BR112019026301A2

BR112019026301A2 - plantas terrestres geneticamente modificadas que expressam uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a ccp1 de planta

Info

Publication number: BR112019026301A2
Application number: BR112019026301-2A
Authority: BR
Inventors: Frank Anthony Skraly; Oliver P. Peoples; Kristi D. Snell; Meghna Malik
Original assignee: Yield10 Bioscience, Inc.
Priority date: 2017-06-16
Filing date: 2018-06-15
Publication date: 2020-07-14
Also published as: US20210147863A1; EP3638015A4; US11834666B2; CA3066220A1; EP3638015A1; AU2018283286A1; AU2018283286B2; WO2018232232A1

Abstract

Planta terrestre geneticamente modificada que expressa uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é fornecida. A planta terrestre geneticamente modificada compreende um gene modificado para a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta. A proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é uma ortóloga de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1 derivada de uma planta terrestre de origem. A proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta está localizada na mitocôndria da planta terrestre geneticamente modificada baseada em um sinal de direcionamento mitocondrial intrínseco à proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta. O gene modificado compreende (i) um promotor e (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta. O promotor não é cognato com respeito à sequência de ácido nucleico. O gene modificado é configurado de modo que transcrição do ácido nucleico seja iniciada do promotor e resulte em expressão da proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta.

Description

“PLANTAS TERRESTRES GENETICAMENTE MODIFICADAS QUE

EXPRESSAM UMA PROTEÍNA TRANSPORTADORA MITOCONDRIAL SEMELHANTE A CCP1 DE PLANTA”

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se, em geral, a plantas terrestres geneticamente modificadas que expressam uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta, e, mais particularmente, a essas plantas terrestres geneticamente modificadas que compreendem um gene modificado para a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] O mundo enfrentará um desafio enorme nos próximos 35 anos para satisfazer demandas aumentadas pela produção de alimentos para alimentar uma população global crescente, que se espera alcançar 9 bilhões até o ano 2050. O rendimento de alimentos precisará ser aumentado em até 70% tendo em vista a população crescente. Uma demanda aumentada por uma dieta aperfeiçoada, concomitantemente a mudanças no uso de terras para novos espaços de convívio e infraestrutura, usos alternativos para colheitas e padrões climáticos e padrões climáticos em mudança somarão para o desafio.

[0003] Colheitas agrícolas principais incluem colheitas de alimentos, tais como milho, trigo, cereais, cevada, soja, painço, sorgo, vagens, feijão, tomate, milho, arroz, cassava, beterrabas, e batatas, plantas de colheita de forragem, como feno, alfalfa, e milho de silagem, e colheitas de oleaginosas, como camelina, espécie Brassica (por exemplo B, napus (canola), B. rapa, B. juncea, e B. carinata), crambe, soja, girassol, açafrão, palmeira oleaginosa, linho, e algodão, dentre outros. A produtividade dessas colheitas, e outras, é limitada por vários fatores, incluindo, por exemplo, ineficiência relativa de conversão fotoquímica de energia luminosa para carbono fixo durante fotossíntese, bem como perda de carbono fixo por fotorrespiração e/ou outras trajetórias metabólicas essenciais tendo enzimas que catalisam reações de descarboxilação. A produtividade de colheita também é limitada pela disponibilidade de água. Alcançar mudanças graduais em rendimento de colheita requer novas abordagens.

[0004] Uma abordagem potencial envolve engenharia metabólica de plantas de colheita para expressar mecanismos de concentração de carbono de cianobactérias ou algas eucarióticas. As cianobactérias e algas eucarióticas evoluíram mecanismos de concentração de carbono para aumentar as concentrações intracelulares de carbono inorgânico dissolvido, particularmente para aumentar as concentrações de CO?» no sítio ativo de ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase — (também —. denominado RUuBisCO) Mostrou-se recentemente por Schnell et al., WO 2015/103074 que plantas Camelina se transformaram para expressar que CCP1 da espécie de alga Chlamydomonas reinhardtii reduziu as taxas de respiração, aumentou as taxas de assimilação de CO,» e rendimento maior do que plantas de controle que não expressam o gene CCP1. Mais recentemente, Atkinson et al., (2015) Plant Biotechnol. J., doi:

10.1111/pbi.12497, revela que CCP1 e seu homólogo CCP2, que foram previamente caracterizados como transportadores Ci, previamente reportados como estando o envelope de cloroplasto, localizados em mitocôndrias em Chlamydomonas reinhardtii, conforme naturalmente expressado, e tabaco, quando expressado de modo heterólogo, sugerindo que o modelo para o mecanismo de concentração de carbono de algas eucarióticas não se expandiu para incluir um papel para as mitocôndrias. Atkinson et al. (2015) revelou que a expressão de transportadores individuais Ci (bicarbonato) não acentuou o crescimento da planta Arabidopsis.

[0005] No Pedido de Patente co-pendente PCT/US2017/016421, por Yield10 Bioscience, uma série de ortólogos de CCP1 de espécies de algas que compartilham domínios de sequência de proteína comum incluindo domínios de membrana mitocondrial e domínios de proteína transportadora foram mostrados para aumentar o rendimento de semente e reduzir o tamanho de semente quando expresso constitutivamente em plantas Camelina. Schnell et al., WO 2015/103074, também reportou uma redução no tamanho de semente em linhagens de Camelina com rendimento maior expressando CCP1.

[0006] No Pedido de Patente Provisório nº U.S. 62/462.074, por Yield10 Bioscience, CCP1 e seus ortólogos de outras algas eucarióticas são referidos como proteínas transportadoras mitocondriais. Os inventores testaram o impacto de expressar CCP1 ou seus ortólogos de alga usando promotores específicos de sementes com o resultado inesperado que tento o rendimento de semente como o tamanho de semente aumentaram. Esses inventores também reconheceram os benefícios de combinar a expressão constitutiva e a expressão específica de semente de CCP1 ou qualquer de seus ortólogos na mesma planta.

[0007] Infelizmente, “plantas transgênicas,” “colheitas de GMO,” e/ou “traços de biotecnologia" não são amplamente aceitos em algumas regiões e países e são submetidas a processos de aprovação regulatória que são bastante demorados e proibitivamente caros. A estrutura regulatória atual para plantas transgênicas resulta em custos significativos (-$136 milhões por traço; MecDougall, P. 2011, “The cost and time involved in the discovery, development, and authorization of a new plant biotechnology derived trait” Crop Life International) e linhas de tempo de desenvolvimento de produto prolongadas que limitam o número de tecnologias que são colocadas no mercado. Isso apresenta um investimento privado seriamente prejudicado e a adoção de inovação nesse setor crucial. Avanços recentes em tecnologias de edição de genoma proporcionam uma oportunidade de remover precisamente genes ou editar sequências de controle para aperfeiçoar significativamente a produtividade de plantas (Belhaj, K. 2013, Plant Methods, 9, 39; Khandagale & Nadal, 2016, Plant Biotechnol Rep, 10, 327) e abrir o caminho para produzir plantas que possam se beneficiar de uma trajetória regulatória expedida, ou situação possivelmente não regularizada.

[0008] Dados os custos e desafios associados à obtenção da aprovação regulatória e aceitação social de colheitas transgênicas, há uma necessidade de identificar, quando possível, proteínas transportadoras mitocondriais de plantas, idealmente derivadas a partir de colheitas ou outras plantas terrestres, que podem ser modificadas geneticamente para permitir que sistemas de captura de carbono melhorados aperfeiçoem o rendimento de colheita e/ou o rendimento de sementes, particularmente sem depender de genes, sequências de controle, ou proteínas derivadas de plantas não terrestres à extensão possível.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] De acordo com um aspecto da presente invenção, revela-se uma planta terrestre geneticamente modificada que expressa uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta. A planta terrestre geneticamente modificada compreende um gene modificado para a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta. A proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é uma ortólogo de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1 derivada de uma planta terrestre de origem. A proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta fica localizada nas mitocôndrias da planta terrestre geneticamente modificada com base em um sinal de direcionamento mitocondrial intrínseco à proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta. Os genes modificados compreendem (i) um promotor e (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta. O promotor é um não cognato em relação à sequência de ácido nucleico. O gene modificado é configurado de modo que a transcrição da sequência de ácido nucleico seja iniciada a partir do promotor e resulte na expressão da proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0010] As Figuras 1A-|l mostram gráficos gerados por Phobius de domínios transmembranares preditos de (A) Chlamydomonas reinhardtil CCP1 (SEQ ID NO: 1), proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 de alga Nível 1 de (B) Gonium pectorale (KXZ50472.1) (SEQ ID NO: 2), (C) Gonium pectorale (KXZ50486.1) (SEQ ID NO: 3), (D) Volvox carteri f. nagariensis (SEQ ID NO: 4), e (E) Ettlia oleocabundans (SEQ ID NO: 5), e proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 Nível 1 de planta (F) Erigeron breviscapus (SEQ ID NO: 6), (G) Zea nicaraguensis (SEQ ID NO: 7), (H) Poa pratensis (SEQ ID NO: 8), e (I) Cosmos bipinnatus (SEQ ID NO: 9). Os gráficos Phobius mostram um domínio transmembranar predito (sombreamento cinza), domínio citoplásmico (linha com X), domínio não citoplásmico (linha com círculo preenchido), e sequência de peptídeo de sinal (linha com triângulo). O eixo geométrico Y corresponde à probabilidade de marcação posterior, graficamente representado de O a 1 em incrementos de 0,2. O eixo geométrico X corresponde ao número de resíduo de aminoácido de proteína de transporte mitocondrial tipo CCP1 ou CCP1 correspondente, graficamente representado de O a 300 em incrementos de 50 (A-G e |) ou de O a 140 em incrementos de 20 (H).

[0011] As Figuras 2A-C mostram gráficos gerados por Phobius de domínios transmembranares preditos de (A) Chlamydomonas reinhardtil CCP1

(SEQ ID NO: 1) e proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 fúngicas Nível 2 de (B) Talaromyces stipitatus (SEQ ID NO: 10) e (C) Saitoella complicata (SEQ ID NO: 11). Os gráficos Phobius mostram um domínio transmembranar predito (sombreamento cinza), domínio citoplásmico (linha com X), domínio não citoplásmico (linha com círculo preenchido), e sequência de peptídeo de sinal (linha com triângulo). O eixo geométrico Y corresponde à probabilidade de marcação posterior, graficamente representado de 0 a 1 em incrementos de 0.2. O eixo geométrico X corresponde ao número de resíduo de aminoácido de proteína de transporte mitocondrial tipo CCP1 ou CCP1 correspondente, graficamente representado de O a 350 em incrementos de 50 (A) ou de O a 300 em incrementos de 50 (B e C).

[0012] As Figuras 3A-G mostram gráficos gerados por Phobius de domínios transmembranares preditos de (A) Chlamydomonas reinhardtil CCP1 (SEQ ID NO: 1) e o melhor BLAST corresponde a CCP1 de (B) Glycine max (KRH74426.1) (SEQ ID NO: 14), (C) Zea mays (NP. 001141073.1) (SEQ ID NO: 16), (D) Oryza sativa, grupo Japônica (XP 015614184.1) (SEQ ID NO: 15), (E) Triticum aestivum (CDM80555.1) (SEQ ID NO: 12), (F) Sorgo bicolor (XP 002464891.1) (SEQ I|D NO: 17) e (G) Solanum tuberosum (XP 006361187.1) (SEQ ID NO: 13). Os gráficos Phobius mostram um domínio transmembranar predito (sombreamento cinza), domínio citoplásmico (linha com X), domínio não citoplásmico (linha com círculo preenchido), e sequência de peptídeo de sinal (linha com triângulo). O eixo geométrico Y corresponde à probabilidade de marcação posterior, graficamente representado de 0 a 1 em incrementos de 0.2. O eixo geométrico X corresponde ao número de resíduo de aminoácido de proteína de transporte mitocondrial tipo CCP1 ou CCP1 correspondente, graficamente representado de O a 300 em incrementos de 50 (A, E G) ou de O a 250 em incrementos de 50 (B-D e F).

[0013] As Figuras 4A-B mostram um alinhamento de sequência múltipla de Chlamydomonas reinhardtii CCP1 e sete proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 de planta ou de alga de acordo com CLUSTAL O(1.2.4). As sequências são da seguinte forma: Chlamydomonas reinharadtii (SEQ ID NO: 1); Gonium pectorale (KXZ50472.1) (SEQ ID NO: 2); Gonium pectorale (KXZ50486.1) (SEQ ID NO: 3); Volvox carteri f. nagariensis (SEQ ID NO: 4); Ettlia oleocabundans (SEQ ID NO: 5); Erigeron breviscapus (SEQ ID NO:

6); Zea nicaraguensis (SEQ ID NO: 7); e Cosmos bipinnatus (SEQ ID NO: 9). As sete proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 de planta e de alga são ortólogos de CCP1 Nível 1 conforme descrito no texto.

[0014] As Figuras 5A-B mostram um alinhamento de sequência múltipla de Chlamydomonas reinhardtiil CCP1 e seis ortólogos mais próximos a CCP1 de colheitas principais de acordo com CLUSTAL O(1.2.4). As sequências são da seguinte forma. Chlamydomonas reinhardtii (SEQ ID NO: 1); Triticum aestivum (SEQ ID NO: 12); Solanum tuberosum (SEQ ID NO: 13); Glycine max (SEQ ID NO: 14); Oryza sativa (SEQ ID NO: 15); Zea mays (SEQ ID NO: 16) e Sorgo bicolor (SEQ ID NO: 17).

[0015] A Figura 6 mostra um mapa para pYTEN-5 (SEQ ID NO: 49), um vetor de transformação projetado para transformação mediada por Agrobacterium de monocotiledôneas, incluindo milho.

[0016] A Figura 7 mostra um mapa para pYTEN-6 (SEQ ID NO: 50), um cassete de DNA para transformação biolítica (também conhecido como bombardeamento de micropartícula) de monocotiledôneas tal como milho.

[0017] A Figura 8 mostra um mapa para pYTEN-7 (SEQ ID NO: 51), outro cassete de DNA para transformação biolística de monocotiledôneas tal como milho.

[0018] A Figura 9 mostra um mapa para pYTEN-8 (SEQ ID NO: 52), um cassete de DNA para transformação biolística de uma dicotiledônea, canola.

[0019] A Figura 10 mostra um mapa para pY TEN-9 (SEQ ID NO: 53), um cassete de DNA para transformação biolística de uma dicotiledônea, soja.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0020] Revela-se uma planta terrestre geneticamente modificada que expressa uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta. A planta terrestre geneticamente modificada compreende um gene modificado para a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta. A proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é um ortólogo de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1 derivado de uma planta terrestre de origem. A proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta fica localizada nas mitocôndrias da planta terrestre geneticamente modificada com base em um sinal de direcionamento mitocondrial intrínseco à proteína transportadora mitocondrial semelhante a

CCP1 de planta. O gene modificado compreende (i) um promotor e (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta. O promotor é não cognato em relação à sequência de ácido nucleico. O gene modificado é configurado de modo que a transcrição da sequência de ácido nucleico seja iniciada a partir do promotor e resulte na expressão da proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta.

[0021] De modo surpreendente, determinou-se que determinadas plantas terrestres codificam ortólogos de CCP1 de alga Chlamydomonas reinhardti, denominadas no presente documento como proteínas transportadoras mitocondriaiso semelhante a CCP1 de planta. Isso foi surpreendente porque, dentre outras razões, nenhuma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta de plantas terrestres foi revelada em buscas BLAST padrão em identificar ortólogos de CCP1 em plantas terrestres, e, logo, tentativas iniciais para identificar proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 de planta por meios convencionais sugeriram que plantas terrestres podem não codificar essas proteínas. Ao acaso, as proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 de planta foram identificadas com base em análises de um banco de dados Transcriptome Shotgun Assembly, conforme discutido anteriormente.

[0022] Da mesma forma, surpreendentemente, as proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 de planta aparentam se agrupar em dois grupos distintos, denominado no presente documento como ortólogos de CCP1 Nível 1 e ortólogos de CCP1 Nível 2, com base nas similaridades de sequência de aminoácido prevista e estrutura em relação a CCP1. Os otólogos de CCP1 Nível 1 de plantas exibem uma identidade de sequência de cerca de 60% em relação a CCP1 de Chlamydomonas reinharatii, grupamento insuficiente com base no grau de sua similaridade de sequência, e foram identificados até o momento somente em quatro espécies vegetais, Zea nicaraguensis (também denominada teosinta), Erigeron breviscapus, Cosmos bipinnatus, e Poa pratensisó, sendo nenhuma dessas particularmente estritamente relacionada à filogenética. Os ortólogos de CCP1 Nível 1 de plantas exibem uma identidade de sequência de cerca de 30% em relação a CCP1 de Chlamydomonas reinharadtii, substancialmente menor que para Nível 1, também grupamento insuficiente com base no grau de similaridade de sequência, e aparentaria ser mais comum, tendo sido identificado até o momento em seis espécies de colheita principais, Zea mays (também denominada milho), Triticum aestivum, Solanum tuberosum, Glycine max, Oryza sativa e Sorgo bicolor. Isso foi surpreendente porque não houve qualquer razão aparente para se esperar por qualquer grupamento de proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 de planta, apenas grupamento em dois grupos distintos. Isso também foi surpreendente porque Zea nicaraguensis, novamente teosinta, é um progenitor selvagem de Zea mays, novamente milho, e, logo, os dois são estritamente relacionados à filogenética, ainda Zea nicaraguensis inclui um CCP1 Nível 1, enquanto Zea mays inclui um CCP1 Nível 2.

[0023] Ainda de modo surpreendente, determinou-se que ocorre um agrupamento adicional dentro dos ortólogos de CCP1 Nível 1 quando vários ortólogos CCP1 de alga forem incluídos, especificamente vários ortólogos de CCP1 de alga Nível 1, isto é, aqueles de Gonium pectorale (KXKZ50472.1), Gonium pectorale (KXZ50486.1), e Volvox carteri f. nagariensis, aqui denominados Nível 1A, exibem cerca de 80% de identidade de sequência em comparação a CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii, enquanto um ortólogo de CCP1 Nível 1 de alga, isto é, Ettlia oleocabundans, aqui denominado Nível 1B, exibe, de preferência, 60% de identidade de sequência e agrupamento com os ortólogos de CCP1 Nível de planta 1, também denominado como Nível 1B. Impressionantemente, os ortólogos de CCP1 Nível 1B de planta e de algas aparentam ser mais estritamente relacionados entre si do que aos outros ortólogos de CCP1 de planta e de alga. Isso sugere que a possiblidade intrigante que os ortólogos de CCP1 Nível 1B de planta podem ter resultado a partir da transferência de gene horizontal de Ettlia oleocabundans ou algas relacionadas. Isso também sugere que Zea nicaraguensis e a outra espécie vegetal que codifica ortólogos de CCP1 Nível 1B de planta pode servir como fontes de ortólogos de CCP1 que estão proximalmente derivado das plantas terrestres, ao invés de algas, reduzindo, assim, questões regulatórias e riscos associados à modificação genética de colheitas, enquanto ainda é capaz de proporcionar aumentos em rendimento de colheita comparáveis àqueles observados para ortólogos de CCP1 e CCP1 derivadas de algas.

