CN112795590A - 一种草木樨毛状根转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种草木樨毛状根转化方法。采用该方法建立草木樨毛状根转化体系，可以在幼苗切根侵染后的两周左右获得转基因毛状根，这比用根癌农杆菌介导的遗传转化体系得到转基因植株要更加快速和简便，获得的毛状根的发生率和转化率分别为78±2％和70.8±4.2％，且超表达MaROP6的相对平均表达量为对照的36.87倍。这就表明利用发根农杆菌进行草木樨的毛状根转化可以作为一种草木樨结瘤基因功能研究的生物技术手段，并可能将其推广到包括抗逆机理研究在内的其他领域的发展，为草木樨基因功能的验证和遗传选育奠定基础。

Description

一种草木樨毛状根转化方法
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种草木樨毛状根转化方法。
【背景技术】
草木樨(Melilotus spp.)是一年生或两年生的豆科(Leguminosae)草本植物，全世界共有19种，主要分布于欧亚大陆地中海区域、东欧和亚洲，白花草木樨(M.albus)是该属最广泛的栽培种之一。草木樨的适应性广泛，具有较强的抗逆性，其抗盐和耐寒的能力在主要豆科牧草中尤其突出。草木樨作为栽培面积仅次于紫花苜蓿的优良豆科牧草，含有较高的粗蛋白和粗脂肪以及胡萝卜素和矿物质等其他营养元素，是家畜的优良饲草。且草木樨拥有发达的根系，既能够固定空气中的氮气(N2)，改善土壤肥力，又可以保持土壤，防治水土流失。
目前对于草木樨的研究主要集中在栽培技术研制、化学成分鉴定、分子标记开发及草木樨属植物遗传多样性评价等方面，但关于草木樨的突变体和分子机制方面研究较少，虽然已对草木樨转录组和miRNAs进行了相关分析，虽然目前也有一些利用根农杆菌对草木樨进行基因转化的方法，但是整体来讲，转化率低效果不理想，因此限制了对其基因功能的深入研究，虽然目前有关于。
自20世纪初，发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)就被发现能够诱导某些植物产生毛状根，其携带的Ri质粒能够使被侵染的植物受伤部位长出毛状根，并产生大量有效的次生代谢产物。ROP6是小GTPases的亚家族ROP基因家族的成员，已经证实该基因正向参与共生固氮信号转导途径，本研究以此为基础，开发了一套高效的草木樨毛状根转化体系，该体系的建立为深入研究草木樨的基因功能奠定了基础。
【发明内容】
鉴于上述内容，找出一种高效、高转化率、低耗时的草木樨毛状根转化方法，能有效促进对草木樨功能基因的研究。
一种草木樨毛状根转化方法，所述方法包括：制备带有目的基因的发根农杆菌菌膜、制备草木樨幼苗、将农杆菌转染到草木樨中、浸染培养、培养后幼苗除菌、除菌后对幼苗进行发根处理。
进一步的，所述制备草木樨幼苗的方法为：将草木樨种子进行灭菌处理后，将种子放入4℃的冰箱中催化2d，之后放入25℃培养箱中采用交替光处理进行培养，培养时间为3d，下胚轴长至不低于5mm时完成草木樨的幼苗制备。
进一步的，所述将农杆菌转染到草木樨中的处理方法包括草木樨切根和侵染两个步骤，其中，草木樨切根的方法为：用手术刀在根尖往上5mm处快速切断，然后放于含有少量无菌水的培养皿培养；侵染方法为：将草木樨的切口端划过发根农杆菌菌膜蘸取少量农杆菌，然后放置于不含抗生素的1/2的MS培养基中，用封口膜封好后，用锡箔纸包住立放在22℃组培室进行避光处理，培养3天。
