CN101874115A - 用于产生具有提高的植物疾病抗性的转基因植物细胞、植物或其部分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病原体的控制。本文中公开了产生具有提高的病原体抗性的转基因植物的方法、包含编码功能蛋白的多核苷酸的表达载体、以及转基因植物和由所述植物产生的种子。

Description

用于产生具有提高的植物疾病抗性的转基因植物细胞、植物或其部分的方法

本申请要求2007年8月31日提交的美国临时专利申请系列号60/969,190和2008年8月27日提交的EP08163071的优先权。

本发明涉及病原体的控制。本文中公开了产生具有提高的病原体抗性的转基因植物的方法、包含编码功能蛋白的多核苷酸的表达载体，和转基因植物及由所述植物产生的种子。

特别地，本发明涉及与相应的非转化野生型对照相比，通过提高或产生生物胁迫相关蛋白(BSRP)的一种或多种活性而具有提高的致病真菌和/或线虫抗性的转基因植物细胞、植物或其部分，并且涉及用于产生所述植物细胞、植物或其部分的方法。

本发明也涉及产生并筛选此类植物细胞或植物和对其育种的方法。

人口增加和气候变化已经使全球性食物、饲料和燃料短缺近年来成为突出的焦点问题。此外在田间条件下，植物性能就生长、发育、生物量积累和产量而言取决于对环境变化的适应能力和对植物疾病胁的耐受性。生物性和非生物性胁迫对作物产量产生严重影响。病原体侵袭有时是最具毁灭性的生物胁迫。作物中疾病抗性的增强可以明显地帮助提高作物的生产力并减少杀虫剂应用，其中所述杀虫剂在过量应用时可能不利地影响人类健康和环境。植物疾病是由生物胁迫引起的传染病，但是非传染病由非生物胁迫引起。生物胁迫由植物病原体，即相关细菌、真菌、线虫、病毒、柔膜细菌(支原体、螺旋体)、原生生物、显花植物原虫、立克次氏体和类病毒、昆虫及寄生植物引起。非生物胁迫意指“次优生长条件”，谈及环境性胁迫时，指因天气和其他环境因素、受限的水和营养物可获性和次优配置性所致的损害。受限的水可获性可以诱导干旱、热、寒冷或盐胁迫。

植物传染病，换言之即生物胁迫，是世界范围内严重的作物损失原因，其中所述的严重的作物损失因感染正在生长的植物和摧毁已收获的作物所致。由这些胁迫所致的主要作物如稻、玉米(maize)(谷物(corn))和小麦的作物损失和作物产量损失代表重要的经济和政治因素并且造成世界范围内粮食短缺。

农业生物技术已经通过能提高作物产量的植物基因修饰来满足人类日益增长的需求，例如通过赋予更好的生物性和非生物性胁迫耐受性或通过增加生物量。植物针对病原体的天然防御机制往往是不充分的。当前，已知众多遗传学和生物技术方法旨在获得生物胁迫条件下生长的植物。

导入来自植物、动物或微生物源的外来基因可以增加所述防御。例子是通过表达苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素对抗昆虫摄食损害的保护作用(Vaeck等人(1987)Nature 328：33-37)或通过表达菜豆几丁质酶对抗真菌性感染的保护作用(Broglie等人(1991)Science254：1194-1197)。

大部分病原体具有针对特定植物物种、属和科的宿主特异性。例如，月季黑斑病将不侵袭万寿菊或芦笋。因此，大部分的所述方法仅针对单一病原体或狭窄范围的病原体提供抗性。植物-病原体相互作用有时受病原体的无毒力基因与植物的基因-对-基因疾病抗性(R)基因之间的特异性相互作用控制。多位作者已经报告通过转基因方法增强疾病抗性，如增加植物的疾病抗性(R)基因表达。R基因介导抗性的特征性防御反应是超敏应答(HR)，即包含受侵袭植物细胞的程序性细胞死亡的强烈抗性反应。抗微生物小肽作为对抗传染性微生物的植物天然防御系统的部分发挥重要作用。抗微生物肽通常是小的、阳离子的和两亲性的，并且具有开链形式。已经在植物中鉴定到多种类型的抗微生物肽，包括硫素、玉米zeamatin、咖啡环杆菌素、小麦嘌呤吲哚蛋白和植物防御素(Kawata等人，JARQ 37(2)，71-76(2003))。

仅存在向植物赋予更广泛范围病原体抗性的几种方法。全身获得性抗性(SAR)-在多种植物/病原体相互作用中的一种防御机制-可以通过应用内源性信使物质如茉莉酮酸(JA)或水杨酸(SA)而赋予(Ward等人(1991)Plant Cell 3：1085-1694；Uknes等人(1992)Plant Cell 4(6)：645-656)。类似作用也可以由合成的化合物如2，6-二氯异烟酸(INA)或S-甲基苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸酯(BTH；Bion200)(Friedrich等人(1996)Plant J10(1)：61-70；Lawton等人(1996)Plant J.10：71-82)实现。在SAR的情况下发病机理相关(PR)蛋白的上调的表达也可以在一些情况下引起病原体抗性。

在大麦，Mlo基因的丢失引起提高且尤其是品种非特异的针对数量众多霉菌物种的抗性(Buschges R等人(1997)Cell 88：695-705；Jorgensen J H(1977)Euphytica 26：55-62；Lyngkjaer M F等人(1995)PlantPathol 44：786-790)。没有描述其他植物中、尤其禾谷类物种中的mlo样抗性。描述了使用Mlo基因和来自其他禾谷类物种的同源物以获得病原体抗性的多种方法(WO98/04586；WO00/01722；WO99/47552)。不利之处在于mlo-介导的防御机制包含叶细胞的自发死亡(Wolter M等人(1993)MolGen Genet 239：122-128)。另一个不利之处在于Mlo-缺陷基因型显示对半活体营养型病原体如稻瘟病菌(Magnaporte grisea(M.grisea))和禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus(麦根腐平脐蠕孢(Bipolaris sorokiniana))的超敏感性(Jarosch B等人(1999)Mol Plant Microbe Interact 12：508-514；Kumar J等人(2001)Phytopathology 91：127-133)。

确定了活性氧类(ROS)的释放是对植物病原体反应中的重要保护功能(Wojtaszek P(1997)。已经证实在拟南芥(Arabidopsisthaliana)NADPH氧化酶的催化亚基中的突变显示活性氧中间体(ROI)的积累减少。就超敏感反应(HR)而言，结果是不一致的：无毒力细菌丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的感染在双重突变体中显出降低的HR，而有毒力的卵菌纲(Oomycete)寄生霜霉(Peronospora parasitica)显出提高的HR。在US 20080047033中，公开了用于通过降低NADPH氧化酶的表达、活性或功能来产生或增加植物中病原体抗性的方法。

另一种方法涉及发病机理相关蛋白(PRP)，尤其涉及转基因植物中编码PRP的DNA序列的组成型表达。发病机理相关蛋白是病原体感染后诱导的植物蛋白。此类PRP在US 20080120747或US 20080090294中公开，其中这些杀线虫及抗真菌多肽的物种源是植物物种。参与植物抗性的其他植物基因从例如US 7,320,892；US 20080184397或US 20070226839了解。

鉴于植物疾病构成人类食物储备和动物饲料的主要及持续性威胁的这一事实，需要可鉴定赋予广谱植物疾病抗性和/或耐受性的方法。最理想地是这种抗性和/或耐受性应当由蛋白质赋予，所述蛋白质可以由植物细胞通过翻译至少一个基因、两个或多个基因或基因组合直接形成。

因此，在第一实施方案中，本发明提供了用于通过任意放置“疾病抗性赋予蛋白”DRCP产生具有这些性状的转基因植物细胞的方法。

一些向植物赋予更广谱病原体抗性的方法基于增强的非生物性环境因素耐受性，其中所述的非生物性环境因素导致植物受胁迫。这种胁迫可以导致植物逐步衰弱。衰弱导致植物更易感于传染病。因此，问题的真正原因是非生物胁迫因子，而传染病仅是次要因素。

仍需要鉴定编码具有活性的多肽的基因，其中当产生或提高所述活性时，该活性在植物或植物细胞中赋予与相应的非转化野生型对照相比较而言提高的生物胁迫抗性，不仅在非生物胁迫条件下如此。提高的生物胁迫抗性应当主要并且直接针对生物胁迫因素。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了这样的“疾病抗性赋予蛋白”DRCP，其赋予主要且直接针对生物胁迫因素的提高的生物胁迫抗性

生物胁迫由病原体引起和诱导。

农艺经济重要的一大类植物病原体是真菌。真菌引起可能导致多种植物物种的作物损失巨大的毁灭性流行病。作物植物的真菌性感染已经反复地造成灾难性收获失败，所述收获失败在波及的国家中引起重大的经济和社会问题。在传染性作物植物疾病的致病物质当中，植物致病性真菌占据主导地位。这种潜在的严重作物流行病至今仍持续存在。除了引起粮食短缺外，植物的真菌性感染还可以通过毒素的毒害作用直接影响人和家畜的健康。引起植物疾病的真菌类别是根肿菌纲(Plasmodiophoromycetes)、壶菌纲(Chytridiomycetes)、接合菌纲(Zygomycetes)、卵菌纲(Oomycetes)、子囊菌纲(Ascomycetes)、担子菌纲(Basidiomycetes)和半知菌纲(Deuteromycetes)。此外，众多真菌物种可以作为食物的潜在污染物而重要。来自子囊纲真菌链格孢属(Alternaria)物种作为主要的植物病原体是已知的。至少20％的农业腐败病害由链格孢属物种引起。它们还是人类中的常见变应原，在室内生长并引起干草热或有时导致哮喘的超敏反应。在链格孢属(暗色孢科(Dematiaceae)、丝孢纲(Hyphomycetes)、半知菌类；界：真菌；门：子囊菌门(Ascomycota)；纲：真子囊菌纲(Euascomycetes)；目：格孢腔目(Pleosporales)；科：格孢腔菌科(Pleosporaceae)；属：链格孢属)是极常见和丰富的。链格孢属感染田间植物并可以污染小麦、高粱和大麦。链格孢属物种也感染多种水果和蔬菜并可以引起这些食物在冷藏贮存下的腐败。一般而言，链格孢属具有世界范围的地理分布。芸苔链格孢(A.brassicicola)在几乎每种重要的栽培芸苔属(Brassica)物种(包括青花菜、卷心菜、卡诺拉油菜和芥菜)中引起黑斑病(也称作暗色叶斑病(dark leafspot))。它具有世界范围的经济重要性，有时在作物如卡诺拉油菜、芥菜或油菜中导致20-50％的产量下降。链格孢(A.alternata)引起豌豆的叶和荚枯萎病、竹芋属某些物种(Calathea spp)的叶斑点病以及番茄和马铃薯晚疫病。暗色症状是病原体链格孢属物种的征兆，所述链格孢属物种具有暗色菌丝和携带分生孢子直链或支链的直立的分生孢子梗。种子、幼苗、叶和荚可以遭受损害。感染可以在种子播种于感染土壤中播种时发生，不过也可以在种子本身被感染时发生。因此，需要鉴定安全和有效的组合物和方法用于控制植物病原体、尤其是用于控制致病性真菌、特别是来自链格孢属的致病性真菌，和用于产生具有提高的植物病原体抗性的植物、尤其种子并且最终用于提高产量。

农艺经济重要的又一大类植物病原体是线虫。线虫是以超过2000种中耕作物、蔬菜、水果和观赏植物的根、叶和茎为食的显微镜可见的蠕虫样动物，引起世界范围内估计一千亿美元的作物损失。多种的寄生性线虫物种感染作物植物，包括根结线虫(RKN)、形成胞囊和形成损伤的线虫。根结线虫(RKN)，其特征是在摄食部位处引起根瘿形成，具有相对大的宿主范围并因而对为数甚多的作物物种有致病性。形成胞囊和形成损伤的线虫物种具有较有限的宿主范围，不过仍引起易感作物的严重损失。致病性线虫遍及全美国存在，在南部和西部的温暖、潮湿地区和在砂质土壤地区存在最大密度。大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)-大豆植物的最严重病虫-在1954年首次于南卡莱罗纳州发现。一些地区遭受如此严重的大豆胞囊线虫(SCN)侵染，以至于若不采用控制措施，则大豆生产在经济上不再可能。尽管大豆是受SCN侵袭的主要经济作物，然而SCN寄生总计约50种宿主，包括田地作物、蔬菜、观赏植物和杂草。线虫损伤的迹象包括叶矮化与黄化和在炎热时节期间植物萎蔫。但是，线虫侵染可以引起严重产量损失，而无任何明显的地上部分疾病症状。产量降低的主要原因归咎于地下部分根损伤。受SCN感染的根矮缩或矮化。线虫侵染也可以减少根上固氮根瘤的数目，并且可以使根更易感其他土源性植物病原体侵袭。线虫的生活周期具有3个主要阶段：卵、幼虫和成虫。在线虫的种之间生活周期是变化的。例如在最适的条件下，SCN的生活周期通常可以在24至30日内完成，而其他物种可能花费长达一年或更长的时间完成生活周期。当温度和湿度水平在春季变得适宜时，蠕虫形状的幼体从土壤中的卵孵化出来。仅处于幼体发育阶段的线虫能够感染大豆根。SCN的生活周期已经成为众多研究的主题，并且因此是理解线虫生活周期的有用例子。穿透大豆根后，SCN幼虫移动穿过根直到它们接触维管组织，此时SCN幼虫停止移行并开始摄食。借助口针，线虫注射出调节某些根细胞并使这些根细胞转化成特化摄食部位的分泌物。这些根细胞在形态学上转化成大的多核合胞体(或在RKN例子中的巨大细胞)，这些合胞体被用作线虫的营养物源。活跃摄食的线虫因此从植物偷取必需的营养物，导致产量损失。当雌性线虫摄食时，它们变胖并逐渐变得如此庞大，以至它们的身体突破根组织并暴露于根的表面。在一段时间摄食后，雄性SCN线虫(其作为成虫不变胖)移出根，进入土壤中并使膨大的雌性成虫受精。雄性线虫随后死亡，而雌性线虫仍附着于根系统并继续摄食。膨大雌性线虫中的卵开始发育，最初在身体外的团块或卵囊中并稍后在线虫体腔内部发育。雌性成虫的整个体腔逐渐被卵充满，并且雌线虫死亡。正是充满卵的死亡雌线虫身体才称作胞囊。胞囊逐渐释放并游离存在于土壤中。胞囊的璧变得极坚韧，从而为胞囊内部所含的大约200至400粒卵提供优异的保护。SCN卵在胞囊内存活直至出现适宜的孵化条件。尽管众多的卵可以在第一年中孵化，然而众多卵也会在保护性胞囊内部存活几年。线虫可以依赖其自身力量每年在土壤中移动仅若干英寸。但是，线虫侵染可以以多种方式传播相当大的距离。可以移动受侵染土壤的任何事物能够传播这种侵染，包括农场机械、交通工具和用具、风、水、动物和农场工作者。种子大小的土壤颗粒经常污染收获的种子。结果是，在非侵染田地中播种来自受侵染田地的污染种子时，可以传播线虫侵染。甚至有证据表明某些线虫物种能够通过鸟传播。这些起因中仅有一些可以预防。管理线虫侵染的常规实践包括：在线虫侵染的土地中保持合理的土壤养分和土壤pH水平；控制其他植物疾病以及昆虫与杂草病害；使用环境卫生实践，如仅在操作了非侵染田地工作后才翻耕、播种和中耕受线虫侵染的田地；在受侵染田地中工作后用高压水或蒸汽彻底清洁设备；不使用在受侵染田地上培育的种子播种非侵染田地，除非该种子已经被恰当地清洁过；轮作受侵染田地并且用非宿主作物替换宿主作物；使用杀线虫剂；和播种抗性植物品种。已经提出了用于遗传地转化植物旨在赋予提高的植物寄生线虫抗性的方法。美国专利号5,589,622和5,824,876涉及鉴定线虫附着后在植物摄食部位内部或其附近特异性表达的植物基因。但是，这些专利没有提供用于赋予线虫感染抗性的任何特定线虫基因。即便在植物生物技术的某些领域中取得若干项进展，然而在植物中取得病原体抗性方面的成功还是很有限的。因病原体所致、尤其因线虫侵袭引起的产量损失是个严重问题。减少线虫侵染的现有操作主要限于高强度地施加杀线虫剂。因此，需要鉴定安全和有效的组合物和方法用于控制植物病原体、尤其线虫，和用于产生具有提高的植物病原体抗性的植物、并且最终用于提高产量。

本发明满足了对这样的植物的需求，所述植物与相应的非转化野生型对照相比较而言抵抗植物疾病、优选地抵抗致病性真菌和/或线虫，并且与此同时显示提高的产量。本发明的转基因植物包含在所述植物中表达时赋予提高的病原体抗性表型的微生物基因和它们的同源物。

因此，在第一实施方案中，本发明提供了用于产生与相应的非转化野生型对照相比较而言具有提高的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性的转基因植物细胞、植物或其部分的方法，其中所述方法包括步骤：a)向植物细胞导入编码来自酵母和/或埃希氏菌属的“疾病抗性赋予蛋白”DRCP的多核苷酸；(b)从该植物细胞产生表达所述多核苷酸的转基因植物。在一个实施方案中，本发明提供了用于产生与相应的非转化野生型对照相比较而言具有提高的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性的转基因植物细胞、植物或其部分的方法，其中所述方法包括过量表达编码DRCP的微生物基因。在一个实施方案中，本发明提供了用于产生与相应的非转化野生型对照相比较而言具有提高的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性的转基因植物细胞、植物或其部分的方法，其中所述方法包括过量表达编码DRCP的微生物基因的同源物。如本文中所用的术语“增加的表达”或“过量表达”意指相对于原有野生型表达水平为附加的任何形式的表达。

在本发明的一个实施方案中，所述的DRCP具有选自以下的活性：GTP酶、非必需的小GTP酶、转录调节物gabP 3’区、具有结合DNA的翼状螺旋结构域35的转录阻遏蛋白(GntR家族)和结合DNA的转录性双重调节蛋白。

在一个实施方案中，本发明提供了用于产生与相应的非转化野生型对照相比较而言具有提高的植物疾病抗性并最终具有提高的产量的转基因植物细胞、植物或其部分的方法。在一个实施方案中，本发明提供了用于产生与相应的非转化野生型对照相比较而言具有提高的胁迫抗性和/或耐受性的转基因植物细胞、植物或其部分的方法。在一个实施方案中，本发明提供了用于产生与相应的非转化野生型对照相比较而言具有、优选地在胁迫条件下具有提高的产量的转基因植物细胞、植物或其部分的方法。

在一个实施方案中，术语“提高的产量”指任何生物量提高。在一个实施方案中，提高的产量和/或增加的生物量生产包括更高的种子产量、更高的光合作用和/或更高的干物质生产。在本发明的一个实施方案中，术语“提高的产量”、“提高的生物量”或“提高的生物量生产”意指与相应的非转化野生型植物相比较而言，植物从第一胁迫条件开始表现提高的生长速率。提高的生长速率包括完整植物的生物量生产提高、植物可见部分(例如茎和叶和花)的生物量提高、可见的更高和更大的茎。在一个实施方案中，提高的产量和/或增加的生物量生产包括更高的种子产量、更高的光合作用和/或更高的干物质生产。

所述提高的产量根据本发明一般可以与非转化的初始或野生型植物相比较而言通过增强或改善植物的一种或多种产量相关性状实现。植物的此类产量相关性状包括但不限于植物固有生产能力的提高、改善的营养物使用效率和/或提高的胁迫耐受，其中所述产量相关性状的改善导致提高的产量。根据本发明，涉及植物固有生产能力提高的产量相关性状可以由改善特定(固有)的种子产量(例如就提高的种子/籽粒尺寸、提高的穗数、提高的每穗种子数、种子充实改善、种子组成的改善、胚和/或胚乳改善等而言)；植物内在生长和发育机制调节和改善(如植物高度、植物生长速率、荚果数、植株上的荚果位置、节间数、荚果开裂发生率、结瘤和固氮效率、碳同化效率、幼苗生长势/早期生长势的改善、增强的萌发效率(在受胁迫或不受胁迫的条件下)、植物构造的改善、细胞周期调节、光合作用调节、多种信号途径调节、对转录性调节的调节、对翻译性调节的调节、对酶活性的调节等)和/或其他等表现。根据本发明，涉及植物的营养物使用效率改善或提高的产量相关性状可以由改善植物营养物同化的总体效率(例如就改善总体营养物摄取和/或转运、改善植物的总体转运机制、同化途径改善等方面而言)和/或由改善特定营养物(包括但不限于磷、钾和氮)的使用效率表现。根据本发明，涉及植物胁迫耐受性改善或提高的产量相关性状可以由改善或提高植物对生物性和/或非生物性胁迫的耐受性表现。在本申请中，生物胁迫通常指包含，但不限于真菌疾病(包括卵菌纲真菌病)、病毒病、细菌病、昆虫侵染、线虫侵染等的植物病原体和植物疫病。在本申请中，非生物胁迫通常指植物一般遭遇的非生物性环境条件，包括一般称作“非生物胁迫”条件的条件，所述条件包括但不限于干旱(干旱耐受性可以因水使用效率改善而实现)、热、低温和寒冷条件(如冰冻和激冷条件)、盐度、渗透胁迫、荫蔽、高植物密度、机械胁迫、氧化胁迫等。

如本文中所用的术语“产量”通常指来自植物、尤其作物的可测量生产。产量和产量提高(与非转化的初始或野生型植物相比而言)可以用多种方式测量，并且应当理解技术人员将能够视具体实施方案、涉及的具体作物和涉及的具体目的或用途而采用正确的手段。在本文所述的本发明优选实施方案中，产量的提高指提高的生物量产量、提高的种子产量和/或关于完整植物或其部分或植物种子的一种或多种具体内容物的产量提高。在优选的实施方案中，“产量”指生物量产量，包含生物量干重产量和/或鲜重生物量产量，每种情况均就植物的地上部分和/或地下部分而言，这取决于具体环境(试验条件，具体目的作物、目的用途等)。在每种情况下，生物量产量可以基于鲜重、干重或含水量调节的基础或另一方面基于每株植物基础或相对于特定面积(例如每英亩/平方米/或其他等的生物量产量)进行计算。在其他的优选实施方案中，“产量”指可以通过一个或多个以下参数测量的种子产量：种子数或充实种子数(每株植物或每单位面积(英亩/平方米/或其他等))；种子充实率(充实种子数与种子总数之间的比率)；每株植物花数；种子生物量或总种子重量(每株植物或每单位面积(英亩/平方米/或其他等))；千粒核重(TKW；从计数的充实种子数和其总重量外推出来；TKW的提高可以由增加的种子尺寸、提高的种子重量、提高的胚尺寸和/或增加的胚乳引起)或允许测量种子产量的其他参数。种子产量可以基于干重或鲜重测定，或一般基于含水量调节的基础例如在15.5％含水量测定。在其他优选的实施方案中，产量指可收获产物的具体含量和/或组成，包括但不限于增强和/或改善的糖含量或糖组成、增强或改善的淀粉含量和/或淀粉组成、增强和/或改善的油含量和/或油组成(如增强的种子油含量)、增强和/或改善的蛋白质含量和/或蛋白质组成(如增强的种子蛋白含量)、增强和/或改善的维生素含量和/或维生素组成等。在根据本申请的一个优选手段中，如本文所述的“产量”也可以指植物的可收获产量，其在每个具体情况下主要取决于具体目的植物/作物以及其预期目的用途(如食物生产、饲料生产、加工食品产生、生物燃料、生物燃气或醇生产等)。因此，产量也可以计算为收获指数(表述为相应可收获部分的重量除以总生物量的比率)、每单位面积(英亩、平方米等)可收获部分的重量等。优选地，根据本发明的本文中所述植物的优选的增强或改善的产量特征可以在胁迫条件不存在或存在下实现。“产量”的意思因而主要取决于目的作物和预期用途，并且应当理解技术人员会在每个具体情况下从描述的上下文理解究竟为何意。

如本发明中所用，术语“胁迫”指任何次优生长条件并且包括生物性和非生物性胁迫。一般而言，术语“提高的胁迫耐受性”可以定义为在胁迫条件下，与非转化的野生型或起始植物相比而言植物存活和/或更高的产量产生。在文中引入作为参考的WO2004/092398中公开了本发明的转化细胞的非生物胁迫抗性和/或耐受性。

在一个实施方案中，术语“提高的产量”指在非生物胁迫条件下与相应的非转化野生型对照相比较而言提高的产量。提高的产量因与相应的非转化野生型对照相比较而言增强的非生物胁迫抗性和/或耐受性而实现。

非生物胁迫优选地包括与干旱、寒冷或盐度或其组合相关的次优条件。在优选的实施方案中，非生物胁迫是干旱和低水含量。其中干旱胁迫意指导致植物中水缺乏或对植物的水供应降低的任意环境胁迫。在本发明的一个实施方案中，术语“提高的非生物胁迫抗性”涉及提高的水胁迫抗性，其中所述的水胁迫作为继发胁迫而由寒冷和/或盐产生，和/或当然在干旱期间作为原发胁迫产生。

在一个实施方案中，提高的非生物胁迫抗性指干旱抗性。在本发明中，增强的干旱耐受性可以例如并且优选地根据以下方法确定：转化的植物在生长室(例如，York，曼海姆，德国)的花钵中培育。在植物是拟南芥的情况下，将土壤制备为土壤和石英砂4∶1(v/v)的混合物。标准生长条件是：16小时光照和8小时黑夜的光周期，20℃，60％相对湿度和150μE光子流密度。为诱导萌发，将播种的种子在4℃于黑暗中保持3日。每日给植物浇水直至它们大约3周龄，此时通过停水施加干旱。平行地，相对湿度每隔2日以10％减量降低至20％。在停水大约12日后，大部分植物显示损伤的视观症状，如萎蔫和叶褐变，而鉴定耐受植物为视观上饱满并在颜色上呈健康绿色。植物与近邻植物连续比较3日，就干旱损伤症状进行评分。可以进行连续3个实验。在第一实验中，对每个正在测试的基因播种10株独立T2品系。确定不显示视观损伤症状的植物百分比。在第二实验中，使第一实验中已经被评定为耐受的品系经受根据相同实验流程的验证筛选。在这个实验中，如前述培育并处理每个耐受品系的植物。在第三实验中，如前述培育并处理最为耐受的品系的至少7个复制物。在野生型对照已经视观死去后确定干旱存活的平均日数和最大日数。另外，使用Mini-PAM(Heinz Walz GmbH，Effeltrich，德国)获得受胁迫和不受胁迫的植物中的叶绿素荧光测量值。

在一个实施方案中，术语“提高的产量”指在生物胁迫条件下与相应的非转化野生型对照相比较而言提高的产量，例如提高的植物疾病抗性和/或耐受性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性和/或耐受性。提高的产量因与相应的非转化野生型对照相比较而言增强的生物胁迫抗性和/或耐受性而实现。

生物胁迫优选地包括与植物疾病相关的次优条件。生物胁迫抗性指与相应的非转化野生型对照相比较而言植物抵抗植物疾病。生物胁迫并且同时植物疾病由病原体引起，所述病原体包括昆虫、真菌、细菌、病毒、线虫、类病毒、支原体等，优选致病性真菌和/或线虫。“植物病原体”指在植物中引起疾病状态的任何病原体，包括病毒、真菌、细菌、线虫和其他微生物。生物胁迫抗性或“病原体抗性”指在病原体感染后植物的疾病症状减少或减弱。症状可以是多样的，但优选地包括对植物品质、产量、作为饲料或食物的适合性直接或间接地产生不利影响或造成作物播种、种植、收获或加工困难的那些症状。病原体引起的疾病症状包括植物组织上坏死或萎黄色损害、褐色损害(其常具有淡褐色至略带白色的中心，伴以深暗略带紫色至黑色的外边缘，逐步是环绕该损害的萎黄色区带)的大小和/或频度；溃烂病、黑斑病(也称作暗色叶斑病)、叶霜霉病等的大小和/或频度。

在一个实施方案中，提高的生物胁迫抗性指植物疾病抗性、优选地致病性真菌和/或线虫抗性。在本发明中，增强的致病性真菌耐受性可以例如并且优选地根据以下方法确定：转化的植物在生长室(例如，York，曼海姆，德国)的花钵中培育。在植物是拟南芥的情况下，使用营养丰富土壤(GS90，Tantau，Wansdorf，德国)。将花钵填满土壤并置于托盘中。向托盘添加水以使土壤吸收适宜量的水用于播种流程。转基因拟南芥C24植物的种子播种在花钵(直径10cm)中。随后，将装满的托盘用无孔的透明盖子盖住并转移到生长室的搁架系统中。每日对盖子和花钵喷水。在4℃黑暗中8小时，在20℃光照(220μmol/m2s)下16小时，相对湿度68％持续4日时间，建立层积催芽。4日后，将参数变成12小时光照和12小时黑暗并且撤除盖子。在转基因植物含有bar标记基因的情况下，在播种后第5、7、10和12日通过自顶部喷洒带小植物的花钵进行BASTA选择。因此，喷洒BASTA浓缩剂(183g/l草铵膦)在自来水中的0.02％(v/v)溶液。播种后，在工作日期间改变托盘在生长室内部的位置。从托盘上撤除盖子后，根据需要进行浇水。在播种后14日，将植物种植在具有GS90的另一个花钵中，1个花钵中5株植物并且每个品系3个花钵。可以在1个托盘中将4个品系和1野生型(在中央)安置在一起。托盘用盖子盖住并喷洒3日。阳性(敏感＝pad3-1-wt-F1-(1))和阴性(抗性＝Col-0-Lehle-F1-(1))对照可以位于一个额外托盘中。播种28日后，在植物与野生型对照不同的情况下，评价表型信息。播种31日后，在托盘中添加高度1cm的自来水。1日后，植物用真菌孢子混悬液、优选芸苔链格孢(Alternaria brassicicola)或链格孢(Alternaria alternate)(1.5x106个孢子/ml)孢子混悬液喷洒3次并再次盖住。每日用水喷洒盖子2次，持续2日。接种3和4日后，进行评价。疾病症状可以与未转化的野生型对照植物相比进行评分。评分范围可以是1与5之间。计数全部3个花钵的具有萎黄色区和组织mazaration的症状的叶子。植物表型(大小和株型)对最终评分有影响。

在一个实施方案中，提高的生物胁迫抗性指植物疾病抗性、优选地致病性真菌和/或线虫抗性。在本发明中，增强的线虫耐受性可以例如并且优选地根据以下方法确定：在植物是拟南芥的情况下，来自含有待测试微生物基因的所选C24拟南芥品系的种子包裹在滤纸袋子中并给予主观标示并且用于初级筛选。初级筛选由以下步骤组成：1)由氯气消毒，2)在选择培养基上培育；3)转移至测试平板；4)用定义量的J2幼虫接种测试平板中的幼苗；5)计数J4雌性线虫和胞囊和6)结果分析和7)选择先导品系。在含有Murashige Skoog培养基的培养皿上培育由对于微生物试验基因的表达分离的群体组成的消毒种子，所述培养基含有添加的适宜选择剂(草铵膦(Bayer Crop Science Kansas City，MO)、咪草烟(BASF Corporation，RTP，NC)或卡那霉素，取决于该拟南芥品系中存在的标记基因)。培养皿置于4℃持续72小时并随后转移至22℃生长室。10日后，基于大小和颜色选择幼苗。含有设计旨在表达微生物试验基因的转基因的各株幼苗是绿色的并具有充分伸展的子叶。选择这些个体转移至测试平板。从中选择的幼苗转移至含有用0.8％Daishin琼脂固化的0.2浓度Knop培养基的12孔测试平板(Sijmons等人1991)，并在24℃的生长室中以16小时光周期维持10日。对于每个接种组，使用含有对照的至少两个平板。转移的幼苗在相同条件下培育额外10日并随后用定义数目(90-100)的消毒甜菜胞囊线虫J2幼虫接种。接种的幼苗于生长室中维持额外28日。28日后，取出平板并在解剖镜下观察。计数成熟雌虫(J4雌虫和成年阶段胞囊)的数目并记录结果。可以赋予每株接种的籽苗1-5的根评分，以1为小且以5为大。另外，可以在接种当日和计数当日拍摄高分辨率图像。记录的结果可以使用SAS软件包(SAS，Cary，NC)进行统计分析。结果的分析揭示了以特定批次线虫接种的组内部具有较低(推定抗性品系)或较高(推定超高易感品系)雌虫数目的品系组。从用产生每株幼苗10只成熟雌虫平均值的线虫批次所接种的组中选出具有较低成熟雌虫数的品系。来自基于初级筛选所选出先导品系的种子包裹在滤纸袋子中并给予主观标示并且用于确证测定法(二次筛选)中。确证测定法由与上文相同的步骤组成，仅将不同之处描述如下。对于感染测定法，每个品系20株幼苗转移至含有Knop培养基的6孔平板旨在相对于12孔平板允许更大的根发育。每个平板可以含有来自一个品系的两株幼苗和两个对照。因此，每个平板含有两个试验品系并且全部复制物及给定品系的相应对照存在于10个平板上。幼苗以相对于第一次筛选的更大数目(250只)消毒J2幼虫接种。这些幼虫从体外根培养物产生，因此上文所述的消毒不是必需的。如先前例子中所述计数成熟雌虫并使用SAS软件包(SAS，Cary，NC)通过t检验分析数据。仅认为具有平均每孔至少20只J4雌虫的相应对照并以p＜0.05与对照平板显示25％差异的那些品系是经确证的先导品系。

在一个实施方案中，本发明提供了与相应的非转化野生型对照相比较而言具有广谱胁迫抗性的植物。在一个实施方案中，“广谱”抗性指针对至少两种、三种、四种或更多种胁迫条件的增强抗性。胁迫条件可以是非生物性和/或生物性胁迫。优选地，本发明的植物具有针对干旱、致病性真菌和线虫的提高抗性。在一个实施方案中，“广谱”抗性指针对不同病原体物种的至少两种、三种、四种或更多种病原体的增强抗性。优选地，所述病原体选自致病性真菌和线虫。

本发明的一个实施方案中，致病性真菌和与它们相关的疾病选自以下：根肿菌门(Plasmodiophoromycota)如芸苔根肿菌(PlasmodiophoraBrassicae)(十字花科植物的根肿病)、马铃薯粉痂菌(Spongosporasubterranea)(马铃薯块茎的粉痂病)、禾谷多粘菌(Polymyxa graminis)(禾谷类和牧草的根病)。卵菌门(Oomycota)如莴苣盘梗霉(Bremia lactucae)(莴苣霜霉病)、霜霉属(Peronospora)(如在金鱼草(snapdragon)(金鱼草霜霉(P.antirrhini))、洋葱(葱霜霉(P.destructor))、菠菜(散展霜霉(P.effusa))、大豆(东北霜霉(P.manchurica))、烟草(“青霉”；烟草霜霉(P.tabacina))、苜蓿和车轴草(车轴草霜霉(P.trifolium))、葎草假霜霉(Pseudoperonospora humuli)(蛇麻花霜霉病)中的霜霉病、单轴霉属(Plasmopara)(葡萄树的霜霉病)(葡萄生单轴霉(P.viticola))和向日葵(霍尔斯单轴霉(P.halstedii))、大孢指疫霉(Sclerophtohra macrospora)(禾谷类和牧草中的霜霉病)、腐霉属(Pythium)(全部类型植物的种子腐病、幼苗猝倒病和根腐病，例如由德巴利腐霉(P.debaryanum))引起的甜菜猝倒病)、致病疫霉(Phytophthorainfestans)(马铃薯的晚疫病、番茄的青枯病等)、白锈菌属(Albugo spec)(十字花科植物的白锈病)或大豆疫霉(Phytophthora sojae)。子囊菌门(Ascomycota)如白小羊蹄菌(Microdochium nivale)(黑麦和小麦的雪霉病)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)(主要在小麦中的部分穗不育)、尖镰孢(Fusariumoxysporum)(番茄的镰孢枯萎)、禾谷类白粉菌(Blumeria graminis)(大麦(大麦专化型(f.sp.hordei))和小麦(小麦专化型(f.sp.tritici)的白粉病)、豌豆白粉菌(Erysiphe pisi)(豌豆白粉病)、仁果癌丛赤壳菌(Nectria galligena)(果树的丛赤壳菌溃烂病)、葡萄钩丝壳(Uncinula necator)(葡萄树的白粉病)、维管束假盘菌(Pseudopeziza tracheiphila)(葡萄树的红热病)、麦角菌(Clavicepspurpurea)(例如黑麦和牧草的麦角症)、禾顶囊壳(Gaeumannomycesgraminis)(小麦、黑麦和其他牧草上的全蚀病)、灰色大角间座壳(Magnaporthe grisea)(稻瘟病)、麦类核腔菌(Pyrenophora graminea)(大麦叶纹病)、圆核腔菌(Pyrenophora teres)(大麦网斑病)、假麦草核腔菌(Pyrenophora tritici-repentis)(小麦叶枯病)、苹果黑星菌(Venturiainaequalis)(苹果斑点病)、核盘菌(Sclerotinia sclerotium)(茎断、茎腐)、苜蓿假盘菌(Pseudopeziza medicaginis)(苜蓿、白车轴草和红车轴草的叶斑病)或斐济球腔菌(Mycoshaerella fijiensis)(香蕉黑斑病)、腐病镰孢(Fusariumrots)(串珠镰孢(Fusarium moniliforme)和禾本科镰孢(F.graminearum)和炭疽茎腐病(Anthracnose stalk rot)(禾生炭疽菌(Colletotrichumgraminicola)、色二孢茎腐病(Diplodia stalk rot)(玉米色二孢(Diplodiamaydis))、茎炭腐病(charcoal stalk rot)(菜豆壳球孢(Maacrohominaphaseolina))。担子菌纲(Basidiomycetes)如肉孢核瑚菌(Typhula incarnata)(大麦、黑麦、小麦的核瑚菌枯萎病)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)(玉米的黑粉病)、裸黑粉菌(Ustilago nuda)(大麦的散黑穗病)、小麦黑粉菌(Ustilago tritici)(小麦、斯佩尔特小麦的散黑穗病)、燕麦散黑粉菌(Ustilago avenae)(燕麦的散黑穗病)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)(马铃薯的丝核菌根腐病)、轴黑粉菌属的某些物种(Sphacelotheca spp.)(高粱丝黑穗病)、亚麻栅锈菌(Melampsora lini)(亚麻锈病)、禾柄锈菌(Puccinia graminis)(小麦、大麦、黑麦、燕麦的茎锈病)、隐匿柄锈菌(Puccinia recondita)(小麦上的叶锈病)、散生柄锈菌(Puccinia dispersa)(黑麦的褐锈病)、大麦柄锈菌(Pucciniahordei)(大麦的叶锈病)、禾冠柄锈菌(Puccinia coronata)(燕麦的冠锈病)、条形柄锈菌(Puccinia striiformis)(小麦、大麦、黑麦和多种牧草的黄锈病)、疣顶单胞锈(Uromyces appendiculatus)(菜豆的褐锈病)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)(众多植物的根和茎腐病)或豆薯层锈菌(Phakopsorapachyrhizi)(大豆锈病)。半知菌纲(Deuteromycetes)(半知真菌)如小麦(小麦壳针孢(Septoriatritici))的颖枯壳针孢(颖斑枯病)、小麦基腐病菌(Pseudocercosporellaherpotrichoides)(小麦、大麦、黑麦的眼斑病)、黑麦喙孢(Rynchosporiumsecalis)(黑麦和大麦上的叶斑病)、茄链格孢(Alternaria solani)(马铃薯、番茄的早疫病)、甜菜茎点霉(Phoma betae)((甜菜的黑胫病)、甜菜生尾胞(Cercospora beticola)(甜菜的叶斑病)、芸苔链格孢(油菜籽油菜、卷心菜和其他十字花科植物的黑斑病)、链格孢(链格孢叶斑病；烟草褐腐病；苹果心腐病；番茄果腐病；菜豆叶枯病；苹果贮存腐病；梨贮存腐病)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)(黄萎病(verticillium wilt))、豆刺盘孢(Colletotrichum lindemuthianum)(菜豆炭疽病)、黑胫茎点霉(Phomalingam)(卷心菜和油菜的黑胫病)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)(葡萄树、草莓、番茄、蛇麻花等的灰霉病)。更优选的是致病疫霉(马铃薯的晚疫病、番茄的青枯病等)、雪腐微结节菌(先前为雪霉镰孢，黑麦和小麦的雪霉病)、禾本科镰孢、大刀镰孢(小麦中部分穗的不育性)、尖镰孢(番茄枯萎病)、禾谷类白粉菌(大麦(大麦专化型)和小麦(小麦专化型)的白粉病)、灰色大角间座壳(稻瘟病)、核盘菌(菌核病、茎腐病)、小麦(小麦壳针孢)的颖枯壳针孢(颖斑枯病)、芸苔链格孢(油菜籽油菜、卷心菜和其他十字花科植物的黑斑病)、黑胫茎点霉(卷心菜和油菜籽油菜的黑胫病)、链格孢(链格孢叶斑病；烟草褐腐病；苹果心腐病；番茄果腐病；菜豆叶枯病；苹果贮存腐病；梨贮存腐病)。最优选的是芸苔链格孢和链格孢。

