BR112021004034A2 - plantas terrestres geneticamente modificadas que expressam uma proteína de rendimento de sementes aumentado e/ou um rna de rendimento de sementes aumentado - Google Patents

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Abstract

PLANTAS TERRESTRES GENETICAMENTE MODIFICADAS QUE EXPRESSAM UMA PROTEÍNA COM RENDIMENTO DE SEMENTES AUMENTADO E/OU UM RNA COM RENDIMENTO DE SEMENTES AUMENTADO. Planta terrestre geneticamente modificada que expressa uma proteína que tem homologia a um inibidor de invertase de planta e/ou a um inibidor de pectina metilesterase e que aumenta rendimento de semente com expressão aumentada (uma proteína de ISY) é revelada. A planta compreende um gene modificado para a proteína de ISY. A proteína de ISY compreende um ou mais dentre uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2 ou um fragmento, homólogo de Camelina sativa, ou ortólogo da mesma. O gene modificado compreende um promotor e uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de ISY. O promotor é não cognato com relação à sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de ISY. O gene modificado é configurado de tal modo que transcrição da sequência de ácido nucleico é iniciada a partir do promotor e resulta em expressão da proteína de ISY. A planta terrestre geneticamente modificada que expressa um RNA que aumenta rendimento de sementes com expressão aumentada também é revelada.

Description

“PLANTAS TERRESTRES GENETICAMENTE MODIFICADAS QUE EXPRESSAM UMA PROTEÍNA COM RENDIMENTO DE SEMENTES AUMENTADO E/OU UM RNA COM RENDIMENTO DE SEMENTES AUMENTADO” CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se a plantas terrestres geneticamente modificadas e, mais particularmente, a plantas terrestres geneticamente modificadas que expressam uma proteína que tem homologia a um inibidor de invertase de plantas e/ou a um inibidor de pectina metilesterase e que aumenta o rendimento de sementes com expressão aumentada ("uma proteína de ISY”) e/ou um RNA que aumenta o rendimento de sementes com expressão aumentada (“um ISY RNA”).
FUNDAMENTO DA INVENÇÃO
[0002] O mundo enfrenta um grande desafio nos próximos 30 anos para atender às crescentes demandas de produção de alimentos para alimentar uma crescente população global, que deve chegar a 9 bilhões até o ano de 2050. A produção de alimentos precisará ser aumentada em até para 70% devido ao crescimento da população. A demanda aumentada por dieta melhorada, mudanças concomitantes no uso da terra para um novo espaço de vida e infraestrutura, usos alternativos para culturas e mudanças nos padrões climáticos irão adicionar ao desafio.
[0003] As principais culturas agrícolas incluem culturas alimentícias, tais como milho, trigo, aveia, cevada, soja, painço, sorgo, pulses, feijão, tomate, milho, arroz, mandioca, beterraba sacarina, e batatas, plantas de culturas forrageiras, tais como feno, alfafa e milho para silagem, e culturas de sementes oleaginosas, tais como camelina, espécies de Brassica (por exemplo, B. napus (colza), B. rapa, B. juncea e B. carinata), crambe, soja, girassol, cártamo, óleo de palma, linho e algodão, entre outros. A produtividade dessas culturas, e outras, é limitada por vários fatores, incluindo, por exemplo, a ineficiência relativa da conversão fotoquímica da energia da luz em carbono fixo durante a fotossíntese, bem como, a perda de carbono fixo por fotorrespiração e/ou outras vias metabólicas essenciais com enzimas que catalisam reações de descarboxilação. Para sementes (grãos), tubérculos ou culturas de frutos, a relação de sementes, tubérculos ou frutos produzidos por unidade de biomassa de planta também é um determinante principal da produtividade da cultura. A produtividade da cultura também é limitada pela disponibilidade de água. Alcançar mudanças de etapa no rendimento da cultura requer novas abordagens.
[0004] O aumento do rendimento de sementes nas culturas principais pode ser visto como um problema de otimização de carbono em duas etapas, a primeira é melhorar a fixação de carbono fotossintético e a segunda é otimizar o fluxo de carbono fixo para a produção de sementes versus biomassa vegetativa (raízes, caules, folhas etc.). A relação da semente colhida para a biomassa da planta vegetativa também é descrita como o índice de colheita. O aumento do índice de colheita de sementes, frutos e culturas de tubérculos é um objetivo desta invenção.
[0005] Há uma série de exemplos de uso de engenharia genética para aumentar a captura de carbono em culturas, incluindo o uso de genes de outras espécies fotossintéticas, tais como algas. Foi recentemente demonstrado por Schnell et al., WO2015/103074, que as plantas Camelina transformadas para expressar CCP1 da espécie de algas eucarióticas Chlamydomonas reinhardtii têm taxas de transpiração reduzidas, taxas de assimilação de CO2 aumentadas e maior rendimento do que as plantas de controle que não expressam o gene CCP1. Embora essas plantas modificadas tenham maior rendimento de sementes, os inventores também revelam que o tamanho das sementes individuais dessas plantas foi significativamente reduzido. Uma interpretação razoável desses resultados é que a proteína CCP1 aumenta a eficiência de captura de carbono, resultando no aumento de disponibilidade de carbono para a produção de sementes. Isso, por sua vez, resulta em um número aumentado de estruturas portadoras de sementes e sementes sendo produzidas, mas a planta é incapaz de fornecer carbono fixo suficiente para produzir o grande número de sementes em tamanho real ou a disponibilidade aumentada de carbono fixo no tecido verde está sinalizando a planta para interromper o fluxo de carbono para as sementes.
[0006] No documento WO2017/136668, para Yield10 Bioscience, um número de ortólogos de CCP1 de espécies de algas que compartilharam domínios de sequência de proteínas comuns, incluindo domínios de membrana mitocondrial e domínios de proteína transportadora foi mostrado para aumentar o rendimento de sementes quando expresso constitutivamente em plantas Camelina.
[0007] No documento WO2018/156686, para Yield10 Bioscience, CCP1 e seus ortólogos de outras algas são referidos como proteínas transportadoras mitocondriais. Os inventores testaram o impacto da expressão de CCP1 ou seus ortólogos de algas usando promotores específicos de sementes com o resultado inesperado de que tanto o rendimento da semente quanto o tamanho da semente aumentaram. Novamente, isso implica que nas plantas CCP1 originais, onde CCP1 foi expresso constitutivamente, a planta estava fechando o fluxo de carbono para as sementes. Esses inventores também reconheceram os benefícios de combinar a expressão constitutiva e a expressão específica de semente de CCP1 ou qualquer um de seus ortólogos na mesma planta como um meio para aumentar ainda mais a produção de sementes.
[0008] No documento WO2018/232232, para Yield10 Bioscience, plantas geneticamente modificadas que expressam uma proteína transportadora mitocondrial similar à planta CCP1 são reveladas. As plantas geneticamente modificadas incluem um gene modificado para a proteína transportadora mitocondrial similar à planta CCP1. O gene modificado inclui um promotor e uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína transportadora mitocondrial similar à planta CCP1. O promotor não é cognato em relação à sequência de ácido nucleico.
[0009] No documento WO2019/104278, para Yield10 Bioscience, plantas geneticamente modificadas que expressam uma proteína transportadora mitocondrial similar à planta CCP1 e um gene LCID/E são reveladas.
[0010] O produto primário da fotossíntese é a sacarose (açúcar), que é em seguida transportada por toda a planta e usada em células e tecidos de planta como uma fonte tanto de carbono fixo quanto de energia. A partição da sacarose em sementes e outros tecidos absorvedores de carbono, tais como frutos ou tubérculos, é um fator chave na determinação do rendimento. Demonstrou-se que as invertases de plantas e seus respectivos inibidores têm um papel significativo na regulação da partição de açúcar nas plantas. As invertases realizam isso regulando o carregamento, descarregamento e transporte de sacarose no floema (Lammens et al. (2008), J Mol Biol, 377 (2): 378-385). As invertases de plantas são uma classe de proteínas que hidrolisam a sacarose em frutose e glicose. As rtases de plantas incluem as invertases da parede celular (CWIs) e as invertases vacuolares. As invertases da parede celular, localizadas dentro da parede celular, desempenham um papel fundamental na descarga de sacarose do apoplasto para os tecidos coletores. A parede celular e as invertases vacuolares são proteínas altamente estáveis devido à presença de glicanos. Como um resultado, sua atividade pode ser altamente dependente da regulação pós-tradução por suas proteínas inibidoras, denominadas inibidores de invertase de plantas, que incluem inibidores de invertase da parede celular (CWIIs) e inibidores de invertase vacuolar. Assim, por exemplo, as invertases da parede celular interagem com os inibidores de invertase da parede celular, que regulam pós-transcricionalmente a sua atividade.
[0011] Os inibidores de invertase de plantas, incluindo inibidores de invertase da parede celular, são pequenos peptídeos, com massas moleculares (MW) variando de 15 a 23 kDa, e podem estar localizados na parede celular ou no vacúolo. Os inibidores de invertase da parede celular são expressos no desenvolvimento do pólen, sementes em desenvolvimento inicial, e folhas senescentes, indicando que a alocação de assimilados é um fator limitante nesses estágios de desenvolvimento.
[0012] As análises quantitativas de traço loci para tamanho do fruto em tomate (Lin5) e tamanho de grão em arroz (GIF1) e milho (MN1) identificaram mutações nas invertases da parede celular que levaram à redução em sua atividade nos tecidos do pedicelo/fruto (Wang et al. (2008), Nature Genetics, 40 (11): 1370-1374; Fridman et al. (2004), Science, 305 (5691): 1786-1789; Cheng et al. (1996), Plant Cell, 8 (6): 971-983). A supressão específica do fruto do inibidor de invertase da parede celular (CWII) em tomate ou arroz levou a aumentos no peso líquido da semente/grão de 22% e 10%, respectivamente (Wang et al. (2008), Nature Genetics, 40 (11): 1370-1374; Jin et al. (2009), Plant Cell, 21 (7): 2072-2089).
[0013] Assim, com base nos ensinamentos na literatura, duas abordagens gerais podem ser usadas para aprimorar o fluxo de assimilação em tecidos coletores para aumentar o rendimento de sementes, frutos ou tubérculos: superexpressão de CWI ou repressão de sua proteína inibidora CWII. Métodos usando uma ou ambas as abordagens gerais para a produção de plantas tendo um número aumentado de sementes e métodos para a produção de plantas com aumento da partição de assimilação direcionado em frutos, sementes e/ou outra parte da planta (por exemplo, raízes e/ou tubérculos), e/ou aumento do tamanho da semente, raiz e/ou tubérculo, ou qualquer combinação dos mesmos e plantas transgênicas feitas por esses métodos foram reveladas em Sederoff et al., WO2014209792.
[0014] “Plantas transgênicas”, “culturas GMO” e/ou “traços biotecnológicos” não são amplamente aceitos em algumas regiões e países e estão submetidos a processos de aprovação regulatória que consomem muito tempo e são proibitivamente dispendiosos. A estrutura regulatória atual para plantas transgênicas resulta em custos significativos (~$ 136 milhões por traço; McDougall, P. 2011, “The cost and time involved in the Discovery, development, and authorization of a new plant biotechnology derived trait”. Crop Life International) e longos prazos de desenvolvimento de produto que limitam o número de tecnologias que são lançadas no mercado. Isso prejudicou gravemente o investimento privado e a adoção de inovação neste setor crucial. Avanços recentes em tecnologias de edição de genoma fornecem uma oportunidade para remover genes com precisão ou editar sequências de controle para melhorar significativamente a produtividade da planta (Belhaj (2013), Plant Methods, 9:39; Khandagale & Nadaf (2016), Plant Biotechnol Rep, 10: 327- 343) e abrir o caminho para a produção de plantas que podem se beneficiar de um caminho regulatório acelerado ou possivelmente de um status não regulado.
[0015] Esses riscos têm prejudicado gravemente o investimento privado e a adoção de inovação neste setor crucial. Mudanças recentes nos regulamentos que regem os cultivos geneticamente modificados pelo USDA- APHIS nos Estados Unidos e novas tecnologias, tal como a edição do genoma, começaram a mudar essa situação. Por exemplo, uma planta de milho que foi geneticamente modificada para modificar a atividade de um gene de milho usando apenas sequências de DNA de milho, tecnicamente descrita como cisgênica, não transgênica, pode ser classificada como não regulada, desde que a planta de milho modificada não contenha sequências de DNA estranhas. Os avanços nas tecnologias de edição de genoma fornecem uma oportunidade para remover ou inserir com precisão sequências de DNA no genoma da planta de interesse para inativar genes de plantas específicos ou para alterar sua expressão, modificando suas sequências promotoras para melhorar o desempenho da planta (Belhaj (2013), Plant Methods, 9:39; Khandagale & Nadaf (2016), Plant Biotechnol Rep, 10: 327-343). As plantas geneticamente modificadas feitas usando esta abordagem não contêm sequências de DNA estranhas e também podem ser categorizadas como não reguladas pelo USDA- APHIS. Em ambos os casos, entretanto, o status regulatório das plantas modificadas está apropriadamente submetido aos critérios usuais para aprovação de qualquer nova variedade de planta.
[0016] Dados os custos e desafios associados à obtenção de aprovação regulatória e aceitação social de culturas transgênicas, há uma necessidade de identificar, sempre que possível, genes de plantas, que podem ser geneticamente modificados para aumentar o rendimento de sementes, frutos ou tubérculos, particularmente sem depender de genes, sequências de controle ou proteínas derivadas de não plantas, na medida do possível. Aqui, foram revelados novos genes de plantas e métodos para identificar esses novos genes de plantas que podem ser usados para aumentar o rendimento de sementes, frutos e tubérculos nas principais culturas alimentícias. Também foram revelados métodos de uso desses novos genes de plantas, e fragmentos dos mesmos, para aumentar o rendimento de sementes, frutos e/ou tubérculos. Também foram reveladas plantas modificadas para ter maior expressão daqueles genes com maior rendimento de sementes, frutos e/ou tubérculos.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0017] Uma planta terrestre geneticamente modificada que expressa uma proteína que tem homologia a um inibidor de invertase de plantas e/ou a um inibidor de pectina metilesterase e que aumenta o rendimento de sementes com expressão aumentada ("uma proteína de ISY") é revelada. A planta terrestre geneticamente modificada compreende um gene modificado para a proteína de ISY. A proteína de ISY compreende um ou mais dentre (i) uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; (ii) um fragmento de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; (iii) um homólogo de Camelina sativa de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; ou (iv) um ortólogo de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2. O gene modificado compreende (i) um promotor e (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de
ISY. O promotor não é cognato em relação à sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de ISY. O gene modificado é configurado de modo que transcrição da sequência de ácido nucleico seja iniciada a partir do promotor e resulte em expressão da proteína de ISY.
[0018] Em alguns exemplos, a proteína de ISY compreende a proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2. Em alguns desses exemplos, a proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2 corresponde a uma ou mais das proteínas de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 2, proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5, proteína de ISY modificada de Camelina sativa de SEQ ID NO: 138 ou proteína de ISY modificada de Camelina sativa de SEQ ID NO: 140.
[0019] Em alguns exemplos, a proteína de ISY compreende o fragmento de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2. Em alguns desses exemplos, o fragmento corresponde a 114 a 133 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2.
[0020] Em alguns exemplos, a proteína de ISY compreende o homólogo de Camelina sativa de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2. Em alguns desses exemplos, o homólogo de Camelina sativa corresponde a uma ou mais proteínas de Camelina sativa de SEQ ID NOS: 21-40.
[0021] Em alguns exemplos, a proteína de ISY compreende o ortólogo de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2. Em alguns destes exemplos, o ortólogo corresponde a uma ou mais (i) proteínas de colza de SEQ ID NOS: 69, 71, 73 e/ou 75; (ii) proteínas de soja de SEQ ID NOS: 89, 91, 93 e/ou 95; ou (iii) proteínas de milho de SEQ ID NOS: 99, 101, 103, 105 e/ou 107.
[0022] Em alguns exemplos, a proteína de ISY compreende (i) (a) um resíduo de cisteína na posição 40, (b) um resíduo de leucina na posição 59, (c) um resíduo de cisteína na posição 98, e (d) um resíduo de cisteína na posição 138, com a numeração das posições em relação à proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5, e (ii) uma identidade geral de, pelo menos, 10% com a proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 2. Em alguns destes exemplos, a proteína de ISY ainda compreende apenas entre 1 a 14 resíduos de aminoácidos N-terminais para o resíduo de cisteína na posição 40, com numeração das posições em relação à proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5. Também em alguns destes exemplos, a proteína de ISY carece de um peptídeo de sinal N-terminal. Também em alguns desses exemplos, a proteína de ISY carece de um motif de PKF.
[0023] Em alguns exemplos, a proteína de ISY compreende (i) (a) um resíduo de cisteína na posição 25, (b) um resíduo de cisteína na posição 40, (c) um resíduo de leucina na posição 59, (d) um resíduo de cisteína na posição 98, e (e) um resíduo de cisteína na posição 138, com numeração de posições em relação à proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5, e (ii) uma identidade geral de, pelo menos, 10% com a proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5. Em alguns desses exemplos, a proteína de ISY carece de um motif de PKF.
[0024] Em alguns exemplos, a proteína de ISY é heteróloga em relação à planta terrestre geneticamente modificada. Em alguns exemplos, a proteína de ISY é homóloga em relação à planta terrestre geneticamente modificada.
[0025] Em alguns exemplos, o promotor é um promotor constitutivo. Em alguns exemplos, o promotor é um promotor específico de semente.
[0026] Em alguns exemplos, o gene modificado é integrado ao DNA genômico da planta terrestre geneticamente modificada.
[0027] Em alguns exemplos, o gene modificado é expresso de forma estável na planta terrestre geneticamente modificada.
[0028] Em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada exibe expressão aumentada da proteína de ISY em comparação com uma planta terrestre de referência que não inclui o gene modificado.
[0029] Em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada exibe endimento de sementes, rendimento de frutos e/ou rendimento de tubérculos aumentado em comparação com uma planta terrestre de referência que não inclui o gene modificado.
[0030] Em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta C3. Em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta C4.
[0031] Em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta de cultura alimentícia selecionada a partir do grupo que consiste em milho, trigo, aveia, cevada, soja, painço, sorgo, batata, beterraba sacarina, pulse, grão de bico, ervilha verde, ervilha amarela, lentilha, feijão, tomate e arroz. Em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta de cultura oleaginosa selecionada a partir do grupo que consiste em camelina, espécies de Brassica (por exemplo, B. napus (colza), B. rapa, B. juncea e B. carinata), crambe, soja, girassol, cártamo, óleo de palma, linho e algodão.
[0032] Uma planta terrestre geneticamente modificada que expressa um RNA que aumenta o rendimento de sementes com expressão aumentada ("um ISY RNA") também é revelada. A planta terrestre geneticamente modificada compreende um gene modificado para o ISY RNA. O ISY RNA compreende uma sequência contígua de códons que codificam uma proteína que tem homologia a um inibidor de invertase de plantas e/ou a um inibidor de pectina metilesterase ("uma proteína codificada"). A proteína codificada compreende um ou mais dentre (i) uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; (ii) um fragmento de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; (iii) um homólogo de Camelina sativa de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; ou (iv) um ortólogo de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2. O gene modificado compreende (i) um promotor e (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica o ISY RNA. O promotor não é cognato em relação à sequência de ácido nucleico que codifica o ISY RNA. O gene modificado é configurado de modo que transcrição da sequência de ácido nucleico seja iniciada a partir do promotor e resulte em expressão do ISY RNA.
[0033] Em alguns exemplos, a proteína codificada compreende a proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2.
[0034] Em alguns exemplos, a proteína codificada compreende o fragmento de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2, em que o fragmento corresponde a 114 a 133 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2.
[0035] Em alguns exemplos, a proteína codificada compreende o homólogo de Camelina sativa de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2, em que o homólogo de Camelina sativa corresponde a uma ou mais proteínas de Camelina sativa de SEQ ID NOS: 21-
40.
[0036] Em alguns exemplos, a proteína codificada compreende o ortólogo de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2, em que o ortólogo corresponde a uma ou mais (i) proteínas de colza de SEQ ID NOS: 69, 71, 73, e/ou 75; (ii) proteínas de soja de SEQ ID NOS: 89, 91, 93 e/ou 95; ou (iii) proteínas de milho de SEQ ID NOS: 99, 101, 103, 105 e/ou 107.
[0037] Em alguns exemplos, a proteína codificada compreende (i) (a) um resíduo de cisteína na posição 40, (b) um resíduo de leucina na posição 59, (c) um resíduo de cisteína na posição 98, e (d) um resíduo de cisteína na posição 138, com numeração de posições em relação à proteína de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5, e (ii) uma identidade geral de, pelo menos, 10% com a proteína de Camelina sativa de SEQ ID NO: 2.
[0038] Em alguns exemplos, a proteína codificada compreende (i) (a) um resíduo de cisteína na posição 25, (b) um resíduo de cisteína na posição 40, (c) um resíduo de leucina na posição 59, (d) um resíduo de cisteína na posição 98, e (e) um resíduo de cisteína na posição 138, com numeração de posições em relação à proteína de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5, e (ii) uma identidade geral de, pelo menos, 10% com a proteína de Camelina sativa de SEQ ID NO:
5.
[0039] Em alguns exemplos, a proteína codificada é heteróloga em relação à planta terrestre geneticamente modificada.
[0040] Em alguns exemplos, a proteína codificada é homóloga em relação à planta terrestre geneticamente modificada.
[0041] Em alguns exemplos, o promotor é um promotor constitutivo. Em alguns exemplos, o promotor é um promotor específico de semente.
[0042] Em alguns exemplos, o gene modificado é integrado ao DNA genômico da planta terrestre geneticamente modificada.
[0043] Em alguns exemplos, o gene modificado é expresso de forma estável na planta terrestre geneticamente modificada.
[0044] Em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada exibe expressão aumentada do ISY RNA em comparação com uma planta terrestre de referência que não inclui o gene modificado.
[0045] Em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada exibe rendimento de sementes, rendimento de frutos e/ou rendimento de tubérculos aumentado em comparação com uma planta terrestre de referência que não inclui o gene modificado.
[0046] Em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta de cultura alimentícia selecionada a partir do grupo que consiste em milho, trigo, aveia, cevada, soja, painço, sorgo, batata, beterraba sacarina, pulse, grão de bico, ervilha verde, ervilha amarela, lentilha, feijão, tomate e arroz. Em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta de cultura oleaginosa selecionada a partir do grupo que consiste em camelina, espécies de Brassica (por exemplo, B. napus (colza), B. rapa, B. juncea e B. carinata), crambe, soja, girassol, cártamo, óleo de palma, linho e algodão.
[0047] Em alguns exemplos, a sequência de ácido nucleico que codifica o ISY RNA é, pelo menos, 80% idêntica à SEQ ID NO: 1. Em alguns desses exemplos, a sequência de ácido nucleico que codifica o ISY RNA compreende a SEQ ID NO: 1.
[0048] Em alguns exemplos, a expressão do ISY RNA resulta na expressão da proteína codificada. Em alguns exemplos, a expressão do ISY RNA não resulta na expressão da proteína codificada.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0049] FIGURAS 1A-B mostram um alinhamento de múltiplas sequências de três proteínas putativas do inibidor de invertase da planta Camelina/inibidor de pectina metilesterase, ou proteínas com rendimento de sementes aumentado (ISY), que incorporam CSA15G017550.1, com nove proteínas identificadas como inibidores de invertase da planta conhecidos de acordo com CLUSTAL O (1.2.4). As três proteínas de ISY diferem em tamanho em relação ao número total de aminoácidos devido aos diferentes códons iniciais. As sequências são as seguintes: proteína Csa15g017550 com 134 aminoácidos (Csa15g017550_134aa; SEQ ID NO: 2); uma proteína de 168 aminoácidos contendo um códon inicial diferente usando a sequência a montante de Csa15g017550 (Csa15g017550_168aa; SEQ ID NO: 5); um fragmento de 190 aminoácidos contendo a sequência a montante de Csa15g017550 (Csa15g017550_190aa; SEQ ID NO: 4); Zea mays (XP_008668976.1) (SEQ ID NO: 8); Arabidopsis thaliana (AT5G64620) (SEQ ID NO: 9); Arabidopsis thaliana (AEE32232.1) (SEQ ID NO: 10); Solanum lycopersicum (Solyc12g099190) (SEQ ID NO: 11); Solanum lycopersicum (Solyc12g099200) (SEQ ID NO: 12); Beta vulgaris subsp. vulgaris (XP_010685378.1) (SEQ ID NO: 13); Nicotiana tabacum (AY145781.1) (SEQ ID NO: 14); Nicotiana tabacum (Y12805.1) (SEQ ID NO: 15); Solanum tuberosum cultivar Shepody (GU321341.1) (SEQ ID NO: 16). Csa15g017550.1 foi anotado como um inibidor de invertase de plantas putativas/inibidor de pectina metilesterase. Sequências identificadas como inibidores de invertase de plantas conhecidos foram descritas por Wan et al. (2018), Trends Plant Sci, 23: 163-177, e Tang et al. (2017), J Exp Bot, 68: 469-482, e são adicionalmente descritos na TABELA 3.
