CN109111510B - 蛋白质及基因的应用、以及重组载体、表达盒、重组菌及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蛋白质及其基因在影响大丽轮枝菌致病性中的应用，以及包含或敲除该基因的重组载体、表达盒、重组菌及其构建方法。该蛋白质为如下1)或2)的蛋白质：1)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；2)将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大丽轮枝菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。通过敲除大丽轮枝菌中的该基因使大丽轮枝菌的致病性降低。与野生型大丽轮枝菌相比，敲除该基因的大丽轮枝菌突变体侵染的棉花黄萎病发病率、病情指数和病级数均有降低。

Description

蛋白质及基因的应用、以及重组载体、表达盒、重组菌及构建 方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋白质及其基因在影响大丽轮枝菌致病性中的应用，以及包含或敲除该基因的重组载体、表达盒、重组菌及其构建方法。

背景技术

棉花黄萎病是一种土壤传播的维管束病害，其具有分布广，危害重，存活时间长，化学农药难于防治等特点，是棉花生长过程中最具毁灭性的病害之一，严重威胁着棉花的生产和发展。我国棉花黄萎病主要是由土壤丝状真菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliaeKleb.)所引起的。大丽轮枝菌属半知菌亚门，丛梗抱目，淡色孢科，轮枝菌属，其寄主范围很广，涉及十字花科、蔷薇科、豆科、茄科、唇形花科、菊科等，目前已达660多种植物，并且还在逐年扩大。

棉花黄萎病1914年始见于美国的费吉尼亚州，随后在其它州和世界各植棉国先后发现(沈其益，1992)，1935年随引进美棉品种传入我国，但危害不重。到二十世纪50年代以后，黄萎病在我国南北局部棉区陆续发生，扩散蔓延速度加快。80年代末，黄萎病已遍及全国478个植棉县(市)。进入90年代以来，我国棉花黄萎病扩展蔓延迅猛，尤其是1993，1995，1996，2002年在全国范围内连续大发生，导致我国棉花产业损失严重。我国是棉花生产大国，全国棉花种植面积近亿亩，棉产量占全球棉花总产量的四分之一。然而，我国每年因为棉花黄萎病引起的棉花减产问题非常严重，给棉农及国家造成了很大的经济损失，并已成为当前制约我国棉花生产的突出问题。

由于棉花黄萎病危害的严重性和寄主的广泛性，世界上不少国家的科技工作者对其进行了深入研究。无论是通过常规方法寻找抗源，还是通过分子生物学手段克隆抗病基因都已经取得了一定的进展。在常规育种上，国内外棉花育种者一直重视抗源的筛选和创造。1983-1986年，李成葆等对911份陆地棉资源进行了抗黄萎病鉴定，筛选了抗性较好的一批抗(耐)病品种。K.V.Srinvasin鉴定了126个海岛棉品种的抗性，结果显示表现耐病和抗病的占85％。目前通过分子生物学手段己经克隆的植物抗病基因大概有39个以上，其中抗病原真菌的大概有20多个，如拟南芥抗白粉病基因RPW8，番茄抗枯萎病基因泌Ve，高梁抗普通锈病(Puccinia Sorghi)基因Rpl-D，且在海岛棉上已经克隆了NBS-LRR类抗病基因。但都并没有找到真正防治棉花黄萎病的有效办法。根本原因在于棉花等作物遗传背景复杂，很难在分子水平进行更深入的研究。此外，大丽轮枝菌小种分化变异性强等原因也为抗病遗传育种带来重重困难。所以，进一步深入研究大丽轮枝菌致病性的分子机理也就具备重要意义，且可为抗棉花黄萎病寻找新的防治措施奠定基础。

NADPH氧化酶(Nox)产生的活性氧(ROS)在多细胞真核生物中主要参与宿主的免疫或防卫、细胞增殖与分化、信号传导及离子运输等过程。Nox是由gp91^phox、p22^phox、p47^phox、p40^phox、p67^phox和小G蛋白Rac(small GTpase)亚基组成的多组分复合物，最初是在吞噬细胞中发现了它的表达。吞噬细胞的催化亚基gp91^phox(又称为Nox2)和调节亚基p22^phox在细胞膜上形成异二聚体，当与细胞质中的p47^phox、p40^phox、p67^phox和小G蛋白Rac结合时可形成有活性的复合物。gp91^phox是其主要的功能亚基。在真菌中，gp91^phox的同源蛋白为NoxA/NoxB(或者写为Nox1/Nox2，不同的参考文献写法不一)，p67^phox的同源蛋白为NoxR，p22^phox的同源蛋白为NoxD。

在过去的研究中，通过比较野生型大丽轮枝菌V592和VdNoxB及VdPls1敲除突变体的侵染过程，发现大丽轮枝菌在紧密接触到宿主根表皮细胞时会分化形成顶端膨大的附着枝，并发育出侵染钉，VdNoxB和VdPls1在附着枝特异表达；VdNoxB及VdPls1敲除突变体的附着枝不能形成侵染钉，从而丧失了穿透植物细胞壁的能力和在棉花上的致病力。进一步实验表明VdPls1和VdNoxB在侵染钉细胞膜上形成复合物并通过在尖端产生活性氧调控侵染钉的发育。