进一步的，所述幼苗除菌方法为：在黑暗处理时，将转染后的草木樨取出，将其将放置于含有250mg/L头孢霉素和250mg/L羧苄青霉素的灭菌水中，在28℃摇床120rpm除菌30min，灭菌水冲洗3遍，将幼苗放入含有250mg/L头孢霉素和250mg/L羧苄青霉素的1/2MS培养基中，用封口膜封好后，立放在22℃组培室中采用交替光处理进行培养5天。
进一步的，所述除菌后对幼苗进行发根处理的方法为：将幼苗从固体培养基中移入营养液中，放置在22℃组培室进行光交替处理，直至幼苗长出发根。
进一步的，所述交替光处理的方法为：采用16h光照处理，8h黑暗处理。
进一步的，所述1/2的MS培养基由如下成分组成MS(Murashige&Skoog BasalMedium With Vitamins)2.22g、蔗糖8.0g、7.0g琼脂、pH＝5.8。
进一步的，所述草木樨优选为白花草木樨。
本发明具有以下有益效果：
采用本申请的方法所建立的草木樨毛状根转化体系，可以在幼苗切根侵染后的两周左右获得转基因毛状根，这比用根癌农杆菌介导的遗传转化体系得到转基因植株要更加快速和简便，获得的毛状根的发生率和转化率分别为78±2％和70.8±4.2％，且超表达MaROP6的相对平均表达量为对照的36.87倍。这就表明利用发根农杆菌进行草木樨的毛状根转化可以作为一种草木樨结瘤基因功能研究的生物技术手段，并可能将其推广到包括抗逆机理研究在内的其他领域的发展，为草木樨基因功能的验证和遗传选育奠定基础。
【附图说明】
图1为带有pBI121-DsRed2-MaROP6的发根农杆菌的培养基示意图；
图2为5d幼苗及幼苗切根位置图；图中A为未切根的草木樨苗，B为切根处理的草木樨苗；
图3为草木樨苗蘸取农杆菌后在1/2MS培养基上的形态图；
图4为草木樨苗转移至含有抗生素的1/2MS培养基养基上的形态图；
图5为草木樨苗切根处膨大的形态图；
图6为草木樨苗幼苗在营养液中的培养示意图；
图7为草木樨苗幼苗长出毛状根的形态图；
图8为草木樨苗幼苗幼苗长出侧根的形态图；
图9为毛状根在共聚焦激光扫描显微镜下形态图；
图10为低于萌发总时长5d的幼苗切根侵染结果图，图中A为选择的幼苗，B为侵染结果图；
图11为高于萌发总时长5d的幼苗切根侵染结果图，图中A为选择的幼苗，B为侵染结果图；
图12为不同培养基对草木樨无菌苗生长的影响图，图中A为避光培养结束后草木樨无菌苗的形态图，图中B为后期接触光照后幼苗的形态图；
图13为暗处理时间对草木樨无菌苗生长的影响图，图中A为处理时间在1-2d时，浸染结果；图中B为处理时间在4-5d时，浸染结果；
图14为除菌时间和抗生素对草木樨无菌苗生长的影响图，图中A为不进行除菌处理时无菌苗的形态图；图中B为添加单一抗生素时无菌苗的形态图；图中C为添加过量抗生素时无菌苗的毛状根形态图；
图15为无菌苗在含抗生素的培养基上培养时间大于5d时的形态图；
图16为转基因毛状根中MaROP6基因的表达水平；其中2、3、6、11、13、17、23均为空载对照，其他组为阳性根组。
【具体实施方式】
下面结合附图和实施例和试验对本发明作进一步说明。
实施例1：
本实施例的转染方法如图1-9所示：
(1)制备带有目的基因的发根农杆菌菌膜：
取200uL已制备好的含有目的基因MaROP6的发根农杆菌菌液均匀涂到含相应抗生素的LB固体培养基中，28℃倒置培养两天；
(2)制备草木樨幼苗
①种子处理：将草木樨Ma389种子，用浓硫酸处理3min后，使用灭菌水清洗五次，用75％的乙醇处理30S，再用5％的次氯酸钠溶液处理5min后，使用灭菌水清洗五次，在超净工作台中均匀的点在8.5％琼脂培养基上。每次实验可使用100粒种子；