[0050] FIG. 2 mostra um alinhamento de múltiplas sequências de duas proteínas de ISY que incorporam Csa15g017550.1, com dois inibidores de invertase de parede celular de Camelina previamente descritos em Sederoff et al., Pub. U.S. No. 2016/0138038, de acordo com CLUSTAL O (1.2.4). Os três homeólogos para cada um dos dois inibidores de invertase da parede celular (CWII1 e CWII2) são mostrados no alinhamento. As sequências são as seguintes: a proteína Csa15g017550 com 134 aminoácidos (Csa15g017550_134aa; SEQ ID NO: 2); uma proteína de 168 aminoácidos contendo um códon inicial diferente usando a sequência a montante de Csa15g017550 (Csa15g017550_168aa; SEQ ID NO: 5); Csa03g051630, proteína 1 inibidora de invertase da parede celular (CWII1) com 159 aminoácidos (SEQ ID NO: 77); homeólogo CWII1 Csa14g051860, CWII1 com 155 aminoácidos (SEQ ID NO: 79); homeólogo CWII1 Csa17g075360, CWII1 com 159 aminoácidos (SEQ ID NO: 81); homeólogo CWII2 Csa02g074171, CWII2 com 180 aminoácidos (SEQ ID NO: 83); homeólogo CWII2 Csa11g101740, CWII2 com 181 aminoácidos (SEQ ID NO: 85); homeólogo CWII2 Csa18g038260, CWII2 com 181 aminoácidos (SEQ ID NO: 87). A sequência de assinatura de aminoácidos de PKF para inibidores de invertase da parede celular pode ser encontrada nas sequências CWII1 (Csa03g051630, Csa14g051860 e Csa17g075360) dos resíduos 110-112.
[0051] FIG. 3 mostra um mapa de plasmídeo do vetor de transformação pMBXO58 (SEQ ID NO: 19) que expressa o gene CCP1 do promotor constitutivo 35S. O plasmídeo pMBXO58 contém um promotor constitutivo CaMV35S operacionalmente ligado a CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii fundido a um marcador myc C-terminal operacionalmente ligado a uma sequência de terminação OCS3. Um cassete de expressão para o gene bar, conduzido pelo promotor de manopina sintetase, confere resistência às plantas transgênicas ao herbicida bialafos.
[0052] FIG. 4 mostra um mapa de plasmídeo do vetor de transformação pMBXO84 (SEQ ID NO: 96). O plasmídeo pMBXO84 contém um cassete de expressão específico de semente, conduzido pelo promotor do gene de isoforma A de oleosina de soja, para a expressão de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii. Um cassete de expressão para o gene bar, conduzido pelo promotor CaMV35S, confere resistência às plantas transgênicas ao herbicida bialafos.
[0053] FIG. 5 mostra as análises de múltiplas estruturas de leitura abertas do fragmento do gene em SEQ ID NO: 7 produzindo proteínas de ISY de tamanhos diferentes. “M”, códon inicial previsto de acordo com Camelina sativa Genome Browser Csa15g017550.1 que produz uma proteína de 134 aminoácidos (SEQ ID NO: 2). “L”, códon inicial alternativo, codificado por TTG, que produz uma proteína de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5). Este códon inicial foi escolhido com base em alinhamentos com outros inibidores de invertase da parede celular (FIG. 1). "T", primeiro aminoácido da sequência de aminoácidos grande de 190 aminoácidos abrangendo Csa15g017550. Os locais de ligação dos iniciadores P675, P676, P677 e P678 usados para experimentos de PCR e RT-PCR (FIG. 7) são mostrados.
[0054] FIG. 6 mostra um gráfico gerado por Phobius de um peptídeo de sinal N-terminal previsto para a proteína de ISY de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5). O gráfico de Phobius mostra a probabilidade do domínio de transmembrana previsto (X), domínio citoplasmático (quadrado), domínio não citoplasmático (triângulo), e sequência de peptídeo de sinal (círculo). Apenas um peptídeo de sinal e um domínio não citoplasmático foram previstos. O eixo Y corresponde à probabilidade do rótulo posterior, representado graficamente de 0 a 1 em incrementos de 0,2. O eixo X corresponde ao número de resíduos de aminoácidos da proteína de ISY de 168 aminoácidos de SEQ ID NO: 5, representado graficamente de 0 a 168 em incrementos de 20.
[0055] FIG. 7 mostra experimentos para verificar a presença do gene Csa15g017550 e transcrito de RNA em germoplasma Camelina sativa
10CS0043 (abreviado WT43). A) Mapa de 576 pb de DNA (SEQ ID NO: 7) na região do gene Csa15g017550. As sequências de codificação para as proteínas de ISY de 134 aminoácidos e 168 aminoácidos são mostradas. Os locais de ligação do iniciador para os iniciadores P675, P676, P677 e P678 para PCR e experimentos de RT PCR são mostrados. B) Experimentos de PCR em DNA genômico da linhagem WT43 de Camelina de tipo selvagem mostrando a presença do gene Csa15g017550 (SEQ ID NO: 1), bem como, a sequência a montante do gene Csa15g017550, no genoma. Uma reação de PCR com o par de iniciador P675/P676 produziu uma banda consistente com o fragmento esperado de 0,236 kb. Uma reação de PCR com o par de iniciador P677/P678 produziu uma banda consistente com o fragmento esperado de 0,269 kb. C) Experimentos de RT-PCR com RNA da linhagem transgênica M116 16-0365, expressando o gene CCP1 do promotor constitutivo 35S no vetor pMBXO58 (SEQ ID NO: 19, FIG. 3), e linhagem de controle de tipo selvagem WT43 linhagem 16-0359. A expressão aumentada do inibidor de invertase de plantas putativas é observado em folhas e síliquas de linhagens CCP1. Experimentos de controle para sondar a presença de transcritos do gene de actina também foram realizados. D) Experimentos de RT-PCR com RNA de sementes em desenvolvimento transformados com vetor pMBXO84 (SEQ ID 96; FIG. 4), expressando o gene CCP1 do promotor de oleosina específico de semente (linhagens ND79, ND11, ND04 e ND78), em comparação com a linhagem de controle de tipo selvagem WT43. Experimentos de controle para sondar a presença de transcritos do gene de actina também foram realizados.
[0056] FIG. 8 mostra as análises sintênicas de Csa15g017550. O inibidor de invertase de plantas putativo/inibidor de pectina metilesterase (Csa15g017550, seta branca) foi encontrado no subgenoma G1 e é flanqueado por sequências de codificação para Csa15g017560 à esquerda e por Csa15g017530 à direita. Os dois homeólogos do gene flanqueador esquerdo Csa15g017560 nos subgenomas G2 (Csa19g018770) e G3 (Csa01g015740) são mostrados. O homeólogo de sequência do gene flanqueador direito Csa15g017530 no subgenoma 2 (Csa19g018760) e no subgenoma 3 (Csa01g015720) é mostrado. Nenhum homeólogo foi identificado para o inibidor de invertase de plantas putativo/inibidor de pectina metilesterase Csa15g017550. No subgenoma 2, não havia CDS anotado na posição genômica esperada no banco de dados do genoma Camelina. No subgenoma G3, o gene Csa01g015730.1 está presente com apenas 28% de identidade de sequência com Csa15g017550. A figura não está desenhada em escala.
[0057] FIG. 9 mostra um mapa para pMBXS1168 (SEQ ID NO: 17), um vetor de transformação projetado para a transformação de dicotiledôneas mediada por Agrobacterium, incluindo Camelina. O vetor contém o promotor constitutivo CaMV35S duplamente aprimorado (2X 35S) operacionalmente ligado a um gene (SEQ ID NO: 1) que codifica a proteína de 134 aminoácidos para Csa15g017550 (SEQ ID NO: 2) operacionalmente ligada a uma sequência de poliadenilação 35S. O marcador visual DsRed2B é usado para identificar sementes transgênicas.
[0058] FIG. 10 mostra um mapa para pMBXS1169 (SEQ ID NO: 18), um vetor de transformação projetado para a transformação de dicotiledôneas mediada por Agrobacterium, incluindo Camelina. O vetor contém o promotor constitutivo CaMV35S duplamente aprimorado (2X 35S) operacionalmente ligado a um gene (SEQ ID NO: 6) que codifica a proteína de ISY de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) operacionalmente ligada a uma sequência de poliadenilação 35S. O marcador visual DsRed2B é usado para identificar sementes transgênicas.
[0059] FIG. 11 mostra uma comparação de rendimento de sementes e número de ramificações terciárias em linhagens de Camelina transformadas com vetores de transformação pMBXS1168 e pMBXS1169. As linhagens são as seguintes: linhagem de controle NJ02, Suneson de tipo selvagem transformado com pMBXO58 expressando CCP1; OX10, linhagem de NJ02 transformada com pMBXS1168 (SEQ ID NO: 17) expressando os 134 aminoácidos Csa15g017550 de SEQ ID NO: 2; PA22, linhagem de NJ02 transformada com pMBXS1169 (SEQ ID NO: 18) expressando a proteína de ISY de 168 aminoácidos de SEQ ID NO: 5; WTSU, Suneson de tipo selvagem; linhagem OY12, Suneson de tipo selvagem transformado com pMBXS1168; linhagem OZ27, Suneson de tipo selvagem transformado com pMBXS1169. *, indica resultados estatisticamente significativos de acordo com o teste t de Student (p < 0,05).
[0060] FIGURAS 12A-E mostram os resultados de um segundo experimento de crescimento de linhagens de Camelina de geração T3 transformadas com vetores de transformação pMBXS1168 e pMBXS1169. A)
Rendimento médio de sementes de T4 (em gramas) de linhagens de camelina C3004 em comparação com controles de tipo selvagem (WTSU), n = 4 plantas. B) Número médio de ramificações terciárias por planta de linhagens de camelina C3004 em comparação com controles de tipo selvagem, n = 3-4 plantas. C) Número médio de síliquas por planta de linhagens de camelina C3004 em comparação com controles de tipo selvagem, n = 3-4 plantas. D) Número médio de sementes por planta de linhagens de camelina C3004 em comparação com controles de tipo selvagem, n = 4 plantas. E) Peso médio de 1000 sementes de linhagens de camelina C3004 em comparação com controles de tipo selvagem, n = 4 plantas. As linhagens de camelina C3004 de pMBXS1168 (OY02, OY04, OY12, OY15 e OY17) e pMBXS1169 (OZ12, OZ15, OZ19, OZ21, OZ26 e OZ27) e o tipo selvagem correspondente (WTSU) foram cultivados em uma Câmara de Crescimento Conviron BDR16 definida em um fotoperíodo de 16 horas e uma temperatura dia/noite de 22ºC/18ºC. Com as luzes acesas, uma leitura de luz de intensidade de luz de 450-650 µmol/m2/s foi registrada de 12 polegadas abaixo das lâmpadas na câmara. * = ANOVA e DMRT significativos (p = 0,05).
[0061] FIGURAS 13A-C mostram os resultados de medições fotossintéticas de Camelina sativa selecionada cv. transformantes Suneson C3004 em comparação com seus controles de tipo selvagem sob condições de crescimento de campo. A) Fotossíntese, fixação de CO2 (µmol/m2/s), n = 4-10 plantas. B) Rendimento quântico efetivo do fotossistema II (PSII), n = 4-10 plantas. C) Taxa de transferência de elétrons (ETR) de PSII (µmol/m2/s), n = 4- 10 plantas. Sementes de geração T4 de Camelina sativa C3004 cv. linhagens de Suneson transformadas com pMBXS1168 (OY03, OY04, OY15 e OY17) e pMBXS1169 (OZ15, OZ19, OZ21 e OZ26) e os controles de tipo selvagem correspondentes (WTSU) foram plantados em um ensaio de campo em Saskatoon, Canadá, durante a temporada de crescimento de 2019. As medições de fotossíntese foram realizadas em plantas de geração T4 em um estágio de pré-peneiração de cerca de 3,5 semanas após a germinação. Dados analisados por testes t de Student. **, * = teste t significativo a p ≤ 0,01 e p ≤ 0,05, respectivamente.
[0062] FIG. 14 mostra um alinhamento de múltiplas sequências das proteínas de ISY Camelina com quatro ortólogos de cultivar Brassica napus ZS11 de acordo com CLUSTAL O (1.2.4). As sequências são as seguintes:
Csa15g017550_134aa, proteína de ISY com 134 aminoácidos (SEQ ID NO: 2); Csa15g017550_168aa, proteína de ISY com 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5); XP_013675048, ortólogo B. napus com 175 aminoácidos (SEQ ID NO: 75); XP_013675049, ortólogo B. napus com 175 aminoácidos (SEQ ID NO: 71); XP_013714182, ortólogo B. napus com 175 aminoácidos (SEQ ID NO: 69); e XP_013718725, ortólogo B. napus com 175 aminoácidos (SEQ ID NO: 73).
[0063] FIG. 15 mostra um alinhamento de múltiplas sequências das proteínas de ISY Camelina com quatro ortólogos de cultivar Glycine max "Williams 82" de acordo com CLUSTAL O (1.2.4). As sequências são as seguintes: Csa15g017550_134aa, proteína de ISY com 134 aminoácidos (SEQ ID NO: 2); Csa15g017550_168aa, proteína de ISY com 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5); XP_003550932.1, ortólogo Glycine max com 183 aminoácidos (SEQ ID NO: 89); XP_006579665.1, ortólogo Glycine max com 183 aminoácidos (SEQ ID NO: 91); NP_001235997, ortólogo Glycine max com 187 aminoácidos (SEQ ID NO: 93); e XP_006604724, ortólogo Glycine max com 183 aminoácidos (SEQ ID NO: 95).
[0064] FIGURAS 16A-B mostram um alinhamento de múltiplas sequências das proteínas de ISY Camelina com cinco ortólogos identificados a partir do genoma de referência de milho Zea mays B73 de acordo com CLUSTAL O (1.2.4). As sequências são as seguintes: Csa15g017550_134aa, proteína de ISY com 134 aminoácidos (SEQ ID NO: 2); Csa15g017550_168aa, proteína de ISY com 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5); NP_001143588, ortólogo de milho com 217 aminoácidos (SEQ ID NO: 99); NP_001148423, ortólogo de milho com 228 aminoácidos (SEQ ID NO: 101); NP_001149041, ortólogo de milho com 211 aminoácidos (SEQ ID NO: 103); XP_008655849, ortólogo de milho com 195 aminoácidos (SEQ ID NO: 105); XP_008668976, ortólogo de milho com 176 aminoácidos (SEQ ID NO: 107).
[0065] FIGURAS 17A-C mostram um alinhamento de múltiplas sequências das proteínas de ISY Camelina com os ortólogos de cultura de colza, soja e milho listados na TABELA 12. As sequências são as seguintes: Csa15g017550_134aa, proteína de ISY com 134 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de Camelina sativa; Csa15g017550_168aa, proteína de ISY com 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) de Camelina sativa; XP_013675048, ortólogo B. napus com 175 aminoácidos (SEQ ID NO: 75); XP_013675049, ortólogo B.
napus com 175 aminoácidos (SEQ ID NO: 71); XP_013714182, ortólogo B. napus com 175 aminoácidos (SEQ ID NO: 69); XP_013718725, ortólogo B. napus com 175 aminoácidos (SEQ ID NO: 73); XP_003550932.1, ortólogo Glycine max com 183 aminoácidos (SEQ ID NO: 89); XP_006579665.1, ortólogo Glycine max com 183 aminoácidos (SEQ ID NO: 91); NP_001235997, ortólogo Glycine max com 187 aminoácidos (SEQ ID NO: 93); XP_006604724, ortólogo Glycine max com 183 aminoácidos (SEQ ID NO: 95); NP_001143588, ortólogo de milho com 217 aminoácidos (SEQ ID NO: 99); NP_001148423, ortólogo de milho com 228 aminoácidos (SEQ ID NO: 101); NP_001149041, ortólogo de milho com 211 aminoácidos (SEQ ID NO: 103); XP_008655849, ortólogo de milho com 195 aminoácidos (SEQ ID NO: 105); e XP_008668976, ortólogo de milho com 176 aminoácidos (SEQ ID NO: 107).
[0066] FIG. 18 mostra mapas de constructos de DNA para a transformação de um ortólogo de colza do gene de ISY de Camelina em colza. A) O constructo de transformação pMBXS1274 (SEQ ID NO: 193) contém um fragmento de gene (sequência de gene XM_013819595.2, SEQ ID NO: 70), expresso a partir do promotor constitutivo CaMV35S duplamente aprimorado (2X 35S), que codifica a proteína de 175 aminoácidos em SEQ ID NO: 71. B) Constructo de pMBXS1277 (SEQ ID NO: 196) contém o fragmento de DNA SEQ ID NO: 194, expresso a partir do promotor constitutivo CaMV35S duplamente aprimorado (2X 35S), para produzir a proteína de 138 aminoácidos de SEQ ID NO: 195. O marcador visual DsRed2B em ambos os constructos é usado para identificar sementes transgênicas.
[0067] FIG. 19 mostra mapas de plasmídeo para 1) pMBXS1269 (SEQ ID NO: 197) e B) pMBXS1270 (SEQ ID NO: 198), vetores projetados para transformação mediada por Agrobacterium de Colza com os genes ISY Camelina de 134 aminoácidos e 168 aminoácidos, respectivamente. A) O vetor de transformação pMBXS1269 contém o promotor constitutivo CaMV35S duplamente aprimorado (2X 35S) operacionalmente ligado a um gene (SEQ ID NO: 1) que codifica a proteína de 134 aminoácidos para Csa15g017550 (SEQ ID NO: 2) operacionalmente ligada a uma sequência de poliadenilação 35S. B) O vetor de transformação pMBXS1270 contém o promotor constitutivo CaMV35S duplamente aprimorado (2X 35S) operacionalmente ligado a um gene (SEQ ID NO: 6) que codifica a proteína de ISY Camelina de 168 aminoácidos (SEQ ID
NO: 5) operacionalmente ligada a uma sequência de poliadenilação 35S . Um cassete de expressão para o gene bar, conduzido pelo promotor constitutivo CaMV35S duplamente aprimorado (2X 35S), confere resistência às plantas transgênicas ao herbicida bialafos em ambos os vetores.
[0068] FIGURAS 20A-C mostram mapas de DNA para transformação em soja. A) O plasmídeo pMBXO74 (SEQ ID NO: 128) contém um promotor CaMV35S constitutivo para a expressão de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii no vetor linear pJAZZ (Lucigen). O uso do códon do gene CCP1 é proveniente do gene nativo Chlamydomonas reinhardtii. O fragmento terminador Apa I-Swa I CaMV35S-CCP1 de 2,7 kb foi excisado e co-bombardeado com um cassete de higromicina em culturas embriogênicas de soja. B) O fragmento de DNA pMBXO92 (SEQ ID NO: 129) contém um promotor CaMV35S constitutivo para a expressão de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii. Este promotor CaMV35S tem uma sequência ligeiramente diferente daquela em pMBXO74. O gene CCP1 é códon otimizado para soja. O fragmento terminador Hind III - Eco RI CaMV35S- CCP1 de 2,2 kb foi co-bombardeado com um cassete de higromicina em culturas embriogênicas de soja. C) O plasmídeo pMBXO75 (SEQ ID NO: 130) contém um cassete de expressão específico de sementes, conduzido pelo promotor do gene da isoforma A da oleosina de soja, para expressão de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii no vetor linear pJAZZ (Lucigen). O gene CCP1 é códon otimizado para soja. O fragmento terminador de oleosina SmaI oleosina-CCP1 de 2,2 kb foi excisado e co-bombardeado com um cassete de higromicina em culturas embriogênicas de soja.
[0069] FIG. 21 mostra um mapa de plasmídeo do vetor de transformação de arroz pMBXS1091 (SEQ ID NO: 97). O plasmídeo pMBXS1091 contém um cassete de expressão para CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii fundido a um marcador myc C-terminal. A expressão de gene ccp1-myc é controlada pelo promotor do gene de isoenzima 1 insolúvel de beta- frutofuranosidase de arroz (CIN1) (LOC_Os02g33110). Um cassete de expressão para o gene hptI, conduzido pelo promotor CaMV35S e incluindo o intron hsp70, bem como, um intron do gene catalase -1 de feijão (CAT-1), confere resistência às plantas transgênicas ao herbicida higromicina.
[0070] FIG. 22 detalha uma estratégia para a substituição do promotor na frente da sequência nativa Csa15g017550 usando a edição do genoma e um mecanismo de reparo direcionado homólogo. O Guia # 1 e o Guia # 2 são usados para extipar o promotor a ser substituído (Promotor 1). Um novo cassete de promotor (Promotor 2), flanqueado por sequências com homologia à região a montante e a jusante do Promotor 1, é introduzido e é inserido no local anteriormente ocupado pelo Promotor 1 usando o mecanismo de reparação direcionado ao homólogo.
[0071] FIG. 23 mostra uma árvore filogenética (cladograma) de proteínas codificadas por genes diferencialmente expressos em categorias de ontologia genética selecionada (GO) que foram identificados em dados de sequenciamento de RNA de folhas de uma linhagem de soja que expressa o gene CCP1 de um promotor constitutivo. A proteína de ISY Camelina de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) foi incluída no alinhamento. As categorias de GO selecionadas são mostradas na TABELA 16. As proteínas foram agrupadas em cinco categorias para análises adicionais e incluem: Grupo 1, XP_003526981.1 (SEQ ID NO: 141), XP_006589707.1 (SEQ ID NO: 142), XP_003535958. 1 (SEQ ID NO: 143) e XP_003555714.4 (SEQ ID NO: 144); Grupo 2, proteína de ISY Camelina (SEQ ID NO: 5), XP_003543834.1 (SEQ ID NO: 145), XP_006587735.1 (SEQ ID NO: 146), NP_001237215.2 (SEQ ID NO: 147), e NP_001235420. 1 (SEQ ID NO: 148); Grupo 3, XP_003517432.1 (SEQ ID NO: 149), XP_003530773.1 (SEQ ID NO: 150), XP_003525240.1 (SEQ ID NO: 151); Grupo 4, XP_003531408.1 (SEQ ID NO: 152), XP_003526711.1 (SEQ ID NO: 153), XP_003553658.2 (SEQ ID NO: 154); Grupo 5, XP_025981966.1 (SEQ ID NO: 155), XP_003528739.1 (SEQ ID NO: 156).
[0072] FIGURAS 24A-B mostram um alinhamento de múltiplas sequências das proteínas do Grupo 1 da árvore filogenética (cladograma) na FIG. 23 de acordo com CLUSTAL O (1.2.4). As proteínas do Grupo 1 têm termos GO de pectato liases prováveis. As sequências são as seguintes: XP_003526981.1 (SEQ ID NO: 141), XP_006589707.1 (SEQ ID NO: 142), XP_003535958.1 (SEQ ID NO: 143) e XP_003555714.4 (SEQ ID NO: 144).
[0073] FIGURAS 25A-B mostram um alinhamento de múltiplas sequências das proteínas do Grupo 2 da árvore filogenética na FIG. 23 de acordo com CLUSTAL O (1.2.4). As proteínas do Grupo 2 incluem a proteína de ISY Camelina e proteínas que têm termos GO de pectinesterases ou inibidores de parede celular/vacuolar de frutosidase 1. As sequências são as seguintes:
proteína de ISY Camelina (SEQ ID NO: 5), XP_003543834.1 (SEQ ID NO: 145), XP_006587735.1 (SEQ ID NO: 146), NP_001237215.2 (SEQ ID NO: 147) e NP_001235420.1 (SEQ ID NO: 148).
[0074] A FIG. 26 mostra um alinhamento de múltiplas sequências da proteína de ISY Camelina com os dois inibidores de parede celular/vacuolar das proteínas frutosidase 1 no Grupo 2 da árvore filogenética na FIG. 23 de acordo com CLUSTAL O (1.2.4). As sequências são as seguintes: proteína de ISY Camelina (SEQ ID NO: 5), NP_001237215.2 (SEQ ID NO: 147) e NP_001235420.1 (SEQ ID NO: 148).
[0075] FIG. 27 mostra um alinhamento de múltiplas sequências das proteínas do Grupo 3 da árvore filogenética na FIG. 23 de acordo com CLUSTAL O (1.2.4). As proteínas do Grupo 3 têm termos GO de inibidor da pectinesterase ou proteína da superfamília do inibidor de invertase de plantas/pectina metilesterase. As sequências são as seguintes: XP_003517432.1 (SEQ ID NO: 149), XP_003530773.1 (SEQ ID NO: 150), XP_003525240.1 (SEQ ID NO: 151).
[0076] FIGURAS 28A-B mostram um alinhamento de múltiplas sequências das proteínas do Grupo 4 da árvore filogenética na FIG. 23 de acordo com CLUSTAL O (1.2.4). As proteínas do Grupo 4 têm termos GO de inibidores prováveis de pectinesterase/pectinesterase. As sequências são as seguintes: XP_003531408.1 (SEQ ID NO: 152), XP_003526711.1 (SEQ ID NO: 153), XP_003553658.2 (SEQ ID NO: 154).
[0077] FIGURAS 29A-B mostram um alinhamento de múltiplas sequências das proteínas do Grupo 5 da árvore filogenética na FIG. 23 de acordo com CLUSTAL O (1.2.4). As proteínas do Grupo 5 têm termos GO de inibidores de pectinesterase/pectinesterase. As sequências são as seguintes: XP_025981966.1 (SEQ ID NO: 155) e XP_003528739.1 (SEQ ID NO: 156).
[0078] FIG. 30 mostra uma árvore filogenética (cladograma) de proteínas codificadas por genes expressos diferencialmente em categorias de ontologia genética selecionada (GO) que foram identificadas em dados de sequenciamento de RNA de folhas de linhagens de soja transformadas com pMBXO74 (FIG. 20A) expressando o gene CCP1 de um promotor constitutivo 35S (comparação C1/A na TABELA 18). A proteína de ISY Camelina de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) foi incluída no alinhamento. As categorias de GO selecionadas são mostradas na TABELA 16. Os genes que são regulados negativamente são indicados na figura com um triângulo. Os genes que são regulados positivamente em mais de 100 vezes são indicados na figura com um círculo sombreado.
