)3(F0)2(F1)5(F0)6(F0)6(F0)2(F1)2(F0)3(F1)3(F1)1(F1)	735±100388±59126±13173±25148±52141±3822±430±312±0.224±324±23.5±1	63±730±512±315±315±614±413±315±38±315±315±33.5±1	11.712.910.511.59.910.01.7201.51.61.61.0

GUS 효소 활성은 독립 담배형질전환체의 오존처리(+) 및 처리되니 않은(-) 배지 늙은 잎의 단백질 추출물의 형광계로 결정한다.

전이유전자 담배선은 박테리아 GUS-리포터 유전자를 가지는 융합의 Vstl-프로모터의 다양한 5'-삭제를 포함한다. FO-형질전환체 및 F1-식물(11주령)이 10시간 동안 100nL/L의 오존으로 처리되고 계속적으로 2시간 동안 오염되지 않은 공기에서 후배양된다. 평균값±표준에러; 모든 분석은 이중의 실험으로서 완성된다.

(서열 조약)

(ⅰ) 출원인:

(A) 이름:게에스에프-포르숭첸트룸 퓨어 움벨트 운트 게준트하이트 게엠베하

[Reserarch Center for Environment and Health Inc.]

(B) 스트리트: 잉골스스태터 란드스트리트1

(C) 위치: 오버쉬라이쓰하임

(E) 국가: 독일연방공화국

(F) 우편번호: 85764

(A) 이름: 바이어 아게

(B) 스트리트: 바이어베르크

(C) 위치: 레버쿠젠

(E) 국가: 독일연방공화국

(F) 우편번호: 51368

(ⅱ) 발명의 명칭: 식물의 오존유도 유전자 발현

(ⅲ) 서열번호: 3

(ⅳ) 읽기쉬운 컴퓨터 버전:

(A) 데이터 케리어: 플로피디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환성

(C) 작동시스템: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: 릴리즈 #1.0, 버전#1.30(EPA)의 특허

서열번호: 1

서열의 길이: 161 염기쌍

서열의 타입: 뉴클레오타이드

쇄의 수: 2본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: Genome-DNA

서열번호: 2

서열의 길이: 33 염기쌍

서열의 타입: 뉴클레오타이드

쇄의 수: 단일쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: 핵산

서열번호: 3

서열의 길이: 34 염기쌍

서열의 타입: 뉴클레오타이드

쇄의 수: 단일쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: 핵산

Claims

식물 DNA 서열:
제1항에 있어서, 포도덩굴(비티스 비니페라(Vitis vinifera))로부터 생성된 DNA 서열.
제1항 또는 제2항에 있어서, 스틸벤합성효소 유전자, Vstl에 자연적으로 함유되어 있고, 염기쌍 -270 내지 -430에 결합된 DNA 서열.
적어도 제1항에 기재된 DNA 서열이 없는 포고넝굴로부터의 스틸벤합성효소 유전자, Vstl의 포로모터 영역.
제4항에 있어서, 단지 번역 시작으로부터 염기쌍 -270까지의 서열 범위를 포함하는 프로모터 영역.
제4항 또는 제5항에 있어서, 식물세포에 병원체 유도된 유전자 발현을 전달하는 프로모터 영역.
제1항에 기재된 DNA 서열 또는 그의 최소한의 단편이 유도된 가상의 핵산분자.
제7항에 있어서, 상기 분자에 함유된 코딩영역의 오존유도성 발현을 식물에 가능하게 하는 가상의 핵산분자.
제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 기재된 DNA 서열, 프로모터 영역 또는 가상의 핵산분자 또는 그의 단편을 함유하는 벡터.
상기 식물의 자손은 물론 상기 식물 및 원형질체, 식물세포, 칼리, 종자, 괴경(tuber) 또는 커팅 등의 증식물질 뿐 아니라, 제1항 내지 제9항 중 어느 한항에 기재된 DNA 서열, 프로모터 영역 또는 가상의 핵산분자를 함유하는 전이유전자 식물.
DNA 서열