[0024] Sem desejar se ater à nenhuma teoria, acredita-se que através de modificação genética de uma planta terrestre para compreender um gene modificado para uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta, com a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta sendo um ortólogo de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1 derivado de uma planta terrestre de origem, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta estando localizada nas mitocôndrias da planta terrestre geneticamente modificada com base em um sinal de direcionamento mitocondrial intrínseco à proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta, sendo que o gene modificado compreende um promotor e uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta, sendo que o promoter é não cognato em relação à sequência de ácido nucleico, e o gene modificado sendo configurado de modo que a transcrição da sequência de ácido nucleico seja iniciada a partir do promotor e resulta na expressão da proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta, resultará em um rendimento acentuado, com base, por exemplo, em uma taxa de assimilação de CO>2 aumentada e/ou uma taxa de transpiração reduzida da planta terrestre geneticamente modificada, em comparação a uma planta terrestre de referência que não compreende o gene modificado.

Acredita-se que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta acentuará o transporte de malato (também denominado MAL) e/ou oxaloacetato (também denominado OAA) a partir das mitocôndrias, ou nas mesmas, e/ou, de outro modo, alterar o metabolismo mitocondrial pelo transporte de bicarbonato e/ou outras moléculas pequenas, acentuando, assim, taxas de fixação de carbono aumentando-se a recuperação de CO,» a partir de fotorrespiração e respiração.

Alternativamente, o transporte aumentado de moléculas pequenas pode evitar o acúmulo de intermediários fotorrespiratórios que podem inibir a fotossíntese.

Ademais, acredita-se que modificar geneticamente a planta terrestre para expressar uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta que fica localizada nas mitocôndrias em particular, será possível empilhar a expressão da proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta com a expressão de outras proteínas em abordagens de deliberação e complementares para acentuar adicionalmente o rendimento.

Além disso, acredita-se que modificando-se a planta terrestre para expressar uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta de uma planta terrestre em particular, será possível gerar colheitas modificadas geneticamente que incluem somente genes, sequências de controle, e proteínas que sejam proximalmente derivadas de plantas terrestres, e, logo, são geralmente reconhecidas como seguras para consumo humano.

[0025] Conforme — notado, revela-se uma planta terrestre geneticamente modificada que expressa uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta. A planta terrestre é uma planta pertencente ao sub-reino vegetal Embryophyta, incluindo plantas superiores, também denominadas como plantas vasculares, e musgos, Marchantiophyta e Anthocerotophyta.

[0026] O termo “planta terrestre” inclui plantas maduras, sementes, brotos e mudas, e partes, material de propagação, tecido de órgão vegetal, protoplastos, calosidades e outras culturas, por exemplo, culturas celulares, derivadas a partir de plantas pertencentes ao sub-reino vegetal Embryophyta, e todas as outras espécies de grupos de células vegetais fornecendo unidades funcionais ou estruturais, também pertencentes ao sub-reino vegetal Embryophyta. O termo “plantas maduras” se refere a plantas em qualquer estágio de desenvolvimento depois da muda. O termo “mudas” se refere a plantas jovens imaturas em um estágio precoce de desenvolvimento.

[0027] As plantas terrestres abrangem todas as plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas anuais e perenes e incluem a título de exemplo, mas sem limitação, aquelas dos gêneros Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solarium, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorgo, Picea, Populus, Camelina, Beta, Solanum e Carthamus. As plantas terrestres preferenciais são aquelas das famílias vegetais a seguir: Amaranthaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Labiatae,

Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Saxiftagaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae, Sterculiaceae, Tetragoniaceae, Theaceae, Umbelliferae.

[0028] A planta terrestte pode ser uma planta terrestre monocotiledônea ou uma planta terrestre dicotiledônea. As plantas dicotiledôneas preferenciais são selecionadas em particular a partir de plantas de colheita dicotiledôneas tais como, por exemplo, Asteraceae como girassol, tagetes ou calêndula e outras; Compositae, especialmente o gênero Lactuca, muito particularmente a espécie sativa (alface) e outras; Cruciferae, particularmente o gênero Brassica, muito particularmente a espécie napus (colza oleaginosa), campestris (beterraba), oleracea cv Tastie (repolho), oleracea cv Snowball Y (couve-flor) e oleracea cv Emperor (brócolis) e outros repolhos; e o gênero Arabidopsis, muito particularmente a espécie thaliana, e agrião ou canola e outras; Cucurbitaceae como melão, moranga/abóbora ou abobrinha e outras; Leguminosae, particularmente o gênero Glycine, muito particularmente a espécie max (soja), soja, e alfalfa, ervilha, feijão ou amendoim e outras; Rubiaceae, de preferência a subclasse Lamiidae como, por exemplo, Coffea arabica ou Coffea liberica (arbusto de café) e outras; Solanaceae, particularmente o gênero Lycopersicon, muito particularmente a espécie esculentum (tomate), o gênero Solanum, muito particularmente a espécie tuberosum (batata) e melongena (berinjela) e o gênero Capsicum, muito particularmente o gênero annuum (pimenta) e tabaco ou páprica e outras; Sterculiaceae, de preferência a subclasse Dilleniidae como, por exemplo, Theobroma cacao (arbusto de cacau) e outras; Theaceae, de preferência, a subclasse Dilleniidae tal como, por exemplo, Camellia sinensis ou Thea sinensis (arbusto de chá) e outras; Umbelliferae, particularmente o gênero Daucus (muito particularmente a espécie carota (cenoura)) e Apium (muito particularmente a espécie graveolens dulce (aipo)) e outras; e linhaça, algodão, cânhamo, linho, pepino, espinafre, cenoura, beterraba e as várias espécies de árvore, nozes e videiras, em particular banana e kiwi. As plantas monocotiledôneas preferenciais incluem milho, arroz, trigo, cana-de-açúcar, sorgo, aveia e cevada.

[0029] As plantas oleaginosas são de interesse particular. Em plantas oleaginosas de interesse, o óleo é acumulado na semente e pode considerar mais de 10%, mais de 15%, mais de 18%, mais de 25%, mais de 35%, mais de

50%, em peso, do peso de semente seca. As colheitas de oleaginosas abrangem a título de exemplo: Borago officinalis (borragem); Camelina (linho falso); espécie Brassica como B. campestris, B. napus, B. rapa, B. carinata (mostarda, colza oleaginosa ou nabo silvestre); Cannabis sativa (cânhamo); Carthamus tinctorius (açafrão); Cocos nucifera (coco); Crambe abyssinica (crambe); Cuphea species (ácidos graxos de rendimento de espécie Cuphea de comprimento de cadeia média, em particular para aplicações industriais); Elaeis guinensis (palmeira oleaginosa Africana); Elaeis oleifera (palmeira oleaginosa Americana); Glycine max (soja); Gossypium hirsutum (algodão Americano); Gossypium barbadense (algodão Egípcio); Gossypium herbaceum (algodão Asiático); Helianthus annuus (girassol); Jatropha curcas (jatrofa); Linum usitatissimum (linhaça ou linho); Oenothera biennis (onagra); Olea europaea (azeitona); Oryza sativa (arroz); Ricinus communis (rícino); Sesamum indicum (gergelim); Thlaspi caerulescens (Thlaspi); Triticum species (trigo); Zea mays (milho), e várias espécies de nozes tais como, por exemplo, noz ou amêndoa.

[0030] As espécies Camelina, comumente conhecidas como linho falso, são nativas das regiões mediterrâneas da Europa e Ásia e parecem estar particularmente adaptadas a zonas climáticas semiáridas frias (estepes e pradarias). As espécies Camelina sativa foram historicamente cultivadas como uma colheita de oleaginosas para produzir óleo vegetal e ração animal. Além de ser útil como uma colheita de oleaginosa industrial, Camelina é um sistema de modelo bastante útil para desenvolver novas ferramentas e abordagens de engenharia genética para acentuar o rendimento de colheitas em geral e acentuar o rendimento de sementes e óleo de sementes em particular. Aprimoramentos de transgene demonstrados em Camelina podem, então, ser implantados em colheitas de oleaginosas principais incluindo espécie Brassica incluindo B. napus (canola), B. rapa, B. juncea, B. carinata, crambe, soja, girassol, açafrão, palmeira oleaginosa, linho e algodão.

[0031] Conforme ficará aparente, a planta terrestre pode ser uma planta de fotossíntese C3, isto é, uma planta na qual RuBisCO catalisa a caroboxilação de ribulose-1,5-bisfosfato pelo uso de CO, extraído diretamente da atmosfera, tal como por exemplo, trigo, aveia e cevada, dentre outros. À planta terrestre também pode ser uma planta C4, isto é, uma planta na qual RUuBisCO catalisa a carboxilação de ribulose-1,5-bisfosfato pelo uso de CO?

lançado através de malato ou aspartato a partir de células de mesófila para agrupar células de bainha, como, por exemplo, milho, painço, e sorgo, dentre outros.

[0032] De modo correspondente, em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta C3. Da mesma forma, em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta C4. Da mesma forma, em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta de colheita de alimento principal selecionada a partir do grupo que consiste em milho, trigo, aveia, cevada, soja, painço, sorgo, batata, vagens, feijão, tomate e arroz. Em alguns desses exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada é milho. Da mesma forma, em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta de colheita de forragem selecionada a partir do grupo que consiste em milho de silagem, feno e alfalfa. Em alguns desses exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada é milho de silagem. Da mesma forma, em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta de colheita de oleaginosa selecionada a partir do grupo que consiste em camelina, espécie Brassica (por exemplo, B. napus (canola), B. rapa, B. juncea, e B. carinata), crambe, soja, girassol, açafrão, palmeira oleaginosa, linho e algodão.

[0033] A planta terrestre compreende um gene modificado para a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta.

[0034] A proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é um ortólogo de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1 derivado a partir de uma planta terrestre de origem.

[0035] O termo “ortólogo” significa uma sequência de polinucleotídeo ou sequência de polipeptídeo possuindo um alto grau de homologia, isto é, a relação de sequência, a uma sequência em questão e sendo uma função equivalente da sequência em questão, em que a sequência que é ortóloga é de uma espécie que seja diferente daquela da sequência em questão. A homologia pode ser quantificada determinando-se o grau de identidade e/ou similaridade entre as sequências sendo comparadas.

[0036] Conforme o uso em questão, “homologia percentual” de duas sequências de polinucleotídeo ou de duas sequências de polipeptídeo é determinada usando o algoritmo de Karlin and Altschul (1990), Proc. Natl. Acad.

Sci., U.S.A. 87: 2264-2268. Esse algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403-410. Buscas de nucleotídeo BLAST são realizadas com o programa NBLAST, resultado=100, comprimento de palavra 12, para obter sequências de nucleotídeo homólogas a uma sequência de polinucleotídeo de referência. As buscas de proteína BLAST são realizadas com o programa XBLAST, resultado=50, comprimento de palavra=3, para obter sequências de aminoácido homólogas a uma sequência de polipeptídeo de referência. Para obter alinhamentos em lacuna para propósitos de comparação, Gapped BLAST é utilizado conforme descrito em Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Ao utilizar programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão são tipicamente usados.

[0037] No caso de sequências de polipeptídeo que sejam menos de 100% idênticas a uma sequência de referência, as posições não idênticas são preferencialmente, mas não necessariamente, substituições conservativas para a sequência de referência. As substituições conservativas tipicamente incluem substituições dentro dos grupos a seguir: glicina e alanina; valina, isoleucina, e leucina; ácido aspártico e ácido glutâmico; asparagina e glutamina; serina e treonina; lisina e arginina; e fenilalanina e tirosina.

[0038] Onde se diz que um peptídeo particular tem uma identidade percentual específica a um polipeptídeo de referência de um comprimento definido, a identidade percentual é relativa ao peptídeo de referência. Logo, um peptídeo que seja 50% idêntico a um polipeptídeo de referência que tenha 100 aminoácidos de comprimento pode ser um polipeptídeo de 50 aminoácidos que seja completamente idêntico a uma porção longa de 50 aminoácidos do polipeptídeo de referência. Esse também pode ser um polipeptídeo longo de 100 aminoácidos que seja 50% idêntico ao polipeptídeo de referência ao longo de seu comprimento inteiro. Muitos outros polipeptídeos irão satisfazer os mesmos critérios.

[0039] A título de referência, conforme discutido anteriormente CCP1 é uma proteína de transporte mitocondrial de Chlamydomonas reinhardtii. Ademais, CCP1 tem uma sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO:

1. De modo correspondente, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é uma sequência de polipeptídeo que possui um alto grau de relação de SEQuência a CCP1 de Chlamydomonas reinhardtil de SEQ ID NO: 1 e sendo um equivalente funcional do mesmo.

[0040] Conforme notado, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é um ortólogo de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1 derivado a partir de uma planta terrestre de origem.

[0041] A título de referência, Chlamydomonas reinhardtii é uma alga eucariótica. Em contrapartida a uma planta terrestre, uma alga eucariótica é uma planta aquática, variando de uma forma unicelular microscópica, por exemplo, uma alga de célula única, a uma forma multicelular macroscópica, por exemplo, uma alga marinha, que inclui clorofila a e, se multicelular, um talo não diferenciado em raízes, caule, e folhas, e que seja classificado como clorófita (também denominadas como algas verdes), rodófita (também denominadas como algas vermelhas), ou faeófita (também denominadas como algas marrons). Algas eucarióticas incluem, por exemplo, algas de célula única, incluindo a clorófita Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella sorokiniana, e Chlorella variabilis. Algas eucarióticas também incluem, por exemplo, algas marinhas, incluindo clorófita Ulva lactuca (também denominada como alface do mar) e Enteromorpha (Ulva) intenstinalis (também denominada como grama do mar), a rodófita Chondrus crispus (também denominada como musgo irlandês ou carragenina), Porphyra umbilicalis (também denominadas como nori), e Palmaria palmata (também denominada como dulse ou dillisk), e a faeófita Ascophyllum nodosum (também denominada como egg wrack), Laminaria digitata (também denominada como Kombu/Konbu), Laminaria saccharina (também denominada como kombu real ou doce), Himanthalia elongata (também denominada como espagueti do mar), e Undaria pinnatifida (também denominada como wakame). Algas eucarióticas também incluem, por exemplo, clorófitas adicionais como Gonium pectorale, Volvox carteri f. nagariensis, e Ettlia oleocabundans.

[0042] A planta terrestre de origem a partir da qual a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é derivada pode ser uma planta terrestre conforme descrito anteriormente, isto é, uma planta pertencente ao sub-reino vegetal Embryophyta.

[0043] Em alguns exemplos, a planta terrestre de origem é um tipo diferente de planta terrestre em relação à planta terrestre geneticamente modificada. De acordo com esses exemplos, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta pode ser heteróloga em relação à planta terrestre geneticamente modificada. Através disso, sabe-se que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta particular derivada a partir da planta terrestre de origem não é normalmente codificada, expressada, ou, de outro modo, presente em plantas terrestres do tipo a partir do qual a planta terrestre geneticamente modificada é derivada. Isso ocorre porque as plantas terrestres do tipo a partir do qual a planta terrestre geneticamente modificada é derivado não codifica normalmente, expressa, ou, de outro modo, inclui a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta particular, e isso pode ocorrer se as plantas terrestres normalmente expressarem, ou não, uma proteína de transporte mitocondrial tipo CCP1 endógena diferente. A planta terrestre geneticamente modificada expressa a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta particular com base em compreender o gene modificado para a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta. De modo correspondente, o gene modificado pode ser usado para realizar uma expressão modificada da proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta, e, particularmente, a expressão aumentada de ortólogos de CCP1, incluindo a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta e quaisquer proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 endógenas.

[0044] Da mesma forma, em alguns exemplos, a planta terrestre de origem é do mesmo tipo da planta terrestre que a planta terrestre geneticamente modificada. De acordo com esses exemplos, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta pode ser homóloga em relação à planta terrestre geneticamente modificada. Através disso, sabe-se que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta particular é normalmente codificada, e pode ser normalmente expressa, em plantas terrestres do tipo a partir do qual a planta terrestre geneticamente modificada é derivada. De acordo com esses exemplos, a planta terrestre pode ser modificada geneticamente para incluir cópias adicionais de um gene para a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta e/ou expressar uma cópia endógena de um gene para a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta em níveis maiores e/ou em uma maneira preferencial a tecido com base na modificação e/ou substituição de um promotor para a cópia endógena do gene. Novamente, a planta terrestre geneticamente modificada expressa a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta particular com base em compreender o gene modificado para a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta, resultando em uma expressão modificada da proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta, e, particularmente, uma expressão aumentada de ortólogos de CCP1.

[0045] Conforme discutido anteriormente, acredita-se que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta acentuará o transporte de malato e/ou oxaloacetato a partir das mitocôndrias, ou até as mesmas, e/ou, de outro modo, alterar o metabolismo mitocondrial por transporte de bicarbonato e/ou outras moléculas pequenas. De modo correspondente, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta pode ser uma proteína que transporta malato e/ou oxaloacetato por qualquer mecanismo de transporte. Os transportadores mitocondriais úteis para praticar a invenção revelada incluem transportadores envolvidos no transporte de ácidos dicarboxílicos para dentro e fora das mitocôndrias em células vegetais. Em particular, esses transportadores podem ser envolvidos no transporte de oxaloacetato (isto é, OAA) e/ou malato (isto é, MAL). No caso do transporte de OAA e MAL, o transportador pode consistir em antiportadores de modo que OAA e MAL sejam transportados simultaneamente em direções opostas, por exemplo, de modo que OAA seja transportado para dentro, enquanto MAL seja transportado para fora. Basicamente, o transportador mitocondrial atua como uma lançadeira de malato/oxaloacetato. Em outros casos, a lançadeira pode transportar OAA e um ou mais outros ácidos dicarboxílicos ou outros metabólitos. Os transportadores ou lançadeiras que transportam OAA são uma modalidade preferencial desta invenção. A direcionalidade do fluxo de qualquer metabólito é determinada pelas condições de crescimento experimentadas pela planta e qualquer tempo particular. A proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta também pode ser uma proteína que, de outro modo, altera o metabolismo mitocondrial por transporte de bicarbonato e/ou outras moléculas pequenas. As classes de proteínas de transporte de bicarbonato incluem trocadores de ânion e simportadores de Na*/HCO3. O transporte aumentado de outras moléculas pequenas pode evitar seu acúmulo que pode, de outro modo, inibir a fotossíntese.