[0079] FIG. 31 mostra uma árvore filogenética (cladograma) de proteínas codificadas por genes diferencialmente expressos em categorias de ontologia genética selecionada (GO) que foram identificados em dados de sequenciamento de RNA de sementes em maturação de uma linhagem de soja transformada com pMBXO74 (FIG. 20A) expressando o gene CCP1 de um promotor constitutivo 35S (comparação F1/D na TABELA 19). A proteína de ISY Camelina de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) foi incluída no alinhamento. As categorias de GO selecionadas são mostradas na TABELA 16. Os genes que são regulados negativamente são indicados na figura com um triângulo. Os genes que são regulados positivamente em mais de 100 vezes são indicados na figura com um círculo sombreado.
[0080] FIG. 32 mostra uma árvore filogenética (cladograma) de proteínas codificadas por genes expressos diferencialmente em categorias de ontologia genética selecionada (GO) que foram identificadas em dados de sequenciamento de RNA de sementes em desenvolvimento de uma linhagem de soja transformada com pMBXO75 (FIG. 20C) expressando o gene CCP1 de um promotor específico de semente de oleosina de soja (comparação P/L na TABELA 19). A proteína de ISY Camelina de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) foi incluída no alinhamento. As categorias de GO selecionadas são mostradas na TABELA 16. Os genes que são regulados negativamente são indicados na figura com um triângulo. Os genes que são regulados positivamente em mais de 100 vezes são indicados na figura com um círculo sombreado.
[0081] FIG. 33 mostra uma árvore filogenética (cladograma) de proteínas codificadas por genes expressos diferencialmente em categorias de ontologia genética selecionada (GO) que foram identificados em dados de sequenciamento de RNA de sementes em maturação de uma linhagem de soja transformada com pMBXO75 (FIG. 20C) expressando o gene CCP1 de um promotor específico de semente de oleosina de soja (comparação K/H na TABELA 19). A proteína de ISY Camelina de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) foi incluída no alinhamento. As categorias de GO selecionadas são mostradas na TABELA 16. Os genes que são regulados negativamente são indicados na figura com um triângulo. Os genes que são regulados positivamente em mais de 100 vezes são indicados na figura com um círculo sombreado.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0082] Uma planta terrestre geneticamente modificada que expressa uma proteína que tem homologia a um inibidor de invertase de plantas e/ou a um inibidor de pectina metilesterase e que aumenta o rendimento de sementes com expressão aumentada ("uma proteína de ISY") é revelada. A planta terrestre geneticamente modificada compreende um gene modificado para a proteína de ISY. A proteína de ISY compreende um ou mais dentre (i) uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; (ii) um fragmento de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; (iii) um homólogo de Camelina sativa de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; ou (iv) um ortólogo de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2. O gene modificado compreende (i) um promotor e (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de ISY. O promotor não é cognato em relação à sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de ISY. O gene modificado é configurado de modo que transcrição da sequência de ácido nucleico seja iniciada a partir do promotor e resulte em expressão da proteína de ISY.
[0083] A expressão constitutiva de um transportador de metabólito mitocondrial codificado pelo gene de algas CCP1 em Camelina foi observada não apenas para aumentar a fixação de carbono e o rendimento de sementes, mas também para resultar em sementes de tamanho menor (WO2015/103074, para a Universidade de Massachusetts). De forma independente, foram mostrados que mudanças similares no rendimento da semente e no tamanho da semente são obtidas quando o CCP1 é expresso em colza e soja. A análise da expressão de gene das linhagens de Camelina de alto rendimento CCP1 foi realizada usando a tecnologia RNASeq para determinar os impactos da superexpressão de gene CCP1 na expressão de genes nativos da Camelina. Um gene em particular, Csa15g017550 (SEQ ID NO: 1) que codifica uma proteína de 134 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) foi encontrado para ser altamente regulado positivamente e é um inibidor de invertase de plantas putativo e/ou inibidor de pectina metilesterase (também denominado "inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase"). As análises da região a montante do gene Csa15g017550 mostram que existem vários locais iniciais alternativos (FIG. 5). Usando o códon inicial previsto de metionina de acordo com Camelina sativa Genome Browser, Csa15g017550.1 produz uma proteína de 134 aminoácidos (SEQ ID NO: 2). Um códon inicial de leucina alternativo a montante, codificado por TTG, produz uma proteína de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5). Este códon inicial alternativo foi escolhido com base em alinhamentos com outros inibidores de invertase da parede celular (FIG. 1). A família de genes do inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase é muito grande e diversa com a maioria dos genes sendo atribuída a esta família com base em regiões de homologia de sequência limitada na maioria dos casos. Muitos poucos genes individuais foram caracterizados no nível molecular e, portanto, é razoável concluir que, para a grande maioria dos genes listados nesta família, sua atividade e função reais são desconhecidas. Genes inibidores de invertase da parede celular (CWII) para aumentar o rendimento de sementes foram estudados em Camelina. O PCT/US2014/043407 para a Universidade Estadual da Carolina do Norte demonstrou que a expressão reduzida dos genes CWII em Camelina resulta em rendimento de sementes aumentado.
[0084] Foi hipotetizado que a expressão de CCP1 nas plantas de alto rendimento aumentou o nível de carbono fixo e aumentou o número de sementes, embora com um tamanho de semente menor. Foi hipotetizado que homólogo do gene inibidor de invertase de plantas putativo regulado positivamente/inibidor de pectina metilesterase pode ser responsável pela redução do fluxo de carbono para o número de sementes aumentado, resultando em um tamanho de semente menor. A fim de testar esta hipótese, foram superexpressos os 134 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) e 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) das proteínas ortólogas do inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase em Camelina usando um promotor constitutivo com a expectativa de que isso resultaria em plantas com tamanho de sementes reduzido e menor rendimento de sementes.
[0085] Surpreendentemente, foi descoberto que a expressão aumentada deste gene ortólogo de inibidor de invertase de plantas putativo/inibidor de pectina metilesterase resultou em um grande aumento na ramificação, rendimento de sementes e, em algumas plantas, um aumento no tamanho médio de sementes individuais.
[0086] Com base nesses resultados, foi reinvestigada a homologia com genes de inibidor de invertase de plantas e/ou inibidor de pectina metilesterase caracterizados e foi concluído que este gene é um novo gene com uma função ainda desconhecida em Camelina. Além disso, embora Camelina seja um alohexaplóide com 3 cópias de cada cromossomo, foi descoberto que Csa15g017550.1 está presente apenas em uma única cópia. O exame da região do cromossomo onde Csa15g017550.1 está localizado nos outros dois cromossomos indicou que o Csa15g017550.1 não está presente nos outros dois cromossomos. As pesquisas tBLASTn (pesquisa exclui Camelina sativa) e FASTA de outras espécies de cultura para identificar homólogos de Camelina Csa15g017550 não revelaram nenhum gene que codifica proteínas com mais de 58% de identidade ao longo do comprimento da proteína inteira. Por essas razões, acredita-se que o gene Camelina Csa15g017550 seja muito raro e de função desconhecida. Para distingui-lo dos genes de inibidores de invertase de plantas e inibidores de pectina metilesterase caracterizados, foram referidos a este gene e genes similares com homologia fraca aos genes de inibidores de invertase de plantas e inibidores de pectina metilesterase em outras espécies de cultura cuja expressão é aumentada pela expressão de CCP1 como o gene de rendimento de sementes aumentado (“gene de ISY”).
[0087] Desta maneira, são reveladas aqui plantas terrestres geneticamente modificadas com expressão aumentada do gene de ISY (SEQ ID NO: 1) que codifica uma proteína de 134 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) e constructos genéticos, materiais e métodos para fazer tais plantas. Essas plantas podem ter aumento da ramificação e/ou maior rendimento de sementes, tubérculos ou frutos e, opcionalmente, o tamanho de sementes, tubérculos ou frutos aumentado em comparação com plantas terrestres de referência que não têm expressão aumentada de gene de ISY.
[0088] Também são revelados aqui constructos genéticos de modo que o gene de ISY seja expresso a partir de diferentes locais iniciais da tradução, tal como o gene de ISY com um códon inicial alternativo (SEQ ID NO: 6) que codifica uma proteína de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5), e as plantas que os expressam que têm ramificação aumentada e/ou maior rendimento de sementes, tubérculos ou frutos e, opcionalmente, tamanho de sementes, tubérculo ou fruto aumentado em comparação com as mesmas plantas que não têm expressão aumentada de gene de ISY.
[0089] Também são revelados aqui métodos para identificar genes ISY em qualquer planta terrestre. Os métodos compreendem plantas terrestres geneticamente modificadas para ter expressão aumentada de um ou mais genes transportadores de metabólitos mitocondriais para produzir plantas com maior rendimento de sementes e, opcionalmente, tamanho de semente menor, em seguinda, realizando estudos de expressão de gene para identificar genes ISY de plantas nativas cuja expressão é significativamente aumentada nas plantas com expressão aumentada de um ou mais genes transportadores de metabólitos mitocondriais, em que os genes ISY são genes de plantas nativos cuja expressão é significativamente aumentada e que têm homologia de sequência com genes de inibidores de invertase/inibidores de pectina metilesterase. Foram referidos a esses genes aqui como genes ISY. Um gene de ISY pode ser, por exemplo, um gene que codifica uma proteína com 10-65% de identidade de sequência com, pelo menos, uma proteína codificada por um gene da família de genes de inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase e cuja expressão é significativamente aumentada, por exemplo, em pelo menos 5%, 10%, 20% ou mais, em plantas modificadas para ter maior expressão de um ou mais genes transportadores de metabólitos mitocondriais.
[0090] Também são reveladas aqui plantas terrestres geneticamente modificadas para ter expressão aumentada de genes ISY identificados pelos constructos, materiais e métodos genéticos mencionados acima com ramificação aumentada e/ou maior rendimento de sementes, tubérculos ou frutos e, opcionalmente, tamanho de sementes, tubérculos ou frutos aumentado.
[0091] Também são reveladas aqui plantas terrestres geneticamente modificadas feitas usando os materiais e métodos com expressão aumentada de genes ISY e expressão aumentada de genes transportadores de metabólitos mitocondriais que têm maior rendimento de sementes, tubérculos ou frutos e, possivelmente, tamanho aumentado de sementes, tubérculos ou frutos. As plantas são modificadas para ter níveis maiores de expressão de genes ISY identificados, de modo que tenham maior rendimento de sementes, frutos ou tubérculos. De preferência, as plantas modificadas para ter maior expressão de genes ISY são da mesma espécie de planta que os genes ISY usados para aumentar a expressão de genes ISY. Por exemplo, o gene de ISY de Camelina é, de preferência, expresso em Camelina, o gene de ISY de colza é, de preferência, expresso em colza, o gene de ISY de soja é, de preferência, expresso em soja, arroz ISY é, de preferência, expresso em arroz, o gene de ISY de trigo é, de preferência, expresso em trigo, o gene de ISY de batata é, de preferência, expresso em batata, o gene de ISY da beterraba sacarina é, de preferência, aumentado na beterraba sacarina, o gene de ISY do tomate é, de preferência, aumentado no tomate, e assim por diante. Quando a expressão de gene de ISY é aumentada, em seguida, o grau de ramificação, rendimento de sementes, frutos ou tubérculos e, opcionalmente, o tamanho da semente, fruto ou tubérculo também são aumentados.
[0092] O termo "planta terrestre" inclui plantas maduras, sementes, brotos e mudas, e partes, material de propagação, tecido de órgãos de planta, protoplastos, calosidades e outras culturas, por exemplo, culturas de células, derivadas de plantas pertencentes ao sub-reino de planta Embryophyta, e todas as outras espécies de grupos de células de planta fornecendo unidades funcionais ou estruturais, também pertencentes ao sub-reino de planta Embryophyta. O termo “plantas maduras” refere-se a plantas em qualquer estágio de desenvolvimento além da muda. O termo “mudas” refere-se a plantas jovens e imaturas em um estágio inicial de desenvolvimento.
[0093] As plantas terrestres abrangem todas as plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas anuais e perenes e incluem, a título de exemplo, mas não por limitação, as dos gêneros Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solarium, Petúnia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Zea, Elaeis, Saccharum, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorgo, Picea, Populus, Camelina, Beta, Solanum e Carthamus. As plantas preferidas são aquelas das seguintes famílias de plantas: Amaranthaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Poaceae,
Rosaceae, Rubiaceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae, Sterculiaceae, Tetragoniaceae, Theaceae e Umbelliferae.
[0094] A planta terrestre pode ser uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea. As plantas dicotiledôneas preferidas são selecionadas, em particular, a partir das plantas de cultura dicotiledôneas, tais como, por exemplo, Asteraceae, tais como girassol, tagetes ou calêndula e outros; Compositae, especialmente o gênero Lactuca, muito particularmente as espécies sativa (alface) e outros; Cruciferae, particularmente o gênero Brassica, muito particularmente as espécies napus (colza), campestris (beterraba), oleracea cv Tastie (repolho), oleracea cv Snowball Y (couve-flor) e oleracea cv Emperor (brócolis) e outras couves; e o gênero Arabidopsis, muito particularmente as espécies thaliana, e agrião ou colza e outros; Cucurbitaceae tais como melão, abóbora/abóbora-porqueira ou abobrinha e outros; Leguminosae, particularmente o gênero Glycine, muito particularmente a espécie max (soja), soja e alfafa, ervilha, feijão ou amendoim e outros; Rubiaceae, de preferência, a subclasse Lamiidae tais como, por exemplo, Coffea arabica ou Coffea liberica (arbusto de café) e outros; Solanaceae, particularmente o gênero Lycopersicon, muito particularmente a espécie esculentum (tomate), o gênero Solanum, muito particularmente a espécie tuberosum (batata) e melongena (berinjela) e o gênero Capsicum, muito particularmente o gênero annuum (pimenta) e tabaco ou colorau e outros; Sterculiaceae, de preferência, a subclasse Dilleniidae tais como, por exemplo, Theobroma cacao (arbusto de cacau) e outros; Theaceae, de preferência, a subclasse Dilleniidae tais como, por exemplo, Camellia sinensis ou Thea sinensis (arbusto de chá) e outros; Umbelliferae, particularmente o gênero Daucus (muito particularmente a espécie carota (cenoura)) e Apium (muito particularmente a espécie graveolens dulce (aipo)) e outros; e linhaça, algodão, cânhamo, linho, pepino, espinafre, cenoura, beterraba sacarina e as várias espécies de árvores, nozes e videiras, em particular, frutos banana e kiwi. As plantas monocotiledôneas preferidas incluem milho, arroz, trigo, cana-de- açúcar, sorgo, aveia e cevada.
[0095] De particular interesse são as plantas oleaginosas. Nas plantas oleaginosas de interesse, o óleo é acumulado na semente e pode ser responsável por mais de 10%, mais de 15%, mais de 18%, mais de 25%, mais de 35%, mais de 50% em peso do peso de sementes secas. As oleaginosas abrangem a título de exemplo: Borago officinalis (borragem); Camelina (linho falso); espécies de Brassica, tais como B. campestris, B. napus, B. rapa, B. carinata (mostarda, colza ou nabo); Cannabis sativa (cânhamo); Carthamus tinctorius (cártamo); Cocos nucifera (coco); Crambe abyssinica (crambe); espécies Cuphea (as espécies Cuphea produzem ácidos graxos de comprimento de cadeia médio, em particular, para aplicações industriais); Elaeis guinensis (óleo de palma africano); Elaeis oleifera (óleo de palma americano); Glycine max (soja); Gossypium hirsutum (algodão americano); Gossypium barbadense (algodão egípcio); Gossypium herbaceum (algodão asiático); Helianthus annuus (girassol); Jatropha curcas (Jatropha); Linum usitatissimum (linhaça ou linho); Oenothera biennis (prímula da noite); Olea europaea (azeitona); Oryza sativa (arroz); Ricinus communis (castor); Sesamum indicum (gergelim); Thlaspi caerulescens (pennycress); espécie Triticum (trigo); Zea mays (milho), e várias espécies de nozes tal como, por exemplo, noz ou amêndoa.
[0096] As espécies de Camelina, comumente conhecidas como linho falso, são nativas das regiões mediterrâneas da Europa e da Ásia e parecem estar particularmente adaptadas às zonas de clima semiárido frio (estepes e pradarias). A espécie Camelina sativa foi historicamente cultivada como uma cultura oleaginosa para a produção de óleo vegetal e ração animal. Além de ser útil como uma cultura oleaginosa industrial, Camelina é um sistema modelo muito útil para o desenvolvimento de novas ferramentas e abordagens geneticamente modificadas para aumentar o rendimento das culturas em geral e para aumentar o rendimento de sementes e óleo de sementes em particular. Melhorias do transgene demonstradas em Camelina obtidas por meio de engenharia genética de genes específicos podem, em seguida, ser implantadas em outras grandes culturas de alimentos e rações, incluindo culturas oleaginosas, incluindo espécies de Brassica, incluindo B. napus (colza), B. rapa, B. juncea, B. carinata, crambe, soja, girassol, cártamo, óleo de palma, linho e algodão e culturas de amido, incluindo milho, grão, sorgo, trigo, arroz, aveia, cevada, batata e culturas produtoras de sacarose, tal como beterraba sacarina. Cana-de-açúcar e pulses incluindo ervilhas, grão de bico, lentilhas e similares.
[0097] Como será aparente, a planta terrestre pode ser uma planta de fotossíntese C3, ou seja, uma planta em que RubisCO catalisa a carboxilação de ribulose-1,5-bisfosfato pelo uso de CO2 retirado diretamente da atmosfera,
tais como por exemplo, Camelina, colza, soja, trigo, arroz, aveia, cevada, batata doce, batata, beterraba sacarina entre outros. A planta terrestre também pode ser uma planta C4, ou seja, uma planta em que RubisCO catalisa a carboxilação de ribulose-1,5-bifosfato pelo uso de CO2 transportado por meio de malato ou aspartato de células mesófilas para agrupar células de bainha, tais como por exemplo milho, painço, sorgo, cana-de-açúcar entre outros.
[0098] Desta maneira, em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta C3. Além disso, em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta C4. Além disso, em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada é uma importante planta de cultura alimentícia selecionada a partir do grupo que consiste em milho, trigo, aveia, cevada, soja, painço, sorgo, batata, beterraba sacarina, pulse, grão de bico, ervilha verde, ervilha amarela, lentilhas, feijão, tomate e arroz. Em alguns desses exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada é milho. Além disso, em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta de cultura oleaginosa selecionada a partir do grupo que consiste em camelina, espécies de Brassica (por exemplo, B. napus (colza), B. rapa, B. juncea e B. carinata), crambe, soja, girassol, cártamo, óleo de palma, linho e algodão.
[0099] Como observado, a planta terrestre geneticamente modificada compreende um gene modificado para a proteína de ISY. A proteína de ISY compreende um ou mais dentre (i) uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; (ii) um fragmento de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; (iii) um homólogo de Camelina sativa de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; ou (iv) um ortólogo de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2.
[0100] O termo "fragmento", tal como aqui utilizado em referência a uma sequência polinucleotídica ou polipeptídica, significa uma parte contígua da sequência polinucleotídica ou sequência polipeptídica que é menor do que a sequência polinucleotídica ou polipeptídica inteira.
[0101] As frases "fragmento de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2" e "fragmento de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2", conforme usadas aqui,
significam pelo menos 30 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2. Tal fragmento pode ser, por exemplo, 30 ou mais aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2. Tal fragmento também pode ser, por exemplo, 40 ou mais, 50 ou mais, 60 ou mais, 70 ou mais, 80 ou mais, 90 ou mais, ou 100 ou mais aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2. Tal fragmento também pode ser, por exemplo, 114 a 133 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2.
[0102] O termo "ortólogo", como utilizado aqui, significa uma sequência polinucleotídica ou sequência polipeptídica possuindo um alto grau de homologia, ou seja, relação de sequência, com uma sequência objeto e sendo um equivalente funcional da sequência objeto, em que a sequência que é ortóloga é de uma espécie que é diferente daquela da sequência objeto. A homologia pode ser quantificada determinando o grau de identidade e/ou similaridade entre as sequências que estão sendo comparadas.
[0103] Conforme usado aqui, "porcentagem de homologia" de duas sequências polinucleotídicas ou de duas sequências polipeptídicas é a porcentagem de identidade ao longo do comprimento de toda a sequência determinada usando a função de alinhamento ALIGNX do pacote de software Vector NTI (Vector NTI Advance, Versão 11.5.3, ThermoFisher), que usa o algoritmo Clustal W. Parâmetros padrão do programa foram usados.
[0104] A porcentagem de identidade de sequência entre dois polipeptídeos também pode ser determinada fazendo um alinhamento de sequência em pares. Isso pode ser feito usando a ferramenta EMBOSS Needle Pairwise Sequence Alignment (PROTEIN) usando as configurações padrão (matriz: BLOSUM62; lacuna aberta: 10; extensão da lacuna: 0,5; formato de saída: par; penalidade da lacuna final: falso; lacuna aberta final: 10; extensão da lacuna final: 0,5) (site:ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/). Isso também pode ser feito usando outras ferramentas de alinhamento de sequência em pares que são análogas.
[0105] No caso de sequências polipeptídicas que são menos de 100% idênticas a uma sequência de referência, as posições não idênticas são, de preferência, mas não necessariamente, substituições conservativas para a sequência de referência. As substituições conservativas incluem tipicamente substituições dentro dos seguintes grupos: glicina e alanina; valina, isoleucina e leucina; ácido aspártico e ácido glutâmico; asparagina e glutamina; serina e treonina; lisina e arginina; e fenilalanina e tirosina.
[0106] Quando um polipeptídeo particular é dito ter uma identidade percentual específica com um polipeptídeo de referência de um comprimento definido, a identidade percentual é relativa ao peptídeo de referência. Assim, um peptídeo que é 50% idêntico a um polipeptídeo de referência que tem 100 aminoácidos de comprimento pode ser um polipeptídeo de 50 aminoácidos que é completamente idêntico a uma porção de 50 aminoácidos de comprimento do polipeptídeo de referência. Também pode ser um polipeptídeo de 100 aminoácidos de comprimento que é 50% idêntico ao polipeptídeo de referência em todo o seu comprimento. Muitos outros polipeptídeos atenderão aos mesmos critérios.
[0107] Para referência, os genes ISY, conforme definidos aqui, podem ter alguma homologia a genes clássicos de inibidor de invertase de plantas e/ou inibidor de pectina metilesterase. Os genes de inibidor de invertase de plantas e de inibidor de pectina metilesterase são bem conhecidos na técnica e compreendem uma grande família de genes na maioria das espécies de cultura. Por exemplo, as pesquisas de BLAST usando o banco de dados do genoma Camelina (site://www.camelinadb.ca/prairiegold/cgi-bin/blast.cgi) renderam 49 resultados ao usar a proteína de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) e 17 resultados adicionais ao usar a sequência de codificação de 507 pb (SEQ ID NO: 6) (TABELA 6). Pesquisas por palavra-chave do banco de dados NCBI Entrez Gene (site://www.ncbi.nlm.nih.gov/search/?ga_suggest=a&utm_expid =.fAeHyO5JTBGxnObh2WlrCA.1&utm_referrer=https%3A%2F%2Fwww.ncbi.nl m.nih.gov%2FClass%2FMLACourse%2FOriginal8Hour%2FEntrez%2F), encontraram um total de 324 genes no genoma Camelina. Isso incluiu 51 anotados como inibidores de invertase, 200 anotados como inibidores de pectinesterase/pectinesterase, bem como, 73 sequências que pertencem a uma subfamília não caracterizada de domínios de inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase. Em sua maioria, os estudos sistemáticos sobre a expressão e função de genes individuais dentro da família são muito limitados, com apenas alguns genes sendo estudados em alguns detalhes. Exemplos de genes CWII em Camelina que foram estudados incluem dois genes inibidores de invertase da parede celular descritos em Sederoff et al., Pub. U.S. No. 2016/0138038. Sederoff usou o silenciamento do gene RNAi para reduzir a expressão desses genes em Camelina e demonstrou um aumento no rendimento de sementes. Três cópias de cada um desses genes estão presentes no genoma Camelina (Camelina é uma alohexaplóide). Estas incluem homeólogos do inibidor de invertase da parede celular 1 (CWII1) (SEQ ID NO: 76 (Csa03g051630), SEQ ID NO: 78 (Csa14g051860) e SEQ ID NO: 80 (Csa17g075360)) e homeólogos de CWII2 (SEQ ID NO: 82 (Csa02g074171), SEQ ID NO: 84 (Csa11g101740), e SEQ ID NO: 86 (Csa18g038260)). Um alinhamento CLUSTAL das proteínas codificadas por estes genes para a proteína de ISY é mostrado na FIG. 2 e sua homologia percentual com a proteína de ISY Camelina de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) e 134 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) é mostrada na TABELA 7.
[0108] Desta maneira, o gene de ISY é derivado de uma planta ou é uma versão sintética de um gene de ISY de planta.
[0109] Em alguns exemplos, a planta de origem é um tipo diferente de planta do que a planta terrestre geneticamente modificada. De acordo com estes exemplos, a proteína de ISY pode ser heteróloga em relação à planta terrestre geneticamente modificada. Com isso, entende-se que a proteína de ISY particular derivada da planta de origem não é normalmente codificada, expressa ou de outra forma presente em plantas do tipo a partir do qual a planta terrestre geneticamente modificada é derivada. Isso pode ser porque as plantas do tipo do qual a planta terrestre geneticamente modificada é derivada normalmente não codificam, expressam ou de outra forma, incluem a proteína de ISY particular, e isso pode ser verdade quer as plantas expressem ou não normalmente uma proteína de ISY endógena diferente. A planta terrestre geneticamente modificada expressa a proteína de ISY particular com base na expressão de gene modificado para a proteína de ISY. Desta maneira, o gene modificado pode ser usado para realizar a expressão modificada da proteína de ISY e, em particular, a expressão aumentada de quaisquer proteínas de ISY endógenas.
