JP2002523103A

JP2002523103A - 非宿主植物病害抵抗性遺伝子の新しい同定方法

Info

Publication number: JP2002523103A
Application number: JP2000567722A
Authority: JP
Inventors: ローメンズ，カイアス・エム・テイ; ソーズ，キヤサリン・エム・エム; ヤン，ホア; チヤン，ペイ
Original assignee: モンサントカンパニー
Priority date: 1998-08-31
Filing date: 1999-08-31
Publication date: 2002-07-30
Also published as: AU5796099A; WO2000012735A3; CN1333833A; AU6240899A; CA2341324A1; JP2002524056A; WO2000012736A9; EP1108044A2; WO2000012735A2; WO2000012735A9; US20110104681A1; BR9913653A; BR9913651A; US7138273B2; US8093454B2; US20030152975A1; EP1119631A2; US6544733B1; CA2340937A1; WO2000012736A2

Abstract

(57)【要約】本発明は植物中の病害抵抗性遺伝子を単離するための新しい方法を記述する。本方法は、罹病性植物中で非宿主抵抗性植物から単離された多数のＲ−遺伝子ホモログまたは非宿主誘導性遺伝子を一過性に発現させることを教示する。これらの植物体は病害抵抗性に関して、または病原体−エリシターへのばく露に過敏感反応で反応する能力に関して、スクリーニングできる。これらのＲ−遺伝子はタバコにおいて、遍在性のフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）エリシターＩＮＦ１の存在に依存する過敏感反応を誘発する。記載されるＲ−遺伝子は、フィトフトラ・インフェスタンスに対する抵抗性を付与する初めての単離Ｒ−遺伝子であり、しかも非宿主抵抗性に関与する初めてのＲ−遺伝子であると予想される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、非宿主抵抗性で機能する遺伝子を迅速に同定するための新しい方法
に関する。また本発明は、この方法によって同定される遺伝子であって、罹病性
植物で発現させると病害抵抗性のレベルを増進する遺伝子に関する。

【０００２】発明の背景遺伝的多様性は植物とその病原体の間の均衡のとれた進化の重要な要因である
。自然系では異系交配植物集団が雑多な病原体集団と相互作用する。この相互作
用はしばしば植物中の抵抗性（Ｒ−）遺伝子の存在と、病原体中の非病原性（ａ
ｖｒ）遺伝子の存在に依存する。異系交配植物はＲ−遺伝子のプールを共有し、
植物病原体はａｖｒ遺伝子によって直接または間接的に産生される様々なエリシ
ターを産生する。感染性病原体によって産生されるエリシターの一つを何らかの
方法で認識するＲ−遺伝子を含有する個々の植物は、その病原体に対して抵抗性
である。

【０００３】Ｒ−遺伝子が媒介する抵抗性は通常、感染部位での急速な壊死として観察され
る過敏感反応（ＨＲ）をもたらす。活性化されたＲ−遺伝子はアポトーシス細胞
死につながるシグナル伝達事象を誘発するらしく、そのアポトーシス細胞死が、
侵入病原体が感染部位を越えて広がるのを防止し、感染していない隣接細胞にお
ける抵抗性を誘発するのだろう。

【０００４】過去５年間で多くのＲ−遺伝子がクローン化されている。最も遍在性の高い種
類のＲ−遺伝子は、Ｃ末端ロイシンリッチリピート、Ｎ末端ヌクレオチド結合部
位、およびＧＬＰＬＡＬというコンセンサス配列を持つ保存された一続きのアミ
ノ酸を有するタンパク質をコードする。この種のＲ−遺伝子の例は、Ｒｐｓ２（
Ｂｅｎｔら、１９９４）、Ｎ（Ｗｈｉｔｈａｍら、１９９４）、Ｌ６（Ｌａｗｒ
ｅｎｃｅら、１９９５）、Ｍ（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９７）およびＲｐｍｌ
（Ｇｒａｎｔら、１９９５）である。Ｒ−遺伝子が媒介するシグナル伝達に関与
するタンパク質の同定にも進歩があった。最近の論文には、Ｒ−遺伝子シグナル
伝達へのプロテインキナーゼ、転写因子と推定されるものおよびリパーゼ様タン
パク質の関与が報告されている（Ｉｎｎｅｓ、１９９８に総説がある）。最近、
これらのシグナル伝達成分の工学的操作が、植物における病害防除レベルの向上
につながりうることが示された（Ｃａｏら、１９９８）。

【０００５】Ｒ−遺伝子はある病原体の全ての遺伝子型に対して防護を与えるのではない、
すなわち、ある種に含まれる病原体は全てが同じエリシターを産生するのではな
いと考えられる。したがって異系交配集団の感染により、その集団の一部だけが
生き残ることになるだろう。現代の農業はおそらく植物と病原体の間の均衡を乱
すものだろう。数十年前なら影響を受ける植物の数が比較的限られていたであろ
う病害の発生も、現在では破壊的な流行を引き起こしうる。

【０００６】病害による大きな損失を防止するために、植物育種家は最も重要な病原体系統
に対する抵抗性を遺伝子移入しようと試みる。これは、ほとんどの場合、際限の
ない戦いである。なぜなら、ある病原体の１つまたは数個の遺伝子型に対する抵
抗性は、他の遺伝子型の出現を選択するからである。例えば、抵抗性野生ジャガ
イモ種ソラヌム・デミススム（Ｓｏｌａｎｕｍｄｅｍｉｓｓｕｍ）から得た１
１個のＲ−遺伝子を栽培罹病性ジャガイモ品種に遺伝子移入したところ、いずれ
の場合も、病原体フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ
ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）の病原性遺伝子型が出現した。古典的育種は定義として
交雑計画に基づくものであり、したがって同じ植物種の異なるアクセッション（
ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）または栽培品種間、または性的に和合する植物種間で、抵
抗性形質を伝達することしかできない。この抵抗性はしばしば「宿主（ｈｏｓｔ
）」抵抗性と呼ばれる。次に挙げる病原体を含む数多くの病原体の一時的防除が
、Ｒ−遺伝子の遺伝子移入によって得られている：フィトフトラ・インフェスタ
ンス、フィトフトラ・メガスペルマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｍｅｇａｓｐ
ｅｒｍａ）、プクキニア・グラミニス（Ｐｕｃｃｉｎｉａｇｒａｍｉｎｉｓ）
、プクキニア・レコンヂタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａｒｅｃｏｎｄｉｔａ）、プクキ
ニア・ソルギ（Ｐｕｃｃｉｎｉａｓｏｒｇｈｉ）、プクキニア・コロナタ（Ｐ
ｕｃｃｉｎｉａｃｏｒｏｎａｔａ）、プクキニア・ヘリアンチ（Ｐｕｃｃｉｎ
ｉａｈｅｌｉａｎｔｈｉ）、プクキニア・ストリイホルミス（Ｐｕｃｃｉｎｉ
ａｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ）、エリシフェ・グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ
ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ウスチラゴ・ホルデイ（Ｕｓｔｉｌａｇｏｈｏｒｄｅｉ
）、ウスチラゴ・アベネ（Ｕｓｔｉｌａｇｏａｖｅｎａｅ）、ウロミセス・フ
ァセオリ（Ｕｒｏｍｙｃｅｓｐｈａｓｅｏｌｉ）、ペロノスポラ・ファリノサ
（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｆａｒｉｎｏｓａ）、シュードモナス・シリンゲ（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅ）、キサントモナス・オリゼ（Ｘａ
ｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅ）、クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄ
ｏｓｐｏｒｉｕｍｆｕｌｖｕｍ）、トビイロウンカ、アブラムシ、コムギタマ
バエおよびタボコモザイクウイルス。

【０００７】ある特定の病原体のほとんどの系統に対して抵抗性を与えるＲ−遺伝子がいく
つか同定されている。特に興味深いものは、キサントモナス・オリゼのほとんど
の系統を防除するコメＸａ２１遺伝子（Ｍａｚｚｏｌａら、１９９４；Ｓｏｎｇ
ら、１９９５）、ほとんどの葉さび病に対する抵抗性に関与するコムギＬｒ３４
遺伝子、植物をほとんどすべての黒さび病から防護するオオムギＲｐｇ１遺伝子
である。しかしこれらのＲ−遺伝子は稀であり、新しい攻撃的病原型によって破
壊されうる。

【０００８】広域かつ永続的な病害防除を与えるが古典的育種では得がたい抵抗性の優れた
供給源は、いわゆる「非宿主（ｎｏｎ−ｈｏｓｔ）」抵抗性である。ある植物種
またはそのごく近縁の種の性的に和合する全てのアクセッションおよび栽培品種
が、ある特定の病原体の全ての遺伝子型に対して抵抗性である場合、その植物種
は非宿主抵抗性を示す。それらの植物種内には罹病性の構成要素がないので、非
宿主抵抗性の遺伝的根拠を決定することは不可能である。

【０００９】能動的な非宿主抵抗性に関与することが知られている遺伝子は、現在のところ
クローン化されていない。しかしそのような遺伝子は宿主抵抗性を示す供給源か
ら単離されるＲ−遺伝子と似ている可能性はある。この仮説の裏付けは、フィト
フトラ・インフェスタンス（Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）と非宿主植物種ニコチ
アナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）（タバコ）の間の相互
作用に関する研究から得られる。タバコの抵抗性はＨＲによって感染に反応する
その能力と相関することから、フィトフトラ・インフェスタンスに対するタバコ
の抵抗性がＲ−遺伝子によって制御される能動的防御機序に基づくことが示唆さ
れる（Ｋａｍｏｕｎら、１９９７）。したがって、タバコの非宿主抵抗性は「能
動的」であり、既成の病原体抑制物質の存在または病原体の成長に不可欠な因子
の不在などの要因に基づく「受動的」抵抗性とは異なるようである（Ｒｉｄｅ、
１９８５）。

【００１０】特定のクローン化非宿主抵抗性遺伝子を罹病性作物で発現させると、現代の農
業に必要な広域かつ永続的な病害抵抗性が得られると予想できる。しかし、非宿
主抵抗性遺伝子を遺伝学に基づく方法で単離することは不可能である。そこで本
発明者らは、能動的非宿主抵抗性に関係する多数の遺伝子の単離とスクリーニン
グに基づく新しい技術を開発した。このスクリーニングは、特定の標的病原体に
対して罹病性でありしかも形質転換を極めて受けやすい植物で行なわれる。この
技術を実施することにより、罹病性植物中で発現させた場合に病害抵抗性のレベ
ルを増進するまたは増進すると期待される多くの遺伝子が同定された。

【００１１】発明の要約本発明は、罹病性植物中で発現させた場合に抵抗性のレベルを増進する遺伝子
に関して、非宿主抵抗性に関係する遺伝子をスクリーニングする方法であって、
病原体感受性植物の組織をそれらの遺伝子で形質転換し、形質転換された組織を
病原体またはそのエリシターで攻撃し、強化された防御および／またはＨＲ反応
を観察することによる方法に関する。本発明の具体的一態様では、タバコ由来の
Ｒ−遺伝子のホモログを遺伝子増幅によって同定し、それらをニコチアナ・ベン
タミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉にフィトフトラ
・インフェスタンスのＩＮＦ１エリシターと同時形質転換し、機能性を表す過敏
感反応の存在についてスクリーニングする。別の実施形態では、非宿主植物では
標的病原体によって誘導されるが、罹病性宿主では誘導されない（または同じ程
には誘導されない）遺伝子をまず選択し、次に、ニコチアナ・ベンタミアナ（Ｎ
．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物体の葉で一過性に過剰発現させた場合に細菌
病原体シュードモナス・タバキ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｔａｂａｃｉ）など
のモデル病原体に対する抵抗性を増進する能力について前記遺伝子をスクリーニ
ングすることにより、非宿主抵抗性に関係する遺伝子が同定される。

【００１２】本発明は、一実施形態として、フィトフトラ・インフェスタンスに対する病害
抵抗性を植物に付与できる新規核酸配列（配列番号５７および配列番号１〜１０
および配列番号５８、６０、６２）を提供する。本発明のもう一つの実施形態は
、植物におけるフィトフトラ・インフェスタンスに対する病害抵抗性に関与する
新規タンパク質配列（配列番号１１〜２０および配列番号５９）を提供する。

【００１３】本発明のさらなる実施形態としてフィトフトラ・インフェスタンスに対する抵
抗性を増進する核酸配列を含有する植物細胞またはトランスジェニック植物およ
びそのような植物から得られる種子または子孫が提供される。配列番号５７の核
酸配列を含有するトランスジェニック植物、その種子または子孫は、この核酸配
列を欠くが他の点では類似する植物と比較して、フィトフトラ・インフェスタン
スまたは他の真菌病原体による病害に対する抵抗性、またはフィトフトラ・イン
フェスタンスまたは他の真菌病原体に対する過敏感反応を示す。配列番号６０の
核酸配列を含有するトランスジェニック植物、その種子または子孫は、この核酸
配列を欠くが他の点では類似する植物と比較して、フィトフトラ・インフェスタ
ンスまたは他の真菌病原体による病害に対する抵抗性、またはフィトフトラ・イ
ンフェスタンスまたは他の真菌病原体に対する過敏感反応を示す。また、真菌病
原体に対して増進された抵抗性を示すトランスジェニック植物を作出する、関連
の方法であって、植物細胞中にＲ−タンパク質をコードする核酸配列を導入する
ことによって形質転換細胞を作成し、当該核酸配列を欠くが他の点では類似する
植物と比較して、選択された１または複数の真菌病原体に対して抵抗性を示すト
ランスジェニック植物を、そこから再生させることからなる方法も提供する。

【００１４】また本発明は、植物細胞に真菌病原体に対する抵抗性を付与する関連核酸配列
の同定およびそのような真菌病原体に対して抵抗性であるトランスジェニック植
物の作出に役立つ組換えプラスミド、形質転換微生物、プローブ、分子マーカー
およびプライマーを製造するための、本明細書に開示するＤＮＡ配列またはその
生物学的機能等価物の使用も包含する。

【００１５】本発明の上記の態様および他の態様は、以下の詳細な説明と添付の図面から、
より明らかになるだろう。

【００１６】図面の簡単な説明図１は、バイナリーコスミドベクター０４５４１および０４５４１ＭのＴ−Ｄ
ＮＡ構造を表す図である。ＬＢ＝左境界配列、ＲＢ＝右境界配列、Ｐ−３５Ｓ＝
カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、ＮＰＴ＝ネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼ遺伝子、ｏｃｓ３’＝オクトピンシンターゼ遺伝子の終
結配列、Ｐ−ＦＭＶ＝ゴマノハグサモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、ｓ
ｐ＝ＰＲ１ａのシグナルペプチドをコードする配列、ｎｏｓ３’＝ノパリンシン
ターゼ遺伝子の終結配列。図は一定の縮尺では描かれていない。ＩＮＦ１を含有
するＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩＤＮＡ断片の向きは反対でもよい。

【００１７】図２は、ｐＭＯＮ１１７７０のプラスミド地図を表す図である。

【００１８】図３は、ＩＮＦ１誘導性ＨＲの増進に関与する１０種類のＲ−遺伝子ホモログ
の推定部分アミノ酸配列（配列番号１１〜２２）の整列を表す図である。

【００１９】図４は、ｐＭＯＮ１７２２７のプラスミド地図を表す図である。

【００２０】図５は、ｐＭＯＮ３０６５６のプラスミド地図を表す図である。

【００２１】図６は、ｐＭＯＮ３０６２０のプラスミド地図を表す図である。

【００２２】図７は、ｐＭＯＮ３０６２１のプラスミド地図を表す図である。

【００２３】配列表の配列の簡単な説明配列番号１〜１０は、ニコチアナ・ベンタミアナにおけるＩＮＦ１依存性ＨＲ
を増進するタバコＲ−遺伝子ホモログの部分配列を示す。

【００２４】配列番号１１〜２０は、ＩＮＦ１誘導性ＨＲの増進に関与するＲ−遺伝子ホモ
ログ（配列番号１〜１０）の推定部分アミノ酸配列である。

【００２５】配列番号２１〜３０は、クラスＩＲ−遺伝子ホモログの１０種類のサブクラ
スを代表する配列である。

【００２６】配列番号３１〜３６は、クラスＩＩＲ−遺伝子ホモログの６種類のサブクラ
スを代表する配列である。

【００２７】配列番号３７〜３９は、抗微生物ペプチドホモログを単離するために使用され
るプライマーである。

【００２８】配列番号４０〜４５は、クラスＩＲ−遺伝子ホモログを単離するために使用
されるプライマーである。

【００２９】配列番号４６〜４８は、クラスＩＩＲ−遺伝子ホモログを単離するために使
用されるプライマーである。

【００３０】配列番号４９〜５０は、ＰＲ１ａ遺伝子のシグナルペプチドを単離するために
使用されるプライマーである。

【００３１】配列番号５１〜５２は、ＩＮＦ１遺伝子をバイナリーコスミドベクターにクロ
ーン化するために使用されるプライマーである。

【００３２】配列番号５３〜５４は、ＩＮＦ１遺伝子をｐＧＥＸベクターにクローン化する
ために使用されるプライマーである。

【００３３】配列番号５５〜５６は、フィトフトラ・ソーヤ（Ｐ．ｓｏｊａｅ）のエリシ
ターを単離するために使用されるプライマーである。

【００３４】配列番号５７は、Ｅｎｈ３遺伝子を表すゲノム配列である。

【００３５】配列番号５８は、ＴＯＢ−Ｆ１２のＤＮＡ配列である。

【００３６】配列番号５９は、ＴＯＢ−Ｆ１２のタンパク質配列である。

【００３７】配列番号６０は、Ｎｈｒ１遺伝子のＤＮＡ配列である。

【００３８】配列番号６１〜６６は、Ｎｈｒ１遺伝子を単離するために使用されるプライマ
ーである。

【００３９】発明の詳細な説明定義本明細書と特許請求の範囲を、その用語に与えられた範囲を含めて、明確に矛
盾なく理解できるように、次の定義を述べておく。

【００４０】植物病害抵抗性（Ｒ−）遺伝子は、植物が病原体または昆虫と接触したときに
最終的にはその病原体または昆虫に対するその植物の防御反応につながるシグナ
ル伝達経路の誘導に直接または間接的に関与するタンパク質をコードする核酸単
離物である。抵抗性遺伝子産物はエリシターと呼ばれる病原体シグナル分子に反
応して活性化される。