而揭示NoxR在真菌中生物学作用的研究工作才刚起步，NoxR亚基在大丽轮枝菌的侵染机制中是否有作用尚无报道。

发明内容

本发明提供了一种蛋白质(VdNoxR)及其基因(VdNoxR)在影响大丽轮枝菌致病性中的应用，以及包含或敲除该基因的重组载体、表达盒、重组菌及其构建方法。该蛋白质及其基因与大丽轮枝菌导致棉花黄萎病的机理具有紧密联系，通过敲除该基因可以降低大丽轮枝菌的致病性。该致病性为致黄萎病性。

VdNoxR来自大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)。

本发明提供了VdNoxR蛋白在影响大丽轮枝菌致病性中的应用，所述蛋白质为如下1)或2)的蛋白质：1)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；2)将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大丽轮枝菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。

本发明还提供了VdNoxR基因在影响大丽轮枝菌致病性中的应用，所述基因为编码SEQ ID NO.2所示蛋白质的基因。

优选地，上述基因为如下1)至4)中任一所述的基因：1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1中自5′末端第1-15位；第367-702位；第753-914位；第973-1890位；第1947-1967位所示的基因；2)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因；3)在严格条件下与1)或2)限定的基因杂交且编码SEQ ID NO.2所示蛋白质的基因；4)与1)或2)限定的基因具有90％以上的同源性且编码SEQ ID NO.2所示蛋白质的基因。

序列表中SEQ ID NO.1由1967个脱氧核苷酸组成，自5’端第1-15位；第367-702位；第753-914位；第973-1890位；第1947-1967位为ORF区编码SEQ ID NO.2中所述氨基酸残基序列的蛋白质。

所述“严格条件”为足以使核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的基因序列杂交的条件，这些条件对本领域技术人员是公知的，例如：在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

更优选地，敲除所述大丽轮枝菌中的上述基因，使所述大丽轮枝菌致病性降低。

具体地，上述应用包括以下步骤：(1)将含有所述基因上游和下游序列的载体转化农杆菌，所述基因上游序列如SEQ ID NO.3所示，所述基因下游序列如SEQ ID NO.4所示；(2)筛选转化成功的所述农杆菌；(3)转化成功的所述农杆菌转染所述大丽轮枝菌；(4)筛选敲除成功的所述大丽轮枝菌。

本发明还提供了一种重组载体，其含有以下一种或多种基因：编码SEQ ID NO.2所示蛋白质的基因；SEQ ID NO.1所示的基因；SEQ ID NO.1中自5′末端第1-15位、第367-702位、第753-914位、第973-1890位和/或第1947-1967位所示的基因。

本发明还提供了一种重组载体，其为能够敲除以下一种或多种基因的重组载体：编码SEQ ID NO.2所示蛋白质的基因，SEQ ID NO.1所示的基因，SEQ ID NO.1中自5′末端第1-15位、第367-702位、第753-914位、第973-1890位和/或第1947-1967位所示的基因，所述重组载体含有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示基因。

优选地，所述重组载体为将SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示基因插入pGKO2-Gateway质粒构成的重组载体。

本发明还提供了一种表达盒，其含有以下一种或多种基因：编码SEQ ID NO.2所示蛋白质的基因；SEQ ID NO.1所示的基因；SEQ ID NO.1中自5′末端第1-15位、第367-702位、第753-914位、第973-1890位和/或第1947-1967位所示的基因。“表达盒”意指能指导适合宿主细胞中特定核苷酸序列表达的核酸序列，包含与目的核苷酸序列可操作地连接的调控元件。所述调控元件可以是启动子、增强子、静默子、终止子和/或其它控制所述核苷酸序列表达的元件，如聚腺苷酸化序列等。

本发明还提供了一种重组的大丽轮枝菌，所述大丽轮枝菌缺失以下一种或多种基因：编码SEQ ID NO.2所示蛋白质的基因；SEQ ID NO.1所示的基因；SEQ ID NO.1中自5′末端第1-15位、第367-702位、第753-914位、第973-1890位和/或第1947-1967位所示的基因。

本发明还提供了一种构建上述大丽轮枝菌的方法，所述方法包括：敲除所述大丽轮枝菌中的以下一种或多种基因：编码SEQ ID NO.2所示蛋白质的基因；SEQ ID NO.1所示的基因；SEQ ID NO.1中自5′末端第1-15位、第367-702位、第753-914位、第973-1890位和/或第1947-1967位所示的基因。

优选地，所述方法包括将上述重组载体导入所述大丽轮枝菌。

VdNoxR蛋白和VdNoxR基因经实验证明与大丽轮枝菌导致棉花黄萎病的机理具有紧密联系。通过在大丽轮枝菌中敲除该VdNoxR基因可以使大丽轮枝菌的致病性降低，将敲除了VdNoxR基因的大丽轮枝菌突变体与野生型大丽轮枝菌同时侵染植株，被大丽轮枝菌突变体侵染的棉花相比野生型大丽轮枝菌侵染的棉花黄萎病发病率降低了80％以上，病情指数和病级数也大幅降低。因此本发明为研究大丽轮枝菌致病机理提供了新的启示，为治疗和预防棉花黄萎病提供了新的途径。

附图说明

图1为实施例4的southern检测野生型大丽轮枝菌和VdNoxR敲除突变体的对比电泳图；

图2为实施例5中菌株侵染水培棉花的病情情况，其中，A为未被侵染的对照棉花植株，B为被大丽轮枝菌V592侵染后的棉花植株，C为大丽轮枝菌V592的敲除突变体V592^Δnoxr侵染后的棉花植株；