[0110] Também em alguns exemplos, a planta de origem é o mesmo tipo de planta que a planta terrestre geneticamente modificada. De acordo com estes exemplos, a proteína de ISY pode ser homóloga em relação à planta terrestre geneticamente modificada. Com isso, entende-se que a proteína de ISY particular é normalmente codificada, e pode normalmente ser expressa, em plantas do tipo a partir do qual a planta terrestre geneticamente modificada é derivada. De acordo com estes exemplos, a planta pode ser geneticamente modificada para incluir cópias adicionais de um gene para a proteína de ISY e/ou para expressar uma cópia endógena de um gene para a proteína de ISY em níveis maiores e/ou de uma maneira preferida de tecido com base na modificação e/ou substituição de um promotor pela cópia endógena do gene. Novamente, a planta terrestre geneticamente modificada expressa a proteína de ISY particular com base em compreender o gene modificado para a proteína de ISY, resultando na expressão modificada da proteína de ISY e, particularmente, a expressão aumentada de gene de ISY.
[0111] Como discutido acima, acredita-se que a expressão aumentada de uma proteína de ISY pode aumentar o fluxo de carbono do tecido de origem para o tecido coletor. O tecido coletor pode ser semente, fruto ou tubérculo.
[0112] Proteínas de ISY adequadas são reveladas aqui ou podem ser identificadas usando os materiais e métodos revelados aqui, por exemplo, aumentando a expressão de transportadores mitocondriais em uma planta e realizando análise de expressão de gene seguidas por pesquisas de homologia de sequência de genes cuja expressão é aumentada. Essas pesquisas podem ser realizadas, por exemplo, pelo uso de BLAST, por exemplo, tblastn e bancos de dados incluindo polinucleotídeos traduzidos, sequências shotgun do genoma inteiro, e/ou sequências de montagem do transcriptoma, entre outras sequências e bancos de dados. Os ortólogos potenciais de ISY podem ser identificados, por exemplo, com base na porcentagem de identidade e/ou porcentagem de similaridade, com relação à sequência polipeptídica, de sequências individuais nas bases de dados em comparação com proteínas de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 2 e/ou SEQ ID NO: 5. Por exemplo, ortólogos potenciais de ISY podem ser identificados com base na porcentagem de identidade de uma sequência individual em um banco de dados de pelo menos 25%, por exemplo, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, em que a sequência individual é derivada de uma planta terrestre ou uma alga eucariótica.
[0113] Após a identificação de um gene de ISY, a engenharia genética de uma planta para expressar o gene de ISY ou uma versão truncada do mesmo pode ser realizada por métodos que são conhecidos na técnica, conforme discutidos em detalhes abaixo.
[0114] A planta terrestre geneticamente modificada pode ser uma planta terrestre geneticamente modificada que não inclui proteínas heterólogas, por exemplo, em que a proteína de ISY é homóloga em relação à planta terrestre geneticamente modificada, ou apenas uma proteína heteróloga, por exemplo, em que a única proteína de planta heteróloga que a planta terrestre geneticamente modificada compreende é a proteína de ISY.
[0115] Considerando a proteína de ISY em mais detalhes, novamente como observado, a proteína de ISY compreende um ou mais dentre (i) uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; (ii) um fragmento de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; (iii) um homólogo de Camelina sativa de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; ou (iv) um ortólogo de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2.
[0116] Em alguns exemplos, a proteína de ISY compreende uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2. Em alguns desses exemplos, a proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2 corresponde a uma ou mais das proteínas de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 2, proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5, proteína de ISY modificada de Camelina sativa de SEQ ID NO: 138, ou proteína de ISY modificada de Camelina sativa de SEQ ID NO: 140. A proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 2 é a proteína de ISY de Camelina sativa possuindo 134 aminoácidos como aqui descrito. Da mesma forma, a proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5 é a proteína de ISY de Camelina sativa possuindo 168 aminoácidos como aqui descrito. A proteína de ISY modificada de Camelina sativa de SEQ ID NO: 138 é uma versão modificada da proteína de ISY de SEQ ID NO: 5 na qual a leucina N-terminal foi substituída por uma metionina N-terminal. Esta proteína de ISY modificada pode ser codificada, por exemplo, pela sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 137, que é idêntica à SEQ ID NO: 6, exceto que o códon inicial alternativo TTG foi substituído por um códon inicial ATG. A proteína de ISY modificada de Camelina sativa de SEQ ID NO: 140 é uma versão modificada da proteína de ISY de SEQ ID NO: 5 na qual a leucina N-terminal foi precedida por uma metionina N-terminal. Esta proteína de ISY modificada pode ser codificada, por exemplo, pela sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 139, que é idêntica à SEQ ID NO: 6, exceto que o códon inicial alternativo TTG foi precedido por um códon inicial ATG. A proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2 também pode corresponder a proteínas de ISY modificadas adicionais, por exemplo, proteínas de ISY modificadas adicionais similares à SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 138 ou SEQ ID NO: 140, mas incluindo um ou mais resíduos de aminoácidos adicionais no N-terminal e/ou C-terminal.
[0117] Em alguns exemplos, a proteína de ISY compreende um fragmento de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2. Em alguns desses exemplos, o fragmento corresponde a 30 ou mais aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2. Em alguns destes exemplos, o fragmento corresponde a 40 ou mais, 50 ou mais, 60 ou mais, 70 ou mais, 80 ou mais, 90 ou mais, ou 100 ou mais aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2. Em alguns destes exemplos, o fragmento corresponde a 114 a 133 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2. Assim, em alguns desses exemplos, o fragmento corresponde a uma proteína que é idêntica à proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 2, exceto que o fragmento carece de 1 a 20 aminoácidos no N- terminal do fragmento em relação à SEQ ID NO: 2. Também em alguns exemplos, o fragmento corresponde a uma proteína que é idêntica à proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 2, exceto que o fragmento carece de 1 a 20 aminoácidos no C-terminal do fragmento em relação à SEQ ID NO: 2. Também em alguns exemplos, o fragmento corresponde a uma proteína que é idêntica à proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 2, exceto que o fragmento carece de 1 a 10 aminoácidos no N-terminal do fragmento, e 1 a 10 aminoácidos no C-terminal do fragmento, em relação à SEQ ID NO: 2. Em alguns exemplos, o fragmento é como descrito, exceto que o fragmento também inclui um resíduo de metionina no N-terminal do fragmento. Com base nos resultados obtidos para a proteína de ISY de 134 aminoácidos de SEQ ID NO: 2, que carece de um peptídeo de sinal e um trecho de aminoácidos N-terminal em relação aos inibidores de invertase caracterizados, acredita-se que a expressão aumentada de fragmentos de proteínas de ISY seria suficiente para o rendimento de sementes, frutos e/ou tubérculos aumentado.
[0118] Em alguns exemplos, a proteína de ISY compreende um homólogo de Camelina sativa de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2. Em alguns desses exemplos, o homólogo de Camelina sativa corresponde a uma ou mais proteínas de Camelina sativa de SEQ ID NOS: 21-40. Esses homólogos são descritos abaixo.
[0119] Em alguns exemplos, a proteína de ISY compreende o ortólogo de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2. Em alguns destes exemplos, o ortólogo corresponde a uma ou mais (i) proteínas de colza de SEQ ID NOS: 69, 71, 73 e/ou 75; (ii) proteínas de soja de SEQ ID NOS: 89, 91, 93 e/ou 95; ou (iii) proteínas de milho de SEQ ID NOS: 99, 101, 103, 105 e/ou 107. Estes ortólogos são descritos abaixo.
[0120] Em alguns exemplos, a proteína de ISY compreende (i) (a) um resíduo de cisteína na posição 40, (b) um resíduo de leucina na posição 59, (c) um resíduo de cisteína na posição 98, e (d) um resíduo de cisteína na posição 138, com a numeração das posições em relação à proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5, e (ii) uma identidade geral de, pelo menos, 10% com a proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 2. Em alguns destes exemplos, a proteína de ISY ainda compreende apenas entre 1 a 14 resíduos de aminoácidos N-terminais para o resíduo de cisteína na posição 40, com numeração das posições em relação à proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5. Também em alguns destes exemplos, a proteína de ISY carece de um peptídeo de sinal N-terminal. Também em alguns desses exemplos, a proteína de ISY carece de um motif de PKF. Com base nos resultados obtidos para a proteína de ISY de 134 aminoácidos de SEQ ID NO: 2, que inclui um resíduo de cisteína na posição 40, um resíduo de leucina na posição 59, um resíduo de cisteína na posição 98, e um resíduo de cisteína na posição 138, com numeração de posições em relação à proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5, e que inclui apenas entre 1 a 14 resíduos de aminoácidos N- terminais para o resíduo de cisteína na posição 40, a saber 5 resíduos de aminoácidos N-terminais para o resíduo de cisteína na posição 40, também com numeração de posições em relação à proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5, e que também carece de um peptídeo de sinal N-terminal e um motif de PKF, acredita-se que a expressão aumentada de uma proteína de ISY tendo essas características seria suficiente para o rendimento de sementes,
frutos e/ou tubérculos aumentado.
[0121] Em alguns exemplos, a proteína de ISY compreende (i) (a) um resíduo de cisteína na posição 25, (b) um resíduo de cisteína na posição 40, (c) um resíduo de leucina na posição 59, (d) um resíduo de cisteína na posição 98, e (e) um resíduo de cisteína na posição 138, com numeração de posições em relação à proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5, e (ii) uma identidade geral de, pelo menos, 10% com a proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5. Em alguns desses exemplos, a proteína de ISY carece de um motif de PKF. Com base nos resultados obtidos para a proteína de ISY de 168 aminoácidos de SEQ ID NO: 5, que inclui um resíduo de cisteína na posição 25, um resíduo de cisteína na posição 40, um resíduo de leucina na posição 59, um resíduo de cisteína na posição 98, e um resíduo de cisteína na posição 138, com numeração de posições em relação à proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5, e que carece de um motif de PKF, acredita-se que a expressão aumentada de uma proteína de ISY com essas características também seria suficiente para rendimento de sementesa, rendimento de frutos e/ou rendimento de tubérculos aumentados.
[0122] O gene modificado para o gene de ISY compreende (i) um promotor e (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica o gene de ISY.
[0123] O promotor é não cognato em relação à sequência de ácido nucleico que codifica o gene de ISY. Um promotor que não é cognato em relação a uma sequência de ácido nucleico significa que o promotor não está naturalmente emparelhado com a sequência de ácido nucleico em organismos dos quais o promotor e/ou a sequência de ácido nucleico são derivados. Em vez disso, o promotor foi emparelhado com a sequência de ácido nucleico com base no uso de técnicas de DNA recombinante para criar um gene modificado.
[0124] O gene modificado para o gene de ISY é configurado de modo que transcrição da sequência de ácido nucleico que codifica o gene de ISY seja iniciada a partir do promotor e resulte em expressão de gene de ISY. Desta maneira, no contexto do gene modificado, o promotor funciona como um promotor da transcrição da sequência de ácido nucleico e, portanto, da expressão de gene de ISY. Em um exemplo preferido, a expressão de gene de ISY é maior na planta terrestre geneticamente modificada do que em uma planta correspondente que não inclui o gene modificado.
[0125] Em alguns exemplos, o promotor é um promotor constitutivo. Em alguns exemplos, o promotor é um promotor específico de semente. Em alguns exemplos, o gene modificado é integrado ao DNA genômico da planta terrestre geneticamente modificada. Em alguns exemplos, o gene modificado é expresso de forma estável na planta terrestre geneticamente modificada. Em alguns exemplos, a sequência de ácido nucleico codifica um gene de ISY de tipo selvagem. Em alguns exemplos, a sequência de ácido nucleico codifica um gene de ISY variante, modificado, mutante ou, de outro tipo não selvagem. Estas características exemplares, e outras, do promotor, a sequência de ácido nucleico e o gene modificado são discutidos em detalhes abaixo.
[0126] A planta terrestre geneticamente modificada também pode ser uma planta terrestre geneticamente modificada que expressa sequências de ácido nucleico que codificam genes ISY de forma específica para sementes e/ou constitutiva, em que as sequências de ácido nucleico que codificam os genes ISY podem ser as mesmas ou diferentes sequências de ácido nucleico, por exemplo, da mesma planta de origem ou de plantas de origem diferentes. Em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada (i) expressa o gene de ISY de uma maneira específica de semente, e (ii) expressa outro gene de ISY constitutivamente, o outro gene de ISY também correspondendo a um ortólogo de ISY derivado de uma planta de origem.
[0127] A planta terrestre geneticamente modificada pode exibir a expressão aumentada da proteína de ISY em comparação com uma planta terrestre de referência que não inclui o gene modificado. A planta terrestre geneticamente modificada também pode apresentar rendimento de sementes, rendimento de frutos e/ou rendimento de tubérculos aumentado em comparação com uma planta terrestre de referência que não inclui o gene modificado. Por exemplo, a planta terrestre geneticamente modificada pode ter um rendimento de sementes que é pelo menos 5% maior, pelo menos 10% maior, pelo menos 20% maior, pelo menos 40% maior, pelo menos 60% maior, ou pelo menos 80% maior, do que para uma planta terrestre de referência correspondente que não compreende o gene modificado. Além disso, por exemplo, a planta terrestre geneticamente modificada pode ter um rendimento de frutos que é, pelo menos, 5% maior, pelo menos 10% maior, pelo menos 20% maior, pelo menos 40% maior, pelo menos 60% maior, ou pelo menos 80% maior, do que para uma planta terrestre de referência correspondente que não compreende o gene modificado. Também, por exemplo, a planta terrestre geneticamente modificada pode ter um rendimento de tubérculo que é, pelo menos, 5% maior, pelo menos 10% maior, pelo menos 20% maior, pelo menos 40% maior, pelo menos 60% maior, ou pelo menos 80% maior, do que para uma planta terrestre de referência correspondente que não compreende o gene modificado.
[0128] Como observado acima, após a identificação de um gene de ISY de uma planta de origem, a engenharia genética de uma planta terrestre para expressar o gene de ISY pode ser realizada por métodos que são conhecidos na técnica, por exemplo, como se segue.
[0129] Constructos de DNA úteis nos métodos descritos aqui incluem vetores de transformação capazes de introduzir transgenes ou outras sequências de ácido nucleico modificadas em plantas. Como utilizado aqui, "geneticamente modificado" refere-se a um organismo no qual um fragmento de ácido nucleico contendo uma sequência de nucleotídeo heteróloga foi introduzido, ou no qual a expressão de um gene homólogo foi modificada, por exemplo, por edição do genoma. Os transgenes no organismo geneticamente modificado são, de preferência, estáveis e herdáveis. Os fragmentos de ácido nucleico heterólogos podem ou não ser integrados no genoma hospedeiro.
[0130] Várias opções de vetores de transformação de plantas estão disponíveis, incluindo aquelas descritas em Gene Transfer to Plants, 1995, Potrykus et al., eds., Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, Genetically engineered Plants: A Production System for Industrial and Pharmaceutical Proteins, 1996, Owen et al., eds., John Wiley & Sons Ltd. England, e Methods in Plant Molecular Biology: A Laboratory Course Manual, 1995, Maliga et al., eds., Cold Spring Laboratory Press, New York. Os vetores de transformação de plantas geralmente incluem uma ou mais sequências de codificação de interesse sob o controle da transcrição de sequências regulatórias 5' e 3', incluindo um promotor, um sinal de terminação e/ou poliadenilação de transcrição e um gene marcador selecionável ou rastreável.
[0131] Muitos vetores estão disponíveis para transformação usando Agrobacterium tumefaciens. Estes tipicamente carregam, pelo menos, uma sequência de T-DNA e incluem vetores tal como pBIN19. Os vetores típicos adequados para a transformação de Agrobacterium incluem os vetores binários pCIB200 e pCIB2001, bem como, o vetor binário pCIB10 e derivados de seleção de higromicina dos mesmos. Ver, por exemplo, Patente U.S. No. 5.639.949.
[0132] A transformação sem o uso de Agrobacterium tumefaciens contorna a necessidade de sequências de T-DNA no vetor de transformação escolhido e, consequentemente, vetores sem essas sequências são utilizados além de vetores, tais como os descritos acima que contêm sequências de T- DNA. A escolha do vetor para as técnicas de transformação que não dependem de Agrobacterium depende muito da seleção preferida para as espécies sendo transformadas. Os vetores típicos adequados para transformação não- Agrobacterium incluem pCIB3064, pSOG 19 e pSOG35. Ver, por exemplo, Patente U.S. No. 5.639.949. Alternativamente, os fragmentos de DNA contendo o transgene e os elementos reguladores necessários para a expressão do transgene podem ser excisados de um plasmídeo e administrados à célula da planta usando métodos mediados por bombardeamento de microprojéteis.
[0133] As nucleases de dedo de zinco (ZFNs) também são úteis na medida em que permitem a clivagem de DNA de filamento duplo em locais específicos em cromossomos de plantas, de modo que a inserção ou deleção de gene alvo pode ser realizada (Shukla et al., 2009, Nature 459: 437- 441; Townsend et al., 2009, Nature 459: 442-445).
[0134] O sistema CRISPR/Cas9 (Sander, J.D. and Joung, J.K., Nature Biotechnology, publicado online em 2 de março de 2014; doi;
10.1038/nbt.2842) é particularmente útil para editar genomas de plantas para modular a expressão de genes homólogos que codificam enzimas. Tudo o que é necessário para alcançar uma edição de CRISPR/Cas é uma enzima Cas, ou outra nuclease CRISPR (Murugan et al. (2017), Mol Cell, 68:15), e um único RNA guia (sgRNA) conforme extensivamente revisado por outros (Belhag et al. (2015), Curr Opin Biotech, 32: 76; Khandagale & Nadaf (2016), Plant Biotechnol Rep, 10: 327-343). Vários exemplos de uso desta tecnologia para editar os genomas de plantas foram agora relatados (Belhaj et al. (2013), Plant Methods, 9:39; Zhang et al. (2016), Journal of Genetics and Genomics, 43: 251).
[0135] TALENs (nucleases efetoras similares a ativador transcricional) ou meganucleases também podem ser usados para a edição do genoma da planta (Malzahn et al., Cell Biosci, 2017, 7:21).
[0136] Os protocolos de transformação, bem como, os protocolos para a introdução de sequências de nucleotídeos em plantas, podem variar dependendo do tipo de planta ou célula de planta alvo para transformação.
Métodos adequados de introdução de sequências de nucleotídeos em células de planta e subsequente inserção no genoma de planta incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4: 320-334), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc.
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USA 83: 5602-5606), transformação mediada por Agrobacterium (Townsend et al., Patente U.S.
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WO US98/01268), transferência de genes direta (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722), e aceleração de partícula balística (ver, por exemplo, Sanford et al., Patente U.S.
No. 4.945.050; Tomes et al. (1995) Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed.
Gamborg and Phillips (Springer- Verlag, Berlin); e McCabe et al.
Biotechnology 6: 923-926 (1988)). Veja também Weissinger et al.
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Particulate Science and Technology 5: 27-37 (1987) (cebola); Christou et al.
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Nos. 5.322.783 e 5.324.646; Tomes et al. (1995) in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed.
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Plant Cell Reports 9: 415-418 (1990) e Kaeppler et al.
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Plant Cell Reports 12: 250-255 (1993) and Christou and Ford Annals of Botany 75: 407-413 (1995) (arroz); Osjoda et al.
Nature Biotechnology 14: 745-750 (1996) (milho através de Agrobacterium tumefaciens). Referências para transformação de protoplastos e/ou arma genética para tecnologia Agrisoma são descritas no documento WO 2010/037209. Métodos para transformar protoplastos de plantas estão disponíveis incluindo transformação usando polietileno glicol (PEG), eletroporação, e precipitação com fosfato de cálcio (ver, por exemplo, Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genet., 199, 183-188; Potrykus et al., 1985, Plant Molecular Biology Reporter, 3, 117-128), Métodos para regeneração de plantas a partir de protoplastos também foram descritos (Evans et al., in Handbook of Plant Cell Culture, Vol 1, (Macmillan Publishing Co., New York, 1983); Vasil, IK in Cell Culture and Somatic Cell Genetics (Academic, Orlando, 1984)).
[0137] As tecnologias de recombinação que são úteis para produzir as plantas terrestres geneticamente modificadas reveladas incluem os sistemas cre-lox, FLP/FRT e Gin. Os métodos pelos quais essas tecnologias podem ser usadas para a finalidade aqui descrita são descritos, por exemplo, na (Patente U.S. 5.527.695; Dale and Ow, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10558-10562; Medberry et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23: 485-490).
[0138] Os protocolos de transformação, bem como, os protocolos para a introdução de sequências de nucleotídeos em plantas, podem variar dependendo do tipo de planta ou célula de planta, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, alvo para transformação.
[0139] Métodos adequados de introdução de sequências de nucleotídeos em células de planta e de subsequente inserção no genoma de planta são descritos em US 2010/0229256 A1 para Somleva & Ali e US 2012/0060413 para Somleva et al.
[0140] As células transformadas são cultivadas em plantas de acordo com técnicas convencionais. Ver, por exemplo, McCormick et al., 1986, Plant Cell Rep. 5: 81-84. Estas plantas podem, em seguida, ser cultivadas e polinizadas com a mesma variedade transformada ou variedades diferentes, e o híbrido resultante tendo expressão constitutiva da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para assegurar que a expressão constitutiva da característica fenotípica desejada seja estavelmente mantida e herdada e, em seguida, as sementes colhidas para assegurar a expressão constitutiva da característica fenotípica desejada foram alcançadas.
[0141] Os procedimentos para a transformação in planta podem ser simples. Manipulações de cultura de tecidos e possíveis variações somaclonais são evitadas e apenas um curto período de tempo é necessário para obter plantas terrestres geneticamente modificadas. No entanto, a frequência de transformantes na progênie de tais plantas inoculadas é relativamente baixa e variável. Atualmente, existem muito poucas espécies que podem ser rotineiramente transformadas na ausência de um sistema de regeneração com base em cultura de tecido. Transformantes de Arabidopsis estáveis podem ser obtidos por vários métodos in planta, incluindo infiltração a vácuo (Clough & Bent, 1998, The Plant J. 16: 735-743), transformação de sementes em germinação (Feldmann & Marks, 1987, Mol. Gen. Genet. 208: 1-9), imersão floral (Clough and Bent, 1998, Plant J. 16: 735-743), e spray floral (Chung et al., 2000, Genetically engineered Res. 9: 471-476). Outras plantas que foram transformadas com sucesso por métodos in planta incluem colza e rábano silvestre (infiltração a vácuo, Ian and Hong, 2001, Genetically engineered Res., 10: 363-371; Desfeux et al., 2000, Plant Physiol. 123: 895-904), Medicago truncatula (infiltração a vácuo, Trieu et al., 2000, Plant J. 22: 531-541), camelina (imersão floral, WO/2009/117555 para Nguyen et al.), e trigo (imersão floral, Zale et al., 2009, Plant Cell Rep. 28: 903-913). Métodos in planta também foram usados para a transformação de células germinativas em milho (pólen, Wang et al. 2001, Acta Botanica Sin., 43, 275-279; Zhang et al., 2005, Euphytica, 144, 11- 22; pistilos, Chumakov et al. 2006, Russian J. Genetics, 42, 893-897; Mamontova et al. 2010, Russian J. Genetics, 46, 501-504) e Sorghum (pólen, Wang et al. 2007, Biotechnol. Appl. Biochem., 48, 79-83).
[0142] Após a transformação por qualquer um dos métodos descritos acima, os seguintes procedimentos podem ser usados para obter uma planta transformada que expressa os transgenes: selecionar as células de planta que foram transformadas em um meio seletivo; regenerar as células de planta que foram transformadas para produzir plantas diferenciadas; selecionar plantas transformadas que expressam o transgene produzindo o nível desejado de polipeptídeos desejados no tecido desejado e localização celular.
[0143] As células que foram transformadas podem ser cultivadas em plantas de acordo com técnicas convencionais. Ver, por exemplo, McCormick et al. Plant Cell Reports 5: 81-84 (1986). Estas plantas podem, em seguida, ser cultivadas e polinizadas com a mesma variedade transformada ou variedades diferentes, e o híbrido resultante tendo expressão constitutiva da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para assegurar que a expressão constitutiva da característica fenotípica desejada seja estavelmente mantida e herdada e, em seguida, as sementes colhidas para assegurar a expressão constitutiva da característica fenotípica desejada foram alcançadas.
[0144] Plantas terrestres geneticamente modificadas podem ser produzidas usando técnicas convencionais para expressar quaisquer genes de interesse em plantas ou células de planta (Methods in Molecular Biology, 2005, vol. 286, Genetically engineered Plants: Methods and Protocols, Pena L., ed., Humana Press, Inc. Totowa, NJ; Shyamkumar Barampuram and Zhanyuan J. Zhang, Recent Advances in Plant Transformation, in James A. Birchler (ed.), Plant Chromosome Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 701, Springer Science + Business Media). Normalmente, a transferência de genes, ou transformação, é realizada usando explantes capazes de regeneração para produzir plantas férteis completas. Geralmente, um DNA ou uma molécula de RNA a ser introduzido no organismo faz parte de um vetor de transformação. Pode ser utilizado um grande número de tais sistemas de vetores conhecidos na técnica, tais como plasmídeos. Os componentes do sistema de expressão podem ser modificados, por exemplo, para aumentar a expressão dos ácidos nucleicos introduzidos. Por exemplo, sequências truncadas, substituições de nucleotídeos ou outras modificações podem ser empregadas. Os sistemas de expressão conhecidos na técnica podem ser usados para transformar virtualmente qualquer célula de planta sob condições adequadas. Um transgene compreendendo uma molécula de DNA que codifica um gene de interesse é, de preferência, transformado de forma estável e integrado no genoma das células hospedeiras. As células transformadas são, de preferência, regeneradas em plantas férteis inteiras. A descrição detalhada das técnicas de transformação está dentro do conhecimento dos versados na técnica.
