CN104447965A

CN104447965A - 一种大丽轮枝菌的致病相关蛋白VdSENP1及其编码基因

Info

Publication number: CN104447965A
Application number: CN201310424509.4A
Authority: CN
Inventors: 郭惠珊; 赵云龙
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Beijing Zhongke Keshi Silk Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2013-09-17
Filing date: 2013-09-17
Publication date: 2015-03-25
Anticipated expiration: 2033-09-17
Also published as: CN104447965B

Abstract

本发明公开了一种大丽轮枝菌致病相关蛋白VdSENP1及其编码基因与应用。该蛋白VdSENP1，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1）序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列；2）将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与真菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的蛋白和其编码基因对培育抗黄萎病棉花，以及提高棉花产量和品质具有十分重要的意义。

Description

一种大丽轮枝菌的致病相关蛋白VdSENP1及其编码基因

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大丽轮枝菌（Verticillium dahliaeKleb.）致病相关蛋白及其编码基因。

背景技术

由土壤丝状真菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）所引起的棉花黄萎病是威胁棉花生产的主要病害，多年来一直严重影响着我国棉花的品质和产量。棉花黄萎病1914年始见于美国的费吉尼亚州，随后在其它州和世界各植棉国先后发现(沈其益，1992),1935年随引进美棉品种传入我国，但危害不重。到二十世纪50年代以后，黄萎病在我国南北局部棉区陆续发生，扩散蔓延速度加快。80年代末，黄萎病已遍及全国478个植棉县(市)。进入90年代以来，我国棉花黄萎病扩展蔓延迅猛，尤其是1993,1995,1996,2002年在全国范围内连续大发生，损失严重。至今，我国大部分主产棉区己成为黄萎病重病区。

黄萎病致病菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)，属半知菌亚门，丛梗抱目，淡色孢科，轮枝菌属。大丽轮枝菌的寄主范围很广，涉及十字花科、蔷薇科、豆科、茄科、唇形花科、菊科等，目前已达660多种植物，并且还在逐年扩大。关于棉花黄萎病的致病机制有多种解释，其中以导管堵塞和中毒两种观点为主。60年代人们对该病菌致病机制的认识是由于菌体在导管内定殖，并大量繁殖，同时刺激邻近的薄壁细胞产生胶状物质及侵填体而堵塞导管，阻碍水分的运转，从而导致棉株萎焉(Garber,1966)。马远莉等(1990)对棉花各部位黄萎病菌在导管中的分布情况研究后认为，正常的次生木质部导管的潜在输水能力远远超过植物的总需水量，而且被堵塞的导管数占整个维管束的比例不大(最大的有17.7%)，因此导管堵塞不是导致棉花萎焉的主要原因。Keen等(1972)认为，黄萎病菌在代谢过程中产生的毒素为有毒的蛋白质，是一种酸性蛋白质一脂多糖的复合体。该复合物对感病棉花品种的叶片与根组织的细胞膜具有破坏作用，使细胞内K⁺和Na⁺大量渗漏。而抗病品种的细胞膜不具备毒素作用的受体位点而不受毒素破坏。Wang等(2004)从黄萎病原菌的菌丝中分离到一个新的具有对棉花叶片有致萎作用的蛋白VdNEP。该蛋白可以诱导烟草叶片形成坏死斑，也可以使拟南芥产生抗病反应，因此该蛋白可能参与了黄萎病菌对棉花侵染时的互作反应。但目前尚不清楚该蛋白是否与以前己分离的毒素蛋白是同一物质。现在越来越多的研究表明，黄萎病菌分泌的毒素是导致黄萎病的关键生化因子，同时组织导管的阻塞影响水分运输可能加剧了病症的产生。