在本发明的一个实施方案中，致病性线虫和相应的受威胁作物植物列于《美国植物病索引》(1960年美国农业部手册第165号)(Indexof Plant Diseases in the United States(U.S.Dept.of Agriculture HandbookNo.165，1960)；《北美植物中植物寄生性线虫物种分布》(Distribution ofPlant-Parasitic Nematode Species in North America)(1985年美国线虫学家协会)和《美国植物及植物产品中的真菌》(Fungi on Plants and PlantProducts in the United States)(美国植物病理学协会，1989年)中。例如，被本发明靶向的植物寄生性线虫包括但不限于胞囊线虫和根结线虫。被本发明靶向的具体植物寄生性线虫包括但不限于，大豆胞囊线虫、甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)、燕麦胞囊线虫(Heterodera avenae)、水稻胞囊线虫(Heterodera oryzae)、木豆胞囊线虫(Heterodera cajani)、三叶草胞囊线虫(Heterodera trifolii)、马铃薯白线虫(Globodera pallida)、马铃薯金线虫(G.rostochiensis)、或烟草球胞囊线虫(Globodera tabacum)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、北方根结线虫(M.hapla)、爪哇根结线虫(M.javanica)、纳西根结线虫(M.naasi)、短小根结线虫(M.exigua)、鳞球茎茎线虫(Ditylenchusdipsaci)、水稻茎线虫(Ditylenchus angustus)、香蕉穿孔线虫(Radopholussimilis)、柑橘穿孔线虫(Radopholus citrophilus)、多带螺旋线虫(Helicotylenchus multicinctus)、咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)、最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus)、伤残短体线虫(Pratylenchusvulnus)、弯曲针线虫(Paratylenchus curvitatus)、玉米针线虫(Paratylenchus zeae)、肾形线虫(Rotylenchulus reniformis)、银链花类毛刺线虫(Paratrichodorus anemones)、较小类毛刺线虫(Paratrichodorus minor)、Paratrichodorus christiei、小麦粒线虫(Anguina tritici)、Bidera avenae、根瘤亚粒线虫(Subanguina radicicola)、塞恩斯特纽带线虫(Hoplolaimus seinhorsti)、哥伦比亚纽带线虫(Hoplolaimus Columbus)、帽状纽带线虫(Hoplolaimus galeatus)，柑橘半穿刺线虫(Tylenchulus semipenetrans)、蚤缀鞘线虫(Hemicycliophoraarenaria)、椰子红环腐线虫(Rhadinaphelenchus cocophilus)、长尾刺线虫(Belonolaimus longicaudatus)、原始毛刺线虫(Trichodorus primitivus)、异常珍珠线虫(Nacobbus aberrans)、水稻干尖线虫(Aphelenchoidesbesseyi)、卡纳西拟鞘线虫(Hemicriconemoides kanayaensis)、克莱顿矮化线虫(Tylenchorhynchus claytoni)、美洲剑线虫(Xiphinemaamericanum)、有害坏死线虫(Cacopaurus pestsi)等。

在一个实施方案中，本发明部分地满足了鉴定独特的新基因的需要，其中在内源基因和/或外源基因表达或过量表达时，所述基因能够赋予与相应的非转化野生型对照相比较而言提高的胁迫抗性、优选植物疾病抗性、优选地致病性真菌和/或线虫抗性。

因此，本发明涉及用于产生与相应的非转化野生型对照相比较而言具有提高的胁迫抗性的转基因植物细胞、植物或其部分的方法，所述胁迫抗性优选地针对植物疾病，优选针对致病性真菌和/或线虫，所述方法包括：(a)在植物细胞、植物或其部分中提高或产生选自由以下的一种或多种活性：GTP酶、非必需的小GTP酶、转录调节物gabP 3’区、具有结合DNA的翼状螺旋结构域35的转录阻遏蛋白(GntR家族)和结合DNA的转录性双重调节蛋白；和(b)在下述条件下培育该植物细胞、植物或其部分，所述条件允许与相应的非转化野生型植物相比而言具有提高的胁迫抗性的植物发育，所述胁迫抗性优选地针对植物疾病，优选针对致病性真菌和/或线虫。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于产生与相应的非转化野生型对照相比较而言具有提高的胁迫抗性的转基因植物细胞、植物或其部分的方法，所述胁迫抗性优选地针对植物疾病，优选针对致病性真菌和/或线虫，所述方法包括提高或产生选自以下的多肽的一种或多种活性：(i)分别包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述的多肽、共有序列或至少一个多肽基序的多肽；或(ii)包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子的表达产物，(iii)或者(i)或(ii)的功能等同物。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于产生与相应的非转化野生型对照相比较而言具有提高的胁迫抗性的转基因植物细胞、植物或其部分的方法，所述胁迫抗性优选地针对植物疾病，优选针对致病性真菌和/或线虫，所述方法包括提高或产生至少一种核酸分子的表达，所述核酸分子包含选自以下的核酸分子：(a)编码表II第5列或第7列中所示多肽的核酸分子；(b)表I第5列或第7列中所示的核酸分子；(c)核酸分子，其能够因遗传密码的简并性从表II第5列或第7列中所述的多肽序列衍生并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；(d)核酸分子，其与包含在表I第5列或第7列中所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％同一性并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；(e)核酸分子，其编码多肽并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性，其中所述多肽与由(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性并具有由包含如表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子编码的多肽的活性；(f)核酸分子，其与(a)至(c)的核酸分子在严格杂交条件下杂交并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；g)编码多肽并具有由包含如表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性的核酸分子，其中所述多肽能够借助针对由(a)至(e)的核酸分子之一编码的多肽所制备的单克隆或多克隆抗体分离；h)编码多肽的核酸分子，其中所述多肽包含如表IV第7列中所示的共有序列或一个或多个多肽基序并且优选地具有由包含如表II或表IV的第5列中所述多肽的多肽所代表的活性；(i)核酸分子，其编码具有如表II第5列中描述的蛋白质所代表活性的多肽并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；(j)核酸分子，其包含通过使用表III第7列中的引物扩增cDNA文库或基因组文库所获得的多核苷酸并且优选地具有由包含如表II或表IV的第5列中所述多肽的多肽代表的活性；和(k)通过用包含核酸分子(a)或(b)的互补序列的探针或用其片段在严格杂交条件下筛选合适的核酸文库能够获得的核酸分子，其中所述的片段具有与在(a)至(e)中表征并编码下述多肽的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选地至少20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，所述多肽具有由包含如表II第5列中所示多肽的蛋白质代表的活性。

除非另外说明，本文中所用的术语将根据分子生物学领域技术人员常规用法进行理解。除了下文所提供术语的定义之外，分子生物学领域中常见术语的定义也可以在Rieger等人，1991 Glossary of genetics：classical and molecular，5版，柏林：Springer-Verlag；以及在CurrentProtocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人编辑，Greene PublishingAssociates，Inc与John Wiley&Sons，Inc.之间的合资公司CurrentProtocols(1998Supplement)中找到。在本申请书的全文范围内，参考了多种出版物。全部这些出版物及在这些出版物中引用的那些参考文献的公开因而以全文并入本申请作为参考，以更充分地描述本发明所属领域的状态。在Sambrook和Russell，2001Molecular Cloning，3版，Cold Spring Harbor，Plainview，New York；Sambrook等人，1989Molecular Cloning，2版，Cold Spring HarborLaboratory，Plainview，New York；Maniatis等人，1982Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，New York；Wu(编著)1993Meth.Enzymol.218，第I部份；Wu(编著)1979Meth Enzymol.68；Wu等人，(编著)1983Meth.Enzymol.100和101；Grossman和Moldave(编著)1980Meth.Enzymol.65；Miller(编著)1972Experiments in MolecularGenetics，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork；Old and Primrose，1981 Principles of Gene Manipulation，Universityof California Press，Berkeley；Schleif和Wensink，1982Practical Methodsin Molecular Biology；Glover(编著)1985 DNA Cloning V第I和II卷，IRLPress，Oxford，UK；Hames和Higgins(编著)1985Nucleic AcidHybridization，IRL Press，Oxford，UK；以及Setlow和Hollaender 1979Genetic Engineering：Principles和Methods，第1-4卷，Plenum Press，NewYork中描述了众多标准分子生物学技术。

如在本文及所附权利要求书中所用，单数“一个”、“一种”和“该”包括复数称谓，除非上下文另外清楚地指出。如本文中所用，词汇“或”意指一个具体名单的任一成员并且还包括该名单成员的任意组合。如本文中所用的术语“细胞”或“植物细胞”指单个细胞，并且也包括细胞群体。该群体可以是包含一个细胞类型的纯粹群体。同样，该群体可以包含多于一个细胞类型。属于本发明含义范围内的植物细胞可以是分离的(例如在悬浮培养物中)或包含于植物组织、植物器官或处于任何发育期的植物中。就植物(或“植物组织”)而言，术语“组织”意指包括植物的分化和未分化细胞在内的多个植物细胞的排列。植物组织可以构成植物器官的部分(例如，植物叶的表皮)，不过也可以构成肿瘤组织(例如，愈伤组织)和多种类型的培养细胞(例如，单个细胞、原生质体、胚、愈伤组织、原球茎样体(protocorm-like body)等)。植物组织可以在植物原位、在器官培养物、组织培养物或细胞培养物中。就植物(或“植物器官”)而言，术语“器官”意指植物的部分并可以包括但不限于，例如根、果实、小苗、茎、叶、下胚轴、子叶、花药、萼片、花瓣、花粉、种子等。根据上下文，如本文中所用的术语“植物”可以理解为意指完整植物、植物细胞、植物器官、植物种子和其子代。词语“植物”也指任意植物，特别指种子植物，并且可以包括但不限于作物植物。植物部分包括但不限于茎、根、小苗、果实、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉、小孢子、下胚轴、子叶、花药、萼片、花瓣、花粉、种子等。如本文中所用的术语“植物”可以是单子叶作物植物，如例如谷物，包括小麦、大麦、高粱(sorghum)、黑麦、小黑麦(triticale)、玉米、稻、甘蔗，和树，包括苹果树、桃树、柑桔树(quince)、李树(plum)、樱桃树(cherry)、梨树(peach)、油桃树(nectarine)、杏树(apricot)、木瓜(papaya)、芒果(mango)、杨树(poplar)、松(pine)、红杉(sequoia)、雪松(cedar)、栎树(oak)。如本文中所用的术语“植物”可以是双子叶作物植物，如豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、旱芹、番茄、马铃薯、棉属植物、烟草、辣椒、卡诺拉油菜、油菜籽油菜、甜菜、卷心菜、花椰菜、青花椰菜(broccoli)、莴苣和拟南芥。可以用于本发明方法中的植物类别总体上如适用于转化技术的高等和低等植物那么广泛，所述植物包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物、木贼属(horsetail)、裸蕨类植物(psilophyte)、苔藓类植物和多细胞藻类。所述植物可以源于选自苜蓿属(Medicago)、茄属(Solanum)、芸苔属((Brassica))、黄瓜属(Cucumis)、茄属(Solanum)、胡桃属(Juglans)、锦葵属(Gossypium)、苹果属(Malus)、葡萄属(Vitis)、金鱼草属(Antirrhinum)、杨属(Populus)、草莓属(Fragaria)、拟南芥属(Arabidopsis)、云杉属(Picea)、辣椒属(Capsicum)、藜属(Chenopodium)、菊属(Dendranthema)、牵牛属(Pharbitis)、松属(Pinus)、豌豆属(Pisum)、稻属(Oryza)、玉米属(Zea)、小麦属(Triticum)、黑小麦属(Triticale)、黑麦属(Secale)、黑麦草属(Lolium)、大麦属(Hordeum)、大豆属(Glycine)、黄杉属(Pseudotsuga)、伽蓝菜属(Kalanchoe)、甜菜属(Beta)、向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、甜瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、车轴草属(trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑橘属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、烟草属(Nicotiana)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、Majorana、菊芋属(Ciahorium)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、萱草属(Heterocallis)、水仙属(Nemesis)、天竺葵属(Pelargonium)、稷属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛莨属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、喇叭舌属(Salpiglossis)、紫水晶属(Browaalia)、菜豆属(Phaseolus)、燕麦属(Avena)和葱属(Allium)组成的组中的属。

如本文中所用的术语“转基因”意指含有转基因或者其基因组已经因导入至少一个转基因而改变或者已经并入外源基因或多核苷酸的细胞和/或植物。转基因细胞、组织、器官和植物可以通过几种方法产生，包括通过人类干预如通过本文描述的方法将包含多核苷酸(通常是DNA)的“转基因”导入靶细胞或将转基因整合到靶细胞的染色体中。

如本文中所用的术语“野生型”指未经基因修饰过或未经实验意义上处理的植物细胞、种子、植物组分、植物组织、植物器官或完整植物。如本文中所用的术语“对照植物”指用于针对转基因的或基因修饰的植物进行比较的植物细胞、外植体、种子、植物组分、植物组织、植物器官或完整植物，目的在于鉴定转基因的或基因修饰的植物中增强的表型或所希望的特性。“对照植物”可以在一些情况下是下述转基因植物品系，所述转基因植物品系包含空载体或标记基因但不含有在正进行评价的转基因的或基因修饰的植物中存在的重组目的多核苷酸。对照植物可以与正在测试的转基因的或基因修饰的植物是相同品系或品种的植物，或它可以是另外的品系或品种，如已知具有特定表型、特征或已知基因型的植物。合适的对照植物包括用来产生本文中转基因植物的亲本品系的遗传上未改变或非转基因的植物。本发明的术语“非转化的野生型对照”是通过本发明方法进行了基因修饰或处理的野生型，从而它可以用作本发明植物细胞的对照。如本文中所用的术语“合胞体部位”指线虫侵染染后在植物根中形成的摄食部位。该部位用作线虫的营养物源。合胞体是胞囊线虫的摄食部位而巨大细胞是根结线虫的摄食部位。

根据本发明，植物可以是选自由单子叶植物和双子叶植物组成的组中的植物。该植物可以源于选自由玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱、香蕉和黑麦草组成的组中的属。该植物可以源于选自由豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、旱芹、番茄、马铃薯、棉属植物、烟草、辣椒、卡诺拉油菜、油菜籽油菜、甜菜、卷心菜、花椰菜、青花椰菜、莴苣和拟南芥组成的组中的属。

本发明也提供了对上文所述多核苷酸而言是纯合的转基因种子、来自上文所述转基因植物的部分、和来自这种植物的子代植物，包括杂交体和近交系。本发明也提供了植物育种的方法，如旨在开发或繁殖杂交的转基因植物。该方法包括将包含本发明的特定表达载体的转基因植物与其自身或与第二种植物杂交，其中所述第二种植物例如是缺乏该特定表达载体的植物，并且收获杂交植物的所得种子，从而收获的种子包含该特定表达载体。然后种植该种子以获得杂交的转基因子代植物。该植物可以是单子叶植物或双子叶植物。杂交的转基因子代植物可以具有通过母本或通过父本遗传的特定表达载体。所述第二种植物可以是近交系植物。杂交的转基因植物可以是近交系或杂交体。在本发明中也包括这些杂交的转基因植物或其子代中任一者的种子。

本发明的另一个实施方案涉及包含有效连接至上述一个或多个多核苷酸的一个或多个转录调节元件的表达载体，其中所述多核苷酸的表达赋予转基因植物提高的病原体抗性。在一个实施方案中，该转录调节元件是能够调节有效连接的多核苷酸组成型表达的启动子。“组成型启动子”指能够在全部或几乎全部植物组织中于植物的全部或几乎全部发育阶段期间表达受控制的可读框或调节元件的启动子。组成型启动子包括但不限于来自植物病毒的35S CaMV启动子(Franck等人，1980 Cell 21：285-294)、Nos启动子(An G.等人，The Plant Cell 3：225-233，1990)、遍在蛋白启动子(Christensen等人，Plant Mol.Biol.12：619-632(1992)和18：581-8(1991))、MAS启动子(Velten等人，EMBO J.3：2723-30(1984))、玉米H3组蛋白启动子(Lepetit等人，Mol Gen.Genet 231：276-85(1992))、ALS启动子(WO96/30530)、19S CaMV启动子(US 5,352,605)、超启动子(US5,955,646)、玄参花叶病毒(figwort mosaic virus)启动子(US 6,051,753)、稻肌动蛋白启动子(US 5,641,876)、和核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基启动子(US 4,962,028)。根据本发明，该转录调节元件可以是可调节型启动子。“可调节型启动子”指不以组成型方式指导而以时间和/或空间方式指导基因表达的启动子，并且包括组织特异性启动子和诱导型启动子。不同的启动子可以指导基因或调节元件在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或应答于不同的环境条件表达。“组织特异性启动子”或“组织优选的启动子”指不在全部植物细胞内而仅在特定器官(如叶或种子)、特定组织(如胚或子叶)的一个或多个细胞类型中或在特定细胞类型(如叶薄壁组织或种子贮藏细胞)中表达的可调节型启动子。这些启动子包括时间上如在早期或晚期胚发生中、在发育的种子或果实中的果实成熟期间、在充分分化的叶中、或在顺序的起始处受调节的启动子。合适的启动子包括包括来自油菜籽的油菜籽蛋白基因启动子(美国专利号5,608,152)、来自蚕豆(Vicia faba)的USP启动子(Baeumlein等，1991，Mol.Gen.Genet.225(3)：459-67)、来自拟南芥属的油质蛋白启动子(WO98/45461)、来自菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白启动子(美国专利号5,504,200)、来自芸苔属的Bce4启动子(WO91/13980)或豆科植物B4启动子(LeB4；Baeumlein等，1992，Plant Journal，2(2)：233-9)以及在单子叶植物如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等中引起种子特异性表达的启动子。需注意的合适启动子是来自大麦的Ipt2或Ipt1-基因启动子(WO95/15389和WO95/23230)或在WO99/16890中描述的那些启动子(来自大麦的大麦醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的谷醇溶蛋白基因、小麦的麦醇溶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高梁kasirin基因和黑麦的黑麦碱基因的启动子)。适用于在植物根组织中优选表达的启动子包括例如源自谷物烟酰胺合酶基因的启动子(US 20030131377)和稻RCC3启动子(US 11/075,113)。在植物绿色组织中优选表达的合适启动子包括来自如玉米醛缩酶基因FDA的启动子(US 20040216189)、醛缩酶和丙酮酸正磷酸盐双激酶(PPDK)基因的启动子(Taniguchi等人，Plant Cell Physiol.41(1)：42-48，2000)。“诱导型启动子”指可以通过外部刺激物在一个或多个细胞类型中开启的那些可调节型启动子，其中所述外部刺激物例如是化学品、光、激素、胁迫或病原体如线虫。如果想让基因表达以时间特异性方式出现，则化学诱导型启动子是尤其适合的。此类启动子的例子是水杨酸诱导型启动子(WO95/19443)、四环素诱导型启动子(Gatz等，1992，Plant J.2：397-404)、来自核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚单位(ssRUBISCO)的光诱导型启动子和乙醇诱导型启动子(WO93/21334)。另外，应答于生物性或非生物性胁迫条件的合适启动子是那些启动子，如病原体诱导型PRP1基因启动子(Ward等人，1993 Plant.Mol.Biol.22：361-366)、来自番茄的热诱导型hsp80启动子(US 5187267)、来自马铃薯的冷诱导型α-淀粉酶启动子(WO96/12814)、玉米的干旱诱导型启动子(Busk等人，Plant J.11：1285-1295，1997)、来自马铃薯的冷、干旱和高盐诱导型启动子(Kirch，Plant Mol.Biol.33：897-909，1997)或来自拟南芥属的RD29A启动子(Yamaguchi-Shinozalei等人，Mol.Gen.Genet.236：331-340，1993)、许多冷诱导型启动子如来自拟南芥属的cor15a启动子(Genbank登录号U01377)、来自大麦的blt101和blt4.8(Genbank登录号AJ310994和U63993)、来自小麦的wcs120(Genbank登录号AF031235)、来自谷物的mlip15(Genbank登录号D26563)、来自芸苔属的bn115(Genbank登录号U01377)、和创伤诱导型pinII启动子(欧洲专利第375091号)。在本发明中特别有意义的是合胞体部位优选的启动子或线虫摄食部位诱导型启动子，所述启动子包括但不限于以下启动子：在PCT/EP2008/051328中公开的Mtn3-样启动子、在PCT/EP2007/051378中公开的Mtn21-样启动子、在PCT/EP2007/064356中公开的过氧化物酶样启动子、在PCT/EP2007/063761中公开的海藻糖-6-磷酸磷酸酶样启动子和在PCT/EP2008/051329中公开的At5g12170-样启动子，前述全部申请书通过参考的方式并入本文。

本发明的又一个实施方案涉及产生包含多核苷酸的转基因植物的方法，其中该方法包括步骤：1)将包含上述多核苷酸的表达载体导入植物，其中该多核苷酸的表达赋予此植物提高的病原体抗性；和2)对转基因植物选择提高的病原体抗性。

已知用于将多核苷酸导入植物基因组和用于从植物组织或植物细胞再生植物的多种方法，所述方法在例如Plant Molecular Biologyand Biotechnology(CRC出版社，Boca Raton，Florida))，第6/7章，第71-119页(1993)；White FF(1993)Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和Wu R编著，Academic Press，15-38；Jenes B等人，(1993)Techniques for GeneTransfer：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和R.Wu编著，Academic Press，第128-143页；Potrykus(1991)Annu RevPlant Physiol Plant Molec Biol 42：205-225；Halford NG，Shewry PR(2000)Br Med Bull 56(1)：62-73中。转化方法可以包括直接和间接转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导的转化(US 4,536,475)、使用基因枪的生物弹射击法(Fromm ME等人，(1990)Bio/Technology.8(9)：833-9；Gordon-Kamm等人，(1990)Plant Cell 2：603)、电穿孔法、在包含DNA的溶液中孵育干燥胚、和显微注射。在这些直接转化法的情况下，所用的质粒不需要满足任何特殊要求。可以使用简单的质粒，如pUC系列、pBR322、M13mp系列、pACYC184等那些质粒。如果欲从转化的细胞再生完整的植物，则优选地在质粒上存在额外的选择标记基因。直接转化技术同样地适用于双子叶植物与单子叶植物。也可以借助农杆菌(Agrobacterium)通过细菌感染(例如EP 0116718)、借助病毒载体通过病毒感染(EP 0067553；US 4,407,956；WO95/34668；WO93/03161)或借助花粉(EP 0270356；WO85/01856；US4,684,611)实施转化。基于农杆菌的转化技术(尤其对于双子叶植物)在本领域是熟知的。农杆菌菌株(例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes))包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，其在用农杆菌感染植物后转移至该植物。T-DNA(转移的DNA)整合入植物细胞的基因组。该T-DNA可以位于Ri-或Ti-质粒上或分别地包含在所谓双元载体中。用于农杆菌介导转化的方法例如在Horsch RB等人(1985)Science 225：1229中描述。农杆菌介导的转化最适用于双子叶植物，但也已经应用于单子叶植物。在例如White FF，Vectors for Gene Transferin Higher Plants，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，第15-38页；Jenes B等人，Techniques for Gene Transfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，第128-143页；Potrykus (1991)Annu Rev Plant Physiol Plant MolecBiol 42：205-225中描述了通过农杆菌转化植物。转化可以导致瞬时的或稳定的转化和表达。虽然本发明的多核苷酸可以插入属于这些广泛类型范围内的任意植物和植物细胞中，然而它特别地用在作物植物细胞中。多种组织合适作为起始材料(外植体)用于农杆菌介导的转化方法，包括但不限于愈伤组织(US 5,591,616；EP-A1604662)、不成熟胚(EP-A1672752)、花粉(US 54,929,300)、苗端(US 5,164,310)或植物原位转化(US5,994,624)。本文所述的方法和材料可以与本领域已知的实际上全部农杆菌介导的转化方法组合。优选的组合包括但不限于以下起始材料和方法。

在一个实施方案中，本发明的核苷酸可以直接地转化至质体基因组中。质体表达利用了多于核表达基因的许多拷贝数来产生高表达水平，其中在质体表达中基因通过同源重组插入每一植物细胞中存在的几千个拷贝的环状质体基因组。在一个实施方案中，所述核苷酸插入靶向质体的载体，并转化到目的植物宿主的质体基因组中。获得了对含有所述核苷酸序列的质体基因组而言是同质的植物，并且它们优选地能够高表达所述核苷酸。质体转化技术例如深入地描述于美国专利号5,451,513、5,545,817、5,545,818和5,877,462、WO95/16783和WO97/32977、以及McBride等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，7301-7305中，所述文献均全文并入本文作为参考。用于质体转化的基本技术涉及将在选择标记侧翼的所克隆质体DNA的区域和核苷酸序列一起导入合适的靶组织，如使用生物弹射击法或原生质体转化(如氯化钙或PEG介导的转化)。称为靶向序列的1至1.5kb侧翼区促进与质体基因组的同源重组，并因此允许替换或改变质体基因组的特定区域。起初，使用叶绿体16S rRNA和rps12基因中赋予壮观霉素和/或链霉素抗性的点突变作为转化的选择标记(Svab等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，8526-8530；Staub等人，(1992)PlantCell 4，39-45)。克隆位点在这些标记之间的存在允许产生用于导入外源基因的质体靶向载体(Staub等人，(1993)EMBO J.12，601-606)。通过用显性选择标记-编码壮观霉素解毒酶即氨基糖苷-3’-腺嘌呤基转移酶的细菌aadA基因替换隐性rRNA或r-蛋白质抗生素抗性基因获得转化频率的实质提高(Svab等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sc.USA 90，913-917)。用于质体转化的其它选择标记是本领域已知的并包括在本发明的范围内。

本发明的转基因植物可以用于控制作物被植物病原体侵染的方法中，所述方法包括以下步骤：从包含下述表达构建体的种子培育出所述作物，其中所述表达构建体包含与编码对抗所述植物病原体的物质的一个或多个多核苷酸有效连接的转录调节元件，其中该表达载体稳定地整合到种子的基因组中。

在本说明书中使用时，包含/包含着(comprising)及其语法变化将用来说明存在所述特征、整数、步骤或组分或其组合，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤或组分或其组合。

根据本发明，如本文中所理解的术语“植物细胞”或术语“生物”总是涉及植物细胞或其细胞器，优选地是质体，更优选是叶绿体。如本文中所用，“植物”意图不仅包括完整植物，还包括其部分，即一个或多个细胞和组织，包括例如叶、茎、小苗、根、花、果实和种子。

出乎意料地，发现在植物如拟南芥中转基因地表达如表II第3列中所示酿酒酵母蛋白和/或转基因地表达如表II第3列中所示的大肠杆菌蛋白赋予转基因植物细胞、植物或其部分与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性。

因此，在一个实施方案中，在以下情况下，即提高或产生具有SEQ ID NO.：10的大肠杆菌多肽或包含SEQ ID NO.：10的多肽或由分别由SEQ ID NO：9的核酸分子或包含SEQ ID NO：9的核酸分子编码的多肽的活性，例如在植物细胞、植物或其部分中如果提高或产生下述多肽的活性，所述多肽包含如表I、II或IV的第7列与核酸分子SEQ ID NO.：9或多肽SEQ ID NO.：10相同的各自横行中所述的多肽或共有序列或多肽基序，或如果提高或产生“GTP酶”或“非必需的小GTP酶”的活性，则赋予与相应的非转化野生型对照、植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性。因此，在一个实施方案中，在以下情况下，即提高或产生具有SEQ IDNO.：51的酿酒酵母多肽或包含SEQ ID NO.：51的多肽或由分别由SEQID NO：50的核酸分子或包含SEQ ID NO：50的核酸分子编码的多肽的活性，例如在植物细胞、植物或其部分中如果提高或产生下述多肽的活性，所述多肽包含如表I、II或IV的第7列与核酸分子SEQ ID NO.：50或多肽SEQ ID NO.：51相同的各自横行中所述的多肽或共有序列或多肽基序，或如果提高或产生结合“具有结合DNA的翼状螺旋结构域35的转录阻遏蛋白(GntR家族)”、“结合DNA的转录性双重调节蛋白”或“转录调节物gabP 3’区”的活性，则赋予与相应的非转化野生型对照、植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性。

为了本发明的目的，复数一般意图包括单数并且反之亦然。除非另外说明，术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本上下文中可互换地使用。除非另外说明，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本上下文中可互换地使用。术语“序列”可以涉及多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白质，这取决于使用术语“序列”的上下文。如本文中使用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”指任意长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。所述术语仅指分子的一级结构。如本文中使用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”包括双链和单链DNA和/或RNA。它们也包括已知类型的修饰，例如甲基化、“帽化”、用类似物替换一个或多个天然存在的核苷酸。优选地，DNA序列或RNA序列包含编码本文中所定义多肽的编码序列。“编码序列”是转录成RNA(例如调节性RNA，如miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、RNAi、核酶等)或转录成mRNA的核苷酸序列，其中所述mRNA处于适宜的调节序列控制下时被翻译成多肽。该编码序列的边界由5’-末端处的翻译起始密码子和3’-末端处的翻译终止密码子决定。编码序列可以包括但不限于mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因组DNA，同时内含子也可以在某些情况下存在。如本上下文中所用，核酸分子也可以包含在编码基因区域的3’末端和在其5’末端处的非翻译序列，例如该编码区的5’末端上游序列的至少500个、优选200个、特别优选100个核苷酸和该编码基因区域的3’末端下游序列的至少100个、优选50个、特别优选20个核苷酸。例如在使用反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶等技术的情况下，可以有利地使用编码区以及5’-和/或3’-区域。但是，出于克隆和表达目的，往往更有利的是仅选择编码区。“多肽”指氨基酸的聚合物(氨基酸序列)并且不指分子的具体长度。因此，在多肽的定义中包括肽和寡肽。该术语也指或也包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。在该定义中包括例如这样的多肽，其含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)、具有取代键的多肽以及本领域已知的天然存在和非天然存在的其他修饰。在本说明书中使用的术语“表I”将用来说明表IA和表IB的内容。在本说明书中使用的术语“表II”将用来说明表IIA和表IIB的内容。在本说明书中使用的术语“表IA”将用来说明表IA的内容。在本说明书中使用的术语“表IB”将用来说明表IB的内容。在本说明书中使用的术语“表IIA”将用来说明表IIA的内容。在本说明书中使用的术语“表IIB”将用来说明表IIB的内容。在一个优选的实施方案中，术语“表I”意指表IB。在一个优选的实施方案中，术语“表II”意指表IIB。在本说明书中使用时，术语“包含”或“包含着(comprising)”及其语法变化将用来说明存在所述特征、整数、步骤或组分或其组合，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤或组分或其组合。

根据本发明，如果蛋白质或多肽的从头活性或其增加的表达直接或间接地导致和赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性并且该蛋白质具有如表II第3列中所示蛋白质的上文提及的活性，则该蛋白质或多肽具有“如表II第3列中所示蛋白质的活性”。在本说明书通篇范围内，这种蛋白质或多肽或编码这种蛋白质或多肽的核酸分子或核酸序列的活性或优选地生物学活性是相同或相似的，若它仍具有下述蛋白质的生物学活性或酶活性，其中所述蛋白质如表II第3列中显示或与如表II第3列中所示大肠杆菌蛋白或酿酒酵母蛋白相比较具有至少10％、优选至少20％、特别优选至少30％、最特别优选至少40％的初始生物学活性或酶活性。

术语“提高”、“升高”、“扩展”、“增强”、“改善”或“扩增”涉及一种属性在植物、生物、生物部分如组织、种子、根、叶、花等中或在细胞中的相应变化并且是可相互交换的。优选地，在这种情况下提高或增强容积中的总体活性，如果所述提高或增强涉及提高或增强基因产物的活性，无论是否提高或增强基因产物的数量或该基因产物的特定活性或这两者，或者无论是否提高或增强编码该基因产物的核酸序列或基因的数量、稳定性或翻译效能。术语“提高”涉及一种属性在生物中或在植物部分、生物部分如组织、种子、根、叶、花等中或在细胞中的相应变化。优选地，在这种情况下提高容积中的总体活性，如果所述提高涉及提高基因产物的活性，无论是否提高或产生基因产物的数量或该基因产物的特定活性或这两者，或者无论是否提高编码该基因产物的核酸序列或基因的数量、稳定性或翻译效能。在“属性的变化”中，应理解为相对于对照、参考或野生型的相应容积，基因产物的活性、表达水平或数量或代谢物含量在特定容积中改变，包括活性或表达的从头产生。术语“提高”包括所述属性仅在本发明主题物的部分中的变化，例如，修饰作用可以存在于细胞区室如细胞器中，或存在于植物部分如组织、种子、根、叶、花等中，但如果检验完整主题物即完整的细胞或植物，则是不可检测到的。因此，术语“提高”意指可以在特定容积中提高酶的比活性以及化合物或代谢物的量，例如本发明的多肽、核酸分子或编码性mRNA或DNA的量。

术语“野生型”、“对照”或“参考”是可互换的并且可以是这样的细胞，或生物的部分如细胞器(如叶绿体)或组织，或生物，尤其植物，其未经本文描述的本发明方法修饰或处理。因此，作为野生型、对照或参考使用的细胞，或生物的部分如细胞器(如叶绿体)或组织，或生物，尤其植物尽可能地与所述细胞、生物、植物或其部分对应，并且除了在本发明方法的结果方面之外，在任何其他属性方面尽可能地与本发明的主题物相同。因此，野生型、对照或参考以相同方式或以尽可能相同的方式进行处理，也就是说，仅不影响所检验属性之品质的条件或属性可能是不同的。优选地，在类似的条件下实施任何比较。术语“类似条件”意指全部条件例如培养或培育条件、土壤水含量、温度、湿度或周围的空气或土壤、测定条件(如缓冲液组成、温度、底物、病原株、浓度等)在待比较的实验之间保持一致。“参考”、“对照”或“野生型”优选是这样的主题物，例如细胞器、细胞、组织或生物，尤其植物，其未经本文中描述的本发明方法修饰或处理并且在任何其它属性上与本发明的主题物尽可能地相似。该参考、对照或野生型在其基因组、转录组、蛋白质组或代谢组方面与本发明的主题物尽可能地相似。优选地，术语“参考-”、“对照-”或“野生型-”的细胞器、-细胞、-组织或-生物，尤其植物，涉及这样的细胞器、细胞、组织或生物，尤其植物，其在遗传上与本发明的细胞器、细胞、组织或生物，尤其植物，或其部分几乎相同，优选95％，更优选98％、甚至更优选99.00％、尤其99.10％、99.30％、99.50％、99.70％、99.90％、99.99％、99.999％或更多地相同。最优选地，“参考”、“对照”或“野生型”是这样的主题物，例如细胞器、细胞、组织或生物，其中除了根据本发明方法修正、操纵、交换或导入引起或赋予活性的核酸分子或由它们所编码的基因产物以外，所述主题物在遗传上与根据本发明方法使用的生物、细胞或细胞器相同。

在下述情况下，即不能提供仅在本发明方法的主题方面不同于本发明主题的对照、参考或野生型时，对照、参考或野生型可以是这样的生物，在所述生物中已经调低或关闭了本发明核酸分子的表达而调节了活性，例如通过敲除根源性基因产物(responsible gene product)的表达(例如通过反义抑制作用)、通过使激活物或激动物失活、通过激活抑制物或拮抗物、通过添加抑制性抗体进行抑制，通过添加活性化合物如激素、通过导入负显性突变体等，其中所述活性引起与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性或引起如本文所述的本发明核酸分子表达。例如可以通过导入失活性点突变敲除基因产物，其中所述点突变导致酶活性抑制或去稳定化或抑制结合辅因子的能力等。

因此，优选的参考主题是本发明方法的起始主题。优选地，在标准化和归一化后，例如针对总RNA、总DNA或总蛋白的量或参考基因(如持家基因，如遍在蛋白、肌动蛋白基因或核糖体蛋白基因)的活性或表达进行标准化和归一化之后，比较本发明的参考和主题物。

提高或调节根据本发明可以是组成型的，例如原因在于稳定的持久转基因表达或在于编码本发明核酸分子的相应内源基因中的稳定突变或在于调节引起本发明多肽表达的基因的表达或行为特点，或是瞬时的，例如原因在于瞬时转化或暂时添加调节物如激动物或拮抗物或诱导物，如用携带处于诱导型启动子控制下的本发明核酸的诱导型构建体转化并添加诱导物例如四环素或如下文所述的诱导物后。

与对照、参考或野生型相比较，多肽的活性提高在细胞、组织、细胞器、器官或生物或其部分中优选地达到至少5％、优选地到至少20％或到至少50％、特别优选地到至少70％、80％、90％或更多，非常特别优选地是到至少200％、300％或400％、最优选地是到至少500％或更多。在一个实施方案中，术语提高意指相对于生物或其部分的重量在量方面的提高(w/w)。在一个实施方案中，多肽的活性提高在细胞器如质体中出现。

可以如实施例中所述检验由本发明核酸分子编码的多肽或本发明多肽的比活性。特别地，所讨论蛋白质与对照相比在细胞例如植物细胞中的表达是一个容易的实验并且可以如现有技术领域所述进行。