图3为实施例5中棉花植株被野生型大丽轮枝菌V592和敲除突变体V592^Δnoxr侵染20天后的发病率对比图；

图4为实施例5中棉花植株被野生型大丽轮枝菌V592和敲除突变体V592^Δnoxr侵染20天后的病情指数对比图；以及

图5为实施例5中棉花植株被野生型大丽轮枝菌V592和敲除突变体V592^Δnoxr侵染20天后的病级数对比图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的根癌农杆菌EHA105(ElizabethE.Hood.NewAgrobacteriumhelper plasmids for gene transfer to plants.TransgenicResearch,July 1993,Volume 2,Issue 4,pp 208-218)自申请日起二十年公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的大丽轮枝菌V592(Feng-Gao,Bang-JunZhou,A Glutamic Acid-Rich Protein Identified in Verticillium dahliae from an InsertionalMutagenesis Affects Microsclerotial Formation and Pathogenicity.PLoS ONE5(12):e15319.)自申请日起二十年公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中“野生型”意指不含有异源核酸分子的生物体，为非转化的或非转基因的生物体。

实施例1 VdNoxR敲除载体的构建

利用CTAB法提取大丽轮枝菌V592基因组DNA，利用以下引物以该基因组DNA为模板进行PCR扩增：

上游引物1(下划线为BamHI酶切位点)5’→3’方向：CGGGATCCCGAGCCCTCTTGCCTCTCCGT(SEQ ID NO.5)；

上游引物2(下划线为EcoRI酶切位点)5’→3’方向：GGAATTCCCTGCGACAAACCGACCGTG(SEQ ID NO.6)；

下游引物1(下划线为HindIII酶切位点)：5’→3’方向：CCCAAGCTTGGGGCAAGATGGAGGTATGT(SEQ ID NO.7)；

下游引物2(下划线为ClaI酶切位点)5’→3’方向：CCATCGATGGGAGGGTCTACGAATGTC(SEQ ID NO.8)。

其中，上游引物1和2扩增的PCR产物为SEQ ID NO.3所示核苷酸序列，下游引物1和2扩增的PCR产物为SEQ ID NO.4所示核苷酸序列，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4分别为VdNoxR(SEQ ID NO.1)的上下游序列。

用USER enzyme mix(New England Biolabs)将两种PCR产物同时连接到KOV21载体(Gao F,et al.,A glutamic acid-rich protein identified in Verticilliumdahliae from an insertional mutagenesis affects microsclerotial formation andpathogenicity.PLoS One,2010.5(12):0015319.自申请日起二十年公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用)上，获得重组载体KOV21-SEQ ID NO.3-hph-SEQ ID NO.4。

将上述重组载体送去测序，结果为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列分别插入hph两端得到的重组载体。

以带有Gateway BP反应接头(在表中以波浪线表示)的引物特异性扩增上述重组载体中的SEQ ID NO.3-hph-SEQ ID NO.4片段，所用引物1(波浪线表示Gateway BP反应接头)5’→3’方向：

CGGGATCCCGAGCCCTCTTGCCTCTCCGT(SEQ ID NO.9)；所用引物2(波浪线表示Gateway BP反应接头)5’→3’方向：

CCATCGATGGGAGGGTCTACGAATGTC(SEQ ID NO.10)。将PCR产物与pGKO2-Gateway(Khang CH,Park SY,Lee YH,Kang S.Fungal Genet Biol.2005Jun；42(6):483-92.)连接得到VdNoxR敲除载体。

上述敲除载体经过测序分析可知，该敲除载体为成功导入SEQ ID NO.3-hph-SEQID NO.4片段的敲除载体。

实施例2 VdNoxR敲除载体转化农杆菌

采用电击法将VdNoxR敲除载体转入到农杆菌EHA105中，用于大丽轮枝菌V592的遗传转化。

步骤如下：

(1)将农杆菌感受态置于冰上使其成冻融状态，并向每管中加入1μL实施例1制备的VdNoxR敲除载体；

(2)将农杆菌感受态细胞置于冰上融化3min，融化后加入到电击杯中，轻轻震至杯底。电击(用BIO－RAD公司Pluse Controller仪，V＝1.8KV，C＝25μF，R＝200Ω)后，立即加入0.6～0.9ml冰冷的LB，150r/min回复培养45min；

(3)将菌液均匀涂布于含卡那霉素(50μg/mL)和利福平霉素(50μg/mL)的LB平板中，28℃培养1.5-2天；

(4)挑取单菌落进行菌落PCR验证。

经菌落PCR验证可知，所挑取的单菌落为成功转入VdNoxR敲除载体的农杆菌。

实施例3 VdNoxR敲除突变体V592^Δnoxr的获得

相关培养基：

查式培养基(30g/L蔗糖,3g/L NaNO₃,0.5g/L MgSO₄-7H₂O,0.5g/L KCl,100mg/LFeSO₄-7H₂O,1g/L K₂HPO₄,pH 7.2)。LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，水1000ml，用NaOH调pH至7,121℃，高压蒸汽灭菌20min。

LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl₅g，加水至1L，121℃，蒸汽灭菌20min。固体培养基加1.5％琼脂。