【００４１】非宿主誘導性遺伝子（ｎｏｎ−ｈｏｓｔｉｎｄｕｃｉｂｌｅｇｅｎｅ、Ｎ
ＨＩ）は、非宿主植物において病原体によって迅速に誘導される遺伝子である。

【００４２】Ｒ−タンパク質は、Ｒ−遺伝子によってコードされる産物である。

【００４３】植物病害抵抗性（Ｒ−）遺伝子座は、少なくとも１つの機能的Ｒ−遺伝子を含
有することがわかっているまたは少なくとも１つの機能的Ｒ−遺伝子を含有する
と考えられる、昆虫または病害抵抗性に関与する遺伝学的に定義された座である
。

【００４４】Ｒ−遺伝子ホモログは、先に単離された１または複数のＲ−遺伝子と有意な相
同性を有する予想アミノ酸配列を持つＤＮＡ配列である。これはヌクレオチド結
合部位とＧＬＰＬＡＬ領域の両方を含有すべきである。

【００４５】有意な相同性は、通常のハイブリダイゼーション条件で参照配列とハイブリダ
イズするＤＮＡ配列と定義される。上記のハイブリダイゼーション条件は、好ま
しくは、６×ＳＳＣ、５×デンハルト液、１００ｍｇ／ｍＬ魚精子ＤＮＡ、０．
１％ＳＤＳ中、５５℃で、ハイブリダイズさせるのに十分な時間（例えば数時間
〜終夜）にわたるハイブリダイゼーションの後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中
、室温で各１５分間の洗浄を２回および０．５〜１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中
、５５℃で各１５分間の洗浄を２回行ない、次にオートラジオグラフィーを行な
うことを指す。通例、上記核酸分子は、ハイブリダイゼーション混合物を０．１
×ＳＳＣ中、５５℃、好ましくは６０℃、より好ましくは６５℃で、少なくとも
１回の洗浄した時にハイブリダイズする能力を持つ。

【００４６】Ｒ−遺伝子サブクラスは、アミノ酸レベルで７０％を超える同一性を持つか、
植物ゲノムサザンブロット上でクロスハイブリダイズする一群のＲ−遺伝子ホモ
ログからなる。

【００４７】機能的Ｒ−遺伝子は、病原体または昆虫に対する植物抵抗性反応に関与するタ
ンパク質をコードする遺伝子である。

【００４８】Ｒ−遺伝子供給源は、１つまたはいくつかの対象病原体に対して病害抵抗性を
示し、その抵抗性を媒介するＲ−遺伝子を含有する可能性がある植物である。能
動的Ｒ−遺伝子の存在の指標は（１）抵抗性が過敏感反応と関係すること、およ
び（２）抵抗性が単一遺伝子座の存在に依存することである。

【００４９】Ｒ−遺伝子シグナル伝達経路は、特異的病原体エリシターにより、Ｒ−遺伝子
産物との直接または間接的相互作用を介して活性化されうる経路であり、活性化
されると、しばしば過敏感反応、感染特異的遺伝子発現の誘導および病害抵抗性
を誘発する経路である。

【００５０】過敏感反応（ＨＲ）は病原体に対する一つの植物防御である。これは、活性酸
素種の生成、抗微生物化合物の産生および宿主細胞壁の補強と相互に関係する感
染部位近くの迅速な細胞壊死を包含する。ある与えられた宿主でＨＲを引き出す
病原体はその宿主では非病原性であり、その宿主は抵抗性であり、その植物−病
原体相互作用は不和合性である。

【００５１】宿主抵抗性とは、この抵抗性を示さない少なくとも１つの他の栽培品種、生態
型またはアクセッションを含む植物種の一員である栽培品種、生態型またはアク
セッションの病害または昆虫抵抗性をいう。

【００５２】非宿主抵抗性とは、ある特定の植物種および性的に和合する近縁植物種の全て
の栽培品種、生態型またはアクセッションが共有する病害または昆虫抵抗性をい
う。

【００５３】能動的非宿主抵抗性は、感染時の防御反応の活性化に基づくことが知られてい
るまたは感染時の防御反応の活性化に基づくと考えられる非宿主抵抗性である。
能動的非宿主抵抗性は、（１）病原体の分化または成長に不可欠な因子の不在、
（２）既成の病原体成長抑制物質の存在、（３）他の「受動的」理由に基づかな
い。

【００５４】非宿主抵抗性遺伝子は、非宿主植物から単離されたＲ−遺伝子、ＮＨＩまたは
エリシター結合タンパク質をコードする遺伝子であり、罹病性宿主における植物
ＨＲおよび／または防御反応を増進する。

【００５５】エリシターは、病原体によって産生され、植物における反応を誘発する分子ま
たはペプチドである。エリシターの産生は病原体非病原性遺伝子によって制御さ
れる。

【００５６】植物系とは、一過性形質転換により多重遺伝子ファミリーのメンバーをスクリ
ーニングするために使用できる植物種をいう。

【００５７】発現とは、構造遺伝子などのコードＤＮＡ分子が受けてポリペプチドを産生す
る、転写および翻訳などの細胞内過程の組み合せを意味する。

【００５８】プロモーターは、構造遺伝子に発現制御要素を与えるＤＮＡ配列またはＤＮＡ
配列群の認識部位であり、ＲＮＡポリメラーゼはこの部位に特異的に結合して、
その遺伝子のＲＮＡ合成（転写）を開始する。

【００５９】再生は、植物細胞（例えば植物プロトプラストまたは外植体）から植物を成長
させる過程である。

【００６０】構造コード配列とは、その構造コード配列のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ
）への転写と、それに続くそのｍＲＮＡの所望のペプチド、ポリペプチドまたは
タンパク質産物への翻訳の結果、細胞によって作られるペプチド、ポリペプチド
またはタンパク質をコードするＤＮＡ配列をいう。

【００６１】安定形質転換は、外因性ＤＮＡ配列（例えばベクター、組換えＤＮＡ分子）を
細胞またはプロトプラストに導入する過程であって、その外因性ＤＮＡが染色体
に組み込まれるか、自律的に複製できる。

【００６２】一過性形質転換は、細胞またはプロトプラスト内に、プロモーターによって駆
動され終結シグナルが後ろに続いている１つまたはいくつかの遺伝子を保有する
外因性ＤＮＡ配列を、導入された遺伝子を限られた期間発現させる目的で、導入
する過程である。

【００６３】形質転換細胞は、その細胞への外因性ＤＮＡ分子の導入によってそのＤＮＡが
改変されている細胞である。

【００６４】トランスジェニック細胞とは、形質転換細胞に由来する細胞、形質転換細胞か
ら再生される細胞、またはトランスジェニック生物に由来する細胞をいう。典型
的トランスジェニック細胞には、トランスジェニック植物から得られる形質転換
された植物細胞および体細胞（例えば葉、根、茎）または生殖細胞（胚細胞）な
どの特定細胞に由来する植物カルスが包含される。

【００６５】トランスジェニック植物は、形質転換された植物細胞またはプロトプラストに
由来する植物またはその子孫であって、その植物ＤＮＡが同じ株の天然非トラン
スジェニック植物には元来存在しない導入された外因性ＤＮＡ分子を含有するも
のである。「トランスジェニック植物」および「形質転換植物」という用語は、
当技術分野では、外因性ＤＮＡ分子を含有するＤＮＡを持っている植物を特徴づ
ける同義語として使用される場合があった。しかし、形質転換された植物細胞ま
たはプロトプラストから得られる再生植物またはカルスをトランスジェニック植
物と呼ぶ方が科学的には正しいと考えられ、本明細書ではこの用法に従う。

【００６６】ベクターは、宿主細胞中で複製できるＤＮＡ分子であって、そこに別のＤＮＡ
セグメントを、結合されたセグメントの複製が起こるように、有効な形で結合さ
せることができるＤＮＡ分子である。プラスミドは典型的ベクターである。

【００６７】植物という用語はここでは広い意味で使用され、分化した植物と、適当な条件
下で成熟した植物、その子孫およびその一部（例えばそのような植物の挿し木お
よび果実）に成長できる、例えばプロトプラスト、植物細胞、種子、小植物体な
どの未分化の植物材料とを指す。

【００６８】生物学的機能等価物とは、本発明の新規配列に対して配列類似性を示す配列ま
たは部分を含有し、本明細書に開示する配列と同じまたは類似する機能特性を示
す、本発明の核酸およびタンパク質に関する等価物をいう。

【００６９】本発明は、フィトフトラ属、エリシフェ属（Ｅｒｉｓｙｐｈｅ）、プクキニア
属、セプトリア属（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）、ウスチラゴ属、メランプソラ属（Ｍｅ
ｌａｍｐｓｏｒａ）、ブレミア属（Ｂｒｅｍｉａ）、ベンツリア属（Ｖｅｎｔｕ
ｒｉａ）、ウロミセス属、チルレチア属（Ｔｉｌｌｅｔｉａ）、リンコスポリウ
ム属（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ピレノフォラ属（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏ
ｒａ）、フルビア属（Ｆｕｌｖｉａ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ペレノスポラ属（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）
、シュードモナス・シリンゲ、キサントモナス属、クラドスポリウム属、コレト
トリクム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、タバコモザイクウイルス、ジャ
ガイモＹウイルス、ジャガイモＸウイルス、フィアロフォラ属（Ｐｈｉａｌｏｐ
ｈｏｒａ）、ヘテロデラ属（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）、コレトトリクム属、マグ
ナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、トビイロウンカ、ツマグロヨコバイ、
アブラムシ、シュードセルコスポレラ属（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌ
ｌａ）およびコムギタマバエを含む（ただしこれらに限らない）ウイルス、細菌
、真菌または線虫病原体を防除するための非宿主抵抗性遺伝子の単離を可能にす
るものである。また本発明は、機能的なＲ−遺伝子、ＮＨＩおよびエリシター結
合タンパク質コード遺伝子のＤＮＡ配列を提供すると共に、フィトフトラ・イン
フェスタンスを、またできればフィトフトラ属の他の種を防除するために、それ
によってコードされるポリペプチドを産生させるべく、そのようなＤＮＡ配列を
宿主細胞に挿入するための遺伝子コンストラクトおよび方法も提供する。

【００７０】本発明は、ＨＲおよび／または防御反応を増進する遺伝子を同定するためにＲ
−遺伝子、ＮＨＩおよびエリシター結合タンパク質コード遺伝子を罹病性植物中
で発現させることを教示するものである。そのような「機能的」遺伝子を迅速に
単離できることと、それに続くそれら非宿主抵抗性遺伝子の罹病性作物への移入
は、病害抵抗性栽培品種の開発を著しく容易にするだろう。ここに本発明者らは
、古典的遺伝学に基づかない方法を使って非宿主抵抗性遺伝子を単離する全く新
しい方法を記述する。本発明の方法は、古典的遺伝学に基づく方法を使用する代
わりに、植物試験系での機能的活性に関するＲ−遺伝子、ＮＨＩおよびエリシタ
ー結合タンパク質のスクリーニングに基づく。この新しいアプローチの最も重要
な帰結の一つは、抵抗性の供給源が、広域かつ永続的な防除に関与する遺伝子の
単離を可能にすると予想される能動的非宿主植物だということである。

【００７１】能動的非宿主抵抗性に関係する遺伝子のスクリーニング当業者は、非宿主植物を感染させて過敏感反応（ＨＲ）病斑の存在を調べる方
法など（ただしこれに限るわけではない）、様々な方法により、非宿主植物中の
機能的Ｒ−遺伝子の存在について分析することができ、そうすることで有用な抵
抗性供給源（Ｒ−遺伝子供与体）を選択することができるだろう。このＨＲは時
には局部病斑として肉眼的に観察することもできるだろう。しかし感染した葉組
織の顕微鏡分析が必要な場合も多い。ＨＲ細胞を可視化する一つの方法は、ラク
トフェノールブルーで染色することである。ＨＲ細胞の存在を自己蛍光によって
調べる方法など（ただしこれに限らない）、当技術分野でよく知られている他の
方法も植物病斑の検出に使用できる。Ｒ−遺伝子供与体としての非宿主植物の有
用性を増加させる他の因子（ただしそれを欠くことが欠格事由になるわけではな
い）としては、対象病原体由来の既知のエリシターが挙げられる。

【００７２】本発明の一態様として、タバコは、ジャガイモの疫病の病原であるフィトフト
ラ・インフェスタンスに対して広域かつ永続的な非宿主抵抗性を示す。この抵抗
性は感染時の過敏感反応と関係することから（Ｋａｍｏｕｎら、１９９７）、
フィトフトラ・インフェスタンスに対するタバコの抵抗性がＲ−遺伝子によって
制御される能動的防御機構に基づいていることが示唆される。フィトフトラ・イ
ンフェスタンスに対して機能的活性を持つタバコＲ−遺伝子のクローン化は、タ
バコＨＲの誘導の原因となるフィトフトラ・インフェスタンスのエリシターＩＮ
Ｆ１が既にクローン化されているという事実によって容易になる。少量のＩＮＦ
１ペプチドをタバコ葉の細胞間隙に注入するとＨＲの誘導が起こる（Ｋａｍｏｕ
ｎら、１９９７）。

【００７３】一態様として、ＤＮＡ断片を同定し、それらのＤＮＡ断片を使って、ＨＲに関
係する病害抵抗性またはＨＲに関係すると考えられる病害抵抗性を与える潜在的
Ｒ−遺伝子の多くのサブクラスまたは全てのサブクラスを可視化する。当業者は
、当技術分野でよく知られている方法を使って、「サブクラス特異的プローブ」
として使用できるこれらの断片を単離することができる。例えば（１）Ｒ−遺伝
子の多種多様なホモログの断片を増幅するために、Ｒ−遺伝子間で保存されてい
るドメインに特異的な縮重または非縮重Ｒ−遺伝子プライマーを設計し（保存さ
れたドメインの例はヌクレオチド結合部位およびＧＬＰＬＡＬモチーフである）
、（２）抵抗性供給源のゲノムに由来するＲ−遺伝子断片を配列決定して、それ
らをサブクラスに分類し（同じサブクラスのメンバー間の推定アミノ酸配列同一
性は約７０％をより高いことが好ましい）、および（３）各サブクラスを代表す
るＤＮＡ断片を全ゲノム植物ＤＮＡ消化物とハイブリダイズさせて、サブクラス
あたりのメンバーの総数を見積もる方法がある（ただし、これに限るわけではな
い）。次に、サブクラス特異的プローブを使って、抵抗性供給源のバイナリーコ
スミドライブラリーをスクリーニングする。これらのライブラリーは、全ゲノム
ＤＮＡを部分消化し、好ましくは約１５〜約２０ｋｂの断片、最も好ましくは約
２１〜約２５ｋｂの断片を、大腸菌とアグロバクテリウム・ツメファシエンス（
Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の両方で複製することができるバイナリーコス
ミドベクターのＴ−ＤＮＡ境界配列の間にサブクローニングすることによって構
築される（Ｊｏｎｅｓ、１９９２）。

【００７４】ｃＤＮＡライブラリーではなくバイナリーコスミドライブラリーの構築とスク
リーニングが好ましい。なぜなら（１）バイナリーコスミドの場合はさらなるク
ローニング工程を経ないでＲ−遺伝子のスクリーニングを行なうことができ、（
２）Ｒ−遺伝子のｃＤＮＡクローンの発現は特定の場合（例えばＲｐｓ２および
Ｎ）に、対応する非病原性遺伝子を持つ病原体に対する病害抵抗性を与えないこ
とが示されているからである。

【００７５】本発明によって提供されるＤＮＡ配列情報は、選択されたポリヌクレオチドの
遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする能力を持つＤＮＡ（またはＲＮＡ）配
列の調製を可能にすると考えられる。適当な長さの核酸プローブは、例えば最も
好ましくは配列番号１〜１０に同一な配列または好ましくは上記サブクラス特異
的プローブのいずれかなど、Ｒ−遺伝子ホモログの選択した配列を考慮した上で
調製できる。このようなＤＮＡおよび核酸プローブはニコチアナ属、ナス科植物
（Ｓｏｌａｎａｃｅｏｕｓ）および他の植物種中のＲ−遺伝子のサブクラスを選
択的に可視化できるので、様々な実施形態でとりわけ有用である。最も重要なこ
とに、これらのプローブは、機能的Ｒ−遺伝子を単離するための様々なアッセイ
に使用できる。Ｒ−遺伝子のホモログは、植物の分離集団における抵抗性の分離
を研究するためにも使用できる。このようにして、サザンブロット上で抵抗性と
同時分離するバンドを同定することができるだろう。これらのバンドは抵抗性に
関する厳格な分子マーカーとして機能することができ、そのような分子マーカー
として育種計画に使用できる。また、これらのバンドは分離するＲ−遺伝子自体
を可視化できる。したがって実施例に記載のＲ−遺伝子に相同な配列はＲ−遺伝
子のマッピングと単離の両方に役立ちうる。例えば本研究者らは、Ｒ−遺伝子に
相同なＤＮＡ断片（配列番号２１〜３６）を、フィトフトラ・インフェスタンス
のＵＳ−８遺伝子型に対する抵抗性に関して分離するジャガイモ植物体のＤＮＡ
を含有するサザンブロット上で、プローブとして試験した。配列番号２９の放射
標識ＤＮＡ断片を使用して、多くの抵抗性植物中に、罹病性植物には常に存在し
ない一つのバンドを同定することができた。

