CN111527212A

CN111527212A - 使用来自叶绿素结合Ab基因的调控元件表达转基因的组合物和方法

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Publication number: CN111527212A
Application number: CN201880056619.0A
Authority: CN
Inventors: L·西多伦科; S·A·贝文; C·M·拉森; G·安东尼; A·E·罗宾逊; C·N·耶基斯
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Corteva Agriscience LLC
Priority date: 2017-08-31
Filing date: 2018-08-31
Publication date: 2020-08-11
Anticipated expiration: 2038-08-31
Also published as: CA3073050A1; EP3676383A1; WO2019046776A1; EP3676383B1; US20200407742A1; BR112020003918A2; US11390880B2; EP3676383A4; CN111527212B; US20230203522A1

Abstract

提供了使用从大豆叶绿素结合Ab基因分离的调控元件在植物细胞和/或植物组织中表达转基因的组合物和方法，所述调控元件包括启动子、5'UTR、3'UTR和/或终止子。

Description

使用来自叶绿素结合Ab基因的调控元件表达转基因的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年8月31日提交的美国临时专利申请序列号62/552,692的权益的优先权，将所述临时专利申请的公开内容通过引用以其整体特此并入。

通过引用并入以电子方式递交的材料

通过引用以其整体并入的是同时随同提交并且标识如下的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表：在日期2017年8月31日创建的一个名为“77714_ST25.txt”的17KB ACII(文本)文件。

背景技术

许多植物物种能够被转基因转化以引入农学上希望的性状或特征。开发和/或修饰了许多植物物种的改良品种以获得了特定的希望的性状。通常，希望的性状包括例如改善营养价值品质、增加产量、赋予有害生物抗性或疾病抗性、增加干旱和胁迫耐受性、改善园艺品质(例如，色素沉着和生长)、赋予除草剂耐受性、使得能够由植物产生工业上有用的化合物和/或材料和/或使得能够产生药物。

通过植物转化技术产生包含堆叠在单个基因组基因座的多个转基因的转基因植物物种。植物转化技术导致将转基因引入植物细胞，回收在植物基因组中含有稳定整合的转基因拷贝的可育转基因植物，并且随后通过植物基因组的转录和翻译进行的转基因表达得到具有希望的性状和表型的转基因植物。然而，希望允许产生表达工程化为性状叠堆的多个转基因的转基因植物物种的机制。

支持普遍存在、器官/组织特异性和/或发育调控表达模式的宽范围表达水平的调控元件在植物生物技术中提供了宝贵的工具。广泛调控模式的一些实例是在大多数组织/器官中普遍表达、在地上绿色组织中优先表达、在地下根组织中优先表达、在发育中的种子中表达等。

除了需要各种调控表达模式和表达水平外，最佳的转基因表达还可能需要最小化或避免在多转基因叠堆中重复使用相同的启动子。虽然可以通过重复使用相同的启动子来控制多个目的转基因的表达，但是包含具有高水平序列同一性的序列的启动子的重复使用可能导致基于同源性的基因沉默(HBGS)。当将由具有高水平序列同一性的启动子调控的多个转基因引入基因组时，HBGS最有可能出现。已经观察到HBGS在转基因植物中广泛发生(Peremarti等人,(2010),Plant Molecular Biology[植物分子生物学],73,363-378)。

为了使上游(启动子和5'UTR)和下游(嵌入较大终止子片段的3'UTR)调控元件的使用多样化，我们从大豆(Glycine max)叶绿素结合Ab基因中鉴定和表征了所述调控元件。进一步描述了利用叶绿素结合Ab调控元件的构建体和方法。

发明内容

本文公开了用于在植物细胞和/或植物组织中表达转基因的调控元件、构建体和方法。在一个实施例中，从大豆叶绿素结合Ab基因DNA中纯化叶绿素结合Ab基因的调控元件，并且将其与和所述调控元件非天然连接的序列重组以产生表达盒，所述表达盒用于在植物细胞中表达对叶绿素结合Ab调控序列非天然的转基因。在一个实施例中，提供了一种表达载体，其中叶绿素结合Ab基因的调控元件可操作地连接到多接头序列。这样的表达载体有助于以与叶绿素结合Ab基因调控序列可操作地连接的状态将基因或基因盒插入载体。

在实施例中，提供了一种表达盒，其包含大豆叶绿素结合Ab启动子、5'UTR和含有3'UTR和聚腺苷酸化信号的转录终止片段(终止子)。在实施例中，提供了一种基因表达盒，其包含可操作地连接到转基因的大豆叶绿素结合Ab启动子和5'UTR。在实施例中，基因表达盒包括可操作地连接到启动子的大豆叶绿素结合Ab 5'UTR。在实施例中，构建体包括包含大豆叶绿素结合Ab终止子的基因表达盒。在实施例中，基因表达盒包括可操作地连接到转基因的大豆叶绿素结合Ab终止子。在实施例中，基因表达盒包括至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个转基因。

在实施例中，基因表达盒独立地包括a)大豆叶绿素结合Ab启动子、b)大豆叶绿素结合Ab 5'UTR和c)大豆叶绿素结合Ab终止子。

本文公开了在植物中表达转基因的方法，其包括用可操作地连接到转基因的大豆启动子、5'UTR和/或终止子转化植物。本文公开了通过使包含大豆启动子、5'UTR、终止子及其组合的植物生长来表达转基因的方法。本文还公开了培养使用大豆启动子、5'UTR和终止子表达转基因的植物组织和细胞的方法。

根据一个实施例，提供了一种细菌细胞、植物细胞、植物或植物组织，其包含可操作地连接到非叶绿素结合Ab转基因的启动子，其中启动子包含SEQ ID NO:1、5、6或10-11或者与SEQ ID NO:1、5、6或10-11具有95％序列同一性的序列。根据一个实施例，提供了一种植物、植物部分或植物细胞，其包含可操作地连接到转基因的SEQ ID NO:1、5、6或10-11或者与SEQ ID NO:1、5、6或10-11具有95％序列同一性的序列。在一个实施例中，植物是大豆品种。

在一个实施例中，提供了一种植物、植物组织或植物细胞，其包含可操作地连接到非叶绿素结合Ab转基因的启动子，其中启动子由SEQ ID NO:1、5、6或10-11组成。在一个实施例中，启动子可操作地连接到转基因的第一端，其中转基因的第二端可操作地连接到包含SEQ ID NO:3、4、8或9的3'非翻译区或终止子。

附图说明

图1是说明两个大豆内源叶绿素结合Ab基因的表达模式的图。从由Severin等人,(2010),BMC Plant Biol[BMC植物生物学],10,160产生的作图到大豆基因组组装体Glyma1.01的大豆RNA-Seq表达图谱获得大豆基因的表达。DAF代表授粉后的天数。Y轴表示读段/Kb/百万(RPKM)。

图2是SEQ ID NO:5(来自Glyma08g08770的候选启动子和5'UTR)和SEQ ID NO:10(来自Glyma05g25810的候选启动子和5'UTR)的上游DNA序列的比对。图示出了本文鉴定的上游调控序列(启动子和5'UTR)的比对。在本文中以SEQ ID NO:1(来自Glyma08g08770的候选启动子，GmCAB)和SEQ ID NO:6(来自Glyma05g25810的候选启动子)公开大豆叶绿素结合Ab启动子序列。

图3含有由多克隆位点连接并且侧接aatL1和aatL2重组位点的GmCAB启动子(SEQID NO:1)、5'UTR(SEQ ID NO:2)和终止子(SEQ ID NO:4)的线性合成DNA片段。

图4是说明得到由GmCAB调控序列驱动的aad12基因的表达支持的2,4-D除草剂耐受性的代表性大豆植物的照片。在施用后14天(DAA)拍摄照片。

图5是在莲座期用2,4-D喷洒的拟南芥(Arabidopsis)植物的照片的汇编。在7DAA拍摄代表性植物的照片。每张照片上方都标有事件ID和2,4-D喷洒剂量。A.用各种剂量的2,4-D喷洒后，来自pDAB116644构建体的代表性植物。B.用各种剂量的2,4-D喷洒后，来自pDAB4468对照构建体的代表性植物。C.用可变剂量的2,4-D除草剂喷洒后，代表性非转基因(空)植物。

图6是在抽苔期用2,4-D喷洒的拟南芥植物的照片的汇编。在7DAA拍摄代表性植物的照片。每张照片上方都标有事件ID和2,4-D喷洒剂量。A.用各种剂量的2,4-D喷洒后，来自pDAB116644构建体的代表性植物。B.用各种剂量的2,4-D喷洒后，来自pDAB4468构建体的代表性植物。C.用可变剂量的2,4-D除草剂喷洒后，代表性非转基因(空)植物。

具体实施方式

定义

在描述和要求保护本发明时，将根据以下陈述的定义使用以下术语。

如本文所用的术语“约”意指大于或小于所陈述的值或值的范围的百分之十，但并非旨在仅针对此更宽泛的定义来指定任何值或值的范围。术语“约”之后的每个值或值的范围也旨在涵盖所陈述绝对值或值的范围的实施例。

“启动子”是能够结合细胞中的RNA聚合酶并且启动下游(3'方向)编码序列的转录的DNA调控元件。启动子可以含有通过转录因子识别的特定序列。这些因子可以与启动子DNA序列结合，从而导致RNA聚合酶的募集。出于定义本发明的目的，启动子序列在其3'末端以转录起始位点为边界，并且向上游(5'方向)延伸以包括在高于背景可检测的水平上启动转录所必需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列中将发现转录起始位点(例如，通过用核酸酶S1作图来定义)、以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。启动子可以与其他表达控制序列(包括增强子和阻遏物序列)可操作地相关。

出于本公开的目的，“基因”包括编码基因产物(参见下文)的DNA区域、以及调控基因产物(不包括启动子)的产生的所有DNA区域，无论此类调控序列是否与编码和/或转录序列相邻。因此，基因包括但不一定限于终止子、翻译调控序列(如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区。

如本文所用，术语“天然的”或“自然的”定义了天然存在的状况。“天然DNA序列”是自然界中存在的DNA序列，其是通过自然手段或传统育种技术产生的，但不是通过基因工程(例如，使用分子生物学/转化技术)产生的。

如本文所用，“转基因”被定义为编码基因产物的核酸序列，所述基因产物包括例如但不限于mRNA。在一个实施例中，转基因是外源核酸，其中已经通过基因工程将转基因序列引入通常不能发现所述转基因的宿主细胞(或其后代)。在一个实例中，转基因编码工业上或药学上有用的化合物、或编码希望的农业性状的基因(例如，除草剂耐受性基因)。在又另一个实例中，转基因是干扰RNA(iRNA)分子(例如，反义RNA、双链RNA(dsRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)和发夹RNA(hpRNA))核酸序列，其中iRNA核酸序列的表达抑制靶核酸序列的表达。在一个实施例中，转基因是内源核酸，其中希望的是内源核酸的另外的基因组拷贝，或相对于宿主生物体中靶核酸的序列处于反义方向的核酸。

如本文所用，术语“非叶绿素结合Ab转基因”是不是由本发明的大豆调控元件天然表达、不编码叶绿素结合Ab蛋白和/或与大豆叶绿素结合Ab编码序列具有小于80％的序列同一性的任何转基因。

如本文所定义的“基因表达”是将在基因中包含的信息转换成基因产物。

如本文所定义的“基因产物”是由基因产生的任何产物。例如，基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、iRNA、核酶、结构RNA或任何其他类型的RNA)或通过mRNA的翻译产生的蛋白质。基因产物还包括通过诸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑等过程修饰的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)活化、ADP-核糖基化、肉豆蔻酰化(myristilation)和糖基化修饰的蛋白质。基因表达可能受到外部信号(例如，将细胞、组织或生物体暴露于增加或减少基因表达的试剂)的影响。基因的表达也可能在从DNA到RNA到蛋白质的途径中的任何地方受到调控。基因表达的调控例如通过对转录、翻译、RNA转运和加工，中间分子(如mRNA)的降解起作用的控制或通过在制造特定蛋白质分子后将其活化、失活、区室化或降解或者通过其组合而发生。可以通过本领域已知的任何方法(包括但不限于Northern印迹、RT-PCR、Western印迹或一种或多种体外、原位或体内蛋白活性测定)在RNA水平或蛋白质水平上测量基因表达。

如本文所用，术语“内含子”被定义为转录但未翻译的基因(或表达的目的核苷酸序列)中包含的任何核酸序列。内含子包括在表达的DNA序列内的未翻译的核酸序列、以及从其转录的RNA分子中的相应序列。本文所述的构建体还可以含有增强翻译和/或mRNA稳定性的序列，如内含子。一个这样的内含子的实例是拟南芥(Arabidopsis thaliana)组蛋白H3变体的基因II的第一内含子或任何其他通常已知的内含子序列。内含子可以与启动子序列组合使用以增强翻译和/或mRNA稳定性。

如本文所用，术语“5'非翻译区”或“5'UTR”被定义为在前mRNA或成熟mRNA的5'末端中包含非翻译区段的调控元件。例如，在成熟的mRNA上，5'UTR通常在其5'端带有7-甲基鸟苷帽，并且参与许多过程，如剪接、聚腺苷酸化、mRNA向细胞质的输出、通过翻译机器鉴定mRNA的5'端以及保护mRNA免受降解。

如本文所用，术语“3'非翻译区”或“3'UTR”被定义为在前mRNA或成熟mRNA的3'末端中包含非翻译区段的调控元件。例如，在成熟的mRNA上，该区域带有聚-(A)尾，并且已知在mRNA稳定性、翻译起始和mRNA输出中具有许多作用。

如本文所用，术语“终止子”被定义为在含有3'UTR的前mRNA或成熟mRNA的3'末端中包含非翻译区段的调控元件，所述3'UTR可能源于在具有转录终止子片段的多个位置的转录终止和聚腺苷酸化。

如本文所用，术语“聚腺苷酸化信号”表示包含存在于mRNA转录物中的核酸序列的调控元件，当存在聚-(A)聚合酶时，所述调控元件允许转录物在聚腺苷酸化位点(例如，位于聚-(A)信号下游10到30个碱基)被聚腺苷酸化。许多聚腺苷酸化信号是本领域已知的，并且可用于本发明。示例性序列包括AAUAAA及其变体，如描述于Loke J.等人,(2005)PlantPhysiology[植物生理学]138(3):1457-1468。

如本文所用的术语“分离的”意指已经从其自然环境中除去，或从首次形成化合物时存在的其他化合物中除去。术语“分离的”涵盖从自然来源分离的材料以及通过在宿主细胞中重组表达制备后回收的材料(例如，核酸和蛋白质)、或化学合成的化合物，如核酸分子、蛋白质和肽。

如本文所用的术语“纯化的”涉及分子或化合物的分离，所述分子或化合物以基本上不含通常与在天然或自然环境中的分子或化合物相关的污染物，或者基本上在相对于化合物初次形成时存在的其他化合物的浓缩中富集，并且意指由于与原始组合物中的其他组分分离而纯度提高了。在本文使用术语“纯化的核酸”来描述已经与其他生物化合物分离的、分离产生的或纯化的核酸序列，所述其他生物化合物包括但不限于其他多核苷酸、多肽、脂质和碳水化合物，同时影响组分的化学或功能改变(例如，可以通过去除蛋白质污染物并断开将核酸与染色体中其余DNA连接的化学键，从染色体中纯化核酸)。

如本文所用，术语“基于同源性的基因沉默”或“HBGS”是通用术语，其包括转录基因沉默和转录后基因沉默。由于与启动子或转录序列相对应的iRNA的产生，转录抑制(转录基因沉默；TGS)或mRNA降解(转录后基因沉默；PTGS)可能导致未连锁沉默基因座分别对靶基因座的沉默。每个过程中不同细胞组分的参与表明，iRNA诱导的TGS和PTGS可能是由古老的共同机制的多样化导致的。由于与不同靶基因的启动子和转录序列相对应的iRNA的产生，可以将单个转基因基因座描述为同时触发TGS和PTGS。

如本文所用，术语“核酸分子”、“核酸”或“多核苷酸”(所有三个术语彼此同义)是指核苷酸的聚合形式，其可以包括RNA、cDNA、基因组DNA及其合成形式和混合聚合物的有义链和反义链。“核苷酸”可以指代核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或任何一种类型的核苷酸的修饰形式。除非另有说明，否则核酸分子的长度通常至少为10个碱基。所述术语可以指代长度不确定的RNA或DNA分子。所述术语包括DNA的单链和双链形式。核酸分子可以包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸键连接在一起的天然存在的核苷酸和修饰的核苷酸之一或二者。