MM基本培养基：10mL K-bufer(200g/L K₂HPO₄,145g/L KH₂PO₄，H₃PO₃调节pH至7.0)，20mL M-N buffer(30g/L MgSO₄·7H₂O,15g/L NaCl)，1mL 1％的CaCl₂·2H₂O(w/v)，10mL 20％的蔗糖(w/v)，1mL 0.1％的FeSO₄(w/v)，0.5g NH₄NO₃，加蒸馏水至1L。113℃，蒸汽灭菌20min。

IM诱导培养基：10mL K-bufer(pH 7.0)，20mL M-N buffer，1mL 1％CaC1₂·2H₂O(w/v)，2.5mL 20％的NH₄NO₃(w/v)，1mL 0.1％的FeSO₄(w/v)，5mL甘油，5mL 2mol/L的蔗糖，2mL 100mmol/L乙酰丁香酮，40mL l mol/L的MES(pH 5.3)，加蒸馏水至1L。113℃，蒸汽灭菌20min。

CM共培养培养基：IM培养基中加入1.5％琼脂粉，113℃，蒸汽灭菌20min。

具体操作步骤：

1.挑取实施例2制备的农杆菌单菌落放入到5ml含有抗生素(50ug/ml卡那霉素，50ug/ml利福平)的LB液体培养基，置于28℃摇床上，200rpm培养24小时，与此同时用牙签挑取3个PDA固体培养基上的V592菌饼放入含有80ml查式培养基的三角瓶中，置于26℃摇床上，200rpm培养。

2.取1ml培养了24小时的农杆菌菌液加入到20ml含有抗生素(50ug/ml卡那霉素，50ug/ml利福平)的MM液体培养基中，置于28℃摇床上，200rpm继续培养24小时后，离心机上4000rpm离心10min，收集菌体，菌体用IM培养基洗两次，再用IM培养基重悬，调OD₆₀₀≈0.25，将培养了48小时之后的野生型大丽轮枝菌V592用四层灭过菌的纱布过滤，将过滤好的菌液置于离心机上4000rpm，离心10min，用IM+AS重悬孢子，血球计数板计数，调孢子浓度为1.0×10^6-7个孢子/ml。

3.将农杆菌菌液和真菌孢子悬浮液按1：1体积比例混匀(各取1ml)，按照每培养皿200μl涂布于CM培养基平板上的玻璃纸，26℃培养36个小时。

4.用3ml无菌水对共培养物进行冲洗，按照500ul/板涂布于含有抗生素(潮霉素50ug/ml，羧苄青霉素200ug/ml，头孢霉素200ug/ml，20ug/ml五氟尿嘧啶)的PDA固体培养基上培养5-7天，长出的菌落即为转化成功的VdNoxR敲除突变体V592^Δnoxr。

实施例4 southern鉴定VdNoxR敲除突变体V592^Δnoxr

1.CTAB法提取实施例3制备的VdNoxR敲除突变体基因组DNA。

2.提取的DNA分别用BglII和NcoI酶切

酶切体系：DNA 100μg，10×buffer 40μl，酶35μl，加H₂O定容至400μl，37℃，24小时。取5ul电泳检测酶切是否完全。加240μl异丙醇沉淀酶切产物，最后融于约40μl ddH₂O中，加Loading Buffer；点样前65℃，保温5～10min。

3.电泳

0.9％琼脂(0.5×TBE)；50V，18～24小时；最后再反向电泳5min。

4.凝胶处理

(1)电泳完毕后，照相；ddH₂O冲洗凝胶；

(2)0.2M HCl浸泡凝胶，并置于脱色摇床轻轻摇动，大约20min，直至溴酚蓝变黄，浓盐酸为10mol/L，即稀释50倍，10ml到500ml)；

(3)去离子水洗2遍，加变性液置于脱色摇床轻轻摇动，约40min，直至溴酚蓝由黄变蓝，变性液：NaCl 1.5M(87.75g/L)，NaOH 0.5M(20g/L)。

(4)去离子水洗2遍，加中和液置于脱色摇床轻轻摇动，约30min，中和液：NaCl1.5M(87.75g/L)，Tris.cl 0.5M(60.57g/L)，浓HCl约23～25ml，调pH值为7.2。

5.转膜

(1)用长和宽均大于凝胶的板胶作为平台，放在塑料盘中，倒入20×SSC，剪一条与平台等宽，长度大于平台的滤纸，先将滤纸一端浸湿在塑料盘中，慢慢放在平台上，直到另一端也浸湿在20×SSC中，赶出滤纸和平台间的气泡。