【００７６】特定の実施形態ではオリゴヌクレオチドプライマーを使用することが有利であ
る。そのようなプライマーの配列は、ＰＣＲ法によってＲ−遺伝子の所定のセグ
メントを検出、増幅または突然変異誘発する際に使用されるポリヌクレオチドを
使って設計される。その断片が安定かつ選択的な二本鎖分子を形成するのに十分
な長さであることを保証するには、少なくとも１４ヌクレオチド長のサイズが役
立つ。１４塩基より長いストレッチにわたって相補的な配列を持つ分子が一般に
好ましいが、ハイブリッドの安定性と選択性を増加させることによって、得られ
る特異的ハイブリッド分子の質と程度を改善するには、約１４〜約２０ヌクレオ
チドの（または所望によりさらに長い）遺伝子相補的ストレッチを持つ核酸分子
を設計することが一般に好ましいだろう。そのような断片は、例えば化学的手段
によってその断片を直接合成すること、米国特許第４，６８３，１９５号および
同第４，６８３，２０２号（これらは参照により本明細書に組み込まれる）のＰ
ＣＲ法などの核酸複製技術の応用、または適切なインサートと適当な制限部位を
含有する組換えプラスミドから選択したＤＮＡ断片を切り出すことなどによって
、容易に調製できる。

【００７７】バイナリーコスミドライブラリーのスクリーニングにより、Ｒ−遺伝子の少な
くとも一部を保有するコスミドが得られる。Ｒ−遺伝子に相同な配列の存在は、
縮重プライマーを使ったＰＣＲ増幅など（ただしこれに限らない）の当技術分野
周知の方法によって確認できる。当業者は簡単な方法を使って、それ自身のプロ
モーターによって駆動されそれ自身の終結シグナルが後ろに続いている完全長Ｒ
−遺伝子ホモログがＴ−ＤＮＡの境界配列の間に存在することの指標を得ること
ができるだろう。この方法は、Ｒ−遺伝子ホモログを保有する高濃度のアグロバ
クテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株（約１０^９コロニー形成単位／ｍ
Ｌ）を、ニコチアナ・ベンタミアナなどの植物の細胞間隙に注入すると、病原体
攻撃またはエリシター処理に依存しないＨＲの誘導が、注入の３〜６日後にしば
しば起こるという本発明者らの発見に基づいている。したがって植物における「
自発的」ＨＲを誘導するＲ−遺伝子ホモログの構造的および機能的配列は、おそ
らく完全長だろう。

【００７８】もう一つの実施形態として、Ｒ−遺伝子ではないがＲ−遺伝子活性化経路また
は病原体抵抗性につながる他の誘導経路で機能する遺伝子を同定することができ
る。これらの「非宿主誘導性遺伝子」（ＮＨＩ）は、非宿主植物中で病原体攻撃
時に発現されるが罹病性宿主植物では発現されないか発現の程度が低い遺伝子の
同定を可能にするＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ^ＴＭサブトラクションなどの技術を使っ
て単離することができる。最も興味深いリードを迅速に選択するために、これら
の候補遺伝子をニコチアナ・ベンタミアナなどの植物で一過性に発現させ、シュ
ードモナス・タバキなどのモデル病原体によって起こる病徴を制限するそれらの
能力について試験することができる。この目的に使用できる代替病原体は、タバ
コモザイクウイルス、ジャガイモＸウイルスおよびフィトフトラ・インフェスタ
ンスを含めて、ニコチアナ・ベンタミアナに感染する他の全ての病原体である。

【００７９】もう一つの態様として、抵抗性シグナル伝達で機能するエリシター結合タンパ
ク質を、酵母ツーハイブリッド法によって同定することができる。酵母ツーハイ
ブリッド系はタンパク質−タンパク質相互作用の研究に広く使用されている（Ｆ
ｉｅｌｄｓおよびＳｔｅｒｎｇｌａｎｚ、１９９４）。病原体エリシターを「ベ
イト（ｂａｉｔ）」ベクターにサブクローニングして、エリシターと相互作用す
る植物タンパク質の単離に使用することができる。次に、植物内で陽性候補を一
過性に発現させ、ＨＲおよび／または防御反応を誘導するそれらの能力について
試験する。原則的に、植物における防御反応を誘導できる全ての病原体エリシタ
ーおよび／または非病原性因子を、この方法により、それらの植物結合／相互作
用因子を単離するために使用できる。

【００８０】モデル系で非宿主抵抗性遺伝子を同定するには、このモデルが（１）一過性形
質転換を受けやすく、（２）標的および／またはモデル病原体に対する罹病性を
示し、（３）この病原体の特定のエリシターに対して非感受性を示さなければな
らない。非常に興味深い一つの候補植物系は、ニコチアナ・ベンタミアナである
。なぜなら、この植物系はアグロバクテリウムによる安定形質転換を著しく受け
やすく（Ｒｕｂｉｎｏら、１９９３）、アグロバクテリウムによる一過性の形質
転換を受けやすく、ダイズモザイクウイルス、サツマイモ斑紋モザイクウイルス
、サクラ属壊死性モザイクイラルウイルス、インゲンモザイクポティウイルス（
ｂｅａｎｃｏｍｍｏｎｍｏｓａｉｃｐｏｙｖｉｒｕｓ）および非病原性遺
伝子ａｖｒＰｔｏ（Ｒｏｍｍｅｎｓら、１９９５）を保有する細菌シュードモナ
ス・シリンゲ病原体などといった、タバコでは完全に防除される多くの病原体に
対して罹病性だからである。ニコチアナ・ベンタミアナは、他の農学的に重要な
ウイルス、真菌、細菌および線虫病原体、例えばフィトフトラ・インフェスタン
ス、フィトフトラ・ソーヤ、フィアロフォラ・グレガタ（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒ
ａｇｒｅｇａｔａ）、シュードモナス・ソラナケアルム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）およびフザリウム・オキシスポルムなど（た
だしこれらに限らない）に対しても、罹病性を示すと予想される。ジャガイモ、
トマトまたはダイズに感染する線虫も、特定の昆虫と共に、この一覧に含めるこ
とができる。数多くの病原体に対するニコチアナ・ベンタミアナの罹病性が、ニ
コチアナ・ベンタミアナを、機能的活性に関してＲ−遺伝子のホモログをスクリ
ーニングするための優れた植物系にしている。他の植物系にはニコチアナ・クレ
ベランヂイ（Ｎ．ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ）、ニコチアナ・タバクム（Ｎ．
ｔａｂａｃｕｍ）、ロタス・ヤポニクス（Ｌｏｔｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、
グリキネ・マクス（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）およびオリザ・サリバ（Ｏｒｙｚ
ａｓａｌｉｖａ）がある。

【００８１】当業者は、単離された非宿主遺伝子を、例えばこれらの遺伝子を保有するアグ
ロバクテリウム株で植物を形質転換するなどの様々な方法によって、機能的活性
に関してスクリーニングすることができる。それらの植物は一過性の（好ましく
はアグロバクテリウムによる）形質転換を著しく受けやすいと共に、標的病原体
に対して罹病性である。

【００８２】多数の遺伝子で植物を効率よく安定に形質転換する一つの方法は、それぞれに
特有の遺伝子を保有するアグロバクテリウム株を１０株ずつのグループに分けて
プールする方法である。この方法では、およそ５０回の形質転換しか必要でない
。次に、１形質転換あたり４０の植物体から種子をプールすることができる。病
害抵抗性についてスクリーニングするために、シードロットあたり約１６０の植
物体、すなわち合計８０００の植物体を、病原体に感染させることができる。

【００８３】標的病原体が既知のエリシターを産生する場合は、トランスジェニック植物を
そのエリシターに曝すことによって、スクリーニング作業を容易にすることがで
きる。機能的な非宿主抵抗性遺伝子を発現させるトランスジェニック植物は、こ
のエリシターに反応して、明確に観察できるＨＲを樹立するだろう。既知エリシ
ターの例は、フィトフトラ・メガスペルマの細胞壁から放出されるβ−グルカン
エリシター（Ｓｈａｒｐら、１９８４）、フィトフトラ・インフェスタンスによ
って産生されるアラキドン酸（Ｂｏｓｔｏｃｋら、１９８１）、フィトフトラ・
ソーヤの細胞外４２ｋＤａ糖タンパク質（Ｐａｒｋｅｒら、１９９１）およびフ
ィトフトラ属の種によって産生される１０ｋＤエリシチン（Ｙｕ、１９９５）で
ある。病原体感染に対して病害抵抗性を示すか、エリシターへのばく露時にＨＲで応
じるトランスジェニック植物は、様々な方法で機能的非宿主抵抗性遺伝子を同定
するために使用できる。例えば、Ｔ−ＤＮＡ特異的プライマーを使って、導入さ
れたＤＮＡの一部を増幅することができる。次いでこの増幅断片は、元の大腸菌
中の遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用できる
。陽性クローンの多くが機能的遺伝子を含有すると思われ、次にそれらを標準的
なプロトコルに従ってさらに分析し、サブクローニングすることができる。

【００８４】Ｋａｐｉｌａら（１９９７）に記載されているようなアグロバクテリウムによ
る一過性の遺伝子発現は、標的病原体に対する機能的活性に関して非宿主遺伝子
（Ｒ−遺伝子、ＮＨＩまたは推定上のエリシター結合タンパク質）をスクリーニ
ングするための安定形質転換に代わる方法である。標的病原体のエリシターをコ
ードする遺伝子がクローニングされている場合は、この系が好ましい。このアッ
セイは、他の植物種におけるＲ−遺伝子Ｃｆ４およびＣｆ９の機能を試験するた
め（ＰＣＲ出願ＷＯ９６／３５７９０）および安定なトランスジェニック植物を
作出することを必要とせずに特異的突然変異の効果を試験するための迅速で信頼
のおける方法として提案されているが、機能的活性に関して多数の遺伝子（最も
好ましくはＲ−遺伝子）をスクリーニングするための方法として提案されたこと
は一度もなかった。

【００８５】本明細書に記載される方法は、機能的Ｒ−遺伝子に関するホモログのスクリー
ニングに限らない。最も広い意味で、任意の大きな遺伝子ファミリーのメンバー
を機能的活性に関してスクリーニングすることができる。微生物に対する機能的
活性に関してスクリーニングすることができるＲ−遺伝子以外の遺伝子の一例は
、多数の感染特異的（ＰＲ）タンパク質類である。微生物を防御するその能力に
ついてはこれらの遺伝子のごく一部が試験されているに過ぎないが、本明細書に
記載の方法により、さらに多くのＰＲ遺伝子およびＰＲ遺伝子ホモログを迅速に
試験することができるだろう。もう一つの例は、ほとんどまたは全ての植物種に
おける大きな遺伝子ファミリー中に存在する小さい抗微生物ペプチドをコードす
る遺伝子に関するスクリーニングである。抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）の大半は
、偶数個のシステインを持ち、それらはすべてジスルフィド橋により対をなして
結合している。植物ＡＭＰは、一次構造レベルでの相同性に基づいて、チオニン
、植物デフェンシン、脂質転移タンパク質ならびにヘベイン型およびノッチン（
ｋｎｏｔｔｉｎ）型ＡＭＰに分類することができる（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔら、１
９９７）。ＡＭＰ間の相同性は、遺伝子増幅またはサザンブロット分析によるＡ
ＭＰホモログの単離を可能にするだろう。例えば、配列番号３７〜３９に示すプ
ライマーは、１またはいくつかの植物から単離されるゲノムＤＮＡから、多数の
ＡＭＰホモログを増幅するために使用できる。遺伝子増幅反応は、約１００ｎｇ
の鋳型ＤＮＡを使用し、推奨量のヌクレオチド、緩衝液およびＴａｑポリメラー
ゼを、１μＭのプライマー配列番号３７および０．５μＭのプライマー配列番号
３８または０．５μＭのプライマー配列番号３９と共に加えることによって行な
うことができる。増幅されたホモログは、それらＡＭＰの植物体内での発現を可
能にし、アグロバクテリウムに接合させることができるバイナリーベクターにク
ローン化できる。次にそれらのアグロバクテリウム株を、ニコチアナ・ベンタミ
アナなどの植物系の細胞間隙に個別にまたは２、３種類の株を組み合わせて注入
し、複数の被注入葉組織を、病害抵抗性に関して同時に試験することができる。

【００８６】上記の遺伝子発現系を使って、他の任意の遺伝子を、線虫または病原体に対す
る機能的活性について試験することができる。これには、抵抗性シグナル伝達お
よび／または防御反応に関与しＰｔｏやＰｔｉ１などのプロテインキナーゼをコ
ードする遺伝子；防御に関与する転写因子；細胞壁強化またはリグニン生合成に
関与するタンパク質；初期シグナル伝達に関与するタンパク質；ω−６−脂肪酸
デサチュラーゼ；抵抗性に関与するＧＴＰ結合タンパク質；Ｃｐｒ５、Ａｃｄ２
およびＬｓｄ１などのＳＡＲ／ＨＲ集束タンパク質（ｃｏｎｖｅｒｇｉｎｇｐ
ｒｏｔｅｉｎ）；Ｃｐｒ１、Ｃｐｒ６、Ｃｉｍ２、Ｃｉｍ３などのＨＲ／ＳＡＲ
分岐点より下流のＲ−遺伝子カスケード集束経路（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅｐ
ａｔｈｗａｙ）中のタンパク質；サリチル酸およびジャスモン酸生合成に関与す
るタンパク質；フィトアレキシン産生に関与するタンパク質；アポトーシスから
の防護に関与するタンパク質；ｍｌ−Ｏなどの広域抵抗性に関与する膜関連タン
パク質；シャペロンなどの植物ストレスに関与するタンパク質；微生物毒素の解
毒に関与するタンパク質；抗真菌製タンパク質遺伝子；Ｐａｄ４などのリパーゼ
と推定されるもの；およびエリシターによって誘導される上記以外のタンパク質
、例えばチトクロームＰ４５０類、ＡＣＣシンターゼ、ＧＤＰ解離抑制因子など
が包含される。

【００８７】罹病性宿主に病害抵抗性を付与するための機能的非宿主遺伝子のクローニング当業者は、同定された機能的遺伝子を、アグロバクテリウムによる形質転換な
ど（ただしこれに限らない）の様々な方法によって、望ましい品種だが罹病性で
ある植物細胞品種に導入することができる。機能的遺伝子を使って、裸子植物、
単子葉植物および双子葉植物を含む広い範囲の様々な植物細胞に病害抵抗性を付
与することができる。これらの遺伝子は上記の広い分類に含まれる任意の植物細
胞に挿入することができるが、それらは例えば次に挙げるような（ただしこれら
に限るわけではない）関心の持たれる作物ではとりわけ役に立つ：アカシア属（
Ａｃａｃｉａ）、アルファルファ、アネット、リンゴ、アンズ、チョウセンアザ
ミ、キバナスズシロ、アスパラガス、アボカド、オオムギ、マメ類、ビート、ブ
ラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリ、芽キャベツ、キャベツ、キャノーラ
、カンタループ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、セロリ、サクランボ、
コエンドロ、柑橘類、クレメンタイン、コーヒー、トウモロコシ、綿、キュウリ
、アメリカトガサワラ、ナス、エンダイブ、エスカロール、ユーカリ、ウイキョ
ウ、イチジク、ニンニク、ヒョウタン、ブドウ、グレープフルーツ、カンロメロ
ン、クズイモ、キーウィフルーツ、レタス、リーキ、レモン、ライム、テーダマ
ツ、マンゴ、メロン、マッシュルーム、ナッツ、エンバク、アブラヤシ、アブラ
ナ、オクラ、タマネギ、オレンジ、観賞植物、パパイヤ、パセリ、エンドウ、モ
モ、ピーナツ、ナシ、コショウ、カキ、マツ、パイナップル、プランテーン、プ
ラム、ザクロ、ポプラ、ジャガイモ、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）、マルメロ、
ラジアータマツ、赤チコリ、ハツカダイコン、ラズベリー、コメ、ライムギ、モ
ロコシ、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、イ
チゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、モミジバフウ、タンジェ
リン、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝、蔓植物、スイカ、コムギ、ヤムイ
モおよびズッキーニ。

【００８８】発現ベクターを作成する手段は当技術分野ではよく知られている。植物を形質
転換するために使用される発現（形質転換）ベクターと、それらのベクターを作
成する方法は、米国特許第４，９７１，９０８号、第４，９４０，８３５号、第
４，７６９，０６１号および第４，７５７，０１１号に記載があり、これらの特
許の開示は参照により本明細書に組み込まれる。これらのベクターは本発明に基
づくコード配列を含むように改変することができる。

【００８９】相補的付着末端または平滑末端を介してＤＮＡをベクターに有効な形で結合さ
せる方法は種々開発されている。例えば、相補的ホモポリマー配列を、挿入しよ
うとするＤＮＡセグメントと、ベクターＤＮＡとに付加することができる。次に
、そのベクターとＤＮＡセグメントを、相補的ホモポリマー尾部間の水素結合に
よって結合して、組換えＤＮＡ分子を形成させる。

【００９０】細胞に病害抵抗性を付与する能力を持つポリペプチドをコードするコード領域
は、配列番号１〜１０、または配列番号５７、または配列番号５８、６０、６２
、６４、６６、６８、７０、または生物学的機能等価物である配列を含有するこ
とが好ましい。

【００９１】高等植物における遺伝子の発現に有用な典型的ベクターは当技術分野ではよく
知られており、これにはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミドに由
来するベクター（Ｒｏｇｅｒｓら、１９８７）が含まれる。しかし、ｐＣａＭＶ
ＣＮトランスファーコントロールベクター（Ｆｒｏｍｍら、１９８５）をはじめ
とする他のいくつかの植物組込みベクターも、植物内で機能することが知られて
いる。プラスミドｐＣａＭＶＣＮ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社（ニュージャージー州
ピスカタウェイ）から入手可能）はカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）
３５Ｓプロモーターを含んでいる。

【００９２】一部の実施形態では、ポリペプチドを発現させるために使用するベクターが、
植物細胞内で有効な選択マーカーを含んでいる。選択可能マーカーとして役立つ
核酸配列は、そのマーカーを含有しない細胞と比較して、そのマーカーを含む細
胞の同定を容易にする表現型を、その細胞内で生じさせる機能を果たす。有用な
選択可能マーカーには、ＧＵＳ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ネオマイシン
ホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＸ）、ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、抗生物質耐性配列
、および除草剤（例えばグリホサート）耐性配列などがある。選択可能マーカー
はカナマイシン、ハイグロマイシンまたは除草剤耐性マーカーであることが好ま
しい。薬剤耐性マーカーの一つは、その発現がカナマイシン耐性をもたらす遺伝
子、すなわちノパリンシンターゼプロモーター、Ｔｎ５ネオマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）およびノパリンシンターゼ３’非翻訳領域を
含有するキメラ遺伝子である（Ｒｏｇｅｒｓら、１９８７）。