[0145] Os promotores de planta podem ser selecionados para controlar a expressão do transgene em diferentes tecidos de planta ou organelas para todos os métodos que são conhecidos pelos versados na técnica (Gasser & Fraley, 1989, Science 244: 1293-1299). Em uma modalidade, os promotores são selecionados daqueles de origem eucariótica ou sintética que são conhecidos por produzir altos níveis de expressão em plantas e algas. Em uma modalidade preferida, os promotores são selecionados daqueles que são conhecidos por proporcionarem altos níveis de expressão em monocotiledôneas.
[0146] Os promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor do núcleo do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos revelados no documento WO 99/43838 e na Patente U.S. No 6.072.050, o promotor do núcleo CaMV 35S (Odell et al., 1985, Nature 313: 810-812), actina de arroz (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2: 163-171), ubiquitina (Christensen et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12: 619-632; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689), pEMU (Last et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81: 581-588), MAS (Velten et al., 1984, EMBO J. 3: 2723-2730), e promotor ALS (Patente U.S. No. 5.659.026). Outros promotores constitutivos são descritos nas Patentes U.S. Nos 5.608.149;
5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; e 5.608.142.
[0147] Promotores "preferidos de tecido" podem ser usados para direcionar a expressão de gene dentro de um tecido particular. Os promotores preferidos de tecido incluem aqueles descritos por Van Ex et al., 2009, Plant Cell Rep. 28: 1509-1520; Yamamoto et al., Plant J. 12: 255-265; Kawamata et al., 1997, Plant Cell Physiol. 38: 792-803; Hansen et al., 1997, Mol. Gen. Genet. 254: 337-343; Russell et al., 1997, Transgenic Res. 6: 157-168; Rinehart et al., 1996, Plant Physiol. 112: 1331-1341; Van Camp et al., 1996, Plant Physiol. 112: 525- 535; Canevascini et al., 1996, Plant Physiol. 112: 513-524; Yamamoto et al., 1994, Plant Cell Physiol. 35: 773-778; Lam, 1994, Results Probl. Cell Differ. 20: 181-196, Orozco et al., 1993, Plant Mol. Biol. 23: 1129-1138; Matsuoka et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9586-9590, e Guevara-Garcia et al., 1993, Plant J. 4: 495-505. Esses promotores podem ser modificados, se necessário, para expressão fraca.
[0148] Promotores específicos de sementes podem ser usados para direcionar a expressão de genes para sementes em particular. Os promotores específicos de sementes incluem promotores que são expressos em vários tecidos dentro das sementes e em vários estágios de desenvolvimento das sementes. Os promotores específicos de sementes podem ser absolutamente específicos para sementes, de modo que os promotores são apenas expressos em sementes, ou podem ser expressos de preferência, em sementes, por exemplo, em taxas que são 2 vezes mais elevadas, 5 vezes, 10 vezes ou mais, em sementes em relação a um ou mais outros tecidos de uma planta, por exemplo, caules, folhas e/ou raízes, entre outros tecidos. Os promotores específicos de sementes incluem, por exemplo, promotores específicos de sementes de dicotiledôneas e promotores específicos de sementes de monocotiledôneas, entre outros. Para dicotiledôneas, os promotores específicos de sementes incluem, mas não são limitados a, β-phaseolina de feijão, napina, β-conglicinina, oleosina de soja 1, Arabidopsis thaliana sacarose sintase, linho conlinina, lectina de soja, cruciferina e similares. Para monocotiledôneas, os promotores específicos de sementes incluem, mas não são limitados a, zeína de 15 kDa de milho, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, g-zeína, ceroso, encolhido 1, encolhido 2 e globulina 1.
[0149] Promotores quimicamente regulados podem ser usados para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno.
[0150] Promotores exemplares específicos úteis para a expressão de genes em dicotiledôneas e monocotiledôneas são fornecidos na TABELA 1 e TABELA 2, respectivamente. TABELA 1. Promotores úteis para a expressão de genes em dicotiledôneas Gene/Promotor Expressão Organismo Gene ID* nativo do (SEQ ID NO) promotor CaMV 35S Constitutiva Vírus do mosaico da couve-flor (SEQ ID NO: 108) Hsp70 Constitutiva Glycine max Glyma.02G093200 (SEQ ID NO: 41) Proteína de ligação Constitutiva Glycine max Glyma.08G082900 clorofila A/B (Cab5) (SEQ ID NO: 42) Piruvato fosfato dicinase Constitutiva Glycine max Glyma.06G252400 (PPDK) (SEQ ID NO: 43) Actina Constitutiva Glycine max Glyma.19G147900 (SEQ ID NO: 44)
ADP-glicose Específica da Glycine max Glyma.04G011900 pirofosforilase (AGPase) semente (SEQ ID NO: 45) Glutelina C (GluC) Específica da Glycine max Glyma.03G163500 semente (SEQ ID NO: 46) Isoenzima 1 insolúvel β- Específica da Glycine max Glyma.17G227800 frutofuranosidase (CIN1) semente (SEQ ID NO: 47) Caixa MADS Específica de Glycine max Glyma.04G257100 cob (SEQ ID NO: 48) Glicinina (subunidade Específica da Glycine max Glyma.03G163500 G1) semente (SEQ ID NO: 49) Isoform A de oleosina Específica da Glycine max Glyma.16G071800 semente (SEQ ID NO: 50) Hsp70 Constitutiva Brassica napus BnaA09g05860D Proteína de ligação Constitutiva Brassica napus BnaA04g20150D clorofila A/B (Cab5) Piruvato fosfato dicinase Constitutiva Brassica napus BnaA01g18440D (PPDK) Actina Constitutiva Brassica napus BnaA03g34950D ADP-glicose Específica da Brassica napus BnaA06g40730D pirofosforilase (AGPase) semente Glutelina C (GluC) Específica da Brassica napus BnaA09g50780D semente Isoenzima 1 insolúvel β- Específica da Brassica napus BnaA04g05320D frutofuranosidase (CIN1) semente Caixa MADS Específica de Brassica napus BnaA05g02990D cob Glicinina (subunidade Específica da Brassica napus BnaA01g08350D G1) semente Isoforma A de oleosina Específica da Brassica napus BnaC06g12930D semente
1.7S napin (napA) Específica da Brassica napus BnaA01g17200D semente *Gene ID inclui informações de sequência para regiões de codificação, bem como, promotores associados. 5’ UTRs e 3’ UTRs e estão disponíveis em Phytozome (ver, site JGI phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html). TABELA 2. Promotores úteis para a expressão de genes em monocotiledôneas, incluindo milho e arroz Gene/ Expressão Arroz* Milho* Outros Promotor Hsp70 Constitutiva LOC_Os05g38530 GRMZM2G310431 (SEQ ID NO: 51) (SEQ ID NO: 59) Proteína de Constitutiva LOC_Os01g41710 AC207722.2_FG00 ligação (SEQ ID NO: 52) 9 clorofila A/B (SEQ ID NO: 60) (Cab5) GRMZM2G351977 (SEQ ID NO: 61) Promotor de Constitutiva ubiquitina de (SEQ ID NO: 109) milho/intron de ubiquitina de milho (sequência listada no Genbank KT962835) Promotor de Constitutiva ubiquitina de (SEQ ID NO: 110) milho/intron de ubiquitina de milho (promotor de milho e sequência de intron com 99% de identidade para sequenciar no Genbank KT985051.1)
CaMV 35S Constitutiva - - Vírus do mosaico da couve- flor (SEQ ID NO: 108) Piruvato Constitutiva LOC_Os05g33570 GRMZM2G306345 fosfato (SEQ ID NO: 53) (SEQ ID NO: 62) dicinase (PPDK) Actina Constitutiva LOC_Os03g50885 GRMZM2G047055 (SEQ ID NO: 54) (SEQ ID NO: 63) Promotor de Constitutiva N/D SEQ ID NO: 64 intron cab5/hsp70 híbrido ADP-glicose Específica LOC_Os01g44220 GRMZM2G429899 pirofosforilase da semente (SEQ ID NO: 55) (SEQ ID NO: 65) (AGPase) Glutelina C Específica LOC_Os02g25640 N/D (GluC) da semente (SEQ ID NO: 56) Isoenzima 1 Específica LOC_Os02g33110 GRMZM2G139300 insolúvel β- da semente (SEQ ID NO: 57) (SEQ ID NO: 66) frutofuranosida se (CIN1) Caixa MADS Específica LOC_Os12g10540 GRMZM2G160687 de cob (SEQ ID NO: 58) (SEQ ID NO: 67) Promotpr TrpA Específica GRMZM5G841619 de milho da semente (SEQ ID NO: 111) *Gene ID inclui informações de sequência para regiões de codificação, bem como, promotores associados. 5’ UTRs e 3’ UTRs estão disponíveis em Phytozome (ver site JGI phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html).
[0151] Certas modalidades usam plantas terrestres geneticamente modificadas ou células de planta com constructos de expressão de múltiplos genes que abrigam mais de um transgene e promotor. Os promotores podem ser iguais ou diferentes.
[0152] Qualquer um dos promotores descritos pode ser usado para controlar a expressão de um ou mais dos genes, seus homólogos e/ou ortólogos, bem como quaisquer outros genes de interesse de uma maneira espaço- temporal definida.
[0153] Sequências de ácido nucleico destinadas à expressão em plantas terrestres geneticamente modificadas são primeiro montadas em cassetes de expressão por trás de um promotor ativo adequado em plantas. Os cassetes de expressão também podem incluir quaisquer outras sequências necessárias ou selecionadas para a expressão do transgene. Tais sequências incluem, mas não são restritas a, terminadores de transcrição, sequências estranhas para aumentar a expressão, tais como introns, sequências vitais e sequências destinadas ao direcionamento do produto do gene para organelos e compartimentos celulares específicos. Estes cassetes de expressão podem, em seguida, ser transferidos para os vetores de transformação de plantas descritos infra. O que se segue é uma descrição de vários componentes de cassetes de expressão típicos.
[0154] Uma variedade de terminadores transcricionais estão disponíveis para uso em cassetes de expressão. Estes são responsáveis pelo término da transcrição além do transgene e pela poliadenilação correta dos transcritos. Terminadores transcricionais apropriados são aqueles que funcionam em plantas e incluem o terminador CaMV 35S, o terminador tm1, o terminador nopalina sintase e o terminador rbcS E9 de ervilha. Estes são usados em plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas.
[0155] A sequência de codificação do gene selecionado pode ser geneticamente modificada alterando a sequência de codificação para expressão ideal na espécie de cultura de interesse. Os métodos para modificar as sequências de codificação para alcançar a expressão ideal em uma espécie de cultura particular são bem conhecidos (Perlak et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324 and Koziel et al., 1993, Biotechnology 11: 194-200).
[0156] Plantas individuais dentro de uma população de plantas terrestres geneticamente modificadas que expressam um gene recombinante podem ter diferentes níveis de expressão de gene. A expressão de gene variável é devido a vários fatores, incluindo várias cópias do gene recombinante, efeitos da cromatina e supressão do gene. Desta maneira, um fenótipo da planta terrestre geneticamente modificada pode ser medido como uma porcentagem de plantas individuais dentro de uma população. O rendimento de uma planta pode ser medido simplesmente por pesagem. O rendimento da semente de uma planta também pode ser determinado por pesagem. O aumento no peso da semente de uma planta pode ser devido a uma série de fatores, incluindo um aumento no número ou tamanho das vagens da semente, um aumento no número de sementes e/ou um aumento no número de sementes por planta. No laboratório ou na estufa, o rendimento de sementes é geralmente relatado como o peso da semente produzido por planta e em um ambiente de produção de cultura comercial, o rendimento é geralmente expresso como peso por acre ou peso por hectare.
[0157] Um constructo de DNA recombinante incluindo um gene expressável em planta ou outro DNA de interesse é inserido no genoma de uma planta por um método adequado. Os métodos adequados incluem, por exemplo, transferência de DNA mediada por Agrobacterium tumefaciens, transferência de DNA direta, transferência de DNA mediada por lipossomas, eletroporação, co- cultivo, difusão, bombardeio de partículas, microinjeção, arma genética, coprecipitação de fosfato de cálcio, vetores virais e outras técnicas. Os vetores de transformação de plantas adequados incluem aqueles derivados de um plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens. Além dos vetores de transformação de plantas derivados de Ti ou plasmídeos indutores de raiz (Ri) de Agrobacterium, métodos alternativos podem ser usados para inserir constructos de DNA em células de planta. Uma planta terrestre geneticamente modificada pode ser produzida por seleção de sementes transformadas ou por seleção de células de planta transformadas e subsequente regeneração.
[0158] Em algumas modalidades, as plantas terrestres geneticamente modificadas são cultivadas (por exemplo, no solo) e colhidas. Em algumas modalidades, o tecido acima do solo é colhido separadamente do tecido abaixo do solo. Os tecidos acima do solo adequados incluem brotos, caules, folhas, flores, grãos e sementes. Tecidos abaixo do solo exemplares incluem raízes e cabelame radicular. Em algumas modalidades, as plantas inteiras são colhidas e o tecido acima do solo é subsequentemente separado do tecido abaixo do solo.
[0159] Constructos genéticos podem codificar um marcador selecionável para permitir a seleção de eventos de transformação. Existem muitos métodos que foram descritos para a seleção de plantas transformadas (para revisão, ver (Miki et al., Journal of Biotechnology, 2004, 107, 193-232) e referências incorporadas). Genes marcadores selecionáveis que foram usados extensivamente em plantas incluem o gene de neomicina fosfotransferase nptII (Patentes U.S. Nos. 5.034.322, US 5.530.196), gene de resistência à higromicina (Patente U.S. No. 5.668.298, Waldron et al., (1985), Plant Mol Biol, 5: 103-108; Zhijian et al., (1995), Plant Sci, 108: 219-227), o gene bar que codifica a resistência à fosfinotricina (Patente U.S. No. 5.276.268), a expressão de aminoglicosídeo 3"-adeniltransferase (aadA) para conferir resistência à espectinomicina (Patente U.S. No. 5.073.675), o uso de 5-enolpiruvil-3- fosfosiquimato sintetase resistente à inibição (Patente U.S. No. 4.535.060) e métodos para a produção de plantas tolerantes ao glifosato (Patente U.S. No.
5.463.175; Patente U.S. No. 7.045.684). Outros marcadores selecionáveis adequados incluem, mas não são limitados a, genes que codificam resistência ao cloranfenicol (Herrera Estrella et al., (1983), EMBO J, 2: 987-992), metotrexato (Herrera Estrella et al., (1983), Nature, 303: 209-213; Meijer et al, (1991), Plant Mol Biol, 16: 807-820); estreptomicina (Jones et al., (1987), Mol Gen Genet, 210: 86-91); bleomicina (Hille et al., (1990), Plant Mol Biol, 7: 171- 176); sulfonamida (Guerineau et al., (1990), Plant Mol Biol, 15: 127-136); bromoxinil (Stalker et al., (1988), Science, 242: 419-423); glifosato (Shaw et al., (1986), Science, 233: 478-481); fosfinotricina (DeBlock et al., (1987), EMBO J, 6: 2513-2518).
[0160] Métodos de seleção de plantas que não usam antibióticos ou herbicidas como um agente seletivo foram descritos anteriormente e incluem a expressão de glucosamina-6-fosfato desaminase para glucosamina inativa em meio de seleção de plantas (Patente U.S. No. 6.444.878) e um sistema positivo/negativo que utiliza D-aminoácidos (Erikson et al., Nat Biotechnol, 2004, 22, 455-8). A Publicação de Patente Europeia No. EP 0 530 129 A1 descreve um sistema de seleção positivo que permite que as plantas transformadas cresçam além das linhagens não transformadas pela expressão de um transgene que codifica uma enzima que ativa um composto inativo adicionado ao meio de crescimento. A Patente U.S. No. 5.767.378 descreve o uso de manose ou xilose para a seleção positiva de plantas geneticamente modificadas.
[0161] Métodos para seleção positiva usando sorbitol desidrogenase para converter sorbitol em frutose para o crescimento de plantas também foram descritos (WO 2010/102293). Genes marcadores rastreáveis incluem o gene da beta-glucuronidase (Jefferson et al., 1987, EMBO J. 6: 3901-3907; Patente U.S. No. 5.268.463) e gene de proteína fluorescente verde nativo ou modificado (Cubitt et al., 1995, Trends Biochem. Sci. 20: 448-455; Pan et al., 1996, Plant Physiol. 112: 893-900).
[0162] Os eventos de transformação também podem ser selecionados através da visualização de proteínas fluorescentes, tais como as proteínas fluorescentes das espécies de Anthozoa não bioluminescentes que incluem DsRed, uma proteína fluorescente vermelha do gênero Discosoma de coral (Matz et al. (1999), Nat Biotechnol 17: 969-73). Uma versão melhorada da proteína DsRed foi desenvolvida (Bevis and Glick (2002), Nat Biotech 20: 83-87) para reduzir a agregação da proteína.
[0163] A seleção visual também pode ser realizada com as proteínas fluorescentes amarelas (YFP), incluindo a variante com maturação acelerada do sinal (Nagai, T. et al. (2002), Nat Biotech 20: 87-90), a proteína fluorescente azul, a proteína fluorescente ciano e a proteína fluorescente verde (Sheen et al. (1995), Plant J 8: 777-84; Davis and Vierstra (1998), Plant Molecular Biology 36: 521-528). Um resumo das proteínas fluorescentes pode ser encontrado em Tzfira et al. (Tzfira et al. (2005), Plant Molecular Biology 57: 503-516) e Verkhusha and Lukyanov (Verkhusha, V. V. and K. A. Lukyanov (2004), Nat Biotech 22: 289-296). Versões aprimoradas de muitas das proteínas fluorescentes foram feitas para várias aplicações. Será evidente para os versados na técnica como utilizar as versões melhoradas destas proteínas, incluindo combinações, para a seleção de transformantes.
[0164] As plantas modificadas para rendimento aprimorado podem ter traços de entrada empilhados que incluem resistência a herbicidas e tolerância a insetos, por exemplo, uma planta que é tolerante ao herbicida glifosato e que produz a toxina Bacillus thuringiensis (BT). O glifosato é um herbicida que evita a produção de aminoácidos aromáticos nas plantas ao inibir a enzima 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSP sintase). A superexpressão de EPSP sintase em uma cultura de interesse permite a aplicação de glifosato como um herbicida sem matar a planta modificada (Suh, et al., J. M Plant Mol. Biol. 1993, 22, 195-205). A toxina BT é uma proteína que é letal para muitos insetos, proporcionando a planta que a produz proteção contra pragas (Barton, et al. Plant Physiol. 1987, 85, 1103-1109). Outros traços de tolerância a herbicidas úteis incluem, mas não são limitados à tolerância a Dicamba pela expressão de gene de monoxigenase dicamba (Behrens et al, 2007, Science, 316, 1185), tolerância ao ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e 2,4-D colina por expressão de um gene bacteriano aad-1 que codifica para uma enzima ariloxialcanoato dioxigenase (Wright et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010, 107, 20240), tolerância ao glufosinato por expressão de gene de resistência ao bialafos (bar) ou o gene pat que codifica a enzima fosfinotricina acetil transferase (Droge et al., Planta, 1992, 187, 142), bem como, genes que codificam uma 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase modificada (HPPD) que fornece tolerância ao herbicidas mesotriona, isoxaflutol e tembotriona (Siehl et al., Plant Physiol, 2014, 166, 1162).
[0165] A planta terrestre geneticamente modificada que expressa um gene de ISY, conforme revelado, pode ser modificada para também maior rendimento aprimorado.
[0166] Por exemplo, a planta terrestre geneticamente modificada pode expressar uma ou mais proteínas transportadoras mitocondriais que também são expressas como membros de mecanismos de concentração de carbono de algas eucarióticas, bem como, expressar um gene de ISY. Em alguns exemplos, a proteína transportadora mitocondrial é uma proteína transportadora mitocondrial CCP1. Em alguns exemplos, a proteína transportadora mitocondrial é expressa sob o controle de promotores de plantas que podem ser constitutivos, específicos para tecidos ou específicos para sementes. Espera-se que tais plantas terrestres geneticamente modificadas tenham um rendimento ainda maior em comparação com as plantas que não expressam a proteína transportadora mitocondrial, o gene de ISY ou ambos. Por exemplo, tais plantas terrestres geneticamente modificadas podem ter um desempenho melhorado, tais como as taxas de fixação de CO2 aumentadas, transpiração reduzida e/ou biomassa e/ou rendimento de sementes aumentados.
[0167] Assim, em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada expressa uma proteína transportadora mitocondrial CCP1. Nestes exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada compreende um gene modificado para a proteína transportadora mitocondrial CCP1. A proteína transportadora mitocondrial CCP1 compreende: (i) CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii de SEQ ID NO: 112 ou (ii) um ortólogo de CCP1 como revelado em PCT/US2018/037740 e PCT/US2017/016421 para Yield10 Bioscience. O ortólogo de CCP1 pode ser, por exemplo, um ortólogo CCP1 de algas, tal como um ortólogo de CCP1 de Gonium pectorale (por exemplo, SEQ ID NO: 113 ou SEQ ID NO: 114), Volvox carteri f. nagariensis (por exemplo, SEQ ID NO: 115), Ettlia oleoabundans (por exemplo, SEQ ID NO: 116), Chlorella sorokiniana (por exemplo, SEQ ID NO: 117). O ortólogo de CCP1 também pode ser, por exemplo, um ortólogo de CCP1 de planta, tal como um ortólogo CCP1 de Erigeron breviscapus (por exemplo, SEQ ID NO: 118), Zea nicaraguensis (por exemplo, SEQ ID NO: 119), Poa pratensis (por exemplo, SEQ ID NO: 120), Cosmos bipinnatus (por exemplo, SEQ ID NO: 121), Glycine max (por exemplo, SEQ ID NO: 122), Zea mays (por exemplo, SEQ ID NO: 123), Oryza sativa (por exemplo, SEQ ID NO: 124), Triticum aestivum (por exemplo, SEQ ID NO: 125), Sorghum bicolor (por exemplo, SEQ ID NO: 126) ou Solanum tuberosum (por exemplo, SEQ ID NO: 127).
[0168] A proteína transportadora mitocondrial CCP1 está localizada nas mitocôndrias da planta terrestre geneticamente modificada com base em um sinal de direcionamento mitocondrial. O gene modificado para a proteína transportadora mitocondrial CCP1 compreende (i) outro promotor e (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína transportadora mitocondrial CCP1. O outro promotor não é cognato em relação à sequência de ácido nucleico. O gene modificado para a proteína transportadora mitocondrial CCP1 é configurado de modo que transcrição da sequência de ácido nucleico que codifica a proteína transportadora mitocondrial CCP1 seja iniciada a partir do outro promotor e resulte em expressão da proteína transportadora mitocondrial CCP1.
[0169] Uma planta terrestre geneticamente modificada que expressa um RNA que aumenta o rendimento de sementes com expressão aumentada ("um ISY RNA") também é revelada. A planta terrestre geneticamente modificada compreende um gene modificado para o ISY RNA. O ISY RNA compreende uma sequência contígua de códons que codificam uma proteína que tem homologia a um inibidor de invertase de plantas e/ou a um inibidor de pectina metilesterase ("uma proteína codificada"). A proteína codificada compreende um ou mais dentre (i) uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; (ii) um fragmento de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; (iii) um homólogo de Camelina sativa de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; ou (iv) um ortólogo de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2. O gene modificado compreende (i) um promotor e (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica o ISY RNA. O promotor não é cognato em relação à sequência de ácido nucleico que codifica o ISY RNA. O gene modificado é configurado de modo que transcrição da sequência de ácido nucleico seja iniciada a partir do promotor e resulte em expressão do ISY RNA.
[0170] Um ISY RNA expresso a partir de um gene de ISY pode causar um aumento no rendimento da semente independente da proteína de ISY. Em Camelina, o gene de ISY é um gene fracamente transcrito, com uma pontuação potencial de codificação de 0,885 (site://cpc.gao-lab.org/programs/cpc.do, Kang Y-J et al, Nucleic Acids Research, 2017, Vol. 45, Web Server issue W12-16), e é apenas expresso em níveis baixos em folhas senescentes e desenvolvimento inicial de Síliqua (Kagale et al, Plant Journal (2016) 88, 879-894 supplementary data). Além disso, não está totalmente claro qual códon ou códons correspondem aos códons iniciais para a proteína de ISY em plantas de Camelina de tipo selvagem. Estas observações podem refletir um papel para o ISY RNA como, por exemplo, um RNA não codificante longo (lncRNA) e/ou como um RNA bifuncional (bifRNA). Um lncRNA é um RNA, geralmente incluindo mais de 200 nucleotídeos, que pode desempenhar funções regulatórias em uma célula em sua forma de RNA, sem necessariamente codificar uma proteína (Zhang et al., Plant Sciences, 2013, 4, 1038-1045; Hube and Francastel, Frontiers in Genetics, 2018, 9, Article 140). Um bifRNA é um RNA que pode desempenhar funções regulatórias em uma célula na sua forma de RNA e que também codifica uma proteína (Hube and Francastel, 2018). Para efeito de comparação, um RNA mensageiro (mRNA) é um RNA que codifica uma proteína, sem aparentemente desempenhar funções regulatórias em uma célula em sua forma de RNA. Em relação ao gene de ISY, é possível, por exemplo, que o gene de ISY possa ser transcrito para produzir um lncRNA que pode causar um aumento no rendimento de sementes com base em uma função regulatória, sem tradução da proteína de ISY do ISY RNA. Também é possível, por exemplo, que o gene de ISY possa ser transcrito para produzir um bifRNA que pode causar um aumento no rendimento de sementes com base em uma função reguladora e na tradução da proteína de ISY do ISY RNA. Tradução de SEQ ID NO: 3, a região genômica que contém as regiões codificantes para a proteína de 168 aminoácidos (DNA SEQ ID NO: 6, proteína codificada SEQ ID NO: 5) e a proteína de 134 aminoácidos (DNA SEQ ID NO: 1, proteína codificada SEQ ID NO: 2), mostra que não há códons iniciais adicionais aparentes para o gene a montante do códon inicial TTG da proteína de 168 aminoácidos (FIG. 5). O códon inicial TTG da SEQ ID NO: 6 também seria o códon inicial esperado com base no alinhamento para os melhores ortólogos do gene de ISY de Camelina em colza, soja e milho (FIGURAS 17A-B), bem como, alinhamentos com inibidores de invertase de plantas conhecidas (FIGURAS 1A-B). Um códon inicial fraco pode ser consistente com um papel para o gene de ISY na expressão de um lncRNA e/ou bifRNA. Os lncRNAs têm funções importantes no crescimento e desenvolvimento das plantas (Huang et al, 2017, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A, 2017, 114: E3149-E3158, site:www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1617483114; Zhang et al., 2013). bifRNAs também podem. Assim, por exemplo, ISY RNA pode atuar como um transcrito para aumentar as vias relacionadas ao rendimento de sementes ou regular os genes que levam ao rendimento de sementes aumentado de plantas, e isso pode ser independente ou em conjunto com expressão da proteína de ISY.