如本领域技术人员将容易理解的，核酸分子可以被化学或生物化学修饰，或者可以含有非自然或衍生的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(例如，不带电荷的键：例如，甲基的膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；带电荷的键：例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；悬垂部分：例如，肽；嵌入剂：例如，吖啶、补骨脂素等；螯合剂；烷基化剂；和修饰的键：例如，α异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑构象，包括单链、双链、部分双链体、三链体、发夹、环状和挂锁构象。

转录沿着DNA链以5'到3'的方式进行。这意味着RNA是通过在生长链的3'末端顺序添加核糖核苷酸5'-三磷酸(必需消除焦磷酸)而制备的。在线性或环状核酸分子中，如果离散元件(例如，特定的核苷酸序列)在另一个元件的5'方向上已结合或将结合至相同的核酸，则所述离散元件相对于该元件可以称为“上游”。类似地，如果离散元件在另一个元件的3'方向上已结合或将结合至相同的核酸，则所述离散元件相对于该元件可以是“下游”。

如本文所用，术语“碱基位置”是指给定碱基或核苷酸残基在指定核酸内的位置。可以通过与参考核酸比对来定义指定的核酸。

如本文所用，术语“杂交”是指寡核苷酸及其类似物通过互补碱基之间的氢键合(其包括沃森-可里克、胡斯坦或反向胡斯坦氢键合)杂交的过程。通常，核酸分子由含氮碱基组成，所述含氮碱基是嘧啶(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))。这些含氮碱基在嘧啶和嘌呤之间形成氢键，并且嘧啶与嘌呤的键合称为“碱基配对”。更具体地说，A将氢键合至T或U，而G将键合至C。“互补的”是指发生在两个不同的核酸序列或同一核酸序列的两个不同的区域之间的碱基配对。

如本文所用，术语“可特异性杂交”和“特异性互补”是指使得在寡核苷酸与DNA或RNA靶标之间发生稳定且特异性的结合的足够程度的互补性。寡核苷酸不必与其靶序列100％互补即可特异性杂交。当寡核苷酸与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能时，寡核苷酸可特异性杂交，并且存在足够程度的互补性以避免寡核苷酸与非靶序列在希望特异性结合的条件下(例如在体内测定或系统的情况中在生理条件下)的非特异性结合。这种结合称为特异性杂交。导致特定严格性程度的杂交条件将根据所选择的杂交方法的性质以及杂交核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na⁺和/或Mg²⁺浓度)将有助于杂交的严格性，尽管洗涤时间也会影响严格性。关于达到特定严格性程度所需的杂交条件的计算讨论于Sambrook等人(编辑),MolecularCloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版,第1-3卷,Cold SpringHarbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约州冷泉港,1989,第9和11章。

如本文所用，术语“严格条件”涵盖仅在杂交分子与DNA靶标之间的错配小于50％时才发生杂交的条件。“严格条件”包括进一步的特定严格性水平。因此，如本文所用，“中严格性”条件是序列错配率超过50％的分子不会杂交的条件；“高严格性”条件是错配率超过20％的序列不会杂交的条件；并且“非常高严格性”条件是错配率超过10％的序列不会杂交的条件。在特定的实施例中，严格条件可以包括在65℃下杂交，然后在65℃下用0.1x SSC/0.1％SDS洗涤40分钟。以下是代表性的非限制性的杂交条件：

·非常高严格性：在65℃下在5x SSC缓冲液中杂交16小时；在室温下在2x SSC缓冲液中洗涤两次，每次持续15分钟；并且在65℃下在0.5x SSC缓冲液中洗涤两次，每次持续20分钟。

·高严格性：在65℃-70℃下在5-6x SSC缓冲液中杂交16-20小时；在室温下在2xSSC缓冲液中洗涤两次，每次持续5-20分钟；并且在55℃-70℃下在1x SSC缓冲液中洗涤两次，每次持续30分钟。

·中严格性：在室温至55℃下在6x SSC缓冲液中杂交16-20小时；在室温至55℃下在2x-3x SSC缓冲液中洗涤至少两次，每次持续20-30分钟。

在实施例中，可特异性杂交的核酸分子可以在非常高严格性杂交条件下保持结合。在实施例中，可特异性杂交的核酸分子可以在高严格性杂交条件下保持结合。在实施例中，可特异性杂交的核酸分子可以在中严格性杂交条件下保持结合。

如本文所用，术语“寡核苷酸”是指短核酸聚合物。寡核苷酸可以通过切割更长的核酸区段或通过聚合单个核苷酸前体来形成。自动化合成仪允许合成长度长达数百个碱基对的寡核苷酸。因为寡核苷酸可以与互补的核苷酸序列结合，所以它们可以用作检测DNA或RNA的探针。由DNA组成的寡核苷酸(寡脱氧核糖核苷酸)可以用于PCR(扩增小DNA序列的技术)。在PCR中，寡核苷酸通常称为“引物”，它允许DNA聚合酶延伸寡核苷酸并复制互补链。

如本文所用，术语“聚合酶链式反应”或“PCR”定义了如下程序或技术，其中如1987年7月28日授权的美国专利号4,683,195中所述扩增了微量的核酸、RNA和/或DNA。通常，需要从目的区域的末端或以外的区域获得序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列上与待扩增模板的相反链相同或相似。两个引物的5'末端核苷酸可以与扩增的材料的末端一致。PCR可以用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定的DNA序列、和从总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般参见Mullis等人,Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.[冷泉港定量生物学研讨会],51:263(1987)；Erlich编辑,PCRTechnology[PCR技术],(Stockton Press[斯托克顿出版社],纽约州,1989)。

如本文所用，术语“引物”是指当条件适合于引物延伸产物的合成时能够充当沿着互补链的合成起始点的寡核苷酸。合成条件包括存在四种不同的脱氧核糖核苷酸三磷酸和至少一种聚合诱导剂，如逆转录酶或DNA聚合酶。它们存在于合适的缓冲液中，其可以包括作为辅因子的成分或在各种合适的温度下影响诸如pH等条件的成分。引物优选地是单链序列，使得扩增效率得到优化，但是可以利用双链序列。

如本文所用，术语“探针”是指与靶序列杂交的寡核苷酸。在

或

风格的测定程序中，探针与位于两个引物的退火位点之间的靶标的一部分杂交。探针包括约八个核苷酸、约十个核苷酸、约十五个核苷酸、约二十个核苷酸、约三十个核苷酸、约四十个核苷酸或约五十个核苷酸。在一些实施例中，探针包括约八个核苷酸至约十五个核苷酸。探针还可以包括可检测标记，例如荧光团(

异硫氰酸荧光素等)。可检测标记可以直接共价附接于探针寡核苷酸，例如位于探针的5'端或探针的3'端。包括荧光团的探针还可以进一步包括淬灭剂，例如Black Hole Quencher^TM、Iowa Black^TM等。

如本文所用，术语“序列同一性”或“同一性”可互换使用并且是指在两个序列中的核酸残基当在指定的比较窗口上比对最大对应度时是相同的。

如本文所用，术语“序列同一性百分比”是指通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列(例如，核酸序列或氨基酸序列)确定的值，其中用于两个序列的最佳比对，与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口中的序列部分可能包含添加或缺失(即，缺口)。通过如下方式来计算百分比：确定两个序列中出现相同核酸或氨基酸残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并且将结果乘以100以得出序列同一性百分比。用于比对比较用的序列的方法是熟知的。各种程序和比对算法描述于例如：Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国科学院院报]85:2444；Higgins和Sharp(1988)Gene[基因]73:237-44；Higgins和Sharp(1989)CABIOS[计算机应用生物科学]5:151-3；Corpet等人(1988)Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:10881-90；Huang等人(1992)Comp.Appl.Biosci.[计算机应用生物科学]8:155-65；Pearson等人(1994)MethodsMol.Biol.[分子生物学方法]24:307-31；Tatiana等人(1999)FEMS Microbiol.Lett.[FEMS微生物学快报]174:247-50。

美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool)(BLAST^TM；Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10)可从几个来源(包括美国国家生物技术信息中心(马里兰州贝塞斯达))获得，并且在互联网上与几个序列分析程序结合使用。如何使用此程序确定序列同一性的描述可在互联网上在BLAST^TM的“帮助”部分下获得。对于核酸序列的比较，可以使用默认参数采用BLAST^TM(Blastn)程序的“Blast 2序列”功能。当通过这种方法评估时，与参考序列具有甚至更大相似性的核酸序列将显示出增加的同一性百分比。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指两种组分已经置于彼此功能关系中。当关于调控序列和编码序列使用时，术语“可操作地连接”意指调控序列影响所连接的编码序列的表达。“调控序列”、“调控元件”或“控制元件”可互换使用，并且是指影响转录的时间和水平/量、RNA加工或稳定性或相关编码序列的翻译的核酸序列。调控序列可以包括启动子；翻译前导序列；5'和3'非翻译区；内含子；增强子；茎环结构；阻遏物结合序列；终止序列；聚腺苷酸化识别序列；等。特定的调控序列可以位于与之可操作地连接的编码序列内、上游和/或下游。同样，可操作地连接到编码序列的特定调控序列可以位于双链核酸分子的相关互补链上。可以通过在方便的限制位点连接来实现连接。如果此类位点不存在，则按照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。然而，元件不必连续地可操作地连接。

如本文所用，术语“转化”涵盖可以将核酸分子引入这种细胞的所有技术。实例包括但不限于：用病毒载体转染；用质粒载体转化；电穿孔；脂质转染；显微注射；农杆菌属(Agrobacterium)介导的转移；直接DNA摄取；晶须介导的转化；和微粒轰击。

如本文所用的术语“多接头”或“多克隆位点”定义了位于核酸序列上彼此10个核苷酸内的三个或更多个2型限制酶位点的簇。包含多接头的构建体用于核酸序列(如基因的编码区)的插入和/或切除。

如本文所用，术语“限制性内切核酸酶”和“限制酶”是指细菌酶，每种这样的酶在特定核苷酸序列处或附近切割双链DNA。2型限制酶在同一位点识别并切割DNA，并且包括但不限于XbaI、BamHI、HindIII、EcoRI、XhoI、SalI、KpnI、AvaI、PstI和SmaI

术语“载体”可与术语“构建体”、“克隆载体”、“核酸载体”和“表达载体”互换使用，并且意指可以将DNA或RNA序列(例如，外源基因)引入宿主细胞以便转化宿主并且促进所引入序列的表达(例如，转录和翻译)的媒介物。“非病毒载体”旨在意指不包含病毒或逆转录病毒的任何载体。在一些实施例中，“载体”是包含至少一个DNA复制起点和至少一个可选择标记基因的DNA序列。实例包括但不限于将外源DNA带入细胞的质粒、粘粒、噬菌体、细菌人工染色体(BAC)或病毒。载体还可以包括一个或多个基因、iRNA分子和/或可选择标记基因以及本领域已知的其他遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，从而使细胞表达由载体编码的核酸分子和/或蛋白质。

术语“质粒”定义了能够在原核或真核宿主细胞中常染色体复制的核酸的环状链。所述术语包括可以是DNA或RNA并且可以是单链或双链的核酸。所述定义的质粒还可以包括对应于细菌复制起点的序列。

如本文所用的术语“可选择标记基因”定义了编码蛋白质的基因或其他表达盒，所述蛋白质有助于鉴定插入了可选择标记基因的细胞。例如，“可选择标记基因”涵盖报告基因以及用于植物转化以例如保护植物细胞免受选择剂影响或提供对选择剂的抗性/耐受性的基因。在一个实施例中，仅接受功能可选择标记的那些细胞或植物能够在具有选择剂的条件下分裂或生长。选择剂的实例可以包括例如抗生素，包括壮观霉素、新霉素、卡那霉素、巴龙霉素、庆大霉素和潮霉素。这些可选择标记包括新霉素磷酸转移酶(npt II)，其表达赋予对抗生素卡那霉素的抗性的酶；和相关抗生素新霉素、巴龙霉素、庆大霉素和G418的基因；或潮霉素磷酸转移酶(hpt)的基因，其表达赋予对潮霉素的抗性的酶。其他可选择标记基因可以包括编码除草剂耐受性(包括bar或pat(对草铵磷或草丁膦的耐受性)、乙酰乳酸合酶(ALS，对阻止合成支链氨基酸的第一步的抑制剂如磺酰脲类(SU)、咪唑啉酮类(IMI)、三唑并嘧啶类(TP)、嘧啶基氧基苯甲酸酯类(POB)和磺酰氨基羰基三唑啉酮类的耐受性)、草甘膦、2,4-D)和金属抗性或敏感性的基因。可以用作可选择标记基因的“报告基因”的实例包括目视观察表达的报告基因蛋白，如编码β-葡萄糖醛酸酶(GUS)、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、DsRed、红色荧光蛋白(RFP)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、碱性磷酸酶等的蛋白质。短语“标记阳性”是指植物已经被转化为包括可选择标记基因。

如本文所用，术语“可检测标记”是指能够检测的标记，例如像放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。可检测标记的实例包括但不限于以下：荧光标记(例如，FITC、若丹明、镧系元素荧光粉)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基、由二级报告分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在实施例中，可检测标记可以通过各种长度的间隔臂附接以减少潜在的空间位阻。

如本文所用，术语“检测”在最广义上使用以包括特定分子的定性和定量测量，例如特定多肽的测量。

如本文所用，术语“盒”、“表达盒”和“基因表达盒”是指可以随机或在特定限制位点处或通过同源重组(例如，在载体内或基因组内)插入核酸或多核苷酸中的DNA区段。如本文所用，DNA区段可以包含编码目的基因产物(例如，多肽或iRNA)的多核苷酸，并且盒可以包括被设计为确保将盒插入适当的阅读框中以进行转录和翻译的限制位点或同源序列。在实施例中，表达盒可以包括编码目的基因产物的多核苷酸，并且除了促进特定宿主细胞转化的多核苷酸外还具有元件。在实施例中，基因表达盒还可以包括允许在宿主细胞中增强表达编码目的基因产物的多核苷酸的元件。这些元件可以包括但不限于：启动子、最小启动子、增强子、响应元件、终止子序列、聚腺苷酸化序列、5'UTR、3'UTR等。

如本文所用，“接头”或“间隔子”是将两个分开的实体彼此结合的键、分子或分子的组。接头和间隔子可以提供两个实体的最佳间隔，或者可以进一步提供允许两个实体彼此分离的不稳定的连接。不稳定的连接包括光可切割基团、酸不稳定部分、碱基不稳定部分和酶可切割基团。

如本文所用，术语“对照”是指在分析程序中用于比较目的的样品。对照可以是“阳性”或“阴性”。例如，在分析程序的目的是检测细胞或组织中差异表达的转录物或多肽的情况下，通常优选包括阳性对照(如来自已知植物的表现出所需表达的样品)和阴性对照(如来自已知植物的缺少所需表达的样品)。

如本文所用，术语“植物”包括整株植物(和任何子代)、细胞、组织或植物部分。可以在本发明中使用的植物类别通常与易于诱变的高等和低等植物类别一样广泛，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物和多细胞藻类。因此，“植物”包括双子叶植物和单子叶植物。术语“植物部分”包括植物的任何一个或多个部分，包括例如但不限于：种子(包括成熟种子和未成熟种子)；植物插条；细胞植物；植物细胞培养物；植物器官(例如，花粉、胚胎、花、果实、芽、叶、根、茎和外植体)。植物组织或植物器官可以是种子、原生质体、愈伤组织或组织成结构或功能单元的任何其他组的植物细胞。植物细胞或组织培养物可能能够再生具有从其获得细胞或组织的植物的生理和形态特征的植物，并且能够再生具有与所述植物基本上相同的基因型的植物。相反，一些植物细胞不能再生以产生植物。植物细胞或组织培养物中的可再生细胞可以是胚胎、原生质体、分生组织细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花丝、花、籽粒、穗、穗轴、苞叶或茎秆。

植物部分包括可收获部分和可用于后代植物繁殖的部分。可用于繁殖的植物部分包括例如但不限于：种子；果实；插条；秧苗；块茎；和根茎。植物的可收获部分可以是植物的任何有用的部分，包括例如但不限于：花；花粉；秧苗；块茎；叶；茎；果实；种子；和根。

植物细胞是植物的结构和生理单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以呈分离的单个细胞或细胞聚集物(例如，易碎的愈伤组织和培养的细胞)的形式，并且可以是更高组织的单元(例如，植物组织、植物器官和植物)的部分。因此，植物细胞可以是原生质体、产生配子的细胞或可以再生为整株植物的细胞或细胞集合。这样，包含多个植物细胞并且能够再生为整株植物的种子在本文的实施例中被认为是“植物细胞”。

如本文所用，术语“原生质体”是指其细胞壁被完全或部分去除并且其脂质双层膜裸露的植物细胞，并且因此包括原生质体(其细胞壁被完全去除)和原生质球(其细胞壁仅被部分去除)，但不限于此。通常，原生质体是无细胞壁的分离的植物细胞，其具有再生为细胞培养物或整株植物的潜能。

