CN108949798B - 农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及小麦矮腥黑粉菌的遗传转化，具体涉及农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化方法。包括：培养TCK冬孢子，当萌发率≥60％时收集菌丝，配制1×10⁶个/ml的菌丝液；将农杆菌接种于LB培养基中，28℃振荡培养2‑3d，用IM培养基稀释至OD₆₀₀为0.15‑0.35，继续培养7‑8h，用IM培养基稀释至OD₆₀₀为0.53‑0.59；在CM培养基上铺一层无菌玻璃纸，将农杆菌菌液与菌丝液等体积混合后涂布于玻璃纸上，20‑22℃黑暗培养48h；然后将玻璃纸转移至新的CM培养基上，使涂布有菌液的一面贴合培养基，5℃黑暗培养至菌落长出。该方法能够将外源基因成功转入小麦矮腥黑粉菌基因组中并稳定遗传。

Description

农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化方法

技术领域

本发明涉及小麦矮腥黑粉菌的遗传转化，具体涉及农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化方法。

背景技术

小麦矮腥黑粉菌(TilletiacontroversaKühn,TCK)引起的小麦矮腥黑穗病是世界上最具破坏性的小麦病害之一，矮腥黑粉菌通过产生有毒的黑色真菌冬孢子释放鱼腥味的三甲胺，致使小麦减产和品质降低，给小麦生产造成毁灭性的危害。因此，对小麦矮腥黑穗病的防治刻不容缓。有关小麦矮腥黑粉菌的致病基因及致病分子机理尚不清楚，而构建大容量的小麦矮腥黑粉菌转化子库是研究该病菌功能基因及小麦和矮腥黑粉菌互作的基础。

在众多真菌遗传转化方法中，农杆菌介导的转化技术(Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation，ATMT)不仅具有操作简便、转化效率高、受体不受限制等优点，而且转化子稳定性好、T-DNA在真菌基因组中多为单拷贝插入。自从1973年Mishra等首次报道真菌遗传转化以来，该技术已在多种真菌的遗传转化中得到广泛应用。1983年，Banks等利用PEG-CaCl₂介导含有氨基糖苷类抗生物素基因质粒转化到玉米黑粉菌的原生质中是黑粉菌转基因研究的开始，之后又有学者利用潮霉素和PEG-CaCl₂方法转化质粒，通过同源或非同源重组的方式整合到玉米黑粉菌基因组中；张新明不仅建立了大麦坚黑粉菌的遗传转化体系并对转化相关因子做了优化，并且还比较了电击法、PEG-CaCl₂和农杆菌介导法(ATMT)对大麦坚黑粉菌的转化效率，证明了ATMT法明显优于其他两种方法。

目前，对于小麦矮腥黑粉菌的研究多集中在形态鉴定和分类，关于根癌农杆菌介导小麦矮腥黑粉菌的遗传转化体系还未建立。鉴于此，利用ATMT方法对小麦矮腥黑粉菌进行遗传转化研究，建立低成本、快速、高效的小麦矮腥黑粉菌转化体系，将为小麦矮腥黑粉菌突变体库的构建、致病分子机制的研究、致病相关基因克隆及功能研究奠定基础。

发明内容

为了促进小麦矮腥黑粉菌致病分子机制的研究，本发明提供一种小麦矮腥黑粉菌的农杆菌转化方法，该方法能够将外源基因成功转入小麦矮腥黑粉菌基因组中并稳定遗传。

本发明请求保护的技术方案如下：

农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)菌丝液制备：培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子，当冬孢子萌发率≥60％时收集菌丝，离心去上清液，然后用灭菌水配制浓度为1×10⁶个/ml的菌丝液；

(2)农杆菌菌液制备：将含有表达载体的农杆菌接种于LB液体培养基中，28℃振荡培养2-3d，用IM培养基稀释菌液至OD₆₀₀为0.15-0.35，继续振荡培养7-8h，然后用IM培养基稀释菌液至OD₆₀₀为0.53-0.59；