大丽轮枝菌是一种土传真菌，在干燥恶劣的环境下能够产生其休眠结构微菌核，从而在土壤中存活多年。所以微菌核的形成与其致病性息息相关。2004年，DobinsonKF等(Dobinson,K.F.,et al.,2004)利用改造了的EZ::TN转座系统，对来源于番茄的大丽轮枝菌的胰蛋白酶VTP1成功的进行了定向敲除。该基因能够促进微菌核的形成，但是敲除以后没有影响其致病性及生长特性。2005年，Dobinson KF等对来源于莴苣和番茄的大丽轮枝菌的细胞分裂素活化蛋白激酶基因VMK1进行了敲除。敲除VMK1后菌株对各种宿主的致病性严重衰退，说明MAP激酶介导的信号通路在真菌致病性上起着重要作用。并且基因的敲除减少了孢子的产生和微菌核的形成，说明该基因可能参与多个细胞进程。2006年Dobinson KF等(Klimes,A,et al,2006)又利用此系统对来源于番茄的大丽轮枝菌的类型2疏水蛋白基因VDH1进行了敲除。该基因的敲除减少了微菌核的产生，但不影响其致病性。对孢子的产生也没有影响，但影响了孢子对干燥环境的耐受力。说明VDH1基因的功能是多方面的，可能与大丽轮枝菌在土壤中长期的生存有关。2008年Dobinson KF等又研究了在微菌核的形成过程中VDH1基因的调控和表达，发现VDH1基因在微菌核、菌丝融合体及孢子中特异表达，进一步证明了该基因与微菌核的形成相关。

由于棉花黄萎病危害的严重性和寄主的广泛性，世界上不少国家的科技工作者对其进行了深入研究。植物在与病原物的长期协同进化过程中获得了一系列复杂的防御机制保护自己，抗性表现为组成型抗性和诱导型抗性，诱导型抗性又包括组织结构抗性和生理生化抗性。对黄萎病抗性不同的棉花品种在组织结构方面存在一定差异，己被国内外不少研究证实。抗病品种木质部的细胞间隙较小，细胞壁较厚，且木质部中含有较多的髓射线。另外，抗病品种的导管腔和木质部的纤维腔直径小于感病品种，说明棉花品种对黄萎病的抗性与其具有坚实的木质部有关。棉花的生理生化抗病性方面己有过较多的研究，研究较多的抗病相关因子包括:植保素、单宁、可溶性糖、氨基酸及多种酶类。棉株在遭受病菌侵袭后，内部产生多种抑菌物质，主要包括棉酚、植保素、单宁等，另外还与一些酶类、蛋白以及小分子物质如H₂O₂。它们的作用是非专化性，与植物的基础抗性相关。棉花抗黄萎病的机制是一个非常复杂的问题，涉及的因素众多，因此不断深入研究这些抗病反应产物在基因表达水平上的规律，对于进一步深入了解抗病机制和利用基因工程手段改造棉花品种抗性具有重要意义。

抗病基因的获得是选育抗病品种的重要基础，目前通过分子生物学手段己经克隆的植物抗病基因大概有39个以上，其中抗病原真菌的大概有20多个，如拟南芥抗白粉病基因RPW8，番茄抗枯萎病基因Ve，高梁抗普通锈病(Puccinia Sorghi)基因Rpl-D，且在海岛棉上已经克隆了NBS-LRR类抗病基因。在常规育种上，国内外棉花育种者一直重视抗源的筛选和创造。1983-1986年李成葆等161对911份陆地棉资源进行了抗黄萎病鉴定，筛选了抗性较好的一批抗(耐)病品种。K.V.Srinvasin鉴定了126个海岛棉品种的抗性，结果显示表现耐病和抗病的占85%。无论是通过常规方法寻找抗源，还是通过分子生物学手段克隆抗病基因都已经取得了一定的进展，但还没有找到真正防治棉花黄萎病的有效办法。根本原因在于棉花等作物遗传背景复杂，很难在分子水平进行更深入的研究，另外黄萎病菌(大丽轮枝菌，Veriicillium dahliae)小种分化变异性强等原因也为抗病遗传育种带来重重困难。因此，研究棉花黄萎病病原大丽轮枝菌与寄主植物互作的分子机理就至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来自大丽轮枝菌Veriicillium dahliae的致病相关蛋白，名称为VdSENP1(Sentrin-specific Protease1)。