除非另外具体解释，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。分子生物学中常用术语的定义可以在例如：Lewin,Genes V[基因V],Oxford University Press[牛津大学出版社],1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(编辑),The Encyclopedia of Molecular Biology[分子生物学百科全书],Blackwell Science Ltd.[布莱克韦尔科学有限公司],1994(ISBN 0-632-02182-9)；以及Meyers(编辑),Molecular Biology and Biotechnology:A ComprehensiveDesk Reference[分子生物学与生物技术：综合案头参考],VCH Publishers,Inc.[VCH出版社公司],1995(ISBN 1-56081-569-8)中找到。

实施例

如本文所公开，提供了新颖的重组表达盒，其使用来自大豆的叶绿素结合Ab基因的调控序列来表达非叶绿素结合Ab转基因。这些盒可以用于产生载体并且转化细胞(包括植物细胞)，以产生在其细胞中表达转基因基因产物的完整生物体。

调控元件

用于基础研究或生物技术应用的植物启动子通常是单向的，仅指导已在其3'端(下游)融合的一个基因。通常需要将多个基因引入植物以进行代谢工程和性状堆叠，并且因此，转基因作物中通常需要多个启动子来驱动多个基因的表达。

转基因产品的开发变得越来越复杂，这需要将多个转基因堆叠到单个基因座中。传统上，每个转基因通常需要一个启动子用于表达，其中需要多个启动子来表达在一个基因叠堆内的不同转基因。随着基因叠堆大小的增加，这经常导致重复使用相同的启动子以获得相似水平的不同转基因的表达模式，以表达单个多基因性状。已知由相同启动子驱动的多基因构建体会导致基因沉默，从而导致田野中的有效转基因产品较少。由于启动子重复而引起的过量的转录因子(TF)结合位点可能引起内源TF的耗尽，从而导致转录失活。转基因的沉默将可能不希望地影响产生以表达转基因的转基因植物的性能。转基因内的重复序列可能导致基因座内基因同源重组，从而导致多核苷酸重排。

希望使用多样化的启动子以表达基因叠堆中的不同转基因。在实施例中，获得自大豆的叶绿素结合Ab(GmCAB)调控序列(例如，启动子、5'UTR、3'UTR和转录终止序列(终止子))可以驱动一个转录单位或多个转录单位(包括蛋白质编码序列和iRNA序列)的转录。

提供了使用叶绿素结合Ab(GmCAB)启动子、5'UTR、3'UTR和终止子在植物或植物部分中表达非叶绿素结合Ab转基因的方法和表达盒和构建体。在实施例中，启动子可以是大豆叶绿素结合Ab(GmCAB；SEQ ID NO:1)启动子和5'UTR(SEQ ID NO:2)。

(SEQ ID NO:5，其是GmCAB启动子以及5'UTR。5'UTR序列是加粗的)。

在实施例中，提供了一种核酸构建体，其包含叶绿素结合Ab启动子和5'UTR。在实施例中，叶绿素结合Ab启动子和5'UTR是大豆叶绿素结合Ab启动子和5'UTR。在实施例中，提供了包含启动子的核酸构建体，其中启动子与SEQ ID NO:1、5或6至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或100％相同。在实施例中，提供了一种核酸构建体，其包含可操作地连接到多接头的叶绿素结合Ab和5'UTR启动子。在实施例中，提供了一种基因表达盒，其包含可操作地连接到非叶绿素结合Ab转基因的叶绿素结合Ab启动子和5'UTR。在一个实施例中，启动子由SEQ ID NO:1、5、6或10-11组成。在说明性实施例中，基因表达盒包含可操作地连接到转基因的叶绿素结合Ab启动子和5'UTR，其中转基因可以是杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、可选择标记转基因、iRNA或其组合。

转基因表达也可以由位于基因的编码序列下游的3'非翻译基因区域(即，3'UTR)调控。启动子和3'UTR均可以调节转基因表达。虽然启动子是驱动转录所必需的，但是含有包含在终止子片段内的3'UTR基因区域的转录终止子片段可以终止转录并且启动用于翻译和蛋白质合成的所得mRNA转录物的聚腺苷酸化。含有3'UTR基因区域的转录终止子片段有助于转基因的稳定表达。

在实施例中，提供了一种核酸构建体，其包含如本文所述的叶绿素结合Ab启动子和5'UTR以及含有3'UTR的终止子片段。在实施例中，核酸构建体包含含有3'UTR的叶绿素结合Ab终止子片段。在实施例中，含有包含3'UTR的转录终止子片段的叶绿素结合Ab终止子片段是大豆叶绿素结合Ab 3'UTR。在实施例中，包含含有3'UTR的转录终止子片段的终止子片段可以是含有3'UTR的大豆叶绿素结合Ab(GmCAB)终止子片段。

(SEQ ID NO:4)GmCAB终止子序列：3'UTR是加粗的。

在实施例中，提供了一种核酸构建体，其包含如本文所述的叶绿素结合Ab启动子和5'UTR以及含有3'UTR的转录终止子片段，其中含有3'UTR的转录终止子片段与SEQ IDNO:3、4、8或9至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或100％相同。在实施例中，提供了一种核酸构建体，其包含如本文所述的叶绿素结合Ab启动子和5'UTR以及含有3'UTR的转录终止子片段，其中叶绿素结合Ab启动子、5'UTR和3'UTR均可操作地连接到多接头的相对端。在实施例中，提供了一种基因表达盒，其包含如本文所述的叶绿素结合Ab启动子和5'UTR以及3'UTR，其中叶绿素结合Ab启动子、5'UTR和3'UTR可操作地连接到非叶绿素结合Ab转基因的相对端。在一个实施例中，3'UTR由SEQ ID NO:3组成。在另一个实施例中，提供了一种基因表达盒，其包含如本文所述的叶绿素结合Ab启动子和5'UTR以及3'UTR，其中叶绿素结合Ab启动子和5'UTR包含SEQ ID NO:5，并且3'UTR包含SEQ ID NO:3，其中启动子和3'UTR可操作地连接到非叶绿素结合Ab转基因的相对端。在一个实施例中，3'UTR由SEQ ID NO:3组成。在又另一个实施例中，启动子由SEQID NO:1组成，并且3'UTR由SEQ ID NO:3组成。在说明性实施例中，基因表达盒包含可操作地连接到转基因的含有3'UTR的叶绿素结合Ab转录终止子片段，其中转基因可以是杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、可选择标记转基因、iRNA或其组合。在进一步的实施例中，转基因可操作地连接到叶绿素结合Ab启动子和5'UTR以及转录终止子片段，所述转录终止子片段含有来自从大豆分离的相同的叶绿素结合Ab基因的3'UTR。

在实施例中，提供了一种核酸构建体，其包含可操作地连接到来自大豆叶绿素结合Ab基因的5'UTR的大豆叶绿素结合Ab启动子(例如，SEQ ID NO:1或6)，其中5'UTR与SEQID NO:2或7至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或100％相同。在实施例中，提供了一种核酸构建体，其包含如本文所述的叶绿素结合Ab启动子和含有5'UTR的片段，其中5'UTR是叶绿素结合Ab 5'UTR。在实施例中，提供了一种基因表达盒，其包含如本文所述的叶绿素结合Ab启动子和5'UTR，其中叶绿素结合Ab启动子和5'UTR均可操作地连接到作为非叶绿素结合Ab转基因的下游报告基因。在一个实施例中，大豆叶绿素结合Ab启动子包含SEQ ID NO:1或6。在一个实施例中，提供了一种基因表达盒，其包含如本文所述的叶绿素结合Ab启动子和5'UTR，其中叶绿素结合Ab启动子包含SEQ ID NO:1或6，并且5'UTR包含SEQ ID NO:2或7，其中启动子和5'UTR可操作地在非叶绿素结合Ab转基因的上游。在一个实施例中，大豆叶绿素结合Ab启动子由SEQ ID NO:1或6组成，并且5'UTR由SEQ ID NO:2或7组成。在说明性实施例中，基因表达盒包含与可操作地连接到转基因的大豆叶绿素结合Ab 5'UTR连接的叶绿素结合Ab启动子，其中转基因可以是杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、可选择标记转基因、干扰RNA(例如，人工微小RNA、发夹RNA或反义RNA)或其组合。在进一步的实施例中，转基因可操作地连接到叶绿素结合Ab 5'UTR以及转录终止子片段，所述转录终止子片段含有来自从大豆分离的相同的叶绿素结合Ab基因的3'UTR。

转基因表达也可以由位于启动子序列下游的5'UTR区域调控。启动子和5'UTR均可以调节转基因表达。虽然启动子是驱动转录所必需的，但是5'UTR的存在可以增加表达水平，从而产生用于翻译和蛋白质合成的mRNA转录物。5'UTR基因区域有助于转基因的稳定表达。

在实施例中，提供了一种核酸构建体，其包含如本文所述的大豆叶绿素结合Ab启动子和5'UTR。在一个实施例中，5'UTR可操作地连接到启动子的3'端。在实施例中，提供了一种核酸构建体，其包含可操作地连接到从大豆分离的大豆叶绿素结合Ab启动子或这种启动子序列的衍生物的3'端的大豆叶绿素结合Ab 5'UTR，如本文所述。

在实施例中，5'UTR可以是大豆叶绿素结合Ab(GmCAB)5'UTR。ATAAGAACCCAACCACTTCAACCCCATATAAATAAACCCGGACACAACTTCACCAAGTCACTCACCACTTCAAAACACTCATAACACAAAGCACAAAGCAAAGCTCATCCTTGAGTTAAAAAA

在实施例中，5'UTR可以是大豆叶绿素结合Ab(GmCAB)5'UTR(SEQ ID NO:2)。

在实施例中，提供了一种核酸构建体，其包含如本文所公开的叶绿素结合Ab启动子和5'UTR，其中5'UTR与SEQ ID NO:2或7至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或100％相同。在实施例中，提供了包含叶绿素结合Ab启动子的核酸构建体，其中启动子与SEQ ID NO:1或6至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或100％相同，并且5'UTR可操作地连接到多接头。在实施例中，提供了一种基因表达盒，其包含叶绿素结合Ab启动子和可操作地连接到非叶绿素结合Ab转基因的5'UTR序列，其中启动子与SEQ ID NO:1或6至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或100％相同。在一个实施例中，5'UTR由SEQ ID NO:2或7组成。

在实施例中，提供了一种核酸构建体，其包含叶绿素结合Ab启动子和5'UTR的直向同源物。在实施例中，叶绿素结合Ab启动子和5'UTR是大豆叶绿素结合Ab启动子和5'UTR。在实施例中，提供了包含启动子的核酸构建体，其中启动子与SEQ ID NO:1或6至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或100％相同。在实施例中，提供了一种核酸构建体，其包含可操作地连接到多接头的叶绿素结合Ab和5'UTR启动子。在实施例中，提供了一种基因表达盒，其包含可操作地连接到非叶绿素结合Ab转基因的叶绿素结合Ab启动子和5'UTR。在一个实施例中，启动子和5'UTR由SEQ ID NO:5和10组成。在说明性实施例中，基因表达盒包含可操作地连接到转基因的叶绿素结合Ab启动子和5'UTR，其中转基因可以是杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、可选择标记转基因、干扰RNA(例如，人工微小RNA、发夹RNA、反义RNA)或其组合。

SEQ ID NO:5GmCAB启动子和5'UTR。5'UTR序列是加粗的。

SEQ ID NO:10是Glyma05g25810的启动子和5'UTR。5'UTR序列是加粗的。

在实施例中，基因表达盒包含可操作地连接到启动子的叶绿素结合Ab 5'UTR，其中启动子是大豆叶绿素结合Ab启动子、病毒(例如，木薯叶脉花叶病毒启动子)或细菌(例如，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)delta mas)或源自植物(例如，拟南芥泛素3、泛素10、泛素11、泛素14基因、拟南芥肌动蛋白2基因等)的其他启动子。在说明性实施例中，基因表达盒包含可操作地连接到转基因的大豆叶绿素结合Ab 5'UTR，其中转基因可以是杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、干扰RNA(例如，人工微小RNA、发夹RNA或反义RNA)、可选择标记转基因或其组合。

在实施例中，提供了一种核酸构建体，其包含启动子和任选地多接头以及一种或多种以下元件：

a)5'非翻译区；

b)3'非翻译区(有或没有内含子)，其可以进一步包括在终止子内

其中

启动子包含SEQ ID NO:1、6或与SEQ ID NO:1或6具有95％或98％序列同一性的序列；

5'非翻译区包含SEQ ID NO:2、7或与SEQ ID NO:2或7具有95％或98％序列同一性的序列(例如，启动子和5'非翻译区包含SEQ ID NO:5或10)；

3'非翻译区包含SEQ ID NO:3、8或与SEQ ID NO:3或8具有95％或98％序列同一性的序列；进一步，其中所述启动子可操作地连接到每个任选元件(当存在时)。

在一个实施例中，提供了一种核酸构建体，其包含启动子和非叶绿素结合Ab转基因和任选地一种或多种以下元件：

a)5'非翻译区；

b)3'非翻译区，

其中

3'非翻译区包含SEQ ID NO:3、8或与SEQ ID NO:3或8具有95％或98％序列同一性的序列；进一步，其中所述启动子可操作地连接到所述转基因，并且每个任选元件(当存在时)也可操作地连接到启动子和转基因。在进一步的实施例中，提供了一种转基因细胞，其包含以上刚刚公开的核酸构建体。在一个实施例中，转基因细胞是植物细胞，并且在进一步的实施例中，提供了一种植物，其中植物包含所述转基因细胞。

在实施例中，基因表达盒包含可操作地连接到5'UTR(SEQ ID NO:2或7)和3'UTR(SEQ ID NO:3或8)的启动子(SEQ ID NO:1或6)。

在实施例中，基因表达盒包含叶绿素结合Ab启动子、叶绿素结合Ab 5'UTR和叶绿素结合Ab 3'UTR。在实施例中，叶绿素结合Ab启动子、叶绿素结合Ab 5'UTR和含有3'UTR的叶绿素结合Ab转录终止子片段可以各自独立地是大豆叶绿素结合Ab启动子和大豆叶绿素结合Ab 3'UTR。在实施例中，基因表达盒包含：a)启动子，其中启动子与SEQ ID NO:1或6至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或100％相同；b)转录终止片段，其中含有3'UTR的转录终止子片段与SEQ ID NO:4或9至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或100％相同；c)5'UTR，其中5'UTR与SEQ ID NO:2或7至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或100％相同。

例如，基因表达盒可以包括启动子和5'UTR，其中启动子是SEQ ID NO:1或6的多核苷酸，并且5'UTR是SEQ ID NO:2或7的多核苷酸。

例如，基因表达盒可以包括启动子、内含子、5'UTR和含有3'UTR的转录终止子片段，其中启动子是SEQ ID NO:1或6的多核苷酸，5'UTR是SEQ ID NO:2或7的多核苷酸，并且含有3'UTR的转录终止子片段是SEQ ID NO:4或9的多核苷酸。

此外，基因表达盒可以包括启动子和含有3'UTR的转录终止子片段，其中启动子是SEQ ID NO:1或6的多核苷酸，并且含有3'UTR的转录终止子片段具有SEQ ID NO:4或9。

在实施例中，基因表达盒包含可操作地连接到非叶绿素结合Ab转基因的叶绿素结合Ab启动子、叶绿素结合Ab 5'UTR和含有3'UTR的叶绿素结合Ab转录终止子片段。

当基因表达盒包括一个或多个转基因时，启动子、内含子、5'UTR和含有3'UTR的转录终止子片段可以可操作地连接到基因表达盒内的不同转基因。在说明性实施例中，基因表达盒包含可操作地连接到转基因的叶绿素结合Ab启动子和5'UTR，其中转基因可以是杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、可选择标记转基因、干扰RNA(例如，人工微小RNA、发夹RNA或反义RNA)或其组合。在说明性实施例中，基因表达盒包含可操作地连接到转基因的叶绿素结合Ab启动子和5'UTR以及3'UTR，其中转基因可以是杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、可选择标记转基因、干扰RNA(例如，人工微小RNA、发夹RNA或反义RNA)或其组合。在说明性实施例中，基因表达盒包含可操作地连接到转基因的含有3'UTR的叶绿素结合Ab转录终止子片段，其中转基因编码增强杀昆虫抗性、除草剂耐受性、氮利用效率、水利用效率、营养品质的基因产物、人工微小RNA、发夹RNA、反义RNA或其组合。