(3)在CM固体培养基上铺一层无菌玻璃纸，将OD₆₀₀为0.53-0.59的农杆菌菌液与1×10⁶个/ml的菌丝液等体积混合后涂布于玻璃纸上，置于20-22℃黑暗培养48h；然后将玻璃纸转移至新的CM固体培养基上，使涂布有菌液的一面贴合培养基，5℃黑暗培养至菌落长出。

优选地，所述农杆菌为根癌农杆菌菌株EHA105。

优选地，培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子的步骤如下：配制浓度为1×10⁶个/mL的冬孢子悬浮液，取冬孢子悬浮液涂布于土壤浸提液培养基上，置于温度为5℃、相对湿度为50％的人工气候生长培养箱中进行全光照培养。

优选地，所述土壤浸提液培养基的配方为：称取75g已灭菌的土壤，溶于500ml沸水中，经纱布过滤后取滤液，加入16～18g琼脂，用蒸馏水定容至1L。

优选地，所述CM固体培养基的配方为：酵母膏1g，酶水解干酪素0.5g，酸水解干酪素0.5g，葡萄糖10g，Ca(NO₃)₂·4H₂O 1g，KH₂PO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，NaCl 0.15g，琼脂18g，加蒸馏水至1000mL。

优选地，所述IM培养基的配方为：K-buffer 0.8mL，M-N buffer 20mL，1％CaCl₂·2H₂O(w/v)1mL，20％葡萄糖(w/v)10mL，20％NH₄NO₃(w/v)2.5mL，50％甘油(v/v)10mL，补蒸馏水至1000mL；

所述K-buffer的配方为：200g/L K₂HPO₄，145g/L KH₂PO₄；

所述M-N buffer的配方为：30g/L MgSO₄·7H₂O，15g/L NaCl。

优选地，所述IM培养基在使用之前，每毫升IM培养基加入4μL 0.2mol/L乙酰丁香酮，1μL 0.01％FeSO₄(w/v)，10μL 100mg/mL 2-(N-吗啡啉)乙磺酸。

优选地，其特征在于，所述表达载体为pDHT-sk。

优选地，所述LB液体培养基含有100μg/mL的利福平和50μg/mL的卡那霉素。

优选地，所述CM固体培养基含有100μg/mL的潮霉素B和200μg/mL的头孢噻肟钠。

小麦矮腥黑粉菌的萌发和生长缓慢，其冬孢子萌发需要在低温下进行，10℃以上的萌发温度常常产生畸形菌丝，很少形成小孢子，并出现自溶现象。小麦矮腥黑粉菌独特的生物学特征导致农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化十分困难。影响小麦矮腥黑粉菌转化的因素很多，冬孢子萌发菌丝的活力和浓度、农杆菌的活力和浓度、菌丝和农杆菌的配比、IM培养基组成、CM培养基组成、共培养温度对农杆菌介导的TCK转化均有很大的影响，任何条件的改变都可能导致转化失败。发明人经过长期研究，首次建立了农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化体系，利用根癌农杆菌菌株EHA105成功转化了小麦矮腥黑粉菌，并获得了50个/10⁶的转化率，为研究小麦矮腥黑粉菌致病分子机制奠定了基础。

附图说明

图1.小麦矮腥黑粉菌转化子转接第二代长出的菌落；其中，A1，A2为OD₆₀₀＝0.530的农杆菌菌液转化TCK所得；B1，B2为OD₆₀₀＝0.560的农杆菌菌液转化TCK所得；C1，C2为OD₆₀₀＝0.591的农杆菌菌液转化TCK所得。

图2.转化子鉴定结果；其中，泳道1：含有质粒pDHt-SK的农杆菌EHA105的菌液PCR产物；泳道2-5：TCK转化子菌落PCR产物；泳道6：以ddH₂O为模板的PCR产物。