术语“提高”包括将化合物或活性从头导入细胞或亚细胞区室或细胞器或该化合物或活性在此前不可检测到，换言之，它被“产生”。因此，在下文中，术语“提高”也包含术语“产生”或“刺激”。提高的活性本身表现为与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性的增加。

已经在Blattner等人，Science 277(5331)，1453-1474(1997)中发表了来自大肠杆菌的序列B2664，例如在表I第5列中显示，并且将其活性描述为GTP酶或非必需的小GTP酶。因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括提高或产生来自大肠杆菌的具有“GTP酶或非必需的小GTP酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物，如本文提及，例如增加(a)基因的基因产物，其中所述基因包含如表I第5列中所示的核酸分子并且在与所述B2664或其如表I第7列中所述功能性等同物或同源物、优选如表IB第7列中所述同源物或功能性等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述B2664相同的相应横行中描述；或(b)多肽，该多肽包含如表II第5列或表IV第7列中分别所述的多肽、共有序列或多肽基序，并且在与所述B2664或其如表II第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表II B第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中被描述，并且在与所述B2664相同的相应横行中被描述，用于在如所提及的植物细胞、植物或其部分中与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性。因此，在一个实施方案中，在本发明方法中待提高活性的分子是具有被描述为“GTP酶或非必需的小GTP酶”的活性的基因产物，它优选地是本段落的项(a)或(b)的分子。已经在Goffeau等人，Science 274(5287)，546-547，1996中发表了来自酿酒酵母的序列YNL090W，例如在表I第5列中显示，并且将其活性描述为“转录调节物gabP 3’区、具有结合DNA的翼状螺旋结构域35的转录阻遏蛋白(GntR家族)或结合DNA的转录性双重调节蛋白”。因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括提高或产生来自大肠杆菌的具有“转录调节物gabP 3’区、具有结合DNA的翼状螺旋结构域35的转录阻遏蛋白(GntR家族)或结合DNA的转录性双重调节蛋白”的活性的基因产物或其功能等同物或其同源物，如本文提及，例如增加(a)基因的基因产物，其中所述基因包含如表I第5列中所示的核酸分子并且在与所述YNL090W或其如表I第7列中所述功能性等同物或同源物、优选如表IB第7列中所述同源物或功能性等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述YNL090W相同的相应横行中描述；或(b)多肽，该多肽包含如表II第5列或表IV第7列中分别所述的多肽、共有序列或多肽基序，并且在与所述YNL090W或其如表II第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表II B第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中被描述，并且在与所述YNL090W相同的相应横行中被描述，用于在如所提及的植物细胞、植物或其部分中与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性。因此，在一个实施方案中，在本发明方法中待提高活性的分子是具有被描述为“转录调节物gabP 3’区、具有结合DNA的翼状螺旋结构域35的转录阻遏蛋白(GntR家族)或结合DNA的转录性双重调节蛋白”的活性的基因产物，它优选地是本段落的项(a)或(b)的分子。

出乎意料地，观察到在拟南芥、优选在生态型C24中提高或产生至少一个基因的活性，所述基因赋予选自GTP酶、非必需的小GTP酶、转录调节物gabP 3’区、具有结合DNA的翼状螺旋结构域35的转录阻遏蛋白(GntR家族)和结合DNA的转录性双重调节蛋白组成的组中的活性，或者提高或产生包含表I第5列中所述核酸序列的基因的活性，从而赋予了与相应的非转化野生型对照植物相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性。

观察到在拟南芥、优选在生态型C24中提高或产生具有“GTP酶或非必需的小GTP酶”活性的基因产物的活性赋予了与相应的非转化野生型对照相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性，其中所述的基因产物由包含核酸序列SEQ ID NO.：9的基因编码。观察到在拟南芥、优选在生态型C24中提高或产生具有“转录调节物gabP 3’区、具有结合DNA的翼状螺旋结构域35的转录阻遏蛋白(GntR家族)或结合DNA的转录性双重调节蛋白”活性的基因产物的活性赋予了与相应的非转化野生型对照相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性，其中所述的基因产物由包含核酸序列SEQ IDNO.：50的基因编码。

因此，根据本发明的方法，可以实现与相应的非转化野生型对照相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性。因此，在一个实施方案中，就根据多肽SEQ ID NO.：10的多肽或由包含核酸SEQ ID NO.：9的核酸分子编码的多肽或所述核酸分子或多肽的同源物的活性而言，例如在生物中如果提高或产生下述核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的第7列与核酸分子SEQ IDNO.：9或多肽SEQ ID NO.：10相同的各自横行中分别所述的核酸或多肽或者共有序列或多肽基序，或如果提高或产生“GTP酶或非必需的小GTP酶”的活性，则在该生物中赋予与相应的非转化野生型对照相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性。因此，在一个实施方案中，就根据多肽SEQ ID NO.：51的多肽或由包含核酸SEQ ID NO.：50的核酸分子编码的多肽或所述核酸分子或多肽的同源物的活性而言，例如在生物中如果提高或产生下述核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽包含如表I、II或IV的第7列与核酸分子SEQID NO.：50或多肽SEQ ID NO.：51相同的各自横行中分别所述的核酸或多肽或者共有序列或多肽基序，或如果提高或产生“转录调节物gabP 3’区、具有结合DNA的翼状螺旋结构域35的转录阻遏蛋白(GntR家族)或结合DNA的转录性双重调节蛋白”的活性，则在该生物中赋予与相应的非转化野生型对照相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性。优选地，在所述生物中与相应的非转化野生型对照相比较而言额外地赋予了提高的干旱抗性。

术语“表达”指编码性基因节段或基因的转录和/或翻译。通常，所得产物是mRNA或蛋白质。但是，表达产物也可以包括功能性RNA，例如反义核酸、tRNA、snRNA、rRNA、RNAi、siRNA、核酶等。表达可以是全身的、局部的或暂时的，例如，限于某些细胞类型、组织、器官或细胞器或时间段。

在一个实施方案中，本发明的方法包括一个或多个以下步骤：a)稳定一种蛋白质，该蛋白质赋予由本发明核酸分子编码的蛋白质或具有本文中所提及活性的本发明多肽的表达增加并赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性，其中所述活性选自由GTP酶、非必需的小GTP酶、转录调节物gabP 3’区、具有结合DNA的翼状螺旋结构域35的转录阻遏蛋白(GntR家族)和结合DNA的转录性双重调节蛋白组成的组；b)稳定一种mRNA，该mRNA赋予由本发明核酸分子编码的蛋白质或其同源物或编码具有本文中所提及活性的本发明多肽的mRNA的表达增加并赋予与相应的非转化野生型对照相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性，其中所述活性选自由GTP酶、非必需的小GTP酶、转录调节物gabP 3’区、具有结合DNA的翼状螺旋结构域35的转录阻遏蛋白(GntR家族)和结合DNA的转录性双重调节蛋白组成的组；c)提高蛋白质的比活性，其中所述蛋白质赋予由本发明核酸分子编码的蛋白质或本发明多肽的表达提高或减少对本发明多肽的抑制性调节作用；d)产生或增加内源性或人工转录因子的表达，其中所述的转录因子介导蛋白质的表达，所述蛋白质引起由本发明核酸分子编码的蛋白质或具有本文中所提及活性的本发明多肽的表达增加并赋予与相应的非转化野生型对照相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性，其中所述活性选自由GTP酶、非必需的小GTP酶、转录调节物gabP3’区、具有结合DNA的翼状螺旋结构域35的转录阻遏蛋白(GntR家族)和结合DNA的转录性双重调节蛋白组成的组；e)刺激一种蛋白质的活性，该蛋白质赋予由本发明核酸分子编码的蛋白质或具有本文中所提及活性的本发明多肽的表达增加并赋予与相应的非转化野生型对照相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性，其中所述活性选自由GTP酶、非必需的小GTP酶、转录调节物gabP 3’区、具有结合DNA的翼状螺旋结构域35的转录阻遏蛋白(GntR家族)和结合DNA的转录性双重调节蛋白组成的组；f)表达编码蛋白质的转基因，其中所述蛋白质赋予由本发明核酸分子编码的多肽或具有本文中所提及活性的本发明多肽的表达增加并赋予与相应的非转化野生型对照相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性，其中所述活性选自由GTP酶、非必需的小GTP酶、转录调节物gabP 3’区、具有结合DNA的翼状螺旋结构域35的转录阻遏蛋白(GntR家族)和结合DNA的转录性双重调节蛋白组成的组；和/或g)增加基因的拷贝数，所述基因引起核酸分子的表达增加并赋予与相应的非转化野生型对照相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性，其中所述核酸分子编码由本发明核酸分子所编码的多肽或具有本文中所提及活性的本发明多肽，所述活性选自由GTP酶、非必需的小GTP酶、转录调节物gabP 3’区、具有结合DNA的翼状螺旋结构域35的转录阻遏蛋白(GntR家族)和结合DNA的转录性双重调节蛋白组成的组；h)通过添加正向表达元件或除去负向表达元件增加编码本发明多肽或其同源物的内源基因表达，例如，同源重组可以用来导入正向调节元件如对植物而言35S增强子至启动子或用来从调节区域除去阻遏元件。其他基因转变方法可以用来破坏阻遏元件或用来增强正向元件的活性-可以在植物中通过T-DNA或转座子诱变随机地导入正向元件并且可以鉴定所述正向元件已经整合于本发明基因附近的品系，所述基因的表达因而增强；和/或i)以增强编码本发明蛋白质的基因或该蛋白质本身的表达或活性的方式调节植物的生长条件；j)从天然资源或从诱变资源选择具有本发明蛋白质的特别高的活性的生物并将它们育种成目标生物，例如原种作物。

优选地，所述mRNA是本发明核酸分子和/或蛋白质，所述核酸分子和/或蛋白质赋予由单独或与转运核酸序列或编码转运肽的核酸序列连接的本发明核酸分子所编码的蛋白质或具有本文中所提及活性的多肽表达增加，例如在增加所编码多肽的表达或活性或者拥有多肽(其具有如表II第3列中所示蛋白质或其同源物的活性)的活性后，赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性。

通常，生物的细胞或区室中mRNA或多肽的量与所编码蛋白质的量相关并且因而与所述容积中所编码蛋白质的总体活性相关。所述相关并不总是线性的，该容积中的活性取决于所述分子的稳定性或者激活性或抑制性辅助因子的存在性。另外，酶的产物抑制作用和离析物抑制作用是熟知的并在教科书例如Stryer，Biochemistry中描述。

通常，生物的细胞或区室中mRNA、多核苷酸或核酸分子的量与所编码蛋白质的量相关并且因而与所述容积中所编码蛋白质的总体活性相关。所述相关并不总是线性的，在该容积中的活性取决于所述分子的稳定性、对所述分子的降解作用或者激活性或抑制性辅助因子的存在。另外，酶的产物抑制作用和离析物抑制作用是熟知的，例如。Zinser等人“Enzyminhibitoren”/“酶抑制剂”。

由本发明核酸分子编码的以上所提及蛋白质和/或多肽的活性可以以多种方式提高。例如，通过增加基因产物数目提高生物或其部分如细胞中的活性，例如通过提高表达速率，如导入更强的启动子，或通过增加所表达的mRNA的稳定性，因而提高翻译速率，和/或增加该基因产物的稳定性，因而减少衰变的蛋白质。另外，可以以这种方式影响酶的活性或周转，从而实现降低或提高反应速率或调整(减少或增加)对底物的亲和力。在本发明(例如作为酶的)多肽的催化中心内的突变可以调节该酶的周转率，例如敲除关键氨基酸可以导致该酶活性的降低或完全敲除，或将调节物结合位点缺失或突变可以降低负向调节作用如反馈抑制作用(或底物抑制作用，如果该底物的水平也提高)。可以提高本发明酶的比活性，从而提高周转率或改善对辅助因子的结合。改善编码性mRNA或蛋白质的稳定性也可以提高基因产物的活性。活性的刺激作用也属于术语“提高的活性”的范围。

另外，可以修饰对上文所提及核酸序列的调节作用，从而增加基因表达。这可以有利地借助异源性调节序列或通过修饰例如突变现有的天然调节序列来实现。所述有利方法也可以相互组合。

通常，基因产物在生物或其部分、尤其在植物细胞、植物细胞的细胞器、植物或植物组织或其部分或在微生物中的活性可以通过增加特定编码性mRNA或相应蛋白质在所述生物或其部分中的量提高。“蛋白质或mRNA的量”理解为意指多肽分子或mRNA分子在生物、组织、细胞或细胞区室中的分子数目。“增加”蛋白质的量意指与野生型、对照或参考相比较而言定量地减少所述蛋白质在生物、组织、细胞或细胞区室如细胞器例如质体或线粒体或其部分中的分子数，例如通过下文描述的方法之一减少。

分子数的增加优选地达到至少1％，优选地到多于10％，更优选地到30％或更多，特别优选地到50％、70％或更多，非常特别优选地到100％，最优选地到500％或更多。但是，从头表达也视为本发明的主题。

修饰，即提高，可以由内源性或外源性因子引起。例如，生物或其部分中活性的提高可以通过添加基因产物或前体或激活物或激动物至培养基或营养物引起或可以通过瞬时或稳定地导入所述主题至生物引起。另外，这种提高可以通过导入本发明的核酸序列或所编码的蛋白质于合适的细胞区室，例如通过转化和/或打靶分别导入细胞核或细胞浆或导入质体来达到。

在一个实施方案中，通过提高本发明多肽的内源性水平实现植物或其部分中例如在细胞、组织、器官、细胞器等中与相应的非转化野生型植物细胞相比而言环境胁迫耐受性和/或抗性的提高或降低。因此，在本发明的实施方案中，本发明涉及这样的方法，在所述方法中提高编码本发明多核苷酸或核酸分子的基因的基因拷贝数。另外，本发明多肽的内源性水平可以例如通过修饰对该多肽的转录性或翻译性调节作用来提高。

在一个实施方案中，植物或其部分中提高的环境胁迫耐受性和/或抗性可以通过定向或随机诱变本发明的内源基因来改变。例如，同源重组可以用来导入正向调节元件如对植物而言35S增强子至启动子或用来从调节区域除去阻遏元件。此外，基因转变法如Kochevenko和Willmitzer(Plant Physiol.2003年5月；132(1)：174-84)和其中引文所述的方法可以用来破坏阻遏元件或增强正向调节元件的活性。另外，正向元件可以通过T-DNA或转座子诱变随机地导入(植物)基因组并且可以筛选可以鉴定所述正向元件已经整合于本发明基因附近的品系，所述基因的表达因而增强。Hayashi等人，1992(Science 258：1350-1353)或Weigel等人，2000(Plant Physiol.122，1003-1013)和其中提到的其他人员已经描述了通过随机整合增强子元件对植物基因的激活。已经对多种情况描述了鉴定目的基因附近的插入(其逐步携带激活元件)的反向遗传策略，例如Krysan等人，1999(Plant Cell 1999，11，2283-2290)；Sessions等人，2002(Plant Cell 2002，14，2985-2994)；Young等人，2001，(Plant Physiol.2001，125，513-518)；Koprek等人，2000(Plant J.2000.24，253-263)；Jeon等人，2000(Plant J.2000.22，561-570)；Tissier等人，1999(Plant Cell 1999，11，1841-1852)；Speulmann等人，1999(Plant Cell1999，11，1853-1866)。简而言之，收集来自T-DNA或转座子诱变的庞大植物群体的全部植物中的材料并制备基因组DNA。随后，该基因组DNA按照例如在Krysan等人1999年(Plant Cell 1999，11，2283-2290)中描述的特定架构汇集。随后通过检测插入性致变物(例如T-DNA或转座子)和目的基因组合的特异性多重PCR反应筛选基因组DNA汇集物。因此，用T-DNA或转座子边界引物和基因特异性引物的特定组合在所述DNA汇集物上进行PCR反应。引物设计的一般原则可以再次取自Krysan等人，1999(PlantCell 1999，11，2283-2290)。再次筛选较低水平的DNA汇集物导致鉴定其中目的基因被插入性致变物激活的各株植物。也可以通过常规诱变技术实现对正向调节元件的增强或对负向调节元件的破坏或弱化：产生化学突变或放射突变的群体是一项常规技术并且是熟练技术人员已知的。用于植物的方法由Koorneef等人1982和其中引文并由Lightner和Caspa在“Methods in Molecular Biologyy”第82卷中描述。这些技术通常诱导可在任意已知基因中使用方法如TILLING(Colbert等人2001)鉴定到的点突变。

因此，如果编码引起本发明多肽表达提高的多肽的内源基因、尤其包含本发明核酸分子的基因借助同源重组、Tilling法或基因转变法进行修饰，则表达水平可以提高。也可能添加如本文提及的靶向性序列至本发明的核酸序列。

除靶序列或其部分之外，调节序列可以优选地有效连接至内源蛋白质的编码区并控制其转录和翻译或控制编码性mRNA或所表达蛋白质的稳定性或衰减。为了调节和控制表达，可以改变、添加或修正启动子、UTR、剪接位点、加工信号、多腺苷酸化位点、终止子、增强子、阻遏物、转录后或翻译后修饰位点。例如，Hayashi等人，1992(Science258：1350-1353)或Weigel等人，2000(Plant Physiol.122，1003-1013)和其中提到的其他人员已经描述了通过随机整合增强子元件对植物基因的激活。例如，可以通过将内源性启动子替换更强的转基因启动子或通过将内源性3’UTR替换为提供更大稳定性而不修饰编码区的一个3’UTR来调节内源蛋白质的表达水平。另外，转录性调节作用可以通过导入如实施例中所述的人工转录因子进行调节。下文描述了备选的启动子、终止子和UTR。

也可以通过导入结合至编码如表II第3列中所示蛋白质的基因的编码区附近并激活其转录的合成转录因子提高对内源性多肽的激活，其中所述的内源性多肽具有上文所提及的活性，例如，具有如表II第3列中所示蛋白质的活性或本发明多肽的活性，其中所述的本发明多肽在细胞浆中或在细胞器如质体中增加表达或活性后例如赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性。可以构建嵌合锌指蛋白，其包含特定DNA结合结构域或激活结构域如单纯疱疹病毒的VP16结构域。这个特异性结合结构域可结合至编码如表II第3列中所示蛋白质的基因的调节区。该嵌合转录因子在生物、尤其在植物中的表达导致如表II第3列中所示蛋白质的特异性表达，见，例如WO01/52620，Oriz，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，第99卷，13290；或Guan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，第99卷，13296。

在本发明方法的一个其他实施方案中，使用这样的生物，在所述生物中以上所提及基因之一或以上所提及核酸之一以如此方式突变，从而与未突变的蛋白质相比而言，编码的基因产物的活性更少地或根本不受细胞因素。例如，熟知的酶活性调节机制是底物抑制或反馈调节机制。用于导入相应序列的一个或多个碱基、核苷酸或氨基酸替换、缺失和添加的方法和技术在下文的相应段落和其中所列参考文献例如在Sambrook等人，Molecular Cloning，Cold Spring Habour，NY，1989中描述。本领域技术人员将能够通过借助计算机软件工具以现有技术比较本发明核酸分子或其表达产物的序列，其中所述的计算机软件工具包含用于鉴定结合部位和调节结构域的算法，或通过系统地将突变导入核酸分子或蛋白质中并分析会导致比活性提高或每容积、尤其每细胞的活性提高的那些突变来鉴定调节物的调节结构域和结合部位。

因此，可能有利的是在生物中表达从进化上远缘相关的生物衍生的本发明核酸分子或本发明多肽，如，例如在真核宿主中使用原核基因，因为在这些情况下宿主细胞的调节机制可以不减弱基因或其表达产物的活性(细胞活性或比活性)。

突变以没有不利地影响在短暂和重复性非生物胁迫条件下提高的产量这一方式导入。

对基因或其基因产物的调节作用影响较少理解为意指减少对酶活性的调节，其中所述的酶活性导致该基因或其产物的比活性或细胞活性提高。酶活性的提高理解为意指这样的酶活性，与起始生物相比，其提高达至少10％、有利地至少20、30或40％、特别有利地至少50、60或70％。这导致与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性。

本发明提供了上述方法可以如此进行，从而胁迫耐受性提高。也可能获得胁迫耐受性下降。

本发明不限于具体核酸、具体多肽、具体细胞类型、具体宿主细胞、具体条件或具体方法等诸如此类，不过可以变化，并且其中的众多修改和变化对本领域技术人员是显而易见的。还应当理解本文中所用术语的目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的。

本发明也涉及分离的核酸，其包含选自以下核酸组成的组中的核酸分子：a)编码表IIB第7列中所示多肽的核酸分子；b)表IB第7列中所示的核酸分子；c)核酸分子，其能够因遗传密码的简并性从表II第5列或第7列中所述的多肽序列衍生并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；d)核酸分子，其与包含在表I第5列或第7列中所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％同一性并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；e)核酸分子，其编码与由(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性并具有由包含如表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子所代表的活性的多肽，并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；f)核酸分子，其与(a)至(c)的核酸分子在严格杂交条件下杂交并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；g)编码多肽并具有由包含如表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性的核酸分子，其中所述多肽能够借助针对由(a)至(e)的核酸分子之一编码的多肽所制备的单克隆或多克隆抗体分离；h)核酸分子，其编码多肽，所述多肽包含如表IV第7列中所示的共有序列或一个或多个多肽基序并且优选地具有由包含如表II或表IV的第5列中所述多肽的多肽所代表的活性；h)核酸分子，其编码具有如表II第5列中描述的蛋白质所代表活性的多肽并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；i)核酸分子，其包含通过使用表III第7列中的引物扩增cDNA文库或基因组文库所获得的多核苷酸并且优选地具有由包含如表II或表IV的第5列中所述多肽的多肽代表的活性；和j)通过用包含核酸分子(a)或(b)的互补序列的探针或用其片段在严格杂交条件下筛选合适的核酸文库能够获得的核酸分子，其中所述的片段具有与在(a)至(e)中表征并编码下述多肽的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选地至少20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，所述多肽具有由包含如表II第5列中所述多肽的蛋白质代表的活性；其中根据(a)至(j)的核酸分子至少在一个或多个核苷酸上与表IA第5列或第7列中所述的序列不同，并且优选地其编码至少在一个或多个氨基酸上与表IIA第5列或第7列中所述的蛋白质序列不同的蛋白质。

在一个实施方案中，表II第3列中所示多肽之任一者的同源物是具有相同或相似活性的同源物。特别地，活性的提高赋予与相应的非转化野生型对照相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性。在一个实施方案中，该同源物是具有如表I或表II的第7列中所示序列的同源物。在一个实施方案中，表II第3列中所示多肽之一者的同源物衍生自真核生物。在一个实施方案中，该同源物衍生自真菌。在一个实施方案中，表II第3列中所示多肽的同源物衍生自子囊菌门。在一个实施方案中，表II第3列中所示多肽的同源物衍生自酵母亚门(Saccharomycotina)。在一个实施方案中，表II第3列中所示多肽的同源物衍生自酵母纲(Saccharomycetes)，优选地来自酵母目(Saccharomycetales)，来自酵母科(Saccharomycetaceae)，更优选地来自酵母属(Saccharomycetes)。在一个实施方案中，该同源物是具有如表I或表II的第7列中所示序列的同源物。在一个实施方案中，表II第3列中所示多肽之一者的同源物衍生自细菌。在一个实施方案中，表II第3列中所示多肽的同源物衍生自变形菌门(Proteobacteria)。在一个实施方案中，表II第3列中所示多肽的同源物是具有相同或相似活性的同源物，其衍生自γ变形菌纲(Gammaproteobacteria)，优选地来自肠杆菌目(Enterobacteriales)，来自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，更优选地来自埃希氏菌属(Escherichia)。在一个实施方案中，本发明涉及前述序列的同源物，所述序列同源物可以有利地从例如酵母、真菌、病毒、藻类、细菌如醋化醋杆菌(Acetobacteraceti)(醋杆菌亚属(subgen.Acetobacter)；嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)；不动杆菌属物种(Acinetobacter sp.)；放线杆菌属物种(Actinobacillus sp)；杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)；根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)；气生超嗜热菌(Aquifexaeolicus)；化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogene)；翠菊黄化植原体(Aster yellows phytoplasma)；芽孢杆菌(Bacillus sp.)；双歧杆菌属物种(Bifidobacterium sp.)；布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)；扩展短杆菌(Brevibacterium linens)；马耳他布氏菌(Brucella melitensis)；巴克纳氏菌属物种(Buchnera sp.)；溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)；空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)；新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)；衣原体属物种(Chlamydia sp.)；嗜性衣原体属物种(Chlamydophila sp.)；泥生绿菌(Chlorobium limicola)；腐蚀柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)；梭菌属物种(Clostridium sp.)；睾丸酮丛生单胞菌(Comamonas testosteroni)；棒状菌种物(Corynebacterium sp.)；伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii)；耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)；节瘤腐蹄杆菌(Dichelobacternodosus)；鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)；肠杆菌属物种(Enterobacter sp.)；猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)；大肠埃希氏菌(Escherichia coli)；黄杆菌属物种(Flavobacterium sp.)；土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)；弗兰克氏属菌物种Cpl1(Frankia sp.Cpl1)；具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)；嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)；氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)；嗜血菌属物种(Haemophilus sp.)；幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)；肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)；乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)；乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；李斯特氏菌属物种(Listeria sp.)；溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)；百脉根中间根瘤菌(Mesorhizobiumloti)；深海噬甲基菌(Methylophaga thalassica)；铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)；微颤菌属物种PRE1(Microscilla sp.PRE1)；莫拉氏菌属物种TA144(Moraxella sp.TA144)；分枝杆菌属物种(Mycobacterium sp.)；支原体属物种(Mycoplasma sp.)；奈瑟氏球菌属物种(Neisseria sp.)；亚硝化单胞菌属物种(Nitrosomonas sp.)；念珠藻属物种PCC7120(Nostoc sp.PCC7120)；多环芳烃降解菌新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium aromaticivorans)；酒酒球菌(Oenococcus oeni)；柠檬泛菌(Pantoea citrea)；多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)；戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)；坑形席藻(Phormidium foveolarum)；植原体属物种(Phytoplasma sp.)；鲍氏织线藻(Plectonema boryanum)；栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)；丙酸杆菌属物种(Propionibacterium sp.)；普通变形菌(Proteus vulgaris)；假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)；罗尔斯通菌属物种(Ralstonia sp.)；根瘤菌属物种(Rhizobium sp.)；马红球菌(Rhodococcus equi)；海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)；立克次氏体属物种(Rickettsia sp.)；鸭瘟立默氏菌(Riemerella anatipestifer)；黄化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)；沙门氏菌(Salmonella sp.)物种；反刍月形单胞菌(Selenomonasruminantium)；嗜虫沙雷氏菌(Serratia entomophila)；志贺氏菌属物种(Shigella sp.)；苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)；葡萄球菌属物种(Staphylococcus sp.)；链球菌属物种(Streptococcus sp.)；链霉菌属物种(Streptomyces sp.)；聚球藻属物种(Synechococcus sp.)；聚球藻属物种PCC6803(Synechocystis sp.PCC 6803)；热海栖热袍菌(Thermotoga maritima)；密螺旋体属物种(Treponema sp.)；解脲脲支原体(Ureaplasmaurealyticum)；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)；苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)；耶尔森氏菌(Yersiniasp.)物种；运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)，优选沙门氏菌或大肠埃希氏菌或植物，或植物，优选来自酵母如来自酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或植物如拟南芥、玉米、小麦、黑麦、燕麦、小黑麦、稻、大麦、大豆、花生、棉属植物、琉璃苣、红花、亚麻子、报春花、油菜籽油菜、拉诺拉油菜和甘蓝型油菜、木薯、辣椒、向日葵、万寿菊、茄科植物如马铃薯、烟草、茄子和番茄、野豌豆属(Vicia)物种、豌豆、苜蓿、灌丛植物如咖啡、可可、茶、柳属(Salix)物种、树如油棕榈、椰子、多年生草如黑麦草和羊茅(fescue)以及饲料作物如苜蓿和车轴草(clover)并且从云杉、松或冷杉分离。更优选地，前述序列的同源物可以从酿酒酵母、大肠杆菌或植物，优选欧洲油菜(Brassicanapus)、大豆(Glycine max)、玉米、棉属植物、或稻(Oryza sativa)分离。

本发明的(胁迫相关)蛋白质优选地通过重组DNA技术产生。例如，将编码该蛋白质的核酸分子克隆至表达载体，例如克隆至双元载体中，将表达载体导入宿主细胞，例如拟南芥野生型NASC N906或如下文所见实施例中描述的任何其他植物细胞，并且在所述的宿主细胞中表达该胁迫相关蛋白。双元载体的例子是pBIN19、pBI101、pBinAR、pGPTV、pCAMBIA 、pBIB-HYG、pBecks、pGreen或pPZP(Haj ukiewicz，P.等人，1994，Plant Mol.Biol.，25：989-994；和Hellens等人，Trends in PlantScience(2000)5，446-451)。在一个实施方案中，本发明的(DRCP)蛋白质优选地在细胞的区室中、更优选地在质体中产生。将核酸导入质体并在该区室中产生蛋白质的方法是本领域技术人员已知的并且也已经在本申请书中描述。

有利地，将本发明的核酸序列或具有至少一个报道基因的基因构建体克隆到表达盒中，该表达盒通过载体导入生物或直接地导入基因组。该报道基因应当允许借助生长、荧光、化学品、生物发光或抗性分析或通过分光光度测量进行轻易检测。可以提到的报道基因例子是抗生素抗性或除草剂抗性基因、水解酶基因、荧光蛋白基因、生物发光基因、糖或核苷酸代谢基因或生物合成基因如Ura3基因、Ilv2基因、萤光素酶基因、β-半乳糖苷基因、gfp基因、2-脱氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酶基因、β-葡糖醛酸酶基因、β-内酰胺酶基因、新霉素磷酸转移酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因、突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)基因，又称做乙酰乳酸合酶(ALS)基因]、D-氨基酸代谢酶基因或BASTA(＝草丁膦-抗性)基因。这些基因允许轻易测量和量化转录活性并因而轻易测量和量化基因的表达。以这种方式，可以鉴定显示不同生产力的基因组位置。

在一个优选的实施方案中，核酸构建体例如表达盒在上游即在编码序列5’端包含启动子并在下游即在编码序列3’端包含多腺苷酸化信号以及任选地与间插的编码序列有效连接的调节元件，其中所述间插的编码序列具有如表I第5列和第7列中所述SEQ ID NO的核酸之一。有效连接意指启动子、编码序列、终止子和任选地其他调节元件以如此方式顺序排列，从而所述调节元件的每一种可以在编码序列表达中以适度方式实现其功能。优选地用于有效连接的序列是用于确保质体中亚细胞定位的靶向序列。但是，也可以使用用于确保在线粒体、在内质网(＝ER)、在细胞核、在油小体或其他区室中亚细胞定位的靶向序列以及翻译启动子如烟草花叶病毒的5’前导序列(Gallie等人，Nucl.Acids Res.15(1987)，8693-8711)。

核酸构建体，例如表达盒，可以例如含有组成型启动子或组织特异性启动子(优选地USP或油菜籽蛋白启动子)、待表达的基因和ER滞留信号。对于ER滞留信号，优选使用KDEL氨基酸序列(赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸)或KKX氨基酸序列(赖氨酸-赖氨酸-X-终止子，其中X意指任何其他已知的氨基酸。

为了在宿主生物例如植物中表达，该表达盒有利地插入载体例如质粒、噬菌体或使所述基因在宿主生物中最佳表达的其他DNA。合适载体的例子是大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR系列如pBR322、pUC系列如pUC18或pUC19、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III¹¹³-B1、λgt11或pBdCI、链霉菌属(Streptomyces)中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361、芽孢杆菌属(Bacillu)中的pUB110、pC194或pBD214、棒状杆菌属(Corynebacterium)中的pSA77或pAJ667、真菌中的pALS1、pIL2或pBB116；其他有利的真菌载体由Romanos，M.A.等人，[(1992)“综述：酵母中外来基因表达(Foreign gene expression in yeast：a review)”，Yeast 8：423-488]；以及由van den Hondel、C.A.M.J.J.等人[(1991)“丝状真菌中的异源基因表达(Heterologous gene expression in filamentous fungi)”以及在《More Gene Manipulations in Fungi》[J.W.Bennet和L.L.Lasure编著，第396-428页：Academic Press：San Diego]和在“用于丝状真菌的基因转移系统和载体开发(Gene transfer systems and vector development forfilamentous fungi)”[van den Hondel、C.A.M.J.J.和Punt，P.J.(1991)在：应用真菌分子遗传学《Applied Molecular Genetics of Fungi》，Peberdy，J.F.等人，编著，第1-28页，Cambridge University Press：Cambridge]描述。有利的酵母启动子的例子是2μM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23。藻类或植物启动子的例子是pLGV23、pGHlac⁺、pBIN19、pAK2004、pVKH或pDH51(见Schmidt，R.和Willmitzer，L.，1988)。上文确定的载体或上文确定的载体衍生物是可能质粒的一小部分选项。其它质粒是本领域技术人员熟知的并且可在例如Cloning Vectors(编者PouwelsP.H.等人，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0444904018)中描述。合适的植物载体尤其在“Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology”(CRC Press)，第6/7章，第71-119页中描述。有利的载体已知是在大肠杆菌和农杆菌中复制的穿梭载体或双元载体。

除质粒之外，载体还意指本领域技术人员已知的全部其他载体，例如，噬菌体、病毒如SV40、CMV、杆状病毒、腺病毒、转座子、IS元件、噬粒、噬菌粒、粘粒、线性或环状DNA。这些载体可以在宿主生物中自主复制或染色体方式复制，优选染色体方式复制。

在载体的一个其他实施方案中，本发明的表达盒也可以有利地以线性DNA方式导入生物并通过异源或同源重组整合到该宿主生物的基因组中。该线性DNA可以由线性化质粒构成或仅由作为本发明载体或核酸序列的表达盒构成。

在一个其他有利实施方案中，本发明的核酸序列也可以自行导入生物。

除了本发明的核酸序列之外，意图将其他基因导入生物，并连同报道基因均位于单个载体中，或可以将每种情况下在一个载体中带有一个报道基因的每个单独基因导入该生物，因而可以同时地或依次地导入不同载体。

载体有利地含有至少一个拷贝的本发明核酸序列和/或本发明表达盒(＝基因构建体)。

本发明还提供了分离的重组表达载体，其包含编码如表II第5列或第7列中所述多肽的核酸，其中该载体在宿主细胞中的表达导致与该宿主细胞的野生型品种相比提高的环境胁迫耐受性。如本文中所用，术语“载体”指这样的核酸分子，其能够运输已经与之连接的另一个核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，指可以向其中连入额外DNA节段的环状双链DNA环。载体的另一类型是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连入病毒基因组。某些载体能够在导入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和哺乳动物游离型载体)。其他载体(例如哺乳动物非游离型载体)在导入宿主细胞后整合到该宿主细胞或细胞器的基因组中，并因而随宿主或细胞器基因组一起复制。另外，某些载体能够指导与它们有效连接的基因表达。此类载体在本文称作“表达载体”。通常，重组DNA技术中使用的表达载体经常处于质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换地使用，因为质粒是载体的最常用形式。但是，本发明意图包括其他同等功能的其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

本发明的重组表达载体包含处于这种形式下的本发明核酸，其中所述形式适于该核酸在宿主细胞中表达，这意指该重组表达载体包含基于待用于表达的宿主细胞所选择的一个或多个调节序列，所述调节序与待表达的核酸序列有效连接。如本文中就重组表达载体方面所用，“有效地连接”意指目的核苷酸序列与调节序列以引起该核苷酸序列表达的方式(当该载体导入宿主细胞时，例如在体外转录/翻译系统或在宿主细胞中)连接。术语“调节序列”意图包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。此类调节序列例如在Goeddel，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)和Gruber与Crosby，在：Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology，Glick和Thompson编著，第7章，89-108，包括其中参考文献中描述。调节序列包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成型表达的那些调节序列和指导该核苷酸序列仅在某些宿主细胞中或在某些条件下表达的那些调节序列。本领域技术人员会理解，表达载体的设计取决于此类因素，如待转化细胞的选择、所需的多肽表达水平等。本发明的表达载体可以导入宿主细胞，旨在因而产生由本文中所述的核酸编码的多肽或肽，包括融合多肽或融合肽(例如DRCP、DRCP的突变体形式、融合多肽等)。

可以设计本发明的重组表达载体用于在植物细胞中表达本发明的多肽。例如，DRCP基因可以表达于植物细胞中(Schmidt，R.和Willmitzer，L.，1988，根癌农杆菌介导的拟南芥叶和子叶外植体高效转化(High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation ofArabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants)，Plant Cell Rep.583-586；Plant Molecular Biology and Biotechnology，C Press，Boca Raton，Florida，第6/7章，S.71-119(1993)；F.F.White，B.Jenesd等人，Techniques for GeneTransfer，in：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和R.Wu编著，128-43，Academic Press：1993；Potrykus，1991，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42：205-225和其中引用的参考文献)。合适的宿主细胞在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中进一步讨论。备选地，该重组表达载体可以在体外转录和翻译，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。

多肽在原核生物中的表达大多数情况下用含有可指导融合蛋白或非融合多肽表达的组成型或诱导型启动子的载体实施。融合载体添加多个氨基酸至其中所编码的多肽，通常添加至重组多肽的氨基端，但也可以添加至羧基端或在该多肽的合适区域中融合。此类融合载体一般起到3种作用：1)增加重组多肽的表达；2)增加重组多肽的溶解度；和3)通过充当配体在亲和纯化中利于重组多肽的纯化。在融合表达载体中，往往在融合部分与重组多肽的接合处导入蛋白水解切割位点，目的是在融合多肽纯化后能够将重组多肽与该融合部分分开。此类酶及它们的相关识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。

例如，植物表达盒可以安置于pRT转化载体中((a)Toepfer等人，1993，Methods Enzymol，217：66-78；(b)Toepfer等人1987，Nucl.Acids.Res.15：5890 ff)。备选地，重组载体(＝表达载体)也可以在体外转录和翻译，例如通过使用T7启动子和T7RNA聚合酶。

用于原核生物中的表达载体往往利用含有或不含有融合蛋白或融合寡肽的诱导型系统，其中这些融合物可以按照氨基末端和羧基末端方式接续或接续于蛋白质的其它有用结构域中。此类融合载体通常具有以下目的：i.)提高RNA表达速率；ii.)提高可实现的蛋白质合成速率；iii.)增加蛋白质的溶解度；iv.)通过可用于亲和层析的结合序列简化纯化过程。蛋白酶水解切割位点也往往借助融合蛋白导入，这允许切割融合蛋白的一部分并纯化。蛋白酶的此类识别序列例如由因子Xa、凝血酶和肠激酶识别。

常见有利的融合和表达载体是pGEX[Pharmacia BiotechInc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40]、pMAL(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)和含有谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白或蛋白A的pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)。

在一个实施方案中，将本发明多肽的编码序列克隆入pGEX表达载体以产生编码融合多肽的载体，其中所述的融合多肽从氨基末端至羧基末端包含GST-凝血酶切割位点-X多肽。该融合多肽可以使用谷胱甘肽-琼脂糖树脂通过亲和层析进行纯化。与GST未融合的重组DRCP可以通过用凝血酶切割该融合多肽进行回收。大肠杆菌表达载体的其他例子是pTrc[Amann等人(1988)Gene69：301-315]和pET载体[Studier等人，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89；Stratagene，Amsterdam，The Netherlands]。