叶绿素结合Ab 5'UTR可以可操作地连接到基因表达盒内的不同启动子。在说明性实施例中，启动子源自植物(例如，大豆叶绿素结合Ab启动子和5'UTR)、病毒(例如，木薯叶脉花叶病毒启动子)或细菌(例如，根癌农杆菌delta mas)。在说明性实施例中，基因表达盒包含可操作地连接到转基因的叶绿素结合Ab启动子和5'UTR，其中转基因可以是杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、可选择标记转基因、干扰RNA(例如，人工微小RNA、发夹RNA或反义RNA)或其组合。

在实施例中，载体包含如本文所公开的基因表达盒。在实施例中，载体可以是用于直接转化或基因靶向如供体DNA的质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体、病毒或切除的多核苷酸片段。

根据一个实施例，提供了一种核酸载体，其包含重组基因表达盒，其中重组基因表达盒包含可操作地连接到多接头序列、非叶绿素结合Ab转基因或其组合的基于叶绿素结合Ab的启动子。在一个实施例中，重组基因盒包含可操作地连接到非叶绿素结合Ab转基因的基于叶绿素结合Ab的启动子。在一个实施例中，重组基因盒包含如本文所公开的可操作地连接到多接头序列的基于叶绿素结合Ab的启动子。多接头以这样的方式可操作地连接到基于叶绿素结合Ab的启动子，使得将编码序列插入多接头的限制位点之一将可操作地连接编码序列，从而当载体转染到宿主细胞中时允许编码序列的表达。

根据一个实施例，基于叶绿素结合Ab的启动子包含SEQ ID NO:1、6或与SEQ IDNO:1或6具有90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。根据一个实施例，基于叶绿素结合Ab的启动子由SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有90％、95％、98％或99％序列同一性的910bp的序列组成。根据进一步的实施例，基于叶绿素结合Ab的启动子由SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6具有90％、95％、98％或99％序列同一性的818bp的序列组成。

根据一个实施例，3'非翻译区包含SEQ ID NO:3、8或与SEQ ID NO:3或8具有90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在进一步的实施例中，3'非翻译区由SEQ IDNO:3或与SEQ ID NO:3具有90％、95％、98％或99％序列同一性的465bp的序列组成。在进一步的实施例中，3'非翻译区由SEQ ID NO:8或与SEQ ID NO:8具有90％、95％、98％或99％序列同一性的296bp的序列组成。

根据一个实施例，含有3'UTR序列的转录终止子片段包含SEQ ID NO:4、9或与SEQID NO:4或9具有90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在进一步的实施例中，含有3'UTR的转录终止子片段由SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有90％、95％、98％或99％序列同一性的556bp的序列组成。在进一步的实施例中，含有3'UTR序列的转录终止子片段由SEQ ID NO:9或与SEQ ID NO:9具有90％、95％、98％或99％序列同一性的543bp的序列组成。

根据一个实施例，核酸载体还包含编码可选择标记的序列。根据另一个实施例，重组基因盒可操作地连接到农杆菌属T-DNA边界。根据一个实施例，重组基因盒还包含第一和第二T-DNA边界，其中第一T-DNA边界可操作地连接到基因构建体的一端，并且所述第二T-DNA边界可操作地连接到基因构建体的另一端。第一和第二农杆菌属T-DNA边界可以独立地选自源自细菌菌株的T-DNA边界序列，其选自由以下组成的组：胭脂碱合成农杆菌属T-DNA边界、章鱼碱合成农杆菌属T-DNA边界、农杆碱合成农杆菌属T-DNA边界或其任何组合。在一个实施例中，提供了一种农杆菌属菌株，其选自由以下组成的组：胭脂碱合成菌株、甘露碱合成菌株、农杆碱合成菌株或章鱼碱合成菌株，其中所述菌株包含质粒，其中质粒包含可操作地连接到选自SEQ ID NO:5、10-11或与SEQ ID NO:5或10-11具有90％、95％、98％或99％序列同一性的序列的序列的转基因。

适用于当前公开的构建体的目的转基因包括但不限于如下编码序列，其(1)赋予对有害生物或疾病的抗性，(2)赋予对除草剂的耐受性，(3)添加性状价值以及(4)下调天然基因或转基因的表达。根据一个实施例，转基因编码可选择标记或者赋予杀昆虫抗性、除草剂耐受性、氮利用效率、水利用效率、干扰RNA或营养品质的基因产物。

根据一个实施例，提供了包含基因盒的核酸载体，其中基因盒包含可操作地连接到转基因的5'端的启动子区，其中转基因的3'端与3'非翻译区连接。在一个实施例中，启动子区包含SEQ ID NO:1、6或与SEQ ID NO:1或6具有90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。根据一个实施例，启动子区由SEQ ID NO:1或6组成。在一个实施例中，3'非翻译区包含SEQ ID NO:3、8或与SEQ ID NO:3或8具有90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，并且在一个实施例中，3'非翻译区由SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有90％、95％、98％或99％序列同一性的465bp的序列组成。在一个实施例中，3'非翻译区由SEQ ID NO:8或与SEQ IDNO:8具有90％、95％、98％或99％序列同一性的296bp的序列组成。

根据一个实施例，提供了包含基因盒的核酸载体，其中基因盒包含可操作地连接到5'非翻译区的5'端的启动子区，其中5'非翻译区的3'端可操作地连接到转基因的5'端，其中转基因的3'端与3'非翻译区连接。在一个实施例中，启动子区包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，或者由其组成。在一个实施例中，启动子区由SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有90％、95％、98％或99％序列同一性的910bp的序列组成。在一个实施例中，启动子区包含SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6具有90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，或者由其组成。在一个实施例中，启动子区包含SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6具有90％、95％、98％或99％序列同一性的818bp的序列，或者由其组成。根据一个实施例，5'非翻译区包含SEQ ID NO:2、7或与SEQ ID NO:2或7具有90％、95％、98％或99％序列同一性的序列，或者由其组成。在一个实施例中，5'非翻译区由SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有90％、95％、98％或99％序列同一性的123bp的序列组成。在一个实施例中，5'非翻译区由SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7具有90％、95％、98％或99％序列同一性的115bp的序列组成。在进一步的实施例中，核酸载体还包含叶绿素结合Ab3'非翻译区和转基因，并且可操作地连接到启动子和转基因。

在实施例中，提供了包含如本文所公开的基因表达盒的细胞或植物。在实施例中，细胞或植物包含含有如本文所公开的基因表达盒的载体。在实施例中，载体可以是质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体或病毒。从而，包含如本文所公开的基因表达盒的细胞或植物分别是转基因细胞或转基因植物。在实施例中，转基因植物可以是双子叶植物。在实施例中，转基因双子叶植物可以是但不限于番茄、烟草、马铃薯、拟南芥、大豆、棉花、向日葵和卡诺拉(canola)。在实施例中，转基因植物可以是单子叶植物。在实施例中，转基因单子叶植物可以是但不限于玉蜀黍、小麦、水稻、高粱、燕麦、黑麦、香蕉、甘蔗、草坪草和粟。实施例还包括来自如本文所公开的转基因植物的转基因种子。

在实施例中，基因表达盒包括两个或更多个转基因。如本文所公开，两个或更多个转基因可以不可操作地连接到启动子、内含子、5'UTR或含有3'UTR和内含子的转录终止子片段。在实施例中，基因表达盒包括一个或多个转基因。在具有一个或多个转基因的实施例中，至少一个转基因可操作地连接到启动子、5'UTR或含有3'UTR的转录终止子片段。

转基因

可以将还描述为报告基因的各种可选择标记掺入选择的表达载体，以允许鉴定和选择经转化的植物(“转化体”)。许多方法可用于确认可选择标记在经转化的植物中的表达，所述方法包括例如DNA测序和PCR(聚合酶链式反应)、Southern印迹、RNA印迹、用于检测从载体表达的蛋白质(例如，介导草丁膦抗性的沉淀的蛋白质)的免疫学方法或目视观察其他蛋白质(如编码β-葡萄糖醛酸酶(GUS)、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、DsRed、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、碱性磷酸酶等的报告基因)(参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第三版,Cold Spring Harbor Press[冷泉港出版社],纽约州,2001，将其内容通过引用以其整体并入本文)。

利用可选择标记基因来选择经转化的细胞或组织。可选择标记基因包括编码抗生素抗性的基因(如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因)、以及赋予对除草化合物的耐受性的基因。

除草剂耐受性基因可以用作可选择标记或赋予植物所需除草剂耐受性表型，并且通常编码对除草剂不敏感的修饰靶蛋白，或编码在其起作用之前降解植物中的除草剂或使其解毒的酶。例如，已经通过使用编码突变型靶酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因获得了对草甘膦的耐受性。EPSPS的基因和突变体是熟知的，并且在下面进一步描述。已经通过使用编码pat或DSM-2、腈水解酶、aad-1或aad-12基因(其使各自的除草剂解毒)的细菌基因获得了对草铵膦、溴苯腈和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的抗性。

在实施例中，可以抑制正常植物生长和发育的除草剂包括但不限于乙酰羟酸合酶(AHAS)抑制剂，如咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类、嘧啶基(硫代)苯甲酸酯类、磺酰脲类和磺酰基氨基羰基三唑啉酮类；合成植物生长素，如苯氧羧酸类(例如，2,4-D)、苯甲酸类(例如，麦草畏)、吡啶羧酸类、喹啉羧酸类、吡啶甲酸芳基酯类；乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂，如芳氧苯氧丙酸酯类、环己二酮类和苯基吡唑啉类；5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶抑制剂，如草甘膦；谷氨酰胺合成酶抑制剂，如草铵膦和草丁膦；类胡萝卜素生物合成抑制剂，如三唑类；八氢番茄红素去饱和酶(PDS)抑制剂，如哒嗪酮类、吡啶甲酰胺类、异噁唑烷酮类等；4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂，如三酮类、异噁唑类、吡唑类等；原卟啉原氧化酶(PPO)抑制剂，如二苯醚类、苯基吡唑类、N-苯基邻苯二甲酰亚胺类、噻二唑类、噁二唑类、三唑啉酮类、嘧啶二酮类等；二氢蝶酸(DHP)合酶抑制剂，如氨基甲酸酯类；纤维素生物合成抑制剂，如腈类、苯甲酰胺类和三唑并甲酰胺类；微管组装抑制剂，如二硝基苯胺类、磷酰胺类、吡啶类、苯甲酰胺类等；有丝分裂抑制剂，如氨基甲酸酯类；光合作用(PS)抑制剂，如三嗪类、三嗪酮类、三唑啉酮类、尿嘧啶类、脲类、苯基氨基甲酸酯类、苯基哒嗪类(phenylpyridizines)、腈类、苯并噻二嗪酮类、酰胺类、哒嗪酮类和联吡啶鎓类；脂质生物合成抑制剂，如硫代氨基甲酸酯类、二硫代磷酸酯类和苯并呋喃类；超长链脂肪酸(VLCFA)抑制剂，如氯乙酰胺类、乙酰胺类、氧乙酰胺类、四唑啉酮类等(例如，苯酮唑)；植物生长素转运抑制剂，如邻苯甲酰胺甲酸酯类(phthalamates)和缩氨基脲类；和膜破坏剂，如二硝基酚类。赋予对许多这些除草剂的耐受性的基因作为基于靶位点和基于非靶位点的除草剂耐受性的来源是熟知的。

植物对乙酰羟酸合酶(AHAS)或乙酰乳酸合酶(ALS)抑制剂、合成植物生长素和乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂除草剂的耐受性的基因是熟知的。草甘膦耐受性基因分别包括突变型5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)和dgt基因(通过引入重组核酸和/或天然EPSPS基因的体内诱变的各种形式)、aroA基因和草甘膦乙酰基转移酶(GAT)基因。其他膦酰基化合物的抗性基因包括来自链霉菌属(Streptomyces)物种的bar和DSM2基因，所述链霉菌属物种包括吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)、绿产色链霉菌(Streptomyces viridichromogenes)和天蓝色链霉菌(Sterptomyces coelicolor)。赋予对吡啶氧(pyridinoxy)、苯氧丙酸类、环己二酮类和/或芳氧苯氧丙酸(包括吡氟氯禾灵、禾草灵、精恶唑禾草灵酸、吡氟禾草灵、喹禾灵)的耐受性的示例性基因包括AAD-1、AAD-12和乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)--Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3(编码ACCase抑制剂的基因)的基因和解毒基因。在实施例中、除草剂可以抑制光合作用，包括三嗪类(psbA和1s+基因)、三嗪酮类、三唑啉酮类、尿嘧啶类、脲类、苯基氨基甲酸酯类、腈类、苯基哒嗪类、苯并噻二嗪酮类、酰胺类、哒嗪酮类、苄腈类(腈水解酶基因)或联吡啶鎓类。

在实施例中，可选择标记基因包括但不限于编码以下的基因：新霉素磷酸转移酶II；氰酰胺水合酶；天冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸合酶；色氨酸脱羧酶；二氢吡啶二羧酸合酶和脱敏天冬氨酸激酶；bar基因；dsm2；aad12；aad1；色氨酸脱羧酶；新霉素磷酸转移酶(NEO)；潮霉素磷酸转移酶(HPT或HYG)；二氢叶酸还原酶(DHFR)；草丁膦乙酰基转移酶；2,2-二氯丙酸脱卤酶；乙酰羟酸合酶；5-烯醇式丙酮酰莽草酸磷酸合酶(aroA)；卤代芳基腈水解酶；乙酰辅酶A羧化酶；二氢蝶酸合酶(sul I)；和32kD光系统II多肽(psbA)。

实施例还包括其编码对以下的抗性的基因：氯霉素；甲氨蝶呤；潮霉素；壮观霉素；溴草腈；草甘膦；和草丁膦。

以上可选择标记基因的列表并不意在是限制性的。本发明涵盖任何报告基因或可选择标记基因。

合成可选择标记基因以在植物中最佳表达。例如，在实施例中，已经通过密码子优化修饰了基因的编码序列以增强在植物中的表达。可以优化可选择标记基因以在特定植物物种中表达，或者可替代地，可以修饰可选择标记基因以在双子叶植物或单子叶植物中最佳表达。植物偏好性密码子可以从特定目的植物物种中以最大量表达的蛋白质中频率最高的密码子确定。在实施例中，可选择标记基因被设计为在植物中以更高的水平表达，从而导致更高的转化效率。植物基因优化的方法是熟知的。关于合成DNA序列的优化和产生的指导可以在例如WO 2013016546、WO 2011146524、WO 1997013402、美国专利号6166302和美国专利号5380831(通过引用并入本文)中找到。

转化

合适的植物转化方法包括可以将DNA引入细胞的任何方法，例如但不限于：电穿孔(参见例如，美国专利5,384,253)；微粒轰击(参见例如，美国专利5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861和6,403,865)；农杆菌属介导的转化(参见例如，美国专利5,635,055、5,824,877、5,591,616、5,981,840和6,384,301)；和原生质体转化(参见例如，美国专利5,508,184)。

可以使用诸如用碳化硅纤维搅拌等技术将DNA构建体直接引入植物细胞的基因组DNA(参见例如，美国专利5,302,523和5,464,765)，或者可以使用基因枪方法(如DNA颗粒轰击)将DNA构建体直接引入植物组织。可替代地，可以通过纳米颗粒转化将DNA构建体引入植物细胞(参见例如，美国专利公开号20090104700，将其通过引用以其整体并入本文)。

此外，可以使用非农杆菌属细菌或病毒(如根瘤菌属物种(Rhizobium sp.)NGR234、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizoboium meliloti)、中慢生型百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)、马铃薯病毒X、花椰菜花叶病毒和木薯叶脉花叶病毒和/或烟草花叶病毒)来实现基因转移。

通过应用转化技术，几乎任何植物物种的细胞都可以稳定地转化，并且可以通过熟知的技术将这些细胞发育成转基因植物。例如，在美国专利5,846,797、5,159,135、5,004,863和6,624,344中描述了在棉花转化的背景下可能特别有用的技术；例如在美国专利5,750,871中特别描述了用于转化芸苔属(Brassica)植物的技术；例如在美国专利6,384,301中描述了用于转化大豆的技术；并且例如在美国专利7,060,876和5,591,616以及国际PCT公开WO 95/06722中描述了用于转化玉蜀黍的技术。

在实现外源核酸向受体细胞的递送后，通常鉴定经转化的细胞用于进一步培养和植物再生。为了提高鉴定转化体的能力，人们可能希望将可选择标记基因与用于产生转化体的转化载体一起采用。在说明性实施例中，可以通过将细胞暴露于一种或多种选择剂来测定经转化的细胞群，或者可以针对所需标记基因性状筛选细胞。