[0046] A proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta fica localizado nas mitocôndrias da planta terrestre com base em um sinal de direcionamento mitocondrial intrínseco à proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta. A proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta pode estar localizada nas mitocôndrias, por exemplo, com base em ser codificadas pelo DNA presente no núcleo de uma célula vegetal, sintetizadas no citosol da célula vegetal, direcionadas às mitocôndrias da célula vegetal, e inseridas em membranas externas e/ou membranas internas das mitocôndrias. Um sinal de direcionamento mitocondrial é uma porção de uma sequência de polipeptídeo que direciona a sequência de polipeptídeo às mitocôndrias. Um sinal de direcionamento mitocondrial intrínseco à proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é um sinal de direcionamento mitocondrial que seja integral à proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta, por exemplo, com base na ocorrência natural na extremidade N-terminal da proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta ou em segmentos discretos ao longo da proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta. Isso ocorre, por exemplo, em contrapartida à fusão de um sinal de direcionamento mitocondrial heterólogo a uma proteína de transporte mitocondrial que, de outro modo, não seria direcionada às mitocôndrias. A título de referência, conforme também discutido anteriormente CCP1 fica localizado nas mitocôndrias em Chlamydomonas reinhardtii, conforme expressado naturalmente, e tabaco, quando expressado de modo heterólogo. De modo correspondente, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta pode ser uma proteína de transporte mitocondrial que seja codificada por DNA nuclear, sintetizada de modo citosólico, direcionada às mitocôndrias, e inserida em membranas externas e/ou membranas internas, com base no direcionamento por uma porção da sequência de polipeptídeo integral à proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta. A proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta não tem sinais de direcionamento de plastídeo típico.

[0047] As proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 de planta adequadas podem ser identificadas, por exemplo, com base em bancos de dados de busca de sequências de polinucleotídeos ou sequências de polipeptídeos para ortólogos de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1, em que as sequências de polinucleotídeos ou sequências de polipeptídeos são derivadas a partir de plantas terrestres, tendo em vista a revelação do presente documento, conforme discutido abaixo.

Essas buscas podem ser realizadas, por exemplo, pelo uso de BLAST, por exemplo, tblastn, e bancos de dados incluindo polinucleotídeos transladados, cujas sequências de pistola de genoma, e/ou sequências de montagem de transcriptoma, dentre outras sequências e bancos de dados.

Ortólogos potenciais de CCP1 podem ser identificados, por exemplo, com base na porcentagem de identidade e/ou porcentagem de similaridade, em relação à sequência de polipeptídeo, de sequências individuais nos bancos de dados em comparação a CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii.

Por exemplo, ortólogos potenciais de CCP1 podem ser identificados com base na porcentagem de identidade de uma sequência individual em um banco de dados e CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 25%, por exemplo pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, em que a sequência individual é derivada a partir de uma planta terrestre.

Da mesma forma, por exemplo, ortólogos potenciais de CCP1 podem ser identificados com base na porcentagem de similaridade de uma sequência individual em um banco de dados e CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 10%, por exemplo pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% , em que a sequência individual é derivada a partir de uma planta terrestre.

Da mesma forma, por exemplo, ortólogos potenciais de CCP1 podem ser identificados com base na porcentagem de identidade de pelo menos 25%, por exemplo pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, e porcentagem de similaridade de pelo menos 10%, por exemplo pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, em que a sequência individual é derivada a partir de uma planta terrestre.

[0048] Proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 de planta adequadas também podem ser identificadas, por exemplo, com base em telas funcionais.

[0049] Por exemplo, alguns transportadores de bicarbonato cianobacteriano foram previamente mostrados por localizarem funcionalmente na membrana citoplásmica de Escherichia coli, incluindo alguns transportadores de bicarbonato, conforme reportado por Du et al. (2014), PLoS One 9, e115905. A expressão de seus transportadores de bicarbonato cianobacteriano particular em E. coli usando uma cepa de E. coli mutante, denominada EDCM636, que seja deficiente e atividade de anidrase carbônica e que seja incapaz de crescer em placas LB ou M9 sem suplementação com altos níveis de CO, crescimento restaurado do E. coli mutante em níveis atmosféricos de CO>2, enquanto a expressão de vários outros não, conforme reportado por Du et al. (2014). À função de CCP1 e ortólogos potenciais do mesmo em relação ao transporte de malato e/ou oxaloacetato, bicarbonato, ou outros metabólitos pode ser testada por uma abordagem análoga, e telas funcionais correspondentes desenvolvidas, também com base no crescimento de restauração de cepas de E. coli mutantes.

[0050] A função de CCP1 e ortólogos potenciais da mesma em relação ao transporte de malato e/ou oxaloacetato, bicarbonato, ou outros metabólitos também pode ser testada, e telas funcionais correspondentes desenvolvidas, com base no uso de levedura modificada para expressar CCP1 e ortólogos potenciais dos mesmos. O transporte de bicarbonato ou outros metabólitos a partir das mitocôndrias de levedura assim modificadas indicaria que essas sequências também permitem o transporte de bicarbonato em levedura.

[0051] Após a identificação de uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta, pode-se realizar modificação genética de uma planta terrestre para expressar a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta através de métodos que sejam conhecidos na técnica, conforme discutido em detalhes abaixo.

[0052] A planta terrestre geneticamente modificada pode ser uma planta terrestre geneticamente modificada que não inclui proteínas heterólogas, por exemplo, em que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é homóloga em relação à planta terrestre geneticamente modificada, ou somente uma proteína homóloga, por exemplo, em que a única proteína vegetal heteróloga que a planta terrestre geneticamente modificada compreende é a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta. Conforme notado anteriormente, Atkinson et al. (2015) também revela que a expressão de transportadores Ci putativos individuais não acentuam o crescimento de Arabidopsis, e sugere que o empilhamento de componentes adicionais de mecanismos de concentração de carbono provavelmente será requerido alcançar um aumento significativo em eficiência fotossintética nessa espécie, embora sem ter testado a expressão de CCP1 em particular. Em contrapartida, sem desejar se ater à nenhuma teoria, acredita-se que uma planta terrestre geneticamente modificada que expressa uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta conforme descrito no presente documento alcançará um aumento significativo em eficiência fotossintética na planta terrestre geneticamente modificada sem a necessidade de empilhamento de componentes adicionais de mecanismos de concentração de carbono, e, logo, sem expressão heteróloga e/ou modificada de qualquer outra proteína pela planta terrestre geneticamente modificada. A planta terrestre geneticamente modificada correspondente proporcionará vantagens relativas a plantas que são modificadas para expressar múltiplos genes, por exemplo, em termos de métodos mais simples de produzir a planta terrestre geneticamente modificada, e reduzir os ricos de efeitos prejudiciais de outras proteínas submetidas à expressão heterólogas e/ou modificadas em relação ao uso da planta terrestre geneticamente modificada como uma colheita de alimentos, uma colheita de forragem ou uma colheita de oleaginosas.

[0053] Considerando a proteína transportadora “mitocondrial semelhante a CCP1 de planta em maiores detalhes, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta pode corresponder a uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta selecionada dentre sequências de polipeptídeo específicas de plantas terrestres de origem. Conforme notado anteriormente, as proteínas de transporte mitocondrial incluem

CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1. Conforme também notado, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta pode ser identificada com base na homologia a CCP1. Proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 identificaram que essa forma inclui (a) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea nicaraguensis de SEQ ID NO: 7, (b) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Erigeron breviscapus de SEQ ID NO: 6, (c) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Poa pratensis de SEQ ID NO: 8, e (d) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Cosmos bipinnatus de SEQ ID NO: 9. Essas correspondem a proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 Nível 1 de planta. Proteína de transporte mitocondrial! tipo CCP1 exemplificadoras identificaram que essa forma também inclui (a) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea mays de SEQ ID NO: 16, (b) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Triticum aestivum de SEQ ID NO: 12, (c) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Solanum tuberosum de SEQ ID NO: 13, (d) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Glycine max de SEQ ID NO: 14, (e) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Oryza sativa de SEQ ID NO: 15, e (f) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Sorghum bicolor de SEQ ID NO: 17. Essas correspondem a proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 Nível 2 de planta.

[0054] De modo correspondente, em algumas modalidades, uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende pelo menos uma dentre (a) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea nicaraguensis, (bj) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Erigeron breviscapus, (c) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Poa pratensis, ou (d) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Cosmos bipinnatus. Por exemplo, em algumas modalidades, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea nicaraguensis.

[0055] Da mesma forma, em algumas modalidades, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende pelo menos uma dentre (a) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea nicaraguensis de SEQ ID NO: 7, (b) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Erigeron breviscapus de SEQ ID NO: 6, (c) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Poa pratensis de SEQ ID NO: 8, ou (d) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Cosmos bipinnatus de SEQ ID NO: 9. Por exemplo, em algumas modalidades, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea nicaraguensis de SEQ ID NO: 7.

[0056] Da mesma forma, em algumas modalidades, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende uma ou mais dentre (a) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea mays, (b) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Triticum aestivum, (c) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Solanum tuberosum, (d) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Glycine max, (e) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Oryza sativa, ou (f) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Sorghum bicolor. Por exemplo, em algumas modalidades, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea mays.

[0057] Da mesma forma, em algumas modalidades, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende uma ou mais dentre (a) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea mays de SEQ ID NO: 16, (b) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta riticum aestivum de SEQ ID NO: 12, (c) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Solanum tuberosum de SEQ ID NO: 13, (d) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Glycine max de SEQ ID NO: 14, (e) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Oryza sativa de SEQ ID NO: 15, ou (f) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Sorghum bicolor de SEQ ID NO: 17. Por exemplo, em algumas modalidades, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea mays de SEQ ID NO: 16.

[0058] A proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta também pode corresponder a uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta incluindo recursos e características estruturais específicas — compartilhadas — dentre vários ortólogos de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1. Esses recursos e características estruturais compartilhados dentre os vários ortólogos de CCP1, isto é, as proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 Nível 1 de alga Gonium pectorale (KXZ50472.1) (SEQ |D NO: 2), Gonium pectorale (KXZ50486.1) (SEQ ID NO: 3), Volvox carteri f. nagariensis (SEQ ID NO: 4) e Ettlia oleocabundans (SEQ ID NO: 5), e proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 Nível 1 de planta Erigeron breviscapus (SEQ ID NO: 6), Zea nicaraguensis (SEQ ID NO: 7), e Cosmos bipinnatus (SEQ ID NO: 9), incluem (i) (a) um resíduo de prolina na posição 268, (b) um resíduo de aspartato ou resíduo de glutamina na posição 270, (c) um resíduo de lisina ou resíduo de arginina na posição 273, e (d) um resíduo de serina ou resíduo de treonina na posição 274, com numeração das posições relativas a CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1, e (ii) uma identidade geral de pelo menos 15%. Esses resíduos de aminoácido notados ocorrem em ou após a posição C-terminal de uma região de transmembrana potencial de cada entre CCP1 e os vários ortólogos de plantas e de algas Nível 1, isto é, aqueles de Gonium pectorale (KXZ50472.1) (SEQ ID NO: 2), Gonium pectorale (KXZ50486.1) (SEQ ID NO: 3), Volvox carteri f. nagariensis (SEQ ID NO: 4), e Ettlia oleocabundans (SEQ ID NO: 5), Erigeron breviscapus (SEQ ID NO: 6), Zea nicaraguensis (SEQ ID NO: 7), e Cosmos bipinnatus (SEQ ID NO: 9), bem como dentre vários outros ortólogos de CCP1. A conservação dos resíduos de aminoácido notados, em combinação com uma identidade geral de pelo menos 15%, sugere uma relação de estrutura/função compartilhada dentre essas proteínas de transporte mitocondrial. Logo, por exemplo, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta pode ser um ortólogo de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1 com base em compreender: (i) (a) um resíduo de prolina na posição 268, (b) um resíduo de aspartato ou resíduo de glutamina na posição 270, (c) um resíduo de lisina ou resíduo de arginina na posição 273, e (d) um resíduo de serina ou resíduo de treonina na posição 274, com numeração de posições relativas a CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1, e (ii) uma identidade geral de pelo menos 15%.

[0059] A proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta também pode corresponder a uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta incluindo recursos e características estruturais específicos compartilhados dentre ortólogos de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1. Por exemplo, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta pode ser um ortólogo de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii' de SEQ ID NO: 1 com base em compreender: (i) (a) um resíduo de glicina na posição 301, (b) um resíduo de glicina na posição 308, e (c) um resíduo de arginina na posição 315, com numeração de posições relativas a CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1, e (ii) uma identidade geral de pelo menos 15%. Esses resíduos de aminoácido notados também são conservados dentre CCP1 e os vários ortólogos de plantas e de algas Nível 1, bem como outros ortólogos de CCP1.

[0060] A proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta também podem corresponder a uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta incluindo sequências de assinatura de CCP1 Nível 1 compartilhadas especificamente dentre ortólogos de plantas e de algas Nível 1 de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1. Por exemplo, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta pode ser um ortólogo de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii' de SEQ ID NO: 1 com base em compreender: (i) uma ou mais sequências de assinatura de CCP1 Nível 1 de (a) LLGIHFP (SEQ ID NO: 18) na posição 104-110, (b) LRDMQGYAWFF (SEQ ID NO: 19) na posição 212-222, (c) AGFGLWGSMEF (SEQ ID NO: 20) na posição 258-267, ou (d) AIPVNA (SEQ ID NO: 21) na posição 316-321, com numeração de posições relativas a CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1, e (ii) uma identidade geral de pelo menos 60%. Essas sequências de assinatura de CCP1 Nível 1 denotadas também são especificamente conservadas dentre CCP1 e os vários ortólogos de plantas e de algas Nível 1.

[0061] A proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta também pode corresponder a uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta que não somente localiza nas mitocôndrias, mas que também localiza aos cloroplastos. Conforme notado anteriormente, Atkinson et al. (2015) revelada que CCP1 e seu CCP2 homólogo, que são caracterizados como transportadores Ci putativos previamente reportados como estando no envelope de cloroplasto, localizados nas mitocôndrias em Chlamydomonas reinhardtii, conforme naturalmente expressado, e tabaco, quando expressado de modo heterólogo. Sem desejar se ater à nenhuma teoria, acredita-se que a localização de proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 de planta em mitocôndrias a uma extensão maior que os cloroplastos promova um rendimento acentuado. Logo, por exemplo, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta pode ser localizada em mitocôndrias da planta terrestre geneticamente modificada a uma extensão maior que os cloroplastos da planta terrestre geneticamente modificada por um fator de pelo menos 2, pelo menos 5, ou pelo menos 10.

[0062] A proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta também pode corresponder a uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta que não difere de qualquer forma biologicamente significativa de uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta tipo selvagem. Conforme notado anteriormente, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta fica localizada nas mitocôndrias da planta terrestre geneticamente modificada com base em um sinal de direcionamento mitocondrial intrínseco à proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta, e isso ocorre, por exemplo, em contrapartida à fusão de um sinal de direcionamento mitocondrial heterólogo a uma proteína vegetal que, de outro modo, não seria direcionada às mitocôndrias. Em alguns exemplos, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta também não inclui quaisquer outras modificações que possam resultar na proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta diferente em uma forma biologicamente significativa de uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta tipo selvagem. Logo, por exemplo, a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta pode consistir essencialmente em uma sequência de aminoácido que seja idêntica àquela de uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta tipo selvagem. A planta terrestre geneticamente modificada correspondente proporcionará vantagens, por exemplo, novamente em termos de reduzir riscos de efeitos prejudiciais em relação ao uso da planta terrestre geneticamente modificada como uma colheita de alimentos, uma colheita de forragem ou uma colheita de oleaginosas.

[0063] O gene modificado compreende (i) um promotor e (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta.

[0064] O promotor é não cognato em relação à sequência de ácido nucleico. Um promotor que seja não cognato em relação a uma sequência de ácido nucleico significa que o promotor não é naturalmente pareado com a sequência de ácido nucleico em organismos a partir dos quais o promotor e/ou a sequência de ácido nucleico são derivados. De preferência, o promotor foi pareado com a sequência de ácido nucleico com base no uso de técnicas de DNA recombinantes para criar um gene modificado. De modo correspondente, nesse caso, o promotor não é naturalmente pareado com a sequência de ácido nucleico na planta terrestre de origem, isto é, a planta terrestre a partir da qual a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta foi derivada, nem no organismo a partir do qual o promotor oi derivado, seja o organismo a planta terrestre de origem ou outro organismo. De preferência, o promotor foi pareado com a sequência de ácido nucleico com base no uso de técnicas de DNA recombinante para criar o gene modificado.

[0065] O gene modificado é configurado de modo que a transcrição da sequência de ácido nucleico seja iniciada a partir do promoter e resulte na expressão da proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta. De modo correspondente, no contexto do gene modificado, o promotor funciona como um promotor de transcrição da sequência de ácido nucleico, e, logo, da expressão da proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta.

[0066] Em alguns exemplos, o promotor é um promotor constitutivo. Em alguns exemplos, o promotor é um promotor específico de semente. Em alguns exemplos, o gene modificado é integrado no DNA genômico da planta terrestre geneticamente modificada. Em alguns exemplos, o gene modificado é estavelmente expressado na planta terrestre geneticamente modificada. Em alguns exemplos, a sequência de ácido nucleico codifica uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta tipo selvagem. Em alguns exemplos, a sequência de ácido nucleico codificada uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta variante, modificada, mutante, ou, de outro modo, tipo não selvagem. Esses recursos exemplificadores, e outros, do promotor, a sequência de ácido nucleico, e o gene modificado são discutidos em detalhes abaixo.

[0067] A planta terrestre geneticamente modificada também pode ser uma planta terrestre geneticamente modificada que expressa sequências de ácido nucleico que codificam proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 de planta em uma maneira específica de semente e constitutiva, em que as sequências de ácido nucleico que codificam as proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 de planta podem ser sequências de ácido nucleico iguais ou diferentes, a partir da mesma planta terrestre de origem ou a partir de diferentes plantas terrestres de origem. Sem desejar se ter à nenhuma teoria, acredita-se que a expressão constitutiva de proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 de planta resulte em números muito maiores de vagens, e que a expressão específica de semente de proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 de planta pode fornecer o carbono necessário para preencher sementes a um tamanho completo, e, logo, que o rendimento deveria ser maior. De modo correspondente, em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada (i) expressa a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta em um modo específico de semente, e (ii) expressa outra proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta de forma constitutiva, a outra proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta também correspondente a um ortólogo de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1 derivado de uma planta terrestre de origem.