本发明提供的致病相关蛋白，是如下1）或2）的蛋白质：

1）序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2）将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与真菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。

所述真菌具体为大丽轮枝菌。

序列表中SEQ ID №.2所示的氨基酸序列由1064个氨基酸残基组成。

上述1）和2）中的VdSENP1蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述1）和2）中的VdSENP1蛋白的编码基因可通过将序列表中SEQ ID №.1的第383-3577位核苷酸所示的DNA序列缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变后得到。

编码所述VdSENP1蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

本发明的又一个目的是提供所述蛋白的编码基因。

所述编码基因具有下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ ID №：1的第383-3577位核苷酸所示的核苷酸序列；

2)序列表中SEQ ID №.1所示的核酸序列；

3）编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸序列；

4）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

5）与1）或2）或3）或4）限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。

上述高严谨条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

其中，序列表中的SEQ ID №：1由3836个核苷酸组成，其开放阅读框架（ORF）为自5′末端第383-3577位核苷酸，编码序列表中SEQ ID №：2所示的蛋白质，即本发明所述的VdSENP1蛋白。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。

扩增本发明所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供本发明所述蛋白、编码基因和含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在在提高大丽轮枝菌的致病性中的应用。

本发明的再一个目的是提供一株致病性降低的大丽轮枝菌，其保藏编号为CGMCCNO.8056。

抑制大丽轮枝菌中本发明所提供的蛋白的表达或抑制大丽轮枝菌中本发明所提供的编码基因的表达的方法或产品在降低大丽轮枝菌的致病性中的应用也属于本发明保护的范围。

本发明所提供的蛋白或任一本发明所提供的编码基因作为靶点在降低大丽轮枝菌的致病性中的应用也属于本发明保护的范围。

所述致病性是指引起棉花的黄萎病。

附图说明

图1为突变菌株vdsenp1与野生型菌株592致病性比较图示。

图2为突变菌株vdsenp1与野生型菌株592在PDA培养基上生长性状的比较图示。

图3为突变菌株vdsenp1与野生型菌株592在查氏培养基中生长性状的比较图示。

图4为突变菌株vdsenp1的southern杂交图示。

图5为突变菌株vdsenp1经过互补试验获得的互补菌株vdsenp1/VdSENP1的southern和northern鉴定结果图。

图6为突变菌株vdsenp1经过互补试验获得的互补菌株vdsenp1/VdSENP1的致病性鉴定图示。

图7为菌丝及孢子中VdSENP1基因表达水平的northern杂交检测结果图。

图8为菌核期及棉花汁液诱导条件下，VdSENP1基因表达水平的northern杂交检测结果图。

图9不同的环境胁迫及高渗胁迫下，VdSENP1基因表达水平的northern杂交检测结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）致病基因VdSENP1的制备

提取大丽轮枝菌野生型菌株592(菌株592采自新疆棉花田，记载该材料的文献是棉花植株内黄萎病菌致病类型的快速检测.新疆农业科学2010，47(4)：827-831，公众可从中国科学院微生物研究所获得)的RNA，反转录为cDNA，并以该cDNA为模板，用下述引物1和引物2进行RT-PCR扩增：

引物1：gCCCGGG ATGGGGTCAAAAAAACATGTCC（上游引物，下划线部分为Sma I）；

引物2：cACTAGT TCATGCATAAGGATATTCGC（下游引物，下划线部分为Spe I）。

PCR扩增产物经克隆测序证明，扩增产物具有序列表中SEQ ID №.1的第383-3577位核苷酸所示的核酸序列，编码具有序列表中SEQ ID №.2所述氨基酸残基序列的蛋白质，共1064个氨基酸残基，将该具有序列表中SEQ ID №.2所述氨基酸残基序列的蛋白质命名为VdSENP1，将VdSENP1蛋白的编码基因命名为VdSENP1。