可以将在暴露于选择剂的条件下存活的细胞或在筛选测定中被评分为阳性的细胞培养在支持植物再生的培养基中。在实施例中，可以通过包括其他物质(如生长调节剂)来修饰任何合适的植物组织培养基。可以将组织用生长调节剂维持在基本培养基上，直到有足够的组织可用于开始植物再生努力，或者经过反复的手动选择回合，直到组织的形态适合于再生(例如，至少2周)，然后转移到有利于芽形成的培养基上。定期转移培养物，直到形成足够的芽。芽形成后，将其转移到有助于根形成的培养基中。形成足够的根后，可以将植物转移到土壤中以进一步生长和成熟。

为了确认在再生植物中提供的包含所需核酸的构建体的存在，可以进行多种测定。此类测定可以包括：分子生物学测定，如Southern和northern印迹和PCR；生物化学测定，如例如通过免疫学手段(ELISA、western印迹和/或LC-MS MS分光光度法)或通过酶学功能检测蛋白质产物的存在；植物部分测定，如叶或根测定；和/或分析整株再生植物的表型。

例如可以通过使用例如对目的核酸分子具有特异性的寡核苷酸引物的PCR扩增来筛选转基因事件。PCR基因分型被理解为包括但不限于衍生自预测含有整合到基因组中的目的核酸分子的分离的宿主植物愈伤组织的基因组DNA的聚合酶链式反应(PCR)扩增，然后进行PCR扩增产物的标准克隆和序列分析。已经充分描述了PCR基因分型的方法，并且可以将其应用于衍生自任何植物物种或组织类型(包括细胞培养物)的基因组DNA。与靶序列和引入的序列均结合的寡核苷酸引物的组合可以在PCR扩增反应中顺序使用或多路复用。可以产生被设计为对靶位点、引入的核酸序列和/或两者的组合退火的寡核苷酸引物。因此，PCR基因分型策略可以包括例如但不限于：植物基因组中特定序列的扩增；植物基因组中多个特定序列的扩增；植物基因组中非特定序列的扩增；以及任何上述内容的组合。本领域技术人员可以设计出引物和扩增反应的另外组合以探询基因组。例如，可以将一组正向和反向寡核苷酸引物设计成对特异于引入的核酸序列边界外的靶标的一种或多种核酸序列退火。

可以将正向和反向寡核苷酸引物设计成例如在与包含在其中的目的核苷酸序列内的编码区或核酸分子的其他部分相对应的序列处对引入的核酸分子特异性退火。引物可以与本文所述的引物结合使用。寡核苷酸引物可以根据所需序列合成，并且是可商购获得的(例如，购自整合DNA技术公司(Integrated DNA Technologies,Inc.)，爱荷华州科罗维尔)。扩增后可以对扩增产物进行克隆和测序，或对扩增产物进行直接序列分析。在实施例中，对基因靶标具有特异性的寡核苷酸引物用于PCR扩增。

如果需要，可以使用PCR或通过全基因组下一代测序技术确定准确的基因组位置。也可以使用mRNA丰度测定转基因的表达。可以使用专门的全基因组方法确定转基因的表观遗传特征，如DNA甲基化和转基因特定小RNA的存在。

表达转基因的方法

在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括使包含叶绿素结合Ab启动子的植物生长，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因。在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括使包含叶绿素结合Ab 5'UTR的植物生长，所述5'UTR可操作地连接到至少一个转基因。在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括使包含叶绿素结合Ab启动子和叶绿素结合Ab 5'UTR的植物生长，所述启动子和所述5'UTR可操作地连接到至少一个转基因。在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括使包含含有3'UTR的叶绿素结合Ab转录终止子片段的植物生长，所述转录终止子片段可操作地连接到至少一个转基因。在实施例中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含叶绿素结合Ab启动子的植物组织或植物细胞，所述启动子可操作地连接到至少一个转基因。在实施例中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含叶绿素结合Ab 5'UTR的植物组织或植物细胞，所述5'UTR可操作地连接到至少一个转基因。在实施例中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含叶绿素结合Ab启动子和叶绿素结合Ab 5'UTR的植物组织或植物细胞，所述启动子和所述5'UTR可操作地连接到至少一个转基因。在实施例中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含含有3'UTR的叶绿素结合Ab转录终止子片段的植物组织或植物细胞，所述转录终止子片段可操作地连接到至少一个转基因。

在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括使包含基因表达盒的植物生长，所述基因表达盒包含可操作地连接到至少一个转基因的叶绿素结合Ab启动子和叶绿素结合Ab 5'UTR。在一个实施例中，叶绿素结合Ab启动子和叶绿素结合Ab 5'UTR由选自SEQID NO:5、10、11或与选自SEQ ID NO:5、10或11的序列具有90％、95％、98％或99％序列同一性的序列的序列组成。在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括使包含基因表达盒的植物生长，所述基因表达盒包含可操作地连接到至少一个转基因的叶绿素结合Ab5'UTR。在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括使包含基因表达盒的植物生长，所述基因表达盒包含可操作地连接到至少一个转基因的叶绿素结合Ab启动子。在实施例中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括使包含基因表达盒的植物生长，所述基因表达盒包含可操作地连接到至少一个转基因的含有3'UTR的叶绿素结合Ab转录终止子片段。在实施例中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含可操作地连接到至少一个转基因的基因表达盒叶绿素结合Ab启动子和5'UTR的植物组织或植物细胞。在实施例中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含可操作地连接到至少一个转基因的基因表达盒叶绿素结合Ab 5'UTR的植物组织或植物细胞。在实施例中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含可操作地连接到至少一个转基因的基因表达盒叶绿素结合Ab启动子和叶绿素结合Ab 5'UTR的植物组织或植物细胞。在实施例中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含基因表达盒的植物组织或植物细胞，所述基因表达盒包含可操作地连接到至少一个转基因的含有3'UTR的叶绿素结合Ab转录终止子片段。

转基因植物

在实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含叶绿素结合Ab启动子。在实施例中，叶绿素结合Ab启动子可以是大豆叶绿素结合Ab启动子。在实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含含有启动子的基因表达盒，其中启动子与SEQ ID NO:1或6至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或100％相同，其中启动子可操作地连接到非叶绿素结合Ab转基因。在实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含基因表达盒，所述基因表达盒包含选自SEQ ID NO:1、6或与选自SEQ ID NO:1或6的序列具有90％、95％、98％或99％序列同一性的序列的序列，所述序列可操作地连接到非叶绿素结合Ab转基因。在说明性实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含基因表达盒，所述基因表达盒包含可操作地连接到转基因的叶绿素结合Ab启动子，其中转基因可以是杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、可选择标记转基因、人工微小RNA、发夹RNA、反义RNA或其组合。

在实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含含有3'UTR的基因表达盒。在实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含含有叶绿素结合Ab 3'UTR的基因表达盒。在实施例中，含有3'UTR的叶绿素结合Ab转录终止子片段是大豆叶绿素结合Ab 3'UTR。

在实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含含有5'UTR的基因表达盒，其中5'UTR与SEQ ID NO:2或7至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或100％相同。在实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含基因表达盒，所述基因表达盒包含可操作地连接到转基因的叶绿素结合Ab 5'UTR。在说明性实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含基因表达盒，所述基因表达盒包含可操作地连接到转基因的叶绿素结合Ab 5'UTR，其中转基因可以是杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、可选择标记转基因、人工微小RNA、发夹RNA、反义RNA或其组合。

在实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含含有叶绿素结合Ab启动子和叶绿素结合Ab 3'UTR的基因表达盒。在实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含叶绿素结合Ab启动子、含有3'UTR的转录终止子片段，所述叶绿素结合Ab启动子、含有3'UTR的转录终止子片段可以各自独立地是大豆叶绿素结合Ab启动子和大豆叶绿素结合Ab 3'UTR。在实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含基因表达盒，所述基因表达盒包含a)启动子，其中启动子与SEQ ID NO:1或6至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或100％相同；以及b)3'UTR，其中含有3'UTR的转录终止子片段与SEQID NO:4或9至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或100％相同。

在实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含基因表达盒，所述基因表达盒包含可操作地连接到转基因的叶绿素结合Ab启动子、叶绿素结合Ab 5'UTR和含有3'UTR的叶绿素结合Ab转录终止子片段。当基因表达盒包括两个或更多个转基因时，启动子、5'UTR和含有3'UTR的转录终止子片段可以可操作地连接到基因表达盒内的不同转基因。在说明性实施例中，基因表达盒包含可操作地连接到转基因的叶绿素结合Ab启动子和5'UTR，其中转基因可以是杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、可选择标记转基因、人工微小RNA、发夹RNA、反义RNA或其组合。

在说明性实施例中，基因表达盒包含可操作地连接到转基因的叶绿素结合Ab 5'UTR，其中转基因可以是杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、可选择标记转基因、人工微小RNA、发夹RNA、反义RNA或其组合。在实施例中，基因表达盒包含可操作地连接到启动子的叶绿素结合Ab 5'UTR，其中启动子是大豆叶绿素结合Ab启动子或源自植物(例如，大豆叶绿素结合Ab启动子)、病毒(例如，木薯叶脉花叶病毒启动子)或细菌(例如，根癌农杆菌delta mas)的启动子。在说明性实施例中，基因表达盒包含可操作地连接到转基因的含有3'UTR的叶绿素结合Ab转录终止子片段，其中含有3'UTR的转录终止子片段可以是杀昆虫抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、可选择标记转基因、iRNA或其组合。

在实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含载体，所述载体包含如本文所公开的叶绿素结合Ab启动子、5'UTR和/或含有3'UTR的转录终止子片段。在实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含载体，所述载体包含可操作地连接到非叶绿素结合Ab转基因的如本文所公开的叶绿素结合Ab启动子、5'UTR和/或含有3'UTR的转录终止子片段。在实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含含有如本文所公开的基因表达盒的载体。在实施例中，载体可以是质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体或病毒。

根据一个实施例，提供了一种植物、植物组织或植物细胞，其中植物、植物组织或植物细胞包含可操作地连接到转基因的非内源叶绿素结合Ab衍生的启动子和5'UTR，其中叶绿素结合Ab衍生的启动子和5'UTR序列包含序列SEQ ID NO:5、10或与SEQ ID NO:5或10具有90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。在一个实施例中，提供了一种植物、植物组织或植物细胞，其中植物、植物组织或植物细胞包含可操作地连接到非叶绿素结合Ab转基因的SEQ ID NO:1、5、6、10-11或与SEQ ID NO:1、5、6或10-11具有90％序列同一性的序列。在一个实施例中，植物、植物组织或植物细胞是双子叶植物或单子叶植物或者衍生自双子叶植物或单子叶植物的细胞或组织。在一个实施例中，植物选自由以下组成的组：玉蜀黍、小麦、水稻、高粱、燕麦、黑麦、香蕉、草坪草、甘蔗、大豆、棉花、向日葵、烟草、马铃薯、番茄、拟南芥和卡诺拉。在一个实施例中，植物是大豆。根据一个实施例，植物、植物组织或植物细胞包含或可操作地连接到非叶绿素结合Ab转基因的SEQ ID NO:1、5、6、10-11或与SEQ IDNO:1、5、6、10-11具有90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。在一个实施例中，植物、植物组织或植物细胞包含可操作地连接到转基因的启动子，其中启动子由SEQ ID NO:1、6或与SEQ ID NO:1或6具有90％、95％、98％或99％序列同一性的序列组成。根据一个实施例，包含可操作地连接到转基因的非内源叶绿素结合Ab衍生的启动子序列的基因构建体被掺入植物、植物组织或植物细胞的基因组中。

在一个实施例中，提供了一种非大豆属(Glycine)植物、植物组织或植物细胞，其包含可操作地连接到转基因的SEQ ID NO:1、5、6、10-11或与SEQ ID NO:1、5、6、10-11具有90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。根据一个实施例，非大豆属植物、植物组织或植物细胞是双子叶植物或单子叶植物或者衍生自双子叶植物或单子叶植物的植物细胞或组织。在一个实施例中，植物选自由以下组成的组：玉蜀黍、小麦、水稻、高粱、燕麦、黑麦、草坪草、香蕉、甘蔗、大豆、棉花、烟草、马铃薯、番茄、拟南芥、向日葵和卡诺拉。根据一个实施例，可操作地连接到转基因的启动子序列被掺入植物、植物组织或植物细胞的基因组中。在一个实施例中，植物、植物组织或植物细胞还包含5'非翻译区，所述5'非翻译区包含SEQ IDNO:2、7或与SEQ ID NO:2或7具有90％序列同一性的序列，其中5'非翻译区插入所述启动子和所述转基因之间，并且可操作地连接到所述启动子和所述转基因。

在一个实施例中，提供了一种非大豆属植物、植物组织或植物细胞，其包含可操作地连接到包含SEQ ID NO:2或7的转基因的5'端的SEQ ID NO:1、6或与SEQ ID NO:1或6具有90％、95％、98％或99％序列同一性的序列以及包含SEQ ID NO:3、8或与SEQ ID NO:3或8具有90％序列同一性的序列的3'非翻译区，其中3'非翻译区可操作地连接到所述转基因。根据一个实施例，非大豆属植物、植物组织或植物细胞是双子叶植物或单子叶植物或者是衍生自双子叶植物或单子叶植物的植物组织或细胞。在一个实施例中，植物选自由以下组成的组：玉蜀黍、小麦、水稻、高粱、燕麦、黑麦、香蕉、草坪草、甘蔗、大豆、棉花、烟草、马铃薯、番茄、拟南芥、向日葵和卡诺拉。根据一个实施例，可操作地连接到转基因的启动子序列被掺入植物、植物组织或植物细胞的基因组中。在一个实施例中，植物、植物组织或植物细胞还包含5'非翻译区，所述5'非翻译区包含SEQ ID NO:2、7或与SEQ ID NO:2或7具有90％序列同一性的序列，其中5'非翻译区插入所述启动子和所述转基因之间，并且可操作地连接到所述启动子和所述转基因。在一个实施例中，5'非翻译区由SEQ ID NO:2或7组成。

在一个实施例中，非大豆属植物、植物组织或植物细胞还包含大豆的叶绿素结合Ab基因的3'非翻译区。在一个实施例中，3'非翻译区包含SEQ ID NO:3、8或与SEQ ID NO:3或8具有90％序列同一性的序列，或者由其组成，其中3'非翻译区可操作地连接到转基因的3'端。

在实施例中，根据本文公开的方法的植物、植物组织或植物细胞可以是双子叶植物。双子叶植物、植物组织或植物细胞可以是但不限于烟草、番茄、拟南芥、油菜、卡诺拉、印度芥菜、埃塞俄比亚芥菜、大豆、马铃薯、向日葵和棉花。

在实施例中，根据本文公开的方法的植物、植物组织或植物细胞可以是单子叶植物。单子叶植物、植物组织或植物细胞可以是但不限于玉米、水稻、小麦、甘蔗、大麦、黑麦、高粱、兰花、竹、香蕉、香蒲、百合、燕麦、洋葱、粟、草坪草和黑小麦。

关于基因改良植物的生产，用于植物基因工程的方法是本领域熟知的。例如，已经开发了用于植物转化的许多方法，包括用于双子叶植物以及单子叶植物的生物和物理转化方案(例如，Glick,B.R.和Thompson,J.E.编辑,CRC Press,Inc.[CRC出版公司],博卡拉顿,第67-88页(1993))。此外，用于植物细胞或组织转化和植物再生的载体和体外培养方法可在例如Glick,B.R.和Thompson,J.E.编辑,CRC Press,Inc.[CRC出版公司],博卡拉顿,第89-119页(1993)中获得。

本领域技术人员将认识到，在将外源序列稳定地掺入转基因植物中并确认是可操作的之后，可以通过有性杂交将其引入其他植物。可以使用许多标准育种技术中的任何一种，这取决于待杂交的物种。

可以通过选择或筛选工程化植物材料中存在于转化DNA上的标记基因编码的性状来鉴定和分离经转化的植物细胞、愈伤组织、组织或植物。例如，可以通过在含有抑制量的转化基因构建体赋予对其的抗性的抗生素或除草剂的培养基上使工程化的植物材料生长来进行选择。此外，还可以通过筛选可能存在于重组核酸构建体上的任何可见标记基因(例如，yfp、gfp、β-葡萄糖醛酸酶、萤光素酶、B或C1基因)的活性来鉴定经转化的细胞。此类选择和筛选方法是本领域技术人员熟知的。