[0068] A planta terrestre geneticamente modificada pode ter uma taxa de assimilação de CO? que seja maior que para uma planta terrestre de referência correspondente que não compreende o gene modificado. Por exemplo, a planta terrestre geneticamente modificada pode ter uma taxa de assimilação de CO>2 que seja pelo menos 5% maior, pelo menos 10% maior, pelo menos 20% maior, ou pelo menos 40% maior, que para uma planta terrestre de referência correspondente que não compreende o gene modificado.

[0069] A planta terrestre geneticamente modificada também pode ter uma taxa de transpiração que seja menor que para uma planta terrestre de referência correspondente que não compreende o gene modificado. Por exemplo, a planta terrestre geneticamente modificada pode ter uma taxa de transpiração que seja pelo menos 5% menor, pelo menos 10% menor, pelo menos 20% menor, ou pelo menos 40% menor, que para uma planta terrestre de referência correspondente que não compreende o gene modificado.

[0070] A planta terrestre geneticamente modificada também pode ter um rendimento de semente que seja maior que para uma planta terrestre de referência correspondente que não compreende o gene modificado. Por exemplo, a planta terrestre geneticamente modificada pode ter um rendimento de semente que seja pelo menos 5% maior, pelo menos 10% maior, pelo menos 20% maior, pelo menos 40% maior, pelo menos 60% maior, ou pelo menos 80% maior, que para uma planta terrestre de referência correspondente que não compreende o gene modificado.

[0071] Conforme notado anteriormente, a identificação a seguir de uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta de uma planta terrestre de origem, pode-se realizar modificação genética de uma planta terrestre para expressar a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta através de métodos que sejam conhecidos na técnica, por exemplo, da seguinte forma.

[0072] Construções de DNA úteis nos métodos descritos no presente documento incluem vetores de transformação capazes de introduzir transgenes ou outras sequências de ácido nucleico modificado em plantas terrestres. Conforme o uso em questão, “modificado geneticamente” se refere a um organismo no qual um fragmento de ácido nucleico contendo uma sequência de nucleotídeo heteróloga foi introduzido, ou no qual a expressão de um gene homólogo foi modificado, por exemplo, por edição de genoma. Os transgenes no organismo modificado geneticamente são preferencialmente estáveis e hereditários. Os fragmentos de ácido nucleico heterólogos podem, ou não, ser integrados no genoma hospedeiro.

[0073] Diversas opções de vetores de transformação vegetal estão disponíveis, incluindo aquelas descritas em Gene Transfer to Plants, 1995, Potrykus et al., eds., Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, Genetically engineered Plants: A Production System for Industrial and Pharmaceutical Proteins, 1996, Owen et al., eds., John Wiley & Sons Ltd. England, and Methods in Plant Molecular Biology: A Laboratory Course Manual, 1995, Maliga et al,, eds., Cold Spring Laboratory Press, New York. Os vetores de transformação vegetal geralmente incluem uma ou mais sequências de codificação de interesse sob o controle transcricional de sequências regulatórias 5' e 3', incluindo um promotor, uma terminação de transcrição e/ou sinal de poliadenilação, e um gene marcador selecionável ou elegível.

[0074] Muitos vetores estão disponíveis para transformação usando Agrobacterium tumefaciens. Tipicamente, esses portam pelo menos uma sequência de T-DNA e incluem vetores como pBIN19. Vetores típicos adequados para transformação de Agrobacterium incluem os vetores binários pCIB200 e pCIB2001, bem como o vetor binário pCIB 10 e derivados de seleção de higromicina dos mesmos. Vide, por exemplo, a Patente nº U.S. 5.639.949.

[0075] A transformação sem o uso de Agrobacterium tumefaciens evita a exigência por sequências de T-DNA no vetor de transformação escolhido e, consequentemente, vetores desprovidos dessas sequências são utilizados além dos vetores como aqueles descritos anteriormente que contêm sequências de T-DNA. A escolha de vetor para técnicas de transformação que não se baseiam em Agrobacterium depende consideravelmente da seleção preferencial para a espécie sendo transformada Vetores típicos adequados para transformação não-Agrobacterium incluem pCIB3064, pSOG 19, e pSOG35. Vide, por exemplo, a Patente nº U.S. 5.639.949. Alternativamente, fragmentos de DNA contendo o transgene e os elementos regulatórios necessários para expressão do transgene podem ser excisados de um plasmídeo e entregues à célula vegetal usando métodos mediados por bombardeio de microprojéteis.

[0076] Nucleases de dedo de zinco (ZFNs) também são uteis pelo fato de que permitem uma clivagem de DNA de fita dupla em sítios específicos em cromossomos vegetais de modo que a inserção ou exclusão gene alvo possam ser realizadas (Shukla et al., 2009, Nature 459: 437-441; Townsend et al., 2009, Nature 459: 442-445).

[0077] O sistema CRISPR/Cas9 (Sander, J. D. and Joung, J. K.,

Nature Biotechnology, publicado onlhe em 2 de março de 2014; doi;10.1038/nbt.2842) é particularmente útil para edição de genomas vegetais para modular a expressão de genes homólogos que codificam enzimas. Tudo isso é necessário para alcançar uma edição de CRISPR/Cas que é uma enzima Cas, ou outra nuclease de CRISPR (Murugan et al. Mol Cell 2017, 68:15), e um RNA de guia simples (sgRNA) conforme revisado extensivamente por outros (Belhag et al. Curr Opin Biotech 2015, 32: 76; Khandagale and Nadaf, Plant Biotechnol Rep 2016, 10:327). Diversos exemplos do uso dessa tecnologia para edita os genomas de plantas foram reportados (Belhaj et al. Plant Methods 2013, 9:39; Zhang et al. Journal of Genetics and Genomics 2016, 43: 251).

[0078] TALENs (nucleases de efetor tipo ativador transcricional) ou meganucleases também podem ser usadas para edição de genoma vegetal (Malzahn et al., Cell Biosci, 2017, 7:21).

[0079] Protocolos de transformação bem como protocolos para introduzir sequências de nucleotídeos em plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou célula vegetal almejada para transformação. Métodos adequados para introduzir sequências de nucleotídeos em células vegetais e subsequente inserção no genoma vegeta incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 83:5602-5606), transformação mediada por Agrobacterium (Townsend et a/., Patente nº U.S. 5,563,055; Zhao et al. WO US98/01268), transferência de gene direta (Paszkowski et a/. (1984) EMBO J. 3:2717-2722), e aceração de partícula balística (vide, por exemplo, Sanford et a/., Patente nº U.S.

4.945.050; Tomes et al. (1995) Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); e McCabe et al. Biotechnology 6:923-926 (1988)). Vide, também, Weissinger et al. Ann. Rev. Genet. 22:421-477 (1988); Sanford et al. Particulate Science and Technology 5:27-37 (1987) (cebola); Christou et al. Plant Physiol. 87:671-674 (1988) (soja); McCabe et a/. (1988) BioTechnology 6:923-926 (soja); Finer and McMullen In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (1991) (soja); Singh et al. Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (1998) (soja); Dafta et al. (1990) Biotechnology 8:736- 740 (arroz); Klein et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (1988) (milho); Klein et al. Biotechnology 6:559-563 (1988) (milho); Tomes, Patente nº U.S.

5.240.855; Buising et a/., Patentes nºº U.S. 5.322.783 e 5.324.646; Tomes et al.

(1995) em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlim, Alemanha) (milho); Klein et a/. Plant Physiol. 91:440-444 (1988) (milho); Fromm et al. Biotechnology 8:833-839 (1990) (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. Nature 311:763-764 (1984); Bowen et al., Patente nº U.S. 5.736.369 (cereais); Bytebier et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345- 5349 (1987) (Liliaceae); De Wet et al. em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et a/. (Longman, N.Y.), pp. 197-209 (1985) (pólen); Kaeppler et al. Plant Cell Reports 9:415-418 (1990) and Kaeppler et al. Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (1992) (transformação mediada por whisker); D'Halluin et al. Plant Cell 4:1495-1505 (1992) (eletroporação); Li et al. Plant Cell Reports 12:250-255 (1993) e Christou and Ford Annals of Botany 75:407-413 (1995) (arroz); Osjoda et al. Nature Biotechnology 14:745-750 (1996) (milho através de Agrobacterium tumefaciens). Referências à transformação de protoplasto e/ou pistola de gene para tecnologia de Agrisoma são descritas no documento WO 2010/037209. Os métodos para transformar protoplastos vegetais estão disponíveis incluindo transformação usando polietileno glicol (PEG), eletroporação, e precipitação de fosfato de cálcio (vide, por exemplo, Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genet., 199, 183-188; Potrykus et al., 1985, Plant Molecular Biology Reporter, 3, 117-128), Métodos para regeneração vegetal a partir de protoplastos também foram descritos [Evans et al., em Handbook of Plant Cell Culture, Vol 1, (Macmillan Publishing Co., New York, 1983); Vasil, IK in Cell Culture and Somatic Cell Genetics (Academic, Orlando, 1984)].

[0080] Tecnologias de recombinase que são úteis para produzir as plantas modificadas geneticamente reveladas incluem os sistemas cre-lox, FLP/FRT e Gin. Os métodos pelos quais essas tecnologias podem ser usadas para o propósito descrito no presente documento são descritos, por exemplo, na (Patente nº U.S. 5,527,695; Dale and Ow, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10558-10562; Medberry et a/., 1995, Nucleic Acids Res. 23: 485-490).

[0081] Os protocolos de transformação bem como protocolos para introduzir sequências de nucleotídeos em plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou célula vegetal, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, almejadas para transformação.

[0082] Os métodos adequados para introdução de sequências de nucleotídeos em células vegetais e subsequente inserção no genoma vegetal são descritos em US 2010/0229256 A1 por Somleva & Ali e US 2012/0060413 por Somleva et al.

[0083] As células transformadas são desenvolvidas em plantas de acordo com as técnicas convencionais. Vide, por exemplo, McCormick et al, 1986, Plant Cell Rep. 5: 81-84. Essas plantas podem, então, ser desenvolvidas, e polinizadas com a mesma variedade transformada ou variedades diferentes, e o híbrido resultante tendo uma expressão constitutiva da característica genotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser desenvolvidas para garantir que a expressão constitutiva da característica genotípica desejada seja estavelmente mantida e herdada e, então, as sementes colhidas para garantir que uma expressão constitutiva da característica genotípica desejada foi alcançada.

[0084] Os procedimentos para transformação in planta podem ser simples. Manipulações de cultura de tecidos e possíveis variações somacionais são evitadas e somente um tempo curto é necessário para obter plantas geneticamente modificadas. No entanto, a frequência de transformantes na progênie dessas plantas inoculadas é relativamente baixa e variável. No presente, existem poucas espécies que podem ser rotineiramente transformadas na ausência de um sistema de regeneração baseado em cultura de tecido. Transformantes de Arabidopsis estáveis podem ser obtidos por vários métodos in planta incluindo infiltração a vácuo (Clough & Bent, 1998, The Plant J. 16: 735- 743), transformação de sementes de germinação (Feldmann & Marks, 1987, Mol. Gen. Genet. 208: 1-9), floral dip (Clough and Bent, 1998, Plant J. 16: 735-743), e aspersão floral (Chung et al., 2000, Genetically engineered Res. 9: 471-476). Outras plantas foram transformadas com sucesso por métodos in planta que incluem colza e rábano (infiltração a vácuo, lan and Hong, 2001, Genetícally engineered Res., 10: 363-371; Desfeux et al., 2000, Plant Physiol. 123: 895-904), Medicago truncatula (infiltração a vácuo, Trieu et al., 2000, Plant J. 22: 531-541), camelina (floral dip, WO/2009/117555 por Nguyen et al.), e trigo (floral dip, Zale et al., 2009, Plant Cell Rep. 28: 903-913). Métodos in planta também foram usados para transformação de células germinativas em milho (pólen, Wang et al. 2001, Acta Botanica Sin., 43, 275-279; Zhang et al., 2005, Euphytica, 144, 11- 22; pistils, Chumakov et al. 2006, Russian J. Genetics, 42, 893-897; Mamontova et al. 2010, Russian J. Genetics, 46, 501-504) e Sorgo (pólen, Wang et al. 2007,

Biotechnol. Appl. Biochem., 48, 79-83).

[0085] A transformação a seguir por qualquer dos métodos descritos anteriormente, os procedimentos a seguir podem ser usados para obter uma planta transformada que expressa os transgenes: selecionar as células vegetais que foram transformadas em um meio seletivo; regenerar as células vegetais que foram transformadas para produzir plantas diferenciadas; selecionadas plantas transformadas que expressam o transgene que produz o nível desejado de polipeptídeos desejados no tecido e local celular desejados.

[0086] As células que foram transformadas podem ser desenvolvidas em plantas de acordo com técnicas convencionais. Vide, por exemplo, McCormick et al. Plant Cell Reports 5:81-84(1986). Essas plantas podem, então, ser desenvolvidas, e polinizadas com a mesma variedade transformada ou diferentes variedades, e o híbrido resultante tendo uma expressão constitutiva da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser desenvolvidas para garantir que a expressão constitutiva da característica genotípica desejada seja estavelmente mantida e herdada e, então, sementes colhidas para garantir que a expressão constitutiva da característica genotípica desejada foi alcançada.

[0087] Plantas modificadas geneticamente podem ser produzidas usando técnicas convencionais para expressar quaisquer genes de interesse em plantas ou células vegetais (Methods in Molecular Biology, 2005, vol. 286, Genetically engineered Plants: Methods and Protocols, Pena L., ed., Humana Press, Inc. Totowa, NJ; Shyamkumar Barampuram and Zhanyuan J. Zhang, Recent Advances in Plant Transformation, in James A. Birchler (ed.), Plant Chromosome Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 701, Springer Science+Business Media). Tipicamente, a transferência genética, ou transformação, é realizada usando explantes capazes de regeneração para produzir plantas férteis completas. Em geral, um DNA ou uma molécula de RNA a ser introduzida no organismo faz parte de um vetor de transformação. Pode-se usar um grande número desses sistemas de vetor conhecidos na técnica, tais como plasmídeos. Os componentes do sistema de expressão podem ser modificados, por exemplo, para aumentar a expressão dos ácidos nucleicos introduzidos. Por exemplo, sequências truncadas, substituições de nucleotídeos ou outras modificações podem ser empregadas. Os sistemas de expressão conhecidos na técnica podem ser usados para transformar virtualmente qualquer célula vegetal sob condições adequadas. Um transgene que compreende uma molécula de DNA que codifica um gene de interesse é, de preferência, estavelmente transformado e integrado no genoma das células hospedeiras. As células transformadas são preferencialmente regeneradas em plantas férteis completas. A descrição detalhada de técnicas de transformação está dentro do conhecimento dos indivíduos versados na técnica.

[0088] Os promotores vegetais podem ser selecionados para controlar a expressão do transgene em diferentes tecidos vegetais ou organelas, sendo que todos os métodos são conhecidos pelos indivíduos versados na técnica (Gasser & Fraley, 1989, Science 244: 1293-1299). Em uma modalidade, os promotores são selecionados a partir daqueles de origem eucariótica ou sintética que sejam conhecidos por altos níveis de rendimento de expressão e plantas e algas. Em uma modalidade preferencial, os promotores são selecionados a partir daqueles que são bem conhecidos por proporcionarem altos níveis de expressão em monocotiledôneas.

[0089] Os promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor principal do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos revelados em WO 99/43838 e Patente nº U.S. 6.072.050, o promotor CaMV 358 principal (Odell et al., 1985, Nature 313: 810-812), actina de arroz (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2: 163-171), ubiquitina (Christensen et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12: 619-632; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689), pEMU (Last et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81: 581-588), MAS (Velten et al., 1984, EMBO J. 3: 2723- 2730), e promotor de ALS (Patente nº U.S. 5.659.026). Outros promotores constitutivos são descritos nas Patentes nº* U.S. 5.608.149; 5.608.144;

5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463 e 5.608.142.

[0090] Promotores “preferenciais de tecido” podem ser usados para expressão de gene alvo dentro de um tecido particular. Os promotores preferenciais de tecido incluem aqueles descritos por Van Ex et al., 2009, Plant Cell Rep. 28: 1509-1520; Yamamoto et al., 1997, Plant J. 12: 255-265; Kawamata et al., 1997, Plant Cell Physiol. 38: 792-803; Hansen et al., 1997, Mol. Gen. Genet. 254: 337-343; Russell et al., 199), Transgenic Res. 6: 157-168; Rinehart et al., 1996, Plant Physiol. 112: 1331-1341; Van Camp et al., 1996, Plant Physiol. 112: 525-535; Canevascini et al., 1996, Plant Physiol. 112: 513-524; Yamamoto et al., 1994, Plant Cell Physiol. 35: 773-778; Lam, 1994, Results Probl. Cell Differ. 20: 181-196, Orozco et al., 1993, Plant Mol. Biol. 23: 1129-1138; Matsuoka et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9586-9590, e Guevara-Garcia et al., 1993, Plant J. 4: 495-505. Esses promotores podem ser modificados, caso seja necessário, para expressão fraca.

[0091] Os promotores específicos de sementes podem ser usados para expressão de gene alvo a sementes em particular. Os promotores específicos de sementes incluem promotores que são expressados em vários tecidos dentro de sementes e em vários estágios de desenvolvimento de sementes. Os promotores específicos de sementes podem ser absolutamente específicos de sementes, de modo que os promotores sejam somente expressados em sementes, ou podem ser preferencialmente expressados em sementes, por exemplo, em taxas sejam superiores por 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, ou mais, em sementes relativas a um ou mais outros tecidos de uma planta, por exemplo, caules, folhas e/ou raízes, dentre outros tecidos. Promotores específicos de sementes incluem, por exemplo, promotores específicos de sementes de dicotiledôneas e promotores específicos de sementes de monocotiledôneas, dentre outros. Para dicotiledôneas, promotores específicos de sementes incluem, mas não se limitam a, B-faseolina de feijão, napina, B-conglicinina, oleosina 1 de soja, sacarosa sintase de Arabidopsis thaliana, lectina de soja de conlinina de linho, cruciferina, e similares. Para monocotiledôneas, os promotores específicos de sementes incluem, mas não se limitam a, zeina 15 kDa de milho, zeina 22 kDa, zeina 27 kDa, g-zeina, cera, shrunken 1, shrunken 2, e globulina 1.

[0092] Promotores regulados químicos podem ser usados para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno.

[0093] Promotores exemplificadores específicos úteis para expressão de genes em dicotiledôneas e monocotiledôneas são proporcionados na Tabela 1 e na Tabela 2, respectivamente.

TABELA 1. Promotores úteis para expressão de genes em dicotiledôneas.