实施例2、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）致病基因VdSENP1的功能验证

（一）、表达载体的构建

真菌表达载体1300HPH-VdSENP1的构建方法如下：首先，将载体pCAMBIA-1300221（记载pCAMBIA-1300221质粒的文献是Satellite RNA-derived satsiR-12targetingthe 3'UTR of Cucumber mosaic virus triggers viral RNAs for degradation.Journalof Virology.201185.13384-13397，公众可从中国科学院微生物研究所获得该质粒。）用Sma I酶切得到载体片段与pKOV21载体（记载pKOV21载体的文献是Differentchitin synthase genes are required for various developmental and plantinfection processes in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae，PLoS Pathogen，20128:e1002526，公众可从中国科学院微生物研究所获得该质粒。）经EcoR I和HindIII酶切补平得到的HPH片段连接，得到重组载体1300HPH。然后将载体pSULPH-EGFP（记载pSULPH-EGFP质粒的文献是A Glutamic Acid-Rich Protein Identified inVerticillium dahliae from an Insertional Mutagenesis Affects MicrosclerotialFormation and Pathogenicity，PLoS ONE，2010 5(12):e15319，公众可从中国科学院微生物研究所获得该质粒。）和实施例1所述PCR扩增产物用Sma I和Spe I酶切，胶回收约3195bp核酸片段和13000bp载体骨架片段，连接过夜，得到重组载体pSULPH-VdSENP1。最后，将载体1300HPH用Hind III和Xba I酶切得到载体骨架片段，载体pSULPH-VdSENP1用Hind III和Xba I酶切得到VdSENP1表达片段，连接过夜，得到重组表达载体1300HPH-VdSENP1，经测序验证，重组表达载体构建正确，即所述重组表达载体1300HPH-VdSENP1为在出发载体pCAMBIA-1300221的Sma I酶切位点间插入HPH表达片段，并在Hind III和Xba I酶切位点间插入了具有序列表中SEQ ID №.1的第383-3577位所示的核酸序列的DNA片段的表达片段而得到的重组表达载体。

（二）、突变菌株vdsenp1的制备

1、大丽轮枝菌突变体库的构建

大丽轮枝菌菌株592在PDA平板上25℃培养后将孢子接种于查氏液体培养基(将2gNaNO₃、1g KH₂PO₄、1g MgSO₄.7H₂O、1g KCl、2mg FeSO₄.7H₂O和30g蔗糖溶于1L蒸馏水中配制而成。)中振荡培养5-8天直至孢子浓度为1.0×10⁷/mL，孢子培养液用4层无菌纱布过滤以除去菌丝。4000rpm离心10min得到孢子并用诱导培养基加AS(乙酰丁香酮)200mM将孢子浓度调节到1.0×10^6-7/mL。将含pSULPH-EGFP质粒的农杆菌在30ml基本培养基(MM)（含有Kan50mg/L,Rif25mg/L)中28℃培养48h，4000rpm，离心10min,沉淀用诱导培养基(IM)洗两次，重悬农杆菌至OD值为0.2-0.3并加200mM AS(乙酰丁香酮)、40mM MES以及Kan(50mg/L),28℃,200rpm振荡培养6h。然后吸取100μL上述培养物与100μl的分生孢子悬浮液混合，泼于放在共培养基上的孔径为45μm的47mm直径的纤维素膜上，在28℃培养36h。用2mL基本培养基洗膜，收获真菌和细菌培养物，然后取200两涂于含100μg/mL氯嘧磺隆（Cholorimuron）的选择培养基平板上，抑制A.tumefaciens的生长，挑取单个转化子转至选择培养基平板进行二次筛选并保存转化子。