(2)剪一张长和宽均略大于凝胶的尼龙膜，剪去左上角，完全浸湿在无菌水中，取出膜，再浸入20×SSC中，至少5分钟。

(3)电泳结束后，切掉凝胶的无用部分，并在左上角切去一角，以作为方位标记。将凝胶放在20×SSC中漂洗片刻。

(4)将凝胶倒放在平台上滤纸的中央，赶出胶和滤纸间的气泡，用Parafilm封口膜围绕凝胶周围，不要碰到凝胶上的样品。

(5)用20×SSC浸湿凝胶，将湿润的尼龙膜放在凝胶上面，使二者切角重合，赶出尼龙膜和凝胶间的气泡。

(6)用20×SSC浸湿5张与尼龙膜同样大小的滤纸，放在尼龙膜上面，赶出滤纸和尼龙膜间的气泡。

(7)剪一叠10cm厚，略小于滤纸的纸巾，放在滤纸上面，纸巾上放一块玻璃板，再压上500g的重物，转移过夜。

(8)揭去凝胶上方的纸巾、滤纸和Parafilm，翻转凝胶和尼龙膜，以凝胶一面在上放在一个塑料盘中，用铅笔在尼龙膜上标记凝胶加样孔的位置。

(9)从尼龙膜上剥离凝胶弃之，将尼龙膜浸泡在20×SSC中5min，取出尼龙膜，放在湿润的滤纸上，紫外交联固定DNA。

(10)用亚甲基蓝染色，直到看见清晰的DNA条带，蒸馏水冲洗脱色，用保鲜膜包好，放在4℃保存待用。

6.标记探针

Amersham公司随机引物标记试剂盒(货号为RPN1633)，RediprimeTMII RandomPrimer Labelling System。

(1)取待标记的DNA 25ng，加无菌水，使体积扩增至45μl。

(2)98℃，保温5分钟，变性DNA。

(3)离心，使DNA聚集在离心管管底，放在冰上。

(4)将变性的DNA加到标记混合物中，轻轻混匀，直到DNA和标记混合物形成的颗粒完全融解。

(5)加1μl Klenow(防止标记混合物中的Klenow失活)，离心。

(6)加5μlα-32P-dCTP，用枪轻轻吹打均匀，离心。

(7)37℃，反应30分钟；98℃，反应5分钟，变性已标记好的DNA探针，离心，放在冰上。

(8)取适量探针用于杂交，剩余的探针保存在4℃冰箱中。

7.杂交

Southern Blot缓冲液：50×Denhart’s 5ml，20×SSPE 12.5ml，10％SDS2.5ml，用ddH₂O定容至50ml。即终浓度分别为：5×Denhart’s，5×SSPE，0.5％SDS。

(1)预杂交：将杂交缓冲液倒入杂交管中，65℃预热15min，放入交联固定的膜，65℃预杂1～2小时。

(2)杂交：向杂交管中加入20μl标记好的探针，65℃杂交过夜。

(3)洗膜：用洗膜缓冲液2×SSC/2％SDS，在65℃/20min条件下洗膜两次；用0.2×SSC/0.2％SDS，在65℃/20min条件下洗膜一次。

(4)压磷屏：将洗好的膜从杂交管中拿出，转移至两层塑膜中，检测杂交信号强弱，将膜放入GE Healthcare公司生产的磷屏(货号为00146931)中，根据信号强弱压数小时或过夜。

(5)检测杂交信号：扫描磷屏。

检测结果如图1所示，泳道1为野生型大丽轮枝菌V592的DNA；泳道2和3分别为BglII和NcoI酶切的VdNoxR敲除突变体V592^Δnoxr的DNA；southern杂交结果显示野生型V592的DNA能够杂到VdNoxR的条带，而突变体的DNA不能够杂到条带，说明VdNoxR被敲除掉了。

实施例5 VdNoxR敲除突变体的致病性检测

通过VdNoxR敲除突变体的菌株侵染水培棉花来鉴定其致病性。

挑选饱满的棉种用15％的次氯酸钠浸泡30min后，无菌水冲洗2-3遍，再用无菌水浸泡催芽过夜后平铺在培养盒中保湿，待芽长至3cm，种于发芽盒中。将长出子叶的苗转移到盛满清水的塑料盒(高8-10cm)中，于25℃，光照16h，黑暗8h培养。待真叶长出时将清水换成1/3的MS培养液，每周更换一次培养液，1片真叶展平时接种。将-80℃保存的大丽轮枝菌V592菌株和VdNoxR敲除突变体V592^Δnoxr经PDA平板活化3-4d，从菌落边缘挑取菌块放入查氏培养液，25℃，220rpm摇培5d，过滤，滤液5000rpm离心5min，清水稀释孢子，血球计数板计数，将浓度调至1×10⁷个孢子/ml。将调好浓度的孢子悬浮液加入空塑料盒中，棉苗浸根40min。之后用1/3的MS培养液25℃光照16h，黑暗下继续培养棉苗8h。每盒中种12株苗。每个品种3个重复，一共12个品种。20天后观察发病情况并计算发病率和病情指数。

发病率＝发病数/调查总数×100％

病情指数＝∑[病级数×该级病叶(穗、株)数]/(调查总数×最高病级数)×100

发病分级标准：

0级植物健康没有症状；

1级0.1％-25％的叶片萎蔫；

2级25％-50％的叶片萎蔫；

3级50％-75％的叶片萎蔫；

4级75％-100％的叶片萎蔫或者死亡。

结果见图2-图5。图2中A为未被侵染的对照棉花植株，B为被大丽轮枝菌V592侵染后的棉花植株，C为大丽轮枝菌V592的敲除突变体V592^Δnoxr侵染后的棉花植株。由此可见，VdNoxR敲除突变体对棉花的致病性明显减弱。

野生型大丽轮枝菌V592侵染的棉花与敲除突变体V592^Δnoxr侵染的棉花的发病率见图3。野生型大丽轮枝菌V592侵染的棉花的发病率为89％，敲除突变体V592^Δnoxr侵染的棉花的发病率为2.7％。

野生型大丽轮枝菌V592侵染的棉花与敲除突变体V592^Δnoxr侵染的棉花的病情指数统计见图4。野生型大丽轮枝菌V592侵染的棉花的病情指数为87.5，敲除突变体V592^Δnoxr侵染的棉花的病情指数为0.69。