[0171] Em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta de cultura alimentícia selecionada a partir do grupo que consiste em milho, trigo, aveia, cevada, soja, painço, sorgo, batata, beterraba sacarina, pulse, grão de bico, ervilha verde, ervilha amarela, lentilha, feijão, tomate e arroz. Em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta de cultura oleaginosa selecionada a partir do grupo que consiste em camelina, espécies de Brassica (por exemplo, B. napus (colza), B. rapa, B. juncea e B. carinata), crambe, soja, girassol, cártamo, óleo de palma, linho e algodão.
[0172] Como observado, o ISY RNA compreende uma sequência contígua de códons que codificam uma proteína que tem homologia a um inibidor de invertase de plantas e/ou a um inibidor de pectina metilesterase ("uma proteína codificada"). Também como observado, a proteína codificada compreende um ou mais dentre (i) uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; (ii) um fragmento de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; (iii) um homólogo de Camelina sativa de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; ou (iv) um ortólogo de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2.
[0173] Em alguns exemplos, a proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2 corresponde a uma ou mais dentre proteína de ISY Camelina sativa de SEQ ID NO: 2, proteína de ISY Camelina sativa de SEQ ID NO: 5, proteína de ISY modificada de Camelina sativa de SEQ ID NO: 138, ou proteína de ISY modificada de Camelina sativa de SEQ ID NO: 140, cada uma conforme descrito acima.
[0174] Em alguns exemplos, o fragmento de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2 corresponde a 30 ou mais aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2, como descrito acima. Em alguns destes exemplos, o fragmento corresponde a 40 ou mais, 50 ou mais, 60 ou mais, 70 ou mais, 80 ou mais, 90 ou mais, ou 100 ou mais aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2, também como descrito acima. Em alguns destes exemplos, o fragmento corresponde a 114 a 133 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2, também como descrito acima.
[0175] Em alguns exemplos, o homólogo de Camelina sativa de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2 corresponde a uma ou mais proteínas de Camelina sativa de SEQ ID NOS: 21-40.
[0176] Em alguns exemplos, o ortólogo de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2 corresponde a uma ou mais (i) proteínas de colza de SEQ ID NOS: 69, 71, 73 e/ou 75; (ii) proteínas de soja de SEQ ID NOS: 89, 91, 93 e/ou 95; ou (iii) proteínas de milho de SEQ ID NOS: 99, 101, 103, 105 e/ou 107.
[0177] Em alguns exemplos, a proteína codificada compreende (i) (a) um resíduo de cisteína na posição 40, (b) um resíduo de leucina na posição 59, (c) um resíduo de cisteína na posição 98, e (d) um resíduo de cisteína na posição 138, com numeração de posições em relação à proteína de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5, e (ii) uma identidade geral de, pelo menos, 10% com a proteína de Camelina sativa de SEQ ID NO: 2.
[0178] Em alguns exemplos, a proteína codificada compreende (i) (a) um resíduo de cisteína na posição 25, (b) um resíduo de cisteína na posição 40, (c) um resíduo de leucina na posição 59, (d) um resíduo de cisteína na posição 98, e (e) um resíduo de cisteína na posição 138, com numeração de posições em relação à proteína de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5, e (ii) uma identidade geral de, pelo menos, 10% com a proteína de Camelina sativa de SEQ ID NO:
5.
[0179] Em alguns exemplos, a proteína codificada é heteróloga em relação à planta terrestre geneticamente modificada. Em alguns exemplos, a proteína codificada é homóloga em relação à planta terrestre geneticamente modificada.
[0180] Como observado, o gene modificado compreende (i) um promotor e (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica o ISY RNA. Além disso, o promotor não é cognato em relação à sequência de ácido nucleico que codifica o ISY RNA. Além disso, o gene modificado é configurado de modo que transcrição da sequência de ácido nucleico seja iniciada a partir do promotor e resulte em expressão do ISY RNA.
[0181] Em alguns exemplos, o promotor é um promotor constitutivo. Em alguns exemplos, o promotor é um promotor específico de semente.
[0182] Em alguns exemplos, o gene modificado é integrado ao DNA genômico da planta terrestre geneticamente modificada. Em alguns exemplos, o gene modificado é expresso de forma estável na planta terrestre geneticamente modificada.
[0183] Em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada exibe expressão aumentada do ISY RNA em comparação com uma planta terrestre de referência que não inclui o gene modificado. Em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada exibe rendimento de sementes, rendimento de frutos e/ou rendimento de tubérculos aumentado em comparação com uma planta terrestre de referência que não inclui o gene modificado.
[0184] Em alguns exemplos, a sequência de ácido nucleico que codifica o ISY RNA é, pelo menos, 80% idêntica à SEQ ID NO: 1. A sequência de ácido nucleico pode ser, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%,
pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 1. Em alguns exemplos, a sequência de ácido nucleico que codifica o ISY RNA compreende SEQ ID NO: 1. Em alguns exemplos, a sequência de ácido nucleico que codifica o ISY RNA compreende a SEQ ID NO: 6. Em alguns exemplos, a sequência de ácido nucleico que codifica o ISY RNA compreende a SEQ ID NO: 7.
[0185] Como observado acima, um ISY RNA expresso a partir de um gene de ISY pode causar um aumento no rendimento da semente independente da proteína de ISY. Assim, em alguns exemplos, a expressão do ISY RNA resulta na expressão da proteína codificada. Em alguns desses exemplos, o ISY RNA é um bifRNA que causa um aumento no rendimento de sementes com base em uma função reguladora e com base na tradução da proteína codificada do ISY RNA. Além disso, em alguns exemplos, a expressão do ISY RNA não resulta na expressão da proteína codificada. Em alguns desses exemplos, o ISY RNA é um lncRNA que causa um aumento na produção de sementes com base em uma função reguladora, sem tradução da proteína codificada do ISY RNA.
EXEMPLOS Exemplo 1. Expressão de CCP1 em Camelina usando um promotor constitutivo, impacto no rendimento da semente e no tamanho da semente, identificação de genes ISY regulados positivamente em linhagens com maior rendimento de sementes e tamanho de semente opcionalmente reduzido
[0186] Schnell et al., WO 2015/103074, relataram que a expressão heteróloga de CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii em Camelina leva a melhorias significativas nos níveis de fotossíntese nas plantas transgênicas. Para esses experimentos, foi usado um vetor equivalente a pMBXO58 (FIG. 3, SEQ ID NO: 19).
[0187] Schnell et al., WO 2015/103074, também revelaram que os dados funcionais sugerem que as plantas Camelina transformadas para expressar CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii respondem a maior capacidade de transporte de CO2 diminuindo a transpiração e as trocas gasosas (ou seja, fechando estomas), e que em estudos de campo envolvendo a comparação de plantas de três transformantes versus plantas de tipo selvagem, dois dos três transformantes exibiram um aumento no rendimento total de óleo (lb/acre) de 43% e 76%, respectivamente. Schnell et al., WO 2015/103074, também relataram uma diminuição no tamanho da semente em linhagens de Camelina de maior rendimento que expressam CCP1 constitutivamente.
[0188] O gene Csa15g017550 foi identificado a partir das análises de transcriptoma (RNASeq) de linhagens de Camelina modificadas para expressar constitutivamente o gene CCP1 do promotor constitutivo 35S usando amostras cultivadas em estufa (J. Zuber, RNAi Mediated Silencing of Cell Wall Invertase Inhibitors to Increase Sucrose Allocation to Sink Tissues in Transgenic Camelina sativa Engineered with a Carbon Concentrating Mechanism, thesis submitted to the Graduate School of The University of Massachusetts, Amherst, Master of Science, May 2015).
[0189] As análises subsequentes da expressão de gene Csa15g017550 por RT-PCR em linhagens de Camelina transformadas com pMBXO58 (FIG. 3, SEQ ID NO: 19) em Yield10 Bioscience com iniciadores mostrados na TABELA 4 também mostraram um aumento em Csa15g017550 mRNA (FIG. 7C).
[0190] O gene Csa15g017550 tem homologia de sequência limitada aos genes da superfamília do inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase. Os genes do inibidor de invertase da parede celular (CWII) foram anteriormente mostrados em Camelina como alvos úteis para a regulação negativa usando RNAi para aumentar o rendimento de sementes em Camelina (Sederoff et al., Pub. U.S. No. 2016/0138038). A supressão específica do fruto do inibidor de invertase da parede celular (CWII) em tomate ou arroz levou a aumentos no peso líquido da semente/grão de 22% e 10%, respectivamente (Wang et al. (2008) Nat Genet, 40 (11): 1370-1374; Jin et al, Plant Cell, (2009) 21 (7): 2072-89. Exemplo 2. Expressão de CCP1 em Camelina usando um promotor específico de semente e análises RT-PCR do impacto na expressão de gene Csa15g017550 identificado no Exemplo 1
[0191] No pedido de patente co-pendente, PCT/US2018/019105 (WO2018/156686) para Yield10 Bioscience, um constructo de expressão específico de semente para CCP1 foi descrito (pMBXO84 (FIG. 4, SEQ ID NO: 96)). A transformação de pMBXO84 em Camelina resultou em maior rendimento de sementes e um tamanho de semente normal. As análises de RT-PCR foram realizadas no RNA isolado dessas linhagens para comparar a expressão de gene
Csa15g017550 em linhagens transgênicas e de tipo selvagem e uma pequena quantidade de superexpressão de gene Csa15g017550 foi observada (FIG. 7D) usando os iniciadores mostrados na TABELA 4. Exemplo 3. Novo gene para aumentar o rendimento de sementes (Csa15g017550.1)
[0192] No navegador do genoma Camelina sativa (site://www.camelinadb.ca/), um fragmento de 612 pb para Csa15g017550.1 é fornecido, o qual contém uma 5' UTR de 141 pb, uma sequência de codificação de 405 pb (CDS; SEQ ID NO: 1), e uma 3' UTR de 66 pb, de modo que se prevê que a proteína codificada tenha 134 aminoácidos de comprimento (SEQ ID NO: 2). Uma proteína com uma sequência mais longa (SEQ ID NO: 20) foi anotada como um "inibidor de invertase putativo" em GenBank (LOC104745594) (webiste://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/727584402?report=genbank&log$= nucltop&blast_rank=1&RID=YAF599RN015), no entanto, este registro foi removido de GenBank durante o processamento de anotação do genoma padrão.
[0193] Prevê-se que esta proteína esteja relacionada com a superfamília do inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase. Foi realizado um alinhamento da proteína prevista de 134 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) com outros inibidores de invertase de plantas. Este alinhamento (TABELA 3, FIG. 1) mostrou que a proteína de 134 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) era mais curta do que os outros inibidores de invertase, que tinham 168 a 205 aminoácidos de comprimento. SEQ ID NO: 2 está faltando um trecho de aminoácidos N-terminal, frequentemente associado com um peptídeo de sinal, e possui apenas três dos quatro resíduos de cisteína conservados que são tipicamente observados em inibidores de invertase de plantas (Wan et al (2018), Trends Plant Sci, 23: 163-177; Tang at al. (2017), J Exp Bot, 68: 469-482). Na verdade, o gene foi rotulado como “mRNA parcial” no Genbank sob o acesso XM_010466881.1 (este acesso foi recentemente removido do Genbank devido ao processamento de anotação do genoma padrão). Um fragmento de DNA maior foi baixado do NCBI (LOC104745594; site://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/104745594) que contém sequência adicional nas extremidades 5' e 3'. O registro para LOC104745594 foi removido posteriormente do NCBI porque o modelo no qual ele foi baseado não foi previsto em uma anotação posterior. Uma porção de 3376 pb deste fragmento (SEQ ID NO: 3) foi pesquisada por um local de início alternativo para produzir uma proteína maior com uma quarta cisteína conservada. Um fragmento de DNA de 576 pb (SEQ ID NO: 7) foi identificado dentro de SEQ ID NO: 3 que codifica para uma estrutura de leitura aberta de 190 aminoácidos que contém um TTG interno (par de base 70; FIG. 5). Este TTG codifica uma Leucina no aminoácido 23 (FIG. 5) que, se usado como um local de início alternativo, renderia uma proteína de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5). SEQ ID NO: 5 contém a quarta cisteína conservada (FIG. 1A, FIG. 5).
[0194] A topologia de transmembrana de Phobius e o programa de predição de peptídeo de sinal (site://phobius.sbc.su.se/) foram usados para sondar as sequências de proteína de 134 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) e de proteína de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) para um peptídeo de sinal. Um peptídeo de sinal putativo de 17 aminoácidos foi identificado na proteína de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5; FIG. 6) e a proteína foi prevista como não citoplasmática. Nenhum peptídeo sinal foi identificado na sequência de 134 aminoácidos (SEQ ID NO: 2).
[0195] As sequências de proteína de 134 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) e de proteína de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) também foram analisadas usando o servidor TargetP 1.1 (site://www.cbs.dtu.dk/cgi- bin/webface2.fcgi?jobid=5B84A216000034F4085302D6&wait=20) que prevê cloroplasto, mitocondrial e peptídeos de sinal. Este programa também previu a presença de um peptídeo de sinal envolvido em uma via secretória para a proteína de 168 aminoácidos e um comprimento de peptídeo de trânsito de 17 aminoácidos. Para a proteína de 134 aminoácidos, nenhum peptídeo de sinal foi previsto.
[0196] A proteína de 134 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) e a proteína de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) também foram analisadas usando o software Plant-mPloc (site://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/) útil para prever a localização subcelular de proteínas. Este programa previu a localização das proteínas de 134 e 168 aminoácidos na membrana celular.
[0197] Com base nessas análises, a função deste gene é desconhecida e, portanto, foi definida aqui como o gene de rendimento de sementes aumentado (ISY).
TABELA 3. Sequências de inibidor de invertase de plantas usadas para comparação com a nova proteína de ISY de planta Camelina Cultura SEQ ID Gene ID Função da Tamanho Experi- de proteína da mental- proteína proteína mente codificada verificado (amino- ácidos) Camelina SEQ ID Csa15g01755 inibidor de 134 não sativa NO: 2 0.1 invertase de plantas putativo/ inibidor de pectina metilesterase Camelina SEQ ID Csa15g01755 inibidor de 190 não sativa NO: 4 0.1 com região invertase de a montante plantas adicional (SEQ putativo/ ID NO: 7) inibidor de pectina metilesterase Camelina SEQ ID Csa15g01755 inibidor de 168 não sativa NO: 5 0.1 com códon invertase de inicial plantas alternativo putativo/ (SEQ ID NO: inibidor de 6) pectina metilesterase Zea mays SEQ ID XP_00866897 inibidor 176 sim2 NO: 8 6.1 vacuolar/pare de celular de fructosidase 2
Arabidopsis SEQ ID AT5G64620 inibidor 180 sim2 thaliana NO: 9 vacuolar/pare de celular de fructosidase Arabidopsis SEQ ID AEE32232.1 inibidor 205 thaliana NO: 10 vacuolar/pare de celular de fructosidase 1 Solanum SEQ ID Solyc12g0991 inibidor de 175 sim2 lycopersicum NO: 11 90 invertase 1 Solanum SEQ ID Solyc12g0992 inibidor de 171 sim2 lycopersicum NO: 12 00 invertase 1 Beta vulgaris SEQ ID XP_01068537 inibidor 184 sim2 subsp. NO: 13 8.1 vacuolar/pare vulgaris de celular prevista de fructosidase 1 Nicotiana SEQ ID AY145781.1 inibidor de 172 sim2 tabacum NO: 14 invertase vacuolar Nicotiana SEQ ID Y12805.1 inibidor de 166 sim2 tabacum NO: 15 invertase Solanum SEQ ID GU321341.1 inibidor de 181 sim2 tuberosum NO: 16 invertase cultivar putativo Shepody (INVINH2A) 1 Sequência de proteína obtida no site://solgenomics.net/search/locus. 2 Proteína listada como experimentalmente caracterizada na revisão de Wan et al. (2018), Trends Plant Sci, 23: 163-177. 3 Proteína listada como experimentalmente caracterizada na revisão de Tang et al. (2017), J ExpBot, 68: 469-482.
[0198] A maioria dos inibidores de invertase também contém um motif conservado de três aminoácidos conservados de Prolina-Lisina-Fenilalanina (PKF; Tang et al. (2017), J Exp Bot, 68: 469-482). Nem a proteína de 134 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) nem a proteína de 168 aminoácidos (SEQ ID NO:
5) contêm o motif de PKF conservado. A presença do motif de PKF pode ser encontrada nas posições 132 a 134 do inibidor vacuolar/parede celular previsto de frutosidase 1 Beta vulgaris (Gene ID XP_010685378.1, SEQ ID NO: 13, FIG. 1).
[0199] Como o Genbank removeu o registro para XM_010466881 (Csa15g017550.1), um esforço foi feito para verificar a presença do gene no genoma. O DNA genômico foi extraído de plantas de germoplasma de Camelina sativa 10CS0043 (abreviado WT43; germoplasma obtido de Kevin Falk at Agriculture and Agri-Food Canada). Os experimentos de PCR foram conduzidos usando o par de iniciadores P675 e P676, bem como, o par de iniciadores P677 e P678 (TABELA 4). Os locais de ligação destes iniciadores dentro da SEQ ID NO: 7 (contém fragmento de DNA de 576 pb que codifica para uma estrutura de leitura aberta de 190 aminoácidos que contém um TTG interno) são mostrados nas FIG. 5 e FIG. 7. Essas reações de PCR demonstraram que as duas regiões sobrepostas do gene estavam presentes no DNA genômico de WT43. Uma reação de PCR com o par de iniciadores P675/P676 produziu uma banda consistente com o fragmento esperado de 0,236 kb (FIG. 7B). Uma reação de PCR com o par de iniciadores P677/P678 produziu uma banda consistente com o fragmento esperado de 0,269 kb.
[0200] Os níveis de transcrição de RNA do gene de ISY também foram testados em RNA isolado da linhagem WT43 (linhagem 16-0359) e uma linhagem transgênica que expressa CCP1 (linhagem MI16 16-0365). O RNA foi isolado de folhas de ambas as linhagens imediatamente antes do peneiramento e de síliquas coletados 12 dias após a floração. Experimentos de RT-PCR com RNA de ambas as linhagens transgênicas e de controle com o par de iniciadores P675/P676 (FIG. 5 e FIG. 7) mostraram que a linhagem transgênica que expressa o gene CCP1 continha mais transcrito para o ISY em comparação com a linhagem de tipo selvagem em ambas as folhas e síliquas (FIG. 7). TABELA 4. Iniciadores usados para verificar a presença de Csa15g017550.1 em transcritos de DNA e RNA genômico Iniciador Sequência Produto de PCR ou RT- PCR experado P675 5’- CCTTGGTTGTGTTCTCTCTTCT- 3’ fragmento de 0,236 kb de (SEQ ID NO: 131) inibidor de invertase
P676 5’- GATCTGTTCAGCGAGTCCTTT- 3’ putativo (SEQ ID NO: 132) P677 5’- TAGTCCTAGCATCGACGAAGA- 3’ fragmento de 0,269 kb de (SEQ ID NO: 133) inibidor de invertase P678 5’ - AGCGAAGGGAGAAATCCAATAA - 3’ putativo (SEQ ID NO: 134) P602 5’ - CGGCCGATTCTGTTTATCTC - 3’ fragmento de 0,77 kb de (SEQ ID NO: 135) actina com DNA P603 5’ - TCCTTCTGGTTCATCCCAAC - 3’ genômico e fragmento de (SEQ ID NO: 136) actina de 0,32 kb com RNA/cDNA como amostra
[0201] Uma vez que Camelina é um alohexaplóide, normalmente existem três homeólogos de cada gene. As pesquisas BLAST foram realizadas com a proteína de 168 aminoácidos codificada por Csa15g017550.1 contra o banco de dados do genoma Camelina (site://www.camelinadb.ca/prairiegold/cgi- bin/blast.cgi) em esforços para identificar os dois outros homeólogos para Csa15g017550.1. Os resultados da pesquisa BLAST de proteína mostrando IDs de genes e valores E são mostrados na TABELA 5 (homeólogos 1-38, 41, 57- 66). Candidatos aparentes para dois outros homeólogos do gene de ISY Csa15g017550 não foram encontrados. Uma pesquisa BLAST adicional foi realizada usando a sequência de codificação de 507 pares de base (SEQ ID NO: 6) para a proteína de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) de Csa15g017550. Os homeólogos 39, 40 e 42-56 foram identificados e são indicados com um “*” próximo ao número do homeólogo. Não foram encontrados candidatos aparentes para os outros dois homeólogos do gene de ISY Csa15g017550. A homologia percentual da proteína de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) com os primeiros vinte homeólogos de melhor correspondência, conforme indicado pelo valor E, foi calculada usando a função de alinhamento ALIGNX do pacote de software Vector NTI (ThermoFisher) e é mostrada na TABELA 5. Suas sequências de proteínas são fornecidas como SEQ ID NOS: 21-40. As homologias percentuais também foram calculadas para Csa11g101740 (SEQ ID NO: 85) e Csa18g038260 (SEQ ID NO: 87) na TABELA 5, dois homeólogos da proteína inibidora de invertase 2 (CWII2) da parede celular descrita em Sederoff et al., Pub. U.S. No. 2016/0138038. Essas proteínas também são descritas na
TABELA 6. TABELA 5. Homeólogos de Camelina para o novo gene de ISY Csa15g017550.1 de Camelina Proteína codificada % de homologia Homeólo- Gene ID Valor E para proteína go No. 1 na SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 5 (proteína de 168 100 Csa15g017550 aminoácidos) SEQ ID NO: 2 (proteína de 134 79,8 Csa15g017550 6.00E-74 aminoácidos) SEQ ID NO: 21 (proteína de 176 64,8 1 Csa18g003060 .00E-53 aminoácidos) SEQ ID NO: 22 63,1 (proteína de 174 2 Csa11g064960 1.00E-51 aminoácidos) SEQ ID NO: 23 (proteína de 168 63,0 3 Csa11g064980 3.00E-51 aminoácidos)23 SEQ ID NO: 24 (proteína de 175 63,1 4 Csa20g081200 1.00E-50 aminoácidos) SEQ ID NO: 25 (proteína de 175 62,5 5 Csa18g003050 1.00E-49 aminoácidos) SEQ ID NO: 26 (proteína de 176 60,5 6 Csa20g077790 2.00E-49 aminoácidos) SEQ ID NO: 27 59,1 (proteína de 176 7 Csa11g064950 2.00E-46 aminoácidos)
SEQ ID NO: 28 57,4 (proteína de 175 8 Csa02g070240 7.00E-46 aminoácidos) SEQ ID NO: 29 59,1 (proteína de 176 9 Csa20g081210 7.00E-46 aminoácidos) SEQ ID NO: 30 56,8 (proteína de 175 10 Csa18g003030 8.00E-45 aminoácidos) SEQ ID NO: 31 (proteína de 176 56,5 11 Csa18g005290 9.00E-44 aminoácidos) SEQ ID NO: 32 55,4 (proteína de 176 12 Csa07g013600 3.00E-43 aminoácidos) SEQ ID NO: 33 (proteína de 176 55,9 13 Csa17g022200 4.00E-43 aminoácidos) SEQ ID NO: 34 (proteína de 176 55,9 14 Csa15g021010 1.00E-42 aminoácidos) SEQ ID NO: 35 (proteína de 147 50,0 15 Csa15g020370 2.00E-39 aminoácidos) SEQ ID NO: 36 52,8 (proteína de 175 16 Csa20g077190 6.00E-39 aminoácidos) SEQ ID NO: 37 44,3 (sequência de 183 17 Csa18g003080 2.00E-34 aminoácidos) SEQ ID NO: 38 42,9 (sequência de 175 18 Csa20g081180 3.00E-34 aminoácidos) SEQ ID NO: 39 45,8 (sequência de 179 19 Csa20g081190 4.00E-34 aminoácidos)
SEQ ID NO: 40 44,9 (sequência de 178 20 Csa18g003070 2.00E-32 aminoácidos) 21 Csa11g064990 3.00E-32 22 Csa11g065000 3.00E-29 23 Csa20g081220 6.00E-29 24 Csa18g003020 8.00E-16 25 Csa20g081240 3.00E-13 26 Csa18g003010 4.00E-13 27 Csa20g081230 1.00E-10 28 Csa11g066240 3.00E-10
2.00E- 29 Csa11g064940 09 30 Csa10g044780 7.00E-06 31 Csa11g053620 2.00E-05 32 Csa12g083870 2.00E-05 33 Csa13g054980 0.013 34 Csa08g052220 0.013 35 Csa02g005450 0.013 SEQ ID NO: 85 19,2 (sequência de 181 36 Csa11g101740 0.017 aminoácidos) 37 Csa02g074170 0.017 38 Csa11g064930 0.037 39* Csa15g002570 0.72 40* Csa19g004990 0.72 SEQ ID NO: 87 18,7 (sequência de 181 41 Csa18g038260 0.083 aminoácidos) 42* Csa01g001500 2.8 43* Csa01g025990 2.8 44* Csa03g032110 2.8 45* Csa03g059400 2.8 46* Csa03g062690 2.8 47* Csa07g030720 2.8 48* Csa08g002670 2.8
49* Csa08g058620 2.8 50* Csa13g007860 2.8 51* Csa14g036540 2.8 52* Csa15g001530 2.8 53* Csa17g040740 2.8 54* Csa19g002590 2.8 55* Csa19g031990 2.8 56* Csa20g008110 2.8 57 Csa08g034720 0.24 58 Csa01g019830 0.31 59 Csa05g029780 0.41 60 Csa19g024110 0.41 61 Csa12g032200 0.7 62 Csa15g023200 0.7 63 Csa16g012150 3.5 64 Csa07g011430 5.9 65 Csa02g040660 5.9 66 Csa04g024120 5.9 Os IDs do gene Csa são do banco de dados do genoma Camelina, encontrado em (site://www.camelinadb.ca/prairiegold/cgi-bin/blast.cgi). 1Entradas com um “*” foram encontradas com pesquisas BLAST usando a sequência de codificação de 507 pb. Todas as outras entradas foram encontradas usando pesquisas BLAST com a proteína de 168 aminoácidos encontrada na SEQ ID NO: 5, 2homologia percentual sobre a proteína inteira da SEQ ID NO: 5 foi determinada usando a função de alinhamento ALIGNX do pacote de software Vector NTI (ThermoFisher).