2、突变菌株vdsenp1的获得

通过菌株侵染水培棉花来鉴定突变体的致病性，从而筛选出致病性改变的突变体。挑选饱满的棉种(新陆早-16，购于新疆石河子大学农学院)，用15％的次氯酸钠浸泡30min后，无菌水冲洗2-3遍，再用无菌水浸泡催芽过夜后平铺在培养盒中保湿，待芽长至3cm，种于发芽盒中。在泡沫板上打取直径2cm、间距3cm的孔洞，用海绵条缠绕发芽棉子的根芽交界处，塞入泡沫板的孔洞中。将泡沫板置于盛满清水的塑料盒(高8-10cm)上，于25℃，光照16h，黑暗8h下培养。待真叶长出时将清水换成1/3的MS培养液，每周更换一次培养液，1片真叶展平时接种。将-80℃保存的菌株经PDA平板活化3-4d，从菌落边缘挑取菌块放入查氏培养液，25℃，220rpm摇培5d，过滤，滤液5000g离心5min，清水稀释孢子，血球计数板计数，将浓度调至1×10⁷个孢子/ml。将调好浓度的孢子悬浮液加入空塑料盒中，将棉苗根部浸入孢子悬液40min，之后取出棉苗用1/3的MS培养液25℃光照16h，黑暗下继续培养棉苗8h。每盒中种12株苗，每个菌株3次重复，对照棉苗用清水浸泡40min。筛选结果见图1。

通过上述方法，筛选获得了致病性减弱的突变菌株vdsenp1，其生长速度减缓，菌落边缘的生长出现毛刷状不整齐现象，且显微镜下观察可知其菌丝出现极性生长现象（见图2、图3）。将该致病性减弱的突变菌株vdsenp1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.8056，保藏日期为2013年08月13日，分类命名为大丽轮枝菌Verticillium dahliae。保藏中心的地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。公众可从中国科学院微生物研究所获得该突变菌株vdsenp1）。

3、Southern杂交确定突变菌株vdsenp1的T-DNA插入拷贝数

A、基因组DNA的提取方法如下：在液体查氏培养基中，200rpm振荡培养菌丝。震荡培养的液体10000rpm离心10min后用液氮研磨。加入500μL的提取缓冲液(100mmol/LTris-HCl,PH8.0,100mmol/L EDTA,250mmol/L NaCl)，涡流使菌粉与提取缓冲液充分混合，然后加入50μL20%SDS，轻摇Eppendorf管，使混合物混合均匀，置于37℃水浴1h，取出并加入75L5mol/L NaCl，轻轻混匀，再加入65μL10%CTAB及0.75mo1/LNaCl溶液，轻轻混匀，然后放入65℃水中温育20min，取出后加入700μL氯仿/异戊醇(24:1)溶液，混匀，12000rpm离心12min,取上清液，加入2倍体积的冰冻无水乙醇，混匀后放入-20℃冰箱中至少30min,取出后在l0000rpm离心2min，弃上清，用70%酒精洗盐2次，干燥后，加入40μL TE溶解。

B、提取的DNA分别用EcoR I、Xba I和BamH I酶切

酶切体系：

取5ul电泳检测酶切是否完全

加3vol无水乙醇沉淀酶切产物，最后融于约40μlddH₂O中，加Loading Buffer；点样前65℃5～10min。

C、电泳

0.9％Agar（0.5×TBE）；50V，18～24hr；最后反向跑5min。

D、凝胶处理

（1）电泳完毕后，照相；ddH₂O冲洗凝胶

（2）0.2M HCL浸泡凝胶，并置于脱色摇床轻轻摇动（注意不要太快，以防凝胶碎裂）；大约20min，直至溴酚蓝变黄（浓盐酸为10MOL/L，即稀释50倍，10ml到500ml）

（3）去离子水洗2遍，加变性液shaking，约40min，直至溴酚蓝由黄变蓝

Nacl1.5M(87.75g/L)

NaOH0.5M(20g/L)