图3.转化子的假阳性鉴定结果；其中，泳道1：含有质粒pDHt-SK的农杆菌EHA105的菌液PCR产物；泳道2-5：TCK转化子菌落PCR产物；泳道6：以ddH₂O为模板的PCR产物。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的保护范围。

生物材料

小麦矮腥黑粉菌(TilletiacontroversaKühn,TCK)：本发明所使用的小麦矮腥黑粉菌菌株为现有文献L.GAO et al.Development of a SCAR Maker by inter-simplesequence repeat for dignoisis of Dwarf Bunt of Wheat and Detection ofTilletiacontroversaKu hn.Folia Microbiol.55(3),258–264(2010)所记载，参见其中材料与方法部分记载的在美国由B.Goates教授分离到的分离株。

本发明所使用的农杆菌为根癌农杆菌菌株EHA105。

上述生物材料，本实验室亦有保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

主要试剂与仪器

2％土壤浸提液培养基：称取75g已灭菌的土壤，用500ml沸水经纱布过滤后，加入16～18g琼脂，加蒸馏水定容至1L，分装后121℃高压蒸汽灭菌30min。

IM培养基(Induction Medium，诱导培养基)：K-buffer(pH 4.9)0.8mL，M-Nbuffer 20mL，1％CaCl₂·2H₂O(w/v)1mL，20％葡萄糖(w/v)10mL，20％NH₄NO₃(w/v)2.5mL，50％甘油(v/v)10mL，补蒸馏水至1000mL，分装后121℃高压蒸汽灭菌30min。在使用培养基之前，每毫升加4μL 0.2mol/L AS(乙酰丁香酮)，1μL0.01％FeSO₄(w/v)，10μL 100mg/mL 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)。其中，w/v均表示g/ml。

K-buffer配方：以ddH₂O为溶剂，含200g/L K₂HPO₄，145g/L KH₂PO₄。

M-N buffer配方：以ddH₂O为溶剂，含30g/L MgSO₄·7H₂O，15g/L NaCl。

CM培养基(Complete Medium，完全培养基)：酵母膏1g，酶水解干酪素0.5g，酸水解干酪素0.5g，葡萄糖10g，Ca(NO₃)₂·4H₂O 1g，KH₂PO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，NaCl0.15g，琼脂18g，加蒸馏水至1000mL，分装后121℃高压蒸汽灭菌30min。用于小麦矮腥黑粉菌-农杆菌的共培养。

YEB培养基：胰蛋白胨5g，酵母提取物1g，牛肉浸膏5g，MgSO₄ 0.5g，蔗糖5g，用NaOH调pH值至7.0，定容1L。

酶水解干酪素，酸水解干酪素：购自Sigma公司。

质粒pDHt-SK：购自普如汀生物技术(北京)有限公司。

人工气候生长培养箱：LT-36VLC8，PERCIVAL，美国。

全自动研究级倒置显微镜：IX83，OLYMPΜS，日本。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域常规方法，可参考分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:a laboratory manual，2001)或制造厂商提供的说明书。所使用的试剂、材料、仪器等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。

实施例1、农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化体系的建立

1、小麦矮腥黑粉菌冬孢子的萌发

在土壤浸提液培养基中培养萌发冬孢子，步骤如下：

配制冬孢子悬浮液，浓度为1×10⁶个/mL，取220μL冬孢子悬浮液涂布于土壤浸提液培养基上，置于5℃，相对湿度为50％的人工气候生长培养箱进行全光照培养(一天24h光照，光照强度1Lx)，30d后用全自动研究级倒置显微镜对TCK冬孢子的萌发情况进行观察。当侵染菌丝数量达到萌发高峰期(萌发率≥60％)时进行遗传转化。