物理和生物化学方法也可以用于鉴定含有插入的基因构建体的植物或植物细胞转化体。这些方法包括但不限于：1)Southern分析或PCR扩增，用于检测和确定重组DNA插入片段的结构；2)Northern印迹、S1 RNA酶保护、引物延伸或逆转录酶-PCR扩增，用于检测和检查基因构建体的RNA转录物；3)酶学测定，用于检测酶或核酶活性，其中此类基因产物由基因构建体编码；4)下一代测序分析；5)蛋白质凝胶电泳、Western印迹技术、免疫沉淀或酶联免疫测定(ELISA)，其中基因构建体产物是蛋白质。另外的技术(如原位杂交、酶染色和免疫染色)也可以用于检测在特定植物器官和组织中重组构建体的存在或表达。进行所有这些测定的方法是本领域技术人员熟知的。

使用本文公开的方法进行基因操作的效果可以通过例如从目的组织分离的RNA(例如，mRNA)的northern印迹来观察。通常，如果存在mRNA或mRNA的量增加，则可以假定相应的转基因正在表达。可以使用测量基因和/或编码的多肽活性的其他方法。可以使用不同类型的酶学测定，这取决于所使用的底物和检测反应产物或副产物增加或减少的方法。此外，可以通过免疫化学方法(即，ELISA、RIA、EIA和本领域技术人员熟知的其他基于抗体的测定，如通过电泳检测测定(采用染色或western印迹))来测量表达的多肽的水平。作为一个非限制性实例，使用ELISA测定检测AAD-1(芳氧基链烷酸酯双加氧酶；参见WO 2005/107437)和PAT(草丁膦-N-乙酰基转移酶，EC 2.3.1.183)蛋白质描述于美国专利公开号20090093366，将其通过引用以其整体并入本文。转基因可以在植物的一些细胞类型或组织中或在一些发育阶段选择性表达，或者转基因可以基本上在其整个生命周期中在基本上所有植物组织中表达。然而，任何组合表达模式也是适用的。

本公开还涵盖上述转基因植物的种子，其中种子具有转基因或基因构建体。本公开进一步涵盖上述转基因植物的后代、克隆、细胞系或细胞，其中所述后代、克隆、细胞系或细胞具有转基因或基因构建体。

虽然已经参考特定的方法和实施例描述了本发明，但是将理解，可以在不脱离本发明的情况下进行各种修改和改变。

实例

实例1

优先在叶中表达的大豆基因的鉴定以及来自大豆基因组序列的调控元件的源DNA序列

通过分析可公开获得的大豆表达谱(Severin等人,(2010),BMC Plant Biol[BMC植物生物学],10,160)中的数据将Glyma08g08770和Glyma05g25810.1大豆内源基因鉴定为具有相似的组织特异性表达谱(图1A)。这两个基因在幼叶中具有最高的转录物丰度，并且转录物也存在于花和豆荚组织中。发育中的种子中的转录物水平较低，并且在根和根瘤中未检测到转录物。相比之下，在大多数组织中观察到组成性表达的基因Glyma20g27950和Glyma10g39780的高转录物水平(图1B)。因此，对Glyma08g08770和Glyma05g25810的表达模式的分析显示，这两个基因在叶和发育中的豆荚中优先表达。在发育中的根和根瘤中几乎不表达或没有检测到表达(图1A)。这种表达模式是生物技术感兴趣的，因为它将为转基因提供更加差异化的表达模式，在其中可能不需要在根和种子中的高表达。

基于对蛋白质和DNA序列相似性的分析，Glyma08g08770和Glyma05g25810是高度相似的基因。在许多情况下，重复的基因保留相似的功能和相似的表达模式(图1A；Guo等人,(2013),PLoS One[公共科学图书馆·综合],8,e76809；Severin等人,(2010),BMCPlant Biol[BMC植物生物学],10,160)，如针对这两个基因所观察到的。Glyma08g08770和Glyma05g25810具有蛋白质序列的高度保守(98％同一性)并且在Glyma08g08770起始密码子上游(73％，图2)以及起始密码子和终止密码子下游(77％，未显示)的非编码序列内具有显著的序列保守。因为这些基因具有相似的表达模式(图1A)，所以指定这些表达模式的调控元件也可能在这两个共生同源基因中保持保守和功能。我们使用了Glyma08g08770和Glyma05g25810的非编码序列内的序列相似性来分离假定的上游和下游调控序列。

为了降低转基因的基于序列同源性的小RNA介导的转基因沉默的未来可能性，我们排除了与可转座或可逆转座元件具有相似性的源序列DNA区域。我们还避免了在源序列中包括基因组DNA区域，在其中在任何序列背景下(CG、CHG或CHH)，胞嘧啶残基都被严重甲基化。使用如先前公开于美国专利公开号20150128309A1(通过引用以其整体并入本文)中的方法来完成此评估。

因此，以上所述源策略导致从Glyma08g08770基因座中分离出1033bp的片段并且从Glyma05g25810基因座中分离出933bp的片段。这些片段含有来自假定的启动子和5'UTR的上游调控序列。上游调控序列Glyma08g08770(SEQ ID NO:5)和Glyma05g25810(SEQ IDNO:10)的比对在图2中示出。SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10的上游调控序列具有约73％的序列同一性。

通过确保适当的转录终止、从Pol-II RNA聚合酶释放转录物和转录物聚腺苷酸化，下游调控序列在基因表达中起关键作用。RNA聚合酶II(Pol-II)具有非结构化的转录终止子，并且在终止子中可能存在多个主要和次要的聚腺苷酸化位点(Xing等人,(2010),Plant Biotechnol J[植物生物科技杂志],8,772-782)。因为未对在所检查的基因内确切的聚腺苷酸化位点精确作图，所以我们获得了较大的终止子片段，它们比最远的带注释的聚腺苷酸化位点长至少100、200、300或更多个碱基对。基于此策略，从基因组DNA中提取了Glyma08g08770的转录终止子片段，并且显示为SEQ ID NO:4。3'UTR的序列是加粗的。使用类似的策略从Glyma05g25810基因中获得了终止子片段，并且将其显示为SEQ ID NO:9。

除了以上所述对GmCAB调控序列的鉴定外，还鉴定了其他三个大豆基因，并且使用类似于针对GmCAB生物信息学分析所述那些的方法分离了候选调控序列。这些另外的大豆基因是：编码与HAD超家族IIIB酸性磷酸酶具有相似性的假设蛋白质的Glyma07g01730，编码与假定的HAD超家族亚家族IIIB酸性磷酸酶具有相似性的假设蛋白质的Glyma08g21410和编码噻唑生物合成酶的Glyma10g39740(http://soykb.org/)。

用于本氏烟(N.benthamiana)瞬时表达的对照构建体pDAB110167含有与被工程化为含有与来自马铃薯蛋白酶抑制剂II(StPinII)(An等人,Plant Cell.[植物细胞]1989 1:115-22)基因的终止子片段配对的玉蜀黍乙醇脱氢酶I(AdhI)基因内含子6的玉蜀黍条纹病毒(MSV)5'前导序列融合的ScBV启动子(缩写为ScBV/StPinII)以驱动RFP/AAD12融合报告基因的表达。

实例2

用于在本氏烟瞬时测定中表达的候选大豆调控序列的克隆

通过DNA2.0合成Glyma08g08770基因的SEQ ID NO:5(含有启动子序列、5'UTR和SEQ ID NO:4(含有终止子序列)的大豆基因组DNA。合成片段的示意图示于图3。将合成片段克隆到Gateway进入载体中，然后将RFP/AAD12报告基因(SEQ ID NO:12)插入启动子/5'UTR和终止子之间。将所得表达盒移动到最终的二元载体中并且用于转化。报告基因是编码含有用刚性螺旋肽接头LAE(EAAAK)₅AAA连接的RFP和AAD12多肽的转录融合蛋白的双重报告基因，描述于Arai等人,(2001),Protein Eng[蛋白质工程],14,529-532；Marqusee等人,(1987),Proc Natl Acad Sci U S A[美国科学院院报],84,8898-8902。将在启动子/5'UTR和终止子之间的RFP/AAD12报告基因工程化，并且将掺入二元载体pDAB116644中的所得表达盒用于植物转化。此植物转化载体还含有由拟南芥泛素10启动子和5'UTR农杆菌属Orf23终止子(AtuOrf23)驱动的绿色荧光蛋白(GFP)以及由木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子(Samac等人,2004,Transgenic Res[转基因研究],13,349-361)和农杆菌属Orf1终止子(AtuOrf1，Barker等人,1983),Plant Mol Biol[植物分子生物学],2,335-350)驱动的合成的pat基因(来自绿产色链霉菌的草丁膦N-乙酰基转移酶)。

实验中使用的另外的构建体包括pDAB116643(Glyma07g01730，HAD超家族亚家族IIIB酸性磷酸酶)、pDAB116645(Glyma08g21410，HAD超家族亚家族IIIB酸性磷酸酶)和pDAB116646(Glyma10g39740，噻唑生物合成酶)。

实例1中描述了在本氏烟瞬时表达实验中使用的对照构建体pDAB110167。

实例3

本氏烟叶浸润和GmCAB指定的RFP/AAD12表达的瞬时测定

使本氏烟植物在温室中在16小时的光周期、27℃/24℃下生长。将二十四天大的植物用于浸润。使用两种农杆菌属菌株浸润3-4片最上面的叶。第一菌株用于所有浸润，并且携带表达P19沉默抑制子的pDAB112236构建体(Silhavy等人,(2002),EMBO J[欧洲分子生物学会杂志],21,3070-3080；Voinnet等人,(1999),Proc Natl Acad Sci U S A[美国科学院院报],96,14147-14152)。第二农杆菌属菌株是携带pDAB116644的实验菌株或携带对照二元载体pDAB110167的菌株。pDAB110167与pDAB116644相同，除了pDAB110167具有由ScBV/StPinII驱动的报告RFP/AAD12融合基因。对于本氏烟叶浸润，将含有pDAB116644或pDAB110167的农杆菌属菌株与携带含有编码P19沉默抑制子的基因的质粒的农杆菌属菌株以等比例混合。混合比率是基于光密度(OD)读数。将所有农杆菌属培养物的密度调节至OD2.0。浸润后，将植物保持在Conviron中，直到在浸润后第6天收集叶。对于每种构建体，使用Typhoon扫描仪从30片叶中收集荧光数据，每片叶具有3-5个1英寸的圆片。

来自本氏烟的所有样品均在3个通道上进行扫描：叶绿素(488nm蓝色激光，670nmBP30，580nm分裂)，GFP(488nm蓝色激光，520nm BP40，580nm分裂)和RFP(532nm绿色激光，580nm BP30)。PMT设置是340/340/400。通过从测试处理值中减去未处理和空载体对照的计算平均值来进行背景调整。

在本氏烟瞬时测定中的测试结果示于表1。结果分析显示，Typhoon测量的pDAB116644的RFP荧光相对于对照pDAB110167构建体具有高约5倍的平均RFP荧光。与GmCAB调控序列的结果(表1)相反，携带来自其他三个大豆内源基因的候选调控序列的另外的构建体pDAB116643(Glyma07g01730)、pDAB116645(Glyma08g21410)、pDAB116646(Glyma10g39740)产生的RFP荧光低于pDAB110167对照的RFP荧光(表1)。这些构建体未能产生显著的RFP荧光不是由于浸润性差，因为在相同的构建体中存在的GFP转基因产生了相当水平的荧光(表1)。因此，GmCAB表达盒很好地用于表达转基因，尤其是与其他内源大豆启动子候选物相比，后者对转基因表达不能很好地起作用。

表1.在瞬时转化的本氏烟叶中测定RFP和GFP荧光的结果。

实例4

用于在大豆中表达的候选大豆调控序列的克隆。

通过DNA2.0合成Glyma08g08770基因的SEQ ID NO:5(含有启动子和5'UTR)和SEQID NO:4(含有终止子序列)的大豆基因组DNA。将合成片段克隆到Gateway进入载体中，并且然后将编码AAD12蛋白的基因插入5'UTR和终止子之间。将所得表达盒转移到最终的二元载体中，得到最终的质粒pDAB116629，将其用于转化。最终的植物转化载体还含有由CsVMV启动子和农杆菌属Orf1终止子(AtuOrf1)驱动的合成pat基因(来自绿产色链霉菌的草丁膦N-乙酰基转移酶)。

实例5

大豆转化

如本领域已知的，包括例如通过农杆菌属介导的转化，如下产生了10到20个具有包含启动子的核酸的表达载体的转基因T₀大豆植物。将成熟的大豆(soybean/Glycinemax)种子用氯气灭菌过夜持续十六小时。用氯气灭菌后，将种子置于在LAMINAR^TM通风橱中的敞开容器中以驱散氯气。接下来，在24℃下，使用黑箱在黑暗中使经灭菌的种子吸收无菌H₂O持续十六个小时。

制备种子分裂的(split-seed)大豆。包含一部分胚轴的分裂的大豆种子方案需要准备大豆种子材料，将其使用固定在解剖刀上的#10刀片沿种脐纵向切开，以分离和去除种皮并且使种子分裂成两个子叶部分。小心操作以部分去除胚轴，其中约1/2-1/3的胚轴仍然附着在子叶的节末端。

接种。然后将包含一部分胚轴的分裂的大豆种子浸入含有包含启动子的二元质粒的根癌农杆菌(例如，菌株EHA 101或EHA 105)的溶液中持续约30分钟。在浸没包含胚轴的子叶之前，将根癌农杆菌溶液稀释至λ＝0.6OD₆₅₀的终浓度。

共培养。接种后，允许将分裂的大豆种子与根癌农杆菌菌株在盖有一张滤纸的培养皿中在共培养培养基上共培养5天(Wang,Kan.Agrobacterium Protocols.[农杆菌属方案]2.1.New Jersey:Humana Press[新泽西州：胡玛纳出版社],2006.印刷)。

芽诱导。共培养5天后，将分裂的大豆种子在液态芽诱导(SI)培养基中洗涤，所述液态芽诱导培养基由B5盐、B5维生素、28mg/L亚铁、38mg/L Na₂EDTA、30g/L蔗糖、0.6g/LMES、1.11mg/L BAP、100mg/L TIMENTIN^TM、200mg/L头孢噻肟和50mg/L万古霉素组成(pH5.7)。然后将分裂的大豆种子在芽诱导I(SI I)培养基上培养，所述芽诱导I培养基由B5盐、B5维生素、7g/L诺布尔琼脂、28mg/L亚铁、38mg/L Na₂EDTA、30g/L蔗糖、0.6g/L MES、1.11mg/L BAP、50mg/L TIMENTIN^TM、200mg/L头孢噻肟、50mg/L万古霉素组成(pH 5.7)，其中子叶的平坦侧朝上，并且将子叶的节末端浸入培养基中。培养2周后，将来自经转化的分裂的大豆种子的外植体转移到芽诱导II(SI II)培养基中，所述芽诱导II培养基含有补充有6mg/L草铵膦

的SI I培养基。

芽伸长。在SI II培养基上培养2周后，将子叶从外植体中移出，并且通过在子叶根部制造切口来切除含有胚轴的齐平芽块。将从子叶分离出的芽块转移到芽伸长(SE)培养基中。SE培养基由MS盐、28mg/L亚铁、38mg/L Na₂EDTA、30g/L蔗糖和0.6g/L MES、50mg/L天冬酰胺、100mg/L L-焦谷氨酸、0.1mg/L IAA、0.5mg/L GA3、1mg/L玉米素核苷、50mg/LTIMENTIN^TM、200mg/L头孢噻肟、50mg/L万古霉素、6mg/L草铵膦、7g/L诺布尔琼脂组成(pH5.7)。每2周将培养物转移到新鲜的SE培养基中。使培养物在CONVIRON^TM生长室中在24℃下以18h的光周期在80-90μmol/m²sec的光强度下生长。

生根。通过在子叶芽块的根部切下细长芽并且将细长芽蘸入1mg/L IBA(吲哚3-丁酸)中持续1-3分钟以促进生根，使从子叶芽块发育的细长芽分离。接下来，将细长芽转移到在phyta托盘中的生根培养基(MS盐、B5维生素、28mg/L亚铁、38mg/L Na₂EDTA、20g/L蔗糖和0.59g/L MES、50mg/L天冬酰胺、100mg/L L-焦谷氨酸、7g/L诺布尔琼脂，pH 5.6)中。

培养。在CONVIRON^TM生长室中在24℃、18h的光周期下培养1-2周后，将发育成根的芽转移到有盖圣代杯(sundae cup)中的土壤混合物中，并且置于CONVIRON^TM生长室(型号CMP4030和CMP3244，受控环境有限公司(Controlled Environments Limited)，加拿大马尼托巴省温尼伯)中，在长日照条件下(16小时光照/8小时黑暗)，在120-150μmol/m²sec的光强度下，在恒定温度(22℃)和湿度(40％-50％)下，用于使小植物适应环境。在将生根的小植物转移到温室以进一步适应环境并且获得强大的转基因大豆植物之前，将它们在圣代杯中适应新环境持续数周。