Gene/Promotor | Expressão Organismo nativo | *ID de gene use e im Hsp70 Constitutivo Glycine max Glyma.02G093200 cvs proa Proteína de | Constitutivo Glycine max Glyma.08G082900 Ligação A/B de (SEQ ID NO: 40) clorofila (Cab5) Piruvato fosfato | Constitutivo Glycine max Glyma.06G252400 diquinase (SEQ ID NO: 41)

FA Actina Constitutivo Glycine max Glyma.19G147900 e cvs proa Pirofosforrilase | Específico de | Glycine max Glyma.04G011900 ADP-glicose semente (SEQ ID NO: 43) (AGPase) Glutelina C | Específico de | Glycine max Glyma.03G163500 Go me eranrota Isoenzima Específico de | Glycine max Glyma.17G227800 insolúvel em B- | semente (SEQ ID NO: 45) fructofuranosida se 1 (CIN1) Caixa de MADS | Específico ao | Glycine max Glyma.04G257100 As o sabia Glicinina Específico de | Glycine max Glyma.03G163500 (subunidade semente (SEQ ID NO: 47) G1) Isoforma de | Específico de | Glycine max Glyma.16G071800 [amena amem o raptada | Proteína de | Constitutivo Brassica napus BnaAO4g920150D ligação A/B de clorofila (Cab5)

1.78 napina | Específico de | Brassica napus BnaAO01g17200D tram ss *ID de gene inclui informações de sequência para regiões de codificação bem como promotores associados. 5' UTRs e 3' UTRs se encontram disponíveis — em Phytozome (visite o site da web JG| phytozome .jgi.doe.gov/pz/portal.html).

TABELA 2. Promotores úteis para expressão de genes em monocotiledôneas, incluindo milho e arroz. [smeranatar — Teressão [ARE TR Hsp70 Constitutivo — | LOC Os05g38530 | GRMZM2G310431 o scapros eranro sa |

[0094] Determinadas — modalidades usam plantas modificadas geneticamente ou células vegetais tendo construções de expressão multi-gene abrigando mais de um transgene e promotor. Os promotores podem ser iguais ou diferentes.

[0095] Qualquer um dos promotores descritos pode ser usado para controlar a expressão de um ou mais dos genes, seus homólogos e/ou ortólogos bem como quaisquer outros genes de interesse em uma maneira espaço- temporal definida.

[0096] Sequências de ácido nucleico destinadas para expressão em plantas modificadas geneticamente são primeiro montadas em cassetes de expressão atrás de um promotor adequado ativo em plantas. Os cassetes de expressão também podem incluir quaisquer sequências adicionais requeridas ou selecionadas para a expressão do transgene. Essas sequências incluem, mas não se restringem a, terminadores de transcrição, sequências estranhas para acentuar a expressão como intrões, sequências vitais, e sequências destinadas para o direcionamento do produto de gene a organelas específicas e compartimentos celulares. Esses cassetes de expressão podem, então, ser transferidos aos vetores de transformação vegetal descritos infra. A seguir encontra-se uma descrição de vários componentes de cassetes de expressão típicos.

[0097] Uma variedade de terminadores transcricionais está disponível para uso em cassetes de expressão. Esses são responsáveis pela terminação da transcrição além do transgene e pela poliadenilação correta das transcrições. Terminadores transcricionais apropriados são aqueles que se sabe funcionar em plantas e incluem o terminador CaMV 358, o terminador tm1, o terminador de sintase de nopalina e o terminador de rbcS E9 de ervilha. Esses são usados em plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas.

[0098] A sequência de codificação do gene selecionado pode ser modificada geneticamente alterando-se a sequência de codificação para expressão ideal na espécie de colheita de interesse. Os métodos para modificar sequências de codificação para alcançar uma expressão ideal em uma espécie de colheita particular são bem conhecidos (Perlak et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324 e Koziel et al., 1993, Biotechnology 11: 194-200).

[0099] Plantas individuais em uma população de plantas modificadas geneticamente que expressam um gene recombinante podem ter diferentes níveis de expressão genética. A expressão genética variável ocorre devido a múltiplos fatores incluindo múltiplas cópias do gene recombinante, efeitos de cromatina, e supressão genética. De modo correspondente, um fenótipo da planta modificada geneticamente pode ser medido como uma porcentagem de plantas individuais em uma população. O rendimento de uma planta pode ser medido simplesmente pesando-se. O rendimento de semente de uma planta também pode ser determinado pesando-se. O aumento no peso de semente de uma planta pode ocorrer devido a uma série de fatores, incluindo um aumento no número ou tamanho dos vasos de sementes, um aumento no número de sementes e/ou um aumento no número de sementes por planta. No laboratório ou na estufa, o rendimento de semente é geralmente reportado como o peso de semente produzida por planta e em um rendimento de ajuste de produção de colheita comercial é geralmente expressado como peso por acre ou peso por hectare.

[0100] Uma construção de DNA recombinante incluindo um gene expressível de planta ou outro DNA de interesse é inserida no genoma de uma planta por um método adequado. Os métodos adequados incluem, por exemplo, transferência de DNA mediada por Agrobacterium tumefaciens, transferência de DNA direta, transferência de DNA mediada por lipossomo, eletroporação, co- cultivo, difusão, bombardeamento de partículas, microinjeção, pistola de genes, co-precipitação de fosfato de cálcio, vetores virais, e outras técnicas. Os vetores de transformação vegetal adequados incluem aqueles derivados a partir de um plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens. Além dos vetores de transformação vegetal derivados a partir de plasmídeos Ti ou indutor de raízes (Ri) de Agrobacterium, podem-se usar métodos alternativos que podem ser usados para inserir construções de DNA em células vegetais. Uma planta modificada geneticamente pode ser produzida pela seleção de sementes transformadas ou pela seleção de células vegetais transformadas e subsequente regeneração.

[0101] EM — algumas — modalidades, as plantas modificadas geneticamente são desenvolvidas (por exemplo, em terra) e colhidas. Em algumas modalidades, o tecido terrestre é colhido separadamente do tecido terrestre abaixo. Os tecidos terrestres anteriores adequados incluem brotos, caules, folhas, flores, grãos e sementes. Tecidos terrestres abaixo exemplificadores incluem raízes e capilares de raízes. Em algumas modalidades, plantas inteiras são colhidas e o tecido terrestre anterior é subsequentemente separado do tecido terrestres abaixo.

[0102] As construções genéticas podem codificar um marcador selecionável para permitir a seleção de eventos de transformação. Existem muitos métodos que foram descritos para a seleção de plantas transformadas (para análise vide (Miki et al., Journal of Biotechnology, 2004, 107, 193-232) e referências incorporadas). Os genes marcadores selecionáveis que foram extensivamente usados em plantas incluem o gene de fosfotransferase de neomicina nptll (Patentes nºº U.S. 5.034.322, U.S. 5.530.196), gene de resistência à higromicina (Patente nº U.S. 5.668.298, Waldron et al., (1985), Plant Mol Biol, 5:103-108; Zhijian et a/., (1995), Plant Sci, 108:219-227), o gene de barra que codifica resistência à fosfinotricina (Patente nº U.S. 5.276.268), a expressão de aminoglicosídeo 3"-adeniltransferase (aadA) para conferir resistência à espectinomicina (Patente nº U.S. 5.073.675), o uso de sintetase de B-enolpiruvil-3-fosfoshikimato resistente à inibição (Patente nº U.S. 4.535.060) e métodos para produzir plantas tolerantes a glifosato (Patente nº U.S. 5.463.175; Patente nº U.S. 7.045.684). Outros marcadores selecionáveis adequados incluem, mas não se limitam a, genes que codificam resistência a cloranfenicol (Herrera Estrella et a/., (1983), EMBO J, 2:987-992), metotrexato (Herrera Estrella et a/., (1983), Nature, 303:209-213; Meijer et al, (1991), Plant Mol Biol, 16:807-820); estreptomicina (Jones et al., (1987), Mol Gen Genet, 210:86-91); bleomicina (Hille et al, (1990), Plant Mol Biol, 7:171-176); sulfonamida (Guerineau et a/., (1990), Plant Mol Biol, 15:127-136); bromoxinil (Stalker et al., (1988), Science, 242:419-423); glifosato (Shaw et al., (1986), Science, 233:478- 481); fosfinotricina (DeBlock et a/., (1987), EMBO J, 6:2513-2518).

[0103] Os métodos de seleção de plantas que não usa antibióticos ou herbicidas como um agente seletivo foram previamente descritos e incluem a expressão de glucosamina-6-fosfato deaminase para inativar glucosamina em um meio de seleção de planta (Patente nº U.S. 6.444.878) e um sistema positivo/negativo que utiliza ácidos D-amino (Erikson et al., Nat Biotechnol, 2004, 22, 455-8). A Publicação de Patente Europeia nº EP 0 530 129 A1 descreve um sistema de seleção positiva que permite que as plantas transformadas ultrapassem as linhagens não transformadas expressando-se um transgene que codifica uma enzima que ativa um composto inativo adicionado ao meio de crescimento. A Patente nº U.S. 5.767.378 descreve o uso de manose ou xilose para a seleção positiva de plantas modificadas geneticamente.

[0104] Métodos para seleção positiva usando sorbitol deidrogenase para converter sorbitol em frutose para crescimento vegetal também foram descritos (WO 2010/102293). Genes marcadores elegíveis incluem gene beta- glucuronidase (Jefferson et al/., 1987, EMBO J. 6: 3901-3907; Patente nº U.S.

5.268.463) e gene de proteína fluorescente verde nativo ou modificado (Cubitt et al., 1995, Trends Biochem. Sci. 20: 448-455; Pan et a/., 1996, Plant Physiol. 112:

893-900).

[0105] Eventos de transformação também podem ser selecionados através da visualização de proteínas fluorescentes como as proteínas fluorescentes da espécie Anthozoa não bioluminescente que incluem DsRed, uma proteína fluorescente vermelha do gênero Discosoma de coral (Matz et al. (1999), Nat Biotechnol 17: 969-73). Desenvolveu-se uma versão aperfeiçoada da proteína DsRed (Bevis and Glick (2002), Nat Biotech 20: 83-87) para reduzir a agregação da proteína.

[0106] Pode-se realizar também uma seleção visual com as proteínas fluorescentes amarelas (YFP) incluindo a variante com maturação acelerada do sinal (Nagai, T. et al. (2002), Nat Biotech 20: 87-90), a proteína fluorescente azul, a proteína fluorescente ciano, e a proteína fluorescente verde (Sheen et al. (1995), Plant J 8: 777-84; Davis and Vierstra (1998), Plant Molecular Biology 36: 521-528). Um resumo de proteínas fluorescentes pode ser encontrado em Tzfira et al. (Tzfira et al. (2005), Plant Molecular Biology 57: 503-516) e Verkhusha and Lukyanov (Verkhusha, V. V. and K. A. Lukyanov (2004), Nat Biotech 22: 289- 296). Versões aperfeiçoadas de muitas das proteínas fluorescentes foram feitas para várias aplicações. Ficará aparente aos indivíduos versados na técnica como usar as versões aperfeiçoadas dessas proteínas, incluindo combinações, para seleção de transformantes.

[0107] As plantas modificadas para rendimento aprimorado foram empilhadas em traços de entrada que incluem resistência à herbicida e tolerância a insetos, por exemplo, uma planta que seja tolerante ao herbicida glifosato e que produz a toxina Bacillus thuringiensis (BT). Glifosato é um herbicida que evita a produção de aminoácidos aromáticos em plantas inibindo-se a enzima 5- enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSP sintase). A superexpressão de EPSP sintase em uma colheita de interesse permite a aplicação de glifosato como um exterminador de ervas daninhas sem exterminar a planta modificada (Suh, et al., J. M Plant Mol. Biol. 1993, 22, 195-205). Toxina BT é uma proteína letal a muitos insetos proporcionando a planta que produz sua proteção contra pragas (Barton, et al. Plant Physiol. 1987, 85, 1103-1109). Outros traços de tolerância à herbicida úteis incluem, mas não se limitam a, tolerância a Dicamba pela expressão do gene dicamba monoxigenase (Behrens et al, 2007, Science, 316, 1185), tolerância a 2,4-D e 2,4-D colina pela expressão de um gene aad-1 bacteriano que codifica para uma enzima ariloxialcanoato dioxigenase (Wright et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010, 107, 20240), tolerância a glufosinato pela expressão do gene de resistência a bialophos (bar) ou gene pat que codifica a enzima fosfinotricina acetil transferase (Droge et al,, Planta, 1992, 187, 142), bem como genes que codificam uma 4- hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD) modificada que proporciona tolerância aos herbicidas mesotriona, isoxaflutola e tembotriona (Siehl et al., Plant Physiol, 2014, 166, 1162).

[0108] A planta terrestre geneticamente modificada que expressa uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta, conforme revelado, pode ser adicionalmente modificada para um rendimento acentuado.

EXEMPLOS Exemplo 1. Identificação de ortólogos tipo CCP1 em plantas terrestres Tentativas iniciais de identificar ortólogos tipo CCP1 em plantas terrestres

[0109] Tentativas iniciais de determinar se plantas terrestres codificam ortólogos CCP1 sugeriram que plantas terrestres não codificam. Buscas BLAST típicas não revelam os homólogos de CCP1 em plantas superiores. Por exemplo, uma busca BLAST convencional usando CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii como a sequência de busca e o banco de dados de proteína padrão (nr) não rendeu nenhuma correspondência de ortólogo CCP1 Nível 1 de plantas superiores. Os acertos superiores nesse tipo de busca são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3: Resultados da busca BLAST convencional usando CCP1 como sequência de busca e o banco de dados de proteína padrão.

Descrição Resultado | E Identidade

A Proteína de envelope | 738 100% XP 001692197.1 de cloroplasto induzível por co2 baixo [Chlamydomonas reinhardtiil

Proteína de envelope | 738 99% AAB71743.1 [Chlamydomonas reinharatii| Proteína de envelope | 652 96% XP 001692288.1 de cloroplasto induzível por co2 baixo [Chlamydomonas reinharadti Proteína hipotética | 629 86% KXZ50472.1 GPECTOR 16g646 [Gonium pectorale] Proteína hipotética | 593 82% XP 002951243.1 VOLCADRAFT 61165 [Volvox carteri f nagariensis] Proteína hipotética | 586 83% KXZ50486.1 GPECTOR 16g661 [Gonium pectorale] Proteína hipotética | 187 96-55 |37% KNA16433.1 SOVF 089040 [Spinacia oleracea]

[0110] Surpreendentemente, os resultados revelam somente três acertos não CCP1, correspondentes às proteínas hipotéticas das algas Gonium pectorale (KXZ50472.1), Volvox carteri f. nagariensis (XP 002951243.1), e Gonium pectorale (KXZ50486.1), respectivamente, todas com 80+% de identidade a CCP1, então, uma queda imediata a uma proteína de espinafre com somente 37% de identidade. Após a proteína de espinafre existem centenas de proteínas com 30+% de identidade que provavelmente derivam a maioria de sua identidade do mero fato de que elas são proteínas carreadoras mitocondriais.

Identificação bem sucedida de ortólogos tipo CCP1 em plantas terrestres

[0111] Fortuitamente, homólogos de plantas superiores a CCP1 foram encontrados no banco de dados Transcriptome Shotgun Assembly (tsa nr) com base em comparações de sequência adicionais. Isso revelou que plantas terrestres codificam ortólogos CCP1. Isso também implicou que as únicas plantas superiores que contêm homólogos CCP1 ainda precisam ser sequenciadas em genoma.

[0112] Os resultados são mostrados nas Tabelas 4 e 5.

o“ << 8 o = o o a = = S = o Õ Õ = o o o qa qa ol qa qa Es] o > v À > » d = Ó = co co = = co Ss O q TIO a a fa o a 3, o 6 86 sô | - - - - - wa 2 8 2 Ol ra La E. OS. o - 2 E dv So ÀS o mo Mm E = o No à W O ES BE He ole Ájr qilis ole - = e E gg a lv or órómrnN|T dl a 2 = O E 2jwvN TN FlN FO NjN TN FT 3X LA AD sSEeNdSd|N NON NE NN NON So

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RMEESCONANAA Grupo Japônica | XP 015614184.1 | 296 47,5 29,1 ontsata amet Triticum CDMB80555.1 324 42,8 24,9 dem frame a Sorghum XP 002464891.1 | 296 47,2 29,3 Lee era Solanum XP 006361187.1 | 323 46,0 29,9 mm frame

[0113] Os resultados indicam que determinadas plantas terrestres codificam ortólogos de CCP1 de alga Chlamydomonas reinhardtii. Ademais, as proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 de planta codificadas por essas plantas terrestres aparentam se agrupar em dois grupos, denominados ortólogos de CCP1 Nível 1 e ortólogos de CCP1 Nível 2, com base na similaridade sequência e estrutural a CCP1. Conforme mostrado na Tabela 4, os ortólogos de CCP1 Nível 1 de planta exibem cerca de 60% de identidade de sequência em comparação a CCP1 de Chlamydomonas reinharatii, agrupamento estritamente baseado em seus graus similares de identidade, e foram identificados até o momento somente em quatro espécies vegetais, Zea nicaraguensis (também denominado como teosinta), Erigeron breviscapus, Cosmos bipinnatus, e Poa pratensis, sendo nenhuma dessas particularmente estritamente relacionada à filogenética. Conforme mostrado na Tabela 5, os ortólogos de CCP1 Nível 2 de planta exigem cerca de 30% de identidade de sequência em comparação a CCP1 de Chlamydomonas reinharatii, substancialmente menor que para Nível 1, também estritamente com base em seus graus similares de identidade, e aparentaria ser mais comum, tendo sido identificados até o momento em seis espécies de colheita principais, Zea mays (também denominada milho), Triticum aestivum, Solanum tuberosum, Glycine max, Oryza sativa e Sorghum bicolor. Isso foi surpreendente porque não houve nenhuma razão aparente para esperar quaisquer agrupamentos de proteínas transportadoras mitocondriais semelhante a CCP1 de planta, permite-se um grupamento em dois grupos distintos. Isso também foi surpreendente porque Zea nicaraguensis, novamente teosinta, é um progenitor selvagem de Zea mays, novamente milho, e Zea nicaraguensis inclui um ortólogo de CCP1 Nível 1, enquanto Zea mays inclui um ortólogo de CCP1 Nível 2.

[0114] Determinou-se também que ocorre um agrupamento adicional dentro dos ortólogos de CCP1 Nível 1, com vários ortólogos de CCP1 de alga Nível 1, isto é, aqueles de Gonium pectorale (KXZ50472.1), Gonium pectorale (KXZ50486.1), e Volvox carteri f. nagariensis, denominados Nível 1A, exibindo cerca de 80% de identidade de sequência em comparação a CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii, e com um ortólogo de CCP1 Nível 1 de alga, isto é, de Ettlia oleocabundans, denominado Nível 1B, ao invés de exibir 60% de identidade de sequência e agrupamento com os ortólogos de CCP1 Nível 1, também denominado como Nível 1B. Surpreendentemente, os ortólogos de CCP1 Nível 1B de planta e de alga parecem estar mais estritamente relacionados entre si a outros ortólogos de CCP1 de alga ou de planta, sugerindo a possiblidade intrigante que os ortólogos de CCP1 Nível 1B de planta podem ter resultado a partir da transferência de gene horizontal de Ettlia oleocabundans ou algas relacionadas. Isso também sugere que Zea nicaraguensis e a outra espécie vegetal que codifica ortólogos de CCP1 Nível 1B de planta pode servir como fontes de ortólogos de CCP1 que estão proximalmente derivado das plantas terrestres, ao invés de algas, reduzindo, assim, questões regulatórias e riscos associados à modificação genética de colheitas, enquanto ainda é capaz de proporcionar aumentos em rendimento de colheita comparáveis àqueles observados para CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii e ortólogos de CCP1 derivados de outras algas.