野生型大丽轮枝菌V592侵染的棉花与敲除突变体V592^Δnoxr侵染的棉花的发病分级见图5。在野生型大丽轮枝菌V592侵染的棉花中，0级为4棵，2级为1棵，4级为31棵；在敲除突变体V592^Δnoxr侵染的棉花中，0级为35棵，1级为1棵。

通过上述方法的结果图，我们可以看出敲除突变体V592^Δnoxr侵染棉花相比于野生型大丽轮枝菌V592侵染棉花发病率、病情指数及发病分级都显著降低，说明VdNoxR基因与大丽轮枝菌的致病性相关。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 蛋白质及基因的应用、以及重组载体、表达盒、重组菌及构建方法

<130> 20170523

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1967

<212> DNA

<213> 大丽轮枝菌Verticillium dahliae

<400> 1

atgtcgttga aacaggtacg taactccgga ttcgatcgcc agtaagcctt gcttgtgttg 60

ttggtggtgg ggggaacatc agggaagcaa gcactggacg agcaggatgt gcccctcaat 120

ccaggaccag ttcgctgaca tgccatccca aaaggaaatc gaaacctggg tgacggcctt 180

ggcccgttat gataacaatg aattcgacga ctcattgggc gagttcgaca agattgccga 240

cacatccaag attcttttca atatgggcgt gatccatgcg actttgggag agcacgagaa 300

agctgtacgt gccgtcccac cacaccaccc attttggccg tgcttgctaa tacgttggcc 360

ccttaggttg agtgctacca gcgcgccatt cgactcgacc aatacctcgc cgtcgcatac 420

ttccaacaag gcgtctccaa ctttctcctc ggtgacttcg aggaggcctt ggccaacttc 480

aacgacaccc tgctttatct ccgaggcaac acaatgatcg attatgcgca actcggtctt 540

cttttcaagc tttactcttg cgaagttctc ttcaaccgcg gtctctgcta catctatctc 600

caacaaaagg atgccggcat gcaggacctg tcatatgcag taaaggagaa ggttgttgag 660

gaccacaacg tcatcgacga ggctatcaag gaggaggcag aggtacgcaa tcagcgggac 720

tggatggagg gtcgtgaact gacctttggc agggctatac ggttttctcc attcctgtcg 780

gcgtcgtcta caggccgaat gaagccaagg tccgcaacct caagacaaaa gattaccttg 840

gcaaggctcg cctcgtggcc gcctctgacc gtgccaatgc cttcactggc tttgctggtt 900

cggagatgaa gacggtaagc gatttcccac agttcattct gcccttgatc gtactgactc 960

tgccgcctac agcaacaaag acaaaccgtc aaggacgacc gcccagccga caacatttcc 1020

tatgccgcta cgaatctcat caagcccggc atccagtccc gatcaaccga caacaatcgc 1080

aatgtcttcc cacctacgcc gccaccggac aatgacaggg caagcggtgg tagtggcggc 1140

ggcagcggtg gcagtggaaa cggcaacgcg agcggccaga tgactcgagg ccagtctgtt 1200

cgtaacgggc cgaaacctca actcgcaaag ctcaacatcg acacctcagg tggcaacaac 1260

agatacgaga agacatcaag cccaccggaa cgccgaccca ccaacgccac acgctccgcc 1320

agctctacac ccgctcgagg ctactcccgt cgtgaccagc agcgccgcaa cttgcgggac 1380

gacgaggaag gaggtgatgc ctatcccgac gagttgtacg atatgtacca gggcggtcgc 1440

agcagccggg gcccttctcg tcgcccgcaa caacagcagc ggtatatcga ggaagaggat 1500

gaggggtctg attacgatga cgggtccttc gacgagggcg actttgaaat ggtctccaac 1560

aacccacccc ggcgcatggg caccaactcg acatcttctg gcggccgcgg ggcatcacgg 1620

aggcccgatg tccgaaaggt ccgcgttaag gttcacgctg aggatgtgcg gtacatcatg 1680

attggcacgg cgatagagtt caccgacctg gtcgacaaga tccgtgataa gtttggactg 1740

cgcaggcgat tcaagattac agtccgcgac gatgacggtg gcccgaacgc cgacatgatc 1800

actatgggcg atcaagatga tcttgagatg gtcatcatga gctccaaggc tattgcgagg 1860

aggacaaggc aggagatcgg caagatggag gtatgtctga gtcttcacga agcaatgatg 1920

agtacgacac taattcgaca tcgcagattt ggatccagga gctgtag 1967

<210> 2

<211> 483

<212> PRT

<213> 大丽轮枝菌Verticillium dahliae

<400> 2

Met Ser Leu Lys Gln Val Glu Cys Tyr Gln Arg Ala Ile Arg Leu Asp

1 5 10 15

Gln Tyr Leu Ala Val Ala Tyr Phe Gln Gln Gly Val Ser Asn Phe Leu

20 25 30

Leu Gly Asp Phe Glu Glu Ala Leu Ala Asn Phe Asn Asp Thr Leu Leu

35 40 45

Tyr Leu Arg Gly Asn Thr Met Ile Asp Tyr Ala Gln Leu Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Lys Leu Tyr Ser Cys Glu Val Leu Phe Asn Arg Gly Leu Cys Tyr