（4）去离子水洗2遍，加中和液shaking，约30min

Nacl1.5M(87.75g/L)

Tris.cl0.5M(60.57g/L)

浓HCL约23～25ml，调PH7.2

E、转膜

(a)用长和宽均大于凝胶的板胶作为平台，放在塑料盘中，倒入20×SSC，剪一条与平台等宽，长度大于平台的滤纸，先将滤纸一端浸湿在塑料盘中，慢慢放在平台上，直到另一端也浸湿在20×SSC中，赶出滤纸和平台间的气泡。

(b)剪一张长和宽均略大于凝胶的尼龙膜，剪去左上角，完全浸湿在无菌水中，取出膜，再浸入20×SSC中，至少5分钟。

(c)电泳结束后，切掉凝胶的无用部分，并在左上角切去一角，以作为方位标记。将凝胶放在20×SSC中漂洗片刻。

(d)将凝胶倒放在平台上滤纸的中央，赶出胶和滤纸间的气泡，用Parafilm围绕凝胶周围，不要碰到凝胶上的样品。

(e)用20×SSC浸湿凝胶，将湿润的尼龙膜放在凝胶上面，使二者切角重合，赶出尼龙膜和凝胶间的气泡。

(f)用20×SSC浸湿5张与尼龙膜同样大小的滤纸，放在尼龙膜上面，赶出滤纸和尼龙膜间的气泡。

(g)剪一叠10cm厚，略小于滤纸的纸巾，放在滤纸上面，纸巾上放一块玻璃板，再压上500g的重物，转移过夜。

(h)揭去凝胶上方的纸巾、滤纸和Parafilm，翻转凝胶和尼龙膜，以凝胶一面在上放在一个塑料盘中，用铅笔在尼龙膜上标记凝胶加样孔的位置。

(i)从尼龙膜上剥离凝胶弃之，将尼龙膜浸泡在20×SSC中5min，取出尼龙膜，放在湿润的滤纸上，紫外交联固定DNA。

(j)用亚甲基蓝染色，直到看见清晰的RNA条带，蒸馏水冲洗脱色，用保鲜膜包好，放在4℃保存待用。

F、标记探针

(Amersham公司随机引物标记试剂盒，RediprimeTMII Random Primer LabellingSystem)。

(a)取待标记的DNA25ng，加无菌水，使体积扩增至45μl。

(b)98℃，保温5分钟，变性DNA。

(c)离心，使DNA聚集在离心管管底，放在冰上。

(d)将变性的DNA加到标记混合物中，轻轻混匀，直到pellet完全融解(不能用枪吹打)。

(e)加1μl Klenow(防止标记混合物中的Klenow失活)，离心。

(f)加5μlα-32P-dCTP，用枪轻轻吹打均匀，离心。

(g)37℃，反应30分钟；98℃，5分钟，变性已标记好的DNA探针，离心，放在冰上。

(h)取适量探针用于杂交，剩余的探针保存在4℃冰箱中。

G、杂交

即终浓度分别为：

5×Denhart’s

5×SSPE

0.5%SDS

(a)预杂交：将杂交缓冲液倒入杂交管中，65℃预热15min，放入交联固定的膜，65℃预杂1～2hr。

(b)杂交：向杂交管中加入20μl标记好的探针，65℃杂交过夜。

(c)洗膜：用洗膜缓冲液2×SSC/2%SDS，在65℃/20min条件下洗膜两次；用0.2×SSC/0.2%SDS，在65℃/20min条件下洗膜一次。

(d)压片：将洗好的膜从杂交管中拿出，转移至两层塑膜中，检测杂交信号强弱，将膜放入暗夹中，在暗室中将X-光片压入暗夹中，－80℃压片。

(e)冲片：暗室中将X-光片取出，分别在显影液中显影和定影液中定影。

结果如图4所示。图4B显示的是pSULPH-EGFP载体简图，杂交的探针为EGFP序列。图4A结果显示，分别用EcoR I、Xba I和BamH I酶切DNA后用杂交探针EGFP都只能杂交到一条带，说明pSULPH-EGFP在突变菌株vdsenp1中为单拷贝。