[0115] Considerando os resultados em maiores detalhes, os ortólogos de CCP1 Nível 1A são muito similares a CCP1 e incluem somente as outras algas Volvox e Gonium. Esses ortólogos CCP1 de alga são 80+% idênticos a CCP1. A identidade Nível 1B cai para 60+%, mas gráficos de Phobius de domínios transmembranares dessas proteínas continuam a parecer muito similares àqueles de CCP1, enquanto os gráficos de Phobius de proteínas Nível 2 não.

[0116] Nível 1B inclui apenas uma alga, Ettlia oleocabundans, e várias plantas superiores, sugerindo que Ettlia oleocabundans pode ser a fonte do homólogo de CCP1 em plantas superiores, ou pelo menos que Ettlia oleoabundans e as plantas superiores ultimamente adquirira o homólogo de CCP1 a partir de uma fonte comum.

Plantas que codificam ortólogos de CCP1 Nível 1B

[0117] Considerando que as plantas que codificam ortólogos de CCP1 Nível 1B em maiores detalhes, essas plantas exibem algumas características distintivas.

[0118] Zea nicaraguensis é um progenitor selvagem de milho que se desenvolve ao longo de bancos geralmente inundados de rios e vazões, logo, está tentando especular que seja adquirido seu ortólogo de CCP1 a partir de uma espécie de algas que popula as águas próximas. O papel original que descreve Zea nicaraguensis diz que: “Agora evidentemente extremamente local e rara, a teosinta nesse local é considerável para sua capacidade de crescer tanto quanto 04 m verticalmente ou água de movimento lento,” e que “antecipamos que essa espécie proporcionará reprodutores de milho com uma fonte potencialmente valiosa de germoplasma que pode levar ao desenvolvimento de milho capaz de crescer em solos encharcados de água” (Iltis et al., Novon 10:382-390 (2000)).

[0119] Erigeron breviscapus é uma flor usada para propósitos medicinais encontradas em altitudes mais elevadas na China. A distribuição de Erigeron breviscapus foi descrita da seguinte forma: “Montanhas de altitude média, prados alpinos a montanos, margens da floresta, florestas de Pinus, riachos, pastagens, encostas conturbadas, acostamentos de estradas; 1200- 3600 m. Guangxi, Guizhou, Hunan, Sichuan, E and S Xizang, Yunnan" (site da web: efloras.org). Logo, Erigeron breviscapus, como Zea nicaraguensis, é também encontrada em margens de curso de água.

[0120] Cosmos bipinnatus é um grande áster que cresce em climas temperados. O Cosmos bipinnatus é usado como uma flor ornamental, mas pode se espalhar como uma erva daninha.

[0121] Poa pratensis é nativa da América do Norte, de acordo com o USDA (Serviço de Conservação dos Recursos Nacionais, USDA, Plant Guide: Kentucky Blue Grass, Poa pratensis L., site da web: plants.usda.gov/plantguide/pdf/pg. popr.pdf). Poa pratensis cresce preferencialmente em climas frios e úmidos e é um dominante comum de pradarias do meio-oeste.

Buscas de homologia

[0122] Considerando abordagens para identificar ortólogos CCP1 em plantas terrestres em maiores detalhes, várias buscas de BLAST (por exemplo, tblastn; site da web blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) foram conduzidas usando um banco de dados de nucleotídeo transladado, um banco de dados de pistola de genoma completo (também denominado WGS), e um banco de dados de montagem de transcriptoma (também denominado TSA) para encontrar sequências altamente similares à proteína CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii em plantas terrestres e espécies de algas não comestíveis (Tabela 4 e Tabela 5). Várias sequências com 60% ou maior de identidade a CCP1 foram encontradas, seguidas por um número muito maior de SEQuências com identidades de cerca de 30% e inferiores, sem representativos entre. Conforme notado, esses grupos são denominados Nível 1 e Nível 2, respectivamente. Algoritmos da Internet publicamente disponíveis fora usados para prever regiões de transmembrana putativa para caracterizar adicionalmente as sequências, incluindo Motif Finder (site da web: genome .jp/tools/motif/), ProSite (site da web: prosite.expasy.org/), e Phobius (site da web: phobius.sbc.su.se/). O programa Motif Finder identificou domínios Mito carr (PFO0153) em cada uma das proteínas Nível 1 (Tabela 4), indicando que elas são provavelmente proteínas portadoras mitocondriais que transportam solutos para dentro e fora das mitocôndrias (site da web: pfam.xfam.org/family/PFO0153). O programa ProSite previu que CCP1 e as proteínas Nível 1 contêm domínios SOLCAR (PS50920) (Tabela 4), indicando que elas são provavelmente proteínas portadoras de soluto envolvidas na transferência de energia na membrana mitocondrial interna (site da web: prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/nicedoc.pl?PS50920). A ferramenta Phobius (site da web: phobius.sbc.su.se) foi usada para comparar domínios transmembranares preditos das proteínas àquelas de CCP1 (Figuras 1A-, Figuras 2A-C e Figuras 3A-G). O mapeamento de regiões transmembranares preditas de CCP1 e a comparação dos resultados aos ortólogos com a maior homologia foram usados para caracterizar adicionalmente as proteínas. Cada uma das proteínas Nível 1 compartilhou uma estrutura de domínio transmembranar predito muito similar ao CCP1, enquanto as proteínas Nível 2 foram consideravelmente diferentes de CCP1 nesse aspecto.

Alinhamento de sequência múltipla

[0123] Os alinhamentos de sequência múltipla de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii e os ortólogos descritos anteriormente foram preparados usando uma ferramenta de Alinhamento de Sequência Múltipla (EMBL-EBI; ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). As Figuras 4A-B e 5A-B mostram resultados de alinhamentos CLUSTAL usando parâmetros padrão (sequências de entrada desalinhada [não]; árvore guia de agrupamento tipo MBED [sim]; iteração de agrupamento tipo MBED [sim]; número de iterações combinadas [padrão (0)]; iterações de árvore guia máximas [padrão (-1)]; iterações HMM máximas [padrão (-1)]; e ordem [alinhada]).

Recursos comuns

[0124] Existem muitos recursos compartilhados pelos ortólogos que agora podem ser usados para identificar representativos adicionais à medida que dados de sequência de plantas adicionais se tornam disponíveis. Além de seu alto grau de identidade a CCP1 (60% ou maior), os ortólogos de CCP1 Nível 1 também compartilham uma arquitetura transmembranar muito similar (Figura 1A- |). Cada ortólogo de CCP1 Nível 1 tem quatro domínios transmembranares putativos com probabilidade de marcação posterior com pico em 0,4 ou maior. Os mesmos podem ter uma colocação muito similar em todos os ortólogos de CCP1 Nível 1 de acordo com os gráficos de Phobius, embora Phobius nem sempre preveja explicitamente um domínio transmembranar em cada caso de alta probabilidade. As predições de domínio transmembranar de Phobius são mostradas na Tabela 6. Apesar da ausência de alguns valores, as predições de domínio transmembranar de Phobius, junto aos gráficos da Figura 1A-,

permitem definir regiões comuns com probabilidade significativa de localização transmembranar. De modo inclusivo, essas faixas traspõem os resíduos 89-113, 129-154, 216-235 e 245-266. Alguns ortólogos de CCP1, tal como o exemplo de Volvox carteri f. nagariensis citado no presente documento, podem ter vãos que alteram os valores absolutos de uma ou mais dessas faixas, mas os domínios transmembranares estariam em posições relativas muito similares em um alinhamento de proteína múltipla. Logo, por exemplo, o gráfico Phobius para Volvox carteri f. nagariensis, conforme mostrado na Figura 1D, mostra o quarto domínio transmembranar deslocado para frente em relação aos outros. Conforme mostrado no alinhamento de sequência múltipla da Figura 4A, ocorre um vão de 12 resíduos entre os locais preitos dos terceiros e quartos domínios transmembranares para o ortólogo de CCP1 de Volvox carteri f. nagariensis em comparação à sequência correspondente de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii, explicando, assim, o deslocamento para frente.

Tabela 6. Domínios transmembranares putativos de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii e otólogos de CCP1 Nível 1. Organismo Domínio Domínio Domínio Domínio transmembra | transmembran | transmembra | transmembra nar 1 ar 2 nar 3 nar 4 Chlamydomon | 89-111 131-154 [esmas Erigeron 89-111 131-154 217-234 246-265 estas cs Zea Não aplicável * | Não aplicável * | Não aplicável * | Não aplicável * engguónão O e SS SSI Gonium 89-109 129-154 216-233 245-266 pectorale 16g646 Gonium 89-113 133-154 217-235 247-266 pectorale 16g661 Volvox carteri | Não aplicável * | Não aplicável * | Não aplicável * | Não aplicável * raguenão | E je e

Ettlia 89-111 131-154 217-234 246-265 Caem cvs Cosmos Não aplicável * | Não aplicável * | Não aplicável * | Não aplicável * pa SOUSA SS VS * Phobius não atribui uma região transmembranar apesar do gráfico na Figura 1G, |.

Exemplo 2. Testes funcionais para triagem de atividade tipo CCP1 codificado por gene de colheita

[0125] Ao definir uma classe de genes ou proteínas vegetais tais como aquelas com funções complementares, ou similares, a CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii, é benéfico utilizar uma triagem, seleção, ou outro teste que identifique candidatos como membros ou não membros da família útil. A triagem mais minuciosa dessa atividade ocorre em plantas inteiras por um período sustentado para assegurar que o rendimento e eficiência de captura de carbono sejam de fato aperfeiçoados. No entanto, uma triagem mais fácil em um sistema mais simples que requer menos tempo e ainda sirva como um bom preditor de aperfeiçoamento de rendimento em virtude de demonstração de função similar a CCP1 seria valiosa. Existem muitos sistemas nos quais uma triagem poderia ser razoavelmente conduzida, da qual alguns exemplos são os seguintes.

Levedura

[0126] Um sistema de modelo eucariótico útil é Saccharomyces cerevisiae, cujo genoma foi sequenciado e ao qual bancos de dados com informações funcionais como aqueles hospedados pela Universidade de Stanford (site da web: yeastgenome.org) estão disponíveis. Murantes nocaute e bibliotecas estão disponíveis para esse organismo, tal como a Yeast Knockout Collection em GE Life Sciences (site da web: dharmacon.gelifesciences.com). Candidatos tipo CCP1 podem, portanto, ser expressos em levedura usando técnicas de biologia molecular padrão para complementar vários mutantes transportadores mitocondriais de levedura a fim de classificar os candidatos de acordo com a função e identificar se são ou não similares em função a CCP1. Um exemplo dessa abordagem é encontrado em Herzig et al., Science 337:93- 96 (2012) no qual transportadores mitocondrias de camundongos complementaram mutantes de levedura deficientes na capacidade de transportar piruvato no mitocôndrio.

Escherichia coli

[0127] A bactéria Gram-negativa E. coli pode servir como um modelo para mitocôndrias, porque ambos os sistemas têm uma estrutura de membrana dupla. Usando técnicas padrão de biologia molecular e transformação bacteriana, ortólogos de CCP1 podem ser expressos funcionalmente em E. coli e o fenótipo resultante examinado. Mutantes de E. coli desprovidos de uma ou mais proteínas transportadoras podem ser especialmente úteis nesse aspecto. Mutantes de E. coli são amplamente disponíveis, tal como na coleção de Keio, que contém todos os mutantes de gene único que produzem células viáveis (site da web: cgsc2.biology.yale.edu/KeioList.php) Por exemplo, proteínas carreadoras ADP/ATP de várias plantas foram funcionalmente expressas e caracterizadas em E. coli (Haferkamp et al., Eur. J. Biochem. 269:3172 (2002)), onde o transporte de ADP e ATP radiomarcados foi medido.

Lactococcus lactis

[0128] A bactéria Gram-positiva Lactococcus lactis tem somente uma membrana de célula simples e é passível à manipulação genética. Portanto, técnicas de biologia molecular padrão podem ser utilizadas para introduzir homólogos de CCP1 nesse organismo como uma plataforma de triagem. Um exemplo dessa abordagem pode ser encontrado em Kunji et al., Biochimica et Biophysica Acta 1610:97 (2003), onde proteínas carreadoras mitocondriais eucarióticas foram funcionalmente expressas e caracterizadas usando transporte de ATP radiomarcado em células intactas e em vesículas membranares preparadas a partir de células inteiras.

Mitocôndrias isoladas

[0129] Existem métodos diretos para a medição de transporte de soluto mitocondrial, tais como aqueles esboçados em Palmieri and Klingenberg, Methods Enzymol. 56:279 (1979). Esses métodos podem ser usados, por exemplo, em mitocôndrias de levedura que expressam CCP1 vs. mitocôndrias de levedura tipo selvagem ou mitocôndrias isoladas de vários mutantes de levedura. Esses testes também podem ser realizados em mitocôndrias isoladas de Chlamydomonas reinhardtii (tipo selvagem vs. mutantes de CCP1).

Lipossomos

[0130] Proteínas portadoras mitocondriais podem ser expressas em altos níveis em um sistema fácil como E. coli e reconstituídas em lipossomos. Por exemplo, o carreador de aminoácido mitocondrial Arabidopsis thaliana AtmBAC1 foi expresso em E. coli, purificado, e reconstituído em vesículas de fosfolipídeo e foi mostrado transportando arginina, lisina, ornitina e histidina (Hoyos et al., Plant J. 33:1027 (2003)).

Chlamydomonas reinhardtii

[0131] Mostrou-se, por exemplo, por Pollock et al., Plant Mol. Biol. 56:125 (2004), que mutantes duplos de Chlamydomonas reinhardti' em CCP1 e CCP? sofrem de defeitos de crescimento em culturas a longo prazo (>48 horas). Portanto, um teste complementar pode ser usado com esses mutantes que definem uma complementação de CCP1 como a capacidade de um gene de complementar a perda de CCP1 e CCP2 em Chlamydomonas reinhardtii restaurando-se taxas de crescimento a longo prazo ao normal.

Exemplo 3. Transformação mediada por Agrobacterium de gene tipo CCP1 de Z. nicaraguensis em milho

[0132] Para transformação mediada por Agrobacterium de milho, um vetor binário contendo um promotor, o gene CCP1, e um terminador é construído e um cassete de expressão para um marcador selecionável, tal como o gene de bar que confere resistência a bialophos de herbicida, são incluídos.

[0133] pYTEN-5 (SEQ ID NO: 49; Figura 6) é um vetor de transformação projetado para transformação mediada por Agrobacterium de monocotiledôneas, incluindo milho. O gene CCP1 de Z. nicaraguensis é expressado a partir do promotor cab5/hsp70 híbrido, que consiste em promotor de proteína de ligação a/b de clorofila e milho (Sullivan et a/., 1989, Mol. Gen. Genet., 215, 431-440; esse promotor é equivalente ao promotor cab-m5 descrito no último trabalho de Becker et a/., 1992, Plant Mol. Biol. 20, 49-60), fundido ao intrão hsp70 (Patente nº U.S. 5.593.874). O plasmídeo também contém um cassete de expressão para o marcador selecionável de bar para seleção, conferindo resistência de material vegetal transgênico ao bialophos de herbicida.

[0134] Na preparação para transformação, pYTEN-5 é transformado em uma cepa de Agrobacterium tumefaciens, tal como a EHA101 de cepa de A. tumefaciens. Transformação mediada por Agrobacterium de máiz pode ser realizada seguindo um procedimento previamente descrito (Frame et al., 2006, Agrobacterium Protocols Wang K., ed., Vol. 1, pp 185 199, Humana Press) da seguinte forma.

[0135] Material vegetal: Plantas desenvolvidas em uma estufa são usadas como uma fonte de explante. Espigas foram colhidas 9 a 13 dias após a polinização e a superfície esterilizada com etanol a 80%.

[0136] Isolamento de explante, Infecção e Co-cultivo: Embriões zigóticos imaturos (1,2 a 2,0 mm) são assepticamente dissecados de caroços individuais e incubados em cultura EHA1I01 de cepa de A. tumefaciens (desenvolvidos em 5 ml de meio N6 suplementado com 100 uM de acetosiringona para estímulo dos genes vir bacterianos por 2 a 5 horas antes da transformação) em temperatura ambiente por 5 minutos. Os embriões infectados são transferidos ao Scutellum virado para cima em um meio de co-cultivo (meio solidificado de agar N6 contendo 300 mg/l de cisteína, 5 uM de nitrato de prata e 100 uM de acetosiringona) e incubados a 20ºC, no escuro por 3 dias. Os embriões são transferidos para o meio de descanso N6 contendo 100 mg/l de cefotaxima, 100 mg/l de vancomicina e 5 uM de nitrato de prata e incubados a 28 ºC, no escuro por 7 dias.

[0137] Seleção de calosidade: Todos os embriões são transferidos ao primeiro meio de seleção (o meio de descanso descrito anteriormente suplementado com 1,5 mg/l de bialaphos) e incubados a 28 ºC, no escuro por 2 semanas seguido pela subcultura em um meio de seleção contendo 3 mg/l de bialaphos. As partes em proliferação de calosidades são propagadas e mantidas por subcultura no mesmo meio a cada 2 semanas.

[0138] Regeneração e seleção de plantas: Linhagens de calosidades embriogênicas resistentes a bialaphos são transferidas em um meio de regeneração | (meio MS basal suplementado com 60 g/I de sacarose, 1,5 mg/l de bialaphos e 100 mg/l de cefotaxima e solidificado com 3 g/I de Gelrita) e incubados a 25ºC, no escuro por 2 a 3 semanas. Os embriões maduros formados durante esse período são transferidos ao meio de regeneração Il (igual ao meio de regeneração | com 3 mg/1 de bialaphos) para germinação no claro (25º C, 80 a 100 uE/m?/s de intensidade luminosa, 16/8-h de fotoperíodo). As plantas regeneradas estão prontas para transferência ao solo dentro de 10 a 14 dias.

Exemplo 4. Transformação de gene tipo CCP1 de Z. nicaraquensis em milho usando biolística

[0139] pYTEN-6 (SEQ ID NO: 50; Figura 7) é um cassete de DNA para transformação biolística (também conhecida como bombardeamento de micropartículas) de monocotiledôneas como milho. Projetou-se sem o uso de sequências de pragas de plantas facilitar a trajetória regulatória através de USDA-APHIS, e o material de cadeia principal de vetor estranho foi removido. USDA-APHIS proporcionou previamente uma opinião que a milho transformada através de procedimentos mediados biolísticos com DNA que não contém sequências de pragas de plantas não é considerada um material regulado (site da web: aphis.usda .gov/biotechnology/downloads/reg loi/13-242- 01 air response.pdf).