将转基因品系的发育和形态特征与未转化的植物进行比较。比较植物的根、芽、叶和繁殖特征。记录植物芽的特征，如高度、叶数目和大小、开花时间、花的大小和外观。

实例6

使用实时

PCR估算转基因拷贝数

在96孔收集管中收集来自转基因大豆植物和非转基因对照的叶组织样品。使用2mm钨珠进行组织破坏。组织浸软后，将基因组DNA使用Agilent BioCel上的MagAttract植物试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，德国希尔登)以高通量形式分离。通过使用水解探针测定(类似于

测定)，在用大豆内部参考基因GMS116的双路复用(bi-plex)中确定pat的转基因拷贝数。使用

探针设计软件2.0设计测定。通过使用水解探针测定(类似于

测定)，在用大豆内部参考基因GMS116的双路复用中确定壮观霉素抗性基因(SpecR)的转基因存在/不存在。设计此测定以检测位于用于转化的二元构建体的骨架内的SpecR基因。仅没有用SpecR探针扩增的事件再生，因为这表明在转基因大豆基因组中不太可能存在骨架片段。为了扩增所有目的基因(pat、SpecR、GMS116)，在含有0.4μM的每种引物和0.2μM的每种探针(引物和探针的组成列于表2)的10μL体积多路复用反应中以1x的终浓度制备

480探针预混合物(罗氏应用科学公司(Roche Applied Science)，#04707494001)。使用LIGHTCYCLER 480系统(罗氏应用科学公司)进行两步扩增反应，其中在60℃下延伸60秒，并且进行荧光捕获。

使用先进的相对定量模块，使用

软件版本1.5进行实时PCR数据的分析，并且所述分析是基于ΔΔCt方法。对于pat，每次运行均包括已知单拷贝gDNA样品，并且将其用作单拷贝校准物。此外，对于所有目的基因，每次运行均包括作为阴性对照的野生型(Maverick)样品。

表2：用于位于骨架中的pat和SpecR基因和内部参考(GMS116)的水解探针测定的引物和探针信息。所有序列均以5'-3'表示。

实例7

可操作地连接到叶绿素结合Ab调控序列的基因在大豆中的表达

从大豆叶中提取蛋白质。从组织培养小瓶中移植后，使植物适应土壤生长后对其进行取样。在96孔簇试管架中收集两个直径为6mm的叶圆片，并且将其保存在-80℃直至分析当天。将两个2mm的DAISY^TM钢球和200μl的提取缓冲液(含有0.05％的Tween 20、5μl/ml的西格玛(Sigma)蛋白酶抑制剂和0.75％卵清蛋白的PBS溶液)添加到每个试管中。在最大设置下，将样品在Kleco^TM组织粉碎机中研磨3分钟。将样品在3,000x g下离心5分钟；将100μl的上清液转移到空的样品试管中。将另外100μl的提取缓冲液添加到植物样品中，并且再珠磨3分钟，离心，并且将100μl的此提取物与前100μl合并。将合并的上清液混合，并且在提取的同一天进行分析。

检测在大豆叶中的AAD12蛋白积累的ELISA定量方法。在转基因荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株中表达和纯化了用于实验的AAD-12纯蛋白。使用冻干的转基因和非转基因对照组织样品。常见的生物化学和化学试剂购自西格玛-奥德里奇化学公司(Sigma-Aldrich Chemical Co.)(密苏里州圣路易斯)。ELISA实验在96孔微孔板(能肯公司(Nunc)，丹麦罗斯基勒)中进行，并且吸光度用Vmax酶标仪(分子装置公司(MolecularDevices)，加利福尼亚州门洛帕克)以双波长模式(450-650nm)测量。AAD-12ELISA试剂盒购自恩沃劳格公司(Envirologix Inc)(缅因州波特兰)。

分析植物叶样品(干重大约15mg或4个叶穿孔)的AAD-12。使用提取缓冲液含0.05％Tween 20的磷酸缓冲盐水(PBST)缓冲液和0.75％卵清白蛋白(OVA)(PBST/OVA)(西格玛公司(Sigma)，密苏里州圣路易斯)从植物组织中提取AAD-12蛋白。在含提取缓冲液和两个钢珠的微量离心管中，在Geno-Grinder(BT&C/OPS诊断公司(BT&C/OPS Diagnostics)，新泽西州布里奇沃特)中以1500个冲程/分钟提取1分钟。将提取物离心；将含水上清液收集、稀释并且使用AAD-12ELISA试剂盒测定。以三明治ELISA形式，在抗AAD-12多克隆抗体包被的板的孔中，将经稀释的样品的等分试样与酶缀合的抗AAD-12蛋白单克隆抗体一起孵育。在孵育期结束时，通过用PBST洗涤将未结合的试剂从板上除去。通过将抗体结合的酶缀合物与酶底物一起孵育从而产生有色产物来检测AAD-12的存在。由于AAD-12结合在抗体三明治中，因此显色水平与样品中AAD-12的浓度成比例(即，较低的蛋白质浓度导致较低的显色)。通过添加酸性溶液(0.4N H₂SO₄)终止显色反应，并且使用分光光度计读板器测量在450nm处的吸光度减去在650nm处的吸光度。使用决定系数为0.990或更大的二次回归方程，从七个标准浓度及其随后的吸光度或光密度(OD)估算校准曲线。使用以下公式进行计算：

y＝A+Bx+Cx²

其中y是吸光度值(OD)，并且x是抗原浓度。

实例8

可操作地连接到叶绿素结合Ab调控序列的基因的整株植物大豆稳定表达。

为了评价与GmCAB启动子、5'UTR和终止子片段融合的AAD12基因的表达，在T₀转基因植物的叶中检测转基因的稳定转化(参见实例6和7)。使含有低拷贝数的转基因(1-2个拷贝)并且没有显示出用对SpecR基因具有特异性的引物(表2)的扩增的转基因事件再生，并允许形成种子。使所得的T₁种子在温室中萌发，并且对叶进行取样以提取DNA。将DNA制备物用于PCR扩增(引物序列参见表2)，以确定合子型并且重新确认转基因拷贝数。结果确认大豆植物携带转基因插入物，并且允许以合子型类别(纯合子、半合子和空)分离植物。如实例7中所述，对纯合子和半合子植物进行取样以通过ELISA进行蛋白质分析。蛋白质积累的结果示于表3。所有pDAB116629转基因事件均在半合子和纯合子植物中积累了AAD12蛋白。此结果证明，GmCAB调控元件支持AAD12蛋白在转基因大豆植物叶中的积累。与GmCAB(pDAB116629)相反，其他三个候选调控序列(pDAB116628、pDAB116630和pDAB116631)不会导致可检测的AAD12蛋白积累(表3)。此结果清楚地显示，从Glyma08g08770基因分离的GmCAB(SEQ ID NO:11)很好地用于驱动大豆中的转基因表达。同时，来自其他三个基因Glyma07g01730(pDAB116628)、Glyma08g21410(pDAB116630)和Glyma10g39740(pDAB116631)的调控序列不会在大豆中导致可检测的转基因表达，并且不可用于转基因表达。

表3.在T₁转基因大豆的叶中AAD12蛋白积累的ELISA确定的结果。

实例9

通过由GmCAB调控序列驱动的aad12基因在大豆T₁转基因植物中的表达来详细说明除草剂耐受性。

为了评估T₁大豆除草剂耐受性，将单拷贝T₀事件的自花授粉所产生的T₁种子种植在4英寸方盆中包含的人工土壤混合物(MetroMix 360^TM)中。T₁代是纯合子、半合子和非转基因植物的分离群体。为消除空个体，当植物达到第一个三叶期时，T₁群体接受了叶面施用411g活性成分(ai)/ha草铵膦(

280)。施用后四天(DAA)，对存活的植物取样进行分子分析，以确定转基因合子型并且确认转基因拷贝数。

对于每个事件，对8株纯合子和8株半合子植物进行取样以分析蛋白质，并且第二天(第三个三叶期)，一半植物接受了叶面施用2240g酸当量(ae)/ha 2,4-D二甲胺(DMA)盐(

64)。剩余的植物不接受喷洒施用。还将一些植物用去离子水喷洒作为喷雾器施用对照。除了经转化的事件外，每种处理还包括大豆品种‘Maverick’作为非转化对照。

使用曼德尔(Mandel)履带喷雾器装置进行叶面施用，使用8002E喷嘴并且在植物冠层上方18英寸的喷洒高度，以187L/ha将喷雾溶液递送到0.503m²的喷雾面积。在施用后5小时(HAA)以及1、7和14DAA评价植物对2,4-D施用的反应。通过按0％至100％的比例评估与未经处理的对照相比的视觉损伤和/或生长减少来收集数据，其中0％对应于无损伤或无生长减少，而100％对应于完全植物死亡。将植物在14h的光周期下保持在28℃/25℃(白天/夜晚)下，并且根据需要用水或肥料进行地下灌溉。

表4中示出了大豆转基因pDAB116629植物和对照植物的除草剂耐受性的测试结果。对在除草剂1DAA时的除草剂耐受性的评估揭示到，携带GmCAB调控序列驱动的aad12基因的转基因植物仅表现出对于此类别的除草剂典型的轻度表型症状。这些症状主要包括暂时的叶偏上生长，植物在24小时内从其中恢复。在之后的时间点(7和14DAA)，GmCAB转基因植物没有表现出来自除草剂喷洒的损害的迹象，它们正常生长并且与未喷雾的对照Maverick植物没有显著差异(图4)。与GmCAB转基因植物(pDAB116629)相反，非转基因Maverick植物从未从处理中恢复并且到14DAA死亡(图4)。这些结果显示，以2240g ae/ha2,4-D的高剂量喷洒，以足以支持商业化2,4-D除草剂耐受性的水平，GmCAB调控序列支持目的aad12基因的表达。

表4.由GmCAB驱动的AAD12详细说明的转基因大豆植物除草剂耐受性的测试结果。

与GmCAB调控序列的结果(表4)相反，携带来自其他三个大豆内源基因的候选调控序列的另外的构建体pDAB116628(Glyma07g01730)、pDAB116630(Glyma08g21410)、pDAB116631(Glyma10g39740)在用2,4-D除草剂处理后经受了严重损害(表4)。因此，在此实验中，这些另外的大豆候选调控序列对于提供对2,4-D的所需耐受性是不可接受的。因此，GmCAB对于表达转基因的效果令人惊讶地好，尤其是与其他内源大豆启动子候选物相比，后者对转基因表达不能很好地起作用。

实例10

农杆菌属介导的拟南芥转化和转基因事件的分子分析

将拟南芥生态型哥伦比亚用于转化。通过花序浸渍法(Clough等人,(1998),PlantJ[植物杂志],16,735-743)，使用标准的拟南芥转化程序产生转基因种子。将T₁种子播种在选择托盘(10.5"x21"x1"，T.O.塑料公司(T.O.Plastics Inc.)，明尼苏达州克利尔沃特)上。为此，使用改良的空气驱动的喷雾设备将200mg的冷分层种子(播种前48个小时，0.1％琼脂+385mg/L Liberty)分配在选择托盘上，以使每个选择托盘分配10ml的种子悬浮液。将托盘用湿度圆顶覆盖，用种子标识符标记，并且置于在每个浅箱下具有单独的浇水托盘的Conviron中。播种后大约5天，除去加湿圆顶。选择托盘的第一次浇水是在播种后大约10-14天使用荷格伦特(Hoagland)的肥料进行地下灌溉。除了用除草剂分层外，在播种后7天和9天还将植物用Liberty的0.2％溶液(20μl/10mL蒸馏H₂O)喷洒。将耐受Liberty的T₁植物从选择托盘移植到2英寸的盆中，并且在取样进行分子分析之前允许生长7-10天。基于分子分析的结果，保留了具有单个转基因拷贝的植物的子集用于进一步分析。

使用大约0.5平方厘米的拟南芥叶(从每株植物中夹断)从叶中提取DNA。在96孔DNA提取板(Qiagen^TM，#19560)中收集样品。将200ul的提取缓冲液添加到每个孔中，并且使用Kleco^TM组织粉碎机(最大设置3分钟)将组织用3mm的不锈钢珠破坏。组织浸软后，使用BioSprint 96DNA Plant Kit^TM(凯杰公司，#941558)分离DNA。

对于qPCR，使用被设计为检测pat和aad12基因的水解探针测定转基因拷贝数(表5)。将拟南芥内源基因AtTafII15用于DNA模板浓度的归一化(表5)。如下进行qPCR：10μl的探针预混合物(罗氏应用科学公司，#04707494001)，其中每种引物的终浓度是0.4μM，并且每种探针的终浓度是0.2μM。使用95℃持续10min，然后40个扩增循环(95℃持续1min，60℃持续40sec和72℃持续1sec)以及40℃持续1sec进行PCR循环。所有qPCR测定均以双路复用形式运行，其中pat或aad12测定与内源基因AtTafII-15的测定配对。基于ΔΔCt方法，使用先进的相对定量算法(

软件版本1.5)，Cp得分(荧光信号与背景阈值相交的点)用于进行实时PCR数据分析。将所有样品相对于已知的半合子植物校准以获得转基因拷贝数。

表5.用于拟南芥转基因植物的基因分型和合子型分析的引物和探针

通过qPCR筛选了多达100个Liberty耐受单拷贝T₁事件，以鉴定单拷贝转基因事件(表6)。表6中所示的单拷贝转基因事件用于T₁转基因植物中转基因表达的进一步分析。

表6.拟南芥T₁转基因的拷贝数分析结果

实例11

在T₁拟南芥植物中评价可操作地连接到叶绿素结合Ab调控序列的基因

为了评价由GmCAB启动子、5'UTR和终止子片段驱动的RFP/AAD12报告物的表达，鉴定了单拷贝转基因事件并且使用Typhoon仪器测定了RFP荧光。

来自拟南芥的所有样品均在3个通道上进行扫描：叶绿素(488nm蓝色激光，670nmBP30，580nm分裂)，GFP(488nm蓝色激光，520nm BP40，580nm分裂)和RFP(532nm绿色激光，580nm BP30)。叶的PMT设置是500/500/500。通过从测试处理值中减去未处理和空载体对照的计算平均值来进行背景调整。将每片叶的值取平均值以产生平均荧光值。

为了分析莲座叶中的荧光，从每株植物中收获单拷贝转基因事件的完全展开的叶，并且从近轴(顶)侧进行扫描。将“轮廓绘制”功能用于勾勒叶的形状，并且通过将信号量除以叶表面积来确定归一化的荧光。

T₁拟南芥植物的测试结果示于表7。RFP荧光分析揭示到，相对于在野生型对照(Wt)中检测到的背景荧光，GmCAB(pDAB116644)支持高水平的RFP荧光。相比之下，来自大豆的其他三个候选调控序列(包含在pDAB116643、pDAB116645和pDAB115546构建体中)产生低的与Wt对照相似的RFP荧光。来自pDAB116643、pDAB116645和pDAB115546的低RFP荧光与来自GFP转基因的可比较的荧光相反，后者在所有测试的构建体中均显著高于背景。此结果清楚地显示，从Glyma08g08770基因分离的GmCAB(SEQ ID NO:11)很好地用于驱动转基因拟南芥中的转基因表达。同时，来自其他三个基因(Glyma07g01730、Glyma08g21410和Glyma10g39740)的调控序列不会产生可接受的转基因表达水平。

表7.在转基因T₁拟南芥植物中RFP/AAD12报告物表达的表达测试结果

实例12

可操作地连接到叶绿素结合Ab调控序列的基因在T₂拟南芥转基因植物中的表达

pDAB116644构建体在T₁拟南芥中表现出高RFP/AAD12荧光(实例11)。因此，改进此构建体用于在T₂拟南芥植物进行表征。在T₂中未测试具有低至无可检测表达的构建体(pDAB116643、pDAB116645、pDAB11646)。选择pDAB116644的七个表达高至中RFP/AAD12的转基因事件进行T₂测试，并且对于每个事件，均使56株植物生长。如实例10中所述，对T₂植物进行分子基因分型。基于分子分析，保留了所有纯合子和相当数目的半合子植物用于转基因表达分析和除草剂耐受性测试(参见实例13)。

如实例10中所述，收集完全展开的拟南芥莲座叶并且扫描RFP荧光，并且结果示于表8。结果揭示到，相对于非转基因同科(在表8中显示为“空”)，来自所有七个转基因事件的半合子(Hemi)和纯合子(Homo)转基因植物表现出高RFP荧光。如所预期的，在纯合子植物(两个转基因拷贝)中转基因拷贝数的增加导致相对于平均半合子植物(一个转基因拷贝)具有更高的平均RFP荧光水平。这些结果清楚地说明，pDAB116644中的GmCAB支持可遗传的拷贝数依赖性的转基因表达。