4、TAIL-PCR技术确定突变菌株vdsenp1的T-DNA插入位点

利用热不对称交错PCR（TAIL-PCR）来获得插入位点侧翼序列。根据pSULPH-EGFP载体的已知序列在左右分别设计3个与其边界距离不等的嵌套的特异性引物LB1、LB2、LB3以及RB1，RB2、RB3,特异性引物的长度约20bp,Tm一般为58～68℃:

LB1gggttcctatagggtttcgctcatg

LB2catgtgttgagcatataagaaaccct

LB3gaattaattcggcgttaattcagt

RB1ggcactggccgtcgttttacaac

RB2aacgtcgtgactgggaaaaccct

RB3cccttcccaacagttgcacag

再按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计一系列简并引物AD,简并引物相对较短,长度为14bp,Tm为30～48℃：

AD1 (AGCT)TCGA(GC)T(AT)T(GC)G(AT)GTT

AD2 (AGCT)GTCGA(GC)(AT)GA(AGCT)A(AT)GAA

AD3 (AT)GTG(AGCT)AG(AT)A(AGCT)CA(AGCT)AGA

AD4 TG（AT）G(AGCT)AG（AT）A(AGCT)CA（GC）AGA

AD5 AG(AT)G(AGCT)AG(AT)A(AGCT)CA(AT)CA(AT)AGG

AD6 CA(AT)CGIC(AGCT)GAIA（G/C）GAA

AD7 TC（GC）TICG(AGCT)ACIT（AT）GGA

AD8 （GC）TTG(AGCT)TA（GC）T(AGCT)CT(AGCT)TGC

AD9 （AT）CAG(AGCT)TG（AT）T(AGCT)GT(AGCT)CTG

AD10 TCTTICG(AGCT)ACIT(AGCT)GGA

AD11 TTGIAG(AGCT)ACIA(AGCT)AGG

通过三轮的PCR反应获得侧翼序列，第二、三轮的模板分别为第一、二轮的PCR产物。反应程序如下所示：

上述*,**,***,和****分别代表×5,×10,×15,×30循环。

在获得侧翼序列后，与大丽轮枝菌基因序列库对比，找到T-DNA插入位点，进而找到T-DNA插入的基因为VdSENP1。

（三）、突变体的互补验证

利用农杆菌介导的转化将上述制备的重组表达载体1300HPH-VdSENP1转进突变菌株vdsenp1中，获得互补菌株vdsenp1/VdSENP1。互补菌株vdsenp1/VdSENP1的southern和northern鉴定结果见图5，图5结果表明VdSENP1基因已插入到突变体vdsenp1的基因组中，并使VdSENP1基因恢复到野生型菌株592的表达水平。

按照上述（二）中步骤2所描述的方法进行互补菌株vdsenp1/VdSENP1的致病性鉴定，实验结果见图6。图6结果显示VdSENP1突变基因获得了互补，突变菌株vdsenp1恢复了与野生型592相同的致病性。

实施例3、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）致病基因VdSENP1的其他功能研究

（一）VdSENP1基因在大丽轮枝菌菌丝生长发育过程中起促进作用

从PDA平板上生长的大丽轮枝菌野生型菌株592上挖下菌块置入查氏培养基中，28℃，200rpm培养。第四天取材，用四层纱布滤出孢子，分别提取菌丝和孢子的RNA，进行northern杂交。探针的核苷酸序列具有序列表中SEQ ID №.1的第2154-2580位核苷酸所示序列。Northern杂交结果见图7，图7结果表明VdSENP1基因在菌丝中的表达水平高于孢子的表达水平，结合突变体vdsenp1菌落生长缓慢见图2和菌丝极性生长见图3，说明基因VdSENP1在菌丝的生长和正常发育中发挥作用。