[0140] No fragmento de DNA pYTEN-6, o gene CCP1 de Z. nicaraguensis é expressado a partir do promotor cab5 de milho híbrida contendo o intrão HSP70 de milho. Há um gene NPTII, que codifica fosfotransferase de neomicina a partir de Escherichia coli K-12, conferindo resistência à canamicina para seleção de transformantes. O gene NPTII é expressado a partir do promotor de ubiquitina de milho com um 3'UTR do gene de ubiquitina de milho. Tornar-se- á aparente aos indivíduos versados na técnica que muitos marcadores selecionáveis podem ser usados que não sejam derivados de sequências de pragas de plantas para propósitos de seleção. Esses incluem genes mutantes de milho de acetolactato sintase/ácido acetoidróxi sintase (ALS/AHAS) conferindo resistência a uma faixa de herbicidas da família ALS de herbicidas, incluindo chlorsulfuron e imazethapyr; um gene mutante de sintase de 5- enolpiruvoilshikimato-3-fosfato (EPSPS) de milho, proporcionando resistência ao glifosato; bem como múltiplos outros marcadores selecionáveis que são todos revisados em Que et al., 2014 (Que, Q. et al., Front. Plant Sci. 05 August 2014; doi.org/10.3389/fpls.2014.00379).

[0141] O fragmento de DNA pYTEN-6 pode ser transformado em protoplastos de milho, calosidades, ou embriões maduros usando biolística conforme revisado em Que et al., 2014.

Exemplo 5. Transformação de gene tipo CCP1 de Z. nicaraquensis expressado a partir de um promotor específico de semente em milho usando biolísica

[0142] Em alguns casos, será vantajoso expressar CCP1 a partir de um promotor específico de semente. Podem existir muitos promotores específicos à semente conhecidos e se tornará aparente aos indivíduos versados na técnica que os promotores específicos à semente de múltiplas fontes diferentes podem ser usados para praticar a invenção, incluindo os promotores específicos à semente listados na Tabela 2.

[0143] O fragmento de DNA pYTEN-7 (SEQ ID NO: 51; Figura 8) é projetado para transformação biolística de monocotiledôneas como milho. O mesmo contém o promotor quimérico A27znGIb1i (Número de Acesso EFO64989) que consiste em uma porção do promotor do gene de zeina gama 27 kDa de Zea mays e uma porção do promotor do gene de globulina-1 de Zea mays (Shepard & Scott, 2009, Biotechnol. Appl. Biochem., 52, 233-243) controlando a expressão do gene CCP1. Esse promotor foi mostrado por Shepard and Scott como sendo ativo tanto nos embriões como no endosperma de caroços de milho. O gene CCP1 é flanqueado na extremidade 3' pelo 3' UTR, polyA, e terminador do gene globulina-1 (Acesso AHOO01354.2). O mesmo também contém o gene NPTII expressado a partir do promotor de ubiquitina de milho com um 3UTR do gene de ubiquitina de milho, para seleção de transformantes.

[0144] O fragmento de DNA pYTEN-7 pode ser transformado em protoplastos de milho, calosidades, ou embriões imaturos usando biolítica conforme revisado em Que et al, 2014.

Exemplo 6. Transformação de gene tipo CCP1 de Z. nicaraquensis expressado a partir de um promotor específico de semente em protoplastos de canola

[0145] A transformação de protoplastos de Brassica napus pode ser realizada da seguinte forma.

[0146] Para expressar o gene tipo CCP1 de Z. nicaraguensis em canola, um fragmento de DNA linear, py TEN-8 (SEQ ID NO: 52; Figura 9) é preparado contendo um cassete de expressão para CCP1, controlado pelo promotor de oleosina de soja (SEQ ID NO: 48) e 3' UTR do gene de oleosina de soja (ID de gene de oleosina de soja Glyma.16G071800), bem como um cassete de expressão para a barra marcadora selecionável, controlado pelo promotor de actina de soja (SEQ ID NO: 42) e 3' UTR do gene de actina de soja (ID de gene de actina de soja Glyma.19G147900). o gene bar confere resistência à planta transgênica aos herbicidas bialophos ou fosfinotricina. O fragmento pYTEN-8 linear é transformado em protoplastos de canola da seguinte forma.

[0147] Isolamento de protoplasto: Sementes de Brassica napus são superficialmente esterilizadas com etanol a 70% por 2 minutos seguido por uma agitação suave em uma solução de hipoclorito a 0,4% por 20 minutos. As sementes são lavadas três vezes em água destilada dupla, e plantadas ou esterilizadas em meio 1/2 MS em placas Petri que são colocadas sem as tampas em jarras MAGENTA estéreis. Os protoplastos são isolados de 40 folhas recentemente em expansão de plantas Brassica. O veio intermediário é removido e a superfície abaxial das folhas é suavemente raspada com um bisturi esterilizado. As folhas são, então, lançadas com lado abaxial para baixo em placas Petri contendo 15 ml de solução de Enzima B2 (sais B5, 1% Onozuka R 10, Macerozima R 10 a 0,2%, sacarose a 13%, 5mMM de CaClr:2H20, Polivinilpirrolidona a 0,5%, 1 mg/L de NAA , 1 mg/L de 2, 4-D, 1 mg/L de BA, MES 0,05%, pH 6,0). As placas Petri são vedadas com PARAFILM e as folhas incubadas de um dia para o outro a 22 ºC no escuro sem agitação. Após a incubação de um dia para o outro, as placas são suavemente agitadas a mão e a incubação continuou por 15 a 20 minutos em um agitador giratório ajustado em rpm. O material digerido, que consiste em uma suspensão de protoplasto bruto, é, então, filtrado através de um funil revestido com 63 um de tela de náilon e o filtrado coletado em tubos de centrifuga falcon de 50 ml. Um volume igual de solução de lavagem B5 a 17% (sais B5, SMM de CaCl2:2H20, sacarose a 17%, MÊS a 0,06%, pH 6,0) é adicionado ao filtrado e centrifugado em 100 g por 10 minutos. A fração enriquecida com protoplasto (-4 ml) flutuando sob a forma de um anel é cuidadosamente removida e transferida a tubos FALCON de 15 ml novos e 11 ml de meio WW5-2 (0,1 M de CaCl2:2H20, 0,2 M de NaCl, 4 MM de KCl, Glicose a 0,08%, MES a 0,1%, pH 6,0) são adicionados por tubo. À suspensão resultante é suavemente misturada por inversão e, então, centrifugada em 100 g por 5 minutos. Após centrifugação, o sobrenadante é cuidadosamente descartado e o pélete que consiste em uma fração de protoplasto enriquecido é retido. Os protoplastos são lavados duas vezes com uma solução WWB5-2 seguida por centrifugação em 100 g e ressuspensos em 5 ml de meio WW5-2. A densidade de protoplastos é contada com um hemocitômetro usando uma gota pequena da suspensão de protoplasto. À suspensão é resfriada em um refrigerador (2-8 ºC) por 40 a 45 minutos.

[0148] Transfecção e cultura de protoplasto Brassica napus: Para transfecção de protoplasto, os protoplastos incubação a frio são peletizados por centrifugação em 100 g por 3 minutos e, então, ressuspensos em meio WMMM (15 mM de MgCl2-6H20, 0,4 M de Manitol, 0,1 M de (CaNO3)2, MES a 0,1%, pH 6) a uma densidade de 2 x 10º protoplastos por ml. 500 ul de suspensão de protoplasto são dispensados em tubos FALCON de 15 ml e 50 ul de uma mistura que consiste em 50 ug de DNA de fragmento de DNA linear pYTEN-8 são adicionados à suspensão de protoplasto e misturados por agitação. 500 ul de PEGB2 (40% PEG 4000, 0,4 M de Manitol, 0,1 M de Nitrato de Cálcio, MES a 0,1%, pH 6,0) são adicionados suavemente à mistura de DNA de protoplasto enquanto agita continuamente o tubo. A mistura é incubada por 20 minutos com agitação suave periódica. De modo subsequente, o meio WW5-2 é gradualmente adicionado em dois estágios, primeiro uma alíquota de 5 ml de WW5-2 é adicionada à mistura de protoplasto que é, então, deixada incubar por 10 minutos seguida pela adição de uma segunda alíquota de 5 ml de solução de WW5-2 e incubação por 10 minutos. Após a segunda incubação, os protoplastos são cuidadosamente ressuspensos e, então, peletizados por centrifugação. O pélete de protoplasto é ressuspenso em 12 ml de solução de WW5-2 em seguida peletizado por centrifugação em 100 g por 5 minutos. O pélete é lavado mais uma vez em 10 ml de WW5-2 em seguida peletizado por centrifugação em 100 g por 3 minutos. O pélete de protoplasto é ressuspenso em meio K3P4 (sais basais de Kao, Glicose a 6,8%, MES a 1%, 0,5% Ficoll 400, 2 mM de CaCl2:2H20, 1 mg/L de 2, 4-D, 1 mg/L de NAA, 1 mg/L de Zeatina, pH 5,8, 200 mg/L de Carbenicilina, 200 mg/L de Cefotaxima) em uma densidade de 1 x 10º protoplastos por ml e 1,5 ml da suspensão é dispensada por placa petri de 60 x mm. As placas são vedadas com PARAFILM e mantidas em caixas de plástico com tampas opacas a 22ºC, 16 h de fotoperíodo, sob luzes fluorescentes de dímero (25 vEm? s”).

[0149] Brassica napus, Proliferação de caules e regeneração de linhagens: Após 4 a 5 dias as culturas de protoplasto são carregadas com 1 a 1,25 ml de meio que consiste em uma mistura 1:1 de meio K3P4 e meio EmBed BI (sais MS Basal, sacarose a 3,4%, MES a 0,05%, 1 mg/L de NAA, 1 mg/L de 2,4-D e 1 mg/L de BA, pH 6,0). As placas são novamente vedadas e colocadas sob luz de dímero por 1 a 2 dias e, então, sob luz média (60-80 vEm? s'). Após

4 a 5 dias, os protoplastos são carregados com 4,5 ml de uma mistura 3:1 de K3P4: Meio Embed Bl. Os conteúdos da placa são, então, transferidos para uma placa 100 x 75 mm e 3 ml de meio Embed Bl morno contendo agarose SeaPlaque a 2,1% são adicionados à suspensão de protoplasto. Os conteúdos da placa são rodopiados para misturar gentilmente a suspensão de protoplasto com os meios semissólidos e as placas são deixadas solidificar na tampa de fluxo de cultura de tecido. As placas são vedadas e culturadas sob condições de luz de dímero por uma semana. Após 7 a 9 dias, as culturas de protoplasto impregnadas em cada placa são cortadas em 6 a 8 cunhas e transferidas em duas placas de meio B1 de Proliferação (sais MS Basal, sacarose a 3,4%, MES a 0,05%, 1 mg/L de NAA, 1 mg/L de 2,4-D e 1 mg/L de BA, pH 6,0, agarose SeaPlaque a 0,8%, 200 mg/L de Carbenicilina, 200 mg/L de Cefotaxima) com 60 mg/L de L-fosfinotricina para seleção. As placas de proliferação são incubadas sob luz de dímero durante os primeiros 1 a 2 dias e, então, movidas para luz brilhante (150 uEm? s). As colônias de sobrevivência verdes são obtidas após 3 a 4 semanas no ponto em que são transferidas para placas B1 de proliferação frescas por um período adicional de 2 a 3 semanas. Grandes caules verdes são transferidos a Placas B2 de Regeneração (sais MS Basal, sacarose a 3%, 30 uM de AgNO;, polivinilpirrolidona a 0,05%, MES a 0.05%, 0,1 mg/L de NAA, 5 mg/ | de N6-(2-isopentenil)adenina (2-iP), 0,1 ug/L de GA3, pH 5,8, agarose SeaPlaque a 0,8%, 100 mg/L de Carbenicilina, 100 mg/L de Cefotaxima) com 10 mg/L de L-fosfinotricina para seleção. Os caules são transferidos para placas B2 de Regeneração frescas a cada 3 a 4 semanas. Brotos com morfologia normal são transferidos a um meio de enraizamento (sais B5 + 0,1 mg/L de NAA) e incubados sob conduções de luz de dímero. Plântulas são colocadas em vasos em uma mistura sem terra (Sunshine Mix 4) em vasos de 15 cm (6 polegadas) e irrigadas com fertilizante NPK (20-20-20). As plântulas são aclimatizadas sob copos plásticos por 5 a 6 dias e mantidas em espaço de crescimento a 22 ºC/18 ºC e fotoperíodo de 16 horas sob luz de 200-300 vEm? s“.

[0150] Permite-se que as plantas assentem as sementes (semente T1). As sementes T1 são colhidas e plantadas em solo e desenvolvidas em uma estufa. As plantas são desenvolvidas até a maturidade e a semente T2 é colhida. O rendimento de sementes por planta e teor de óleo das sementes são medidos.

Exemplo 7. Transformação de gene tipo CCP1 de Z. nicaraquensis expressado a partir de um promotor específico de semente em soja usando biolística

[0151] Um vetor contendo o gene CCP1 de Z. nicaraguensis sob o controle de um promotor específico de semente do gene de isoforma A de olesina de soja é construído. Plasmídeo pYTEN-9 (SEQ ID NO: 53; Figura 10) é um derivado do vetor linear pJAZZ (Lucigen, Inc.) e foi construído usando técnicas de clonagem padrão aos indivíduos versados na técnica. O vetor contém o gene CCP1 de Z. nicaraguensis sob o controle de um promotor específico de semente do gene de isoforma A de olesina de soja. O gene CCP1 pode ter seu uso de códon nativo ou pode ser códon otimizado para expressão em soja. No presente documento, o uso de códon nativo do gene CCP1 de Z. nicaraguensis é realizado. A clonagem é projetada para permitir a excisão do cassete de expressão CCP1, usando digestão por restrição. A digestão de pYTEN-9 com Smal liberará um cassete de 2,19 kb contendo o cassete de expressão que consiste em promotor de oleosina, CCP1, e terminador de oleosina de modo que nenhuma cadeia principal de vetor seja integrada à planta.

[0152] O fragmento de DNA purificado contendo o cassete de expressão de CCP1 é co-bombardeado com DNA que codifica um cassete de expressão para o gene de resistência à higromicina através de biolística em culturas embriogênicas de cultivares de soja Glycine max X5 e Westag97, para obter plantas transgênicas. O gene de resistência à higromicina é expressado a partir de um promotor vegetal, como o promotor de actina de soja (SEQ ID NO: 42) e o 3º UTR do gene de actina de soja (ID de Gene de actina de soja Glyma.19G147900).

[0153] O protocolo de transformação, seleção e regeneração de plantas é adaptado a partir de Simmonds (2003) (Simmonds, 2003, Genetic Transformation of Soybean with Biolistics. In: Jackson JF, Linskens HF (eds) Genetic Transformation of Plants. Springer Verlag, Berlin, pp 159—174) e é realizado da seguinte forma.

[0154] Indução de Manutenção de Culturas Embriogênicas Proliferativas: vasos imaturos, contendo embriões com 3 a 5 mm de comprimento, sã colhidos a partir de plantas hospedeiras a 28/24 ºC (dia/noite), fotoperíodo de 15 h em uma intensidade luminosa de 300 a 400 umol m? s!. Os vasos são esterilizados por for 30 s em etanol a 70% seguido por 15 min em hipoclorito de sódio a 1% [com 1 a 2 gotas de Tween 20 (Sigma, Oakville, ON, Canadá)] e três enxágues em água esterilizada. O eixo embriônico é excisado e explantes são culturados com a superfície abaxial em contato com o meio de indução [sais MS, vitaminas B5 (Gamborg OL, Miller RA, Ojima K. Exp Cell Res 50:151-158), sacarose a 3%, 0,5 mg/L de BA, pH 5,8), 1,25 a 3,5% de glicose (concentração varia com genótipo), 20 mg/l de 2,4-D, pH 5,7]. Os explantes, mantidos a 20ºC em um fotoperíodo de 20 h sob luzes fluorescentes brancas frias a 35 a 75 umol m? s, são subculturados quatro vezes em intervalos de 2 semanas. Os agrupamentos embriogênicos, observados após 3 a 8 semanas de cultura dependendo do genótipo, são transferidos para frascos Erlenmeyer de 125 ml contendo 30 ml de meio de proliferação de embriões contendo 5 mM de asparagina, sacarose a 1 a 2,4% (concentração é dependente de genótipo), 10 mg/l de 2,4-D, pH 5,0 e culturados conforme acima em 35 a 60 umol m? s de luz em um agitador giratório em 125 rpm. O tecido embriogênico (30-60 mg) é selecionado, usando um microscópio invertido, para subcultura a cada 4 a 5 semanas.

[0155] Transformação: Culturas são bombardeadas 3 dias após subcultura. Os agrupamentos embriogênicos são borrados em filtro de papel Whatman esterilizado para remover o meio líquido, colocado dentro de uma placa Petri 10 x 30-mm em um retentor de tecido 2 x 2 cm? (PeCap, tamanho de poro 1.005 um, Band SH Thompson and Co. Ltd. Scarborough, ON, Canadá) e revestidos com um segundo retentor de tecido que é, então, gentilmente pressionado para baixo para manter os agrupamentos em posição. Imediatamente antes do primeiro bombardeamento, o tecido é seco a ar na capa de fluxo de ar laminar com a tampa da placa Petri removida por não mais de 5 minutos. O tecido é virado, seco conforme anteriormente, bombardeado no segundo lado ao frasco de cultura. As condições de bombardeamento usadas para o Sistema de Entrega de Partículas PDS-I000/He Biolísticas são as seguintes: pressão a vácuo em câmara de 737 mm Hg, 13 mm de distância entre o disco de ruptura (Bio-Rad Laboratories Ltd., Mississauga, ON, Canadá) e o microcarreador. O primeiro bombardeamento usa discos de ruptura de 900 psi e uma distância de voo de microcarreador de 8,2 cm, e o segundo bombardeamento usa discos de ruptura de 1100 psi e distância de voo de microcarreador de 11,4 cm. A precipitação de DNA sobre partículas de ouro com

1,0 um de diâmetro é realizada da seguinte forma: 2,5 ul de 100 ng/y1 de DNA de inserção de pYTEN-9 e 2,5 ul de 100 ng/ul de DNA marcador selecionável (cassete para seleção de higromicina) são adicionados a partículas de ouro de 3 mg suspensas em 50 ul de dH2O esterilizada e em vórtice por 10 s; 50 ul de 2,5 M de CaC12 são adicionados, em vórtice por 5 s, seguido pela adição de 20 ul de 0,1 M de espermidina que também se encontra em vórtice por 5 s. O ouro é, então, permitido assentar ao fundo do tubo de microcentrífuga (5 a 10 min) e o fluido sobrenadante é removido. O ouro/DNA é ressuspenso em 200 ul de etanol a 100%, permitido assentar e o fluido sobrenadante é removido. À lavagem de etanol! é repetida e o fluido sobrenadante é removido. O sedimento é ressuspenso em 120 ul de etanol a 100% e alíquotas de 8 ul são adicionadas a cada microcarreador. O ouro é ressuspenso antes de cada alíquota ser removida. Os microcarreadores são colocados sob vácuo para garantir uma evaporação completa de etanol (cerca de 5 min).