来自pTrc载体的靶基因表达依赖来自杂合trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。来自pET 11d载体的靶基因表达依赖于源自共表达的病毒RNA聚合酶(T7gn1)所介导的T7-gn10-lac融合启动子的转录。这种病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)从原住性I原噬菌体提供，其中所述原噬菌体携带处于lac UV 5启动子转录性控制下的T7gn1基因。

在本发明的一个优选实施方案中，DRCP表达于植物和植物细胞如单细胞植物细胞(例如藻类)中(见Falciatore等，1999，MarineBiotechnology 1(3)：239-251及其中的参考文献)和来自高等植物的植物细胞(例如，种子植物，如作物植物)。编码如表II第5列或第7列中所述DRCP的多核苷酸可以通过任意方法导入“植物细胞”，所述方法包括转染、转化或转导、电穿孔、粒子轰击、农杆菌感染等。本领域技术人员已知的一种转化方法是将正开花的植物浸入农杆菌溶液，其中所述农杆菌含有本发明的核酸，随后将转化的配子繁育。

用于转化或转染包括植物细胞在内的宿主细胞的其他合适方法可以在Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.，2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989和其他实验室手册如Methods inMolecular Biology，1995，第44卷，Agrobacterium protocols，Gartland和Davey编著，Humana Press，Totowa，New Jersey中找到。由于生物性及非生物性胁迫耐受性是希望遗传至种类多样的植物，如玉米、小麦、黑麦、燕麦、小黑麦、稻、大麦、大豆、落花生、棉属植物、油菜籽油菜和卡诺拉油菜、木薯、辣椒、向日葵和万寿菊、茄科植物如马铃薯、烟草、茄子和番茄、野豌豆属(Vicia)物种、豌豆、苜蓿、灌木植物(咖啡、可可、茶)、柳属(Salix)物种、树(油棕榈、椰子)、多年生草和饲料作物中的一般性状，故作为本发明的又一个实施方案，这些作物植物也是用于基因工程的优选靶植物。饲料作物包括但不限于小麦草(Wheatgrass)、虉草(Canarygrass)、雀麦草(Bromegrass)、披碱草(Wildrye Grass)、早熟禾(Bluegrass)、鸭茅(Orchardgrass)、苜蓿、Salfoin、百脉根(Birdsfoot Trefoil)、杂车轴草(Alsikeclover)、红车轴草(red clover)和草木樨(Sweet clover)。

在本发明的一个实施方案中，通过农杆菌介导的基因转移实现编码如表II第5列或第7列中所述DRCP的核酸分子转染至植物内。农杆菌介导的植物转化可以使用例如GV3101(pMP90)(Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204：383-396)或LBA4404(Clontech)根癌农杆菌菌株进行。转化可以通过标准转化和再生技术(Deblaere等人，1994，Nucl.AcidsRes.13：4777-4788；Gelvin，Stanton B.和Schilperoort，Robert A，PlantMolecular Biology Manual，2版.-Dordrecht：Kluwer Academic Publ.，1995.-在Sect.，Ringbuc Zentrale Signatur：BT11-P ISBN 0-7923-2731-4中；Glick，Bernard R.；Thompson，John E.，Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology，Boca Raton：CRC Press，1993360S.，ISBN0-8493-5164-2)进行。例如，油菜籽可以通过子叶或下胚轴转化法进行转化(Moloney等人，1989，Plant cell Report 8：238-242；De Block等人，1989，Plant Physiol.91：694-701)。抗生素用于农杆菌以及植物选择的用途取决于转化所用的双元载体和农杆菌菌株。油菜籽的选择通常使用卡那霉素作为可选择植物标记进行。可以使用例如Mlynarova等人，1994，Plant CellReport 13：282-285描述的技术进行针对亚麻的农杆菌介导的基因转移。可以使用例如在欧洲专利号0424047、美国专利号5,322,783、欧洲专利号0397687、美国专利号5,376,543或美国专利号5,169,770中描述的技术进行大豆的转化。玉米的转化可以通过粒子轰击法、聚乙二醇介导的DNA摄取法或借助碳化硅纤维技术实现。见，例如Freeling和Walbot“Themaize handbook”Springer Verlag：New York(1993)ISBN 3-540-97826-7).玉米转化的具体例子存在于美国专利号5,990,387中，并且小麦转化的具体例子可以在PCT申请号WO93/07256中找到。

根据本发明，如果导入的编码如表II第5列或第7列中所述DRCP的核酸分子掺入非染色体的自主型复制子或整合到植物染色体或细胞器基因组中，则它可以稳定维持于植物细胞内。备选地，导入的DRCP可以存在于染色体外的非复制型载体上并且瞬时地表达或瞬时地有活性。

在一个实施方案中，可以产生其中DRCP整合至染色体中的同源重组微生物，制备了含有编码如表II第5列或第7列中所述DRCP的核酸分子的至少一部分的载体，其中已经向所述部分导入缺失、添加或替换，以便因此改变(例如功能性地破坏)DRCP基因。优选地，DRCP基因是酵母或大肠杆菌基因，不过它可以是来自相关植物或甚至来自哺乳动物或昆虫源的同源物。可以这样设计载体，使得当同源重组后，编码如表II第5列或第7列中所述DRCP的内源性核酸分子被突变或改变，不过仍编码功能多肽(例如，可以更改上游调节区以便因而更改内源性DRCP的表达)。在一个优选的实施方案中，同源重组后提高了本发明蛋白质的生物学活性。为借助同源重组产生点突变，DNA-RNA杂交体可以用于称做嵌合修复的技术中(Cole-Strauss等人，1999，Nucleic Acids Research27(5)：1323-1330和Kmiec，1999Gene therapy American Scientist.87(3)：240-247)。小立碗藓(Physcomitrella patens)中的同源重组方法也是本领域熟知的并且构思用于本文。

在同源重组载体中，编码如表II第5列或第7列中所述DRCP的核酸分子的改变部分在其5’和3’端侧翼具有该DRCP基因的额外核酸分子，以允许同源重组在该载体所携带的外源DRCP基因与内源性DRCP基因之间于微生物或植物中发生。这种额外的侧翼DRCP核酸分子具有成功与内源性基因同源重组的足够长度。一般地，在该载体中包含(在5’末端和3’末端)数百个碱基对至多到数千碱基对的侧翼DNA。见，例如Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.，1987，1987，Cell 51：503对同源重组载体的描述或Strepp等人，1998，PNAS，95(8)：4368-4373对小立碗藓中基于cDNA之重组的描述)。该载体被导入微生物或植物细胞(例如借助聚乙二醇介导的DNA)，并且使用本领域已知的技术选择其导入的DRCP基因已经与内源性DRCP基因同源重组的细胞。

无论在染色体外非复制型载体中或在整合入染色体的载体中存在，编码如表II第5列或第7列中所述DRCP的核酸分子优选地位于植物表达盒中。植物表达盒优选地包含能够在植物细胞中驱动基因表达的调节序列，其中所述调节序列是有效连接的，从而每种序列可以实现其功能，如通过多腺苷酸化信号终止转录。优选的多腺苷酸化信号是从根癌农杆菌t-DNA如Ti质粒pTiACH5(Gielen等人，1984，EMBO J.3：835)的称作章鱼碱合酶的基因3或其功能性等同物起源的那些多腺苷酸化信号，而在植物中有功能活性的全部其它终止子也是合适的。由于植物基因表达极经常地不在转录水平上受限制，故植物表达盒优选地包含其它有效连接的序列，如翻译增强子，如过量驱动序列，其含有来自烟草花叶病毒的增强多肽/RNA比率的5’非翻译性前导序列(GaINe等人，1987，Nucl.AcidsResearch 15：8693-8711)。植物表达载体的例子包括详述于：Becker，D.等人，1992，具有位于左边界附近的选择标记的新植物双元载体(New plantbinary vectors with selectable markers located proximal to the left border)，Plant Mol.Biol.20：1195-1197；和Bevan，M.W.，1984，用于植物转化的双元农杆菌载体(Binary Agrobacterium vectors for plant transformation)，Nucl.Acid.Res.12：8711-8721；和“用于高等植物中基因转移的载体”(Vectors for Gene Transfer in Higher Plants)；在：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，S.15-38中的那些植物表达载体。

“转化”在本文中定义为用于导入异源DNA至植物细胞、植物组织或植物的过程。该过程可以在天然或人工条件下使用本领域熟知的多种方法进行。转化可以依赖于插入外来核酸序列至原核或真核宿主细胞中的任意已知方法。该方法基于待转化的宿主细胞选择并且可以包括但不限于病毒感染法、电穿孔法、脂质体转染法和粒子轰击法。此类“转化”的细胞包括其中插入的DNA能够作为自主复制型质粒或者作为宿主染色体的部分进行复制的稳定转化的细胞。它们也包括在有限的时间段瞬时表达所插入DNA或RNA的细胞。转化的植物细胞、植物组织或植物理解为不仅包括转化过程的终产物，还包括其转基因子代。术语“转化的”、“转基因的”和“重组的”指已经向其中导入异源性核酸分子的宿主生物，如细菌或植物。该核酸分子可以稳定地整合到该宿主的基因组中或者该核酸分子也可以作为染色体外分子存在。这种染色体外分子可以自主复制。转化的细胞、组织或植物理解为不仅包括转化过程的终产物，还包括其转基因子代。“未转化的”、“非转基因的”或“非重组的”宿主指不含有异源性核酸分子的野生型生物，例如细菌或植物。如本文中所用，“转基因植物”指含有插入其胞核基因组或细胞器基因组的外来核苷酸序列的植物。它还包括后续世代，即，T1-、T2-及连续世代，或BC1、BC2及连续世代以及其与非转基因植物或其它转基因植物的杂种。

宿主生物(＝转基因生物)有利地含有至少一个拷贝的本发明核酸和/或至少一个拷贝的本发明核酸构建体。原则上所有植物均可以用作宿主生物。优选的转基因植物例如选自槭树科(Aceraceae)、漆树科(Anacadiaceae)、伞形科(Apiaceae)、菊科(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、锦葵科(Malvaceae)、睡莲科(Nymphaeaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、蔷薇科(Rosaceae)、杨柳科(Salicaceae)、茄科(Solanaceae)、棕榈科(Arecaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、莎草科(Cyperaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、百合科(Liliaceae)、兰科(Orchidaceae)、龙胆科(Gentianaceae)、唇形科(Labiaceae)、木兰科(Magnoliaceae)、毛莨科(Ranunculaceae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、茜草科(Rubiaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、蓼科(Polygonaceae)、堇菜科(Violaceae)、灯心草科(Juncaceae)或禾本科(Poaceae)并且优选源于选自伞形科、菊科、十字花科、葫芦科、豆科、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科的植物。优选作物植物，如有利地选自以下植物所在属的植物：落花生、油菜籽油菜、卡诺拉油菜、向日葵、红花、橄榄(olive)、芝麻(sesame)、榛子(hazelnut)、扁桃(almond)、鳄梨(avocado)、月桂(bay)、南瓜(pumpkin/squash)、亚麻、大豆(soya)、阿月混子(pistachio)、琉璃苣、玉米、小麦、黑麦、燕麦、高粱(sorghum)和黍(millet)、小黑麦、稻、大麦、木薯(cassava)、马铃薯、甜菜、茄子、苜蓿和多年生草和饲料植物、油棕、蔬菜(芥菜、根用蔬菜、块茎蔬菜、荚用蔬菜、果实蔬菜、葱类蔬菜、叶用蔬菜和茎用蔬菜)、荞麦(buck小麦)、菊芋(Jerusalem artichoke)、蚕豆(broad bean)、野豌豆(vetches)、小扁豆(lentil)、四季豆(dwarf bean)、羽扇豆(lupin)、车轴草和紫花苜蓿(Lucerne)，仅提到它们中的一些。在本发明的一个实施方案中，转基因植物选自包含谷物、大豆、油籽油菜(包括卡诺拉油菜和冬油籽油菜(winter oil seed reap)、棉属植物、小麦和稻的组。在一个优选的实施方案中，宿主植物选自槭树科、漆树科、伞形科、菊科、十字花科、仙人掌科、葫芦科、大戟科、豆科、锦葵科、睡莲科、罂粟科、蔷薇科、杨柳科、茄科、棕榈科、凤梨科、莎草科、鸢尾科、百合科、兰科、龙胆科、唇形科、木兰科、毛莨科、忍冬科、茜草科、玄参科、石竹科、杜鹃花科、蓼科、堇菜科、灯心草科或禾本科并且优选源于选自伞形科、菊科、十字花科、葫芦科、豆科、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科的植物。优选作物植物并且尤其在本文中作为宿主提到的植物，如上文提到的科和属的植物，例如优选的以下物种：腰果(Anacardium occidentale)、金盏花(Calendula officinalis)、红花(Carthamustinctorius)、菊芋(Cichorium intybus)、洋蓟(Cynara scolymus)、向日葵(Helianthus annus)、香叶万寿菊(Tagetes lucida)、万寿菊(Tagetes erecta)、细叶万寿菊(Tagetes tenuifolia)；胡萝卜(Daucus carota)；欧洲榛(Corylusavellana)、土耳其榛(Corylus colurna)、琉璃苣(Borago officinalis)；欧洲油菜、芜青某些物种(Brassica rapa ssp.)、野欧白芥(Sinapis arvensis)、芥菜(Brassica juncea)、芥菜原变种(Brassica juncea var.juncea)、皱叶芥菜(Brassica juncea var.crispifolia)、大叶芥菜(Brassica juncea var.foliosa)、黑芥(Brassica nigra、Brassica sinapioides、Melanosinapis communis)、甘蓝(Brassica oleracea)、拟南芥、凤梨(Anana comosus)、Ananas ananas、Bromelia comosa、番木瓜(Carica papaya)、大麻(Cannabis sative)、甘薯(lpomoea batatus)、提琴叶牵牛花(lpomoea pandurata)、Convolvulusbatatas、Convolvulus tiliaceus、lpomoea fastigiata、lpomoea tiliacea、三裂叶薯(lpomoea triloba)、Convolvulus panduratus、甜菜(Beta vulgaris)、甜萝卜(Beta vulgaris var.altissima)、甜菜原变种(Beta vulgaris var.vulgaris)、沿海甜菜(Beta maritima)、多年生甜菜(Beta vulgaris var.perennis)、红甜菜(Beta vulgaris var.conditiva)、Beta vulgaris var.esculenta、印度南瓜(Cucurbita maxima)、灰籽南瓜(Cucurbita mixta)、西葫芦(Cucurbita pepo)、南瓜(Cucurbita moschata)、油橄榄(Olea europaea)、苦木薯(Manihot utilissima)、Janipha Manihot、Jatropha Manihot、Manihotaipil、Manihot dulcis、Manihot manihot、Manihot melanobasis、甜木薯(Manihot esculenta)、蓖麻(Ricinus communis)、豌豆(Pisum sativum)、饲料豌豆(Pisum arvense)、早生矮豌豆(Pisum humile)、紫花苜蓿(Medicagosativa)、野苜蓿(Medicago falcata)、杂交苜蓿(Medicago varia)、大豆、Dolichos soja、宽叶蔓豆(Glycine gracilis)、Glycine hispida、Phaseolus max、Soja hispida、Soja max、椰子(Cocos nucifera)、椰香天竺葵(Pelargoniumgrossularioides)、Oleum cocoas、月桂(Laurus nobilis)、鳄梨(Perseaamericana)、落花生(Arachis hypogaea)、亚麻(linum usitatissimum)、linumhumile、奥地利亚麻(linum austriacum)、linum bienne、窄叶亚麻(linumangustifolium)、泻亚麻(linum catharticum)、金黄亚麻(linum flavum)、大花亚麻(linum grandiflorum、Adenolinum grandiflorum)、刘易斯亚麻(linum lewisii)、那旁亚麻(linum narbonense)、宿根亚麻(linum perenne)、刘易斯宿根亚麻(linum perenne var.lewisii)、linum pratense、linumtrigynum、石榴(Punica granatum)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、树棉(Gossypium arboreum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、草棉(Gossypiumherbaceum)、瑟伯氏棉(Gossypium thurberi)、香蕉(Musa nana)、小果野蕉(Musa acuminata)、大蕉(Musa paradisiaca)、芭蕉某些种(Musa spp.)、油棕(Elaeis guineensis)、东方罂粟(Papaver orientale)、虞美人(Papaverrhoeas)、长果罂粟(Papaver dubium)、胡麻(Sesamum indicum)、树胡椒(Piper aduncum)、Piper amalago、狭叶胡椒(Piper angustifolium)、Piperauritum、萎叶(Piper betel)、毕澄茄(Piper cubeba)、荜菝(Piper longum)、胡椒(Piper nigrum)、假荜菝(Piper retrofractum)、Artanthe adunca、Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piper elongatum、Steffensiaelongata、大麦(Hordeum vulgare)、芒颖大麦草(Hordeum jubatum)、鼠大麦(Hordeum murinum)、黑麦状大麦草(Hordeum secalinum)、栽培二棱大麦(Hordeum distichon)、三叉大麦(Hordeum aegiceras)、栽培六棱大麦(Hordeum hexastichon.、Hordeum hexastichum)、不规则型大麦(Hordeumirregulare)、大麦(Hordeum sativum)、黑麦状大麦草(Hordeum secalinum)、燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、野燕麦原变种(Avena fatua var.sativa)、杂种野燕麦(Avena hybrida)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、石茅高粱(Sorghum halepense)、甜高粱(Sorghumsaccharatum)、高粱(Sorghum vulgare)、Andropogon drummondii、Holcusbicolor、Holcus sorghum、Sorghum aethiopicum、Sorghum arundinaceum、卡佛尔高粱(Sorghum caffrorum)、垂穗高粱草(Sorghum cernuum)、甜高粱(Sorghum dochna)、Sorghum drummondii、硬高粱草(Sorghum durra)、Sorghum guineense、Sorghum lanceolatum、多脉高粱草(Sorghumnervosum)、甜高粱(Sorghum saccharatum)、Sorghum subglabrescens、Sorghum verticilliflorum、高粱(Sorghum vulgare)、石茅高粱(Holcushalepensis)、黍(Sorghum miliaceum)(谷子(millet))、稷(Panicummilitaceum)、玉米、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticumdurum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum或Triticum vulgare)、咖啡属某些物种(Cofea spp.)、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffeacanephora)、大果咖啡(Coffea liberica)、辣椒(Capsicum annuum)、朝天椒(Capsicum annuum var.glabriusculum)、小米椒(Capsicum frutescens)、辣椒(Capsicum annuum)、普通烟(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、茄(Solanum melongena)、番茄(Lycopersicon esculentum)、番茄(Lycopersicon lycopersicum.)、梨形番茄(Lycopersicon pyriforme)、红茄(Solanum integrifolium)、番茄(Solanum lycopersicum)、可可树(Theobroma cacao)或大叶茶(Camellia sinensis)。漆树科如黄连木属(Pistacia)、芒果属(Mangifera)、腰果属(Anacardium)例如物种阿月混子(Pistacia vera)[pistachios、Pistazie]、芒果(Mangiferindica)[Mango]或腰果[Cashew]；菊科如金盏花属(Calendula)、红蓝花属(Carthamus)、矢车菊属(Centaurea)、菊苣属(Cichorium)、菜蓟属(Cynara)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、新缬草属(Locusta)、万寿菊属、缬草属(Valeriana)例如物种金盏花[Marigold]、红花[红花(safflower)]、矢车菊(Centaurea cyanus)[矢车菊(cornflower)]、菊苣[蓝费利菊(blue daisy)]、洋蓟[球蓟(Artichoke)]、向日葵[Sunflower]、莴苣(Lactuca sativa)、皱叶莴苣(Lactuca crispa)、Lactuca esculenta、毒莴苣栽培种(Lactuca scariolaL.ssp.sativa)、Lactuca scariola L.var.integrata、毒莴苣全缘叶变种(Lactuca scariola L.var.integrifolia)、生菜(Lactuca sativa subsp.romana)、Locusta communis、莴苣缬草(Valeriana locusta)[lettuce]、香叶万寿菊、万寿菊或细叶万寿菊[Marigold]；伞形科如胡萝卜属(Daucus)例如物种胡萝卜[carrot]；桦木科(Betulaceae)如榛属(Corylus)例如物种欧洲榛或土耳其榛[hazelnut]；紫草科(Boraginaceae)如琉璃苣属(Borago)例如物种琉璃苣[brorage]；十字花科如芸苔属(Brassica)、黑芥属(Melanosinapis)、白芥属(Sinapis)、拟南芥属(Arabidopsis)例如物种欧洲油菜、芜青某些物种[卡诺拉油菜、油菜籽油菜、甘蓝型油菜]、野欧白芥、芥菜、芥菜原变种(Brassicajuncea、Brassica juncea var.juncea)、皱叶芥菜、大叶芥菜、黑芥(Brassicanigra)、黑芥(Brassica sinapioides)、黑芥(Melanosinapiscommunis)[mustard]、甘蓝[fodder beet]或拟南芥；凤梨科如凤梨属(Anana)、Bromelia例如物种凤梨、Ananas ananas或Bromelia comosa[菠萝]；番木瓜科如番木瓜属(Carica)例如物种番木瓜[papaya]；大麻科如大麻属(Cannabis)例如物种大麻[hemp]；旋花科如番薯属(Ipomea)、旋花属(Convolvulus)例如物种甘薯、提琴叶牵牛花、Convolvulus batatas、Convolvulus tiliaceus、甘薯、lpomoea tiliacea、三裂叶薯(lpomoea triloba)或Convolvulus panduratus[甜马铃薯、Man of the Earth、野马铃薯]；藜科如甜菜属(Beta)即物种甜菜、甜萝卜、甜菜原变种、沿海甜菜、多年生甜菜、红甜菜或Beta vulgaris var.esculenta[甜菜(sugar beet)]；葫芦科如南瓜属(Cucurbita)例如物种印度南瓜、灰籽南瓜、西葫芦或南瓜[pumpkin、squash]；胡颓子科(Elaeagnaceae)如胡颓子属(Elaeagnus)例如物种油橄榄[olive]；杜鹃花科如山月桂属(Kalmia)例如物种宽叶山月桂(Kalmialatifolia)、窄叶山月桂(Kalmia angustifolia)、小叶山月桂(Kalmiamicrophylla)、沼泽山月桂(Kalmia polifolia)、Kalmia occidentalis、Cistuschamaerhodendros或Kalmia lucida[美洲月桂(American laurel)、阔叶月桂、calico bush、spoon wood、sheep laurel、alpine laurel、bog laurel、western bog-laurel、swamp-laurel]；大戟科如木薯属(Maniho)、Janipha、麻疯树属(Jatropha)、蓖麻属(Ricinus)，例如物种苦木薯、Janipha manihot、Jatropha manihot、Manihot aipil、manihot dulcis、Manihot manihot、Manihot melanobasis、甜木薯[木薯、竹芋(arrowroot)、tapioca、cassava]或蓖麻[castor bean、Castor Oil Bush、Castor Oil plant、Palma Christi、Wonder Tree]；豆科如豌豆属(Pisum)、合欢属(Albizia)、Cathormion、Feuillea、因加属(Inga)、围涎树属(Pithecolobium)、金合欢属(Acacia)、含羞草属(Mimosa)、苜蓿属(Medicago)、大豆属(Glycine)、扁豆属(Dolichos)、菜豆属(Phaseolus)、野大豆亚属(Soja)例如物种豌豆、饲料豌豆、早生矮豌豆[豌豆]、Albizia berteriana、合欢(Albizia julibrissin)、大叶合欢(Albizialebbeck)、Acacia berteriana、Acacia littoralis、Albizia berteriana、Albizziaberteriana、Cathormion berteriana、Feuillea berteriana、Inga fragrans、Pithecellobium berterianum、Pithecellobium fragrans、Pithecolobiumberterianum、Pseudalbizzia berteriana、Acacia julibrissin、Acacia nemu、Albizia nemu、Feuilleea julibrissin、Mimosa julibrissin、Mimosa speciosa、Sericanrda julibrissin、Acacia lebbeck、Acacia macrohylla、Albizia lebbek、Feuilleea lebbeck、Mimosa lebbeck、Mimosa speciosa[bastard logwood、silk tree、East Indian Walnut]、紫花苜蓿、野苜蓿、杂交苜蓿[苜蓿]、大豆、Dolichos soja、宽叶蔓豆(Glycine gracilis)、Glycine hispida、Phaseolusmax、Soja hispida或Soja max[大豆]；牻牛儿苗科如天竺葵属(Pelargonium)、椰子属(Cocos)、Oleum例如物种椰子(Cocos nucifera)、椰香天竺葵或Oleum cocois[椰子]；禾本科如甘蔗属(Saccharum)例如物种甘蔗；核桃科(Juglandaceae)如核桃属、Wallia例如物种核桃(Juglans regia)、Juglans ailanthifolia、山核桃(Juglans sieboldiana)、灰核桃(Juglanscinerea)、Wallia cinerea、Juglans bixbyi、加州黑核桃(Juglans californica)、印度黑核桃(Juglans hindsii)、Juglans intermedia、Juglans jamaicensis、大核桃(Juglans major)、Juglans microcarpa、黑核桃(Juglans nigra)或Wallia nigra[walnut、black walnut、common walnut、Persian walnut、white walnut、butternut、black walnut]；樟科如鳄梨属(Persea)、月桂属(Laurus)例如物种月桂[bay、laurel、bay laurel、sweet bay]、鳄梨、Perseagratissima或Persea persea[鳄梨(avocado)]；豆科如落花生属(Arachis)例如物种落花生[花生]；亚麻科(Linaceae)如亚麻属(Linum)、Adenolinum例如物种亚麻、linum humile、奥地利亚麻、linum bienne、窄叶亚麻、泻亚麻、金黄亚麻、大花亚麻(linum grandiflorum、Adenolinum grandiflorum)、刘易斯亚麻、那旁亚麻、宿根亚麻、刘易斯宿根亚麻、linum pratense、linumtrigynum[亚麻(flax)、亚麻籽(inseed)]；千屈菜科(Lythrarieae)如石榴属(Punica)例如物种石榴；锦葵科如棉属(Gossypium)例如物种陆地棉、树棉、海岛棉、草棉或瑟伯氏棉[棉属植物]；芭蕉科(Musaceae)如芭蕉属(Musa)例如物种香蕉、小果野蕉(Musa nana)、大蕉(Musa acuminata)、芭蕉属某些物种(Musa spp.)[banana]；柳叶菜科(Onagraceae)如Camissonia、月见草属(Oenothera)例如物种月见草(Oenothera biennis或Camissoniabrevipes)[报春花(primose)、晚报春花(evening primose)]；棕榈科(Palmae)如油棕属(Elacis)例如物种油棕[oil plam]；罂粟科如罂粟属(Papaver)例如物种东方罂粟、虞美人、长果罂粟[罂粟(poppy)、东方罂粟(oriental poppy)、corn poppy、田野罂粟(field poppy)、shirley poppies、田野罂粟、长果罂粟(long-headed poppy)、长荚罂粟(long-pod poppy)]；胡麻科(Pedaliaceae)如胡麻属(Sesamum)例如物种胡麻[sesame]；胡椒科(Piperaceae)如胡椒属(Piper)、Artanthe、草胡椒属(Peperomia)、Steffensia例如物种树胡椒、Piper amalago、狭叶胡椒、Piper auritum、萎叶、毕澄茄、荜菝、胡椒、假荜菝、Artanthe adunca、Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piperelongatum、Steffensia elongata[Cayenne pepper、野胡椒(wild pepper)]；禾本科如大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、高粱属(Sorghum)、须芒草属(Andropogon)、绒毛草属(Holcus)、黍属(Panicum)、稻属(Oryza)、玉米属(Zea)、小麦属(Triticum)例如物种大麦、芒颖大麦草、鼠大麦、黑麦状大麦草、栽培二棱大麦、三叉大麦(Hordeum aegiceras)、栽培六棱大麦、栽培六棱大麦、不规则型大麦、大麦、黑麦状大麦草[大麦、薏米(pearl barley)、狐尾大麦(foxtail barley)、wall barley、草地大麦(meadow barley)]、黑麦(Secale cereale)[黑麦]、燕麦、野燕麦、比赞燕麦、野燕麦原变种、杂种野燕麦、两色蜀黍、石茅高粱、甜高粱、高粱(Sorghumvulgare)、Andropogon drummondii、Holcus bicolor、Holcus sorghum、Sorghum aethiopicum、Sorghum arundinaceum、卡佛尔高粱(Sorghumcaffrorum)、垂穗高粱草、甜高粱(Sorghum dochna)、Sorghumdrummondii、硬高粱草、Sorghum guineense、Sorghumlanceolatum、多脉高粱草、甜高粱、Sorghum subglabrescens、Sorghum verticilliflorum、高粱、石茅高粱、黍、稷[高粱(Sorghum)、谷子(millet)]、稻、阔叶野生稻(Oryza latifolia)[rice]、玉米(Zea mays)[谷物(corn)、玉米]、普通小麦、硬粒小麦、圆柱小麦、Triticum hybernum、马卡小麦、普通小麦(Triticumsativum或Triticum vulgare)[小麦、面包小麦(bread wheat)、commonwheat]、山龙眼科(Proteaceae)如澳洲坚果黍(Macadamia)例如物种澳洲坚果(Macadamia intergrifolia)[macadamia]；茜草科如咖啡属(Coffea)例如咖啡属某些物种、小果咖啡、中果咖啡或大果咖啡[咖啡]；玄参科如毛蕊花属(Verbascum)例如物种毛瓣毛蕊花(Verbascum blattaria)、南欧毛蕊花(Verbascum chaixii)、密花毛蕊花(Verbascum densiflorum)、Verbascumlagurus、长叶毛蕊花(Verbascum longifolium)、Verbascum lychnitis、黑毛蕊花(Verbascum nigrum)、奥林匹克毛蕊花(Verbascum olympicum)、抱茎毛蕊花(Verbascum phlomoides)、紫花毛蕊花(Verbascum phoenicum)、Verbascum pulverulentum或毛蕊花(Verbascum thapsus)[毛蕊花(mullein)、白蛾毛蕊花(white moth mullein)、荨麻叶毛蕊花(nettle-leavedmullein)、密花毛蕊花(dense-flowered mullein)、银色毛蕊花(silver mullein)、长叶毛蕊花、白色毛蕊花(white mullein)、深色毛蕊花(dark mullein)、希腊毛蕊花(greek mullein)、橙色毛蕊花(orange mullein)、紫花毛蕊花(purplemullein)、灰白毛蕊花(hoary mullein)、大毛蕊花(great mullein)]；茄科如辣椒属(Capsicum)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)例如物种辣椒、朝天椒、小米椒([辣椒]、辣椒[红辣椒(paprika)]、普通烟、花烟草(Nicotiana alata)、渐狭叶烟草(Nicotianaattenuate)、光烟草(Nicotiana glauca)、郎氏烟草(Nicotiana langsdorffii)、Nicotiana obtusifolia、裂叶烟草(Nicotiana quadrivalvis)、浅波烟草(Nicotiana repanda)、黄花烟草(Nicotiana rustica)、林烟草(Nicotianasylvestris)[烟草]、马铃薯[马铃薯]、茄子[egg-plant]、番茄(Lycopersiconesculentum)、番茄(Lycopersicon lycopersicum)、梨形番茄、红茄或番茄(Solanum lycopersicum)[番茄]；梧桐科(Sterculiaceae)如可可属(Theobroma)例如物种可可树[可可]；山茶科(Theaceae)如山茶属(Camellia)例如物种大叶茶[茶]。

原则上可以通过本领域技术人员已知的全部方法将本发明的核酸、表达盒或载体导入生物，例如植物中。核酸序列的导入产生重组生物或转基因生物。

除非另外说明，如本文中所用的术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可互换地使用。除非另外说明，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本上下文中可互换地使用。术语“序列”可以涉及多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白质，这取决于使用术语“序列”的上下文。如本文中使用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”指任意长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。所述术语仅指分子的一级结构。

如本文中使用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、”核苷酸序列”或”核酸分子”包括双链和单链DNA和RNA。它们也包括已知类型的修饰，例如甲基化、“帽化”、用类似物替换一个或多个天然存在的核苷酸。优选地，本发明的DNA序列或RNA序列包含编码本文中所定义多肽的编码序列。

编码选自由表II中所公开多肽组成的组中的活性的本发明基因也称为“DRCP基因”。

“编码序列”是在置于适宜调节序列的控制下时被转录成mRNA和/或翻译成多肽的核苷酸序列。该编码序列的边界由5’-末端处的翻译起始密码子和3’-末端处的翻译终止密码子决定。编码序列可以包括但不限于mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因组DNA，同时内含子也可以在某些情况下存在。

外来基因转移至植物基因组中的过程称作转化。在进行转化时，描述用于转化并从植物组织或植物细胞再生出植物的方法用于瞬时转化或稳定转化。合适的方法是借助聚(乙二醇)诱导DNA摄取的原生质体转化法、使用基因枪的“生物弹射击法”-称作粒子轰击法、电穿孔法、在DNA溶液中孵育干燥胚、微量注射法和农杆菌介导的基因转移法。例如在B.Jenes等人，Techniq ues for Gene Transfer，在：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编著，Academic Press(1993)128-143；以及在Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中描述了所述方法。待表达的核酸或构建体优选地克隆入适于转化根癌农杆菌的载体，例如pBin19(Bevan等人，Nucl.AcidsRes.12(1984)8711)。通过这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于植物转化，尤其作物植物转化，例如烟草植物，例如通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后在合适的培养基中培育它们。借助根癌农杆菌转化植物例如由和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述或尤其从F.F.White，用于高等植物中基因转移的载体(Vectorsfor Gene Transfer in Higher Plants)；在Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，第15-38页中获知。

被本发明表达载体转化的农杆菌同样可以按照本身已知的方式用于植物如试验植物，如拟南芥属植物或作物植物，如禾谷类作物、谷物、燕麦、黑麦、大麦、小麦、大豆、稻、棉属植物、甜菜、卡诺拉油菜、向日葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、番茄、胡萝卜、红辣椒、油籽油菜、木薯(tapioca)、木薯(cassava)、竹芋、万寿菊、苜蓿、莴苣和多种树、坚果和藤物种、尤其含油作物植物如大豆、落花生、蓖麻植物、向日葵、谷物、棉属植物、亚麻、油籽油菜、椰子、油棕、红花(Carthamus tinctorius)或可可豆的转化，例如通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后在合适的培养基中培育它们。基因修饰的植物细胞可以通过本领域技术人员已知的全部方法再生。适宜的方法可以参考在上文提及的S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或

和Willmitzer的出版物中找到。

因此，本发明的又一方面涉及由本发明的至少一种核酸序列、表达盒或载体所转化的转基因生物以及细胞、细胞培养物、组织、部分-在植物生物的情况下，例子叶、根等-或从这类生物衍生的繁殖材料。术语“宿主生物”、“宿主细胞”、“重组(宿主)生物”和“转基因(宿主)细胞”在这里可互换地使用。当然，这些术语不仅指特定的宿主生物或特定的靶细胞，还指这些生物或细胞的子嗣或可能子嗣。既然某些修饰可以因突变或环境影响而出现于后续世代中，故这些子嗣实际上无需与亲本细胞完全相同，然而无论如何它们仍被此处所用的该术语包括。为本发明的目的，“转基因的”或“重组”例如就核酸序列、表达盒(＝基因构建体、核酸构建体)或含有本发明核酸序列的载体或由本发明核酸序列、表达盒或载体所转化的生物而言，意指通过基因工程法产生的全部那些构建体，在所述构建体中a)在表I第5列或第7列中所述的核酸序列或其衍生物或其部分，或b)与(a)中所述核酸序列功能性连接的遗传控制序列，例如3’-和/或5’-遗传控制序列，如启动子或终止子，或c)(a)和(b)不位于它们天然的遗传环境中或已经通过基因工程方法被修饰，其中所述修饰可以例如是替换、添加、倒位或插入一个或多个核苷酸残基。“天然遗传环境”意指起源生物中或宿主生物内部的天然基因组座位或染色体座位或存在于基因组文库中。在基因组文库的情况下，优选地保留，至少部分地保留该核酸序列的天然遗传环境。该环境位于所述核酸序列的至少一侧边缘并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1,000bp，最优选至少5,000bp序列长度。天然存在的表达盒-例如本发明核酸序列的天然启动子与相应Δ-8-去饱和酶基因、Δ-9-延伸酶基因和/或Δ-5-去饱和酶基因的天然存在组合-在前述这些基因通过非天然、合成(人工)方法例如诱变法修饰时变成转基因表达盒。适宜的方法例如在US 5,565,350或WO00/15815中描述。

对本发明核酸、表达盒或载体合适的生物或宿主生物有利地原则上是适用于表达如上文所述重组基因的全部生物。可以提到的其它例子是植物，如拟南芥属、菊科如金盏花属植物，或作物植物如大豆、落花生、蓖麻油植物、向日葵、亚麻、谷物、棉属植物、亚麻、油籽油菜、椰子、油棕、红花或可可豆。在本发明的一个实施方案中，本发明核酸、表达盒或载体的宿主植物选自谷物、大豆、油籽油菜(包括卡诺拉油菜和冬油籽油菜)、棉属植物、小麦和稻。

本发明又一目的涉及核酸构建体(例如表达盒)用于转化植物细胞、组织或植物部分的用途，其中所述的核酸构建体包含编码表II中所示多肽的DNA序列或与这种DNA序列杂交的DNA序列。在这样做时，根据启动子的选择，表I中所示的序列可以特异性地表达于叶、种子、根瘤、根、茎或植物其它部分中。过量产生表I中所示序列的那些转基因植物、其繁殖材料连同其植物细胞、组织或部分是本发明的又一目的。此外，含有表I序列的本发明表达盒或核酸序列或构建体也可以用于转化例如上文确定的生物，如细菌、酵母、丝状真菌和植物。

在本发明的范围内，提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性例如意指与非基因修饰的初始植物相比，人为获得的提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性的性状至少持续至少一个植物世代的时间，其中所述的性状因功能性表达或过量表达由表I第5列或第7列中所述的相应核酸分子和/或同源物所编码的表II多肽序列引起。

另外，由表I第5列或第7列中所述的相应核酸分子和/或同源物编码的表II多肽序列的组成型表达是有利的。但是，另一方面，诱导型表达也可能似乎是想要的。本发明多肽序列的表达可以是在细胞浆中精确“直接”的，例如源自胞核转化或编码的基因，或是在细胞器，优选地在宿主细胞、优选植物细胞质体中精确“直接”的。可以确定由如表I第5列或第7列中所述的相应核酸分子和/或同源物编码的表II序列的表达效率，例如在体外通过苗端分生组织繁殖确定。此外，可以在温室试验中对试验植物检验表II序列的天然受调节的表达和水平及其对胁迫抗性的影响，其中所述的表II序列由如表I第5列或第7列中所述的相应核酸分子和/或同源物编码。