②种子萌发：将种子放置于4℃的冰箱催化2d后，再放置于25℃培养箱进行光交替处理(其中，光交替方法为：16h光照/8h黑暗)共培养3d，待幼苗长出两片子叶，下胚轴长至5mm左右时，就可以进行转化；
(3)将农杆菌转染到草木樨中：
①草木樨切根：在超净工作台中，准备两个空的培养皿，其中一个中加入少量无菌水，镊子和手术刀用酒精灯消毒后，等恢复至正常温度时，用镊子轻轻夹取幼苗至空的培养皿中，用手术刀在根尖往上5mm处快速切断，然后放于含有少量无菌水的培养皿中，防止萎蔫；
②浸染：将草木樨用夹子夹起，然后将切口端划过发根农杆菌菌膜蘸取少量农杆菌，蘸取少量的农杆菌后，将其放置于不含抗生素的1/2MS培养基，其中，1/2MS培养基配方包括：MS(Murashige&Skoog Basal Medium With Vitamins)2.22g、蔗糖8.0g、7.0g琼脂、pH＝5.8上，用封口膜封好后，用锡箔纸包住立放在22℃组培室进行避光处理，培养3天，幼苗暗处理后，可以清晰的看到幼苗的切根处开始膨大，并且在不含抗生素的1/2MS固体培养基上，可以观察到幼苗切根处繁殖的发根农杆菌；
(4)培养后幼苗除菌：
在超净工作台，将幼苗从暗处理条件下拿出，将其放置于含有250mg/L头孢霉素和250mg/L羧苄青霉素的灭菌水中，在28℃摇床120rpm除菌30min，在超净工作台中，用灭菌水清洗三遍后，将其放在铺好滤纸的含有250mg/L Caf和250mg/LCar的1/2MS培养基上，一个培养基不能放太多植株，然后在幼苗上方铺一层滤纸，用封口膜封好后，立放在22℃组培室进行光交替处理(其中，光交替方法为：16h光照/8h黑暗)共培养5d，处理后，可以看到幼苗的切根处比之前更加膨大。而且有一小部分的幼苗可以长出大约1cm左右的毛状根；
(5)除菌后对幼苗进行发根处理：
幼苗液体培养：将幼苗从固体培养基中移入营养液中，放置在22℃组培室进行光交替处理(其中，光交替方法为：16h光照/8h黑暗)培养至幼苗长出发根，在这期间，需及时补充和更换液体培养基，大约7d左右，绝大部分幼苗便可长出3-4cm左右的毛状根，且可以看到在幼苗的切口处有侧根的出现。并且在共聚焦激光扫描显微镜下，可以看到转基因毛状根中载体pBI121-DsRed2所特有的红色荧光(如图9所示)，表明目的基因已成功转进毛状根中。
本实施例中采用的营养液由如下成分组成：营养液(1L)：25mg FeSO4·7H2O，33.5mg EDTA--Na，98.6mg MgSO4·7H2O，69.7mg K2SO4，117.6mg CaCl2·2H2O,34.8mgK2HPO4，0.711mg H3BO3，0.445mg MnCl2·4H2O，0.037mg CuSO4·5H2O，0.102mg ZnCl2，0.012mg Na2MoO4·2H2O。
观测并计算实施例1的毛状根的发生率和转化率：
其中毛状根发生率的计算方法为：毛状根发生率＝(毛状根数量/总株数)×100％
经PCR检测得到阳性毛状根数量，然后依据毛状根转化率的计算方法：草木樨毛状根转化率＝(阳性毛状根数量/毛状根数量)×100％；计算毛状根的转化率。
经观测、计算得出：毛状根的发生率为：78±2％；毛状根转化率为：70.8±4.2％。
如图16所示，以Maβ-tubulin为内参，以空载体转化的草木樨为对照(图中第2、3、6、11、13、17、23组)，进行Q-PCR实验，来计算草木樨转基因毛状根中MaROP6的表达量。在这17株的阳性根中(图中，第1、4、5、7、8、9、10、12、14、15、16、18、19、20、21、22、24)，MaROP6最低和最高相对表达量分别为对照的6.70倍和134.83倍，平均表达量为对照的36.87倍。