[0156] Seleção: O tecido bombardeado é culturado em um meio de proliferação de embriões descrito anteriormente por 12 dias antes da subcultura ao meio de seleção (meio de proliferação de embriões contém 55 mg/l de higromicina adicionados aos meios em autoclave). O tecido é sub-culturado 5 dias depois e semanalmente pelas 9 semanas seguintes. Colônias verdes (eventos transgênicos putativos) são transferidas a um poço contendo 1 ml de meio de seleção em uma placa de múltiplos poços com 24 poços que é mantida e um agitador de frasco conforme anteriormente. O meio em placas de múltiplos poços é substituído por um meio novo a cada 2 semanas até que as colônias tenham aproximadamente 2 a 4 mm de diâmetro com embriões proliferativos, sendo que nesse momento são transferidos aos frascos Erlenmeyer de 125 ml! contendo 30 ml de meio de seleção. Uma porção dos pró-embriões de eventos transgênicos é colhida para examinar a expressão genética por RT-PCR.

[0157] Regeneração de plantas: Maturação de embriões é realizada, sem seleção, nas condições descritas para indução de embriões. Agrupamentos embriogênicos são culturados em placas Petri contendo meio de maturação (sais MS, vitaminas B5, maltose a 6%, goma gelana gelrite a 0,2% (Sigma), 750 mg/l de MgCl2, pH 5,7) com carvão ativado a 0,5% por 5 a 7 dias e sem carvão ativado pelas 3 semanas seguintes. Os embriões (10 a 15 por evento) com meristemas apicais são selecionados sob um microscópio de dissecação e culturados e um meio similar contendo phytagar a 0,6% (Gibco, Burlington, ON, Canadá) como o agente de solidificação, sem o MgCl2 adicional, por outras 2 a 3 semanas ou até que os embriões se tornem amarelo pálidos em cor. Uma porção dos embriões de eventos transgênicos após tempos variáveis em gelrite é colhida para examinar a expresso genética por RT-PCR.

[0158] Embriões maduros são dissecados transferindo-se embriões de cada evento para esvaziar os fundos das placas Petri que são colocados dentro de caixas Magenta (Sigma) contendo várias camadas de filtro de papel Whatman esterilizado inundado com água esterilizada, para 100% de umidade relativa. As caixas Magenta são revestidas e mantidas no escuro a 20ºC por 5 a 7 dias. Os embriões são germinados em um meio B5 sólido contendo sacarose a 2%, gelrite a 0,2% e MgCl2 a 0,075% em placas Petri, em uma câmara a 20ºC, fotoperíodo de 20 h sob luzes fluorescentes brancas frias em 35-75 umol m? s 1, Os embriões germinados com folhas unifoliadas ou trifoliadas são plantados em solo artificial (Mistura Sunshine No. 3, SunGro Horticulture Inc., Bellevue, WA, EUA), e revestidos com uma tampa plástica transparente para manter a umidade alta. Os lisos são colocados em um armário de crescimento controlado a 26/24 ºC (dia/noite), fotoperíodo de 18 h em uma intensidade luminosa de 150 umol m? s". No estágio de 2-3 trifoliadas (2 a 3 semanas), as plântulas com raízes fortes são transplantadas para vasos contendo uma mistura 3:1:1:1 de ASB Original Grower Mix (uma mistura à base de turfa de Greenworld, ON, Canadá):solo: areia: perlita e desenvolvidas em um fotoperíodo de 18 h em uma intensidade luminosa de 300 a 400 umolm? s*-

[0159] Sementes T1 são colhidas e plantadas em terra e desenvolvidas em um armário de crescimento controlado a 26/24 ºC (dia/noite), 18 h de fotoperíodo em uma intensidade leve 300-400 umol m? s“!. Plantas são desenvolvidas em mundial à maturidade de semente T2 são colhidas. O rendimento de semente por planta e teor de óleo das sementes é medido.

MODALIDADES EXEMPLIFICADORAS

[0160] A seguir, descrevem-se modalidades exemplificadoras da planta terrestre geneticamente modificada que expressa uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta conforme revelado no presente documento.

[0161] Modalidade A. Planta terrestre geneticamente modificada que expressa uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta, sendo que a planta terrestre geneticamente modificada compreende um gene modificado para a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta, em que: a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é um ortólogo de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1 derivado a partir de uma planta terrestre de origem; a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta fica localizada nas mitocôndrias da planta terrestre geneticamente modificada com base em um sinal de direcionamento mitocondrial intrínseco à proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta; o gene modificado compreende (i) um promotor e (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta; o promotor é não cognato em relação à sequência de ácido nucleico; e o gene modificado é configurado de modo que a transcrição da sequência de ácido nucleico seja iniciada a partir do promotor e resulta na expressão da proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta.

[0162] Modalidade B. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a modalidade A, em que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é um ortólogo de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1 com base em compreender: (i) (a) um resíduo de prolina na posição 268, (b) um resíduo de aspartato ou resíduo de glutamina na posição 270, (c) um resíduo de lisina ou resíduo de arginina na posição 273, e (d) um resíduo de serina ou resíduo de treonina na posição 274, com numeração de posições relativas a CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1, e (ii) uma identidade geral de pelo menos 15%.

[0163] Modalidade C. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a modalidades A ou B, em que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é um ortólogo de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1 com base em compreender: (i) (a) um resíduo de glicina na posição 301, (b) um resíduo de glicina na posição 308,

e (c) um resíduo de arginina na posição 315, com numeração de posições relativas a CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1, e (ii) uma identidade geral de pelo menos 15%.

[0164] Modalidade D. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das modalidades A-C, em que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é um ortólogo de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1 com base em compreender: (i) uma ou mais sequências de assinatura de CCP1 Nível 1 de (a) LLGIHFP (SEQ ID NO: 18) na posição 104-110, (b) LRDMQGYAWFF (SEQ ID NO: 19) na posição 212-222, (c) AGFGLWGSMF (SEQ ID NO: 20) na posição 258-267, ou (d) AIPVNA (SEQ ID NO: 21) na posição 316-321, com numeração de posições relativas a CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1, e (ii) uma identidade geral de pelo menos 60%.

[0165] Modalidade E. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das modalidades A-D, em que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende pelo menos uma dentre (a) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea nicaraguensis, (b) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Erigeron breviscapus, (c) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Poa pratensis, ou (d) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Cosmos bipinnatus.

[0166] Modalidade F. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a modalidade E, em que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea nicaraguensis.

[0167] Modalidade G. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das modalidades A-D, em que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende pelo menos uma dentre (a) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea nicaraguensis de SEQ ID NO: 7, (b) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Erigeron breviscapus de SEQ ID NO: 6, (c) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Poa pratensis de SEQ ID NO: 8, ou (d) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Cosmos bipinnatus de SEQ ID NO: 9.

[0168] Modalidade H. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a modalidade G, em que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea nicaraguensis de SEQ ID NO: 7.

[0169] Modalidade |. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das modalidades A-D, em que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende uma ou mais dentre (a) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea mays, (b) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Triticum aestivum, (c) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Solanum tuberosum, (d) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta /ycine max, (e) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Oryza sativa, ou (f) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Sorghum bicolor.

[0170] Modalidade J. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a modalidade |, em que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea mays.

[0171] Modalidade K. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das modalidades A-D, em que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende uma ou mais dentre (a) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea mays de SEQ ID NO: 16, (b) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Triticum aestivum de SEQ ID NO: 12, (c) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Solanum tuberosum de SEQ ID NO: 13, (d) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Glycine max de SEQ ID NO: 14, (e) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Oryza sativa de SEQ ID NO: 15, ou (f) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Sorghum bicolor de SEQ ID NO: 17.

[0172] Modalidade L. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a modalidade K, em que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea mays de SEQ ID NO: 16.

[0173] Modalidade M. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das modalidades A-L, em que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta fica localizada nas mitocôndrias da planta terrestre geneticamente modificada a uma extensão maior que aos cloroplastos da planta terrestre geneticamente modificada por um fator de pelo menos 2, pelo menos 5, ou pelo menos 10.

[0174] Modalidade N. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das modalidades A-M, em que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta consiste essencialmente e uma sequência de aminoácido que seja idêntica àquela de uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta tipo selvagem.

[0175] Modalidade O. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das modalidades A-N, em que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é heteróloga em relação à planta terrestre geneticamente modificada.

[0176] Modalidade P. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das modalidades A-N, em que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é homologa em relação à planta terrestre geneticamente modificada.

[0177] Modalidade Q. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das modalidades A-P, em que o promotor é um promotor constitutivo.

[0178] Modalidade R. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das modalidades A-P, em que o promotor é um promotor específico de semente.

[0179] Modalidade S. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das modalidades A-R, em que o gene modificado é integrado em DNA genômico da planta terrestre geneticamente modificada.

[0180] Modalidade T. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das modalidades A-S, em que o gene modificado é estavelmente expresso na planta terrestre geneticamente modificada.

[0181] Modalidade U. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com quaisquer modalidades A-T, em que a planta terrestre geneticamente modificada (i) expressa a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta em um modo específico de semente, e (ii) expressa outra proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta de forma constitutiva, sendo que as outras proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta também correspondem a um ortólogo de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1 derivado a partir de uma planta terrestre de origem.

[0182] Modalidade V. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com quaisquer modalidades A-U, em que a planta terrestre geneticamente modificada te uma taxa de assimilação de CO>2 que seja pelo menos 5% maior, pelo menos 10% maior, pelo menos 20% maior, ou pelo menos 40% maior, que para uma planta terrestre de referência correspondente que não compreende o gene modificado.

[0183] Modalidade W. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com quaisquer modalidades A-V, em que a planta terrestre geneticamente modificada tem uma taxa de transpiração que seja pelo menos 5% menor, pelo menos 10% menor, pelo menos 20% menor, ou pelo menos 40% menor, do que para uma planta terrestre de referência correspondente que não compreende o gene modificado.

[0184] Modalidade X. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com quaisquer modalidades A-W, em que a planta terrestre geneticamente modificada tem um rendimento de semente que seja pelo menos 5% maior, pelo menos 10% maior, pelo menos 20% maior, pelo menos 40% maior, pelo menos 60% maior, ou pelo menos 80% maior, do que para uma planta terrestre de referência correspondente que não compreende o gene modificado.

[0185] Modalidade Y. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com quaisquer modalidades A-X, em que a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta C3.

[0186] Modalidade Z. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com quaisquer modalidades A-X, em que a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta C4.

[0187] Modalidade AA. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com quaisquer modalidades A-X, em que a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta de colheita de alimentos selecionada a partir do grupo que consiste em milho, trigo, aveia, cevada, soja, painço, sorgo, batata, vagens, feijão, tomate e arroz.

[0188] Modalidade BB. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a modalidade AA, em que a planta terrestre geneticamente modificada é milho.

[0189] Modalidade CC. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com quaisquer modalidades A-X, em que a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta de colheita de forragem selecionada a partir do grupo que consiste em milho de silagem, feno e alfalfa.

[0190] Modalidade DD. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a modalidade CC, em que a planta terrestre geneticamente modificada é milho de silagem.

[0191] Modalidade EE. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com quaisquer modalidades A-X, em que a planta terrestre geneticamente modificada é uma colheita de oleaginosas selecionada a partir do grupo que consiste em camelina, espécie Brassica (por exemplo, B. napus (canola), B. rapa, B. juncea e B. carinata), crcambe, soja, girassol, açafrão, palmeira oleaginosa, linho e algodão.

[0192] A invenção foi descrita com referência às modalidades exemplificadoras descritas anteriormente. Modificações e alterações ocorrerão a terceiros mediante uma leitura e compreensão deste relatório descritivo. Modalidades exemplificadoras que incorporam um ou mais aspectos da invenção são destinadas a incluir todas essas modificações e alterações na medida em que se enquadram no escopo das reivindicações anexas.

REFERÊNCIAA UMA “LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS,” UMA TABELA OU UM APÊNDICE DE LISTAGEM EM PROGRAMA DE COMPUTADOR SUBMETIDO COMO UM ARQUIVO DE TEXTO ASCII

[0193] O material no arquivo de texto ASCII, nomeado “YTEN- 57557 WO-Sequences ST25.txt”, criado em 12 de junho de 2018, tamanho de arquivo de 159.744 bytes, se encontra incorporado ao presente documento a título de referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Planta terrestre geneticamente modificada, CARACTERIZADA pelo fato de que expressa uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta, a planta terrestre geneticamente modificada compreende um gene modificado para a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta, em que: a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é um ortólogo de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1 derivado a partir de uma planta terrestre de origem; a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta está localizada nas mitocôndrias da planta terrestre geneticamente modificada com base em um sinal de direcionamento mitocondrial intrínseco à proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta; o gene modificado compreende (i) um promotor e (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta; o promotor é não cognato em relação à sequência de ácido nucleico; e o gene modificado é configurado de modo que a transcrição da sequência de ácido nucleico seja iniciada a partir do promotor e resulta na expressão da proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta.

2. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é um ortólogo de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1 com base em compreender: (i) (a) um resíduo de prolina na posição 268, (b) um resíduo de aspartato ou resíduo de glutamina na posição 270, (c) um resíduo de lisina ou resíduo de arginina na posição 273, e (d) um resíduo de serina ou resíduo de treonina na posição 274, com numeração de posições relativas a CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1, e (ii) uma identidade geral de pelo menos 15%.

3. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é um ortólogo de CCP1 de

Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1 com base em compreender: (i) (a) um resíduo de glicina na posição 301, (b) um resíduo de glicina na posição 308, e (c) um resíduo de arginina na posição 315, com numeração de posições relativas a CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1, e (ii) uma identidade geral de pelo menos 15%.

4. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é um ortólogo de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1 com base em compreender: (i) uma ou mais sequências de assinatura de CCP1 Nível 1 de (a) LLGIHFP (SEQ ID NO: 18) na posição 104-110, (b) LRDMQGYAWFF (SEQ ID NO: 19) na posição 212-222, (c) AGFGLWGSMEF (SEQ ID NO: 20) na posição 258-267, ou (d) AIPVNA (SEQ ID NO: 21) na posição 316-321, com numeração de posições relativas a CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 1, e (ii) uma identidade geral de pelo menos 60%.

5. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende pelo menos uma dentre (a) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea nicaraguensis, (b) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Erigeron breviscapus, (c) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Poa pratensis, ou (d) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Cosmos bipinnatus.

6. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea nicaraguensis.

7. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende pelo menos uma dentre (a) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea nicaraguensis de SEQ ID NO: 7, (b) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Erigeron breviscapus de SEQ ID NO: 6, (c) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Poa pratensis de SEQ ID NO: 8, ou (d) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Cosmos bipinnatus de SEQ ID NO: 9.

8. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea nicaraguensis de SEQ ID NO: 7.

9. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende uma ou mais dentre (a) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea mays, (b) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Triticum aestivum, (c) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Solanum tuberosum, (d) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Glycine max, (e) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Oryza sativa, ou (f) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Sorghum bicolor.

10. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea mays.

11. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende uma ou mais dentre (a) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea mays de SEQ ID NO: 16, (b) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Triticum aestivum de SEQ ID NO: 12, (c) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Solanum tuberosum de SEQ ID NO: 13, (d) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Glycine max de SEQ ID NO: 14, (e) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Oryza sativa de SEQ ID NO: 15, ou (f) uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Sorghum bicolor de SEQ ID NO: 17.

12. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta compreende uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta Zea mays de SEQ ID NO: 16.

13. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta está localizada nas mitocôndrias da planta terrestre geneticamente modificada a uma extensão maior que aos cloroplastos da planta terrestre geneticamente modificada por um fator de pelo menos 2, pelo menos 5, ou pelo menos 10.

14. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta consiste essencialmente em uma sequência de aminoácido que é idêntica àquela de uma proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta tipo selvagem.

15. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é heteróloga em relação à planta terrestre geneticamente modificada.

16. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta é homóloga em relação à planta terrestre geneticamente modificada.

17. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o promotor é um promotor constitutivo.

18. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o promotor é um promotor específico de semente.

19. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene modificado é integrado ao DNA genômico da planta terrestre geneticamente modificada.

20. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene modificado é expresso de forma estável na planta terrestre geneticamente modificada.

21. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta terrestre geneticamente modificada (i) expressa a proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta em um modo específico de semente, e (ii) expressa outra proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta de forma constitutiva, sendo que a outra proteína transportadora mitocondrial semelhante a CCP1 de planta também corresponde a um ortólogo de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii' de SEQ ID NO: 1 derivado a partir de uma planta terrestre de origem.

22. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta terrestre geneticamente modificada tem uma taxa de assimilação de CO> que é pelo menos 5% maior, pelo menos 10% maior, pelo menos 20% maior, ou pelo menos 40% maior, do que para uma planta terrestre de referência correspondente que não compreende o gene modificado.

23. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta terrestre geneticamente modificada tem uma taxa de transpiração que é pelo menos 5% menor, pelo menos 10% menor, pelo menos 20% menor, ou pelo menos 40% menor, do que para uma planta terrestre de referência correspondente que não compreende o gene modificado.

24. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta terrestre geneticamente modificada tem um rendimento de semente que é pelo menos 5% maior, pelo menos 10% maior, pelo menos 20% maior, pelo menos 40% maior, pelo menos 60% maior, ou pelo menos 80% maior, do que para uma planta terrestre de referência correspondente que não compreende o gene modificado.

25. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta C3.

26. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta C4.

27. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta de colheita de alimentos selecionada a partir do grupo que consiste em milho, trigo, aveia, cevada, soja, painço, sorgo, batata, vagens, feijão, tomate e arroz.

28. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta terrestre geneticamente modificada é milho.

29. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta de colheita de forragem selecionada a partir do grupo que consiste em milho de silagem, feno e alfafa.

30. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta terrestre geneticamente modificada é milho de silagem.

31. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta de colheita de oleaginosas selecionada a partir do grupo que consiste em camelina, espécie Brassica (por exemplo, B. napus (canola), B. rapa, B. juncea e B. carinata), crambe, soja, girassol, açafrão, óleo de palma, linho e algodão.