2、制备小麦矮腥黑粉菌的菌丝液

TCK菌丝液制备：于超净工作台下用灭菌水将长好的菌丝用无菌三角棒清洗下来，收集至50ml无菌离心管中，10000r/min离心10min，倒掉上清液，保存管底菌丝液至2ml无菌离心管，加入灭菌水，调节菌丝液浓度为1×10⁶个/ml，待用。

3、质粒转化农杆菌

制备感受态细胞

(1)从-80℃冰箱中取出保存的农杆菌菌种EHA105，在YEB固体培养基(利福平浓度100μg/ml)上划线，28℃倒置培养36h。

(2)挑取单克隆，接种于20ml YEB液体培养基(利福平浓度100μg/ml)中，28℃，200rpm培养36h。

(3)取1ml菌液培养于200ml YEB液体培养基(利福平浓度100μg/ml)中，28℃，200rpm培养至OD600＝0.5-1.0。

(4)用4个50ml离心管装上培养好的菌液，冰浴30min；4℃预冷离心机。

(5)4℃，6000rpm离心5min，弃上清，倒置离心管除去残余培养基。

(6)每管用25ml冰浴的10％甘油悬浮菌体，4℃，6000rpm离心5min收集菌体，弃上清。

(7)每管用4ml冰浴的10％甘油悬浮菌体，然后将两个管的菌液合并，4℃，6000rpm离心5min收集菌体，弃上清。

(8)每管用4ml冰浴的10％甘油悬浮菌体，4℃，6000rpm离心5min收集菌体，弃上清。

(9)每管用2.5ml冰浴的10％甘油悬浮菌体，分装于1.5ml离心管中，每管100μl，液氮速冻后-80℃保存备用。

转化农杆菌

(1)1％HCl浸泡电击杯内部10min，蒸馏水洗，70％乙醇浸5min，挥干。

(2)冰浴电击杯，取100ng质粒pDHt-SK于100μl农杆菌EHA105感受态细胞中，轻轻吸放2-3次，然后转入电击杯中，盖上杯盖。

(3)1800V电击，听到“滴滴”两声后取出电击杯，迅速加入900μl YEB液体培养基，然后在28℃，200rpm摇床中培养2h。

(4)取400μl培养好的菌液，5000rpm离心5min收集菌体，弃大部分上清，留100μl上清悬浮菌体，然后涂布于YEB固体培养基(利福平浓度100μg/ml，卡那霉素浓度50μg/mL)上，28℃倒置培养36h。

PCR鉴定

(1)挑取单菌落，接种于YEB液体培养基(利福平浓度100μg/ml，卡那霉素浓度50μg/mL)中，28℃，200rpm摇床培养36h。

(2)根据T-DNA中潮霉素磷酸转移酶基因hph设计引物，进行PCR扩增。

引物的核苷酸序列为：

hph-S:5'-CGACAGCGTCTCCGACCTGA-3'；

hph-AS:5'-CGCCCAAGCTGCATCATCGAA-3'。

扩增体系：总体积25μL，包括1μL菌液、12.5μLTaqmix、1μL引物hph-S(10mM)、1μL引物hph-AS(10mM)、9.5μL ddH₂O。

扩增程序：95℃2min；94℃30s，57℃1min，72℃2min，30个循环；72℃10min。

用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若出现750bp的预期条带，则对应的单菌落为阳性克隆，即含有质粒pDHt-SK的农杆菌EHA105。

4、农杆菌转化小麦矮腥黑粉菌

(1)农杆菌菌液的制备

将含有质粒pDHt-SK的农杆菌EHA105在LB培养基平板(含100μg/mL利福平，50μg/mL卡那霉素)划线，28℃培养2-3d；挑取单菌落接种于含有100μg/mL利福平，50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，28℃，220r/min振荡两天；用IM培养基稀释至OD₆₀₀值为0.15、0.20、0.25、0.30、0.35，继续振荡培养7-8h备用。