本发明的一个额外目的包括转基因生物，如被表达盒转化的转基因植物，其中所述表达盒含有如本发明的表I第5列或第7列中所述的序列或与之杂交的DNA序列，以及此类植物的转基因细胞、组织、部分和繁殖材料。在这种情况下特别优选转基因作物植物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、谷物、大豆、稻、棉属植物、甜菜、油籽油菜和卡诺拉油菜、向日葵、亚麻、大麻、蓟、马铃薯、烟草、番茄、木薯(tapioca)、木薯(cassava)、竹芋、苜蓿、莴苣和多种树、坚果和藤物种。在本发明的一个实施方案中，被表达盒转化的转基因植物选自包含谷物、大豆、油籽油菜(包括卡诺拉油菜和冬油籽油菜)、棉属植物、小麦和稻的组，其中所述表达盒含有如本发明的表I第5列或第7列中所述的序列或与之杂交的DNA序列。

为了本发明的目的，植物是单子叶植物和双子叶植物、苔藓植物或藻类植物。本发明的又一体现是如上所述的转基因植物，其含有本发明的核酸序列或构建体或者本发明的表达盒。

但是，转基因也意指尽管本发明核酸位于它们在生物基因组中的天然位置内，然而所述序列相对于天然序列而言已经被修饰，和/或所述天然序列的调节序列已经被修饰。优选地，转基因/重组将理解为意指本发明和表1中所示的核酸转录在基因组的非天然位置处发生，也就是说，该核酸的表达是同源的或优选地是异源的。这种表达可以是瞬时的或是稳定整合到基因组的序列的表达。根据本发明使用的术语“转基因植物”也指转基因植物的子代，例如T₁、T₂、T₃和后续植物世代或BC₁、BC₂、BC₃和后续植物世代。因此，可以将本发明的转基因植物培育并自交或与其他个体杂交，目的是获得本发明的进一步的转基因植物。转基因植物也可以通过营养地繁殖转基因植物细胞而获得。本发明也涉及转基因植物材料，其可以从本发明的转基因植物群体衍生。这种材料包括处于其全部表现形式的植物细胞和植物的某些组织、器官和部分，如种子、叶、花药、须根、块茎、根、根毛、茎、胚、愈伤组织、子叶、叶柄、收获的材料、植物组织、生殖组织和细胞培养物，它们从实际的转基因植物衍生和/或可以用于产生转基因植物。根据本发明获得的任意的转化植物可以用于常规育种方案中或体外植物繁殖中来产生更多的具有相同特征的转化植物和/或可以在相同或相关物种的其他品种中用来导入相同的特征。此类植物也是本发明的部分。从转化植物中遗传地获得的种子也含有相同的特征并且是本发明的部分。如前文提及，本发明原则上适用于可以用本领域技术人员已知的任意转化方法转化的任意植物和作物。

有利的诱导型植物启动子例如是PRP1启动子[Ward等人，Plant.Mol.Biol.22(1993)，361-366]、苯磺酰胺可诱导的启动子(EP 388186)、四环素可诱导的启动子[Gatz等人，(1992)Plant J.2，397-404]、水杨酸可诱导的启动子(WO95/19443)、脱落酸可诱导的启动子(EP 335528)和乙醇或环己醇可诱导的启动子(WO93/21334)。可以有利使用的植物启动子的其它例子是来自马铃薯的胞浆FBP酶启动子、来自马铃薯的ST-LSI启动子(Stockhaus等人，EMBO J.8(1989)2445-245)、来自大豆的磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶启动子(也见Genebank登录号U87999)或如EP 249676中所述的根瘤(nodiene)特异性启动子。特别有利的是当环境性胁迫例如干旱或寒冷或由植物疾病引起的生物胁迫早期开始时确保表达的那些启动子。在一个实施方案中，种子特异性启动子可以用于单子叶或双子叶植物。

原则上，可以使用具有其调节序列的全部天然启动子，如上文对本发明表达盒和本发明方法所提及的那些天然启动子。除此之外，也可以有利地使用人工启动子。在表达盒的制备中，可以操作多种DNA片段，目的是获得以正确方向有效读出并配置以正确可读框的核苷酸序列。为了相互连接DNA片段(＝本发明的核酸)，可以将衔接头或接头连接于所述片段。可以在转录方向上有效地提供具有接头或多接头的启动子区和终止子区，其中所述接头或多接头含有用于插入该序列的一个或多个限制性位点。通常，该接头具有1至10个、大多数是1至8个、优选地2至6个限制性位点。通常，在调节区域内部的接头的大小为小于100bp、经常小于60bp，不过至少是5bp。启动子可以相对于宿主生物(例如相对于宿主植物)是天然或同源的以及是外来或异源的。在5’→3’转录方向上，表达盒含有启动子、表I中所示DNA序列和用于转录终止的区域。不同的终止区可以按照任意需要的方式相互交换。

也如本文中所用，术语“核酸”和“核酸分子”意图包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)和使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。该术语还包括位于基因的编码区3’末端和5’末端处的非翻译序列：距离该编码区5’末端上游至少约1000个核苷酸的序列和距离该基因的编码区3’末端下游至少约200个核苷酸的序列。核酸分子可以是单链的或双链的，但优选是双链DNA。“分离的”核酸分子是与该核酸的天然来源中存在的其他核酸分子实质上分开的核酸分子。这意指基于预期核酸的量，其它核酸分子以小于5％重量、优选小于2％重量、更优选小于1％重量、最优选小于0.5％重量的量存在。优选地，“分离的”核酸不含在衍生该核酸的生物的基因组DNA中天然分布于该核酸侧翼的一些序列(即，位于该核酸5’端和3’端处的序列)。例如，在多个实施方案中，分离的编码胁迫相关蛋白的核酸分子可以含有在细胞的基因组DNA中天然分布于该核酸分子侧翼的小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，其中从所述细胞衍生该核酸分子。此外，“分离”的核酸分子如cDNA分子可以不含与该核酸分子天然关联的某些其余细胞物质，或通过重组技术产生时，不含培养基，或当化学地合成时，不含化学前体或其他化学品。

可以使用标准分子生物学技术和本文提供的序列信息分离本发明的核酸分子，例如编码在植物中赋予环境胁迫耐受性和/或抗性的DRCP或其部分的核酸分子。例如，编码拟南芥胁迫相关性蛋白的cDNA可以从拟南芥cDNA文库分离，或者编码集胞藻物种、欧洲油菜、大豆、玉米或稻胁迫相关蛋白的cDNA可以使用表I中所示序列之一的全长序列或部分序列从集胞藻物种、欧洲油菜、大豆、玉米或稻cDNA文库分别分离。此外，包含表I中所示序列之一的全长序列或部分序列的核酸分子可以通过引物聚合酶链反应，使用基于该序列所设计的寡核苷酸进行分离。例如，可以从植物细胞(例如通过Chirgwin等人，1979 Biochemistry18：5294-5299的硫氰酸胍提取法)分离mRNA并且可以使用逆转录酶(例如从Gibco/BRL，Bethesda，MD可获得的Moloney MLV逆转录酶；或从Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL可获得的AMV逆转录酶)制备cDNA。可以基于表1中所示核苷酸序列之一设计用于聚合酶链反应扩增的合成性寡核苷酸引物。可以使用cDNA或备选地使用基因组DNA作为模板和适宜的寡核苷酸引物，根据标准PCR扩增技术扩增本发明的核酸分子。如此扩增的核酸分子可以克隆到适宜的载体中并且通过DNA序列分析表征。此外，可以通过标准合成技术，例如使用自动化DNA合成仪，制备与编码DRCP的核苷酸序列相对应的寡核苷酸。在一个优选的实施方案中，本发明的分离的核酸分子包含编码DRCP的表1中所示核苷酸序列之一(即“编码区”)，以及5’非翻译序列和3’非翻译序列。此外，本发明核酸分子可以仅包含表I中所示核苷酸序列序列之一的编码区的一部分，例如，可以用作探针或引物的片段或编码DRCP的生物学活性部分的片段。

由编码DRCP的本发明核酸分子所编码的蛋白质的部分优选地是本文中所述的生物学活性部分。如本文中所用，术语DRCP的“生物学活性部分”意图包括参与植物中胁迫耐受性和/或抗性应答的胁迫相关性蛋白的一部分，例如，结构域/基序。为确定DRCP或其生物学活性部分是否在植物中导致提高的胁迫抗性，可以开展包含DRCP的植物的胁迫分析。此类分析方法是本领域技术人员熟知的，如在实施例中所详述。更具体地，编码DRCP的生物学活性部分的核酸片段可以通过分离表I核酸序列之一的一部分，表达该DRCP或肽的编码部分(例如通过体外重组表达)并评估该DRCP或肽的编码部分的活性进行制备。DRCP的生物学活性部分由本发明包括并包括这样的肽，所述肽包含从编码DRCP的基因的氨基酸序列或与DRCP同源的蛋白质的氨基酸衍生的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含比全长DRCP或同源于DRCP的全长蛋白更少的氨基酸并且显示DRCP的至少某种酶活性或生物学活性。一般而言，生物学活性部分(例如具有例如5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100个或更多氨基酸长度的肽)包含具有至少一种DRCP活性的结构域或基序。另外，可以通过重组技术制备该蛋白质的其他区域被缺失的其他生物学活性部分并且对其评价本文所述的一种或多种活性。优选地，DRCP的生物学活性部分包含一个或多个所选结构域/基序或其具有生物学活性的部分。术语“生物学活性部分”或“生物学活性”意指如表II第3列中所述多肽或所述多肽的部分，该部分仍具有天然或起始的酶或蛋白质的至少10％或20％、优选20％、30％、40％或50％、特别优选60％、70％或80％的酶活性或生物学活性。

在本发明的方法中，可以使用根据需要含有合成性、非天然或修饰的核苷酸碱基的核酸序列，其中所述核苷酸碱基可以掺入DNA或RNA。所述合成性、非天然或修饰的核苷酸碱基可以例如提高核酸分子在细胞外部或内部的稳定性。本发明的核酸分子可以含有与前述相同的修饰。

如本上下文中所用，术语“核酸分子”也可以包括位于编码基因区3’末端和5’末端处的非翻译序列，例如该编码区5’末端上游的序列的至少500个、优选200个、特别优选100个核苷酸和该编码基因区域3’末端下游的序列的至少100个、优选50个、特别优选20个核苷酸。出于克隆和表达目的，仅选择编码区经常是有利的。

优选地，在本发明方法中使用的核酸分子或本发明的核酸分子是分离的核酸分子。

“分离的”多核苷酸或核酸分子与存在该核酸的天然来源中的其他多核苷酸或核酸分子分开。分离的核酸分子可以几个kb的染色体片段，或优选地是仅包含基因编码区的分子。本发明的分离的核酸分子可以包含这样的染色体区，所述染色体区是毗邻的5’和3’区域或其他毗邻的染色体区，不过优选地不包含此类序列，其中所述序列在衍生该核酸分子的生物中天然分布于基因组或染色体环境下的该核酸分子序列侧翼(例如毗邻于编码该核酸分子的5’-与3’-UTR的序列)。在多个实施方案中，在本发明方法中使用的分离的核酸分子可以例如包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列在衍生该核酸分子的细胞的基因组DNA中天然分布于该核酸分子侧翼。

可以使用分子生物学标准技术和本文中提供的序列信息分离在该方法中使用的核酸分子，例如，本发明的多核苷酸或其部分。另外，例如可以借助比较算法在DNA水平或氨基酸水平鉴定同源序列或同源保守序列区。前者可以用作标准杂交技术下的杂交探针(例如在Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中所述的那些)用于分离在本方法中有用的其他核酸序列。

包含本方法中所用核酸分子(例如本发明多核苷酸)的全长序列、或其部分的核酸分子可以使用基于该序列或基于其部分的寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应额外地进行分离。例如，包含该全长序列或其部分的核酸分子可以使用已经基于这个精确序列所产生的寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应进行分离。例如，mRNA可以从细胞分离(例如借助Chirgwin等人(1979)Biochemistry 18：5294-5299的硫氰酸胍提取法)并且可以借助逆转录酶(例如从Gibco/BRL，Bethesda，MD可获得的莫洛尼鼠MLV逆转录酶，或从Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL可获得的AMV逆转录酶)产生cDNA。

例如，如表III第7列中所示的用于聚合酶链反应扩增的合成性寡核苷酸引物可以基于本文所示序列(例如表I第5列和第7列中所示序列或从表II第5列和第7列衍生的序列)产生。

此外，可以通过用本发明核酸分子所编码的多肽，尤其用表I第5列或第7列中所示核酸分子所编码的序列实施蛋白质序列比对而鉴定保守蛋白，从其中可以衍生保守区并进而衍生简并引物。保守区是在不同来源的几种同源物的一个特定位置内显示极小氨基酸变异的那些区域。如表IV第7列中所示的共有序列和多肽基序从所述比对衍生，并且代表此类保守的蛋白质区域。此外，可以通过用本发明核酸分子所编码的多肽，尤其用表II第5列或第7列中所示蛋白质分子所编码的序列实施蛋白质序列比对而鉴定来自多种生物的保守区，从其中可以衍生保守区并进而衍生简并引物。在一个有利的实施方案中，在本发明方法中提高了包含表IV第7列中所述共有序列或多肽基序或由表IV第7列中所述共有序列或多肽基序组成的多肽的活性，并且在另一个实施方案中，本发明涉及包含表IV第7列中所述共有序列或多肽基序或由表IV第7列中所述共有序列或多肽基序组成的多肽，其中20个或更少、优选15或10个、优选9、8、7或6个、更优选5或4个、甚至更优选3个、甚至更优选2个、甚至更优选1个、最优选0个所示氨基酸位置可以由任意氨基酸替换。在一个实施方案中，不超过15％、优选10％、甚至更优选5％、4％、3％或2％、最优选1％或0％由一个字母所示的氨基酸位置由另一个氨基酸替换。在一个实施方案中，将20个或更少、优选15或10个、优选9、8、7或6个、更优选5或4个、甚至更优选3个、甚至更优选2个、甚至更优选1个、最优选0个氨基酸插入共有序列或蛋白质基序。该共有序列从如表II中所列出序列的多重比对结果衍生。字母代表单字母氨基酸代码，并表示所述氨基酸在至少80％的所比对蛋白质中是保守的，而字母X代表在至少80％的所比对序列中不是保守的。该共有序列始于比对结果中的第一个保守氨基酸并且止于所研究序列的比对结果中的最末保守氨基酸。给定X的数字表示保守氨基酸残基之间的距离，例如Y-x(21，23)-F意指比对结果中保守的酪氨酸残基和苯丙氨酸残基彼此由全部所研究序列的比对结果中的最少21个氨基酸残基和最多23个氨基酸残基隔开。保守结构域从全部序列鉴定到并且使用标准Prosite注解的子集描述，例如模式Y-x(21，23)-[FW]意指一个保守酪氨酸被最少21个氨基酸残基和最多23个氨基酸残基与苯丙氨酸或色氨酸隔开。模式必须匹配至少80％所研究的蛋白质。保守模式用软件工具MEME版本3.5.1或手工地鉴定。MEME由美国加利福尼亚州圣迭哥市加利福尼亚大学计算机科学与工程系的TimothyL.Bailey和Charles Elkan开发和并且由Timothy L.Bailey和CharlesElkan描述[通过预期最大化拟合混合模型以发现生物聚合物的中基序(Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs inbiopolymers)，第二届国际分子生物学人工智能系统大会论文集(Proceedings of the Second International Conference on IntelligentSystems for Molecular Biology)，第28-36页，AAAI Press，Menlo Park，California，1994]。独立程序的源代码是公众从圣迭哥超级计算中心可获得的(http://meme.sdsc.edu)。为了使用软件工具MEME鉴定全部序列中的共同基序，使用以下设置：-最大尺度500000，-基序数目15，-evt 0.001，-maxw 60，-距离1e-3，-用于分析的序列的最少位点数目。MEME的输入序列是Fasta格式下的未比对序列。其他参数以该软件版本的默认设置使用。用软件工具Pratt版本2.1或手工地产生保守结构域的Prosite模式。Pratt由挪威卑尔根大学信息学系Inge Jonassen开发并且由Jonassen等人描述[I.Jonassen，J.F.Collins和D.G.Higgins，发现未比对蛋白质序列中的柔性模式(Finding flexible patterns in unaligned protein sequences)，Protein Science 4(1995)，第1587-1595页；I.Jonassen，使用模式图形高效发现保守模式(Efficient discovery of conserved patterns using a patterngraph)，1997年2月提交至CABIOS]。独立程序的源代码(ANSI C)是公众例如在已建立的生物信息学中心如EBI(欧洲生物信息学研究所)可获得的。为用软件工具Pratt产生模式，使用以下设置：PL(最大模式长度)：100，PN(模式符号的最大数目)：100，PN(连续x ′s的最大数目)：30，PN(柔性间隔区的最大数目)：5，FL(最大柔性)：30，FP(最大Flex.产物)：10，ON(模式的最大数目)：50.Pratt的输入序列是蛋白质序列的独特区域，所述区域显示如软件MEME所鉴定那样的高度相似性。应当匹配于所产生模式的序列的最小数目(CM，匹配序列的最小数目)设置成所产生序列的至少80％。这里未提及的参数以其默认设置使用。保守结构域的Prosite模式可以用来搜索匹配该模式的蛋白质序列。多个已建立的生物信息学中心提供在数据搜索中使用这些模式的公众互联网接口(例如PIR[位于乔治城大学医学中心的蛋白质信息资源(ProteinInformation Resource)]或ExPASy[蛋白质分析专家系统(Expert ProteinAnalysis System)])。备选地，可获得独立软件，如作为EMBOSS软件包组成部分的程序Fuzzpro。例如，程序Fuzzpro不仅允许搜索精确模式蛋白质匹配，还允许在执行的搜索中设置各种模糊性。比对用软件ClustalW(1.83版本)执行并且由Thompson等人[Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W：借助序列加权、位置特异性空位罚分和加权矩阵选择作用改善累进多重序列比对的灵敏度.Nucleic Acids Research，22：4673-4680]描述。独立程序的源代码是公众从德国海德堡欧洲分子生物学实验室可获得的。使用ClustalWv1.83的默认参数(空位开口罚分：10.0；空位延伸罚分：0.2；蛋白质矩阵：Gonnet；蛋白质/DNA末端空位：-1；蛋白质/DNA空位距离：4)执行分析。

简并引物随后可以用于PCR来扩增新蛋白质的片段，其中所述的新蛋白质具有上文提及的活性，例如，在提高表达或活性或具有如表II第3列中所示蛋白质或来自其他生物的本发明多肽的其他功能性同源物的活性后，赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性。

这些片段随后可以用作杂交探针以分离完整的基因序列。作为备选，失去的5’和3’序列可以借助RACE-PCR分离。可以使用cDNA或作为备选，使用基因组DNA作为模板和合适的寡核苷酸引物，按照标准PCR扩增技术扩增本发明的核酸分子。如此扩增的核酸分子可以克隆至合适的载体并借助DNA序列分析进行表征。与本方法中所用核酸分子之一相对应的寡核苷酸可以通过标准合成方法产生，例如使用自动DNA合成仪产生。

有利于本发明方法的核酸分子可以基于它们与本文中所公开核酸分子的同源性，使用所述序列或其部分作为杂交探针并按照标准杂交技术在严格杂交条件下予以分离。在本上下文中，可以使用例如，长度至少15、20、25、30、35、40、50、60或更多个核苷酸、优选至少15、20或25个核苷酸的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子在严格条件下与上述核酸分子杂交、尤其与以下这些核酸分子杂交，其中所述的核酸分子包含在本发明方法中使用的核酸分子的或编码在本发明中使用的蛋白质的或本发明核酸分子的核苷酸序列。也可以使用具有30、50、100、250个或更多个核苷酸的核酸分子。

术语“同源性”意指相应核酸分子或所编码的蛋白质是功能上和/或结构上同等的。同源于上文所述核酸分子并且作为所述核酸分子的衍生物的核酸分子例如是所述核酸分子的变种，该变种代表具有相同生物学功能的变体，尤其代表编码具有相同或基本上相同生物学功能的蛋白质的变体。它们可以是天然存在变种(如来自其他植物品种或物种的序列)或突变体。这些突变体可以天然存在的或可以通过诱变技术获得。等位变种可以是天然存在的等位变体以及人工产生或基因改造的变体。结构性等同物可以例如通过检验所述多肽对抗体的结合作用或基于计算机的预测进行鉴定。结构性等同物具有相似的免疫学特征，例如包含相似表位。

就“杂交”而言，它意指此类核酸分子在常规杂交条件下、优选在例如由Sambrook(Molecular Cloning；A Laboratory Manual，2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989))或在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中描述的严格条件下杂交。

根据本发明，本发明核酸的DNA分子以及RNA分子可以作为探针使用。另外，作为用于鉴定功能性同源物的模板，可以进行RNA印迹分析以及DNA印迹分析。RNA印迹分析有利地提供关于已表达基因产物的其他信息：例如表达模式、加工步骤(如剪接和加帽)等。DNA印迹分析提供关于编码本发明核酸分子的基因的染色体定位和组织的额外信息。

严格杂交条件的优选的非限制性例子是在大约45℃于6×氯化钠/柠檬酸钠(＝SSC)中杂交，随后在50至65℃例如在50℃、55℃或60℃于0.2×SSC、0.1％SDS中的一个或多个洗涤步骤。技术人员知道这些杂交条件根据核酸类型和例如有机溶剂存在时在温度和缓冲液浓度方面不同。在“标准杂交条件”下的温度例如作为核酸类型的函数在42℃和58℃间、优选在45℃和50℃间，在浓度0.1×、0.5×、1×、2×、3×、4×或5×SSC(pH7.2)的水质缓冲液中不同。若上文提及的缓冲液中存在有机溶剂，例如50％甲酰胺，则标准条件下的温度是大约40℃、42℃或45℃。DNA:DNA杂交体的杂交条件优选地是例如0.1×SSC和20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃，优选在30℃和45℃之间。DNA:RNA杂交体的杂交条件优选地是例如0.1×SSC和30℃、35℃、40℃、45℃、50℃或55℃，优选在45℃和55℃之间。以上提及的杂交温度是例如对长度大约100bp(碱基对)及G+C含量50％的核酸在甲酰胺不存在下所确定的。熟练技术人员借助教材，例如以上提及的所述教材或从以下教材：Sambrook等人，“MolecularCloning”，Cold Spring Harbor Laboratory，1989；Hames和Higgins(编著)1985，”Nucleic Acids Hybridization：A Practical Approach”，IRL Press atOxford University Press，Oxford；Brown(编著)1991，“Essential MolecularBiology：A Practical Approach”，IRL Press at Oxford University Press，Oxford知道确定所需的杂交条件。

一个这样的严格杂交条件的又一例子是在65℃，4×SSC杂交，随后在65℃于0.1×SSC中洗涤1小时。备选地，示例性的严格杂交条件是在42℃于50％甲酰胺、4×SSC中。此外，洗涤步骤期间的条件可以从低严格条件(大约2×SSC在50℃)和高严格条件(大约0.2×SSC在50℃、优选在65℃)所界定的条件范围(20×SSC：0.3M柠檬酸钠，3M NaCl，pH 7.0)选择。另外，洗涤步骤期间的温度可以从室温(约22℃)的低严格条件提高至约65℃的更高严格性的条件。盐浓度和温度这两个参数可以同时变化，或这两个参数之一可以保持恒定而另一个参数变化。也可以在杂交期间使用变性剂，例如甲酰胺或SDS。在50％甲酰胺存在下，杂交优选地在42℃进行。可以逐个组合相关因素如i)处理过程的时长、ii)盐条件、iii)去污剂条件、iv)竞争性DNA、v)温度和vi)探针选择，因而存在本文没有提到全部的可能组合。因此，在一个优选的实施方案中，Northern印迹物与Rothi-Hybri-Quick缓冲液(Roth，Karlsruhe)在68℃预杂交2小时。采用放射标记探针的杂交在68℃过夜进行。后续洗涤步骤在68℃用1×SSC进行。对于DNA印迹分析，将膜与Rothi-Hybri-Quick缓冲液(Roth，Karlsruhe)在68℃预杂交2小时。采用放射标记探针的杂交在68℃过夜实施。随后，弃去杂交缓冲液并使用2×SSC；0.1％SDS短暂洗涤该滤膜。弃去洗涤缓冲液后，添加新的2×SSC；0.1％SDS缓冲液并在68℃孵育15分钟。该洗涤步骤进行两次，随后是使用1×SSC；0.1％SDS在68℃持续10分钟的一个额外洗涤步骤。

下文显示用于DNA杂交(DNA印迹分析)和洗涤步骤的条件的一些例子：(1)杂交条件可以选自例如以下条件：a)4×SSC在65℃，b)6×SSC在45℃，c)6×SSC，100mg/ml变性片段化鱼精DNA，在68℃，d)6×SSC，0.5％SDS，100mg/ml变性鲑精DNA，在68℃，e)6×SSC，0.5％SDS，100mg/ml变性片段化鲑精DNA，50％甲酰胺，在42℃，f)50％甲酰胺，4×SSC，在42℃，g)50％(vol/vol)甲酰胺，0.1％牛血清白蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，750mM NaCl，75mM柠檬酸钠，在42℃，h)2×或4×SSC，在50℃(低严格条件)，或i)30至40％甲酰胺，2X或4×SSC，在42℃(低严格条件)。(2)洗涤步骤可以选自例如以下条件：a)0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS，在50℃。b)0.1×SSC，在65℃。c)0.1×SSC，0.5％SDS，在68℃。d)0.1×SSC，0.5％SDS，50％甲酰胺，在42℃。e)0.2×SSC，0.1％SDS，在42℃。f)2×SSC，在65℃(低严格条件)。

从其他生物衍生的具有上文所提及活性，即赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性的多肽可以由其他DNA序列编码，其中所述其他DNA序列在放松的杂交条件下与表I第5列和第7列中所示的序列杂交并且在表达时编码与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性的肽。

另外，一些应用必须在低严格杂交条件下进行，同时对杂交的特异性无任何影响。例如，总DNA的DNA印迹分析可以用本发明的核酸分子探测并在低严格性(55℃在2×SSPE、0.1％SDS中)下洗涤。该杂交分析可能揭示仅这些基因的简单模式，其中所述基因编码本发明的或用在本发明方法中的多肽，所述多肽例如具有上文提及的与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高植物疾病抗性和生物量生产的活性。此类低严格杂交条件的又一例子是4×SSC在50℃或有30至40％甲酰胺在42℃杂交。此类分子包含下述分子，所述分子是本发明多肽或本发明方法中所用多肽的片段、类似物或衍生物并且例如因单独或组合的氨基酸和/或核苷酸缺失、插入、替代、添加和/或重组或本领域已知的任何其它修饰而不同于上述的氨基酸序列或其基础性核苷酸序列。但是，优选使用高严格杂交条件。

杂交应当有利地用至少5、10、15、20、25、30、35或40bp、有利地至少50、60、70或80bp、优选至少90、100或110bp的片段实施。最优选地是至少15、20、25或30bp的片段。也优选地用长度至少100或200bp、非常特别优选至少400bp的片段进行杂交。在一个特别优选的实施方案中，该杂交应当用完整核酸序列以如上所述条件进行。

术语“片段”、“序列的片段”或“序列的部分”意指所提到的初始序列的截短序列。截短序列(核酸或蛋白质序列)可以在长度方面大幅度地变化；其中最小尺寸是具有这样尺寸的序列，所述尺寸足以产生具有所提到初始序列的可比较功能和/或活性或与本发明核酸分子或在本发明方法中使用的核酸分子在严格条件下杂交的序列，同时最大尺寸不是重要的。在一些应用中，最大尺寸通常基本上不大于为产生该初始序列的预期活性和/或功能所需要的尺寸。

一般而言，截短的氨基酸序列具有从约5个至约310个氨基酸长度范围。更一般地，该序列将具有约250个氨基酸的最大长度，优选约200或100个氨基酸的最大长度。通常想要选择至少约10、12或15个氨基酸、至多到最大约20或25个氨基酸的序列。

术语“表位”涉及抗原中的特定免疫反应性位点，也称作抗原决定簇。这些表位可以是聚合组合物中的单体(如蛋白质中的氨基酸)的线性排列或由更复杂的二级结构或三级结构组成或包含所述结构。技术人员会认识到免疫原(即能够激发免疫应答的物质)是抗原；但是，一些抗原如半抗原无免疫原性，不过可以通过偶联至载体蛋白分子而具有免疫原性。术语“抗原”包括对下述物质的称谓，其中可以产生针对所述物质的抗体和/或该抗体特异性地与其发生免疫反应。

在一个实施方案中，本发明涉及本发明的或本发明方法中所用的多肽的表位并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性。

术语“一个或几个氨基酸”涉及至少一个氨基酸，但是不涉及超过将会产生低于50％同一性的同源性的那个氨基酸数目。优选地，该同一性大于70％或80％，更优选的是85％、90％、91％、92％、93％、94％或95％、甚至更优选的是96％、97％、98％或99％同一性。

另外，本发明的核酸分子包含这样的核酸分子，其是上文所提及核酸分子的核苷酸序列之一的互补物或其部分。互补于如表I表第5列和第7列中所述核苷酸序之一的核酸分子是这样的核酸分子，其充分地互补于如表I表第5列和第7列中所述核苷酸序之一，从而它可以与如表I表第5列和第7列中所述核苷酸序之一杂交，因而形成稳定的双链体。优选地，该杂交在严格杂交条件下进行。但是，根据技术人员熟知的核酸分子的碱基配对作用，本文所公开序列之一的互补物优选地是与所公开序列互补的序列。例如，碱基A和G与碱基T和U或C发生碱基配对，并且反之亦然。碱基的修饰能影响碱基配对作用的对应物。

本发明的核酸分子包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列至少约30％、35％、40％或45％、优选至少约50％、55％、60％或65％、更优选至少约70％、80％或90％和甚至更优选至少约95％、97％、98％、99％或更高地同源于表I第5列和第7列中所示的核苷酸序列或其部分，并且优选地具有上文所提及的活性，尤其通过例如在细胞质中或在细胞器如质体或线粒体或这两者中、优选在质体中表达而提高前述活性或如表II第3列中所示基因产物的活性，具有提高环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产的活性。

本发明的核酸分子包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列杂交至、优选在如本文定义的严格条件杂交至表I第5列和第7列中所示的核苷酸序列或其部分并且编码具有上文所提及活性的蛋白质，所述活性例如通过如在细胞质中或在细胞器如质体或线粒体或这两者中、优选在质体中表达而赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性。

此外，本发明的核酸分子可以仅包含表I第5列和第7列中所示序列的编码区的一部分，例如，可以用作探针和引物的片段或编码本发明多肽的或用于本发明方法中的多肽的生物学活性部分的片段，其中所述生物学活性部分即具有上文提及的活性，例如，如果其活性通过例如在细胞质中或在细胞器如质体或线粒体或这两者中、优选在质体中表达而提高，则引起与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产的提高。因编码本发明蛋白质的本发明基因的克隆而确定的核苷酸序列导致产生下述探针和引物，其中设计所述探针或引物以鉴定和/或克隆其他细胞类型或生物中该基因的同源物。该探针/引物一般包含基本上纯化的寡核苷酸。该寡核苷酸一般包含/括这样的核苷酸序列区，其在严格条件下与(例如表I第5列和第7列中)所述序列之一的有义链、(例如表I第5列和第7列中)所述序列之一的反义序列或其天然存在突变体的至少约12、15个、优选约20或25个、更优选约40、50或75个连续核苷酸杂交。基于本发明核苷酸的引物可以在PCR反应中使用以克隆本发明多肽的或本发明方法中所用多肽的同源物，例如，作为本发明实施例中描述的引物，例如，如实施例中所示的引物。含有表III第7列中所示引物的PCR将产生如表II第3列中所示的基因产物的片段。

引物集是能够相互交换的。本领域技术人员知道组合所述的引物以产生想要的产物，例如产生全长克隆或部分序列。基于本发明核酸分子或本发明方法中所用核酸分子的序列的探针可以用来检测编码相同或同源蛋白质的转录物或基因组序列。该探针可以还包含与其结合的标记基团，例如，此标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。此类探针可以用作基因组标记检测试剂盒的一部分用于鉴定表达本发明多肽或本发明方法中所用多肽的细胞，如通过测量细胞样品中编码性核酸分子的水平(例如检测mRNA水平)或确定包含本发明多核苷酸或本发明方法中所用多核苷酸的序列的基因组基因是否已经被突变或缺失而鉴定。

本发明的核酸分子编码这样的多肽或其部分，所述多肽包含与表II第5列和第7列中所示氨基酸序列充分同源的氨基酸序列，从而该蛋白质或其部分维持了参与同相应的非转化野生型植物细胞、植物或其部分相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产的能力，特别地，包括在植物中提高如上文提及或如实施例中描述的活性。

如本发明中所用，语言“充分同源”指具有下述氨基酸序列的蛋白质或其部分，所述氨基酸序列包含最小数目的与表II第5列和第7列所示氨基酸序列相同或等同的氨基酸残基(例如氨基酸残基，其具有与本发明多肽的序列之一中的氨基酸残基相似的侧链)，从而该蛋白质或其部分能够参与同相应的非转化野生型植物细胞、植物或其部分相比胁迫耐受性和/或抗性的提高、提高的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性。例如，具有如表II第3列中所示的和如本文所述的蛋白质的活性。

在一个实施方案中，本发明的核酸分子包含编码本发明蛋白质的一部分的核酸分子。该蛋白质至少约30％、35％、40％、45％或50％、优选至少约55％、60％、65％或70％并更优选至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％或94％并且最优选至少约95％、97％、98％、99％或更高地同源于表II第5列和第7列的完整氨基酸序列，并且具有上文提及的活性，例如，通过例如在细胞质中或在细胞器如质体或线粒体或这两者中、优选在质体中表达而赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性。

由本发明核酸分子编码的蛋白质的部分优选地是有生物学活性的，优选地具有上文提及的已注释活性，例如在提高活性后，引起相应的非转化野生型植物细胞、植物或其部分相比较而言胁迫耐受性和/或抗性提高、提高的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性。

如本文中提及，术语“生物学活性部分”意图包括这样的部分，例如结构域/基序，所述部分引起与相应的非转化野生型植物细胞、植物或其部分相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高或具有免疫学活性，从而该部分结合至与本发明多肽或本发明方法中所用多肽特异性结合的抗体，以与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高植物疾病抗性、优选地提高致病性真菌和/或线虫抗性。

本发明也涉及这样的核酸分子，该核酸分子因遗传密码的简并性而不同于表IA第5列和第7列中所示核苷酸序列(和其部分)之一，并因而编码本发明多肽，尤其具有上文所提及活性的多肽，如由表II第5列和第7列中所示序列描述的多肽或功能性同源物。有利地，本发明的核酸分子包含编码蛋白质的核苷酸序列，或在另一个实施方案中，具有编码蛋白质的核苷酸序列，其中所述蛋白质包含或在另一个实施方案中具有表II第5列和第7列中所示的氨基酸序列或功能性同源物。在又一个实施方案中，本发明的核酸分子编码与表II第5列和第7列中所示氨基酸序列或功能性同源物基本上同源的全长蛋白质。但是，在一个优选的实施方案中，本发明的核酸分子不由表I第5列和第7列中、优选不由表IA第5列和第7列中所示的序列组成。

另外，本领域技术人员知道引起氨基酸序列改变的DNA序列多态性可以存在于群体内部。编码本发明多肽或包含本发明核酸分子的基因中的这种遗传多态性可以因天然变异而存在于群体内部的个体之间。

如本发明中所用，术语“基因”和“重组基因”指这样的核酸分子，其包含编码本发明多肽的可读框或包含本发明的核酸分子或编码在本发明方法中使用的多肽，优选地来自作物植物或来自用于本发明方法中的微生物。此类天然变异一般可以在基因的核苷酸序列中产生1-5％差异。编码本发明多肽或包含本发明核酸分子的基因中作为天然变异结果并且不改变如所述功能活性的任意及全部此类核苷酸变异和所得氨基酸多态性意图属于本发明的范围。

与本发明核酸分子的天然变体同源物相对应并且也可以是cDNA的核酸分子可以基于它们与本文中公开的核酸分子的同源性，使用本发明的核酸分子或其部分作为杂交探针，根据标准杂交技术在严格杂交条件下予以分离。

因此，在另一个实施方案中，本发明的核酸分子是至少15、20、25或30个核苷酸长度。优选地，它在严格条件下与包含本发明核酸分子的核苷酸序列或本发明方法中所用核酸分子的核苷酸序列(例如包含表I第5列和第7列中所示序列)的核酸分子杂交。该核酸分子优选地是至少20、30、50、100、250或更多个核苷酸长度。

术语“在严格条件下杂交”在上文定义。在一个实施方案中，术语“在严格条件下杂交”意图描述杂交和洗涤条件，在所述条件下彼此至少30％、40％、50％或65％同一的核苷酸序列一般仍保持相互杂交。优选地，所述条件是这样，从而彼此至少约70％、更优选至少约75％或80％并且甚至更优选至少约85％、90％或95％或更大同一的序列一般仍保持相互杂交。

优选地，在严格条件下与序列表I第5列和第7列中所示序列杂交的本发明核酸分子对应于本发明的天然存在核酸分子。如本文中所用，“天然存在的”核酸分子指具有自然界中存在(例如编码天然蛋白质)的序列的RNA或DNA分子。优选地，该核酸分子编码天然蛋白，该天然蛋白具有上文提及的活性，例如，通过例如在细胞质中或在细胞器如质体或线粒体或这两者中、优选在质体中表达该基因产物的核酸序列而提高表达或其活性或本发明蛋白质的或本发明方法中所用蛋白质的活性后，引起环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产提高。

除了群体中可能存在的本发明多肽或核酸分子以及本发明方法中所用多肽或核酸分子的序列的天然存在变体之外，技术人员还将认识到可以通过突变向编码本发明多肽或本发明方法中所用多肽的核酸分子的核苷酸序列导入改变，从而引起编码的所述多肽的氨基酸序列改变，而不改变该多肽的功能性能力，优选地不降低所述活性。

例如，引起“非必需”氨基酸残基处氨基酸替换的核苷酸替换可以在本发明核酸分子或本发明方法中所用核酸分子的(例如，表I第5列和第7列中所示)序列中产生。

“非必需”氨基酸残基是这样的残基，其中可以改变所述残基而偏离于一种多肽的野生型序列，但不改动该多肽的活性，同时“必需”氨基酸残基是对如上文所提及活性必需的，其中所述活性例如在该多肽的活性提高后在生物中引起与相应的非转化野生型植物细胞、植物或其部分相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产的提高。但是，其他氨基酸残基(例如在具有所述活性的结构域中不保守或仅半保守的那些氨基酸残基)可能对活性并非必需并且因而可能是可改变的，而没有改变所述活性。

另外，本领域技术人员知道生物之间的密码子选择可以不同。因此，可以调整本发明核酸分子的密码子选择成为其中表达所述多核苷酸或多肽的生物或细胞区室的密码子选择，例如质体或线粒体的密码子选择。