[0202] Em outros esforços para identificar dois homeólogos para o gene de ISY Csa15g017550, uma análise sintênica foi realizada (FIG. 8). Csa15g017550 foi encontrado no subgenoma G1 e é flanqueado por sequências de codificação para Csa15g017560 à esquerda e por Csa15g017530 à direita. Os dois homeólogos do gene flanqueador esquerdo Csa15g017560 nos subgênomos G2 (Csa19g018770) e G3 (Csa01g015740) foram previamente identificados por Kagale et al. (2014), Nat Commun, 5: 3706). A identidade da sequência de codificação de Csa15g017560, Csa19g018770 e Csa01g015740 está entre 84-92%. O homeólogo de sequência do gene flanqueador direito Csa15g017530 no subgenoma 2 (Csa19g018760) também foi identificado por Kagale et al. (2014). Nosso trabalho identificou Csa01g015720 como o provável outro homeólogo para Csa15g017530 no subgenoma 3 com base em sua posição no genoma e alta identidade de sequência de códons (86-92%) para os outros dois genes. No entanto, nenhum homeólogo foi identificado para Csa15g017550. No subgenoma 2, não havia CDS anotado na posição genômica esperada no banco de dados do genoma Camelina. Sequências repetidas no genoma foram observadas nesta região, sugerindo que um possível rearranjo ou deleção do gene pode ter ocorrido. No subgenoma G3, o CDS Csa01g015730.1 está presente com apenas 28% de identidade de sequência com Csa15g017550. Isso não foi anotado como um homeólogo de Csa15g017550 por Kagale et al. (2014). Assim, parece que o gene de ISY Csa15g017550 está presente como uma única cópia dentro de Camelina alohexaplóide.
[0203] Csa15g017550 é distinto dos dois genes CWII anteriores em Camelina que foram estudados (Sederoff et al., Pub. U.S. No. 2016/0138038, at North Carolina State University). Sederoff et al. usaram o silenciamento do gene RNAi para reduzir a expressão desses genes em Camelina e demonstraram um aumento no rendimento de sementes. Três cópias de cada um desses genes estão presentes (Camelina é uma alohexaplóide). Estes homeólogos incluem homeólogos do inibidor de invertase da parede celular 1 (CWII1) (SEQ ID NO: 76 (Csa03g051630), SEQ ID NO: 78 (Csa14g051860) e SEQ ID NO: 80 (Csa17g075360)) e homeólogos do inibidor de invertase da parede celular 2 (CWII2) (SEQ ID NO: 82 (Csa02g074171), SEQ ID NO: 84 (Csa11g101740) e SEQ ID NO: 86 (Csa18g038260)) encontrados no genoma Camelina. Um alinhamento CLUSTAL das proteínas codificadas por estes genes para a proteína de ISY de 134 e 168 aminoácidos é mostrado na FIG. 2 e a percentagem de cada homeólogo para a proteína de ISY é mostrada na TABELA 6. A homologia percentual para a proteína de ISY de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) varia de 12,3 a 19,2% ao longo de todo o comprimento da sequência. Devido à baixa homologia, apenas SEQ ID NO: 84 (Csa11g101740) e SEQ ID NO: 86 (Csa18g038260) apareceram em nossas pesquisas BLAST de Csa15g017550 mostrado na TABELA 5. TABELA 6. Homologia do novo gene de ISY Csa15g017550.1 de Camelina para proteínas inibidoras de invertase de parede celular de Camelina previamente descrita SEQ ID Tamanho de % de Gene ID1 % de
NO de proteína homologia homologia proteína codificada para proteína para proteína (aminoácidos) na SEQ ID na SEQ ID NO: 22 NO: 53 SEQ ID 168 79,8 Csa15g017550 100 NO: 5 SEQ ID 134 100 Csa15g017550 79,8 NO: 2 Homeólogo CWII1 SEQ ID 159 11,0 SEQ ID NO: 76 NO: 77 12,3 (Csa03g051630) Homeólogo CWII1 SEQ ID 155 11,3 SEQ ID NO: 78 NO: 79 12,5 (Csa14g051860) Homeólogo CWII1 SEQ ID 159 11,0 SEQ ID NO: 80 NO: 81 12,9 (Csa17g075360) Homeólogo CWII2 SEQ ID 180 14,4 SEQ ID NO: 82 NO: 83 18,2 (Csa02g074171) Homeólogo CWII2 SEQ ID 181 14,8 SEQ ID NO: 84 NO: 85 19,2 (Csa11g101740) Homeólogo CWII2 SEQ ID 181 14,3 SEQ ID NO: 86 NO: 87 18,7 (Csa18g038260) 1 Os IDs do gene Csa são do navegador do genoma Camelina sativa (site://www.camelinadb.ca/prairiegold/cgi-bin/gbrowse/camelina/); Os homeólogos CWII1 e CWII2 são as três cópias dos genes CWII que foram estudadas na publicação U.S. Nº 2016/0138038. 2Homologia percentual sobre a proteína total de SEQ ID NO: 2 foi determinada usando a função de alinhamento do pacote de software Vector NTI (ThermoFisher). 3Homologia percentual sobre a proteína total de SEQ ID NO: 5 foi determinada usando a função de alinhamento ALIGNX do pacote de software Vector NTI (ThermoFisher). Exemplo 4. Superexpressão de gene Csa15g017550.1 identificado no Exemplo 1 em Camelina sozinha ou em combinação com expressão de CCP1
[0204] Foram observadas anteriormente em linhagens de camelina, colza e soja modificadas para expressar constitutivamente CCP1 que, além do rendimento de sementes aumentado, houve uma redução no peso individual das sementes. Juntamente com o trabalho revelado por Sederoff et al., Pub. U.S. No. 2016/0138038, na redução da expressão de genes CWII para aumentar o rendimento de sementes levou à hipótese de que a expressão de CCP1 resulta na disponibilidade de carbono aumentada da fotossíntese, número de sementes aumentado e expressão aumentada de gene Csa15g017550, que pode ser um CWII ou outro inibidor de invertase de plantas que é responsável por reduzir o fluxo de carbono para a semente. Para testar essa hipótese, o gene Csa15g017550 foi superexpressado em duas origens diferentes de Camelina. Com base no fato de que o gene Csa15g017550 tem dois locais de iniciação de tradução possíveis (FIG. 5), foram realizados constructos de expressão para ambos para a transformação de Camelina (TABELA 7). O cassete de expressão de gene Csa15g017550 no constructo de pMBXS1168 (FIG. 9, SEQ ID NO: 17) começa em um códon ATG e codifica uma proteína de 134 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) enquanto o cassete de expressão de gene Csa15g017550 no constructo de pMBXS1169 (FIG. 10, SEQ ID NO: 18) começa a montante em um códon TTG e codifica uma proteína de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5). Ambos os constructos foram transformados no ambiente tipo selvagem de Camelina Suneson e em linhagens de Suneson que foram previamente modificados com o vetor pMBXO58 (FIG. 3, SEQ ID NO: 19) para expressar CCP1. TABELA 7. Resumo dos constructos para transformação em Camelina Constructo Tamanho de proteína Promotor codificada Csa15g017550.1 pMBXS1168 134 aminoácidos CaMV 35S (SEQ ID NO: 17; (SEQ ID NO: 2) (constitutivo) FIG. 9) pMBXS1169 168 aminoácidos CaMV 35S (SEQ ID NO: 18; (SEQ ID NO: 5) (constitutivo) FIG. 10)
[0205] Estes constructos foram transformados em Camelina da seguinte forma.
[0206] Em preparação para experimentos de transformação de plantas, sementes de germoplasma de Camelina sativa 10CS0043 (abreviado WT43, obtido a partir de Agriculture and Agri-Food Canada) foram semeadas diretamente em vasos de 4 polegadas (10 cm) cheios de solo na estufa. As condições de crescimento foram mantidas a 24ºC durante o dia e 18ºC durante a noite. As plantas foram cultivadas até a floração. Plantas com vários botões de flores não abertos foram usadas em transformações de “mergulho floral”.
[0207] A cepa de Agrobacterium GV3101 (pMP90) foi transformada com o plasmídeo pMBXS1168 ou pMBXS1169 usando eletroporação. Uma única colônia de GV3101 (pMP90) contendo o constructo de interesse foi obtida a partir de uma placa recentemente semeada e foi inoculada em 5 mL de meio LB. Após crescimento durante a noite a 28ºC, 2 mL de cultura foram transferidos para um frasco de 500 mL contendo 300 mL de LB e incubados durante a noite a 28ºC. As células foram peletizadas por centrifugação (4.000 rpm, 20 min) e diluídas para uma OD600 de ~0,8-1,0 com meio de infiltração contendo 5% de sacarose e 0,05% (v/v) de Silwet-L77 (Lehle Seeds, Round Rock, TX, USA). As plantas de germoplasma de Camelina sativa 10CS0043 (abreviado WT43; germoplasma obtido de Kevin Falk at Agriculture and Agri-Food Canada) foram transformadas por "imersão floral" usando os constructos de transformação pMBXS1168 ou pMBXS1169 como segue. Os vasos contendo plantas em estágio de floração foram colocados em um dessecador a vácuo de 460 mm de altura (Bel-Art, Pequannock, NJ, USA). As inflorescências foram imersas no inóculo de Agrobacterium contido em um béquer de 500 ml. Um vácuo (85 kPa) foi aplicado e mantido durante 5 min. As plantas foram removidas do dessecador e cobertas com sacos plásticos no escuro durante 24 horas à temperatura ambiente. As plantas foram removidas dos sacos e voltaram às condições de crescimento normais dentro da estufa para a formação de sementes (geração de sementes T1).
[0208] Sementes T1 foram rastreadas monitorando a expressão de DsRed, um marcador no T-DNA em vetores plasmídicos pMBXS1168 ou pMBXS1169 (FIGURAS 9 e 10) permitindo a identificação de sementes transgênicas. A expressão de DsRed na semente foi visualizada por microscopia fluorescente usando um microscópio Nikon AZ100 com um módulo de filtro TRITC-HQ (RHOD)2 (HQ545/30X, Q570LP, HQ610/75M) conforme descrito anteriormente (Malik et al., 2015, Plant Biotechnology Journal, 13, 675). Entre 20 e 32 plantas T1 foram produzidas a partir de cada transformação e progrediram até a geração T2. As sementes T1 foram plantadas no solo e as plantas transgênicas foram obtidas. As linhagens de plantas transgênicas foram ainda confirmadas usando PCR com iniciadores específicos para o gene de interesse.
[0209] A superexpressão de gene Csa15g017550 em 3 linhagens transgênicas independentes, cada uma de pMBXO58/pMBXS1168 e pMBXO58/pMBXS1169, e duas linhagens transgênicas T2 independentes, cada uma de pMBXS1168 e pMBXS1169 no ambiente Suneson de tipo selvagem, foram determinadas por RT-PCR semiquantitativo. A superexpressão de Csa15g017550 foi observada (mais transcrição do gene em linhagens transgênicas) em 8 de 10 linhagens. A expressão de gene CCP1 também foi confirmada nas linhagens contendo pMBXO58 (FIG. 3; SEQ ID NO: 19) juntamente com a superexpressão do transcrito Csa15g017550. As linhagens progrediram para a geração T3 para gerar linhagens Csa15g017550 homozigóticas. A TABELA 8 mostra os constructos e o número de linhagens para cada constructo usado nos experimentos de teste de rendimento subsequente realizados em uma câmara de crescimento de planta. TABELA 8. Crescimento da linhagem homozigótica T3 em uma câmara de crescimento de plantas Ambiente do Constructo Promotor/ Geração # de germoplasma de vetor gene linhagens transforma- superexpresso2 selecionadas do 1 para avanço Suneson/pMBXO pMBXS1168 35S/CCP1 T3 4 58 (chamado 35S/Csa15g0175 NJ02) 50 134 aa Suneson/pMBXO pMBXS1169 35S/CCP1 T3 6 58 (chamado 35S/Csa15g0175 NJ02) 50 168 aa Suneson pMBXS1168 35S/Csa15g0175 T3 6 (chamado WTSU) 50 134 aa Suneson pMBXS1169 35S/Csa15g0175 T3 7 (chamado WTSU) 50 168 aa 1 Números de sequência ID para constructos são os seguintes: pMBXO58 (SEQ ID NO: 19); pMBXS1168 (SEQ ID NO: 17); pMBXS1169 (SEQ ID NO: 18). 2Csa15g017550 134 aa,
Csa15g017550 com um códon inicial ATG produzindo um peptídeo de 134 aa (SEQ ID NO: 2); Csa15g017550 168 aa, Csa15g017550 com um códon inicial TTG produzindo um peptídeo de 168 aa (SEQ ID NO: 5). Experimento de Crescimento 1
[0210] Um experimento de rendimento foi realizado para avaliar as linhagens homozigóticas T3 Csa15g017550 mostradas na TABELA 8 sob irrigação igual e um fertilizante equalizado (100 ppm NPK 20-20-20) aplicado três vezes por semana na mistura de envasamento Sunshine 4. A câmara de crescimento da planta foi ajustada para um fotoperíodo de 16 horas, uma temperatura dia/noite de 22ºC/18ºC e uma intensidade de luz de ~350-450 µmol/m2/s.
[0211] Nenhuma diferença foi observada em Csa15g017550 e plantas de controle durante os primeiros 10 dias de desenvolvimento da planta. No entanto, à medida que este experimento progredia, as linhagens Csa15g017550 em todos os ambientes mostraram vigor melhorado e também produziram números maiores de ramificações terciárias na maioria das plantas Csa15g017550 em comparação com os controles. À medida que o estudo avançava, notaram-se que as linhagens que expressam Csa15g017550, além de terem maior vigor e ramificação, tinham floração prolongada. Houve evidência de alguma esterilidade em várias flores de ramificações terciárias. A esterilidade limitada em ramificações terciárias pode ser devido a uma limitação de recursos disponíveis para a planta em um vaso de 6 polegadas (15 cm). No geral, o fenótipo nas ramificações laterais das plantas Csa15g017550 parecia mais saudável e mais produtivo para o rendimento de sementes. Na conclusão do experimento de crescimento, os seguintes parâmetros foram medidos: as alturas das plantas foram anotadas, o número de ramificações terciárias foi determinado, o peso da semente e o peso de 1000 sementes foram determinados e as amostras de sementes foram preparadas para análises de teor de óleo e composição de óleo.
[0212] O rendimento de sementes total (g/planta) foi significativamente maior em várias linhagens de Csa15g017550, com ou sem expressão de CCP1, em comparação com seus controles de ambiente (TABELA 9). A linhagem de maior rendimento foi OY15, que expressou pMBXS1168 no ambiente Suneson de tipo selvagem, que produziu 9,65 ± 1,46 g de semente,
um aumento de 65% em relação aos 5,86 ± 2,25 g de semente produzidos pelo controle Suneson de tipo selvagem.
Este aumento na produção de sementes foi estatisticamente significativo (teste t de Student, p < 0,05). Outros parâmetros relacionados ao rendimento de sementes (peso de 1000 sementes, número total estimado de sementes por planta e altura da planta na maturidade) também foram geralmente aumentados nas linhagens Csa15g017550. As análises do rendimento de sementes total por linhagem revelaram que as linhagens que expressam Csa15g017550 com um número significativamente maior de ramificações terciárias (40-100% mais ramificação) em comparação com os controles também produziram um rendimento de sementes significativamente maior (FIG. 11). TABELA 9. Rendimento de sementes de T4 em linhagens de Camelina transformadas com constructos de expressão Csa15g017550 No. de Rendi- Constructo Linhagem Linhagem plantas mento de Desvio % de genético para transfor- produ- Teste t anali- semente padrão controle2 Csa15g017550 mada1 zida sadas (g) Suneson Nenhum - de tipo 4 5,86 2,25 100% selvagem Suneson de 0,1474 pMBXS1168 tipo OY03 4 7,40 1,36 126% 0 selvagem 0,0651 OY04 4 8,23 1,32 141% 7 0,0350 OY12 4 8,92 0,44 152%* 3 0,0179 OY15 4 9,65 1,46 165%* 3 0,1315 OY16 3 8,57 2,97 146% 2 0,0320 OY17 4 8,95 1,14 153%* 9
Nenhum - NJ02 3 6,40 1,20 100%
0,0238 pMBXS1168 NJ02 OX10 4 9,16 1,78 143%* 5 0,0134 OX13 4 8,66 0,94 135%* 8 0,0506 OX20 4 7,83 0,80 122% 0 0,4309 OX21 3 6,61 1,67 103% 4
Suneson Nenhum - de tipo 5 7,03 1,45 100% selvagem Suneson de 0,1182 MBXS1169 tipo OZ05 4 8,31 1,47 118% 2 selvagem 0,0079 OZ12 4 9,56 0,90 136%** 0 0,0131 OZ15 4 10,16 1,69 144%* 4 0,2082 OZ19 4 8,30 2,52 118% 5 0,0178 OZ21 4 9,72 1,55 138%* 7 0,1339 OZ26 4 9,20 3,13 131% 8 0,1366 OZ27 4 8,28 1,61 118% 6
Nenhum - NJ02 5 7,21 1,14 100% 0,2711 pMBXS1169 NJ02 PA03 4 6,74 1,05 93% 5 0,4556 PA11 4 7,09 1,81 98% 8 0,2583 PA12 3 6,75 0,76 94% 8 PA15 4 6,57 0,63 91% 0,1602
0,3946 PA16 4 6,99 1,27 97% 7 0,0535 PA22 4 8,44 0,85 117%* 8 1 Linhagem NJ02 contém pMBXO58 expressando CCP1 a partir do promotor 35S constitutivo transformado no ambiente Suneson de tipo selvagem. 2Resultados estatisticamente significativos de acordo com o teste t de Student com um p < 0,05 são indicados com *, e P < 0,01 são indicados com **. Experimento de Crescimento 2
[0213] Um segundo experimento de crescimento foi realizado com o mesmo lote de sementes de geração T3 de linhagens ISY selecionadas no ambiente Suneson de tipo selvagem. No segundo experimento, as condições de crescimento foram diferentes. As plantas foram cultivadas em mistura de envasamento Sunshine 4 em vasos de 6" com fertilizante equalizado (100 ppm NPK 20-20-20) três vezes por semana até o final da floração em uma câmara Conviron BDR16 ajustada para fotoperíodo de 16 horas, 22ºC/18ºC temperatura dia/noite de e intensidade de luz de ~450-650 µmol/m2/s. As plantas receberam água adicional conforme necessário em cada vaso. A maioria das linhagens de pMBXS1168 (OY04, OY12, OY15 e OY17) mostrou vigor de mudas aumentado e crescimento da planta geral melhorado em comparação com os controles Suneson de tipo selvagem. As linhagens pMBXS1169 (linhagens OZ) foram geralmente comparáveis ao tipo selvagem no estágio vegetativo inicial.
[0214] O rendimento de sementes de cada planta foi medido e o rendimento médio de sementes para cada linhagem (n = 4 plantas) foi calculado (FIG. 12A). A linhagem Suneson de melhor desempenho transformada com o constructo de pMBXS1168 (linhagem OY12) produziu 9,77 ± 1,08 g de semente por planta, um aumento de 20,7% sobre o rendimento de sementes do controle Suneson de tipo selvagem. Este aumento foi estatisticamente significativo (ANOVA e DMRT significativos (p = 0,05)). A linhagem OY04 também teve um aumento estatisticamente significativo no rendimento de sementes, produzindo 9,54 ± 0,48 g de semente por planta, um aumento de 17,9% acima do controle de tipo selvagem. As linhagens de melhor desempenho transformadas com pMBXS1169 foram OZ21 e OZ26, produzindo aumentos estatisticamente significativos no rendimento de sementes de 22,6% e 17,5%, respectivamente,
em comparação com o controle de tipo selvagem (ANOVA e DMRT significativos (p = 0,05)). A linhagem OZ21 produziu uma média de 9,93 ± 0,74 g de semente por planta, enquanto a linhagem OZ26 produziu uma média de 9,51 ± 0,76 g de semente por planta.
[0215] O número médio de ramificações terciárias por planta foi determinado para cada linhagem e aumentos foram observados (FIG. 12B). Das linhagens transformadas com pMBXS1168, as linhagens com mais ramificações terciárias foram as linhagens OY04, OY12 e OY15, produzindo aumentos estatisticamente significativos no número de ramificações terciárias de 53,9%, 59,7% e 78,8%, respectivamente, em comparação com o controle de tipo selvagem (ANOVA e DMRT significativos (p = 0,05)). A linhagem OY04 produziu 35,00 ± 8,00 ramificações, a linhagem OY12 produziu 36,33 ± 6,43 ramificações, e a linhagem de controle Suneson produziu 22,80 ± 3,94 ramificaçõess. As linhagens de pMBXS1169 com o maior número de ramificações terciárias foram OZ12 e OZ27 que foram estatisticamente significativas com 55,7% e 52,0% mais ramificações terciárias, respectivamente, em comparação com o controle de tipo selvagem (ANOVA e DMRT significativos (p = 0,05)). A linhagem OZ12 produziu 35,50 ± 5,45 ramificações, enquanto a linhagem OZ27 produziu 34,67 ± 2,31 ramificações.
[0216] O número médio de síliquas por planta foi determinado para cada linhagem e aumentos foram observados (FIG. 12C). Das linhagens transformadas com pMBXS1168, a linhagem com mais síliquas foi a linhagem OY15 produzindo 1480,0 ± 68,4 síliquas, um aumento estatisticamente significativo de 21,3% em comparação com o controle de tipo selvagem que tinha 1220,0 ± 86,8 síliquas (ANOVA & DMRT significativos (p = 0,05)). As linhagens transformadas com pMBXS1169 também tinham números estatisticamente significativos de síliquas (FIG. 12C).
[0217] O número médio de sementes por planta também foi determinado (FIG. 12D). As melhores linhagens de produção transformadas com pMBXS1168 foram as linhagens OY04 e OY12 que produziram aumentos estatisticamente significativos em sementes por planta de 19,0% e 19,4%, respectivamente. A linhagem OY04 teve 11.832 ± 1.007 sementes por planta, enquanto a linhagen OY12 teve 11.879 ± 1.374 sementes por planta. A planta de controle Suneson de tipo selvagem tinha 9.946 ± 779 sementes por planta.
[0218] O peso individual das sementes, conforme determinado pela medição da massa de 1000 sementes que foram amostradas usando um contador de sementes, também foi determinado (FIG. 12E). As linhagens com um peso de semente de 1000 próximo ao controle de tipo selvagem (FIG. 12E) em geral tiveram um aumento no número de sementes por planta em comparação com o tipo selvagem (FIG. 12D). Havia algumas linhagens onde havia uma compensação entre o número de sementes por planta e o peso individual da semente. As linhagens OY03 (transformadas com pMBXS1168) e OZ26 (transformadas com pMBXS1169) com o maior peso médio de 1000 sementes também possuíam, pelo menos, o número de sementes por planta (FIGURAS 12D, E).