本实施例采用的草木樨为白花草木樨。
实施例2：
本实施例研究不同生长期的外植体对侵染结果的影响(除变量外，其它条件与实施例1一致)：
申请人在实验过程中发现：在选择草木樨外植体时，一定要选择步骤(2)的第②个步骤：种子萌发过程中：4℃催化2d、25℃交替光共培养3d、长出两片叶子的草木樨幼苗做为实验材料；
当选择萌发时间不够：即当4℃催化2d、25℃交替光共培养1-2d的草木樨幼苗做为外植体进行侵染，结果如图10所示，图10中A图是选择的外植体，B图是侵染后的外植体，结果发现，如图B所示草木樨的幼苗表现出：幼苗白化、茎变细、生长停滞，切根处变细的特性，最终导致草木樨枯萎死亡。
当选择萌发时间过长的幼苗：即当4℃催化2d、25℃交替光共培养4-5d的草木樨幼苗做为外植体进行侵染，结果如图11所示，图11中A图是选择的外植体，B图是侵染后的外植体，结果发现，如图B所示草木樨的幼苗表现出：幼苗侵染效果不明显，生长过程中很少有切根处膨大的特征，且幼苗会变黄的特性，其成活率也会降低。
实施例3：
本实施例研究不同培养基对草木樨无菌苗生长的影响(除变量外，其它条件与实施例1一致)：
采用MS培养基替代步骤(3)第②步骤侵染过程使用的1/2MS培养基，即，培养基配方仅为：MS(Murashige&Skoog Basal Medium With Vitamins)；
结果如图12所示，图12为不同培养基对草木樨无菌苗生长的影响图，如图12的A图所示，避光培养3d后草木樨的切口处没有出现膨大现象；
浸染结束后，如图12的B图所示，在后期接触光照条件下后，幼苗逐渐变为褐色，有茎变细和切根处变细的现象，最终导致幼苗死亡，成活率极低。
实施例4：
暗处理时间对草木樨无菌苗生长的影响(除变量外，其它条件与实施例1一致)：
即对步骤(3)第②步骤侵染过程中锡箔纸包住后立放在22℃组培室进行避光处理的处理时间进行研究，发现当处理时间在1-2d时，浸染结果如图13的A图所示，幼苗没有明显的茎变长，切根处开始膨大等特征；
当处理时间在4-5d时，浸染结果如图13的B图所示，幼苗虽然有茎变长，切根处开始膨大等特征，但是幼苗的叶子出现部分变黄的特征且幼苗处农杆菌繁殖过多，影响幼苗生长。
实施例5：
除菌时间、抗生素和交替光培养时间对无菌苗生长的影响：
对步骤(4)培养后幼苗除菌进行研究时发现：
①除菌时间对无菌苗生长的影响：
除菌时将幼苗转移至含有250mg/L头孢霉素和250mg/L羧苄青霉素的灭菌水中，在28℃摇床120rpm除菌30min，转速过高或除菌时间过长则会对幼苗造成伤害，转速过低或除菌时间过短则无法有效的除菌。
②抗生素对无菌苗生长的影响：
草木樨的将切根后的幼苗与不含抗生素的1/2MS培养基共培养3d后，需要给幼苗进行除菌并且转移至含有250mg/L头孢霉素和250mg/L羧苄青霉素的1/2MS培养基上。如果不进行第(4)步的除菌处理，在幼苗的后续生长中，农杆菌似浆糊附着在培养基及幼苗表面，培养基由无色透明变成黄色污浊，幼苗由最初的嫩绿色变为褐色，最终致死，结果如图14的A图所示；
而如果仅添加单一抗生素，即250mg/L头孢霉素或250mg/L羧苄青霉素，结果如图14的B图所示，在培养基上会出现农杆菌的单菌落，幼苗表面也有过度生长的农杆菌；
而当添加两种抗生素的浓度均达不到250mg/L时，会导致导致农杆菌过度繁殖，污染幼苗；而添加两种抗生素的浓度均超过250mg/L时，如图14的C图所示，会导致幼苗生长缓慢，毛状根生长减缓，颜色逐渐变为褐色最终致死。