65 70 75 80

Ile Tyr Leu Gln Gln Lys Asp Ala Gly Met Gln Asp Leu Ser Tyr Ala

85 90 95

Val Lys Glu Lys Val Val Glu Asp His Asn Val Ile Asp Glu Ala Ile

100 105 110

Lys Glu Glu Ala Glu Gly Tyr Thr Val Phe Ser Ile Pro Val Gly Val

115 120 125

Val Tyr Arg Pro Asn Glu Ala Lys Val Arg Asn Leu Lys Thr Lys Asp

130 135 140

Tyr Leu Gly Lys Ala Arg Leu Val Ala Ala Ser Asp Arg Ala Asn Ala

145 150 155 160

Phe Thr Gly Phe Ala Gly Ser Glu Met Lys Thr Gln Gln Arg Gln Thr

165 170 175

Val Lys Asp Asp Arg Pro Ala Asp Asn Ile Ser Tyr Ala Ala Thr Asn

180 185 190

Leu Ile Lys Pro Gly Ile Gln Ser Arg Ser Thr Asp Asn Asn Arg Asn

195 200 205

Val Phe Pro Pro Thr Pro Pro Pro Asp Asn Asp Arg Ala Ser Gly Gly

210 215 220

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Asn Gly Asn Ala Ser Gly Gln

225 230 235 240

Met Thr Arg Gly Gln Ser Val Arg Asn Gly Pro Lys Pro Gln Leu Ala

245 250 255

Lys Leu Asn Ile Asp Thr Ser Gly Gly Asn Asn Arg Tyr Glu Lys Thr

260 265 270

Ser Ser Pro Pro Glu Arg Arg Pro Thr Asn Ala Thr Arg Ser Ala Ser

275 280 285

Ser Thr Pro Ala Arg Gly Tyr Ser Arg Arg Asp Gln Gln Arg Arg Asn

290 295 300

Leu Arg Asp Asp Glu Glu Gly Gly Asp Ala Tyr Pro Asp Glu Leu Tyr

305 310 315 320

Asp Met Tyr Gln Gly Gly Arg Ser Ser Arg Gly Pro Ser Arg Arg Pro

325 330 335

Gln Gln Gln Gln Arg Tyr Ile Glu Glu Glu Asp Glu Gly Ser Asp Tyr

340 345 350

Asp Asp Gly Ser Phe Asp Glu Gly Asp Phe Glu Met Val Ser Asn Asn

355 360 365

Pro Pro Arg Arg Met Gly Thr Asn Ser Thr Ser Ser Gly Gly Arg Gly

370 375 380

Ala Ser Arg Arg Pro Asp Val Arg Lys Val Arg Val Lys Val His Ala

385 390 395 400

Glu Asp Val Arg Tyr Ile Met Ile Gly Thr Ala Ile Glu Phe Thr Asp

405 410 415

Leu Val Asp Lys Ile Arg Asp Lys Phe Gly Leu Arg Arg Arg Phe Lys

420 425 430

Ile Thr Val Arg Asp Asp Asp Gly Gly Pro Asn Ala Asp Met Ile Thr

435 440 445

Met Gly Asp Gln Asp Asp Leu Glu Met Val Ile Met Ser Ser Lys Ala

450 455 460

Ile Ala Arg Arg Thr Arg Gln Glu Ile Gly Lys Met Glu Ile Trp Ile

465 470 475 480

Gln Glu Leu

<210> 3

<211> 1001

<212> DNA

<213> 大丽轮枝菌Verticillium dahliae

<400> 3

gcgagccgcc caacacttcc gttgttccat tcctcattct ctttcgtacc ctcctttccg 60

taggcgctgg cttctcgtca caacatccat tcattcacgc tcatttttag caagctcatc 120

tgcaagagct ctcttctcgt cacctttctt ggccacgccg cacagtcaac ttctctccat 180

ttcgattctt gacatcgcgc tccacctcga cagaccatcg aaccacgcac gctcaggacc 240

ggccccccca agacgctact gtccgtgaca acttttccca agcaactttg cccatctaat 300

tagacccgat ttgacaacag cgccgccccg acagttattg tcttggtatc tcgcttcgga 360

ctgcgcctga ttctctcgat cgacccggat tctactcaac taataattct ttcatatcac 420

cttcggacaa tccggtaacc ttgcaaggca caaccatata cacccgagac acttgtctgt 480

tcttgggact tcttcggaac caccacttgc tgctgtctca tcggctttcg cgtctgagcc 540

ctcgagcagc cacttcttcc agcgctcttg actctcaatc gagcactgct gcacttgcaa 600

tttcccacca cggcctttgc cgccgcccga ttccttttgc caagaccaga ccacgagacc 660

cagccgattt ctacccagtt gtcagcccaa gcgcggggcg gggaaatttc ctacatcgac 720

cataccgatc gggtccttga ctaagtgcac ggccagcgat acggcacgag gcttagacca 780

gtggccacct aaataagccc tgaaagcccc tctataacct acccgcccca accttacgcc 840

agcccgtcgt ccacctgccc gtttcctccc gcctctctca cgaccaccag catctcgacc 900

tcacgaccac ggtcggtttg tcgcagaagc gaccgtatgc ctgcacagct gcttctatca 960

cagactttcc gcggattctt atccacggtc cagtaacaca a 1001

<210> 4

<211> 1001

<212> DNA

<213> 大丽轮枝菌Verticillium dahliae

<400> 4

gacggacgat acccagcgcc gccacgaggc tggctggtcg caccaccatt atcttttacg 60