【００９３】本発明のコンストラクトの３’非翻訳領域は、転写ターミネーターまたは等価
な機能を持つ配列、および植物内でｍＲＮＡの３’末端へのアデニル酸ヌクレオ
チドの付加をもたらす機能を果たすポリアデニル化シグナルを含有すべきである
。そのような３’領域の例には、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子などのア
グロバクテリウム腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニル化シグナル
を含有する３’転写非翻訳領域、大豆７ｓ貯蔵タンパク質遺伝子やエンドウｓｓ
ＲＵＢＩＳＣＯＥ９遺伝子（欧州特許出願第０３８５９６２号）などの植
物遺伝子がある。これらの要素を組み合わせることで、例えば、５’方向または
３’方向に有効な形で結合された次の成分からなる組換え二本鎖ＤＮＡ分子を提
供することができる：植物細胞内でＲＮＡ配列の産生を引き起こすように機能す
るプロモーター、Ｒ−遺伝子をコードするＤＮＡコード配列、および植物細胞内
で転写の終結と前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル酸ヌクレオチドの付
加とを引き起こすように機能する３’非翻訳領域。

【００９４】抵抗性に関係する遺伝子配列は、その全ヌクレオチド配列または機能的に同じ
意義を持ちうるその一部、例えば切断型などからなりうる。もう一つの選択肢と
して、植物病害抵抗性ポリペプチドのエピトープ領域を発現させ、それらのペプ
チドを使ってそのポリペプチドに対する抗体を産生させることが望ましい場合も
ある。

【００９５】翻訳エンハンサーもベクターＤＮＡの一部として組み込むことができる。した
がって、本発明のＤＮＡコンストラクトは、得られたｍＲＮＡ転写物からの遺伝
子産物の発現を増進するのに役立ちうる１または複数の５’非翻訳リーダー配列
も含有すべきである。そのような配列は当該遺伝子を発現させるために選択した
プロモーターに由来するものであってよく、またはそのｍＲＮＡの翻訳を増加さ
せるように特別に改変することもできる。そのような領域はウイルスＲＮＡ、適
当な真核遺伝子、または合成遺伝子配列から得ることもできる。

【００９６】得られたｍＲＮＡの翻訳効率を増加または変化させるには、そのようなエンハ
ンサー配列が望ましいだろう。本発明は、エンハンサーが天然の５’非翻訳プロ
モーター配列に由来するコンストラクトに限定されず、他のエンハンサー転写活
性化因子または遺伝子などの他の非関連プロモーターに由来する非翻訳リーダー
配列を含むこともできる。例えばペチュニア熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ
７０）はそのようなリーダーを含有する（Ｗｉｎｄｅｒら、１９８８）。

【００９７】本発明は、本明細書に記載するような核酸配列を含有する発現ベクターの作成
を意図するものである。したがって一態様として、発現ベクターは、本発明のポ
リペプチドをコードするコード領域に有効な形で結合されたプロモーター（これ
により前記プロモーターは前記コード領域の転写を駆動する）からなる単離精製
されたＤＮＡ分子を含有する。前記コード領域は転写終結領域に有効な形で結合
される。本明細書で使用する「有効な形で結合」という用語は、あるプロモータ
ーがあるコード領域に、当該コード領域の転写が当該プロモーターによって制御
され調節されるような形で連結されることを意味する。プロモーターをコード領
域に有効な形で結合させる手段は当技術分野ではよく知られている。本発明の発
現ベクターは植物を形質転換するために使用されるので、植物中で発現を駆動す
る能力を持つプロモーターが選択される。植物中で機能するプロモーターも当技
術分野ではよく知られている。誘導性プロモーター、ウイルスプロモーター、合
成プロモーターまたは構成的プロモーター（Ｐｏｓｚｋｏｗｓｋｉら、１９８９
；Ｏｄｅｌｌら、１９８５）および時間的に調節されるプロモーター、空間的に
調節されるプロモーターは、空間時間的に調節されるプロモーター（Ｃｈａｕら
、１９８９）は、植物中でポリペプチドを発現させるのに役立つ。プロモーター
は、形質転換された植物細胞またはトランスジェニック植物の転写活性をコード
領域に向けるその能力で選択される。構造遺伝子は植物組織中で様々なプロモー
ターによって駆動することができる。プロモーターはＣａＭＶ３５Ｓプロモー
ターのようにほぼ構成的であってもよいし、あるいは組織特異的または発生段階
特異的であってもよく、双子葉植物または単子葉植物に影響を及ぼす。

【００９８】上述のように、抵抗性に関係する非宿主遺伝子は天然の同種プロモーターまた
は様々な異種プロモーターの制御下に置くことができる。文献には植物細胞中で
活性なプロモーターが数多く記載されている。それらには、例えばアグロバクテ
リウム・ツメファシエンスの腫瘍誘導プラスミドに保持されているノパリンシン
ターゼ（ｎｏｓ）、マンノピンシンターゼ（ｍａｓ）およびオクトピンシンター
ゼ（ｏｃｓ）プロモーター；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓ
および３５Ｓプロモーター；強化型ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター；ゴマノハグサ
モザイクウイルス（ＦＭＶ）３５Ｓプロモーター；リブロース−１，５−ビスホ
スフェートカルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）に由来す
る光誘導性プロモーター：タバコ由来のＥＩＦ−４Ａプロモーター（Ｍａｎｄｅ
ｌら、１９９５）；アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来のキチナー
ゼプロモーター（Ｓａｍａｃら、１９９１）；ブロッコリ由来のＬＴＰ（脂質ト
ランスファータンパク質）プロモーター（Ｐｙｅｅら、１９９５）；トウモロコ
シ由来のユビキチンプロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９９２）；サ
トウキビバドナウイルスプロモーター；コメ由来のアクチンプロモーター（Ｍｃ
Ｅｌｒｏｙら、１９９０）が含まれる。これらのプロモーターはすべて、植物中
で発現された様々なタイプのＤＮＡコンストラクトを作成するために使用された
ものである。これについては例えばＰＣＴ国際公開ＷＯ８４／０２９１３を参
照されたい。これらのプロモーターの多くは、天然プロモーターによって駆動さ
れる遺伝子の発現レベルと比較して、遺伝子発現レベルを増加させるだろう。
この増加した遺伝子発現は、場合によっては、抵抗性のレベルの増加につながる
だろう。

【００９９】本発明の方法に応用できるＤＮＡコンストラクトに有用なプロモーターは、病
原体感染に反応してコード配列の特異的発現を付与するその能力に基づいて選択
できる。病原体による植物の感染は、防御関連タンパク質または感染特異的（Ｐ
Ｒ）タンパク質と呼ばれる広範な一連のタンパク質の誘導のきっかけになる（Ｂ
ｏｗｌｅｓ、１９９０；Ｂｏｌら、１９９０；Ｌｉｎｔｈｏｒｓｔ、１９９１）
。そのような防御関連遺伝子またはＰＲ遺伝子は、フェニルプロパノイド代謝
に関与する酵素（例：フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、カルコンシンター
ゼ）、植物細胞壁を修飾するタンパク質（例：ヒドロキシプロリンリッチタンパ
ク質、グリシンリッチタンパク質、ペルオキシダーゼ）、真菌細胞壁を分解する
酵素（例：キチナーゼ、グルカナーゼ）、タウマチン様タンパク質、または未知
の機能を持つタンパク質をコードしうる。防御関連遺伝子またはＰＲ遺伝子は、
いくつかの植物種から単離され特徴づけられている。これらの遺伝子のプロモー
ターは、対応する病原体で攻撃したトランスジェニック植物における非宿主抵抗
性遺伝子およびその生物学的機能等価物の発現を駆動するために使用できる。例
えばそのようなプロモーターはジャガイモ（Ｆｒｉｔｚｅｍｅｉｅｒら、１９８
７；Ｃｕｙｐｅｒｓら、１９８８；Ｌｏｇｅｍａｎｎら、１９８９；Ｍａｔｔｏ
ｎら、１９８９；Ｓｃｈｒｏｄｅｒら、１９９２）またはアスパラガス（Ｗａｍ
ｅｒら、１９９３）から単離された防御関連遺伝子またはＰＲ遺伝子から得られ
ている。もう一つの選択肢として、タバコから得ることができるＰＲＰ１プロモ
ーター（Ｍａｒｔｉｎｉら、１９９３）などの病原体誘導性プロモーターも使用
できる。

【０１００】プロモーターは、植物病害抵抗性タンパク質が最も有効な組織、例えば根特異
的病原体（ダイズシストセンチュウなど）の場合は根組織、葉特異的病原体（さ
び病およびうどん粉病など）の場合は葉組織、また主として頭花における病害を
引き起こす病原体（フザリウム・グラミレアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍ
ｉｒｅａｒｕｍ）など）の場合は花組織における特異的発現を付与するその能力
に基づいて選択することもできる。

【０１０１】いずれにせよ、トランスジェニック植物におけるＲ−遺伝子の発現を駆動する
ために選択されるプロモーターは、植物組織内で生物学的に有効な量の当該タン
パク質の発現を促進する能力を持つべきである。そのような発現を駆動する能力
を持つ構成的プロモーターの例は、ｅ３５Ｓ、ＦＭＶ３５Ｓ、コメアクチン、ト
ウモロコシユビキチン、サトウキビバドナウイルスおよびｅＩＦ−４Ａプロモー
ターである。

【０１０２】ＤＮＡコンストラクト中に使用されるプロモーターは、所望により、それらの
制御特性を変化させるために改変してもよい。例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモータ
ーを、光不在下でｓｓＲＵＢＩＳＣＯの発現を抑制するｓｓＲＵＢＩＳＣＯ遺伝
子の一部に結合させて、葉では活性であるが、根では不活性なプロモーターを作
成することができる。本発明では「ＣａＭＶ３５Ｓ」という表現は、ＣａＭＶ３
５Ｓプロモーターの変異体、例えばオペレーター領域との結合、ランダムなまた
は制御された突然変異誘発などによって得られるプロモーターなどを包含するも
のとする。さらに、本発明に有用なプロモーターは、遺伝子発現レベルの増加を
助けるために、複数のエンハンサー配列を含有するように改変してもよい。その
ようなエンハンサー配列の例はＫａｙら（１９８７）によって報告されている。

【０１０３】プロモーターがＣａＭＶ３５Ｓなどのほぼ構成的なプロモーターである場合、
ポリペプチド発現の増加は形質転換された様々な植物組織（例えばカルス、葉、
種子および根）でみられる。もう一つの選択肢として、組織特異的プロモーター
を含有する植物組込みベクターを使うことによって、形質転換の効果を特定の植
物組織に向かわせることもできる。

【０１０４】典型的な組織特異的プロモーターは種子組織に特異的なレクチンプロモーター
である。ダイズ種子中のレクチンタンパク質は単一の遺伝子（Ｌｅ１）にコード
されており、この遺伝子は種子成熟中にしか発現されず、全種子ｍＲＮＡの約２
％〜約５％を占める。このレクチン遺伝子と種子特異的プロモーターは完全に特
徴づけられており、トランスジェニックタバコ植物での種子特異的発現を指示す
るために使用されている（Ｖｏｄｋｉｎら、１９８３；Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍら、
１９９０）。

【０１０５】本発明では、完全長Ｒ−遺伝子配列だけでなく、生物学的に機能等価なヌクレ
オチド配列も考えられる。「生物学的に機能等価なヌクレオチド配列」という表
現は、それらが発現され、植物における効果的な抵抗性反応の誘導に関与するペ
プチド、ポリペプチドまたはタンパク質を産生するように機能的に作動できる形
で宿主細胞に導入された時に、配列番号１１〜２０または配列番号５９に部分的
に記載する配列の生物学的活性と同じまたは類似する生物学的活性を示すペプチ
ド、ポリペプチドおよびタンパク質をコードする、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびｍＲＮＡヌクレオチド配列などのＤＮＡおよ
びＲＮＡを表す。

【０１０６】生物学的に機能等価なヌクレオチド配列には、基本アミノ酸配列内に保存的ア
ミノ酸変化をコードしていてそこにサイレントな変化をもたらすヌクレオチド配
列が包含される。そのようなヌクレオチド配列は、野生型遺伝子をコードするヌ
クレオチド配列と比較して対応する塩基置換を含有する。

【０１０７】基本アミノ酸配列内に保存的アミノ酸変化をコードしているヌクレオチド配列
に加えて、生物学的に機能等価なヌクレオチド配列には、他の塩基置換、付加ま
たは欠失を含有するヌクレオチド配列も包含される。それらには、当該ｃＤＮＡ
に含まれるものと同じ固有の遺伝情報を含有する核酸が包含される。そのような
ヌクレオチド配列は、当該ｃＤＮＡの「遺伝的に等価な改変型」と呼ぶことがで
き、本明細書に記載の方法によって同定できる。

【０１０８】非宿主抵抗性遺伝子をコードするｃＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ
、合成ＤＮＡまたは他の核酸中に施される突然変異はコード配列の読み枠を維持
することが好ましい。さらにそれらの突然変異は、ｍＲＮＡの翻訳に悪影響を与
えるであろうループやヘアピンなどの二次ｍＲＮＡ構造をハイブリッド形成によ
って生じうる相補領域を生み出さないことが好ましい。

【０１０９】突然変異部位を前もって決定しておくことはできるが、突然変異の性質そのも
のを予め決めておく必要はない。例えば所定の部位で突然変異体の最適な特徴を
選択するために、ランダム突然変異誘発を標的コドンで行なうことができる。

【０１１０】もう一つの選択肢として、未改変ｃＤＮＡ配列の断片へのライゲーションを可
能にする制限部位が隣接した、突然変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合
成することによって、突然変異を特定の位置に導入することができる。ライゲー
ション後、得られる再構築ヌクレオチド配列は、所望する核酸の挿入、置換また
は欠失を持つ誘導体型をコードする。

【０１１１】いずれの場合も、発現させた突然変異体を、例えば実施例５および６に記載の
方法などにより、所望する病原活性に関してスクリーニングすることができる。

【０１１２】当該ＤＮＡの有用な遺伝的に等価な改変型の具体例には、当該ＤＮＡに対して
高レベルの相同性、すなわち配列同一性を示すヌクレオチド配列を持つＤＮＡが
包含される。これは、当該ＤＮＡまたはその対応する部分に対して、約７０％以
上の配列同一性、より好ましくは約８０％以上の配列同一性、最も好ましくは約
９０％以上の配列同一性に及びうる。

【０１１３】このような遺伝的に等価な改変型は、従来のＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−Ｒ
ＮＡハイブリダイゼーション法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）またはＰＣＲ
法を用いた増幅によって容易に単離できる。これらの型は、真菌病原体に対して
通常は罹病性である植物細胞中に従来の形質転換法によって導入された時に、そ
のような真菌病原体に対する抵抗性を付与する能力を持つはずである。

【０１１４】非宿主抵抗性遺伝子の断片または変異体は、ｃＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ゲ
ノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはｍＲＮＡによってコードすることができる。こ
れらの核酸は、植物Ｒ−遺伝子をコードするヌクレオチド配列を持つＤＮＡまた
はそれに対応するｍＲＮＡの対応する領域または部分に対して、約７０％以上の
配列類似性、好ましくは約８０％以上の配列類似性、最も好ましくは約９０％以
上の配列類似性を持つべきである。

【０１１５】本発明では、非宿主抵抗性遺伝子またはその断片に生物学的に機能等価な核酸
に、（１）部分的なヌクレオチドの欠失、挿入、付加などの自然または人工突然
変異によって長さが変化しているＤＮＡであって、そのために、その配列の全長
を１００％とすると、生物学的に機能等価な配列がその配列の約６０％〜約１２
０％、好ましくはその約８０％〜約１１０％の長さを持つようなＤＮＡ、または
（２）部分的（通常は全長の約２０％以下、好ましくは約１０％以下、より好ま
しくは約５％以下）な自然または人工突然変異を含有しているヌクレオチド配列
であって、そのために、そのような配列は異なるアミノ酸をコードするが、得ら
れたポリペプチドはその遺伝子の植物病害抵抗性活性を保持しているようなヌク
レオチド配列、が包含される。この方法で作成される突然変異型ＤＮＡは、当該
ヌクレオチド配列によってコードされる植物抵抗性タンパク質のアミノ酸配列に
対して、通常、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０
％以上の配列同一性を持つポリペプチドをコードする。

【０１１６】本発明では人工突然変異を作成するために使用される方法は特に限定されず、
そのような突然変異は当技術分野で一般に行なわれている手段のどれを使って作
成してもよい。

【０１１７】例えば、適正なアミノ酸読み枠が維持されるように適切なＤＮＡ断片を挿入ま
たは欠失するために、ｃＤＮＡを適当な制限酵素で処理することができる。制限
エンドヌクレアーゼ処理に続いて、消化されたＤＮＡを突出端が埋まるように処
理して、そのＤＮＡを再連結することができる。

【０１１８】突然変異は、未改変ｃＤＮＡ配列またはゲノム配列の断片へのライゲーション
を可能にする制限部位が隣接した、突然変異配列を含有するオリゴヌクレオチド
を合成することによって、特定の位置に導入することもできる。ライゲーション
後、得られる再構築配列は、所望するアミノ酸の挿入、置換または欠失を持つ誘
導体型をコードする。

【０１１９】もう一つの選択肢として、オリゴヌクレオチド指定部位特異的またはセグメン
ト特異的突然変異誘発法を使って、所望する置換、欠失または挿入に応じて改変
された特定のコドンを有する改変されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列を作成
することもできる。