用IM培养基稀释农杆菌菌液，将不同OD值的农杆菌菌液分别与TCK菌丝液等体积混合，得到的每一份混合菌液再分为三份，分别加AS至终浓度为0μmol/l、100μmol/l、200μmol/l，在CM培养基平板上铺一层无菌玻璃纸，吸取矮腥黑粉菌-农杆菌混合液200μL涂布于玻璃纸上，置于20-22℃黑暗培养48h。

将玻璃纸转移至空培养皿中(正面朝上)，其上覆盖一层含潮霉素B(100μg/mL)和头孢噻肟钠(200μg/mL)的CM固体培养基，于5℃培养箱中黑暗培养；或将玻璃纸转移至CM培养基平板中(正面朝下)，5℃培养箱中黑暗培养。每隔5天观察一次，将长出的单菌落转移至含有100μg/mL潮霉素的CM平板上继续培养，能在该平板上继续生长的菌落初步推定为转化子做进一步鉴定。继代培养时，CM培养基中只需添加潮霉素B(100μg/mL)，以观察转化子是否仍然对潮霉素表现出抗性。

结果如下表所示，当OD₆₀₀为0.53-0.59的农杆菌菌液与TCK菌丝液等体积混合且不添加AS(即AS终浓度为0μmol/l)时可将外源质粒成功转入小麦矮腥黑粉菌中。

注：表中符号“√”表示转化成功，符号“×”表示转化失败。

图1显示了分别使用OD₆₀₀为0.530、0.560、0.591的农杆菌菌液转化TCK得到的转化子第二代长出的菌落。

5、转化子的PCR鉴定

转化子鉴定

采用潮霉素磷酸转移酶基因hph的特异性引物，对随机选取的小麦矮腥黑粉菌转化子进行PCR扩增。

引物的核苷酸序列为：

hph-S:5'-CGACAGCGTCTCCGACCTGA-3'；

hph-AS:5'-CGCCCAAGCTGCATCATCGAA-3'。

扩增体系：总体积25μL，包括1μL菌液、12.5μLTaqmix、1μL引物hph-S(10mM)、1μL引物hph-AS(10mM)、9.5μL ddH₂O。

扩增程序：95℃2min；94℃30s，57℃1min，72℃2min，30个循环；72℃10min。

用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，根据是否扩增得到预期条带，鉴定T-DNA是否插入到小麦矮腥黑粉菌基因组中。

如图2所示，泳道1为阳性对照，含有质粒pDHt-SK的农杆菌EHA105的菌液PCR产物；泳道2-5为TCK转化子菌落PCR产物；泳道6为阴性对照，以水为模板进行PCR。结果表明，从阳性对照和所有转化子中均扩增出750bp的目的片段，阴性对照无目的片段出现。

所有转化子转接5代后按照上述步骤进行PCR鉴定，结果同上，表明插入小麦矮腥黑粉菌基因组中的基因片段得到了稳定遗传。

假阳性鉴定

为了排除转化子表面粘附农杆菌而导致假阳性的出现，利用农杆菌vir基因的特异性引物对经过鉴定的转化子进行PCR扩增。

引物的核苷酸序列为：

VCF：5'-ATCATTTGTAGCGACT-3'；

VCR：5'-AGCTCAAACCTGCTTC-3'。

扩增体系：总体积25μL，包括1μL菌液、12.5μLTaqmix、1μL引物VCF(10mM)、1μL引物VCR(10mM)、9.5μL ddH2O。

扩增条件：95℃2.5min；95℃1min，45.8℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

如图3所示，泳道1为阳性对照，含有质粒pDHt-SK的农杆菌EHA105的菌液PCR产物；泳道2-5为TCK转化子菌落PCR产物；泳道6为阴性对照，以水为模板进行PCR。结果表明，只有阳性对照中扩增出730bp的vir基因片段，从所有转化子中均未扩增出vir基因片段，表明转化结果中没有出现假阳性。