acgtaatgaa atcaagcccc acagggcaag tgggagagag aaagagccac cttagagctg 120

gctcgatggc atacgcaaga aaattgcaat gaactattct tgactatttc tttggattgc 180

atccaacagc atagaattgg ggaaagggga gggggatggg cggagcggtg gttcctggac 240

tggaccaagt gtcatgtgtt tcggatgtag gtgtggtact gtgaagggat ttcgccccga 300

tcatcgagtg cgtgcacgcg cgtgtgtggt gcgagggagg tagctacccg taataactcg 360

tacgtgctgt tgtcgtgaaa gacggttttg tccattgcgc ggttttgagg tgcgtgctcc 420

atgacgtgtt cccctgtgat gtgaaacgcg cagtgttttg tgatggatgg gcgaggcatc 480

atgacctcgt ttatcaattg tcacgagatg acctgcaacc cgtgaccggt agtgctcccg 540

tcaaaacgtc ttatactcta caataatgaa cagactatga tacaaggtat aggccgacag 600

tcacgcgacg aacaaccccc ctttcatgcc caccgaccca gcccatctaa gcagcgccgg 660

ccccttgaag cctcagcata gcctcctcgg gccccagcac agcaagctgc agcttggccg 720

gcttagccgg cctcgtcccg tcgcccgtga gaagcaggcg cagacattcg tagaccctcg 780

tccgctcctc gaccggcttg tcggcgagca gcgcagcaat ggccttttgg atcgcatccg 840

gggtccagcc gtcgcggccc tcgccgtctc gggtcgccag gggcgccagc gccgcggtca 900

gggcggctgc tgcttcgcgg agcgcaccat ccgccgcgtc cgcgcgggcc gggcggaaga 960

agagggaagg gtggtttgcg aggagcgagt gcgggtcgat g 1001

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 大丽轮枝菌Verticillium dahliae

<400> 5

cgggatcccg agccctcttg cctctccgt 29

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 大丽轮枝菌Verticillium dahliae

<400> 6

ggaattccct gcgacaaacc gaccgtg 27

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 大丽轮枝菌Verticillium dahliae

<400> 7

cccaagcttg gggcaagatg gaggtatgt 29

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 大丽轮枝菌Verticillium dahliae

<400> 8

ccatcgatgg gagggtctac gaatgtc 27

<210> 9

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 大丽轮枝菌Verticillium dahliae

<400> 9

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggccg ggatcccgag ccctcttgcc tctccgt 57

<210> 10

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 大丽轮枝菌Verticillium dahliae

<400> 10

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggcc atcgatggga gggtctacga atgtc 55

Claims (10)

1.一种蛋白质在降低大丽轮枝菌致病性中的应用，所述蛋白质氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

2.一种基因在降低大丽轮枝菌致病性中的应用，所述基因为编码SEQ ID NO.2所示蛋白质的基因。

3.根据权利要求2所述的应用，所述基因为如下1）至3）中任一基因：

1）核苷酸序列如SEQ ID NO.1中自5´末端依次连接第1-15位、第367-702位、第753-914位、第973-1890位和第1947-1967位所示的基因；

2）核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因；

3）与1）或2）限定的基因具有90％以上的同源性且编码SEQ ID NO.2所示蛋白质的基因。

4.根据权利要求2所述的应用，其包括：敲除所述大丽轮枝菌中的所述基因。

5.根据权利要求4所述的应用，其包括：（1）将含有所述基因上游和下游序列的载体转化农杆菌，所述基因上游序列如SEQ ID NO.3所示，所述基因下游序列如SEQ ID NO.4所示；（2）筛选转化成功的所述农杆菌；（3）转化成功的所述农杆菌转染所述大丽轮枝菌；（4）筛选敲除成功的所述大丽轮枝菌。

6.一种重组载体，其为能够敲除以下一种或多种基因的重组载体：

编码SEQ ID NO.2所示蛋白质的基因，

SEQ ID NO.1所示的基因，

SEQ ID NO.1中自5´末端依次连接第1-15位、第367-702位、第753-914位、第973-1890位和第1947-1967位所示的基因，

其特征在于，所述重组载体含有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示基因。

7.根据权利要求6所述的重组载体，所述重组载体为将SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示基因插入pGKO2-Gateway质粒构成的重组载体。

8.一种重组的大丽轮枝菌，其特征在于，所述大丽轮枝菌缺失以下一种或多种基因：

编码SEQ ID NO.2所示蛋白质的基因；

SEQ ID NO.1所示的基因；

SEQ ID NO.1中自5´末端依次连接第1-15位、第367-702位、第753-914位、第973-1890位和第1947-1967位所示的基因。

9.一种构建权利要求8所述大丽轮枝菌的方法，其特征在于，所述方法包括：敲除所述大丽轮枝菌中的以下一种或多种基因：

编码SEQ ID NO.2所示蛋白质的基因；

SEQ ID NO.1所示的基因；

SEQ ID NO.1中自5´末端依次连接第1-15位、第367-702位、第753-914位、第973-1890位和第1947-1967位所示的基因。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求6所述重组载体导入所述大丽轮枝菌。

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