因此，本发明涉及编码多肽的核酸分子，所述多肽在生物或其部分通过例如在细胞质中或在细胞器如质体或线粒体或这两者中、优选在质体中表达而具有上文所提及的活性并含有对所述活性并非关键的氨基酸残基改变。此类多肽在氨基酸序列上不同于包含在表II第5列和第7列中所示序列内的序列，然而仍保留本文中所述的活性。该核酸分子可以包含编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包含与表II第5列和第7列中所示氨基酸序列至少约50％同一的氨基酸序列并且在通过例如在细胞质中或在细胞器如质体或线粒体或这两者中、优选在质体中表达提高其活性，例如其表达后，能够参与同相应的非转化野生型植物细胞、植物或其部分相比较而言在短暂和重复性非生物胁迫产生条件下提高的产量。优选地，由该核酸分子编码的蛋白质至少约60％同一于表II第5列和第7列中所示的序列、更优选至少约70％同一于表II第5列和第7列中所示序列之一、更优选至少约80％、90％、95％同源于表II第5列和第7列中所示的序列并且最优选至少约96％、97％、98％或99％同一于表II第5列和第7列中所示的序列。

为确定两个氨基酸序列或两个核酸分子的同源性(＝同一性，在本文可互换地使用)百分数，将所述序列以一条序列在另一条序列下的方式书写以最佳比较(例如，可以将空位插入蛋白质的序列或核酸的序列，旨在与另一种蛋白质或另一种核酸产生最佳比对)。

随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核酸分子。当一个序列中的位置由另一个序列中对应位置处的相同氨基酸残基或相同核酸分子占据时，则所述分子在这个位置处是同源的(即，如本上下文中所用的氨基酸或核酸“同源性”对应于氨基酸或核酸“同一性”)。这两个序列之间的同源性百分数是所述序列共有的相同位置的函数(即同源性百分数＝相同位置数/位置总数x100)。术语“同源性”和“同一性”因而将视为同义词。

为确定两个或多个氨基酸序列或两个或多个核苷酸序列的同源性(＝同一性)百分数，已经开发了计算机软件程序。两个或更多序列的同源性可以用例如软件fasta计算，其中软件fasta已经以fasta 3版本使用(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，用于生物序列比较的改良工具(Improved Tools for Biological Sequence Comparison).PNAS 85：2444-2448；W.R.Pearson(1990)采用FASTP和FASTA的快速及敏感的序列比较(Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP andFASTA)，Methods in Enzymology 183：63-98；W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)用于生物序列比较的改良工具(Improved Tools forBiological Sequence Comparison).PNAS 85：2444-2448；W.R.Pearson(1990)；采用FASTP和FASTA的快速及敏感的序列比较(Rapid andSensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA)，Methods inEnzymology 183：63-98)。用于计算不同序列的同源性的另一种有用程序是标准blast程序，其中该程序包含于Biomax pedant软件(联邦德国慕尼黑Biomax)中。这有时不幸地产生次优结果，因为blast不总是包含主题和查询对象的完整序列。但是，由于该程序极高效，因而它可以用于比较庞大数目的序列。以下设置一般用于这样的序列比较：-p程序名称[字符串]；-d数据库[字符串]；默认＝nr；-i查询文件[File In]；默认＝stdin；-e期望值(E)[Real]；默认＝10.0；-m比对显示选项：0＝配对；1＝查询-比上区域，显示同一性；2＝查询-比上区域，无同一性；3＝查询-比上区域的屏文形式，显示同一性；4＝查询-比上区域的屏文形式，无同一性；5＝查询-比上区域，无同一性和突然结束；6＝查询-比上区域的屏文形，无同一性和突然结束；7＝XML Blast输出；8＝TAB格式输出；9带注释行的TAB格式输出[整数]；默认＝0；-o BLAST报告输出文件[FileOut]任选；默认＝stdout；-F过滤软件查询序列(DUST用blastn，EG用其他方法)[字符串]；默认＝T；-G空位开口成本(零激发默认行为)[整数]；默认＝0；-E开口延伸成本(零激发默认行为)[整数]；默认＝0；-X X空位比对的下降值(比特)(零激发默认行为)；blastn 30，megablast 20，tblastx 0，全部其他方法15[整数]；默认＝0；-I在定义行中显示GI′[T/F]；默认＝F；-q核苷酸错配罚分(仅blastn)[整数]；默认＝-3；-r核苷酸匹配回报(仅blastn)[整数]；默认＝1；-v显示对(V)的单-线描述的数据库序列数目[整数]；默认＝500；-b显示对(B)的比对的数据库序列数目[整数]；默认＝250；-f延伸命中的阈值，若为零，则默认；blastp 11，blastn 0，blastx 12，tblastn13；tblastx 13，megablast 0[整数]；默认＝0；-g执行空位比对(对tblastx不可用)[T/F]；默认＝T；-Q查询使用的遗传密码[整数]；默认＝1；-D DB遗传密码子(仅用于tblast[nx])[整数]；默认＝1；-a使用的处理器数目[整数]；默认＝1；-O SeqAlign文件[File Out]任选；-J相信查询定义行[T/F]；默认＝F；-M矩阵[字符串]；默认＝BLOSUM62；-W字大小，如果为零，则默认(blastn 11，megablast 28，全部其他方法3)[整数]；默认＝0；-z数据库的有效长度(对于真实大小，使用零)[Real]；默认＝0；-K来自保持区域的最佳命中数(默认关闭，若使用，推荐值100)[整数]；默认＝0；-P 0用于多重命中；1用于单一命中[整数]；默认＝0；-Y搜索空间的有效长度(对真实大小，使用零)[Real]；默认＝0；-S针对数据库搜索的查询链(对于blast、[nx]和tblastx)；3用于两者，1是顶端，2是底部[整数]；默认＝3；-T产生HTML输出结果[T/F]；默认＝F；-l限制数据库搜索至GI′s列表[字符串]任选；-U使用FASTA序列的较低事件过滤作用[T/F]任选；默认＝F；-y无空位延伸的X下降值(比特)(0.0激发默认行为)；blastn20，megablast 10，全部其他方法7[Real]；默认＝0.0；-Z最终空位比对的X下降值(比特)(0.0激发默认行为)；blastn/megablast 50，tblastx 0，全部其他方法25[整数]；默认＝0；-R PSI-TBLASTN检查点文件[File In]任选；-n MegaBlast搜索[T/F]；默认＝F；-L查询序列上的位置[字符串]任选；-A多重命中窗口大小，如果为零，则默认(blastn/megablast 0，全部其他方法40[整数]；默认＝0；-w移码罚分(OOF算法用于blastx)[整数]；默认＝0；-t允许tblastn中用于联系HSP的最大内含子的长度(0取消连接联系)[整数]；默认＝0。

通过使用Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman算法获得高质量的结果。因此，优选基于所述算法的程序。有利地，序列比较可以用程序PileUp(J.Mol.Evolution.，25，351(1987)，Higgins等人，CABIOS 5，151(1989))或优选用二者均基于Needleman与Wunsch算法的程序“Gap”和“Needle”(J.Mol.Biol.48；443(1970))和基于Smith与Waterman算法的“BestFit”(Adv.Appl.Math.2；482(1981))进行。“Gap”和“BestFit”是软件包GCG(Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)；Altschul等人，(Nucleic Acids Res.25，3389(1997))的组成部分，“Needle”是欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS)(Trends in Genetics 16(6)，276(2000))的组成部分。因此，确定序列同源性百分数的计算优选地用程序“Gap”或“Needle”在序列的全部范围内进行。为比较核酸序列，以下标准调整用于“Needle”：矩阵：EDNAFULL，空位罚分：10.0，延伸罚分：0.5。为比较核酸序列，以下标准调整用于“Gap”：空位权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000，平均错配：0.000。

例如，在核酸水平与序列SEQ ID NO.：9具有80％同源性的序列理解为意指当通过具有上文参数设置的以上程序Needle与序列SEQ ID NO：9比较时具有80％同一性的序列。

两个多肽之间的同源性理解为意指在每种情况下在整个序列长度范围内氨基酸序列的同一性，其中借助以上程序“Needle”，使用矩阵：EBLOSUM62，空位罚分：8.0，延伸罚分：2.0，通过比较来计算所述同一性。

例如，在蛋白质水平与序列SEQ ID NO.：10具有80％同源性的序列理解为意指通过具有上文参数设置的以上程序Needle与序列SEQ ID NO：10比较时具有80％同一性的序列。

通过置换、插入或缺失从本发明如表II第5列和第7列中所示多肽之一衍生的功能等同物与本发明如表II第5列和第7列中所示多肽之一具有至少30％、35％、40％、45％或50％、优选至少55％、60％、65％或70％、优选至少80％、特别优选至少85％或90％、91％、92％、93％或94％、非常特别优选至少95％、97％、98％或99％同源性，并且因基本上与表II第5列和第7列中所示多肽相同的特性而引人注目。

通过置换、插入或缺失从本发明如表I第5列和第7列中所示核酸序列之一衍生的功能等同物与本发明如表II第5列和第7列中所示多肽之一具有至少30％、35％、40％、45％或50％、优选至少55％、60％、65％或70％、优选至少80％、特别优选至少85％或90％、91％、92％、93％或94％、非常特别优选至少95％、97％、98％或99％同源性，并且编码与如表II第5列和第7列中所示多肽具有基本上相同特性的多肽。

功能等同物的“基本上相同特性”尤其理解为意指该功能等同物具有上文提及的活性，通过例如在细胞质中或在细胞器如质体或线粒体或这两者中、优选在质体中表达，同时在生物例如微生物、植物或植物或动物组织、植物或动物细胞或其一部分中增加蛋白质的量、该功能等同物的活性或功能。

可以通过将一个或多个核苷酸置换、添加或缺失导入本发明的核酸分子、尤其表I第5列和第7列的核酸分子的核苷酸序列中产生编码表II第5列和第7列中蛋白质序列的同源物的核酸分子，从而将一个或多个氨基酸置换、添加或缺失导入所编码的蛋白质。突变可以通过标准技术如位点定向诱变和PCR介导诱变法导入表I第5列和第7列的编码序列中。

优选地，可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处产生保守性氨基酸置换。“保守性氨基酸残基置换”是其中氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基的氨基酸残基置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支的侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

因此，在本发明的多肽或本发明方法中所用的多肽中预测的非必需氨基酸残基优选地替换为来自相同家族的另一个氨基酸。备选地，在另一个实施方案中，突变可以沿本发明核酸分子或本发明方法中所用核酸分子的全部或部分编码序列随机地导入，如通过饱和诱变导入，并且可以对所得突变体筛选本文中所述的活性以鉴定这样的突变体，该突变体仍保留活性或具有提高的上文所提及的活性，例如赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性。

在诱变本文中所示序列之一后，可以重组地表达所编码蛋白质并且可以使用例如本文中描述的测定法(见实施例)测定该蛋白质的活性。

可以通过Gap搜索法对数据库条目找到本发明方法中所用核酸分子的高同源性。

具有表I第5列和第7列中所示序列的所用核酸序列的同源物也包括与所示核苷酸序列或上文提及的衍生核酸序列或它们的同源物、衍生物或类似物或其部分之一具有至少大约30％、35％、40％或45％同源性、优选至少大约50％、60％或70％、更优选至少大约90％、91％、92％、93％、94％或95％并且甚至更优选至少大约96％、97％、98％、99％或更大同源性的等位变体。等位变体尤其包括通过缺失、插入或置换核苷酸可以从所示的、优选来自表I第5列和第7列的序列或从衍生性核酸序列获得的功能变体，但是，意图是合成的所得蛋白质的酶活性或生物学活性有利地保留或提高。

在本发明的一个实施方案中，本发明的或在本发明方法中所用的核酸分子包含在表I第5列和第7列任意者所示的序列。优选该核酸分子包含尽可能少的未在表I第5列和第7列任一列中显示的其他核苷酸。在一个实施方案中，该核酸分子包含少于500、400、300、200、100、90、80、70、60、50或40个其他核苷酸。在又一个实施方案中，该核酸分子包含少于30、20或10个其他核苷酸。在一个实施方案中，本发明方法中使用的核酸分子与表I表第5列和第7列中所示的序列相同。

也优选在本发明方法中使用的核酸分子编码包含在表II第5列和第7列所示序列的多肽。在一个实施方案中，该核酸分子编码少于150、130、100、80、60、50、40或30个其他氨基酸。在又一个实施方案中，所编码的多肽包含少于20、15、10、9、8、7、6或5个其他氨基酸。在本发明方法中使用的一个实施方案中，编码的多肽与如表II第5和第7列中所示的序列相同。

在一个实施方案中，本发明的或在本发明方法中用的核酸分子编码包含在表II第5列和第7中所示序列的多肽。该核酸分子包含少于100个其他核苷酸。在又一个实施方案中，所述核酸分子包含少于30个其他核苷酸。在一个实施方案中，在所述方法中使用的核酸分子与表I第5列和第7列中所示序列的编码序列相同。

仍具有本发明多肽的基本生物学活性或酶活性，在短暂和重复性非生物胁迫产生条件下引起与相应的非转化野生型植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的产量，即其活性基本上不降低的多肽(＝蛋白质)是这样的多肽，其具有至少10％或20％、优选30％或40％、特别优选50％或60％、非常特别优选80％或90％或更多的野生型生物学活性或酶活性，有利地，所述活性与相同条件下表达的表II第5列和第7列中所示多肽的活性相比较而言基本上不降低。

表I第5列和第7列的同源物或者表II第5列和第7列的衍生序列的同源物意指编码性和非编码性DNA序列的截短序列、cDNA、单链DNA或RNA。所述序列的同源物也理解为意指包含非编码区例如UTR、终止子、增强子或启动子变体的衍生物。在所述核苷酸序列上游或下游的启动子可以通过一个或多个核苷酸置换、插入和/或缺失进行修饰，然而优选地不干扰启动子、可读框(＝ORF)的功能性或活性或不干扰3’调节区如终止子或远离该ORF存在的其他3’调节区。还有可能所述启动子的活性因修饰其序列或它们被更活跃的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底替换而提高。适宜启动子是本领域技术人员已知的并且在本文以下提及。

除编码以上所述DRCP的核酸分子外，本发明的另一方面还涉及选自表I第5列和/或第7列、优选第7列的核酸分子的活性的负向调节物。认为反义多核苷酸通过特异性结合靶多核苷酸并干扰该靶多核苷酸的转录、剪接、转运、翻译和/或稳定性而抑制那些负向调节物的下调活性。本领域中描述了用于将反义多核苷酸靶向染色体DNA、靶向至初级RNA转录物或靶向已加工mRNA的方法。优选地，靶区域包括剪接位点、翻译起始起始密码子、翻译终止密码子和在可读框范围内的其它序列。

为本发明的目的，术语“反义”指这样的核酸，其包含充分互补于基因、初级转录物或已加工mRNA的全部或部分以至干扰内源性基因表达的多核苷酸。“互补的”多核苷酸是根据标准Watson-Crick互补法则能够进行碱基配对的那些多核苷酸。具体而言，嘌呤将与嘧啶进行碱基配对以形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G:C)和在DNA情况下腺嘌呤与胸腺嘧啶配对(A:T)或在RNA情况下腺嘌呤与尿嘧啶配对(A:U)的组合。应当理解两种多核苷酸可以相互杂交，甚至当它们彼此并不完全互补，只要每种多核苷酸具有与另一种多核苷酸基本上互补的至少一个区域。术语“反义核酸”包括可以被转录以产生反义RNA的单链RNA表达盒和双链DNA表达盒。“有活性”的反义核酸是能够选择性地与核酸分子的活性的负向调节物杂交的反义RNA分子，其中所述核酸分子编码与选自表I第5列和/或第7列、优选第7列的多肽具有至少80％序列同一性的多肽。反义核酸可以与完整的负向调节物链或仅与其部分互补。在另一个实施方案中，该反义核酸分子反义于编码DRCP的核苷酸序列的编码链的“非编码区。术语“非编码区”指分布在不翻译成氨基酸的编码区侧翼的5’和3’序列(即也称作5’和3’非翻译区)。该反义核酸分子可以互补于DRCPmRNA的非编码区的仅一部分。例如，反义寡核苷酸可以互补于DRCPmRNA的翻译起点周围的区域。反义寡核苷酸可以例如是约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸长度。一般而言，本发明的反义分子包含与表I核酸之一的非编码区的至少14个连续核苷酸具有60-100％序列同一性的RNA。优选地，该序列同一性将是至少70％、更优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％并且最优选地是99％。本发明的反义核酸可以使用化学合成和酶连接反应，利用本领域已知的方法构建。例如，反义核酸分子(例如反义寡核苷酸)可以使用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学地合成，其中设计所述的修饰核苷酸以提高分子的生物学稳定性或提高反义核酸与有义核酸之间所形成双链体的物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可以用来产生反义核酸的修饰核苷酸的例子包括5氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧氨基-2-硫尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。或者，反义核酸可以使用表达载体以生物学方式产生，其中将一种核酸以反义方向亚克隆(即从所插入核酸转录出的RNA将与目的靶核酸呈反义方向)至所述表达载体。

又在另一个实施方案中，本发明的反义核酸分子是α-端基核酸分子。α-端基异构核酸分子与互补RNA形成特定的双链杂交体，在所述双链杂交体中与常见的b-单元相反，所述链彼此平行(Gaultier等人，1987，Nucleic Acids.Res.15：6625-6641)。反义核酸序列也可以包含2′-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等人，1987，Nucleic Acids Res.15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等人，1987，FEBS Lett.215：327-330)。

本发明的反义核酸分子一般施用至细胞或在原位(in situ)产生，从而它们与细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合。杂交可以通过常规核苷酸互补性以形成稳定双链体引起，或例如与DNA双链体结合的反义核酸分子的情形下，因双螺旋大沟内的特异性相互作用引起。可以修饰反义分子，从而它特异性地结合至所选择的细胞表面上表达的受体或抗原，例如通过将反义核酸分子连接到与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体进行修饰。该反义核酸分子也可以使用本文所述的载体递送至细胞。为得到反义分子的足够胞内浓度，优选其中该反义核酸分子处于强力原核、病毒或真核(包括植物)启动子控制下的载体构建体。

作为反义多核苷酸的备选，核酶、有义多核苷酸或双链RNA(dsRNA)可以用来减少DRCP多肽的表达。“核酶”意指能够切割单链核酸如mRNA的具有核糖核酸酶活性的基于催化性RNA的酶，其中该酶具有针对所述单链核酸的互补区。核酶(例如，在Haselhoff和Gerlach，1988，Nature 334：585-591中描述的锤头状核酶)可以用来催化性地切割DRCPmRNA转录物，以因此抑制DRCP mRNA的翻译。对编码DRCP的核酸具有特异性的核酶可以基于如本文中公开的DRCP cDNA的核苷酸序列或基于根据本发明中教授的方法分离的异源序列进行设计。例如，可以构建四膜虫(Tetrahymena)L-19IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列互补于编码DRCP的mRNA中待切割的核苷酸序列。见，例如Cech等人美国专利号4,987,071和5,116,742。备选地，DRCP mRNA可以用来从RNA分子汇集物中选择具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA。见，例如Bartel，D.和Szostak，J.W.，993，Science 261：1411-1418。在优选的实施方案中，核酶将含有这样的部分，其具备与靶RNA的一部分具有100％互补性的至少7、8、9、10、12、14、16、18或20个核苷酸并且更优选7或8个核苷酸。用于产生核酶的方法是本领域技术人员已知的。见，例如美国专利号6,025,167；5,773,260和5,496,698。如本文中所用，术语“dsRNA”指包含两条RNA链的RNA杂交体。dsRNA可以在结构上是线形或环状的。在一个优选的实施方案中，dsRNA是对下述多核苷酸特异的，其中所述多核苷酸编码表II的多肽或编码与表II的多肽具有至少70％序列同一性的多肽。杂交的RNA可以基本上或完全地互补。“基本上互补”意指在使用如上文所述的BLAST程序最佳比对两种杂交的RNA时，杂交的部分至少95％互补。优选地，dsRNA将是至少100个碱基对长度。一般而言，杂交的RNA具有相同长度，没有突出的5’或3’末端并且无缺口。但是，可以在本发明的方法中使用具有多达100个核苷酸的5’或3’突出端的dsRNA。dsRNA可以包含核糖核苷酸或核糖核苷酸类似物(如2′-O-甲基核糖基残基)或其组合。见，例如美国专利号4,130,641和4,024,222。在美国专利4,283,393中描述了dsRNA聚核糖肌苷酸:聚核糖胞苷酸。用于产生和使用dsRNA的方法是本领域已知的。一种方法包括在体内或在单一体外反应混合物中同时转录两条互补DNA链。见，例如美国专利号5,795,715。在一个实施方案中，dsRNA可以通过标准转化方法直接导入植物或植物细胞。备选地，dsRNA可以通过转录两个互补RNA在植物细胞中表达。

本领域已知用于抑制内源基因表达的其它方法，如三股螺旋形成(Moser等人，1987，Science 238：645-650和Cooney等人，1988，Science 241：456-459)和共抑制作用(Napoli等人，1990，The Plant Cell2：279-289)。部分的和全长的cDNA已经用于共抑制内源植物基因。见，例如美国专利号4,801,340、5,034,323、5,231,020和5,283,184；Van der Kroll等人，1990，The Plant Cell 2：291-299；Smith等人，1990，Mol.Gen.Genetics224：477-481和Napoli等人，1990，The Plant Cell 2：279-289。对于有义抑制，认为有义多核苷酸的导入阻断相应的靶基因转录。有义多核苷酸将与靶植物的基因或RNA具有至少65％序列同一性。优选地，同一性百分数是至少80％、90％、95％或更多。相对于靶基因或靶转录物，导入的有义多核苷酸不必是全长的。优选地，有义多核苷酸将与如表I中所述核酸之一的至少100个连续核苷酸具有至少65％序列同一性。同一性区域可以包含内含子和/或外显子和非翻译区。导入的有义多核苷酸可以瞬时地存在于植物细胞中，或可以稳定地整合到植物染色体或染色体外复制子中。

另外，本发明的目的是包含核酸分子的表达载体，其中所述核酸分子包含选自以下的核酸分子：a)编码表II第5列或第7列中所示多肽的核酸分子；b)表I第5列或第7列中所示的核酸分子；c)核酸分子，其能够因遗传密码的简并性从表II第5列或第7列中所述的多肽序列衍生并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；d)核酸分子，其与包含在表I第5列或第7列中所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％同一性并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；e)核酸分子，其编码多肽并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性，其中所述多肽与由(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性并具有由包含如表I第5列中所描述多肽的多肽所代表的活性；f)核酸分子，其与(a)至(c)的核酸分子在严格杂交条件下杂交并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；g)编码多肽并具有由包含如表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性的核酸分子，其中所述多肽能够借助针对由(a)至(e)的核酸分子之一编码的多肽所制备的单克隆或多克隆抗体分离；h)核酸分子，其编码多肽，所述多肽包含如表IV第7列中所示的共有序列或一个或多个多肽基序并且优选地具有由包含如表II或表IV的第5列中所述多肽的多肽所代表的活性；h)核酸分子，其编码具有如表II第5列中描述的蛋白质所代表活性的多肽并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；i)核酸分子，其包含通过使用表III第7列中的引物扩增cDNA文库或基因组文库所获得的多核苷酸并且优选地具有由包含如表II或表IV的第5列中所述多肽的多肽代表的活性；和j)通过用包含核酸分子(a)或(b)的互补序列的探针或用其片段在严格杂交条件下筛选合适的核酸文库能够获得的核酸分子，其中所述的片段具有与在(a)至(e)中表征并编码下述多肽的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选地至少20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，所述多肽具有由包含如表II第5列中所示多肽的蛋白质代表的活性。其中根据(a)至(j)的核酸分子优选地至少在一个或多个核苷酸上与表IA第5列或第7列中所述的序列不同，并且优选地其编码至少在一个或多个氨基酸上与表IIA第5列或第7列中所述的蛋白质序列不同的蛋白质。

本发明还提供了分离的重组表达载体，其包含如上所述的编码胁迫相关蛋白的核酸，其中所述载体或所述编码胁迫相关蛋白的核酸在宿主细胞中的表达导致与该宿主细胞的相应非转化野生型相比较而言提高的胁迫耐受性和/或抗性，其中所述的胁迫优选地是植物疾病，该植物疾病优选地由致病性真菌和/或线虫引起。如本文中所用，术语“载体”指这样的核酸分子，其能够运输已经与之连接的另一个核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指可以向其中连入额外DNA节段的环状双链DNA环。载体的另一类型是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连入病毒基因组。其他类型的载体可以是作为可自我复制和插入的DNA片段的线性化核酸序列，如转座子。已经发现了2个类型的转座子：称作插入序列的简单转座子和可以具有几个基因及转位所需基因的复合转座子。某些载体能够在导入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和哺乳动物游离型载体)。其他载体(例如哺乳动物非游离型载体)在导入宿主细胞时整合到该宿主细胞的基因组中，并因而随宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够指导与它们有效连接的基因表达。此类载体在本文称作“表达载体”。通常，重组DNA技术中使用的表达载体经常处于质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换地使用，因为质粒是载体的最常用形式。但是，本发明意图包括其他同等功能的其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

植物表达盒优选地包含能够在植物细胞中驱动基因表达和有效连接的调节序列，从而每种序列可以实现其功能，如通过多腺苷酸化信号终止转录。优选的多腺苷酸化信号是从根癌农杆菌T-DNA如Ti质粒pTiACH5(Gielen等，1984，EMBO J.3：835)的称作章鱼碱合酶的基因3或其功能性等同物起源的那些多腺苷酸化信号，而在植物中有功能活性的全部其它终止子也是合适的。由于植物基因表达非常经常地不限于转录水平，故植物表达盒优选地包含其它有效连接的序列，如翻译增强子，如过量驱动序列，其含有来自烟草花叶病毒的增强蛋白质/RNA比率的5’非翻译性前导序列(Gallie等人，1987，Nucl.Acids Research 15：8693-8711)。

植物基因表达应当有效地与以时间、细胞或组织特异性方式引起基因表达的适宜启动子关联。优选驱动组成型表达(Benfey等人，1989EMBO J.8：2195-2202)的启动子，如衍生自植物病毒的那些启动子如35S CaMV(Franck等人，1980 Cell 21：285-294)、19S CaMV(也见美国专利号5352605和PCT申请号WO8402913)或植物启动子如美国专利号4,962,028中所述的来自二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)小亚基的那些植物启动子。

额外的有利调节序列例如包含于植物启动子如CaMV/35S[Franck等人，Cell 21(1980)285-294]、PRP1[Ward等人，Plant.Mol.Biol.22(1993)]、SSU、OCS、Iib4、usp、STLS1、B33、LEB4、nos或包含于遍在蛋白、油菜籽蛋白或菜豆蛋白启动子中。在本上下文中也有利的是诱导型启动子，如EP-A-O 388186(苄磺酰胺诱导型)，Plant J.2，1992：397-404(Gatz等人，四环素诱导型)、EP-A-O 335528(脱落酸诱导型)或WO93/21334(乙醇或环己醇诱导型)中描述的启动子。额外的有用植物启动子是马铃薯的胞浆FBP酶启动子或ST-LSI启动子(Stockhaus等人，EMBO J.8，1989，2445)、大豆的磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶启动子(GenBank登录号U87999)或EP-A-249,676中所述的根瘤特异性启动子。额外的特别有利的启动子是可用于单子叶植物或双子叶植物并于US 5,608,152(来自油菜籽的油菜籽蛋白启动子)、WO98/45461(来自拟南芥属植物的油质蛋白启动子)、US 5,504,200(来自菜豆的菜豆蛋白启动子)、WO91/13980(来自芸苔属植物的Bce4启动子)和Baeumlein等人，Plant J.，2，2，1992：233-239(来自豆科植物的LEB4启动子)中描述的种子特异性启动子。所述启动子用于双子叶植物中。以下启动子例如用于单子叶植物中：来自大麦的Ipt2-或Ipt1-启动子(WO95/15389和WO95/23230)或来自大麦的大麦醇溶蛋白启动子。其它有用的启动子在WO99/16890中描述。原则上可以将具有自身调节序列如上文所提及那些调节序列的全部天然启动子用于所述新方法。使用合成性启动子也是可能的并且额外有利。

基因构建体也可以包含将插入生物并且例如参与胁迫抗性和生物量生产提高的其它基因。这些基因可以在起源上是异源或同源的。插入的基因可以具有其自身启动子或处在与表I的核酸的序列或其同源物相同的启动子控制下。为表达存在的其它基因，该基因构建体有利地额外包含3’和/或5’末端调节序列以增强表达，其中所述调节序列根据所选宿主生物和基因或诸基因而选择以最佳表达。

这些调节序列意图产生基因的特异性表达和如上所述可能的蛋白质表达。例如取决于宿主生物，这可能意指该基因仅在诱导后才表达或过量表达或它立即表达和/或过量表达。调节序列或调节因子还可以优选地对导入的基因的表达产生有益影响并因而增加表达。通过使用强转录信号如启动子和/或增强子，有可能以这种方式有利地在转录水平上增强所述调节元件。然而除此之外，也可能例如通过改善mRNA的稳定性增强翻译。

用于植物基因表达盒中的其它优选序列是对于合适的细胞区室中引导基因产物为必需的靶向序列(综述，见Kermode，1996 Crit.Rev.Plant Sci.15(4)：285-423及其中引用的参考文献)，所述细胞区室例如是液泡、细胞核、全部类型的质体如淀粉体、叶绿体、色质体、胞外空间、线粒体、内质网、油体、过氧化物酶体和植物细胞的其它区室。植物基因表达也可以借助诱导型启动子促进(综述，见Gatz，1997Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48：89-108)。当需要基因表达以时间特异性方式发生时，化学诱导型启动子是特别适合的。

表1列出了可用来调节编码胁迫相关蛋白的核酸序列转录的启动子的几个例子。表1：植物中的组织特异性启动子和胁迫诱导型启动子的例子

表达	参考文献
		Cor78-寒冷、干旱、盐、ABA、创伤诱导型	Ishitani，等人，Plant Cell 9：1935-1949(1997).Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，Plant Cell

表达	参考文献
			6：251-264(1994).
Rci2A-寒冷、脱水-诱导型	Capel等人，Plant Physiol 115：569-576(1997)
		Rd22-干旱、盐	Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，Mol GenGenet 238：17-25(1993).
Cor15A-寒冷、脱水、ABA	Baker等人，Plant Mol.Biol.24：701-713(1994).

表达	参考文献
		GH3-植物生长素诱导型	Liu等人，Plant Cell 6：645-657(1994)
ARSK1-根，盐诱导型	Hwang和Goodman，Plant J 8：37-43(1995).
		PtxA-根，盐诱导型	GenBank登录号X67427
SbHRGP3-根特异性	Ahn等人，Plant Cell 8：1477-1490(1998).
		KST1-防卫细胞特异性	Plesch等人，Plant Journal.28(4)：455-64，(2001)
KAT1-防卫细胞特异性	Plesch等人，Gene 249：83-89(2000)Nakamura等人，Plant Physiol.109：371-374(1995)
		水杨酸诱导型	PCT申请号WO95/19443
四环素诱导型	Gatz等人.Plant J.2：397-404(1992)
		乙醇诱导型	PCT申请号WO93/21334
病原体诱导型PRP1	Ward等人，1993Plant.Mol.Biol.22：361-366
		热诱导型hsp80	美国专利号5187267
寒冷诱导型α-淀粉酶	PCT申请号WO96/12814
		创伤诱导型pinII	欧洲专利号375091
RD29A-盐-诱导型	Yamaguchi-Shinozalei等人.(1993)Mol.Gen.Genet.236：331-340

表达	参考文献
		质体特异性病毒RNA聚合酶	PCT申请号WO95/16783和WO97/06250

其它启动子例如超启动子(Ni等人，Plant Journal 7，1995：661-676)、遍在蛋白启动子(CaINs等人，J.Biol.Chem.，1990，265：12486-12493；US5,510,474；US 6,020,190；Kawalleck等人，Plant.MolecularBiology，1993，21：673-684)或34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)类似地用于本发明并且是本领域技术人员已知的。发育期优选性启动子在某个发期中偏好性地表达。组织优选性和器官优选性启动子包括在特定组织或器官如叶、根、种子或木质部中偏好表达的那些启动子。组织优选的和器官优选的启动子的例子包括但不限于果实优选的、胚珠优选的、雄性组织优选的、种子优选的、珠被优选的、块茎优选的、柄优选的、果皮优选的和叶优选的、柱头优选的、花粉优选的、花药优选的、花瓣优选的、萼片优选的、花梗优选的、长角果优选的、茎优选的、根优选的启动子等。种子优选的启动子在种子发育和/或萌发期间偏好性表达。例如，种子优选的启动子可以是胚优选的、胚乳优选的和种衣优选的。见Thompson等人，1989，BioEssays 10：108。种子优选的启动子的例子包括但不限于纤维素合酶(celA)、Cim1、γ-玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、玉米19kD玉米醇溶蛋白(cZ19B1)等。在本发明表达盒中有用的其它启动子包括但不限于主要叶绿素a/b结合蛋白启动子、组蛋白启动子、Ap3启动子、β-伴大豆球蛋白启动子、油菜籽蛋白启动子、大豆凝集素启动子、玉米15kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27kD玉米醇溶蛋白启动子、γ-玉米醇溶蛋白启动子、蜡质、皱缩1、皱缩2和青铜色启动子、Zm13启动子(美国专利号5,086,169)、玉米聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)(美国专利号5,412,085和5,545,546)和SGB6启动子(美国专利号5,470,359)以及合成的启动子或其它天然启动子。

在植物中控制异源基因表达的额外灵活性可以通过使用异源的DNA结合结构域和应答元件(即来自非植物源的DNA结合结构域)获得。这种异源DNA结合结构域的例子是LexA DNA结合结构域(Brent和Ptashne，1985，Cell 43：729-736)。

本发明还提供了这样的重组表达载体，其包含以反义方向克隆至该表达载体中的本发明DRCP DNA分子。也即，该DNA分子以引起对DRCP mRNA反义的RNA分子表达的方式(通过转录该DNA分子)有效连接于调节序列。可以选择与以反义方向克隆的核酸分子有效连接的调节序列，所述调节序列指导反义RNA分子在多种细胞类型中连续表达。例如，可以选择指导反义RNA的组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达的病毒启动子和/或增强子或调节序列。反义表达载体可以是其中在高效调节区控制下产生反义核酸的重组质粒、噬菌粒或减毒病毒形式。调节区的活性可以由向其中导入该载体的细胞类型决定。对于使用反义基因调节基因表达的讨论，见Weintraub，H.等人，1986，综述：作为用于遗传分析的分子工具的反义(Antisense RNA as a molecular tool for geneticanalysis)，RNA-Trends in Genetics，第1卷(1)和MoI等人，1990，FEBSLetters 268：427-430。

本发明的另一方面涉及分离的DRCP及其生物学活性部分。“分离的”或“纯化的”多肽或其生物学活性部分在通过重组DNA技术产生时不含细胞物质，或在化学地合成时不含化学前体或其它化学品。语言“基本上不含细胞物质”包括DRCP的制品，在所述制品中该多肽与天然或重组地产生该多肽的细胞的某些细胞组分分开。在一个实施方案中，语言“基本上不含细胞物质”包括这样的DRCP制品，其具有少于大约30％(干重)的非DRCP物质(本文中也称作“杂质多肽”)、优选小于约20％的非DRCP物质、仍更优选小于约10％的非DRCP物质并且最优选小于大约5％的非DRCP物质。

当重组地产生DRCP或其生物学活性部分时，它还优选地基本上不含培养基，即，培养基占所述多肽制品的体积少于约20％、更优选小于约10％并且最优选小于约5％。语言“基本上不含化学前体或其它化学品”包括这样的DRCP制品，其中所述多肽与参与合成该多肽的化学前体或其它化学品分开。在一个实施方案中，词组“基本上不含化学前体或其它化学品”包括这样的DRCP制品，其具有小于约30％(干重)的化学前体或非DRCP化学品、更优选小于约20％的化学前体或非DRCP化学品、仍更优选小于约10％的化学前体或非DRCP化学品并且最优选小于约5％的化学前体或非DRCP化学品。在优选的实施方案中，分离的多肽或其生物学活性部分不含来自衍生DRCP的相同生物的杂质多肽。一般而言，通过在不是酿酒酵母、大肠杆菌或微生物如谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)、纤毛虫、藻类或真菌而是植物中重组表达例如酿酒酵母、大肠杆菌或欧洲油菜、玉米或稻DRCP而产生此类多肽。

本文所述的核酸分子、多肽、多肽同源物、融合多肽、引物、载体和宿主细胞可以用于一种或多种下列方法中：鉴定酿酒酵母、大肠杆菌或欧洲油菜、大豆、玉米或稻和相关生物；与酿酒酵母、大肠杆菌相关的生物的基因组作图；鉴定并定位酿酒酵母、大肠杆菌或欧洲油菜、大豆、玉米或稻的目的序列；进化研究；确定对于功能必需的DRCP区域；调节DRCP活性；调节一种或多种细胞功能的代谢；调节一种或多种化合物的跨膜转运；调节胁迫抗性和调节DRCP核酸的表达。

本发明的DRCP核酸分子也用于进化研究及多肽结构研究。本发明分子参与其中的代谢及转运过程被种类多样的原核和真核细胞利用；通过将本发明核酸分子的序列与其它生物来源的编码相似酶的核酸分子的序列比较，可以评估生物的进化相关性。类似地，这种比较允许评估该序列的哪些区域保守而哪些区域不保守，这可能有助于确定多肽内对酶功能为必需的那些区域。该类型的确定对多肽工程研究是有价值的，并且可以提供该多肽可以耐受哪种诱变而不丧失功能的线索。

操作本发明的DRCP核酸分子可以导致与野生型DRCP存在功能性差异的DRCP产生。这些多肽可以在效率或活性方面改良，可以在细胞中以比平常更多的量存在，或可以在效率或活性方面降低。存在多种机制，其中通过这些机制改变本发明的DRCP可能直接影响胁迫应答和/或胁迫耐受性。在表达DRCP的植物的情况下，转运提高可以导致植物组织和植物器官内部改善的盐和/或溶质分布。通过提高从细胞输出离子性分子的转运蛋白分子的数量或活性，可以影响细胞的盐和寒冷耐受性。

植物中遗传修饰对胁迫耐受性的影响可以通过在次适宜环境下培育已修饰的植物并随后分析该植物的生长特征和/或代谢进行评估。此类分析技术是本领域技术人员熟知的，并且包括干重、湿重、多肽合成、糖合成、脂类合成、蒸发蒸腾速率、总体植物和/或作物产量、开花、繁殖、结种、根生长、呼吸速率、光合作用速率、代谢物组成等(Applications ofHPLC in Biochemistry in：Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology，第17卷；Rehm等人，1993 Biotechnology，第3卷，第III章：产物回收与纯化(Product recovery and purification)，第469-714页，VCH：Weinheim；Belter，P.A.等人，1988，Bioseparations：downstreamprocessing for biotechnology，John Wiley and Sons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.，1992，Recovery processes for biological materials，JohnWiley and Sons；Shaeiwitz，J.A.和Henry，J.D.，1988，Biochemsicalseparations，在Ulmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry中，第B3卷，第11章，第1-27页，VCH：Weinheim；和Dechow，F.J.，1989，Separation and purification techniques in biotechnology，NoyesPublications)。例如，可以构建包含本文所公开核酸或其片段的酵母表达载体并使用标准方法将其转化至酿酒酵母中。随后可以分析所得转基因细胞的生物胁迫或干旱、盐、寒冷胁迫的丧失或变更，其中所述的生物胁迫优选地由植物疾病、优选由致病性真菌和/或线虫引起。类似地，可以构建包含本文所公开核酸或其片段的植物表达载体并使用标准方案将其转化至适宜的植物细胞中，如拟南芥属植物、大豆、油菜、玉米、小麦、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)等。随后可以分析所得转基因细胞和/或从中所衍生植物的生物胁迫或干旱、盐、寒冷胁迫的丧失或变更，其中所述的生物胁迫优选地由植物疾病、优选由致病性真菌和/或线虫引起。