（二）VdSENP1基因参与大丽轮枝菌的菌核形成并在棉花诱导下抑制表达。

从长满大丽轮枝菌野生型菌株592的孢子及菌核的PDA平板上挖下菌块置入查氏培养基中，28℃，200rpm培养。第四天时，把真菌培养液分成等量的两瓶，一瓶作为对照。把新陆早-16棉花植株研磨成汁液，加入另一瓶培养液中，继续培养，分别于自加入棉花植株汁液后的第2小时、第8小时取材，提取RNA进行northern杂交试验。探针的核苷酸序列具有序列表中SEQ ID №.1的第2154-2580位核苷酸所示序列。

用无菌水从平板上的大丽轮枝菌野生型菌株592的菌落上洗下孢子，涂于铺有硝酸纤维素膜的PDA培养基上，培养至产生微菌核。刮下微菌核，提取RNA进行northern杂交试验。探针的核苷酸序列具有序列表中SEQ ID №.1的第2154-2580位核苷酸所示序列。

Northern杂交结果见图8，图8结果表明VdSENP1基因在菌核期处于高表达水平状态，当受到棉花汁液诱导的时候，低水平表达，可能是棉花中的杀菌物质对菌体形成了伤害，影响了菌丝的生长，从而导致基因VdSENP1表达水平的降低。说明VdSENP1基因参与大丽轮枝菌的菌核形成，并在致病过程中可能受到棉花抗病机制影响抑制其表达，从而减轻大丽轮枝菌的侵染。

（三）环境及高渗胁迫抑制VdSENP1基因的表达

从长满大丽轮枝菌野生型菌株592的孢子及菌核的PDA平板上挖下菌块置入查氏培养基中，28℃，200rpm培养。第三天时，对真菌分别进行缺氮、缺糖、高浓度盐、高浓度甘露醇及紫外线照射处理。缺氮、缺糖的具体实施步骤为：把真菌培养液1200rpm离心1分钟，收集真菌菌体，分别加入到缺氮和缺糖的查氏培养基中。高浓度盐、高浓度甘露醇的具体实施步骤为：在第三天的真菌培养物中分别加入0.5M NaCl、0.6M甘露醇。紫外线照射处理的具体实施步骤为：把第三天的真菌培养液倒入玻璃平皿中，置于紫外灯下照射培养。上述处理的培养物继续培养8小时后取材，提取RNA进行northern杂交。探针的核苷酸序列具有序列表中SEQ ID №.1的第2154-2580位核苷酸所示序列。

Northern杂交结果见图9，图9结果表明VdSENP1基因的表达还受到环境胁迫如缺氮、紫外线照射以及高渗胁迫如高浓度NaCl、高浓度甘露醇的抑制。说明VdSENP1基因在大丽轮枝菌应对环境胁迫的过程中有着一定的调控功能。

Claims

1.一种蛋白，是如下1）或2）的蛋白：

1）序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因具有下述核苷酸序列之一：

2)序列表中SEQ ID №.1所示的核酸序列；

3）编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸序列；

4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述重组载体具体为重组表达载体或重组克隆载体。

5.扩增权利要求2或3所述编码基因全长或其任意片段的引物对。

6.权利要求1所述的蛋白和权利要求2-3任一所述的编码基因和权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高大丽轮枝菌的致病性中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述致病性是指引起棉花的黄萎病。

8.一株致病性降低的大丽轮枝菌，其保藏编号为CGMCC NO.8056。

9.抑制大丽轮枝菌中权利要求1所述的蛋白表达或抑制大丽轮枝菌中权利要求2-3任一所述的编码基因表达的方法或产品在降低大丽轮枝菌的致病性中的应用。

10.权利要求1所述的蛋白或权利要求2-3任一所述的编码基因作为靶点在降低大丽轮枝菌的致病性中的应用。