表8.由RFP/AAD12报告物在转基因T₂拟南芥植物中的表达详细说明的RFP荧光的pDAB116644表达的测试结果

实例13

通过由GmCAB调控序列驱动的RFP/AAD12报告物在于莲座期和抽苔期用2,4-D除草剂喷洒的拟南芥T₂植物中的表达来详细说明除草剂耐受性

为了测试2,4-D耐受性，用四种浓度的2,4-D二甲胺盐(DMA)(280、560、1120、2240gae/ha)喷洒拟南芥T₂植物。将Weedar 64的商业配制品(456g ae/L 2,4-二甲胺，拜耳作物科学公司(Bayer CropScience))用于喷洒施用。这些浓度分别对应于控制非转化拟南芥所需的2,4-D施用的1X、2X、3X和4X水平。使用固定式曼德尔履带喷雾器(曼德尔科技有限公司(Mandel Scientific Company Ltd.))在莲座期和抽苔期完成喷洒。将曼德尔履带喷雾器校准以用扇形尖喷嘴(梯杰特公司(TeeJet)，8002E)递送187L/ha。

RFP/AAD12融合报告基因允许通过RFP荧光表征转基因表达，以及经由在RFP/AAD12融合报告物内功能性AAD12肽的存在来表征对2,4-D的除草剂耐受性。在发育的莲座期和抽苔期，将pDAB116644植物用2,4-D除草剂喷洒。将基因分型非转基因“空”植物用作2,4-D施用引起的损害的对照。作为此实验的阳性对照，我们使用了携带由拟南芥泛素10(AtUbi10)启动子和农杆菌属Orf23终止子(AtuOrf23)驱动的AAD12的pDAB4468转基因植物，描述于Wright等人,(2010),Proc Natl Acad Sci U S A[美国科学院院报],107,20240-20245。在施用后14天(DAA)对植物损害进行视觉评估，并且使用0％至100％的视觉损害百分比分级量表进行记录；其中0％损害相当于未经处理的对照，而100％损害是完全损害。

在莲座期对2,4-D耐受性的数据分析(表9，图5A)证明，pDAB116644的所有七个测试的转基因事件均对较低(280和560g ae/ha)和较高(1120和2240g ae/ha)的2,4-D施用率耐受。此结果显示，GmCAB(SEQ ID NO:11)以足以实现强大的2,4-D耐受性的水平驱动RFP/AAD12融合物的表达。如所预期的，对于非转基因(空)对照观察到100％的损害(表9，图5C)。pDAB116644事件的耐受性与阳性pDAB4468对照的五个事件中的四个相似(表9，图5B)。令人惊奇地，五分之一的pDAB4468事件(4468[13]-279)易受2,4-D的影响(表9)，这表明了在此事件中自发转基因沉默的可能性。因此，关于2,4-D耐受性，pDAB116644的七个转基因事件的表现与对照pDAB4468构建体的五个事件相似或更好。

表9.在14DAA在莲座期喷洒的T₂拟南芥的2,4-D损伤(％)的总结

¹对于一些事件，合并具有纯合子和半合子合子型的植物用于此测试，因此在这种情况下，结果没有由合子型分开。

类似于在莲座期的结果，在pDAB116644中，当RFP/AAD12表达受GmCAB的控制时，在抽苔期对pDAB116644植物的分析揭示了强大的2,4-D耐受性(表10，图6A)。对于此构建体，在高(2240g ae/ha)2,4-D剂量喷洒后未观察到花或蒴果的败育(未显示)，这表明对生殖组织的发育没有影响。对照pDAB4468构建体的分析展示了对所用事件之一的强大的耐受性(4468[13]-295，表10，图6B)，而对于第二pDAB4468事件观察到降低的耐受性(4468[13]-279，表10)。后pDAB4468事件降低的2,4-D耐受性与此事件在莲座期的不良表现一致，因此表明了转基因表达的丧失，并且因此表明了在此事件中较差的2,4-D耐受性(表9)。如所预期的，非转基因(空)植物在抽苔期对2,4-D施用高度敏感(表10，图6C)。因此，这些结果证明，在pDAB116644中的GmCAB(SEQ ID NO:11)驱动了强大的2,4-D耐受性，其等于或优于对照pDAB4468构建体驱动的耐受性，即使在后期发育期喷洒植物时也是如此。

表10.在14DAA在抽苔期喷洒的T₂拟南芥的2,4-D损伤(％)的总结

¹对于此构建体，将来自事件116644[2]-015.Sx001、116644[2]-048.Sx001、116644[2]-068.Sx001、116644[2]-071.Sx001的转基因植物合并用于2,4-D喷洒施用。

²对于此构建体，将来自事件116644[2]-015、116644[2]-068和116644[2]-071的空植物合并用于2,4-D喷洒施用。

³对于此构建体，将来自事件4468[13]-279和4468[13]-295的空植物合并用于2,4-D喷洒施用。

实例14

棉花转化

通过利用本领域技术人员已知的方法，例如与先前在美国专利7,838,733的实例14或PCT国际专利公开号WO 2007/053482的实例12(通过引用并入本文)中描述的基本上相同的技术，用启动子(具有或不具有叶绿体转运肽)转化棉花以驱动基因表达。

实例15

农杆菌属介导的卡诺拉(甘蓝型油菜(Brassica napus))下胚轴转化

农杆菌属制备。将含有二元质粒的农杆菌属菌株在含有链霉素(100mg/ml)和壮观霉素(50mg/mL)的YEP培养基(Bacto Peptone^TM20.0gm/L和酵母提取物10.0gm/L)板上划线，并且在28℃下孵育2天。使用无菌接种环从2天的划线板上刮下含有二元质粒的繁殖的农杆菌属菌株。然后将刮下的含有二元质粒的农杆菌属菌株接种到一个或多个无菌的500mL带挡板烧瓶中的含链霉素(100mg/ml)和壮观霉素(50mg/ml)的150mL改良YEP液体中，并且在28℃下在200rpm下振荡。在转化卡诺拉下胚轴之前，将培养物离心并且重悬于M培养基(LS盐、3％葡萄糖、修饰的B5维生素、1μM激动素、1μM 2,4-D，pH 5.8)中，并且稀释至适当的密度(50Klett单位，如使用分光光度计测量的)。

卡诺拉转化

种子萌发：将卡诺拉种子(品种NEXERA 710^TM)在10％Clorox^TM中进行10分钟表面灭菌，并且用无菌蒸馏水冲洗三次(在此过程中，种子包含在不锈钢滤网中)。将种子种植在含有1/2MS卡诺拉培养基(1/2MS、2％蔗糖、0.8％琼脂)的Phytatrays^TM(25粒种子/Phytatray^TM)中以萌发并且置于Percival^TM生长室中，其中将生长方案设定为25℃，光照16小时和黑暗8小时的光周期，持续5天萌发。

预处理：在第5天，将长度为约3mm的下胚轴节段以无菌的方式切除，弃去剩余的根和芽部分(在切除过程中，通过将下胚轴节段浸入10mL的无菌milliQ^TM水中来防止下胚轴节段干燥)。将下胚轴节段水平置于愈伤组织诱导培养基MSK1D1(MS、1mg/L激动素、1mg/L 2,4-D、3.0％蔗糖、0.7％植物琼脂)上的无菌滤纸上，在Percival^TM生长室中预处理3天，其中将生长方案设置为22℃-23℃以及光照16小时、黑暗8小时的光周期。

与农杆菌属共培养：在农杆菌属共培养的前一天，将含有适当抗生素的YEP培养基的烧瓶用含有二元质粒的农杆菌属菌株接种。将下胚轴节段从滤纸愈伤组织诱导培养基MSK1D1转移到含有10mL的液体M培养基的空的100x 25mm Petri^TM皿中以防止下胚轴节段干燥。在此阶段使用刮铲铲出节段并将节段转移到新的培养基中。用移液管除去液体M培养基，并且将40mL的农杆菌属悬浮液添加到Petri^TM皿中(500个节段用40mL的农杆菌属溶液)。将下胚轴节段通过Petri^TM皿的周期性涡旋处理30分钟，使得下胚轴节段浸没在农杆菌属溶液中。在处理期结束时，将农杆菌属溶液用移液器吸取到废烧杯中；高压灭菌并且弃去(彻底除去农杆菌属溶液以防止农杆菌属过度生长)。用镊子将经处理的下胚轴转移回含有用滤纸覆盖的MSK1D1培养基的原来的板中(注意确保节段不会干燥)。在降低的光强度下(通过用铝箔覆盖板)，将经转化的下胚轴节段和未经转化的对照下胚轴节段返回到Percival^TM生长室中，并且将经处理的下胚轴节段与农杆菌属共培养3天。

在选择培养基上诱导愈伤组织：在共培养3天后，用镊子将下胚轴节段分别转移到愈伤组织诱导培养基MSK1D1H1(MS、1mg/L激动素、1mg/L2,4-D、0.5gm/L MES、5mg/L AgNO₃、300mg/L Timentin^TM、200mg/L羧苄青霉素、1mg/L Herbiace^TM、3％蔗糖、0.7％植物琼脂)上，其中将生长方案设定为22℃-26℃。将下胚轴节段锚定在培养基上，但是没有深深地嵌入培养基中。

选择和芽再生：在愈伤组织诱导培养基上7天后，将形成愈伤组织的下胚轴节段转移到选择芽再生培养基1MSB3Z1H1(MS、3mg/L BAP、1mg/L玉米素、0.5gm/L MES、5mg/LAgNO₃、300mg/L Timentin^TM、200mg/L羧苄青霉素、1mg/L Herbiace^TM、3％蔗糖、0.7％植物琼脂)中。14天后，将发育成芽的下胚轴节段转移到增加选择的再生培养基2MSB3Z1H3(MS、3mg/L BAP、1mg/L玉米素、0.5gm/L MES、5mg/L AgNO₃、300mg/l Timentin^TM、200mg/L羧苄青霉素、3mg/L Herbiace^TM、3％蔗糖、0.7％植物琼脂)中，其中将生长方案设定为22℃-26℃。

芽伸长：14天后，将发育成芽的下胚轴节段从再生培养基2转移到芽伸长培养基MSMESH5(MS、300mg/L Timentin^TM、5mg/l Herbiace^TM、2％蔗糖、0.7％TC琼脂)中，其中将生长方案设定为22℃-26℃。从下胚轴节段中分离出已经伸长的芽，并且将其转移到MSMESH5中。14天后，将在芽伸长培养基上的第一轮培养中未伸长的剩余芽转移到新鲜的芽伸长培养基MSMESH5中。在此阶段，将不产生芽的所有剩余下胚轴节段弃去。

根诱导：在芽伸长培养基上培养14天后，在22℃-26℃下，将分离的芽转移到MSMEST培养基(MS、0.5g/L MES、300mg/L Timentin^TM、2％蔗糖、0.7％TC琼脂)中用于根诱导。将在第一次转移到MSMEST培养基中孵育后未产生根的任何芽转移到MSMEST培养基上进行第二轮或第三轮孵育，直到芽发育成根。

虽然本公开可能易于进行各种修改和替代形式，但是本文已经通过例示的方式详细描述了特定实施例。然而，应当理解，本公开并不旨在限于所公开的特定形式。而是，本公开将覆盖落入如由以下所附权利要求及其合法等同物所定义的本公开的范围内的所有修改、等同物和替代物。

本文引用的所有参考文献(包括出版物、专利和专利申请)均以与本公开的明确细节不矛盾的程度通过引用特此并入，并且并入程度如同每个参考文献是单独并且具体地指示通过引用并入并且在本文以其整体阐述一般。本文讨论的参考文献只是为了它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供。本文的任何内容不应解释为承认诸位发明人无权因在先发明而享有早于此类公开内容的权利。提供以下实例以说明某些特定特征和/或实施例。所述实例不应当解释为将本公开限制为示例的特定特征或实施例。

Claims

1.一种核酸表达盒，其包含可操作地连接到非叶绿素结合Ab转基因的启动子，其中所述启动子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6或者与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6具有95％序列同一性的序列。

2.如权利要求1所述的核酸表达盒，其中所述启动子由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6或者与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6具有95％序列同一性的序列组成。

3.如权利要求1所述的核酸表达盒，其还包含包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7或者与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有95％序列同一性的序列的5'非翻译区，其中所述5'非翻译区插入所述启动子序列和所述转基因之间，并且可操作地连接到所述启动子序列和所述转基因。

4.如权利要求3所述的核酸表达盒，其中所述启动子和5'非翻译区由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10组成。

5.如权利要求1所述的核酸表达盒，其还包含包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8或者与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8具有95％序列同一性的序列的3'非翻译区，其中所述3'非翻译区可操作地连接到所述转基因。

6.如权利要求5所述的核酸表达盒，其中所述3'非翻译区是包含SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:9或者与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9具有95％序列同一性的序列的终止子的一部分。

7.如权利要求1所述的核酸表达盒，其还包含编码可选择标记的序列。

8.如权利要求1所述的核酸表达盒，其中所述转基因编码可选择标记，干扰RNA，或赋予杀昆虫抗性、除草剂耐受性、氮利用效率、水利用效率或营养品质的基因产物。

9.如权利要求8所述的核酸表达盒，其中所述转基因赋予对选自由以下组成的组的除草剂的耐受性：草甘膦、草铵膦、麦草畏、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、苯氧基植物生长素、吡啶氧基植物生长素、芳氧苯氧丙酸酯、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)、原卟啉原氧化酶(PPO)、三嗪类、溴苯腈、咪唑啉酮、磺酰脲、乙酰羟酸合酶(AHAS)和乙酰乳酸合酶(ALS)。

10.一种核酸载体，其包含可操作地连接到(i)多接头序列、(ii)非叶绿素结合Ab转基因或(iii)(i)和(ii)的组合的启动子，其中所述启动子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6或者与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6具有95％序列同一性的序列。

11.如权利要求10所述的核酸载体，其还包含包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7或者与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有95％序列同一性的序列的5'非翻译区，其中所述5'非翻译区插入所述启动子序列和所述接头或所述转基因之间，并且可操作地连接到所述启动子序列和所述接头或所述转基因。

12.如权利要求10所述的核酸载体，其还包含包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8或者与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8具有95％序列同一性的序列的3'非翻译区，其中所述3'非翻译区可操作地连接到所述接头或所述转基因。

13.如权利要求10所述的核酸载体，其中所述载体包含SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11具有95％序列同一性的序列。

14.一种细胞，其包含如权利要求1所述的核酸表达盒。

15.如权利要求14所述的细胞，其中所述细胞是根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)细菌细胞。

16.一种植物或植物部分，其包含如权利要求14所述的细胞。

17.如权利要求16所述的植物，其中所述植物选自由以下组成的组：拟南芥(Arabidopsis)、烟草、番茄、玉蜀黍、小麦、水稻、高粱、燕麦、黑麦、草坪草、香蕉、甘蔗、大豆、棉花、马铃薯、向日葵和卡诺拉。

18.如权利要求17所述的植物，其中所述植物是大豆(Glycine max)。

19.如权利要求14所述的细胞，其还包含包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7或者与SEQID NO:2或SEQ ID NO:7具有95％序列同一性的序列的5'非翻译区，其中所述5'非翻译区插入所述启动子序列和所述接头或所述转基因之间，并且可操作地连接到所述启动子序列和所述接头或所述转基因。

20.如权利要求14所述的细胞，其还包含包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8或者与SEQID NO:3或SEQ ID NO:8具有95％序列同一性的序列的3'非翻译区，其中所述3'非翻译区可操作地连接到所述接头或所述转基因。

21.一种用于在植物中表达转基因的方法，其包括使包含如权利要求1所述的基因表达盒的植物生长。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述基因表达盒还包含含有SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:7或者与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有95％序列同一性的序列的5'非翻译区，其中所述5'非翻译区插入所述启动子序列和所述接头或所述转基因之间，并且可操作地连接到所述启动子序列和所述接头或所述转基因。

23.如权利要求21所述的方法，其中所述基因表达盒还包含含有SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:8或者与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8具有95％序列同一性的序列的3'非翻译区，其中所述3'非翻译区可操作地连接到所述接头或所述转基因。

24.一种用于在植物中表达转基因的方法，其包括将植物用如权利要求1所述的基因表达盒转化。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述基因表达盒还包含含有SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:7或者与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有95％序列同一性的序列的5'非翻译区，其中所述5'非翻译区插入所述启动子序列和所述接头或所述转基因之间，并且可操作地连接到所述启动子序列和所述接头或所述转基因。

26.如权利要求24所述的方法，其中所述基因表达盒还包含含有SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:8或者与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8具有95％序列同一性的序列的3'非翻译区，其中所述3'非翻译区可操作地连接到所述接头或所述转基因。