【０１２０】上記の改変を行なう方法の典型的な例は、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９５）、Ｂ
ａｕｅｒら（１９８５）、Ｃｒａｉｋ（１９８５）、ＦｒｉｔｓＥｃｋｓｔｅ
ｉｎら（１９８２）、Ｏｓｕｎａら（１９９４）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８
９）、Ｓｍｉｔｈら（１９８１）およびＷａｌｄｅｒら（１９８６）に開示され
ている。これらの方法のいずれかによって製造される、本明細書記載のＤＮＡ配
列の生物学的機能等価物は、それによってコードされるペプチド、ポリペプチド
またはタンパク質を当技術分野周知の技術を使って測定することによって選択で
きる。

【０１２１】Ｒ−遺伝子をコードするＤＮＡの生物学的機能等価型には、非宿主抵抗性遺伝
子に対して産生された抗体と反応し（すなわち前記抗体に特異的に結合し）、当
該ポリペプチドと同じまたは類似する生物学的活性を示すペプチド、ポリペプチ
ドおよびタンパク質をコードするヌクレオチド配列が包含される。そのような抗
体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体である。

【０１２２】遺伝コードは縮重しているので、すなわち自然界でタンパク質中に見出される
アミノ酸の大半には２以上のコドンが存在するので、本発明のＤＮＡと基本的に
同じ遺伝情報を含有し、非宿主抵抗性遺伝子のヌクレオチド配列によってコード
されるものと基本的に同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ（およびＲＮＡ
）配列を、本発明の実施に使用することができる。この原理は本明細書で論じら
れる他のヌクレオチド配列のいずれにも当てはまる。

【０１２３】本発明が意図するＤＮＡの生物学的機能等価型には、特定の宿主細胞内で発現
が増進するように設計された合成ＤＮＡも包含される。宿主細胞は選択的なコド
ン使用頻度パターンを示すことが多い（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９０）。した
がって特定の宿主での発現が増進するように設計される合成ＤＮＡには、その宿
主細胞でのコドン使用頻度パターンが反映されるべきである。

【０１２４】本発明では、「ＢｅｓｔＦｉｔ」または「Ｇａｐ」プログラムを使用し、その
配列解析ソフトウェアパッケージ（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒ
ｏｕｐ社、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、ウィスコンシン州
５３７１１マディソン）のデフォルト値を使って、配列類似性または配列同一性
を決定することができる。好ましいスコアリングマトリックスはＰＡＭ２５０で
ある。

【０１２５】本発明には、単離された非宿主抵抗性遺伝子の配列およびそれらの相補配列に
ハイブリダイズし、天然物と同じまたは類似する生物学的活性を持つペプチド、
ポリぺプチドまたはタンパク質を発現時にコードするヌクレオチド配列も包含さ
れると理解すべきである。そのようなヌクレオチド配列は、非宿主抵抗性遺伝子
またはその相補配列に、中等度〜高いストリンジェンシー条件（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、１９８９を参照されたい）でハイブリダイズすることが好ましい。典型的
な条件としては、まず、６×ＳＳＣ、５×デンハルト液、１００ｍｇ／ｍＬ魚精
子ＤＮＡ、０．１％ＳＤＳ中、５５℃で、ハイブリダイズさせるのに十分な時間
（例えば数時間〜終夜）にわたってハイブリダイゼーションを行なった後、２×
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で各１５分間の洗浄を２回および０．５〜１×
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５５℃で各１５分間の洗浄を２回行ない、次にオー
トラジオグラフィーを行なうことが挙げられる。通例、上記核酸分子は、ハイブ
リダイゼーション混合物を０．１×ＳＳＣ中、５５℃、好ましくは６０℃、より
好ましくは６５℃で、少なくとも１回洗浄した時にハイブリダイズする能力を持
つ。

【０１２６】上記のヌクレオチド配列は、それらが本明細書に同定されるヌクレオチド配列
の抗病原体効果と同様の抗病原体効果を有するペプチド、ポリペプチドまたはタ
ンパク質をコードするのであれば、抵抗性コード遺伝子の生物学的機能と実質的
に等価な生物学的機能を有するとみなされる。

【０１２７】細菌、酵母作用、植物細胞または植物全体を、非宿主抵抗性遺伝子を含有する
１つまたは複数の発現ベクターで形質転換するための方法と組成物は、この開示
のさらなる態様である。そのような形質転換法によって得られるトランスジェニ
ック細菌、酵母細胞、植物細胞または植物体またはそのようなトランスジェニッ
ク植物に由来する子孫および種子も、本発明のさらなる態様である。

【０１２８】細菌および酵母細胞を形質転換する手段は当技術分野ではよく知られている。
植物細胞のＤＮＡ形質転換法には、アグロバクテリウムによる植物形質転換、プ
ロトプラスト形質転換、花粉への遺伝子導入、生殖器官への注入、未成熟な胚へ
の注入、および粒子射撃法などがある。これらの方法はそれぞれに異なる長所と
短所を持っている。したがって、特定の植物株に遺伝子を導入する特定の一方法
が、別の植物株にとって最も有効であるとは限らないが、特定の植物株にとって
どの方法が有用かはよく知られている。

【０１２９】主にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを使って双子葉植物を形質転換し
、トランスジェニック植物を得る方法は、当技術分野ではよく知られており、綿
（米国特許第５，００４，８６３号；米国特許第５，１５９，１３５号；米国特
許第５，５１８，９０８号）、ダイズ（米国特許第５，５６９，８３４号；米国
特許第５，４１６，０１１号；ＭｃＣａｂｅら、１９８８；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら
、１９８８）、ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）（米国特許第５，４６３，１７
４号）、ピーナッツ（Ｃｈｅｎｇら、１９９６；ＭｃＫｅｎｔｌｙら、１９９５
）、パパイヤ（Ｙａｎｇら、１９９６）およびエンドウ（Ｇｒａｎｔら、１９９
５；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら、１９９３；ＤｅＫａｔｈｅｎおよびＪａｃｏｂｓ
ｅｎ、１９９０）に関して公表されている。この分野についてはＧａｓｓｅｒお
よびＦｒａｌｅｙ（１９８９）による総説がある。

【０１３０】エレクトロポレーション、粒子射撃法およびアグロバクテリウムによる単子葉
植物の形質転換も報告されている。形質転換と植物再生は、アスパラガス（Ｂｙ
ｔｅｂｉｅｒら、１９８７）、オオムギ（ＷａｎおよびＬｅｍａｕｘ、１９９４
）、トウモロコシ（Ｒｈｏｄｅｓら、１９８８；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら、１
９９０；Ｆｒｏｍｍら、１９９０；Ｋｏｚｉｅｌら、１９９３；Ａｒｍｓｔｒｏ
ｎｇら、１９９５）、エンバク（Ｓｏｍｅｒｓら、１９９２）、カモガヤ（Ｈｏ
ｒｎら、１９８８）、コメ（Ｔｏｒｉｙａｍａら、１９８８：Ｚｈａｎｇおよび
Ｗｕ、１９８８；Ｚｈａｎｇら、１９８８；ＢａｔｔｒａｗおよびＨａｌｌ、１
９９０；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、１９９１；Ｐａｒｋら、１９９６）、ライムギ（
ＤｅｌａＰｅｎａら、１９８７）、サトウキビ（ＢｏｗｅｒおよびＢｉｒｃ
ｈ、１９９２）、トールフェスク（Ｗａｎｇら、１９９２）およびコムギ（Ｖａ
ｓｉｌら、１９９２；Ｗｅｅｋｓら、１９９３）で達成されている。単子葉植物
の形質転換および植物再生技術もＤａｖｅｙら（１９８６）およびＤａｖｅｙら
（１９８９）に概説されている。

【０１３１】本明細書に記載する研究は、機能的なＲ−遺伝子、ＮＨＩおよび／またはエリ
シター結合タンパク質を単離し、それらの遺伝子を関心ある作物に移入して昆虫
または病害抵抗性を発達させるために使用できる。

【０１３２】実施例下記の実施例により、本発明をさらに説明する。決して下記の実施例を、本願
請求項の範囲と意味の限定であるとみなしてはならない。

【０１３３】実施例１：ジャガイモ疫病防除用のタバコＲ−遺伝子の同定タバコゲノムからＲ−遺伝子を単離し、次いでそれらの遺伝子をジャガイモに
導入すれば、フィトフトラ・インフェスタンスに対して抵抗性であるトランスジ
ェニックジャガイモ植物体を作出することができるだろう。フィトフトラ・イン
フェスタンスに対して機能的活性を持つタバコＲ−遺伝子のクローニングは、タ
バコのＨＲの誘導の原因となるフィトフトラ・インフェスタンスのエリシターＩ
ＮＦ１が既にクローン化されているという事実（Ｋａｍｏｕｎら、１９９７）に
よって容易になる。ＨＲ細胞の可視化を助けるのに好ましい方法は、ラクトフェ
ノールブルー（０．５ｍｇ／ｍＬトリパンブルー、０．２５ｇ／ｍＬフェノール
、２５％グリセロール、２５％乳酸）１部および９６％エタノール２部を含有す
る溶液中で、感染した葉組織を煮沸し、次に２．５ｇ／Ｌ抱水クロラール中で終
夜脱色することである（ＳｈｉｐｔｏｎおよびＢｒｏｗｎ、１９６２）。

【０１３４】Ｒ−遺伝子ホモログの一部を単離するために、Ｒ−遺伝子間で保存されている
領域にアニールするプライマーを設計した。クラスＩＲ−遺伝子は、ヌクレオ
チド結合部位とコンセンサス配列「ＧＬＰＬＡＬ」を有する保存された一続きの
アミノ酸とを持つタンパク質をコードする。

【０１３５】クラスＩ遺伝子用のプライマーセット１は配列番号４０〜４１に示すプライマ
ーからなった。クラスＩ遺伝子用のプライマーセット２は配列番号４２〜４３に
示すプライマーからなった。配列番号４２は配列番号４４または配列番号４５に
示すプライマーのいずれかと置き換えることができた。

【０１３６】クラスＩＩＲ−遺伝子は、保存された膜アンカーと推定される部分を持つタ
ンパク質である。配列番号４６〜４７に示すプライマーを使って、この種類のＲ
−遺伝子ホモログを単離することに成功した。配列番号４７のプライマーは配列
番号４８に示すプライマーで置き換えることができた。

【０１３７】上述したプライマーと類似するまたは同じプライマーとＧｉｂｃｏＢＲＬ試
薬システム（カタログ番号１０１９８−０１８；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）とを使って製造者が推奨する標準的
条件でＰＣＲ反応（９４℃で１分間の変性、４８〜５２℃で１分間のアニーリン
グ、７２℃で２分間の伸長を、合計３５サイクル）を行なうことにより、Ｒ−遺
伝子ホモログ断片を得た。そのＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動したとこ
ろ、しばしば主要な０．５ｋｂバンドとして現れた。しかしゲル精製したバンド
をベクターＰＣＲｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホ
ーヤ）にサブクリーニングし、個々の増幅産物の配列解析を製造者の方法（ＡＢ
ＩＰＲＩＳＭ^ＴＭダイターミネーターサイクルシークエンシング、Ｐｅｒｋｉ
ｎＥｌｍｅｒ、カリフォルニア州フォスターシティー）に従って行なったとこ
ろ、各バンドは何十ものＲ−遺伝子ホモログの異なる断片を含有するらしいこと
が明らかになった。できる限り多くのサブクラスが同定されることを保証するた
めに、上記のプライマーを同じ条件で使用して、タバコだけでなく近縁植物種ソ
ラヌム・ミクロドンツム（Ｓｏｌａｎｕｍｍｉｃｒｏｄｏｎｔｕｍ）からもＲ
−遺伝子ホモログを単離した。これらの植物種から単離された２００を越えるＲ
−遺伝子相同断片を整列し、アミノ酸レベルでの相同性のレベルに基づいて異な
るサブクラスにグループ分けした。各サブクラスは、メンバー間で少なくとも７
０％の同一性、またはサザンブロットでクロスハイブリダイズするメンバーの能
力によって定義づけた。

【０１３８】多くの異なるサブクラスが同定されたので、次の段階として、これらのサブク
ラスの代表的メンバーをサザンブロット上でプローブとして使用して、Ｒ−遺伝
子ホモログの総数を決定することにした。クラスＩの１０種類のサブクラス代表
配列（配列番号２１〜３０）とクラスＩＩの６種類のサブクラス代表配列（配列
番号３１〜３６）とを、標準プライマーＴ３およびＴ７（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ゲーサースバーグ）を使って対応するプラスミ
ドから増幅した。次に、増幅された断片をＰｒｉｍｅ−ＩｔＩＩ（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）を使って標識し、５×１０^７ｃｐｍ相
当を１５ｍＬのＲａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ州アー
リントンハイト）に添加して、植物ＤＮＡ消化物を含有するＨｙｂｏｎｄ−Ｎ^＋フィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ州アーリントンハイト）を使ったサザ
ンブロット実験を行なった。１６の異なるハイブリダイゼーション実験により、
クラスＩの２００個とクラスＩＩの１５０個で合計約３５０個のＲ−遺伝子ホモ
ログがタバコで可視化された。ソラヌム・ミクロドンツム（Ｓ．ｍｉｃｒｏｄ
ｏｎｔｕｍ）から単離したプローブは、タバコＤＮＡを含有するフィルターでの
Ｒ−遺伝子ホモログの可視化にタバコプローブと同じくらい役に立つと思われ、
Ｒ−遺伝子ホモログが近縁植物種間で保存されていることを実証すると共に、内
因性プローブと異種プローブの両方を使用することの妥当性を示した。選択され
た１６個一組みのプローブを使用することによって、このように多数のＲ−遺伝
子ホモログを可視化できることは、機能的タバコＲ−遺伝子の単離にとって、こ
れらのプローブが、したがって対応するＤＮＡ配列が重要であることを含意し、
それら機能的タバコＲ−遺伝子の多くはこれらのＤＮＡ断片のいずれかに高度の
相同性を示すと予想される。生物学的に機能的なＲ−遺伝子は、選択された１６
種類のＤＮＡ断片（配列番号２１〜３６）のいずれかの配列に対して、約７０％
以上の配列類似性、好ましくは約８０％以上の類似性、最も好ましくは約９０％
以上の配列類似性を持つ約１８０アミノ酸の領域を含有するはずである。フィル
ターを、ＰａｍＲｏｎａｌｄ（カリフォルニア大学デービス校）から提供され
たトマトＰｔｏ遺伝子および２つのトマトＸａ２１ホモログともハイブリダイズ
させたところ、さらに約４０個のバンドが明らかになった。

【０１３９】完全長ライブラリーの構築ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子の他にゴマノハ
グサモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターによって駆動されるＩＮＦ１遺伝子
をＴ−ＤＮＡの境界配列間に含有する、ＳＬＪ４４０２４（Ｊｏｎｅｓら、１９
９２）由来の改変バイナリーコスミドベクター０４５４１（０４５４１Ｍと命名
）を作成した（図１）。この０４５４１Ｍベクターは、まず、ＰＲ１ａ遺伝子（
Ｈａｍｍｏｎｄ−Ｋｏｓａｃｋら、１９９４）のシグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ配列を配列番号４９〜５０に示すプライマーを使って増幅すると共に、Ｉ
ＮＦ１遺伝子（２９４ｂｐ、フィトフトラ・インフェスタンスのＵＳ−８遺伝子
型のゲノムＤＮＡから単離されるもの）を配列番号５１〜５２に示すプライマー
を使って増幅することによって構築した。増幅されたシグナルペプチド配列をそ
れぞれＸｂａＩ−ＫｐｎＩおよびＫｐｎＩ−ＢｇｌＩＩで消化し、ＸｂａＩおよ
びＢａｍＨＩで消化したプラスミドベクターｐＭＯＮ１１７７０（図２）にサブ
クローニングした。得られたプラスミドは、順にゴマノハグサモザイクウイルス
の３５Ｓプロモーター、ＰＲ１ａシグナルペプチド、ＩＮＦ１遺伝子およびノパ
リンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子の転写ターミネーター配列からならるカセット
を含有した。このカセットを含有するＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩＤＮＡ断片を
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）
にサブクローニングし、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＨｉｎｃＩＩで直線化した。最後
に、そのカセットをこのベクターからＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで切り出し、同
じ酵素で消化したバイナリーコスミドベクター０４５４１にクローン化した。

【０１４０】元の０４５４１ベクターと新しい０４５４１Ｍベクターの両方を、Ｇｉｇａｐ
ａｃｋＩＩＩＧｏｌｄシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州
ラホーヤ）を使って、大腸菌ＭＲ細胞に形質導入し、三親交雑によってアグロバ
クテリウムＡＢＩに接合した（Ｄｉｔｔａら、１９８０）。ＡＢＩは、無害化
されたｐＴｉＣ５８プラスミドｐＭＰ９０ＲＫを保有するアグロバクテリウム・
ツメファシエンスＡ２０８株である（Ｋｏｎｃｚら、１９８６）。アグロバク
テリアを、２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールおよび５０μｇ／ｍＬのカナ
マイシンを含有するＬＢ培地（１リットルあたりトリプトン１０ｇ、酵母５ｇお
よびＮａＣｌ５ｇ）中、３０℃で３０時間生育させた。ヘルパープラスミドｐＲ
Ｋ２０１３を含有する大腸菌を、５０μｇ／Ｌのカナマイシンを含有するＬＢ培
地で終夜生育させた。バイナリーコスミドベクターを保有する大腸菌を、１０μ
ｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地で生育させた。これらの培養物
をすべて生育させた後、ＡＢＩ、大腸菌（ｐＲＫ２０１３）および大腸菌（バイ
ナリープラスミドベクター）各１００ｍＬを含有するチューブに４ｍＬのＬＢを
加えた。この混合物を微量遠心機で１分間遠心分離し、上清画分を傾瀉した。ペ
レット画分を残りの液に再懸濁し、その一部をピペットでＬＢ寒天プレートの中
心に乗せた。３０℃で終夜生育させた後、このプレートから得た細胞の一部を、
２μｇ／ｍＬのテトラサイクリン、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび２５μ
ｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補足したＬＢプレートに画線した。３０℃で
２４〜４８時間後に「三親」交雑によって生じたコロニーが選択プレートの上に
認められた。このプレートから４つの独立したコロニーを選択し、２μｇ／ｍＬ
のテトラサイクリン、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬのク
ロラムフェニコールを補足したＬＢの液体培養に、それぞれ個別に接種し、３０
℃で生育させた。完全なＴ−ＤＮＡの存在を、それらアグロバクテリウム株から
単離されたプラスミドＤＮＡの制限分析によって確認した。