工程化根据表I的并编码本发明表II的DRCP的一种或多种基因也可以产生具有改变的活性的DRCP，其中所述改变的活性间接地影响藻类、植物、纤毛虫或真菌或其它微生物如谷氨酸棒状杆菌的胁迫应答和/或抗性。

此外，本文所公开的序列或其片段可以用来在多种生物(如细菌、哺乳动物细胞、酵母细胞和植物细胞)的基因组中产生敲除突变(Girke，T.，1998，The Plant Journal 15：39-48)。随后可以评价所得敲除细胞耐受多种胁迫条件的能力或潜能，其对多种胁迫条件的应答及突变对表型和/或基因型的影响。就基因失活的其它方法而言，见美国专利号6,004,804“非嵌合突变载体(Non-Chimeric Mutational Vectors)”和Puttaraj u等人，1999，作为基因治疗手段的剪接体介导的RNA反式剪接作用(Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy)，Nature Biotechnology 17：246-252。用于DRCP的导致胁迫抗性提高的前述诱变策略不意图是限制性的；本领域技术人员将轻易地明白这些策略的变化。使用此类策略并且并入本文所公开的机制，本发明的核酸和多肽分子可以用来产生表达突变的DRCP核酸和多肽分子从而改善胁迫耐受性的藻类、纤毛虫、植物、真菌或其它微生物如谷氨酸棒状杆菌。

本发明也提供与如本文中所述核酸编码的DRCP或其部分特异性结合的抗体。可以通过众多的熟知方法产生抗体(见，例如Harlow和Lane，“Antibodies；A Laboratory Manual”，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1988))。简而言之，可以将纯化的抗原以足够激发免疫应答的量和间隔时间注射到动物中。可以直接纯化抗体，或可以从该动物获得脾细胞。所述细胞随后可以与永生细胞系融合并就抗体分泌进行筛选。抗体可以用来筛选分泌抗原的细胞的核酸克隆文库。随后可以将那些阳性克隆测序。见，例如，Kelly等人，1992，Bio/Technology 10：163-167；Bebbington等人，1992，Bio/Technology10：169-175。短语与多肽“选择性结合”和“特异性结合”指确定在不均一的多肽群体和其它生物物质中存在该多肽的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，与特定多肽结合的指定抗体不以明显的量与样品中存在的其它多肽结合。抗体在此类条件下的选择性结合可能需要这样的抗体，其中针对特定多肽选择所述抗体的特异性。多种免疫测定法可以用来选择与特定多肽选择性结合的抗体。例如，固相ELISA免疫测定例行地用来选择与多肽选择性发生免疫反应的抗体。对于可能用来确定选择性结合作用的免疫测定模式及条件的描述，见Harlow和Lane，“Antibodies，A LaboratoryManual，”Cold Spring Harbor Publications，New York，(1988)。在一些情况下，希望制备来自多种宿主的单克隆抗体。可以在Stites等人编著，“Basic and Clinical Immunology，”(Lange Medical Publications，Los Altos，Calif.，第5版)及其中引用的参考文献，并在Harlow和Lane，“Antibodies，A Laboratory Manual，”Cold Spring Harbor Publications，New York，(1988)中找到用于制备此类单克隆抗体的技术的描述。

植物中的基因表达受蛋白质转录因子与基因的调节区内部核苷酸序列的相互作用调节。转录因子的一个例子是含有锌指(ZF)基序的多肽。每一ZF模块约30个氨基酸长，围绕一个锌离子折叠。ZF蛋白的DNA识别结构域是插入DNA双螺旋大沟内的α-螺旋结构。该模块含有与DNA结合的3个氨基酸，每个氨基酸接触靶DNA序列中的单个碱基对。ZF基序以模块重复方式排列以形成识别连续DNA序列的一组指状物。例如，一个三指ZF基序将识别DNA的9个bp。已经证实数百种蛋白质含有ZF基序，每种蛋白质中存在2和37个之间的ZF基序(Isalan M，等人，1998Biochemistry 37(35)：12026-33；Moore M，等人，2001Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(4)：1432-1436和1437-1441；美国专利US 6007988和US6013453)。植物基因的调节区含有充当转录因子(包括ZF蛋白)识别结构域的众多短DNA序列(顺式作用元件)。不同基因中的相似识别结构域通过常见转录因子引起编码代谢途径中酶的几个基因协调表达。一个基因家族的各成员之间识别结构域内的变异引起同一个基因家族内部的基因表达差异，例如在组织及发育期之间和应答于环境条件下引起基因表达差异。常见ZF蛋白质不仅含有DNA识别结构域，还含有使ZF蛋白质能够激活或阻遏特定基因转录的功能结构域。实验上，激活结构域已经用来激活靶基因的转录(美国专利5789538和专利申请WO9519431)，不过也可以将转录阻遏物结构域连接至ZF并且因而抑制转录(专利申请WO00/47754和WO2001002019)。已经报道了酶功能如核酸切割作用可以与ZF相关联(专利申请WO00/20622)。

本发明提供了这样的方法，该方法允许本领域技术人员从植物细胞的基因组分离编码胁迫相关蛋白的一种或多种基因的调节区并且设计连接至功能性结构域的锌指转录因子，其中所述功能性结构域将与所述基因的调节区相互作用。可以以这样的方式设计该锌指蛋白与植物基因的相互作用，从而改变该基因的表达并且因而优选地赋予短暂和重复性非生物胁迫条件下提高的产量。

特别地，本发明提供了用编码胁迫相关蛋白的核酸产生转基因植物的方法，其中所述核酸在植物中的表达产生与野生型植物相比而言提高的环境性胁迫耐受性，该方法包括：(a)用包含编码胁迫相关蛋白的核酸的表达载体转化植物细胞，和(b)从植物细胞产生与野生型植物相比而言具有提高的环境胁迫耐受性的转基因植物。对于这种植物转化，可以使用双元载体如pBinAR(

和Willmitzer，1990Plant Science66：221-230)。此外，合适的双元载体是例如pBIN19、pBI101、pGPTV或pPZP(Hajukiewicz P.等人，1994，Plant Mol.Biol.，25：989-994)。所述双元载体的构建可以通过将cDNA连接入T-DNA进行。该cDNA5’端的植物启动子激活此cDNA的转录。多腺苷酸化序列位于该cDNA 3’端。组织特异性表达可以通过使用如上文所列的组织特异性启动子实现。此外，可以使用任意的其它启动子元件。对于完整植物内部的组成型表达，可以使用CaMV 35S启动子。所表达的蛋白质可以使用信号肽被定向至细胞区室，例如质体、线粒体或内质网(Kermode，1996Crit.Rev.Plant Sci.4(15)：285-423)。该信号肽以符合可读框的方式克隆至此cDNA的5’端以实现融和蛋白的亚细胞定位。额外地，应答非生物性胁迫的启动子可以随如拟南芥属启动子RD29A一起使用。本领域技术人员会知道所用的启动子应当有效连接于核酸，从而该启动子引起此核酸的转录，这导致编码多肽的mRNA合成。

备选的转染方法包括借助电穿孔或农杆菌介导的基因转移将DNA直接转移至正在发育的花。可以使用例如根癌农杆菌菌株GV3101(pMP90)(Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204：383-396)或LBA4404(Ooms等人，Plasmid，1982，7：15-29；Hoekema等人，Nature，1983，303：179-18)进行农杆菌介导的植物转化。可以通过标准转化及再生技术(Deblaere等人，1994，Nucl.Acids Res.13：4777-4788；Gelvin和Schilperoort，Plant Molecular Biology Manual，2版.-Dordrecht：KluwerAcademic Publ.，1995.-在Sect.，Ringbuc Zentrale Signatur：BT11-P ISBN0-7923-2731-4中；Glick，B R和Thompson，J E，Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology，Boca Raton：CRC Press，1993-360S.，ISBN 0-8493-5164-2)进行转化。例如，油菜籽可以通过子叶或下胚轴转化法进行转化(Moloney等人，1989，Plant Cell Reports 8：238-242；De Block等人，1989，Plant Physiol.91：694-701)。使用抗生素对农杆菌和植物的选择取决于转化所用的双元载体和农杆菌菌株。油菜籽选择通常使用卡那霉素作为植物选择标记进行。可以使用例如Mlynarova等人，1994，Plant CellReport 13：282-285描述的技术进行针对亚麻的农杆菌介导的基因转移。此外，可以使用例如在欧洲专利号0424047、美国专利号5,322,783、欧洲专利号0397687、美国专利号5,376,543或美国专利号5,169,770中描述的技术进行大豆的转化。玉米的转化可以通过粒子轰击法、聚乙二醇介导的DNA摄取或借助碳化硅纤维技术实现(见，例如Freeling和Walbot“玉米手册(The maize handbook)”Springer Verlag：New York(1993)ISBN3-540-97826-7)。玉米转化的具体实施例存在于美国专利号5,990,387中，并且小麦转化的具体实施例可以在PCT申请号WO93/07256中找到。

在胁迫条件下培育修饰的植物并且随后筛选和分析生长特征和/或代谢活性，这评估了植物中遗传性修饰对短暂和重复性非生物胁迫条件下提高的产量的影响。此类分析技术是本领域技术人员熟知的。它们包括在筛选后(

Lexikon Biotechnologie，Stuttgart/New York：GeorgThieme Verlag 1992，“Screening”，第701页)干重、湿重、多肽合成、糖合成、脂类合成、蒸发蒸腾速率、总体植物和/或作物产量、开花、繁殖、结种、根生长、呼吸速率、光合作用速率等(Applications of HPLC inBiochemistry in：Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology，第17卷；Rehm等人，1993Biotechnology，第3卷，第III章：产物回收与纯化(Product recovery and purification)，第469-714页，VCH：Weinheim；Belter，P.A.等人，1988Bioseparations：downstream processingfor biotechnology，John Wiley and Sons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.，1992Recovery processes for biological materials，John Wiley and Sons；Shaeiwitz，J.A.和Henry，J.D.，1988Biochemical separations，在：Ulmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry，第B3卷，第11章，第1-27页，VCH：Weinheim；和Dechow，F.J.(1989)Separation and purification techniquesin biotechnology，Noyes Publications)。

在一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定基因产物的方法，所述的基因产物在生物例如植物的细胞中赋予与相应的非转化野生型对照细胞相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性，所述方法包括以下步骤：a)使可能含有候选基因的样品(例如细胞、组织、植物或微生物或核酸文库)的一些或全部核酸分子与如表I A或B的第5列或第7列中所示核酸分子或其功能同源物接触，例如杂交，其中所述的候选基因编码赋予提高的胁迫抗性的基因产物，所述胁迫抗性优选地针对植物疾病，该植物疾病优选地由致病性真菌和/或线虫引起；b)鉴定在放松的严格条件下与所述核酸分子、尤其与如表I第5列或第7列中所示核酸分子序列杂交的核酸分子，并且任选地，分离全长cDNA克隆或完整基因组克隆；c)鉴定宿主细胞中，优选地鉴定植物细胞中的候选核酸分子或其片段；d)增加宿主细胞中已鉴定核酸分子的表达，其中对于所述宿主细胞而言提高的植物疾病抗性是希望的，其中所述植物疾病优选地由致病性真菌和/或线虫引起；e)分析所述宿主细胞中提高的胁迫抗性的水平；和f)鉴定与野生型相比其增加的表达引起胁迫抗性提高的核酸分子及其基因产物。放松的杂交条件是：在标准杂交流程后，可以在低至中等严格条件实施洗涤步骤，与严格洗涤条件例如60至68℃，0.1％SDS相比，通常采用40°-55℃的洗涤条件和含0.1％SDS的2×SSC和0.2xSSC之间的盐条件。可以在上文所列参考文献中找到用于严格杂交条件的其他例子。通常，洗涤步骤以增加的严格性和时间长度重复直至检测到有用信号/噪声比，并且取决于众多因素，例如靶的纯度、GC含量、大小等，例如，探针长度、它是否为RNA或DNA探针、盐条件、洗涤或杂交温度、洗涤或杂交时间等。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定其表达引起细胞中胁迫抗性提高的基因产物的方法，该方法包括以下步骤：a)鉴定生物中的核酸分子，例如通过在数据库中的同源性搜索鉴定，其中所述核酸分子与编码蛋白质的核酸分子至少20％、优选25％、更优选30％、甚至更优选35％、40％或50％、甚至更优选60％、70％或80％、最优选90％或95％或更多同源，其中所述蛋白质包含如表II第5列或第7列中所示的多肽分子或包含如表IV第7列中所示的共有序列或由包含如表I表第5列或第7列中所示多核苷酸或其如本文中所述同源物的核酸分子编码；b)增强所鉴定的核酸分子在所述宿主细胞中表达；c)分析宿主细胞中提高的胁迫抗性的水平，所述的胁迫抗性优选地针对植物疾病，所述植物疾病优选地由致病性真菌和/或线虫引起；和d)鉴定宿主细胞，其中增强的表达赋予该宿主细胞中与野生型相比而言提高的胁迫抗性。

另外，本文中所公开的核酸分子，尤其表IA或B的第5列或第7列中所示的核酸，可以充分地同源于相关物种的序列，从而这些核酸分子可以充当标记用于构建相关生物中的基因组图谱或用于联合作图。另外，与本文所公开核酸或其同源物、尤其表I A或B的第5列或第7列中所示核酸分子相应的基因组区域内的天然变异可以导致本文所公开的蛋白质及其同源物的活性、尤其包含表IIA或B的第5列或第7列中所示多肽或包含表IV第7列中所示共有序列或多肽基序的蛋白质的活性变异，并且因而产生环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量产生的天然变异。因此，天然变异逐步也以活性较低的等位变体形式存在，其中所述的等位变体已经引起环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量产生相对提高。可以鉴定本文公开的核酸的不同变体、尤其包含如表IA或B第5列或第7列中所示核酸分子的对应于不同耐受性和/或胁迫抗性水平和生物量生产水平的核酸的不同变体，并将所述变体用于针对提高的胁迫抗性的标记辅助育种，其中所述胁迫抗性优选地针对植物疾病，该植物疾病优选地由致病性真菌和/或线虫引起。

因此，本发明涉及用于植物针对提高的胁迫抗性育种的方法，所述胁迫抗性优选地针对植物疾病，该植物疾病优选地由致病性真菌和/或线虫引起，该方法包括：a)基于提高如本文所公开的本发明核酸的表达，尤其基于提高包含如表IA或B的第5列或第7列中所述核酸分子的核酸分子或包含如表IIA或B的第5列或第7列中所述多肽或包含如表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的多肽的表达，选择具有提高的胁迫抗性的第一植物变种，所述胁迫抗性优选地针对植物疾病，该植物疾病优选地由致病性真菌和/或线虫引起；b)将胁迫耐受性和/或抗性的水平与编码所述多肽或所述核酸分子的基因的表达水平或基因组结构关联，其中所述胁迫抗性优选地针对植物疾病，该植物疾病优选地由致病性真菌和/或线虫引起；c)将第一植物变种与在耐受性和/或抗性和生物量生产的水平方面明显不同的第二植物变种杂交；和e)通过所述多肽或核酸分子的表达水平或编码本发明所述多肽或核酸分子的基因的基因组结构，鉴定哪个后代变种已经获得提高水平的胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产。在一个实施方案中，根据步骤(b)的基因的表达水平提高。

本发明的另一个实施方案涉及用于鉴定化合物的方法，该化合物在植物细胞、植物或其部分、植物或其部分中赋予与相应的非转化野生型植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性，所述方法包括步骤：a)培养植物细胞、植物或其部分，维持表达如表II第5列或第7列中所示或由下述核酸分子编码的多肽并提供下述读出系统的植物，其中所述核酸分子包含如表I第5列或第7列中所述的多核苷酸或其如本文中所述的同源物或包含编码所述多肽并赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性的多核苷酸，所述读出系统能够在允许该多肽在一种化学化合物或包含多种化学化合物的样品存在时与该读出系统相互作用的合适条件下相互作用于所述多肽，并且能够提供与一种化学化合物在允许所述读出系统和如表II第5列或第7列中所示或由下述核酸分子编码的蛋白质表达的条件下结合至所述多肽相对应的可检测信号，其中所述核酸分子包含如表I表第5列或第7列中所述的多核苷酸或其如本文中所述的同源物；和b)通过检测由所述读出系统产生的信号存在或不存在或降低或提高来鉴定该化学化合物是否为有效的激动物。所述化合物可以化学地合成或以微生物方式产生和/或例如存在于样品，例如来自植物、动物或微生物(例如病原体)的细胞提取物中。另外，所述化合物可以是本领域已知的，但是迄今不知道能够激活本发明的多肽。反应混合物可以是无细胞提取物或可以包含细胞或组织培养物。用于鉴定本发明化合物的方法的合适建立是本领域技术人员已知的并且例如广泛地在Alberts等人，Molecular Biology of the Cell，3版(1994)、尤其第17章中描述。所述化合物可以例如添加至反应混合物、培养基，注射至细胞中或喷洒到植物上。如果在所述方法中鉴定到了含有化合物的样品，则可能从原始样品分离该化合物，其中所述原始样品被确定为含有能够在短暂和重复性非生物胁迫条件下与相应的非转化野生型相比而言刺激或增加产量产生的该化合物，或者可以进一步细分该原始样品，例如，如果该原始样品由多种不同化合物组成，从而降低每个样品不同物质的数目，并且重复该方法，伴以细分该原始样品。取决于样品的复杂程度，上文所述步骤可以进行几次，优选地直至根据本发明方法鉴定的样品仅包含有限数目的或仅包含一种物质。优选地，所述样品包含具有相似化学属性和/或物理属性的物质，并且最优选地，该物质是相同的。优选地，进一步以适用于植物育种或植物细胞和组织培养中应用的方式配制根据上述方法鉴定的化合物或其衍生物。可以根据所述方法检验和鉴定的化合物可以是表达文库例如cDNA表达文库、肽、蛋白质、核酸、抗体、小分子有机化合物、激素、肽拟似物、PNA等(Milner，Nature Medicine 1(1995)，879-880；Hupp，Cell 83(1995)，237-245；Gibbs，Cell 79(1994)，193-198和其中引用的参考文献)。所述化合物也可以是已知抑制物或激活物的功能性衍生物或类似物。用于制备化学衍生物和类似物的方法是本领域技术人员熟知的并且在例如Beilstein，Handbook of Organic Chemistry，Springer edition New York Inc.，175Fifth Avenue，New York，N.Y.10010U.S.A.和Organic Synthesis，Wiley，New York，USA中描述。另外，可以根据本领域已知的方法检验所述衍生物和类似物的作用。另外，例如根据上文所述方法，可以使用适宜衍生物和类似物的肽拟似物和/或计算机辅助设计。可以在所述方法中使用的细胞或组织优选地是在前文实施方案中描述的本发明宿主细胞、植物细胞或植物组织。因此，在又一个实施方案中，本发明涉及根据鉴定本发明激动物的方法所获得或鉴定的化合物，所述化合物是本发明多肽的拮抗物。因此，在一个实施方案中，本发明还涉及通过鉴定本发明化合物的方法所鉴定的化合物。

在一个实施方案中，本发明涉及特异性识别本发明化合物或激动物的抗体。

本发明也涉及包含本发明前述核酸分子、反义核酸分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶、载体、蛋白质、抗体或化合物至少之一者的诊断组合物和任选地用于检测的合适手段。本发明的诊断组合物适用于从细胞分离mRNA并使如此获得的mRNA与包含如上文所述核酸探针的探针在杂交条件下接触，检测与该探针杂交的mRNA的存在性，并且因而检测该细胞中蛋白质的表达。检测本发明蛋白质存在性的其他方法包括本领域熟知的免疫技术，例如酶联免疫吸附测定。另外，可以使用本发明的核酸分子作为植物育种中的分子标记或引物。用于检测的合适手段是本领域技术人员熟知的，例如用于杂交测定的缓冲液和溶液，例如前述溶液和缓冲液，如在例如Sambrook等人中描述的用于DNA印迹、蛋白质印迹、RNA印迹等的其他手段是已知的。在一个实施方案中，诊断组合物含有PCR引物，其中将所述PCR引物设计成特异性检测在本发明的方法中待降低的核酸分子(例如本发明核酸分子)的存在性或表达水平或区分本发明或在本发明方法中待降低其活性的核酸分子的不同变体或等位基因。

在另一个实施方案中，本发明涉及试剂盒，该试剂盒包含本发明核酸分子、载体、宿主细胞、多肽或反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或核酶分子、或病毒核酸分子、抗体、植物细胞、植物或植物组织、可收获部分、繁殖材料和/或根据本发明方法鉴定的化合物和/或激动物。本发明试剂盒的化合物可以包装在容器如小瓶中，任选地在缓冲液和/或溶液中。根据需要，所述组分之一者或多者可能包装在一个且相同的容器中。另外或备选地，所述组分之一者或多者可以吸附至固体支持物，如硝化纤维素滤器、玻璃平板、芯片或尼龙膜或吸附至微量滴定平板的板孔上。该试剂盒可以用于本文所述的任意方法和实施方案，例如用于产生宿主细胞、转基因植物、药物组合物、检测同源序列、鉴定拮抗物或激动剂，作为食物或饲料或作为其补充物或作为用于治疗植物等的补充物。另外，该试剂盒可以包含该试剂盒用于任意所述实施方案的用途的说用书。在一个实施方案中，所述试剂盒还包含编码一种或多种前述蛋白质的核酸分子，和/或抗体、载体、宿主细胞、反义核酸、植物细胞或植物组织或植物。在另一个实施方案中，所述试剂盒包含旨在检测和区分在本发明方法中待减少的核酸分子例如本发明核酸分子的PCR引物。

在又一个实施方案中，本发明涉及用于产生农业用组合物的方法，所述方法提供根据本发明方法使用的核酸分子、本发明的核酸分子、本发明的载体、本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶或抗体、本发明的病毒核酸分子或多肽或包括用于鉴定所述化合物或激动物的本发明方法的步骤；和配制本发明的核酸分子、载体或多肽或激动物或根据本发明方法鉴定的化合物或以可用作植物农业用组合物的形式使用本发明的主题物。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于产生植物培养组合物的方法，该方法包括本发明方法的步骤；和以农业用组合物可接受的方式配制已鉴定的化合物。“作为农业用组合物可接受的”理解为该组合物符合管理杀真菌剂、植物营养物、除草剂等内容的法律规定。优选地，这种组合物对受保护的植物和以之为食的动物(包括人)没有任何伤害。

在本申请书的全文范围内，参考了多种出版物。全部这些出版物及在这些出版物中引用的那些参考文献的公开因而以全文并入本申请作为参考，以更充分地描述本发明所属领域的状态。还应当理解前文涉及本发明的优选实施方案并且可以在其中进行众多改变和变化而不脱离本发明的范围。本发明进一步由以下实施例说明，所述实施例无论如何将不得解释为限制性的。相反，将清晰地理解在阅读本文的描述内容后，多种其他其他实施方案、修改和其等同物自身可以展现于本领域技术人员眼前，而不脱离本发明的精神和/或权利要求书的范围。

实施例1通过过量表达编码DRCP的基因来工程化胁迫耐受性拟南芥植物

实施例1：分别克隆根据SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：50的本发明序列用于植物中表达除非另外说明，使用如Sambrook等人，Molecular Cloning：Alaboratory manual，Cold Spring Harbor 1989，Cold Spring HarborLaboratory Press中所述的标准方法。本发明序列通过PCR如Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶(Stratagene)技术方案中所述进行扩增。Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶(Stratagene)技术方案的组成如下：1x PCR缓冲液(Stratagene)，0.2mM每种dNTP，100ng的酿酒酵母(菌株S288C；Research Genetics，Inc.，现在的Invitrogen)或大肠杆菌(菌株MG1655；大肠杆菌遗传保藏中心)基因组DNA，50pmol正向引物，50pmol反向引物，2.5U Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶。扩增循环如下：酿酒酵母：1个循环2-3分钟94-95℃；随后以下25-36个循环，每个循环中1分钟95℃或30秒94℃，45秒50℃，30秒50℃或30秒55℃，和210-480秒72℃；随后1循环8分钟72℃，然后4℃。大肠杆菌：1个循环2-3分钟94℃；随后以下25-30个循环，每个循环中30秒95℃，30秒50-60℃，和5-10分钟72℃；随后1循环10分钟72℃，然后4℃。为克隆目的，将以下衔接头序列添加至酿酒酵母ORF特异性引物(见表IV)：i)正向引物：5’-GGAATTCCAGCTGACCACC-3’SEQ ID NO：5ii)反向引物：5’-GATCCCCGGGAATTGCCATG-3’SEQ ID NO：6为克隆目的，将以下衔接头序列添加至大肠杆菌ORF特异性引物：iii)正向引物：5’-TTGCTCTTCC-3’SEQ ID NO：7iiii)反向引物：5’-TTGCTCTTCG-3’SEQ ID NO：8因此，为了扩增和克隆酿酒酵母SEQ ID NO：50，使用由衔接头序列i)和ORF特异性序列SEQ ID NO：756组成的一条引物和由衔接头序列ii)和ORF特异性序列SEQ ID NO：757组成的第二条引物。为了扩增和克隆大肠杆菌SEQ ID NO：9，使用由衔接头序列iii)和ORF特异性序列SEQ ID NO：43组成的一条引物和由衔接头序列iiii)和ORF特异性序列SEQ ID NO：44组成的第二条引物。

构建用于蛋白质非靶向表达的双元载体“非靶向”表达在该上下文中意指没有额外的靶向序列添加至待表达的ORF。为了绿色组织中的偏好性非靶向组成型表达，以下双元载体用于克隆：pMTX155SEQ ID NO：1和VC-MME220-1qcz SEQ ID NO：2。为从酵母克隆ORF，使用含有增强型35S(Big35S)启动子SEQ ID NO：3(Comai等人，Plant Mol Biol 15，373-383(1990))的双元载体pMTX155。为从大肠杆菌克隆ORF，使用含有超启动子SEQ ID NO：4(Ni等人Plant Journal 7，661(1995)，WO95/14098)的双元载体VC-MME220-1qcz。其他有用的双元载体是技术人员已知的；可以在Hellens，R.，Mullineaux，P.和Klee H.，((2000)“农杆菌双元载体指南《A guide toAgrobacterium binary vectors》”，Trends in Plant Science，第5卷，第10期，446-451中找到双元载体及其用途的综述。此类载体应当同等地配备适宜的启动子和靶向序列。

为了将如上文所述从酿酒酵母扩增的ORF克隆到含有Resgen衔接头序列的载体(pMTX155)中，用限制酶NcoI处理该载体DNA。为了将源自大肠杆菌的ORF克隆到含有Colic衔接头序列的载体(C-MME220-1qcz)中，用限制酶PacI和NcoI按照标准方案(MBIFermentas)处理该载体DNA。在全部情况下，反应通过在70℃持续20分钟失活终止并经QIAquick或NucleoSpin Extract II柱，按照标准方案(Qiagen或Macherey-Nagel)纯化。随后，代表具备相应衔接头序列的所扩增ORF的PCR-产物和载体DNA用T4DNA聚合酶根据产生单链突出端的标准方案(MBI Fermentas)处理，参数对于载体是1单位T4DNA聚合酶在37℃持续2-10分钟，并且对于代表ORF的PCR产物是1-2单位T4DNA聚合酶在15-17℃持续10-60分钟。反应通过添加高盐缓冲液终止并经QIAquick或NucleoSpin Extract II柱，按照标准方案(Qiagen或Macherey-Nagel)纯化。将大约30-60ng制备的载体和定义量的制备的扩增物混合并且在65℃杂交15分钟，随后0.1℃/1秒降至37℃，随后在37℃杂交10分钟，随后0.1℃/1秒降温，然后4-10℃。通过添加感受态大肠杆菌细胞(菌株DH5α)并在1℃孵育20分钟，随后在42℃热休克90秒并冷却至1-4℃，在同一个反应容器中转化连接的构建体。随后，添加完全培养基(SOC)并且该混合物在37℃孵育45分钟。全部混合物随后涂布到含0.05mg/ml卡那霉素的琼脂平板上并在37℃孵育过夜。借助结合整合部位上游和下游，因而引起插入物扩增的引物，通过扩增验证克隆步骤的结果。扩增如Taq DNA聚合酶方案(Gibco-BRL)中所述实施。扩增循环如下：1个循环1-5分钟94℃；随后以下35个循环，每个循环中15-60秒94℃，15-60秒50-66℃，和5-15分钟72℃；随后1循环10分钟72℃，然后4-16℃。检验了几个菌落，不过仅一个菌落用于以下步骤使用，其中对该菌落检测到预期大小的PCR产物。该阳性菌落的一部分转移至充满补充有卡那霉素(50μg/ml)的完全培养基(LB)的反应容器中并在37℃孵育过夜。质粒制备如Qiaprep或NucleoSpin Multi-96Plus标准方案(Qiagen或Macherey-Nagel)中详述那样实施。

实施例2：产生分别表达SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：50的转基因植物。1-5ng分离的质粒DNA通过电穿孔或转化法转化至根癌农杆菌菌株GV 3101pMP90的感受态细胞(Koncz和Schell，Mol.Gen.Gent.204，383，1986)。随后，添加完全培养基(YEP)并且将该混合物转移至一只新反应容器在28℃持续3小时。随后，将全部混合物涂布到补充有相应抗生素例如利福平(0.1mg/ml)、庆大霉素(0.025mg/ml和卡那霉素(0.05mg/ml)的YEP琼脂平板上并在28℃孵育48小时。含有该质粒构建体的农杆菌随后用于植物的转化。借助移液器吸头从该琼脂平板挑取菌落并分散于3ml液体TB培养基，该培养基也含有如上所述的合适抗生素。该预培养物在28℃和120转/分钟培育48小时。400ml含有与上文相同的抗生素的LB培养基用于主培养物。将预培养物转移至主培养物中。该主培养物在28℃和120转/分钟培育18小时。在4000转/分钟离心后，沉淀重悬于浸润培养基(MS培养基，10％蔗糖)中。为了培育植物用于转化，培养皿(Piki Saat 80，绿色，配备筛底，30x20x4.5cm，来自Wiesauplast，Kunststofftechnik，德国)以GS 90基质(标准土壤，Werkverband E.V.，Germany)半充满。培养皿以0.05％Proplant溶液(比利时Chimac-Apriphar)浇灌过夜。拟南芥C24种子(诺丁汉姆拟南芥保藏中心，UK；NASC Stock N906)遍及该培养皿散布，每培养皿大约1000粒种子。培养皿覆以罩子并置于层积催芽设施中(8小时，110μmol/m²s，22℃；16小时，黑暗，6℃)。5日后，将培养皿置入短日照受控环境室(8小时，130μmol/m²s¹，22℃；16小时，黑暗，20℃)，在那里培养皿停留大约10日直至第一真叶已经形成。将幼苗移入含有相同基质的花钵(Teku花钵，7cm，LC系列，由

GmbH&Co制造，德国)。每个花钵挑入5株植物。随后，花钵返回短日照受控环境室以便植物继续生长。10日后，将植物转移至温室(补充光照，16小时，340μmol/m²s，22℃；8小时，黑暗，20℃)，在那里使植物进一步生长17日。为了转化，将刚开始开花的6周龄拟南芥植物浸入事先已经用10μlSilwett L77(Crompton S.A.，Osi Specialties，瑞士)处理过的上述农杆菌混悬液中10秒。相应方法在Clough和Bent，1998(Clough，JC和Bent，AF.1998成花浸渍法：用于农杆菌介导转化拟南芥的简化方法(Floral dip：asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana)，Plant J.16：735-743)中描述。植物随后置入湿润室18小时。随后，将花钵返回温室以便植物继续生长。植物该温室中停留另外10周，直至准备收获种子。取决于用于选择已转化植物的抗性标记，将收获的种子在温室中种植并接受喷洒选择，或首先进行消毒并随后在补充有相应选择剂的琼脂平板上培育。由于载体含有bar基因作为抗性标记，故而用0.02％

以2至3日间隔喷洒小植物4次并且允许转化的植物结种。植物在该温室中停留另外10周，直至准备收获种子。转基因拟南芥植物的种子贮存于冰箱内(在-20℃)。

实施例3：真菌抗性筛选

植物生长和实验设计在标准实验中，使用富营养土壤(GS90，Tantau，Wansdorf，德国)。将花钵填满土壤并置于托盘中。向托盘添加水以使土壤吸收适宜量的水用于播种流程。将转基因拟南芥C24植物的种子播种于花钵(直径10cm)中。随后，将装满的托盘用无孔的透明盖子盖住并转移到生长室的搁架系统中。每日对盖子和花钵喷水。在4℃黑暗中8小时，在20℃光照(220μmol/m²s)下16小时，相对湿度68％持续4日时间，建立层积催芽。4日后，将参数变成12小时光照和12小时黑暗并且撤除盖子。在播种后第5、7、10和12日通过从顶部喷洒带小植物的花钵进行BASTA选择。因此，喷洒BASTA浓缩剂(183g/l草铵膦)在自来水中的0.02％(v/v)溶液。播种后，在工作日期间改变托盘在生长室内部的位置。从托盘上撤除盖子后，根据需要进行浇水。在播种14日后，将植物种植在含有GS90的另一个花钵中，1个花钵中5株植物并且每个品系3个花钵。在1个托盘中将4个品系和1个野生型(在中央)安置在一起。托盘用盖子覆盖并喷洒3日。阳性(敏感＝pad3-1-wt-F1-(1))和阴性(抗性＝Col-0-Lehle-F1-(1))对照位于一个额外托盘中。播种28日后，在植物与野生型对照不同的情况下，评价表型信息。播种31日后，在托盘中添加高度1cm的自来水。1日后，植物用芸苔链格孢或链格孢(1.5x10⁶个孢子/ml)喷洒3次并再次盖住。每日用水喷洒盖子2次，持续2日。接种3和4日后，进行评价。

真菌的培育和接种在含有2％麦芽提取物的2％琼脂上维持植物致病性真菌芸苔链格孢和链格孢。平板在24℃以12小时光照/黑暗节律孵育。为接种植物，制备孢子混悬液。用2％麦芽提取物溶液淋洗20日龄真菌培养平板。粗制孢子-菌丝体混悬液经过1层滤网过滤。通过在Thoma室内计数确定孢子密度。使用具有密度1.5x10⁶个孢子/ml的新鲜收获的孢子混悬液来接种充分浇灌的植物。

对植物症状的评分与未转化的野生型对照植物相比对疾病症状评分。评分范围在1与5之间。计数全部3个花钵的具有萎黄色区和组织mazaration的症状的叶子。植物表型(大小和体型)对最终评分有影响。表2来自酵母(酿酒酵母)(列1)或大肠杆菌(列2)的ORF名单，所述ORF产生与非转化的野生型植物相比而言如第3列中所示的增强真菌抗性。

Seq ID NO	Orf	生物	对链格孢属物种的抗性
				9	B2664	大肠杆菌	链格孢和芸苔链格孢
50	YNL090w	酵母	链格孢和芸苔链格孢

材料和一般方法除非另外说明，实施例中的化学品和试剂从Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)获得，限制性核酸内切酶来自New England Biolabs(Beverly，MA)或Roche(Indianapolis，IN)，寡核苷酸由MWG Biotech Inc.(High Point，NC)合成，并且有关生物化学和分子生物测定法的其他修饰酶或试剂盒来自Clontech(Palo Alto，CA)、Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega Corporation(Madison，WI)或Stratagene(La Jolla，CA)。细胞培养基的材料从Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)或DIFCO(Detroit，MI)获得。本发明目的所实施的克隆步骤例如限制性切割、琼脂糖凝胶电泳、纯化DNA片段、转移核酸至硝化纤维素和尼龙膜、连接DNA片段、转化大肠杆菌细胞、培育细菌、增殖噬菌体和重组DNA的序列分析，如Sambrook(1989)所述实施。使用ABI激光荧光DNA序列仪，按照Sanger方法(Sanger 1977)实施重组DNA分子的测序。

实施例4：用甜菜胞囊线虫对拟南芥品系的初级筛选来自所选品系的足量种子包裹在滤纸袋子中并给予主观标示。包装的种子用于初级筛选。初级筛选由以下步骤组成：1)由氯气消毒，2)在选择培养基上培育；3)转移至测试平板；4)用定义量的J2幼虫接种测试平板中的籽苗；5)计数J4雌性线虫和胞囊和6)结果分析和7)选择先导品系。1.氯气消毒为消毒所选品系的种子，封装于Whatman滤纸中的种子在70％乙醇中进行表面消毒，随后浸泡在5％次氯酸钙中并用无菌水彻底淋洗。2.在选择培养基上培育幼苗在含有Murashige Skoog培养基的培养皿上培育由对于微生物试验基因的表达分离的群体组成的消毒种子，所述培养基含有添加的适宜选择剂。取决于拟南芥品系，所用的选择剂是50μg/ml草铵膦(Bayer Crop ScienceKansas City，MO)，100nM咪草烟(BASF公司，RTP，NC)或50μg/ml卡那霉素。全部种子置于4℃持续72小时并随后转移至设置在22℃的生长室。10日后，基于大小和颜色选择籽苗。不含转基因的各株幼苗(即无效分离子)发育不良且呈萎黄色。含有设计旨在表达任意给定微生物基因的转基因的各株幼苗是绿色的并具有充分伸展的子叶。选择这些个体转移至测试平板。3.转移至测试平板从中选择的幼苗用镊子转移至含有用0.8％Daishin琼脂固化的0.2浓度Knop培养基的12孔测试平板(Sijmons等人1991)和并在24℃的生长室中以16小时光周期维持10日。对于每个接种组，使用含有对照的至少两个平板。4.幼苗的接种转移的幼苗在相同条件下培育额外10日并随后用定义数目(90-100个)的消毒甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)J2幼虫接种。接种的籽苗于生长室中维持额外28日。5.数据获取28日后，取出平板并在解剖镜下观察。计数成熟雌虫(J4雌虫和成年阶段胞囊)的数目并记录结果。可以赋予每株接种的籽苗1-5的根评分，以1为小且以5为大。另外，在接种当日和计数当日拍摄高分辨率图像。6.分析筛选结果和选择先导品系记录的结果使用SAS软件包(SAS，Cary，NC)进行统计分析。结果的分析揭示了以特定批次线虫接种的组内部具有较低(推定的抗性品系)或较高(推定的超高易感品系)雌虫数目的品系组。从用产生每株籽苗10只成熟雌虫平均值的线虫批次所接种的组中选出具有较低成熟雌虫数的品系。