6、转化率

按照如下公式计算转化率：转化率＝每板上长出的转化子数/涂板菌液中的小麦矮腥黑粉菌数。结果表明，采用本发明的转化体系得到的转化率为50个/10⁶。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化方法

<130> P180277/ZWB

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> hph-S

<400> 1

cgacagcgtc tccgacctga 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> hph-AS

<400> 2

cgcccaagct gcatcatcga a 21

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VCF

<400> 3

atcatttgta gcgact 16

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VCR

<400> 4

agctcaaacc tgcttc 16

Claims (8)

1.农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)菌丝液制备：培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子，当冬孢子萌发率≥60％时收集菌丝，离心去上清液，然后用灭菌水配制浓度为1×10⁶个/ml的菌丝液；

(2)农杆菌菌液制备：将含有表达载体的根癌农杆菌菌株EHA105接种于LB液体培养基中，28℃振荡培养2-3d，用IM培养基稀释菌液至OD₆₀₀为0.15-0.35，继续振荡培养7-8h，然后用IM培养基稀释菌液至OD₆₀₀为0.53-0.59；所述IM培养基在使用之前，每毫升IM培养基加入4μL 0.2mol/L乙酰丁香酮，1μL 0.01％(w/v)FeSO₄，10μL 100mg/mL 2-(N-吗啡啉)乙磺酸；

(3)在CM固体培养基上铺一层无菌玻璃纸，将OD₆₀₀为0.53-0.59的农杆菌菌液与1×10⁶个/ml的菌丝液等体积混合后涂布于玻璃纸上，置于20-22℃黑暗培养48h，共培养期间不添加乙酰丁香酮；然后将玻璃纸转移至新的CM固体培养基上，使涂布有菌液的一面贴合培养基，5℃黑暗培养至菌落长出。

2.根据权利要求1所述的小麦矮腥黑粉菌转化方法，其特征在于，培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子的步骤如下：配制浓度为1×10⁶个/mL的冬孢子悬浮液，取冬孢子悬浮液涂布于土壤浸提液培养基上，置于温度为5℃、相对湿度为50％的人工气候生长培养箱中进行全光照培养。

3.根据权利要求2所述的小麦矮腥黑粉菌转化方法，其特征在于，所述土壤浸提液培养基的配方为：称取75g已灭菌的土壤，溶于500ml沸水中，经纱布过滤后取滤液，加入16～18g琼脂，用蒸馏水定容至1L。

4.根据权利要求1所述的小麦矮腥黑粉菌转化方法，其特征在于，所述CM固体培养基的配方为：酵母膏1g，酶水解干酪素0.5g，酸水解干酪素0.5g，葡萄糖10g，Ca(NO₃)₂·4H₂O 1g，KH₂PO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，NaCl 0.15g，琼脂18g，加蒸馏水至1000mL。

5.根据权利要求1所述的小麦矮腥黑粉菌转化方法，其特征在于，所述IM培养基的配方为：K-buffer 0.8mL，M-N buffer 20mL，1％CaCl₂·2H₂O(w/v)1mL，20％葡萄糖(w/v)10mL，20％NH₄NO₃(w/v)2.5mL，50％甘油(v/v)10mL，补蒸馏水至1000mL；

所述K-buffer的配方为：200g/L K₂HPO₄，145g/L KH₂PO₄；

所述M-N buffer的配方为：30g/L MgSO₄·7H₂O，15g/L NaCl。

6.根据权利要求1-5任一所述的小麦矮腥黑粉菌转化方法，其特征在于，所述表达载体为pDHT-sk。

7.根据权利要求6所述的小麦矮腥黑粉菌转化方法，其特征在于，所述LB液体培养基含有100μg/mL的利福平和50μg/mL的卡那霉素。

8.根据权利要求6所述的小麦矮腥黑粉菌转化方法，其特征在于，所述CM固体培养基含有100μg/mL的潮霉素B和200μg/mL的头孢噻肟钠。

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