【０１４１】０４５４１を保有するアグロバクテリウム株を、タバコおよびニコチアナ・ベ
ンタミアナの細胞間隙に注入したが予想通り何の表現型も生じず、注入された組
織は、コスミドベクターを欠くアグロバクテリウム株を注入した組織と同じに見
えた。しかし０４５４１Ｍをタバコの葉に注入すると激しい壊死反応が起こった
ことから、ＩＮＦ１の一過性発現がタバコにおけるＨＲを誘発することが示され
た。ニコチアナ・ベンタミアナでは、死細胞に関する被注入組織のトリパンブル
ー染色後に、限られた量の壊死が観察されるだけだった。ニコチアナ・ベンタミ
アナにおけるＩＮＦ１誘導性壊死の量はタバコにおける誘導性壊死の量の５％未
満だった。これらの結果は（１）タバコがフィトフトラエリシターＩＮＦ１を認
識するのに適した遺伝子を含有していて、この認識が迅速で強いＨＲを誘発する
ことと、（２）ニコチアナ・ベンタミアナはタバコほど強くＩＮＦ１を認識する
のに適した遺伝子を含有せず、ＩＮＦ１を認識した時に迅速で強いＨＲを誘発す
ることができないことを示している。したがって、ＩＮＦ１を認識する能力と、
フィトフトラ・インフェスタンスに対する病害抵抗性との間には、明確な相関関
係があるように見える。

【０１４２】ＩＮＦ１の認識におけるＲ−遺伝子の役割を仮定して、本発明者らは、ニコチ
アナ・ベンタミアナにおけるＩＮＦ１依存性ＨＲを誘発するその能力に関して、
タバコＲ−遺伝子ホモログをスクリーニングすることにした。この目的のために
、若いタバコ葉からゲノムＤＮＡを単離し、ＳａｕＩＩＩＡで部分消化し、ウシ
アルカリ性ホスファターゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ、インデ
ィアナ州インディアナポリス）で処理して３’−ＯＨ基を除去し、ＢａｍＨＩで
消化した０４５４１Ｍに結合し、ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩＧｏｌｄシステム
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）を使って大腸菌ＭＲ細胞
に形質導入することにより、２０キロ塩基対の平均インサートサイズを持つ２×
１０^６クローンのバイナリーコスミドライブラリーを作成した。

【０１４３】このタバコバイナリーコスミドライブラリーを、先に最初のサザンブロット分
析に使用した全てのサブクラス特異的プローブでスクリーニングした。通例、本
研究者らは、５種類のプローブを同時に使って、このライブラリーをスクリーニ
ングした。サブクラス特異的プローブ（配列番号２１〜３６）にハイブリダイズ
する全てのバイナリーコスミドベクターを、Ｒ−遺伝子プライマー（配列番号４
０〜４１）を使ったＰＣＲ分析にかけて、Ｒ−遺伝子ホモログの少なくとも一部
が存在することを確認した。次に、これらの「陽性」コスミドをアグロバクテリ
ウム・ツメファシエンスに接合して、植物の一過性または安定形質転換用の株を
作成した。

【０１４４】実施例２：非宿主誘導性遺伝子の単離非宿主防御シグナル伝達において機能する遺伝子の過剰発現は、罹病性植物に
おける病害抵抗性を増進するだろう。そのような非宿主誘導性遺伝子（ＮＨＩ）
を同定するために、以下の実験をおこなった。

【０１４５】ＲＮＡ抽出ＴＲＩｚｏｌ^ＴＭ試薬を使用し、製造者のプロトコル（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）に従って、以下の植物の葉
からＲＮＡを抽出した：タバコ葉、フィトフトラ・インフェスタンスによる攻撃感染の４時間後タバコ葉、水の噴霧による擬似処理の４時間後タバコ葉、フィトフトラ・インフェスタンスによる攻撃感染の１８時間後タバコ葉、水の噴霧による擬似処理の１８時間後。

【０１４６】サブトラクション以下のＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ^ＴＭｃＤＮＡサブトラクションを、製造者のプロ
トコル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）に従って行なうこと
により、抵抗性植物中でフィトフトラ・インフェスタンスによって主に誘導され
る遺伝子について選択した：「１」のｃＤＮＡから「２」の全てのｃＤＮＡをサブトラクトしてプールＩを
作成「３」のｃＤＮＡから「４」のすべてのｃＤＮＡをサブトラクトしてプールＩ
Ｉを作成。

【０１４７】候補遺伝子選択サブトラクトされたｃＤＮＡプールをｐＧＥＭＴベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、
ウィスコンシン州マディソン）にクローン化した。さらなる発現分析のために、
タバコサブトラクション物から１０００個のクローンを無作為に拾い上げた。サ
ブトラクトされたクローンを、標準Ｔ７およびＭ１３リバースプライマー（Ｌｉ
ｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）を使った
ＰＣＲによって増幅し、ナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ州ア
ーリントンハイツ）上に１対ずつスポットした。その複製メンブレンを、ＴＲＩ
ｚｏｌ^ＴＭ試薬（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ゲーサ
ーズバーグ）を使って抵抗性または罹病性植物から単離したメッセンジャーＲＮ
Ａから得たｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。罹病性プローブよりも抵
抗性プローブとより強いハイブリダイゼーションを示したドットを、その発現を
確認するためのさらなるノーザンブロット分析のために選択した。

【０１４８】ノーザンブロット分析に使用したフィルターは次の試料から単離した１０μｇ
のＲＮＡを含有した：タバコ葉、フィトフトラ・インフェスタンスによる攻撃感染の０、４、８およ
び１８時間後タバコ葉、水の噴霧による擬似処理の０、４、８および１８時間後。

【０１４９】リードの優先順位付けノーザンブロットデータに基づき、次の基準を使って候補に優先順位をつけた
：１．擬似処理したタバコ植物体より感染処理したタバコ植物体における誘導の
方が強いこと、２．感染１８時間後より感染４時間後の誘導の方が強いこと、３．感染した罹病性ジャガイモおよび／またはベンサタミアナ（ｂｅｎｔｈａ
ｍｉａｎａ）よりも感染したタバコにおける誘導の方が強いこと、４．レセプター、キナーゼおよび転写因子などの上流シグナル伝達に明らかに
関与するか、酵素機能を有するタンパク質をコードすること。

【０１５０】完全長ｃＤＮＡの単離完全長ｃＤＮＡを単離するために、ＳＭＡＲＴ^ＴＭｃＤＮＡライブラリーコ
ンストラクションキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）を
使用し、製造者の推奨に従って、タバコｃＤＮＡライブラリーを作成した。この
ライブラリーのために合計２×１０^６個の独立したクローンを作成し、４０〜５
０枚のプレート（１５０×１５ｍｍ）で増幅させた。各プレートから溶解物を収
集し、各全ライブラリーのサブプールとして個別に保存した。

【０１５１】各候補遺伝子について、サブトラクトされたクローンから得た配列に基づいて
、特異的プライマーを設計した。遺伝子特異的プライマーを使って、全てのサブ
プールを、少なくとも１つの陽性ｃＤＮＡを含有するものに関してスクリーニン
グした。

【０１５２】バイナリープラスミドベクターへの全長配列のサブクローニングクローニングとそれに続く耐性関連遺伝子の分析が容易なように、バイナリー
ベクターｐＭＯＮ３０６５６（図５）を構築した。このベクターを使えば、ＳＭ
ＡＲＴライブラリーから単離された完全長遺伝子を一段階でサブクローニングで
きる。なぜなら、このベクターは、ゴマノハグサモザイクウイルスの３５Ｓプロ
モーターと、アグロバクテリウム・ツメファシエンスｐＴｉＴ３７のノパリン
シンターゼ遺伝子の終結シグナルを持つ非翻訳尾部配列との間に、ユニークなＳ
ｆｉＩ部位を含有するからである。このベクターはＬｏｘ−Ｐ部位も含有してお
り、この部位により、対象遺伝子を植物ゲノムから回収することができる。もう
一つの選択肢として、対象遺伝子はＰａｃＩでＤＮＡを断片化することによって
も回収できる。断片化されたＤＮＡは、次に自己連結させて、対象遺伝子の他に
、カナマイシンとネオマイシンに対する耐性を細菌に付与するｋａｎ遺伝子およ
び細菌ｐＡＣＹＣ１８４の複製起点を含有するプラスミド構造を形成させる必要
がある。

【０１５３】実施例３：タバコからのエリシター結合タンパク質の単離フィトフトラ・インフェスタンスエリシターの認識に基づくＨＲの誘導につな
がるシグナル伝達経路を活性化できるＲ−遺伝子以外の植物因子または植物レセ
プターを単離するために、酵母ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲツーハイブリッドを使用し
た（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）。タバコＭＡＴＣＨＭＡ
ＫＥＲｃＤＮＡライブラリーを製造者のプロトコルに従って構築し、それを使
って、フィトフトラ・インフェスタンスエリシターＩＮＦ１と相互作用する能力
に関してスクリーニングした。合計３×１０^６個のクローンをスクリーニングし
たところ、６個の陽性クローンが同定された。Ｎｈｒ１（配列番号６０）と名付
けた陽性クローンの一つは２つのジンクフィンガー様ドメインとブロモドメイン
を含有することから、Ｎｈｒ１は転写調節物質またはシグナル伝達タンパク質で
あるかもしれないことが示唆される。

【０１５４】Ｎｈｒ１の完全長遺伝子を単離するために、ＦＭＶプロモーターの制御下にあ
るＩＮＦ１遺伝子と２０キロ塩基対の平均サイズを持つタバコＤＮＡ断片の両方
を含有するバイナリーコスミドライブラリーを構築し、Ｎｈｒ１でスクリーニン
グした。陽性クローンをアグロバクテリウムに接合し、得られた株を終夜培養し
、０．１×ＭＳ培地（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、ミズーリ州セン
トルイス）に再懸濁し、ＯＤ_６００＝１．０に希釈して、後述するようにニコチ
アナ・ベンタミアナの細胞間隙に注入した。

【０１５５】実施例４：機能的遺伝子に関するスクリーニングを行なうための植物系の同定遺伝子活性に関する予備的証拠を得るには、機能的活性に関するタバコＲ−遺
伝子、ＮＨＩおよび推定エリシターレセプターのスクリーニングを可能にするモ
デル植物系が必要だった。この植物系は（１）一過性形質転換を著しく受けやす
く、（２）標的病原体フィトフトラ・インフェスタンスおよびシュードモナス・
シリンゲなどのモデル病原体に対して罹病性であり、（３）ＩＮＦ１ペプチドに
は非感受性であるべきである。ニコチアナ・ベンタミアナはこれらの基準の全て
を満たす。一過性形質転換の効率を決定するために、Ｔ−ＤＮＡの境界領域の間
に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を保有するアグロバクテリ
ウム株をＯＤ_６００＝０．１でニコチアナ・ベンタミアナの葉の細胞間隙に注入
した。注入の３日後に、次のプロトコルを使ってプロトプラストを単離した。葉
を小片に切断し、２％セルラーゼ、０．５％マセロザイムＲ−１０、０．５Ｍ
ショ糖および５ｍＭＣａＣｌ_２を含有する溶液中で２時間半消化した。消化産
物を４０μｍ篩に通し、８０〜１００×ｇで４分間遠心分離した。次に、浮遊さ
せたプロトプラストを新しいチューブに移し、光学顕微鏡でその数を数えた。次
いで、ＵＶ照射により、蛍光を発するプロトプラストの数を決定した。全プロト
プラストと蛍光を発するプロトプラストとの比に１００をかけることによって、
形質転換細胞のパーセンテージを決定した。表１に示すようにこの実験と、リポ
ーターとしてＧＦＰ遺伝子の代わりにＧＵＳ遺伝子を用いた同様の実験から、形
質転換頻度は約９０％であることが実証される。

【０１５６】

【表１】

【０１５７】Ｔ−ＤＮＡの境界配列の間にそれぞれ緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とβ−グル
クロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするリポーター遺伝子を保有するアグロバクテ
リウム株を葉に注入した。ＧＵＳ遺伝子は、細菌遺伝子発現を防止するためにイ
ントロンによって分断した。ＧＦＰ遺伝子はゴマノハグサモザイクウイルスの３
５Ｓプロモーターによって駆動され、ＧＵＳ遺伝子はカリフラワーモザイクウイ
ルスの３５Ｓプロモーターによって駆動された。使用したアグロバクテリウム株
はそれぞれＡＢＩとＧＶ２２５０である。浸潤の２日後に、プロトプラストを自
己蛍光についてモニターして、ＧＦＰ発現細胞の頻度を決定した。ＧＵＳ発現細
胞の頻度はＸ−グルクロニドでプロトプラストを染色することによって決定した
。データはＧＦＰについては７つの独立した実験、ＧＵＳについては３つの独立
した実験の平均値である。

【０１５８】タバコなどの他の近縁植物に対して非病原性である真菌病原体に対するニコチ
アナ・ベンタミアナの反応については、ほとんどわかっていない。フィトフトラ
・インフェスタンスに対するニコチアナ・ベンタミアナの罹病性を決定するため
に、６週齢の植物体を８０００胞子／ｍＬの遺伝子型ＵＳ−１およびＵＳ−８に
感染させた。タバコ植物体とジャガイモ植物体をそれぞれ抵抗性および罹病性の
対照として同時に感染させた。感染した植物を暗所で１７℃の湿生長箱に約４０
時間置いて感染を確実にした後、病徴を発生させるために、１６時間明／８時間
暗で１８℃の生長箱に移した。感染の５日後には、ニコチアナ・ベンタミアナ植
物体の広い領域が崩壊していた。トリパンブルーで染色し、抱水クロラールで脱
色した感染葉の顕微鏡分析（Ｋｅｏｇｈら、１９８０）により、病斑における広
範な真菌の成長が明らかになった。予想通りタバコでは何の病徴も観察されなか
ったが、ジャガイモ植物体はすべての地上組織に重度の病徴を示した。

【０１５９】ＩＮＦ１ペプチドに対するニコチアナ・ベンタミアナの低い感受性は、グルタ
チオン−Ｓ−トランスフェラーゼとＩＮＦ１からなる精製融合タンパク質を使っ
て実証された。この融合タンパク質は（１）配列番号５３〜５４に示すプライマ
ーを使ってＩＮＦ１遺伝子を増幅し（２）増幅されたＤＮＡ断片をｐＣＲｓｃｒ
ｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）にサブクローニン
グし、（３）ＢａｍＨＩとＮｏｔＩを使ってこのベクターからＩＮＦ１遺伝子を
切り出し、（４）ＩＮＦ１を含有するそのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩＤＮＡ断片を
ｐＧＥＸ−５Ｘ−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニューヨーク州ピスカタウェイ）に
サブクローニングし、（５）ＧＳＴ−ＩＮＦ１融合物を大腸菌中で発現させ、（
６）その融合タンパク質を先に記述されているように精製する（Ｚｈａｎｇら、
１９９５）ことによって作成した。８葉段階の植物を使って、第３葉に精製タン
パク質を注入した。注入の２日後に、過敏感壊死反応を起こしたのは接種領域の
１０％未満だった。タバコにおける類似の実験では接種領域全体の壊死が起こる
ので、ＩＮＦ１に対するニコチアナ・ベンタミアナの感受性はタバコの少なくと
も１／１０であると結論できる。

【０１６０】機能的な病害Ｒ−遺伝子に関するスクリーニングにニコチアナ・ベンタミアナ
を使用するという発想は二組の実験で実証された。第一に、トマトＲ−遺伝子Ｐ
ｔｏによるニコチアナ・ベンタミアナの安定形質転換は機能的病害抵抗性をもた
らすことが示された（Ｒｏｍｍｅｎｓら、１９９５）。第二に、ニコチアナ・ベ
ンタミアナの葉をタバコ病害Ｒ−遺伝子Ｎ（植物選択可能マーカーとしてのネオ
マイシンホスホトランスフェラーゼと、細菌マーカーとしてのスペクチノマイシ
ン耐性を持つプラスミドＳＰＤＫ１６７、ＢｒａｂａｒａＢａｋｅｒ博士（米
国農務省、オールバニー）から提供されたもの）で一過性に形質転換し、３日後
に、病原体タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）で攻撃した。その攻撃感染の５日
後に、形質転換された組織は、ニコチアナ・ベンタミアナにおけるＮ遺伝子の機
能的活性を示す過敏感反応（ＨＲ）を起こした。ＧＦＰ遺伝子で一過性に形質転
換し、ＴＭＶに感染させた対照植物体には、ＨＲ反応は観察されなかった。