实施例5：所选拟南芥品系的确证筛选来自基于初级筛选所选出先导品系的足量种子包裹在滤纸袋子中并给予主观标示。包装的种子随后用于确证测定法中。验证测定法由与实施例1中相同的步骤组成，而差异描述如下。对于感染测定法，每株20株籽苗转移至含有Knop培养基的6孔平板旨在相对于12孔平板产生更大的根发育。每个平板含有来自一个品系的两株籽苗和两个对照。因此，每个平板含有两个试验品系并且全部复制物及给定品系的相应对照存在于10个平板上。籽苗以相对于第一次筛选的更大数目(250只)的消毒J2幼虫接种。这些幼虫从体外根培养物产生并且如实施例1中所述的消毒不是必需的。如先前例子中所述计数成熟雌虫并使用SAS软件包(SAS，Cary，NC)分析数据。仅认为具有平均每孔至少20只J4雌虫的相应对照并以p＜0.05与对照平板显示25％差异的那些品系是经确证的先导品系。在附图中显示针对过量表达由SEQ ID NO：9和50所述序列的已确证叶的胞囊计数数据。[0248.1.1.2]实施例6：用于大豆转化的编码PCP的基因的载体构建使用组成型启动子和大豆胞囊线虫(SCN)诱导型启动子产生过量表达由SEQ ID NO：9和50和762所述的PCP基因的植物转化双元载体。为此，由SEQ ID NO：9和50和762所述的可读框有效连接于组成型遍在蛋白启动子和SCN诱导型启动子TPP-样和MtN3-样。所得植物双元载体含有由赋予除草剂Arsenal抗性的改良拟南芥AHAS基因组成的植物转化选择标记。将设计的旨在过量表达PCP的双元载体转化到卸甲发根农杆菌(A.rhizogenes)菌株K599，为转化和SCN生物测定法以确定对SCN胞囊计数的影响作好准备。

实施例7：线虫生物测定法将使用生根的外植体测定法展示表达和所得的线虫抗性。该测定法可以在文中并入作为参考的2006年年12月21日提交的共同待决申请USSN60/871,258和在下文描述中找到。大豆种子萌发来自大豆栽培品种W82的清洁大豆种子在一个房间内用逐滴添加3.5ml12N HCl至100ml漂白液中产生的氯气消毒。全部操作在通风橱内进行。在该房间内24小时后，将种子移出并立即使用或贮存在室温直至使用。剔除褪色和开裂的种子。为浸润种子，将温热的GM培养基倾倒在种子周围，直至种子被该培养基完全覆盖。幼苗在光照下(150μM m^-2s^-1)培育5-7日直至上胚轴伸展超过子叶。幼苗可以用于转化之前贮存在4℃过夜。GM(萌发培养基)包含：1X B5盐和维生素、1X MS铁母液、2％蔗糖和0.8％Noble琼脂，pH5.8。农杆菌制备在农杆菌接种3日前，农杆菌培养物例如卸甲发根农杆菌菌株K599液体培养物置入28℃振荡培养箱中的5ml LB+Kan50(含有50μg/ml卡那霉素)培养基过夜。次日，取出1ml培养物并涂布到LB+Kan50琼脂平板上。该平板在28℃培养箱中孵育2日。在两日时间结束时，该平板将覆盖以浓厚菌落。每50个待接种的外植体制备一个平板。大豆外植体的制备-子叶使用含有其与幼苗连接的近端的子叶作为另一种类型的转化用外植体。切口末端是农杆菌接种的靶。用发根农杆菌转化大 豆植物和共培养从幼苗切下外植体后，切口末端立即浸入在实施例3中制备的浓稠发根农杆菌菌落，从而在切口末端上可见所述菌落。外植体置于培养皿中用于共培养的1％琼脂上。在一个培养皿上放置大约10个外植体。培养皿用Saran封皮密封并在25-27℃在30～50mmol m^-2S^-1光照下共培养6日。大豆植物根诱导在转化和共培养步骤后，将大豆外植体转移至含有选择剂例如用于Bar基因选择(De Block等人1987)的S-B5-605或用于AHAS基因选择的S-B5-708的生根诱导培养基。如此插入外植体，从而在底部的愈伤组织刚好在培养基表面之下。每个培养皿中放置6至9个外植体。培养物将维持在与共培养步骤相同的条件下。S-B5-605培养基包含：0.5X B5盐、3mM MES、2％蔗糖、1X B5维生素、400μg/ml特美汀、0.8％Noble琼脂和3μg/ml草铵膦(Bar基因的选择剂)，pH 5.8。S-B5-708培养基包含：0.5X B5盐、3mM MES、2％蔗糖、1X B5维生素、400μg/ml特美汀、0.8％Noble琼脂和1μM咪唑烟酸(Imazapyr)(AHAS基因的选择剂)，pH5.8。大豆根伸长/生长根诱导2至3周后，转化的根在外植体切口末端上形成。在转移期间除去位于高过愈伤组织的组织上的伸长根。对于bar基因选择，将外植体转移至补充有3mg/l草铵膦和400mg/l特美汀而不含IBA的根伸长培养基(S-MS-607培养基)以进一步选择。对于AHAS2基因选择，将外植体转移至相同的选择培养基(S-B5-708培养基)以进一步选择。转基因根在1周内于该培养基内良好繁殖并准备进行传代培养。S-MS-607培养基包含：0.2X MS盐和B5维生素、2％蔗糖、400mg/l特美汀和3mg/L草铵膦，pH5.8。收获和传代培养用于生物测定法的大豆转基因根从生根的外植体切下强壮和白色的大豆根并在6孔平板或Petri平板中补充有200mg/l特美汀的根生长培养基(S-MS-606培养基)内培养。去除主根尖以诱导次生根生长。培养物维持在室温黑暗条件下。将每个根事件传代培养成3个不同的孔作为重复。每个孔内传代培养的根应当旺盛地长出侧根。S-MS-606培养基包含：0.2X MS盐和B5维生素、2％蔗糖和200mg/l特美汀，pH5.8。线虫测定法传代培养1至5日后，在目的基因或启动子构建体测定的多孔平板中用表面消毒的线虫幼体接种根。作为对照，使用大豆栽培品种Williams 82对照载体根和Jack对照载体根。占据至少一半孔的每个品系的根培养物用表面消毒的大豆胞囊线虫(SCN)第二期幼虫(J2)的3号生理小种以500个J2/孔的水平接种。平板随后密封并放回培养箱，在25℃黑暗中。从每次双元载体转化中产生几个独立的根品系并且所述品系将用于生物测定法。线虫接种4周后，计数每个孔内的胞囊。作为用于转基因构建体X的命名的例子，构建体XL16意指从采用PCP载体(构建体X)的转化中产生品系16。线虫接种4周后，计数每个孔内的胞囊。雌虫指数是胞囊数目与易感栽培品种Williams82相比较的关系。对于每个转化品系，确定几个重复孔(重复数由“n”显示)、每孔平均胞囊数(MEAN)和标准误(SE)值和雌虫指数(FI(％))。

实施例8密码子优化的YNL090W(co)(SEQ ID NO：762)的线虫生物测定法使用在共同拥有的待决USSN 12/001,234中公开的生根植物测定系统，开展生物测定法以评估由本文所述多核苷酸赋予的线虫抗性。在用上述的双元载转化后，产生转基因根。多个转基因根品系用表面消毒的大豆胞囊线虫(SCN)第二期幼虫(J2)的3号生理小种以约500个J2/孔的水平接种。线虫接种4周后，计数每个孔内的胞囊。对于每个转化构建体，计算每品系胞囊数以确定针对该构建体的平均胞囊计数和标准误。每个转化构建体的胞囊计数值与平行测试的空载体对照的胞囊计数值进行比较，以确定测试的构建体是否导致胞囊计数降低。如表3和附图中所示，当有效连接于SCN诱导型启动子MtN3样(SEQ ID NO：680)时，含有由SEQ ID NO：762所述的基因的构建体的生物测定结果显示产生胜过众多测试品系的降低大豆胞囊线虫胞囊计数的总体趋势。表3对密码子优化的YNL090W产生的构建体：

基因	构建体	启动子	SCN生物测定结果
				YNL090W(co)	密码子优化的	MtN3样	减少的胞囊

YNL090W(co)SCN生物测定法数据显示59％测试品系位于对照平均值的95％置信区间以下。这显示与对照相比而言胜过大部分所测试品系的胞囊计数降低的总体趋势。

根据上文公开的实施例，技术人员能够克隆表I、优选第5列中公开的全部序列。

实施例9通过过量表达例如来自酿酒酵母或大肠杆菌或来自欧洲油菜、大豆、玉米或稻的胁迫相关基因来工程化具有提高的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性的苜蓿植物使用(McKersie等，1999 Plant Physiol 119：839-847)的方法转化苜蓿的再生性克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生性植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW和AAtanassov(1985.Plant Cell Tissue Culture 4：111-112)所述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯康星大学)用于组织培养(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。叶柄外植体与含有双元载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999Plant Physiol 119：839-847)或LBA4404的过夜培养物共培育。已经描述了用于植物转化的众多不同的双元载体系统(例如An，G.在Agrobacterium Protocols，Methods in Molecular Biology第44卷，第47-62页，Gartland KMA和MR Davey编著，Humana Press，Totowa，NewJersey)。多种双元载体基于Bevan描述的载体pBIN19(Nucleic AcidResearch.1984.12：8711-8721)，所述pBIN19载体包含侧翼分布有源自根癌农杆菌Ti质粒的左边界和右边界序列的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两个基因-选择标记基因和调节性状基因cDNA或基因组DNA的转录的植物启动子组成。如上所述，可以使用多种选择标记基因，包括编码突变乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(美国专利57673666和6225105)。类似地，可以使用多种启动子来调节性状基因以提供对基因转录的组成型、发育性、组织或环境性调节。在本实施例中，使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)来提供对性状基因的组成型表达。所述外植体在黑暗中于含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K₂SO₄和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。所述外植体在半浓度的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并铺种在不含乙酰丁香酮而含有抑制农杆菌生长的合适选择剂和合适抗生素的相同SH诱导培养基上。几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半浓度Murashige-Skoog培养基上萌发。生根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。T0转基因植物通过结节插条繁殖并且在Turface生长培养基中生根。将植物脱叶并培育至约10cm高度(在脱叶后大约2周)。植物随后接受植物疾病、优选地致病性真菌和/或线虫处理。使用如实施例3或7中所述的方法测量植物疾病耐受性、优选致病性真菌和/或线虫耐受性。耐受植物疾病、优选耐受致病性真菌和/或线虫的植物比易感植物具有更高的存活率和生物量生产，包括种子产量、光合作用和干物质生产。实施例10通过过量表达例如来自酿酒酵母或大肠杆菌或来自欧洲油菜、大豆、玉米或稻的胁迫相关基因来工程化具有提高的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性的黑麦草植物可以使用几个不同黑麦草品种的种子作为外植体来源用于转化，所述品种包括可从Svalof Weibull种子公司获得的商业品种Gunne或品种Affinity。种子依次用1％Tween-20持续1分钟、100％漂白粉持续60分钟、用去离子水和蒸馏H₂O淋洗3次(每次5分钟)进行表面消毒，并且随后在潮湿、无菌的滤纸上在黑暗中萌发3-4日。幼苗再次用1％Tween-20持续1分钟、75％漂白剂持续60分钟、用dd H₂O淋洗3次(每次5分钟)进行表面消毒。将表面消毒的种子置于含有Murashige和Skoog基础盐和维生素、20g/l蔗糖、150mg/l天冬酰胺、500mg/l酪蛋白水解物、3g/l植物凝胶、10mg/l BAP和5mg/l麦草畏的愈伤组织诱导培养基上。将平板在25℃于黑暗中孵育4周以萌发种子和胚发生愈伤组织诱导。在愈伤组织诱导培养基上4周后，剪去幼苗的小苗和根，将愈伤组织转移至新鲜培养基，维持培养另外4周，并且随后转移至MSO培养基在光照下2周。使几片愈伤组织(11-17周龄)滤过10目筛并置于愈伤组织诱导培养基上，或在250ml烧瓶内的100ml液体黑麦草愈伤组织诱导培养基(与具琼脂的用于愈伤组织诱导的培养基相同)中培养。烧瓶用箔片包裹并在23℃于黑暗中175转/分钟振摇1周。用40目筛过滤液体培养物以收集细胞。将筛子上所收集的部分涂布在固体黑麦草愈伤组织诱导培养基上并在25℃于黑暗中培养1周。随后将愈伤组织转移至含有1％蔗糖的MS培养基并在其上培养2周。转化可以用农杆菌或用粒子轰击方法完成。产生了表达载体，其含有组成型植物启动子和在pUC载体中的所述基因的cDNA。使用Qiagen试剂盒根据制造商说明书，从大肠杆菌细胞制备质粒DNA。大约2g胚发生愈伤组织涂布在培养皿中的无菌滤纸的中央。含10g/l蔗糖的等份液体MSO添加至该滤纸上。金粒子(大小1.0μm)根据Sanford等人1993年的方法用质粒DNA涂敷并按照以下参数送递至胚发生愈伤组织：500μg粒子和2μg DNA/每次射击，1300psi和从终止平板至愈伤组织平板的靶距离8.5cm并且1次射击/每个愈伤组织平板。轰击后，将愈伤组织转移回新鲜愈伤组织发育培养基并在黑暗中于室温维持1周时间。随后将愈伤组织转移至光照下在25℃的生长条件以用合适的选择剂(例如250nM Arsenal(咪唑烟酸)、5mg/l PPT或50mg/L卡那霉素)启动胚分化。抵抗该选择剂的小苗出现并且一旦生根，则被转移至土壤。原代转基因植物(T0)的样品通过PCR分析以证实T-DNA的存在。这些结果通过Southern杂交证实，在所述Southern杂交中将DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳并转移至带正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)。使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)来通过PCR制备洋地黄甙标记的探针并且如制造商推荐那样使用。转基因T0黑麦草植物通过切下分蘖以营养方式繁殖。在温室中维持移植的分蘖2个月直至充分建立。使小苗脱叶并允许其生长2周。使用如实施例3或7中所述的方法测量植物疾病耐受性、优选致病性真菌和/或线虫耐受性。耐受植物疾病、优选耐受致病性真菌和/或线虫的植物比易感植物具有更高的存活率和生物量生产，包括种子产量、光合作用和干物质生产。实施例11通过过量表达例如来自酿酒酵母或大肠杆菌或来自欧洲油菜、大豆、玉米或稻的胁迫相关基因来工程化具有提高的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性的稻植物稻转化使用含有本发明表达载体的农杆菌来转化稻植物。将稻粳型栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过如下方式实施消毒：在70％乙醇中孵育1分钟，随后在0.2％HgCl₂中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟。无菌的种子随后在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育4周后，将胚发生的盾片衍生的愈伤组织切下并在相同的培养基上增殖。2周后，将所述愈伤组织通过在同一种培养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。胚发生愈伤组织片在新鲜培养基上传代培养3日，随后共培育(以助长细胞分裂活性)。将含有本发明表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后收集细菌并在液体共培育培养基中悬浮至密度(OD₆₀₀)约1。该混悬液随后转移至培养皿内并将所述愈伤组织浸入此混悬液中15分钟。该愈伤组织随后在滤纸上蘸干并转移至固化的共培育培养基，并在25℃于黑暗中孵育3日。共培育的愈伤组织在含2，4-D的培养基上在28℃于黑暗中在选择剂存在下培育4周。在此期间，迅速生长的抗性愈伤组织团发育。将这种材料转移至再生培养基并在光照下孵育后，释放了胚发生潜能并且小苗在随后4至5周内发育。将小苗从愈伤组织上切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，将小苗从所述培养基转移至土壤。硬化的小苗在温室中于高湿度和短日照下培育。针对一个构建体，产生大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留针对所述选择剂显示抗性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移栽后3至5个月收获。该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等1993，Hiei等1994)。使用如实施例3或7中所述的方法测量植物疾病耐受性、优选致病性真菌和/或线虫耐受性。耐受植物疾病、优选耐受致病性真菌和/或线虫的植物比易感植物具有更高的存活率和生物量生产，包括种子产量、光合作用和干物质生产。实施例12通过过量表达例如来自酿酒酵母或大肠杆菌或来自欧洲油菜、大豆、玉米或稻的胁迫相关基因来工程化具有提高的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性的大豆植物根据对Texas A&M美国专利5,164,310中所述方法的以下改良形式转化大豆。几个商业化大豆品种适合于通过这种方法转化。栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)通常用于转化。通过在70％(v/v)乙醇浸泡6分钟并且补充有0.1％(v/v)Tween的商业漂白剂(NaOCl)中浸泡20分钟消毒，随后用无菌重蒸水淋洗4次，将种子消毒。从每株幼苗除去胚根、下胚轴和一片子叶而繁殖7日龄幼苗。随后，带有一片子叶的上胚轴转移至培养皿中的新鲜萌发培养基并在25℃在16小时光周期下(大约100μE-m-2s-1)孵育3周。从3-4周龄的植物切下腋生结节(长度约4mm)。将腋生结节切下并在农杆菌LBA4404培养物中孵育。已经描述了用于植物转化的众多不同的双元载体(例如An，G.在Agrobacterium Protocols，Methods in Molecular Biology第44卷，第47-62页，Gartland KMA和MR Davey编著，Humana Press，Totowa，NewJersey)。多种双元载体基于Bevan描述的载体pBIN19(Nucleic AcidResearch.1984.12：8711-8721)，所述pBIN19载体包含侧翼分布有源自根癌农杆菌Ti质粒的左边界和右边界序列的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两个基因-选择标记基因和调节性状基因cDNA或基因组DNA的转录的植物启动子组成。可以使用多种选择标记基因，包括编码突变乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(美国专利57673666和6225105)。类似地，可以使用多种启动子来调节性状基因以提供对基因转录的组成型、发育性、组织或环境性调节。在本实施例中，可以使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)来提供对性状基因的组成型表达。在共培育处理之后，洗涤外植体并转移至补充有500mg/L特美汀的选择培养基。切下小苗并置于小苗伸长培养基上。将长度超过1cm的小苗置于生根培养基2至4周，随后移植至土壤。原代转基因植物(T0)通过PCR分析以证实T-DNA的存在。这些结果通过Southern杂交证实，在所述Southern杂交中将DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳并转移至带正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)。使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)来通过PCR制备洋地黄甙标记的探针并且如制造商推荐那样使用。使用如实施例3或7中所述的方法测量植物疾病耐受性、优选致病性真菌和/或线虫耐受性。耐受植物疾病、优选耐受致病性真菌和/或线虫的植物比易感植物具有更高的存活率和生物量生产，包括种子产量、光合作用和干物质生产。实施例13通过过量表达例如来自酿酒酵母或大肠杆菌或来自欧洲油菜、大豆、玉米或稻的胁迫相关基因来工程化具有提高的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性的油菜籽/卡诺拉油菜植物使用5-6日龄年幼幼苗的子叶柄和下胚轴作为组织培养的外植体并且根据Babic等人(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)转化。商业品种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，不过可以使用其他品种。含有双元载体的根癌农杆菌LBA4404可以用于卡诺拉油菜转化。已经描述了用于植物转化的众多不同的双元载体(例如An，G.在Agrobacterium Protocols，Methods in Molecular Biology第44卷，第47-62页，Gartland KMA和MR Davey编著，Humana Press，Totowa，NewJersey)。多种双元载体基于Bevan描述的载体pBIN19(Nucleic AcidResearch.1984.12：8711-8721)，所述pBIN19载体包含侧翼分布有源自根癌农杆菌Ti质粒的左边界和右边界序列的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两个基因-选择标记基因和调节性状基因cDNA或基因组DNA的转录的植物启动子组成。可以使用多种选择标记基因，包括编码突变乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(美国专利57673666和6225105)。类似地，可以使用多种启动子来调节性状基因以提供对基因转录的组成型、发育性、组织或环境性调节。在本实施例中，可以使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)来提供对性状基因的组成型表达。卡诺拉油菜种子在70％乙醇中持续2分钟，随后在含一滴Tween-20的30％Clorox中持续10分钟进行表面消毒，随后用消毒蒸馏水淋洗3次。种子随后在不含激素、1％蔗糖、0.7％植物琼脂的半浓度MS培养基上，在23℃体外萌发16小时。从体外籽苗切下带子叶的子叶柄外植体，并通过将子叶柄外植体的切口端浸入细菌混悬液而用农杆菌接种。所述外植体随后在23℃，16小时光照下于含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培养基上培养2日。与农杆菌共培育2日后，将所述叶柄外植体转移至含有3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7日，并且随后在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至小苗再生。当小苗长度是5-10mm时，切下这些小苗并转移至小苗伸长培养基(MSBAP-0.5，含有0.5mg/l BAP)。将长度大约2cm的小苗转移至生根培养基(MS0)用于根诱导。原代转基因植物(T0)的样品通过PCR分析以证实T-DNA的存在。这些结果通过Southern杂交证实，在所述Southern杂交中将DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳并转移至带正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)。使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)来通过PCR制备洋地黄甙标记的探针并且如制造商推荐那样使用。使用如实施例3或7中所述的方法测量植物疾病耐受性、优选致病性真菌和/或线虫耐受性。耐受植物疾病、优选耐受致病性真菌和/或线虫的植物比易感植物具有更高的存活率和生物量生产，包括种子产量、光合作用和干物质生产。实施例14通过过量表达例如来自酿酒酵母或大肠杆菌或来自欧洲油菜、大豆、玉米或稻的胁迫相关基因来工程化具有提高的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性的谷物植物玉米(Zea Mays L.)的转化用Ishida等人(1996).Nature Biotech14745(-50)：745-50所述方法的改良形式进行。在谷物中，转化是基因型依赖的并且仅特定基因型适合于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂交体是用于转化的供体材料的良好来源(Fromm等人，1990Biotech 8：833-839，不过其他基因型也可以成功地使用。从授粉后(DAP)大约11日的谷物植物收获谷穗，此时不成熟胚的长度是约1至1.2mm。将不成熟胚与携带“超级双元”载体的根癌农杆菌共培养，并且通过器官发生作用恢复转基因植物。日本烟草的超级双元载体系统在WO专利WO94/00977和WO95/06722中描述。可以使用多种选择标记基因，包括编码突变乙酰羟酸合酶(AHAS)的玉米基因(美国专利6025541)。类似地，可以使用多种启动子来调节性状基因以提供对基因转录的组成型、发育性、组织或环境性调节。在本实施例中，使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)来提供对性状基因的组成型表达。切下的胚在愈伤组织诱导培养基上培育，随后在含有咪唑啉酮作为选择剂的玉米再生培养基上培育。培养平板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至小苗发育。来自每一胚的绿色小苗转移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。生根的小苗移植至温室中的土壤内。从显示耐受咪唑啉酮除草剂并对转基因为PCR阳性的植物产生T1种子。随后评价T1转基因植物的改善的胁迫耐受性。使用如实施例3或7中所述的方法测量植物疾病耐受性、优选致病性真菌和/或线虫耐受性。耐受植物疾病、优选耐受致病性真菌和/或线虫的植物比易感植物具有更高的存活率和生物量生产，包括种子产量、光合作用和干物质生产。实施例15通过过量表达例如来自酿酒酵母或大肠杆菌或来自欧洲油菜、大豆、玉米或稻的胁迫相关基因来工程化具有提高的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性的小麦植物用Ishida等人(1996，Nature Biotech.14745-50)所述的方法开展小麦转化。栽培品种Bobwhite(可从墨西哥CYMMIT获得)通常用于转化中。不成熟的胚与携带“超级双元”载体的根癌农杆菌共培养，并且通过器官发生作用恢复转基因植物。日本烟草的超级双元载体系统在WO专利WO94/00977和WO95/06722中描述。可以使用多种选择标记基因，包括编码突变乙酰羟酸合酶(AHAS)的玉米基因(美国专利6025541)。类似地，可以使用多种启动子来调节性状基因以提供对基因转录的组成型、发育性、组织或环境性调节。在本实施例中，使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)来提供对性状基因的组成型表达。在与农杆菌孵育后，胚在愈伤组织诱导培养基上培育，随后在含有咪唑啉酮作为选择剂的再生培养基上培育。培养平板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至小苗发育。将源自每个胚的绿色小苗转移至生根培养基并在25℃孵育2-3周，直至根发育。生根的小苗移植至温室中的土壤内。从显示耐受咪唑啉酮除草剂并对转基因为PCR阳性的植物产生T1种子。随后根据先前实施例3中描述的方法评价T1转基因植物的改善的胁迫耐受性。T-DNA单基因座插入的T1世代将对该转基因以3∶1比率分离。含有该转基因一个或两个拷贝的那些子代耐受咪唑啉酮除草剂，并且比缺少该转基因的那些子代显示更大的生物胁迫或干旱胁迫耐受性。耐受性植物比易感的植物具有更高的存活率和生物量生产，包括种子产量、光合作用和干物质生产。纯合的T2植物显示相似的表型。使用如实施例3或7中所述的方法测量植物疾病耐受性、优选致病性真菌和/或线虫耐受性。耐受植物疾病、优选耐受致病性真菌和/或线虫的植物比易感植物具有更高的存活率和生物量生产，包括种子产量、光合作用和干物质生产。实施例16同一基因和异源基因的鉴定基因序列可以用来从cDNA或基因组文库鉴定同一或异源基因。可以使用例如cDNA文库通过核酸杂交分离同一基因(例如全长cDNA克隆)。取决于目的基因的丰度，将100,000至多到1,000,000个重组噬菌体铺展并转移至尼龙膜。用碱变性后，DNA通过如UV交联作用固定在该膜上。杂交在高严格条件下实施。在水溶液中，杂交和洗涤在1M NaCl离子强度和68℃温度进行。杂交探针通过例如放射性(³²P)切口转录标记法(HighPrime，Roche，Mannheim，德国)产生。通过放射自显影检测信号。部分同一或相关但不同一的异源基因可以按照与上文所述方法类似的方式，使用低严格杂交和洗涤条件鉴定。对于水性杂交，离子强度通常保持在1M NaCl，而温度从68℃逐步降低至42℃。可以通过使用合成的放射标记寡核苷酸探针实施仅在独特结构域(例如10-20个氨基酸)内具有同源性(或序列同一性/相似性)的基因序列的分离。放射标记的寡核苷酸通过用T4多核苷酸激酶磷酸化两条互补性寡核苷酸的5引发端制备。互补寡核苷酸复性并连接以形成多联体。双链多联体随后通过例如切口转录进行放射标记。杂交通常在使用高寡核苷酸浓度的低严格条件下进行。寡核苷酸杂交溶液：6x SSC0.01M磷酸钠1mM EDTA(pH8)0.5％SDS100μg/ml变性鲑精DNA0.1％脱脂乳在杂交期间，温度逐步降低到估计的寡核苷酸T_m以下5-10℃或降低至室温，随后进行洗涤步骤和放射自显影。洗涤可以用低严格条件如使用4x SSC的3个洗涤步骤进行。其他细节由Sambrook，J.等人，1989，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual，”Cold Spring HarborLaboratory Press或Ausubel，F.M.等人，1994，“Current Protocols inMolecular Biology，”John Wiley&Sons描述。实施例17通过用抗体筛选表达文库鉴定同源或直向同源基因c-DNA克隆可以用来例如在大肠杆菌(例如Qiagen QIA表达pQE系统)中产生重组多肽。重组多肽随后一般通过Ni-NTA亲和层析(Qiagen)进行亲和纯化。重组多肽随后用产生特异性抗体，例如通过使用兔免疫标准技术。如Gu等人，1994，BioTechniques 17：257-262所述，使用以重组抗原饱和的Ni-NTA柱将抗体亲和纯化。该抗体随后可以用来通过免疫筛选法筛选cDNA表达文库以鉴定直向同源或异源基因(Sambrook，J.等人，1989，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual，”Cold Spring HarborLaboratory Press或Ausubel，F.M.等人，1994，“Current Protocols inMolecular Biology，”John Wiley&Sons)。实施例18体内诱变微生物的体内诱变可以通过质粒(或其他载体)DNA经维持其遗传信息完整性的能力遭受破坏的大肠杆菌或其他微生物(例如芽孢杆菌某些物种或酵母如酿酒酵母)传代进行。常见的突变株在用于DNA修复系统的基因中具有突变(例如，mutHLS、mutD、mutT等；参考文件，见Rupp，W.D.，1996，DNA修复机制(DNA repair mechanisms)，在：Escherichia coli andSalmonella，第2277-2294页，ASM：Washington)。此类菌株是本领域技术人员熟知的。此类菌株的用途在例如Greener，A.和Callahan，M.，1994，Strategies 7：32-34中说明。在选择和在微生物中测试后，优选地将突变的DNA分子转移到植物中。根据本文件示例部分中的多个实施例产生转基因植物。实施例19通过使用胁迫诱导型和组织特异性启动子过量表达来自欧洲油菜、大豆、玉米或稻的编码产量相关和胁迫相关蛋白的基因来工程化具有提高的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性的拟南芥植物如上所述产生过量表达来自欧洲油菜、大豆、玉米和稻的编码胁迫相关蛋白的基因的转基因拟南芥植物以在组织特异性启动子或胁迫诱导型启动子控制下表达编码胁迫相关蛋白的转基因。产生T2世代植物并以胁迫处理。使用如实施例3或7中所述的方法测量植物疾病耐受性、优选致病性真菌和/或线虫耐受性。耐受植物疾病、优选耐受致病性真菌和/或线虫的植物比易感植物具有更高的存活率和生物量生产，包括种子产量、光合作用和干物质生产。

附图：图1用于克隆目的基因以非定向表达的载体pMTX155(SEQ ID NO：1)图2用于克隆目的基因以非定向表达的载体VC-MME220-1qcz(SEQID NO：2)图3：密码子优化的YNL090W的生物测定法数据：数字表示SCN胞囊计数。列表示对所有测试品系进行SCN胞囊计数的平均值。误差线表示该平均值的95％置信区间。图4：显示了描述组成型过量表达的基因ID和相关的二次筛选品系编号、SEQ ID NO和生物测定法数据附图编号的表。图5：显示在过量表达大肠杆菌基因b2664的品系286中观察到的下降的根线虫侵染率。该表包括MC24对照和所测试品系286株植物的胞囊计数的原始数据。图6：显示平均胞囊计数，误差线表示平均标准误。图7：显示在过量表达酵母基因YNL090W的品系37中观察到的下降的根线虫侵染率。该表包括对MC24对照和品系37所测试的植物原始数据。图8：显示平均胞囊计数，误差线表示平均标准误。图9：显示在过量表达酵母基因YNL090W的品系400中观察到的下降的根线虫侵染率。该表包括对MC24对照和品系400所测试的植物原始数据。图10：显示平均胞囊计数，误差线表示平均标准误。图11：显示在过量表达酵母基因YNL090W的品系401中观察到的下降的根线虫侵染率。该表包括对MC24对照和品系401所测试的植物原始数据。图12：显示平均胞囊计数，棒表示平均标准误。图13和14显示了描述SEQ ID NO 1-14的同源物的表。显示了鉴定的相应同源物、同源物生物、同源物SEQ ID NO和对前导序列的同源物同一性百分数。图15：显示已鉴定的与SEQ ID NO：2(b2664)相对应的同源物的矩阵表。加灰色阴影的表格表示相应氨基酸序列的SEQ ID NO。无阴影的表格表示对该表x轴和y轴上相应表格内相交的SEQ ID NO为特异的两个SEQID NO的总体氨基酸同一性百分数。图16：显示已鉴定的与SEQ ID NO：10(YNL090W)相对应的同源物的矩阵表。加灰色阴影的表格表示相应氨基酸序列的SEQ ID NO。无阴影的表格表示对该表x轴和y轴上相应表格内相交的SEQ ID NO为特异的两个SEQ ID NO的总体氨基酸同一性百分数。

Claims (16)

1.用于产生与相应的非转化野生型对照相比较而言具有提高的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性的转基因植物细胞、植物或其部分的方法，其中所述方法包括步骤：

a)向植物细胞导入编码来自酵母和/或埃希氏菌属(Escherichia)的“疾病抗性赋予蛋白”DRCP的多核苷酸；

b)从该植物细胞产生表达所述多核苷酸的转基因植物。

2.根据权利要求1的方法，其中所述的DRCP具有选自以下的活性：GTP酶、非必需的小GTP酶、转录调节物gabP 3’区、具有结合DNA的翼状螺旋结构域35的转录阻遏蛋白(GntR家族)和结合DNA的转录性双重调节蛋白。

3.用于通过提高或产生一种或多种选自以下的活性，产生与相应的非转化野生型对照相比较而言具有提高的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性的转基因植物细胞、植物或其部分的方法，所述活性选自GTP酶、非必需的小GTP酶、转录调节物gabP 3’区、具有结合DNA的翼状螺旋结构域35的转录阻遏蛋白(GntR家族)和结合DNA的转录性双重调节蛋白。

4.根据权利要求3的方法，其中提高或产生至少一种多肽的活性，所述多肽包含选自以下的多肽：

(i)分别包含表II或表IV的第5列或第7列中所述的多肽、共有序列或至少一个多肽基序的多肽；或

(ii)包含表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子的表达产物，或者

(iii)(i)或(ii)的功能等同物。

5.权利要求1或3所述的方法，其中增加或产生至少一种核酸分子的表达，所述核酸分子包含选自以下的核酸分子：

a)核酸分子，其编码在表II第5列或第7列中显示的或包含表II第5列或第7列中所示多肽的多肽；

b)表I第5列或第7列中所示的核酸分子；

c)核酸分子，其能够因遗传密码的简并性从表II第5列或第7列中所述的多肽序列衍生并且赋予与相应的非转化野生型对照、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；

d)核酸分子，其与包含在表I第5列或第7列中所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％同一性并且赋予与相应的非转化野生型对照、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；

e)核酸分子，其编码多肽并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性，其中所述多肽与由(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性并具有由包含表II第5列中所描述多核苷酸的多肽所代表的活性；

f)核酸分子，其与(a)至(c)的核酸分子在严格杂交条件下杂交并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；

g)编码多肽并具有由包含表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性的核酸分子，其中所述多肽能够借助针对由(a)至(e)的核酸分子之一编码的多肽所制备的单克隆或多克隆抗体分离；

h)编码多肽的核酸分子，其中所述多肽包含表IV第7列中所示的共有序列或一个或多个多肽基序并且优选地具有由包含表II或表IV的第5列中所述多肽的蛋白质所代表的活性；

i)核酸分子，其编码具有表II第5列中描述的蛋白质所代表活性的多肽并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；

j)核酸分子，其包含通过使用表III第7列中的引物扩增cDNA文库或基因组文库所获得的多核苷酸并且优选地具有由包含表II第5列中所述多肽的蛋白质代表的活性，和

k)通过用包含核酸分子(a)或(b)的互补序列的探针或用其片段在严格杂交条件下筛选合适的核酸文库能够获得的核酸分子，其中所述的片段具有与在(a)至(e)中表征并编码下述多肽的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选地至少20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，所述多肽具有由包含如表II第5列中所述多肽的蛋白质代表的活性。

6.权利要求1或3所述的方法，其中与相应的非转化野生型对照相比较而言具有提高的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性的转基因植物细胞、植物或其部分衍生自单子叶植物。

7.权利要求1或3所述的方法，其中与相应的非转化野生型对照相比较而言具有提高的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性的转基因植物细胞、植物或其部分衍生自双子叶植物。

8.权利要求1或3任一项的方法，其中所述植物选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、小黑麦、稻、大麦、大豆、落花生、棉属植物、包括卡诺拉油菜和冬油籽油菜在内的油籽油菜、谷物、木薯、辣椒、向日葵、亚麻、琉璃苣、红花、亚麻籽、报春花、油菜籽、芜菁、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、蚕豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油棕、椰子、多年生草、饲料作物和拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

9.权利要求1或3所述的方法，其中与相应的非转化野生型对照相比较而言具有提高的植物疾病抗性、优选地具有提高的致病性真菌和/或线虫抗性的转基因植物细胞、植物或其部分衍生自裸子植物、优选地衍生自云杉、松树和冷杉。

10.分离的核酸分子，其包含选自以下的核酸分子：

a)编码表IIB第7列中所示多肽的核酸分子；

b)表IB第7列中所示的核酸分子；

c)核酸分子，其能够因遗传密码的简并性从表II第5列或第7列中所述的多肽序列衍生并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；

d)核酸分子，其与包含在表I第5列或第7列中所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％同一性并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；

e)核酸分子，其编码与由(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性并具有由包含表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子所代表的活性的多肽，并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；

f)核酸分子，其与(a)至(c)的核酸分子在严格杂交条件下杂交并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；

g)编码多肽并具有由包含表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性的核酸分子，其中所述多肽能够借助针对由(a)至(e)的核酸分子之一编码的多肽所制备的单克隆或多克隆抗体分离；

h)核酸分子，其编码包含表IV第7列中所示共有序列或一个或多个多肽基序并且优选地具有由包含表II或表IV第5列中所述多肽的蛋白质所代表的活性的多肽；

i)核酸分子，其编码具有表II第5列中描述的蛋白质所代表活性的多肽并且赋予与相应的非转化野生型对照植物细胞、植物或其部分相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性；

j)核酸分子，其包含通过使用表III第7列中的引物扩增cDNA文库或基因组文库所获得的多核苷酸并且优选地具有由包含表II或表IV的第5列中所述多肽的蛋白质代表的活性；和

k)通过用包含核酸分子(a)或(b)的互补序列的探针或用其片段在严格杂交条件下筛选合适的核酸文库能够获得的核酸分子，其中所述的片段具有与在(a)至(e)中表征并编码下述多肽的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选地至少20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，所述多肽具有由包含表II第5列中所述多肽的蛋白质代表的活性；

其中根据(a)至(j)的核酸分子至少在一个或多个核苷酸上与表IA第5列或第7列中所述的序列不同，并且优选地其编码至少在一个或多个氨基酸上与表IIA第5列或第7列中所述的蛋白质序列不同的蛋白质。

11.赋予权利要求11的所述核酸分子表达的核酸构建体，其包含一个或多个调节元件，其中所述核酸在宿主细胞中的表达导致与相应的非转化野生型对照相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性。

12.载体，其包含权利要求10中所述的核酸分子或权利要求11的核酸构建体，其中所述编码性核酸在宿主细胞中的表达导致与相应的非转化野生型对照相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性，所述载体优选地包含

(i)调节有效连接的多核苷酸在植物中组成型表达的启动子，

(ii)调节有效连接的多核苷酸在植物中组织特异性表达的启动子，或

(iii)调节有效连接的多核苷酸在线虫感染时于植物的合胞体部位中表达的启动子，或

(iiii)调节有效连接的多核苷酸的病原体诱导型表达的启动子。

13.宿主细胞，其已经用权利要求中12所述载体或权利要求中10所述核酸分子或权利要求11的核酸构建体稳定或瞬时地转化并且显示因转化所致的与相应的非转化野生型对照相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性。

14.植物组织、繁殖材料、种子、收获的材料或植物，其包含权利要求13中所述的宿主细胞。

15.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中额外地赋予非生物胁迫抗性，优选地水缺乏抗性、更优选地干旱抗性。

16.宿主细胞、植物组织、繁殖材料、种子、收获的材料或植物，其已经用权利要求中12所述载体或权利要求中10所述核酸分子或权利要求111的核酸构建体稳定或瞬时地转化并且显示因转化所致的与相应的非转化野生型对照相比较而言提高的植物疾病抗性、优选地提高的致病性真菌和/或线虫抗性和非生物胁迫抗性，优选地水缺乏抗性、更优选地干旱抗性。

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