의 존재(자연상태에서 존재) 또는 자연적으로 오존유도성 유전자의 오존유도성 발현을 더 이상 나타내지 않는 그의 하나 이상의 단편의 결여에 기인하는 전이유전자 식물.
제11항에 있어서, 병 저항 유전자의 오존유도성 발현이 크게 감소된 전이유전자 식물.
제11항 또는 또는 제12항에 있어서, 포도덩굴로부터의 스틸벤 합성유전자, 특히 Vstl 유전자의 오존유도성 발현이 매우 감소된 전이유전자 식물.
제10항에 있어서, 제1항에 기재된 DNA 서열 또는 최소한의 그의 단편의 도입, 상기 DNA 서열이 자연적으로 일어난 유전자의 오존유도성 유전자 발현이 일어나는 전이유전자 식물.
제14항에 있어서, 그들 유전자의 오존유도성 발현이 일어나고, 식물에서의 유전자 생성물이 반응성 산소종의 독성를 제거할 수 있는 전이유전자 식물.
제14항 또는 제15항에 있어서, 촉매효소 또는 과산화물디스뮤타아제 유전자의 오존유도성 발현이 일어날 수 있는 전이유전자 식물.
제14항에 있어서, 리포터 유전자의 오존유도성 발현이 일어날 수 있는 전이유전자 식물.
제10항 내지 제17항 중 어느 한항에 있어서, 장식용 식물 또는 나무 뿐 아니라 대두, 평지, 토마토, 사탕무, 감자, 목화, 담배 등의 특히 유용한 식물인 쌍자엽의 전이유전자 식물.
제10항 내지 제17항 중 어느 한항에 있어서, 귀리, 밀, 호밀, 보리, 쌀 밀 또는 옥수수 등의 특히, 곡류인 단자엽의 전이유전자 식물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한항에 기재된 DNA 서열, 프로모터영역 또는 가상의 핵산분자, 또는 그것으로부터 유도된 DNA 서열을 함유하는 원형질체를 포함하는 전이유전자 식물세포.
DNA서열

의 존재(자연상태에서 존재) 또는 자연적으로 오존유도성 유전자의 오존유도성 발현이 더 이상 나타나지 않는 그의 하나 이상의 단편의 결여에 기인하는, 원형질체를 포함하는 전이유전자 식물세포.
제20항에 있어서, 제1항에 기재된 DNA서열 또는 최소한의 그의 단편의 도입으로, 상기 DNA서열이 자연적으로 일어나지 않는 유전자의 오존유도성 유전자 발현이 일어날 수 있는 전이유전자 식물세포.
자연적으로 오존유도성의 방어유전자의 오존유도성 발현이 제1항에 기재된 DNA 서열, 또는 상기 DNA 서열 또는 그로부터 유도된 DNA 서열을 자연적으로 포함하는 방어유전자에서 최소한의 그의 단편을 삭제하는 것에 의해 크게 감소되거나 제거되는 전이유전자 식물 또는 식물세포를 생산하기 위한 방법.
제23항에 있어서, 스틸벤합성효소 유전자의 오존유도성 발현이 크게 감소되거나 제거되는 전이유전자 식물 또는 식물세포를 생산하기 위한 방법.
제23항 또는 제24항에 있어서, 포도덩굴로부터의 Vstl유전자의 오존유도성 발현이 크게 감소되거나 제거되는 전이유전자 식물 또는 식물세포를 생산하기 위한 방법.
오존에 의해 자연적으로 유도되지 않거나 연속적으로 유도되지 않는 하나 또는 몇 개의 유전자의 발현이 제1항에 기재된 DNA 서열 또는 그의 최소한의 단편의 도입으로 오존유도성이 되는 전이유전자 식물 또는 식물세포의 생산을 위한 방법.
제26항에 있어서, 하나 또는 몇 개의 촉매효소 및/또는 과산화물디스뮤타아제 유전자가 오존을 통해 유도되는 전이유전자 식물 또는 식물세포의 생산을 위한 방법.
제26항에 있어서, 하나 이상의 리포터 유전자가 오존을 통해 유도되는 전이유전자 식물 또는 식물세포의 생산을 위한 방법.
제1항에 기재된 DNA 서열 또는 그의 최소한의 단편의 삭제 또는 비활성을 통해 제1항에 기재된 DNA 서열 또는 그로부터 유도된 DNA 서열을 자연적으로 함유하는 자연적으로 오존유도성인 방어유전자의 오존유도성능을 제거하기 위한 방법.
제29항에 있어서, 유전자가 스팁벤합성효소 유전자인 자연적으로 오존유도성인 방어유전자의 오존유도성능을 제거하기 위한 방법.
제29항 또는 제30항에 있어서, 유전자가 포도덩굴로부터의 Vstl 유전자인 자연적으로 오존유도성인 방어유전자의 오존유도성능을 제거하기 위한 방법.
오존을 통해 자연적으로 유도성이 아니거나 연속적으로 유도성이 아닌 유전자에 제1항에 기재된 DNA 서열 또는 그의 최소한의 단편을 삽입함으로서 전이유전자 식물 또는 식물세포에 오존유도성 성질을 생성시키기 위한 방법.
식물의 유전자에서 오존반응성 서열을 탐지하게 위한 제1항에 기재된 DNA 서열 또는 그의 단편의 용도.
전이유전자 식물 또는 식물세포에서 오존유도성 특성을 생성하기 위한 제1항에 기재된 DNA 서열 또는 그의 단편의 용도.
오존농도의 질적 및/또는 양적인 결정을 위해 바이오모니터로서 사용할 수 있는 제17항에 기재된 전이유전자 식물을 생산하기 위한 제1항에 기재된 DNA 서열 또는 그의 단편의 용도.
전이유전자 식물에서 병에 대한 오존유도성 저항성 뿐 아니라 더 큰 병원체 유도성을 생성하기 위한 제4항 내지 제6항 중 어느 한항에 기재된 프로모터 영역의 용도.