【０１６１】実施例５：Ｒ−遺伝子ホモログとＮＨＩのスクリーニングによる機能的遺伝子
の同定Ｒ−遺伝子ホモログのスクリーニングアグロバクテリウムとコスミドベクターの両方の存在について選択するのに適
した抗生物質を含有する液体ブロス中でアグロバクテリウム株を約２日間生育さ
せた。アグロバクテリウム細胞を沈降させ、ＴＴ培地（０．１×Ｍｕｒａｓｈｉ
ｇｅおよびＳｋｏｏｇの基礎培地＋Ｇａｍｂｏｒｇのビタミン類［Ｓｉｇｍａ
ＭＳＢ５塩類］、３．９ｇ／ＬＭＥＳ（ｐＨ５．４）、２０ｇ／Ｌショ糖お
よび１０ｇ／Ｌグルコース）にＯＤ_６００＝０．０５になるよう再懸濁した。
その細胞懸濁液をニコチアナ・ベンタミアナの葉の細胞間隙に１ｍＬシリンジで
注入した。フィトフトラエリシターＩＮＦ１を認識するＲ−遺伝子は、このニコ
チアナ・ベンタミアナ一過性発現系において、ＩＮＦ１の存在下にＨＲを誘導さ
せると予想された。クラスＩＲ−遺伝子を保有する合計１８１株を注入した、
７例で、注入により、注入後３日以内に迅速なＨＲの発生が起こった。対応する
Ｒ−遺伝子をＲ１〜Ｒ７と名付けた。最初の６つのＲ−遺伝子のＰ−ループとＧ
ＬＰＬＡＬ領域の間の０．５ｋｂ断片を配列解析したところ、タバコＲ−遺伝子
Ｎと最も似ていることが明らかになった。７番目のＲ−遺伝子ホモログは弱いＨ
Ｒしか誘導しなかった。このホモログはトマトＲ−遺伝子Ｐｒｆに最も相同であ
ると思われた。Ｒ１〜Ｒ７によって誘導されるＨＲがＩＮＦ１依存性であること
を確認するために、ＩＮＦ１遺伝子を含有しないバイナリーコスミドベクター０
４５４１に挿入されたタバコゲノムＤＮＡ断片を使って、第２のライブラリーを
構築した。この第２ライブラリーをハイブリダイズするために使用したプローブ
は（１）プライマー配列番号４０〜４１を使ってＲ１〜Ｒ７のＰ−ループ−ＧＬ
ＰＬＡＬ領域を増幅し（２）それらの増幅産物をプールし、放射標識することに
よって作成した。ハイブリダイゼーション陽性クローンをアグロバクテリウムに
接合し、得られた株の細胞懸濁液（ＯＤ_６００＝０．０５）を、ＧＦＰ遺伝子を
保有するバイナリーコスミドまたはＩＮＦ１遺伝子を保有するバイナリーコスミ
ドを含有するアグロバクテリウム株の細胞と、等量ずつ混合した。次に、その混
合した株をニコチアナ・ベンタミアナの細胞間隙に注入した。表２に示すように
、Ｒ１〜Ｒ７遺伝子のホモログ１０種は、ＩＮＦ１によって誘導されるＨＲ反応
を強く増進できた。ＩＮＦ１依存的ＨＲを誘発するこれらＲ１〜Ｒ７遺伝子のタ
バコホモログ１０種をＥｎｈ１〜Ｅｎｈ１０（ｅｎｈａｎｃｅｒｏｆＩＮＦ
１−ｉｎｄｕｃｅｄＨＲ（ＩＮＦ１誘導性ＨＲのエンハンサー））と名付けた
。Ｅｎｈｌ〜Ｅｎｈ１Ｏの部分配列をそれぞれ配列番号１〜１０に示す。図３は
アミノ酸配列配列番号１１〜２０の整列を表し、これらのＲ−遺伝子が高レベル
の相同性を共有していることを示している。

【０１６２】表２．Ｒ−遺伝子のサブセットとＩＮＦ１またはＧＦＰとの同時発現に対する
ニコチアナ・ベンタミアナの反応ＩＮＦ１の存在下でＨＲを誘発する能力に関してＲ−遺伝子のホモログをスク
リーニングするために、植物にアグロバクテリウム株の同時注入−そのうちの一
つはＲ−遺伝子ホモログを含有し、もう一つはＩＮＦ１遺伝子を含有するもの−
を行なった。対照として、Ｒ−遺伝子ホモログを保有するアグロバクテリウム株
とＧＦＰ遺伝子を保有するアグロバクテリウム株との同時注入を行なった。注入
の４日後および７日後（４ＤＡＩおよび７ＤＡＩ）に、ＨＲの程度を測定した。
「−」：被注入組織の＜１０％がＨＲで反応；「＋」１０〜２０％ＨＲ；「＋＋
」２０〜５０％ＨＲ；「＋＋＋」：５０〜１００％ＨＲ。

【０１６３】

【表２】

【０１６４】機能未知のタバコＲ−遺伝子ホモログを保有するバイナリーコスミドベクター
は、アグロバクテリウムによる形質転換法でニコチアナ・ベンタミアナに安定に
導入することができる。この方法で、異なる植物がそれぞれ少なくとも１つのタ
バコＲ−遺伝子を発現させるトランスジェニックニコチアナ・ベンタミアナ植物
体のライブラリーを作成できる。行なう必要がある独立した形質転換の数を制限
するために、本研究者らは、クラスＩＲ−遺伝子ホモログを保持するバイナリ
ーベクターを含有する約１８０のアグロバクテリウム株を、それぞれ１０株ずつ
の１８プールにグループ分けした。各プールにつき２５系統のトランスジェニッ
クニコチアナ・ベンタミアナを作成した。タバコでは非病原性でありニコチアナ
・ベンタミアナでは病原性である任意の病原体に対する病害抵抗性に関するスク
リーニングを、異なるプールから単離された種子を使って行なうことができる。
そのような病原体に対して抵抗性を示すトランスジェニックニコチアナ・ベンタ
ミアナ植物体は機能的なタバコＲ−遺伝子を含有する可能性がある。このＲ−遺
伝子の配列は、タバコＤＮＡインサートに隣接するＴ−ＤＮＡ配列に特異的なプ
ライマーを使ってＰＣＲ反応（例えば長距離ＰＣＲまたはインバースＰＣＲ）を
行なうことによって決定できる。次にこのＲ−遺伝子を、適当なベクターへのク
ローニングと形質転換によって任意の対象作物に導入して、標的病原体に対する
病害抵抗性をその作物で発達させることができる。

【０１６５】本願にはＲ−遺伝子に対して相同性を有する配列を数多く記載した。これらの
遺伝子はいずれも、植物の分離集団における抵抗性の分離を研究するためのプロ
ーブとして使用できる。この方法で、抵抗性と同時分離するサザンブロット上の
バンドを同定することが可能だろう。これらのバンドは抵抗性の優れたマーカー
であり、そのようなマーカーとして育種計画に使用できる。また、これらのバン
ドは分離Ｒ−遺伝子自体を可視化しうる。したがってここに記載するＲ−遺伝子
ホモログ配列は、Ｒ−遺伝子のマッピングと単離の両方に役立ちうる。例えば、
本研究者らは、上述した全てのサブクラス代表ＤＮＡ断片を、フィトフトラ・イ
ンフェスタンスのＵＳ−８遺伝子型に対する抵抗性に関して分離するジャガイモ
植物体のＤＮＡを含有するサザンブロットで、プローブとして試験した。標準的
条件でプライマー配列番号４０〜４１を使ってタバコＤＮＡから増幅されたＤＮ
Ａ断片（配列番号２９）を使用することにより、本研究者らは、罹病性植物体に
は常に存在しない１つのバンドを多くの抵抗性植物中に同定した。

【０１６６】ニコチアナ・ベンタミアナへの能動的Ｒ−遺伝子ホモログの安定形質転換ＩＮＦ１−誘導性ＨＲを増進させるＥｎｈ遺伝子の能力がトランスジェニック
ニコチアナ・ベンタミアナ植物体におけるフィトフトラ・インフェスタンスに対
する病害抵抗性の増加につながるかどうかを調べるために、１０種類のＥｎｈ遺
伝子（配列番号１〜１０）を、アグロバクテリウムによる形質転換法で、この植
物種に導入した。これらの形質転換は次のように行なった。無菌株繁殖小植物体
（ｓｔｅｒｉｌｉｅｓｔｏｃｋ−ｐｒｏｐａｒａｇｅｄｐｌａｎｔｌｅｔ）
を使ってリーフディスクを作成し、そのリーフディスクを、２ｍＬの液体ＴＸＤ
培地（４．３ｇ／ＬＭＳ塩類、２ｍＬ／ＬＧａｍｂｏｒｇのＢ−５（５００
倍）、４ｍｇ／Ｌｐ−クロロフェノキシ酢酸（ｐ−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｒｏｘ
ｙａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）、０．００５ｍｇ／Ｌキネチン、３０ｇ／Ｌショ糖
、ｐＨ５．８）と滅菌Ｗｈａｔｍａｎろ紙ディスクとが加えられている固形ＭＳ
１０４前培養プレート上に置いた。温かい部屋（２３℃、終夜照明）で１〜２日
間リーフディスクの前培養した後、テトラサイクリン（２ｍｇ／Ｌ）、クロラム
フェニコール（３５ｍｇ／Ｌ）およびカナマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）を補足し
たＬＢ培地中の終夜生育培養物を１０倍希釈して得たアグロバクテリウム懸濁液
７ｍＬを、前培養プレートに加えた。１５分後に、過剰のアグロバクテリウムを
吸引し、外植体を残りのアグロバクテリウム細胞と２〜３日間、共培養した。次
に、カルベニシリン（５００ｍｇ／Ｌ）、セフォタキシム（１００ｍｇ／Ｌ）お
よびバンコマイシン（１５０ｍｇ／Ｌ）を含有するＭＳ１０４（４．４ｇ／Ｌ
ＭＳ基礎塩類＋Ｂ５ビタミン類、３０ｇ／Ｌショ糖、１．０ｍｇ／Ｌ６−ベ
ンジルアミノプリン、Ｏ．１ｍｇ／Ｌ α−ナフタレン酢酸、９ｇ／Ｌ寒天）プ
レートに外植片を移した。３日後、トランスジェニック細胞の選択と再生のため
に、カルベニシリン（５００ｍｇ／ｌ）、セフォタキシム（１００ｍｇ／Ｌ）、
バンコマイシン（１５０ｍｇ／Ｌ）およびカナマイシン（３００ｍｇ／Ｌ）を含
むＭＳ１０４プレートに外植体を移した。頂端分裂組織を含む伸長したシュート
を、カルスから切除し、カルベニシリン（５００ｍｇ／Ｌ）を含有するＭＳＯ培
地（４．４ｇ／ＬＭＳ基礎塩類＋Ｂ５ビタミン類、３０ｇ／Ｌショ糖、９ｇ／
Ｌ寒天）で培養した。次に、根のついたシュートを４インチ植木鉢に移して、ト
ランスジェニック小植物体を生成させた。これらの小植物体と非形質転換対照と
を、生長箱中、１８℃、１６時間明／８時間暗で栽培した。約３週間後に、植物
を約１０^４胞子嚢／ｍＬのフィトフトラ・インフェスタンスのＵＳ−８遺伝子型
に感染させた。接種した植物体を暗所で１７℃の湿生長箱に約４０時間置いて感
染を確実にした後、疫病の病徴を発生させるために１８℃の生長箱に移した。病
徴で覆われている葉組織のパーセンテージを見積もることにより、病害の発病度
を接種後３日、４日および５日に評価した。

【０１６７】大半のトランスジェニック植物はフィトフトラ・インフェスタンス感染に対し
て対照植物体と同じように反応して、感染の５日後には激しい病徴を示し、葉組
織の４５％〜５０％が崩壊した。Ｅｎｈ３（配列番号３）の３１の植物体のうち
２つは何の病徴も示さず、抵抗性であるようだった。Ｅｎｈ６（配列番号６）を
含有する４０の植物体のうちの１つ（フィトフトラ・インフェスタンスにより組
織の５％が損傷）と、Ｅｎｈ９（配列番号９）を保有する３０の植物体のうちの
１つ（葉組織の１５％が損傷）に、ほとんど同じレベルの抵抗性が観察された。
抵抗性が導入遺伝子の存在によるものかどうか確認するために、抵抗性トランス
ジェニック植物を自家受精させた。Ｅｎｈ６植物体とＥｎｈ９植物体から得たト
ランスジェニック種子を土に植えて、導入遺伝子に関して分離する２つの集団を
作った。第３の集団は非形質転換対照植物体から得た。抵抗性Ｅｎｈ３系統は不
稔であるらしく、さらなる分析には使用できなかった。発芽の６週間後に、植物
体を約１０^４胞子嚢／ｍＬのフィトフトラ・インフェスタンスのＵＳ−８遺伝子
型に感染させた。病原体感染の５日後、Ｅｎｈ６とＥｎｈ９に関して分離する集
団における崩壊した葉組織の平均パーセンテージはどちらの場合も３３％だった
。対照植物におけるフィトフトラ・インフェスタンス誘導性損傷ははるかに高く
、平均５５％だった。

【０１６８】このようにＥｎｈ６とＥｎｈ９は（そしておそらくＥｎｈ３も）ニコチアナ・
ベンタミアナにおけるフィトフトラ・インフェスタンスの部分的防除を与える。
これら３つの遺伝子は高レベルの配列相同性を共有しているので、これらはおそ
らく同じ作用様式を持つだろう。この作用様式は、おそらく、ＩＮＦ１誘導性Ｈ
Ｒの増進に基づくのだろう。Ｅｎｈ遺伝子の過剰発現は病害抵抗性のさらなる増
進をもたらす可能性がある。また、Ｅｎｈ遺伝子またはそれら遺伝子のホモログ
は、フィトフトラ・メガスペルマ（Ｐ．ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ）、フィトフト
ラ・ドレクスレリ（Ｐ．ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｉ）、フィトフトラ・カプシキ（
Ｐ．ｃａｐｓｉｃｉ）、フィトフトラ・カクトルム（Ｐ．ｃａｃｔｏｒｕｍ
）、フィトフトラ・クリプトギ（Ｐ．ｃｒｙｐｔｏｇｅａ）およびフィトフト
ラ・シンナモミ（Ｐ．ｃｉｎｎａｍｏｍｉ）を含むフィトフトラの他の種に対
する耐性にも関与する可能性がある。なぜなら、これらは全て、構造がＩＮＦ１
に極めて類似していてタバコでＨＲを誘導するエリシターをコードするからであ
る（Ｙｕ、１９９５）。これらの遺伝子は、ＩＮＦ１様エリシターを産生するピ
チウム・ベクサンス（Ｐｙｔｈｉｕｍｖｅｘａｎｓ）などの他の病原体に対す
る抵抗性を与える可能性さえある。フィトフトラ・インフェスタンスに対するタ
バコの非宿主抵抗性の永続性の一因は、タバコがエリシターＩＮＦ１の認識に関
与する機能的なＲ−遺伝子を少なくとも４つ含有しているという事実にあるのだ
ろう。

【０１６９】フィトフトラ・インフェスタンス以外のフィトフトラ種の防除にＩＮＦ１を認
識するＲ−遺伝子を応用できることを実証するために、本発明者らは、ダイズに
おける疫病の病原であるフィトフトラ・ソーヤのエリシターコード遺伝子を単離
した。この遺伝子は、配列番号５５〜５６に示す２つのプライマーを使ってフィ
トフトラ・ソーヤ全ＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行なうことによって単離できる
。そのＰＣＲ産物はＰＣＲｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリ
フォルニア州ラホーヤ）にサブクローニングして、増幅されたＤＮＡが完全であ
ることを確認するために配列決定することができる。ＩＮＦ１相同遺伝子を含有
するＫｐｎＩとＢｇｌＩＩで消化された３００ｂｐ断片を、ＸｂａＩとＫｐｎＩ
で消化したＰＲ１遺伝子の１００ｂｐシグナルペプチド配列（Ｈａｍｍｏｎｄ−
Ｋｏｓａｃｋら、１９９４）と連結し、ｐＭＯＮ１１７７０ベクター（図２）に
サブクリーニングすることができる。次に、ＦＭＶプロモーター、シグナルペプ
チド、フィトフトラ・ソーヤエリシチンおよびｎｏｓターミネーターを含有する
ＮｏｔＩ消化断片を精製し、ｐＭＯＮ１７２２７（図４）Ｔ−ＤＮＡバイナリー
ベクターにサブクローニングすることができる。成功したクローンを選択し、さ
らなる試験のためにアグロバクテリウムに接合させることができる。

【０１７０】Ｅｎｈ遺伝子のＨＲ増進活性は、フィトフトラ種のエリシターに限らないかも
しれない。Ｅｎｈ遺伝子の発現または過剰発現はウイルス、細菌または真菌病原
体の広域防除をもたらす可能性がある。これは病害抵抗性に関与するシグナル伝
達経路の自発的誘発によるものであるかもしれない。

【０１７１】ＮＨＩのスクリーニング抵抗性関連遺伝子の活性の指標は、これらの遺伝子を一過性に発現するニコチ
アナ・ベンタミアナ葉を、「野火」病の病原である病原性細菌病原体シュードモ
ナス・タバキにさらすことによって得ることができる。この目的のために、問題
にしている遺伝子を含有するｐＭＯＮ３０６５６（図５）誘導体を保有するアグ
ロバクテリウム株を、葉の右半分に注入した。対照として、葉の左半分には、バ
イナリーベクターｐＭＯＮ３０６５６を含有するアグロバクテリウム株を注入し
た。注入の２日後に、葉の左半分と右半分に細菌懸濁液を注入した。この懸濁液
は、シュードモナス・タバキ（Ｐ．ｔａｂａｃｉ）の終夜培養物を１０ｍＭ
ＭｇＣｌ_２で洗浄し、この懸濁液をＯＤ_６００が０．００１（１０^６コロニー形
成単位に相当）になるように希釈することによって得た（Ｒｏｍｍｅｎｓら、１
９９５）。病原体攻撃の４日後に、葉の右半分での病害の進行を、対照である左
半分での病害の進行と比較した。

【０１７２】この方法で現在までに分析した２つの遺伝子のうち、一つの遺伝子の発現は、
野火病を部分的に防除することが示された。ＴＯＢ−Ｆ１２（配列番号５８）は
、ダウクス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓｃａｒｏｔａ）の２１ｋＤａタンパク質の
ホモログをコードし、コメ細菌病原体キサントモナス属に対する抵抗性に関与す
るレセプターキナーゼ（Ｓｏｎｇら、１９９５）であるＸａ２１と共通するいく
つかの保存されたアミノ酸をＮ末端領域に持つ。

【０１７３】Ｎｈｒ１の試験ＨＲの誘導がＩＮＦ１依存性であることを実証するために、ＩＮＦ１を含有し
ない第２のコスミドライブラリーを作成した。Ｎｈｒ１にハイブリダイズするク
ローンをアグロバクテリウムに接合し、Ｔ−ＤＮＡの境界配列の間にＩＮＦ１遺
伝子または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を保有するアグロ
バクテリウム株と混合した。混合した株をニコチアナ・ベンタミアナの葉にＯＤ _６００＝０．３で注入した。試験した５株うち３株が注入後３日以内にＩＮＦ１
の存在下でＨＲを誘導した。５日後には５株すべてがＨＲを誘導し、それら５株
のうちの１株はＯＤ_６００＝０．１でもＨＲを誘導した。このコスミドＮｈｒ１
クローンを使って、ＩＮＦ１存在下でのそのＨＲ誘導能をさらに分析した（表３
）。ＧＦＰの存在下ではＨＲは誘導されず、ＨＲを誘導する能力がＩＮＦ１依存
性であることが示された。