③交替光培养时间对无菌苗生长的影响：
幼苗除去多余的农杆菌后，将其放置在铺好滤纸的含有250mg/L头孢霉素或250mg/L羧苄青霉素，的1/2MS培养基上，并将培养基立放在22℃组培室(其中，光交替方法为：16h光照/8h黑暗)5d，在此条件下，如果培养时间大于5d，如图15所示，会出现时间过长会出现叶片干枯的现象，影响无菌苗的生长。
综上，使用本申请的草木樨毛状根转化方法步骤缺一不可，整体方法都达到了促进草木樨无菌苗生长，提高毛状根的发生率和毛状根转化率的效果。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (9)

1.一种草木樨毛状根转化方法，其特征在于，所述方法包括：制备带有目的基因的发根农杆菌菌膜、制备草木樨幼苗、将农杆菌转染到草木樨中、浸染培养、培养后幼苗除菌、除菌后对幼苗进行发根处理。
2.根据权利要求1所述的一种草木樨毛状根转化方法，其特征在于，所述制备草木樨幼苗的方法为：将草木樨种子进行灭菌处理后，将种子放入4℃的冰箱中催化2d，之后放入25℃培养箱中采用交替光处理进行培养，培养时间为3d，下胚轴长至不低于5mm时完成草木樨的幼苗制备。
3.根据权利要求1所述的一种草木樨毛状根转化方法，其特征在于，所述将农杆菌转染到草木樨中的处理方法包括草木樨切根和侵染两个步骤，其中，草木樨切根的方法为：用手术刀在根尖往上5mm处快速切断，然后放于含有少量无菌水的培养皿培养；侵染方法为：将草木樨的切口端划过发根农杆菌菌膜蘸取少量农杆菌，然后放置于不含抗生素的1/2的MS培养基中，用封口膜封好后，用锡箔纸包住立放在22℃组培室进行避光处理，培养3天即完成转染过程。
4.根据权利要求1所述的一种草木樨毛状根转化方法，其特征在于，所述幼苗除菌方法为：在黑暗处理时，将转染后的草木樨取出，将其将放置于含有250mg/L头孢霉素和250mg/L羧苄青霉素的灭菌水中，在28℃摇床120rpm除菌30min，灭菌水冲洗3遍，将幼苗放入含有250mg/L头孢霉素和250mg/L羧苄青霉素的1/2MS培养基中，用封口膜封好后，立放在22℃组培室中采用交替光处理进行培养5天。
5.根据权利要求1所述的一种草木樨毛状根转化方法，其特征在于，所述除菌后对幼苗进行发根处理的方法为：将幼苗从固体培养基中移入营养液中，放置在22℃组培室进行交替光处理，直至幼苗长出发根。
6.根据权利要求2、权利要求4-5任意一项所述的一种草木樨毛状根转化方法，其特征在于，所述交替光处理的方法为：采用16h光照处理，8h黑暗处理。
7.根据权利要求3-4任意一项所述的一种草木樨毛状根转化方法，其特征在于，所述1/2的MS培养基由如下成分组成：MS 2.22g、蔗糖8.0g、7.0g琼脂。
8.根据权利要求5所述的一种草木樨毛状根转化方法，其特征在于，所示营养液中，1L营养液包含有如下重量的物质：25mg FeSO4·7H2O，33.5mg EDTA--Na，98.6mg MgSO4·7H2O，69.7mg K2SO4，117.6mg CaCl2·2H2O,34.8mg K2HPO4，0.711mg H3BO3，0.445mgMnCl2·4H2O，0.037mg CuSO4·5H2O，0.102mg ZnCl2，0.012mg Na2MoO4·2H2O。
9.根据权利要求1所述的一种草木樨毛状根转化方法，其特征在于，所述草木樨优选为白花草木樨。
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