【０１７４】

【表３】

【０１７５】ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ（インディアナ州インディアナポリ
ス）製の５’／３’ＲＡＣＥキットを使用し、製造者のプロトコルに従って、完
全長ｃＤＮＡ型のＮｈｒ１を単離した。５’ＲＡＣＥに使用したプライマーは、
配列番号６１：ＴＡＡＧＣＣＴＣＴＣＧＡＣＡＣＡＴＧＧＣ配列番号６２：ＴＣＧＧＴＴＧＣＡＣＡＡＴＴＡＧＴＧＧＣ配列番号６３：ＣＧＡＴＴＣＧＴＧＧＣＡＣＡＡＣＡＴＴＣである。３’ＲＡＣＥに使用したプライマーは、配列番号６４：ＴＧＧＴＣＡＡＡＧＴＡＴＴＧＣＣＡＣＣ配列番号６５：ＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧ配列番号６６：ＴＴＡＧＧＴＧＴＡＣＡＧＴＧＴＡＣＣＣＣである。

【０１７６】完全長配列を配列番号６０に示す。

【０１７７】実施例６：疫病病害抵抗性を付与するためのジャガイモへの能動的遺伝子のク
ローニングモデル系でＨＲおよび／または防御反応を増進すると同定された非宿主遺伝子
は全て、作物における病害防除を増進するためのよい候補である。上記の研究で
は、ニコチアナ・ベンタミアナにおける一過性または安定発現時にＩＮＦ１誘導
性ＨＲを増進できるＥｎｈおよびＮｈｒ１遺伝子を含有するバイナリーコスミド
ベクターを同定した。同じバイナリーベクターを使ってジャガイモを安定に形質
転換した。

【０１７８】Ｅｎｈ３遺伝子を持つバイナリーコスミドベクター（ｐＭＯＮ３０６２１；図
７）（配列番号３）を保有するアグロバクテリウム株を、２μｇ／ｍＬテトラサ
イクリン、５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコ
ールを含有するＬＢ培地２ｍＬで終夜生育させた。翌日、その細菌を、１リット
ル中にＭＳ塩類（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、ミズーリ州セントル
イス）４．４ｇ、ショ糖３０ｇおよびビタミンＢ５２ｍＬを含有するＭＳＯ培
地（ｐＨ７．５）で１：１０希釈、または６００ｎｍでの光学密度測定値が０．
１になるまで希釈した。

【０１７９】１リットルあたりＭＳ塩類４．４ｇ、ショ糖３０ｇ、ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ０．１７ｇ、チアミン−ＨＣｌ０．４ｍｇ、アスコルビン酸２５ｇおよび
イノシトール０．１ｇを含有するＰＭ培地（ｐＨ６．０）と０．２％ゲルライト
アガー上、温度１９℃、１６時間明／８時間暗周期および光強度１００μＥ／秒
／ｍ^２で、無菌条件下に、節を含む茎挿しから３週間生育させたジャガイモ植物
体（ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））の茎から
葉を除去した。茎を３〜５ｍｍセグメントに切断した。

【０１８０】接種前に、３０個の茎セグメントを同時培養プレートにおいて、非接種対照と
した。同時培養プレートは、１ＸＭＳ塩類、５．０ｍｇ／Ｌゼアチンリボシド、
１０ｍｇ／ＬＡｇＮＯ_３、３％ショ糖、５００ｍｇ／Ｌカルベニシリン、０．
３ｍｇ／ＬＧＡ_３および０．０２５ｍＭグリホサートを含有する０．９％寒天
固化カルス誘導培地を含んだ。８週間後にシュートが現れはじめた。外植体を１
２週間にわたって４週間ごとに新鮮なシュート誘導培地に移した。シュートをカ
ルスから切除し、０．２％ゲルライトアガーで固化したＰＭ培地上に約２週間置
いた。得られた植物体を使って、１形質転換事象あたり少なくとも４本の挿し木
からなるトランスジェニック系統を作成した。挿し木が十分に大きくなり根を出
したら直ちに、１系統につき３本の挿し木を土に挿した。

【０１８１】トランスジェニック小植物体と、非形質転換対照から得た小植物体とを、１８
℃の生長箱中の４インチ植木鉢で栽培した。約３週間後に、植物体に約１０^４胞
子嚢／ｍＬのフィトフトラ・インフェスタンスのＵＳ−８遺伝子型を接種した。
接種した植物体を１７℃の湿生長箱に約４０時間置いて感染を保証した後、疫病
の病徴を発生させるために、１８℃の生長箱に移した。発病度を接種の３日、４
日および５日後に、病徴によって覆われた葉組織のパーセンテージを見積もるこ
とによって評価した。対照植物体はフィトフトラ・インフェスタンスに激しく感
染し、３日目に組織の２５％が病原体によって損傷を受けた。感染の５日後には
、迅速な病害の進行により、葉組織の８３％の崩壊が起こっていた。全対照植物
体の平均「病害進行曲線下面積（ａｒｅａｕｎｄｅｒｔｈｅｄｉｓｅａｓ
ｅｐｒｏｇｒｅｓｓｃｕｒｖｅ）」（ＡＵＤＰＣ）（これは罹病性のレベル
の信頼できる指標である）は１０７だった。トランスジェニック系統の一部は対
照植物と同じくフィトフトラ・インフェスタンスに対して罹病性であるらしく、
これらの系統では導入遺伝子が存在しないかその発現が不十分であることを示し
た。興味深いことに、４つのトランスジェニック系統が一貫して有意に増進した
抵抗性を示し、第五日で５０〜６０％の病徴しか示さなかった。これらの系統の
ＡＵＤＰＣ値は６０〜７０だった。この結果は、ジャガイモにおけるＥｎｈ３の
発現が、フィトフトラ・インフェスタンスに対する病害抵抗性の増進をもたらし
うることを示している。

【０１８２】コスミドクローンＮｈｒ１（ｐＭＯＮ３０６２０；図６）をジャガイモ栽培品
種ラセット・バーバンク（ＲｕｓｓｅｔＢｕｒｂａｎｋ）に上述のように安定
に形質転換した。合計５０の推定トランスジェニック系統を作出した。病害試験
により、６つのトランスジェニック系統がフィトフトラ・インフェスタンスＵＳ
８菌系に対して増進した抵抗性を示すことが明らかになった。その増進した抵抗
性を確認するために、完全長Ｎｈｒ１遺伝子を含有するそれら６系統のうちの１
つ、５６４３３を選択した。５６４３３および３つのベクター対照系統のそれぞ
れ６本の挿し木をフィトフトラ・インフェスタンスで攻撃した。病害進行データ
を表４に要約する。５６４３３系統は抵抗性を有意に増進し、フィトフトラ・イ
ンフェスタンス接種後５日（５ｄａｉ）で病害防除率は約３７％だった。５６４
３３系統のノーザンブロット分析により、Ｎｈｒ１遺伝子の発現はこの植物では
極めて低く、タバコで発現されるレベルの１０分の１に満たないことが明らかに
なった。本発明者らは、ジャガイモにおけるＮｈｒ１遺伝子の発現量を増やすこ
とで、抵抗性を有意に増加させることができると考える。

【０１８３】

【表４】

【０１８４】実施例７：Ｅｎｈ３の完全長配列予備データから、トランスジェニックジャガイモ植物体でのＥｎｈ３遺伝子発
現レベルが極めて低いことが示唆された。トランスジェニックジャガイモ植物体
におけるＥｎｈ３遺伝子発現レベルの増加は、Ｅｎｈ３によるフィトフトラ・イ
ンフェスタンスに対する病害抵抗性のさらなる増加につながる可能性がある。Ｅ
ｎｈ３遺伝子を過剰発現させることによってトランスジェニックジャガイモ植物
体における病害抵抗性をさらに増加させることが可能だろう。ノパリンシンター
ゼ遺伝子のプロモーターなどのプロモーターにＥｎｈ３遺伝子を融合するために
、Ｅｎｈ３の完全長ゲノム配列（配列番５７）をＡＢＩＰＲＩＳＭダイターミ
ネーターサイクルシークエンシング（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、カリフォルニ
ア州フォスターシティー）によって決定した。ｃＤＮＡクローンはまだ入手でき
ないので、Ｅｎｈ３とその最も近縁のホモログ（タバコモザイクウイルスに対す
る機能的活性を有するタバコ病害抵抗性遺伝子Ｎ）との相同性のレベルを予想す
ることはまだできない。しかし現時点での概算値は、ＤＮＡレベルで約６５％の
全体的相同性を示している。

【０１８５】本明細書で言及した全ての刊行物と特許出願は本発明が属する技術分野の当業
者の技術水準を示している。全ての刊行物と特許出願は、あたかも参照によりこ
こに組み込まれる旨を各刊行物または特許出願について限定的かつ個別に表示し
たかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

【０１８６】例示のために本発明を詳しく説明したが、そのような詳細は単なる例示に過ぎ
ず、当業者は本願特許請求の範囲に規定される本発明の精神と範囲から逸脱する
ことなく、これらに変更を加えることができると解される。

【０１８７】

【表５】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】バイナリーコスミドベクター０４５４１および０４５４１ＭのＴ−ＤＮＡ構造
を表す図である。ＬＢ＝左境界配列、ＲＢ＝右境界配列、Ｐ−３５Ｓ＝カリフラ
ワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、ＮＰＴ＝ネオマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼ遺伝子、ｏｃｓ３’＝オクトピンシンターゼ遺伝子の終結配列、
Ｐ−ＦＭＶ＝ゴマノハグサモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、ｓｐ＝ＰＲ
１ａのシグナルペプチドをコードする配列、ｎｏｓ３’＝ノパリンシンターゼ遺
伝子の終結配列。図は一定の縮尺では描かれていない。ＩＮＦ１を含有するＨｉ
ｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩＤＮＡ断片の向きは反対でもよい。

【図２】ｐＭＯＮ１１７７０のプラスミド地図を表す図である。

【図３】ＩＮＦ１誘導性ＨＲの増進に関与する１０種類のＲ−遺伝子ホモログの推定部
分アミノ酸配列（配列番号１１〜２２）の整列を表す図である。

【図４】ｐＭＯＮ１７２２７のプラスミド地図を表す図である。

【図５】ｐＭＯＮ３０６５６のプラスミド地図を表す図である。

【図６】ｐＭＯＮ３０６２０のプラスミド地図を表す図である。

【図７】ｐＭＯＮ３０６２１のプラスミド地図を表す図である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１０月１１日（２０００．１０．１１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ヤン，ホアアメリカ合衆国、ミズーリ・63088、チエスターフイールド、クレセント・リツジ・ドライブ・837 (72)発明者チヤン，ペイアメリカ合衆国、ミズーリ・63021、ボールウイン、オークウツド・フアームス・レーン・1056 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AA03 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 CB02 CD02 CD06 CD09 CD10 4B024 AA08 AA11 BA80 CA04 DA01 DA05 EA04 EA05 GA11 HA12 4B063 QA01 QA06 QQ09 QQ13 QQ43 QR08 QR32 QR42 QR56 QS25 QS34 QX07 4B065 AA11X AA88X AA88Y AB01 BA02 CA24 CA46 CA53

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】対象とする病原体またはエリシターに対して抵抗性である非
宿主植物を選択する工程、前記抵抗性植物中に存在する完全長抵抗性遺伝子ホモログを回収する工程、病原体感受性植物の組織を前記ホモログで形質転換することにより、前記ホモ
ログを機能性に関してスクリーニングする工程、前記形質転換組織をエリシターまたは病原体で攻撃する工程、および対象とする病原体に対する機能的活性を観察する工程、からなる、植物病原体またはエリシターに対する抵抗性を付与するタンパク質を
コードする核酸配列の同定方法。
【請求項２】対象とする病原体またはエリシターに対して抵抗性である前
記植物が過敏感反応による抵抗性を示す請求項１に記載の方法。
【請求項３】対象とする病原体またはエリシターに対して抵抗性である前
記植物がタバコである請求項２に記載の方法。
【請求項４】対象とする病原体またはエリシターに対して抵抗性である前
記植物がソラヌム・ミクロドンツム（Ｓｏｌａｎｕｍｍｉｃｒｏｄｏｎｔｕｍ
）アクセッション４９８１２４である請求項２に記載の方法。
【請求項５】前記対象とする病原体がフィトフトラ・インフェスタンス（
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｉｎｆｅｓｔａｎｓ）である請求項１に記載の方法
。
【請求項６】前記完全長抵抗性遺伝子ホモログが配列番号３７〜４８に記
載のプライマーによる遺伝子増幅を使って回収される請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記形質転換がアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）による形質転換である請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記病原体感受性植物がニコチアナ・ベンタミアナ（Ｎｉｃ
ｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）である請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記エリシターによる前記攻撃が前記エリシターの遺伝子と
の同時形質転換によって行なわれる請求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記エリシターがＩＮＦ１である請求項１の方法。
【請求項１１】前記機能的活性を病原体またはエリシター依存性過敏感反
応の存在によって同定することができる請求項１に記載の方法。
【請求項１２】植物病原体中の非病原性遺伝子に反応することによって植
物に非宿主病害抵抗性を付与する核酸セグメント。
【請求項１３】エリシターＩＮＦ１に反応する請求項１２に記載の核酸セ
グメント。
【請求項１４】配列番号１〜１０または配列番号５７または配列番号５８
または配列番号６０の核酸配列からなる請求項１２に記載の核酸セグメント。
【請求項１５】配列番号１１〜２０に相当するアミノ酸配列をコードする
請求項１２に記載の核酸セグメント。
【請求項１６】請求項１〜１０の核酸配列またはその相補配列または高ス
トリンジェンシー条件で配列番号１〜１０にハイブリダイズする配列からなる核
酸セグメント。
【請求項１７】配列番号２１〜３０またはその相補配列または高ストリン
ジェンシー条件で配列番号２１〜３０にハイブリダイズする配列からなる核酸セ
グメント。
【請求項１８】配列番号３１〜３６またはその相補配列または高ストリン
ジェンシー条件で配列番号３１〜３６にハイブリダイズする配列からなる核酸セ
グメント。
【請求項１９】配列番号５７またはその相補配列または高ストリンジェン
シー条件で配列番号５７にハイブリダイズする配列からなる核酸セグメント。
【請求項２０】配列番号５８またはその相補配列または高ストリンジェン
シー条件で配列番号５８にハイブリダイズする配列からなる核酸セグメント。
【請求項２１】配列番号６０またはその相補配列または高ストリンジェン
シー条件で配列番号６０にハイブリダイズする配列からなる核酸セグメント。
【請求項２２】植物病原体中の非病原性遺伝子に反応することによって植
物に非宿主病害抵抗性を付与する異種ＤＮＡが挿入されている発現ベクターから
なる組換えＤＮＡ発現系。
【請求項２３】植物病原体中の非病原性遺伝子に反応することによって植
物に非宿主抵抗性を付与する異種ＤＮＡで形質転換された細胞。
【請求項２４】前記異種ＤＮＡが請求項１１〜２０に相当するアミノ酸配
列をコードする請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】植物細胞および細菌からなる群より選択される請求項２３
の細胞。
【請求項２６】裸子植物、単子葉植物および双子葉植物からなる群より選
択される植物細胞である請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】アカシア属（Ａｃａｃｉａ）、リンゴ、バナナ、オオムギ
、マメ、ブロッコリ、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、柑橘、コーヒー、トウ
モロコシ、綿、キュウリ、アメリカトガサワラ、ユーカリ、ニンニク、ブドウ、
テーダマツ、メロン、エンバク、アブラヤシ、タマネギ、観賞植物、エンドウ、
ピーナツ、コショウ、ポプラの木、ジャガイモ、ラジアータマツ、コメ、ライム
ギ、モロコシ、サザンパイン、ダイズ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワ
リ、モミジバフウ、茶、トマト、芝、蔓植物およびコムギからなる群より選択さ
れる作物植物細胞である請求項２６の細胞。
【請求項２８】アグロバクテリウム属に由来する請求項２５の細胞。
【請求項２９】前記異種ＤＮＡが発現ベクターからなる組換えＤＮＡ発現
系に挿入される請求項２３に記載の細胞。
【請求項３０】前記植物病原体がフィトフトラ・インフェスタンスである
請求項２３に記載の細胞。
【請求項３１】植物病原体中の非病原性遺伝子に反応することによって植
物に非宿主病害抵抗性を付与する核酸セグメントで形質転換されたトランスジェ
ニック植物。
【請求項３２】前記植物病原体がフィトフトラ・インフェスタンスである
請求項３１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３３】前記核酸セグメントが配列番号１１〜２０に相当するアミ
ノ酸配列をコードする請求項３１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３４】裸子植物、単子葉植物および双子葉植物からなる群より選
択される請求項３１のトランスジェニック植物。
【請求項３５】アカシア属、リンゴ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコ
リ、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、柑橘、コーヒー、トウモロコシ、綿、キ
ュウリ、アメリカトガサワラ、ユーカリ、ニンニク、ブドウ、テーダマツ、メロ
ン、エンバク、アブラヤシ、タマネギ、観賞植物、エンドウ、ピーナツ、コショ
ウ、ポプラの木、ジャガイモ、ラジアータマツ、コメ、ライムギ、モロコシ、サ
ザンパイン、ダイズ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、モミジバフウ
、茶、トマト、芝、蔓植物およびコムギからなる群より選択される請求項３４に
記載のトランスジェニック植物。
【請求項３６】対象とする病原体に対して当該植物を抵抗性にする請求項
１に記載の方法で単離されたＲ−遺伝子で形質転換された植物。
【請求項３７】核酸セグメント配列番号１〜１０または配列番号５７また
は配列番号５８または配列番号６０を含有する診断キット。