[0219] Sementes de geração T4 de plantas C3004 selecionadas foram plantadas em um teste de campo em Saskatoon, Canadá, durante a temporada de crescimento de 2019. As medições de fotossíntese foram realizadas em plantas de geração T4 em um estágio de pré-peneiração de cerca de 3,5 semanas após a germinação usando um Sistema de Fotossíntese Portátil LI-6400XT (LI-COR Inc., Lincoln, NE, USA). Fotossínteses combinadas e medições de fluorescência de clorofila adaptada à luz foram registradas a partir de folhas jovens totalmente desenvolvidas de cada linhagem e de tipo selvagem correspondente. Isso permitiu a determinação da assimilação fotossintética líquida, da taxa de transferência de elétrons (fluxo real de fótons direcionando o PSII) e da eficiência do rendimento quântico (PhiPS2) do fotossistema II (PSII). Camelina sativa cv. linhagens de Suneson transformadas com pMBXS1168 que tiveram aumentos estatisticamente significativos nos parâmetros fotossintéticos para fixação de CO2 (FIG. 13A), rendimento quântico efetivo do fotossistema II (PSII) (FIG. 13B), e taxa de transporte de elétrons (ETR) de PSII (FIG. 13C) incluíram linhagens OY04, OY15 e OY17 (TABELA 10). Linhagens de Suneson transformadas com pMBXS1169 que tiveram aumentos estatisticamente significativos nos parâmetros fotossintéticos para fixação de CO2 (FIG. 13A), rendimento quântico efetivo do fotossistema II (PSII) (FIG. 13B), e taxa de transporte de elétrons (ETR) em torno de PSII (FIG. 13C) incluíram as linhagens OZ21 e OZ26 (TABELA 10). Esses resultados indicam uma proporção maior de luz absorvida usada em fotoquímica e fotossíntese geral melhorada. As linhagens C3004 mostrando maior eficiência fotossintética sob condições de crescimento em campo tiveram maiores rendimentos durante os experimentos de crescimento 1 e 2 descritos acima. TABELA 10. Aumentos percentuais nos parâmetros fotossintéticos para Camelina sativa cv. Suneson transformados com pMBXS1168 ou pMBXS1169. Vetor % de aumento % de aumento % de aumento na fotossíntese no rendimento na taxa de Linha- (fixação de quântico eficaz transporte de gem CO2) de PSII elétron de PSII OY04 pMBXS1168 12** 12** 12** OY15 pMBXS1168 23** 23** 22** OY17 pMBXS1168 12* 14* 14* WTSU - - - - OZ21 pMBXS1169 12** 13** 13** OZ26 pMBXS1169 21* 24* 24* 1 Somente as linhagens com aumentos estatisticamente significativos são mostradas. Dados analisados por testes t de Student. **, * = teste t significativo em p ≤ 0,01 e p ≤ 0,05, respectivamente.
[0220] No geral, a expressão aumentada de Csa15g017550 em Camelina resulta em um aumento significativo no vigor do crescimento da planta, número de ramificações, número de síliquas, rendimento de sementes, e alguns parâmetros fotossintéticos. Esses resultados são o oposto do que seria previsto com base na hipótese de que Csa15g017550 pode ser um gene inibidor de invertase da planta. Além do número limitado de linhagens de plantas testadas para cada vetor em cada ambiente genético, há alguma evidência de que o gene que codifica a proteína de ISY 134 aa pode ser mais eficaz mais ou menos o gene CCP1 e, portanto, pode ser uma modalidade preferida. Esses resultados também suportam a teoria de que Csa15g017550 não codifica um inibidor de invertase de plantas. Exemplo 5. Superexpressão de gene de ISY de Camelina em outras culturas: colza, soja, milho, trigo, arroz, batata, tomate, etc.
[0221] Para plantas dicotiledôneas, os vetores pMBXS1168 e pMBXS1169 podem ser modificados para incluir um marcador selecionável apropriado para a seleção de transformantes para a cultura de interesse. Transformação de Colza
[0222] Para a transformação de colza, os vetores pMBXS1168 e pMBXS1169 podem ser modificados para incluir um cassete para expressão de gene bar, proporcionando resistência ao herbicida bialafos. O constructo de pMBXS1269 (FIG. 19A, SEQ ID NO: 197) foi preparado, o qual contém o gene de ISY de Camelina (SEQ ID NO: 1) que codifica a proteína de ISY de 134 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) expressada a partir do promotor constitutivo CaMV35S duplamente aprimorado (2X 35S). O constructo de pMBXS1270 (FIG. 19B, SEQ ID NO: 198) foi preparado, o qual contém o gene de ISY de Camelina (SEQ ID NO: 6) que codifica a proteína de ISY Camelina de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) expressada a partir do promotor constitutivo CaMV35S duplamente melhorado (2X 35S). Um cassete de expressão para o gene bar, conduzido pelo promotor constitutivo CaMV35S duplamente melhorado (2X 35S), foi incluído para seleção. Ambos os constructos foram transformados em colza.
[0223] Em preparação para experimentos de transformação de plantas, sementes de Brassica napus cv DH12075 (obtidas a partir de Agriculture and Agri-Food Canada) foram esterilizadas em superfície com 95% de etanol suficiente durante 15 segundos, seguidas por 15 minutos de incubação com agitação ocasional em Javex de força total (ou outro alvejante comercial, 7,4% de hipoclorito de sódio) e uma gota de agente umectante, tal como Tween 20. A solução de Javex foi decantada e 0,025% de cloreto de mercúrio com uma gota de Tween 20 foi adicionado e as sementes foram esterilizadas durante mais 10 minutos. As sementes foram, em seguida, enxaguadas três vezes com água destilada estéril. As sementes esterilizadas foram semeadas em meio Murashige e Skoog (MS) livre de hormônio de meia força (Murashige T, Skoog F (1962). Physiol Plant 15: 473-498) com 1% de sacarose em placas de petri de 15 x 60 mm que eram, em seguida, colocadas com a tampa removida, em um recipiente estéril maior (potes Majenta GA7). As culturas foram mantidas a 25ºC, com 16 h de luz/8h de escuridão, sob aproximadamente 70-80 µE de intensidade de luz em um gabinete de cultura de tecidos. Mudas de 4-5 dias de idade foram usadas para extirpar cotilédones totalmente desdobrados junto com um pequeno segmento de hipocótilo. As excisões foram feitas de forma a garantir que nenhuma parte do meristema apical fosse incluída.
[0224] Cepas separadas de Agrobacterium de GV3101 (pMP90)
transportando pMBXS1269 (FIG. 19A, SEQ ID NO: 197) ou pMBXS1270 (FIG. 19B, SEQ ID NO: 198) foram preparadas e cresceram durante a noite em 5 ml de meio LB com 50 mg/L de canamicina, gentamicina e rifampicina. A cultura foi centrifugada a 2.000 g durante 10 min., o sobrenadante foi descartado e o pélete foi suspenso em 5 ml de meio de inoculação (Murashige e Skoog com vitaminas B5 (MS/B5; Gamborg OL, Miller RA, Ojima K. Exp Cell Res 50: 151-158), 3% de sacarose, 0,5 mg/L de benzil aminopurina (BA), pH 5,8). Os cotilédones foram coletados em placas de Petri com ~1 ml de água estéril para evitar que murchem. A água foi removida antes da inoculação e os explantes foram inoculados em uma mistura de 1 parte de suspensão de Agrobacterium e 9 partes de meio de inoculação em um volume final suficiente para banhar os explantes. Depois que os explantes foram bem expostos à solução de Agrobacterium e inoculados, uma pipeta foi usada para remover qualquer líquido extra das placas de Petri.
[0225] As placas de Petri contendo os explantes incubados no meio de inoculação foram seladas e mantidas no escuro em um gabinete de cultura de tecidos a 25ºC. Após 2 dias, as culturas foram transferidas para 4ºC e incubadas no escuro durante 3 dias. Os cotilédones, em bateladas de 10, foram em seguida transferidos para meio de seleção consistindo em Murashige Minimal Organics (Sigma), 3% de sacarose, 4,5 mg/L de BA, 500 mg/L de MES, 27,8 mg/L de heptahidrato de sulfato de ferro (II), pH 5,8, 0,7% de Phytagel com 300 mg/L de timentina, e 2 mg/L de L-fosfinotricina (L-PPT) adicionados após autoclavagem. As culturas foram mantidas em um gabinete de cultura de tecido ajustado para 25 ºC, 16h/8h, com uma intensidade de luz de cerca de 125 µmol m-2 s-1. Os cotilédones foram transferidos para seleção fresca a cada 3 semanas até que os brotos fossem obtidos. Os brotos foram excisados e transferidos para meio de alongamento de brotos contendo meio MS/B5, 2% de sacarose, 0,5 mg/L de BA, 0,03 mg/L de ácido giberélico (GA3), 500 mg/L de ácido 4- morfolinaetanossulfônico (MES), 150 mg/L de floroglucinol, pH 5,8, 0,9% de Phytagar e 300 mg/L de timentina e 3 mg/L de L-fosfinotricina adicionados após autoclavagem. Após 3-4 semanas, qualquer calo que foi formado na base dos brotos com morfologia normal foi cortado e os brotos foram transferidos para meio de enraizamento contendo meio MS/B5 com metade da força com 1% de sacarose e 0,5 mg/L de ácido indol butírico, 500 mg/L de MES, pH 5,8, 0,8% de ágar, com 1,5 mg/L de L-PPT e 300 mg/L timentina adicionados após autoclavagem. As plântulas com brotos saudáveis foram endurecidas e transferidas para vasos de 6 polegadas (15 cm) na estufa e sementes transgênicas T1 foram coletadas.
[0226] Para o constructo genético pMBXS1269, 22 linhagens T0 foram isoladas e cultivadas até a maturidade para colher sementes T1. Sementes T1 de 6 linhagens de cópia única, 2 linhagens de cópia dupla e 1 linhagem de várias cópias são cultivadas em uma estufa para identificar plantas transgênicas homozigotas de pMBXS1269.
[0227] Para o constructo genético pMBXS1270, 32 linhagens T0 foram isoladas e cultivadas até a maturidade para colher sementes T1. Sementes T1 de 11 linhagens de cópia única são cultivadas em uma estufa para identificar plantas transgênicas homozigotas de pMBXS1270.
[0228] A triagem de plantas transgênicas de colza que expressam o gene de ISY para identificar plantas com maior rendimento é realizada como segue. A geração T2 de sementes de cada linhagem é colhida. O rendimento de sementes de cada planta é determinado colhendo-se todas as sementes maduras de uma planta e secando-as em um forno com convecção mecânica ajustado a 22ºC durante dois dias. O peso de toda a semente colhida é registrado. O peso de 100 sementes é medido para obter uma indicação do tamanho da semente. O teor de óleo das sementes é medido usando procedimentos publicados para a preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos (Malik et al. 2015, Plant Biotechnology Journal, 13, 675-688). Transformação de Soja
[0229] Para a transformação de soja, os cassetes de expressão para o gene de ISY podem ser excisados do vetor pMBXS1168 ou pMBXS1169. A transformação da soja pode ser realizada com o cassete de expressão para o gene de ISY de escolha e um cassete de expressão para o marcador selecionável de resistência à higromicina como segue. Os cassetes de DNA purificado são co-bombardeados usando biolística em culturas embriogênicas de cultivares de soja Glycine max X5 e Westag97, para obter plantas transgênicas. O gene de resistência à higromicina é expresso a partir de um promotor de planta, tal como o promotor da actina de soja (TABELA 1; SEQ ID NO: 44) e é flanqueado por uma UTR 3' adequada, tal como a UTR 3' do gene da actina de soja (gene da actina de soja ID Glyma.19G147900). O gene de ISY também pode ser expresso a partir do promotor da actina de soja e flanqueado pela 3' UTR do gene da actina de soja nos casos em que é útil usar apenas sequências de DNA da soja para fins de aprovação regulatórios nos termos de USDA-APHIS nos Estados Unidos.
[0230] O protocolo de transformação, seleção e regeneração de plantas é adaptado a partir de Simmonds (2003) (Simmonds, 2003, Genetic Transformation of Soybean with Biolistics. In: Jackson JF, Linskens HF (eds) Genetic Transformation of Plants. Springer Verlag, Berlin, pp 159–174) e é executado da seguinte maneira.
[0231] Indução e manutenção de culturas embriogênicas proliferativas: vagens imaturas, contendo embriões de 3-5 mm de comprimento, são colhidas de plantas hospedeiras cultivadas a 28/24ºC (dia/noite), fotoperíodo de 15 h a uma intensidade de luz de 300-400 µmol m-2 s-1. As vagens são esterilizadas durante 30 s em 70% de etanol seguido por 15 min em 1% de hipoclorito de sódio (com 1-2 gotas de Tween 20 (Sigma, Oakville, ON, Canadá)) e três enxágues em água estéril. O eixo embrionário é excisado e os explantes são cultivados com a superfície abaxial em contato com o meio de indução (sais de MS, vitaminas B5 (Gamborg OL, Miller RA, Ojima K. Exp Cell Res 50: 151- 158), 3% de sacarose, 0,5 mg/L de BA, pH 5,8), 1,25-3,5% de glicose (a concentração varia com o genótipo), 20 mg/l de 2,4-D, pH 5,7). Os explantes, mantidos a 20ºC em um fotoperíodo de 20 h sob luzes fluorescentes brancas frias a 35-75 µmol m-2 s-1, são subcultivados quatro vezes em intervalos de 2 semanas. Grupos embriogênicos, observados após 3-8 semanas de cultura dependendo do genótipo, são transferidos para frascos Erlenmeyer de 125 ml contendo 30 ml de meio de proliferação embrionária contendo 5 mM de asparagina, 1-2,4% de sacarose (a concentração é dependente do genótipo), 10 mg/l de 2,4-D, pH 5,0 e cultivados como acima a 35-60 µmol m-2 s-1 de luz em um agitador rotativo a 125 rpm. Tecido embriogênico (30-60 mg) é selecionado, usando um microscópio invertido, para subcultura a cada 4-5 semanas.
[0232] Transformação: as culturas são bombardeadas 3 dias após a subcultura. Os grupos embriogênicos são manchados em papel de filtro Whatman estéril para remover o meio líquido, colocados dentro de uma placa de Petri de 10 x 30 mm em um suporte de tecido de 2 x 2 cm2 (PeCap, 1005 µm de tamanho de poro, Band SH Thompson and Co. Ltd. Scarborough, ON, Canadá)
e cobertos com um segundo suporte de tecido que é, em seguida, pressionado suavemente para manter os grupos no lugar. Imediatamente antes do primeiro bombardeio, o tecido é seco ao ar na capa de fluxo de ar laminar com a tampa da placa de Petri por no máximo 5 min. O tecido é virado, seco como antes, bombardeado no segundo lado e devolvido ao frasco de cultura. As condições de bombardeio usadas para o Sistema de Entrega de Partículas Biolistic PDS- I000/He são as seguintes: 737 mm Hg de pressão de vácuo da câmara, 13 mm de distância entre o disco de ruptura (Bio-Rad Laboratories Ltd., Mississauga, ON, Canadá) e o macroveículo. O primeiro bombardeio usa discos de ruptura de 900 psi e uma distância de voo de microveículo de 8,2 cm, e o segundo bombardeio usa discos de ruptura de 1100 psi e distância de voo de microveículo de 11,4 cm. A precipitação do DNA em partículas de ouro de 1,0 µm de diâmetro é realizada da seguinte forma: 2,5 µl de 100 ng/µl de DNA contendo o cassete de expressão para o gene de ISY de pMBXS1168 ou pMBXS1169, e 2,5 µl de 100 ng/µl de DNA marcador selecionável (cassete para seleção de higromicina) são adicionados a 3 mg de partículas de ouro suspensas em 50 µl de dH20 estéril e submetidas a vórtice durante 10 segundos; 50 µl de 2,5 M de CaCl2 foram adicionados, agitados em vórtex durante 5 s, seguidos pela adição de 20 µl de 0,1 M de espermidina que também são agitados em vórtex durante 5 s. O ouro é, em seguida, deixado assentar no fundo do tubo de microcentrífuga (5-10 min) e o fluido sobrenadante é removido. O ouro/DNA é ressuspenso em 200 µl de 100% de etanol, deixado sedimentar e o fluido sobrenadante é removido. A lavagem com etanol é repetida e o fluido sobrenadante é removido. O sedimento é ressuspenso em 120 µl de 100% de etanol e alíquotas de 8 µl são adicionadas a cada macroveículo. O ouro é ressuspenso antes de cada alíquota ser removida. Os macroveículos são colocados sob vácuo para garantir a evaporação completa de etanol (cerca de 5 min).
[0233] Seleção: o tecido bombardeado é cultivado em meio de proliferação de embrião descrito acima durante 12 dias antes da subcultura em meio de seleção (meio de proliferação de embrião contém 55 mg/l de higromicina adicionados ao meio autoclavado). O tecido é subcultivado 5 dias depois e semanalmente durante as 9 semanas seguintes. Colônias verdes (eventos transgênicos putativos) são transferidas para uma cavidade contendo 1 ml de meio de seleção em uma placa de múltiplas cavidades, de 24 cavidades, que é mantida em um agitador de frasco como acima. O meio em placas de múltiplas cavidades é substituído por meio fresco a cada 2 semanas até que as colônias tenham aproximadamente 2-4 mm de diâmetro com embriões proliferativos, momento em que são transferidos para frascos Erlenmeyer de 125 ml contendo 30 ml de meio de seleção. Uma porção dos pró-embriões a partir de eventos transgênicos é colhida para examinar a expressão de gene por RT-PCR.
[0234] Regeneração de plantas: a maturação de embriões é realizada, sem seleção, nas condições descritas para a indução de embriões. Grupos embriogênicos são cultivados em placas de Petri contendo meio de maturação (sais de MS, vitaminas B5, 6% de maltose, 0,2% de gelrite, goma de gelano (Sigma), 750 mg/l de MgCl2, pH 5,7) com 0,5% de carvão ativado durante 5-7 dias e sem carvão ativado durante as 3 semanas seguintes. Embriões (10- 15 por evento) com meristemas apicais são selecionados sob um microscópio de dissecção e cultivados em um meio similar contendo 0,6% de fitagar (Gibco, Burlington, ON, Canadá) como o agente de solidificação, sem o MgCl2 adicional, para outras 2-3 semanas ou até que os embriões se tornem amarelo pálido em cor. Uma porção dos embriões de eventos transgênicos após vários tempos em gelrite são colhidos para examinar a expressão de gene por RT-PCR.
[0235] Os embriões maduros são dessecados pela transferência de embriões de cada evento para fundos de placas de Petri vazios que são colocados dentro de caixas Magenta (Sigma) contendo várias camadas de papel de filtro Whatman estéril inundadas com água estéril, para 100% de umidade relativa. As caixas Magenta são cobertas e mantidas no escuro a 20ºC durante 5-7 dias. Os embriões são germinados em meio B5 sólido contendo 2% de sacarose, 0,2% de gelrite e 0,075% de MgCl2 em placas de Petri, em uma câmara a 20ºC, fotoperíodo de 20 h sob luz fluorescente branca fria a 35-75 µmol m-2 s-1. Embriões germinados com folhas unifoliadas ou trifoliadas são plantados em solo artificial (Sunshine Mix No. 3, SunGro Horticulture Inc., Bellevue, WA, USA) e cobertos com uma tampa de plástico transparente para manter a alta umidade. As cestas são colocadas em uma cabine de crescimento controlado a 26/24ºC (dia/noite), fotoperíodo de 18 h a uma intensidade de luz de 150 µmol m-2 s-1. No estágio de 2-3 trifoliadas (2-3 semanas), as mudas com raízes fortes são transplantadas para vasos contendo uma mistura 3: 1: 1: 1 de ASB Original Grower Mix (uma mistura à base de turfa de Greenworld, ON, Canadá): solo:
areia: perlite e cultivadas em fotoperíodo de 18 h a uma intensidade de luz de 300-400 µmol m-2 s-1.
[0236] Sementes T1 são colhidas e plantadas no solo e cultivadas em um gabinete de crescimento controlado a 26/24ºC (dia/noite), fotoperíodo de 18 h a uma intensidade de luz de 300-400 µmol m-2 s-1. As plantas são cultivadas até a maturidade e a semente T2 é colhida. O rendimento de sementes por planta e o teor de óleo das sementes são medidos.
[0237] O marcador selecionável pode ser removido por segregação, se desejado, identificando plantas cotransformadas que não integraram o cassete de expressão do marcador selecionável e o cassete do gene de ISY no mesmo locus. As plantas são cultivadas, deixadas para definir sementes e germinadas. O tecido foliar é colhido de plantas de crescimento no solo e rastreado quanto à presença do cassete marcador selecionável. Plantas contendo apenas o cassete de expressão de gene de ISY são avançadas. Transformação de Milho
[0238] Um cassete de expressão para o gene de ISY pode ser construído usando uma variedade de diferentes promotores para expressão. Os candidatos constitutivos e promotores específicos de semente para uso em monocotiledôneas, incluindo milho, estão listados na TABELA 2, no entanto, os versados na técnica entenderão que outros promotores podem ser selecionados para expressão.
[0239] Em alguns casos, pode ser vantajoso criar um promotor híbrido contendo uma sequência promotora e um intron. Esses promotores podem fornecer níveis maiores de expressão estável. Exemplos de tais promotores híbridos incluem o promotor Cab-m5 de milho híbrido/intron hsp70 de milho (SEQ ID NO: 64, TABELA 2) e o promotor ubiquitina de milho/intron de ubiquitina de milho (SEQ ID NO: 109 e 110, TABELA 2).
[0240] Um exemplo de cassete de expressão para o gene de ISY para milho inclui os elementos genéticos na TABELA 11, em que o promotor está operacionalmente ligado ao gene de ISY que está operacionalmente ligado à sequência de terminação. TABELA 11. Exemplo de cassete de transformação para o gene de ISY de Camelina para milho
Promotor Gene Terminador Promotor Cab-m5 de Gene de ISY Hsp70 3’ UTR milho híbrido/intron codificando a proteína Glyma.02G093200* hsp70 de milho (SEQ de 134 aminoácidos ID NO: 64) (SEQ ID NO: 1) *GENE ID Glyma.02G093200 inclui informações de sequência para regiões de codificação, bem como, promotores associados, 5' UTRs e 3' UTRs (disponíveis em Phytozome, ver JGI site phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html).
[0241] Métodos para transformar o cassete de expressão descrito na TABELA 11 em milho são rotineiros e bem conhecidos na técnica e foram recentemente revisados por Que et al., (2014), Frontiers in Plant Science 5, artigo 379, pp 1 - 19
[0242] Os métodos de transformação de protoplastos úteis para a prática da invenção são bem conhecidos dos versados na técnica. Tais procedimentos incluem, por exemplo, a transformação de protoplastos de milho conforme descrito por Rhodes and Gray (Rhodes, C.A. and D.W. Gray, Transformation and regeneration of maize protoplast, in Plant Tissue Culture Manual: Supplement 7, K. Lindsey, Editor. 1997, Springer Netherlands: Dordrecht. p. 353-365). Para a transformação de protoplastos de milho, o cassete de expressão descrito na TABELA 11 pode ser co-bombardeado com um cassete de expressão para um marcador selecionável, tal como o gene bar que confere resistência de plantas transgênicas a bialafos.
[0243] Para a transformação de milho mediada por Agrobacterium, o cassete de expressão descrito na TABELA 11 pode ser inserido em um vetor binário que também contém um cassete de expressão para um marcador selecionável, tal como o gene bar. O vetor binário é transformado em uma cepa de Agrobacterium tumefaciens, tal como cepa A. tumefaciens EHA101.
[0244] A transformação de milho mediada por Agrobacterium pode ser realizada seguindo um procedimento descrito anteriormente (Frame et al. (2006), Agrobacterium Protocols, Wang K., ed., Vol. 1, pp 185-199, Humana Press) como segue.
[0245] Material de planta: as plantas cultivadas em uma estufa são usadas como uma fonte de explante. As orelhas são colhidas 9-13 dias após a polinização e a superfície esterilizada com 80% de etanol.
[0246] Isolamento de Explante, Infecção e Co-cultivo: embriões zigóticos imaturos (1,2-2,0 mm) são dissecados assepticamente a partir de grãos individuais e incubados em uma cultura EHA101 de cepa A. tumefaciens contendo o vetor de transformação de interesse para edição do genoma (cultivado em 5 ml de meio N6 suplementado com 100 µM de acetosseringona para estimulação dos genes vir bacterianos durante 2-5 h antes da transformação) à temperatura ambiente durante 5 min. Os embriões infectados são transferidos com o lado do escutelo para cima para um meio de co-cultivo (meio solidificado com ágar N6 contendo 300 mg/l de cisteína, 5 µM de nitrato de prata e 100 µM de acetosseringona) e incubados a 20ºC, no escuro durante 3 dias. Os embriões são transferidos para meio de repouso N6 contendo 100 mg/l de cefotaxima, 100 mg/l de vancomicina e 5 µM de nitrato de prata e incubados a 28ºC, no escuro durante 7 dias.
[0247] Seleção de calos: todos os embriões são transferidos para o primeiro meio de seleção (o meio de repouso descrito acima suplementado com 1,5 mg/l de bialafos) e incubados a 28ºC no escuro durante 2 semanas seguidos por subcultura em um meio de seleção contendo 3 mg/l de bialafos. Pedaços de calo em proliferação são propagados e mantidos por subcultura no mesmo meio a cada 2 semanas.
[0248] Regeneração e Seleção de Plantas: linhagens de calo embriogênico resistentes ao bialafos são transferidas para o meio de regeneração I (meio basal MS suplementado com 60 g/l de sacarose, 1,5 mg/l de bialafos e 100 mg/l de cefotaxima e solidificado com 3 g/l Gelrite) e incubadas a 25ºC no escuro durante 2 a 3 semanas. Os embriões maduros formados durante este período são transferidos para o meio de regeneração II (o mesmo que o meio de regeneração I com 3 mg/l de bialafos) para germinação na luz (25ºC, 80-100 µmol/m2/s de intensidade de luz, fotoperíodo de 16/8 h). As plantas regeneradas estão prontas para serem transferidas para o solo dentro de 10-14 dias. As plantas são cultivadas na estufa até a maturidade e as sementes T1 são isoladas.
[0249] O número de cópias da inserção do transgene é determinado, por meio de métodos tal como Southern blotting ou PCR digital, e as linhagens são selecionadas para serem apresentadas para análises posteriores. A superexpressão de gene de ISY é determinada por RT-PCR e/ou técnicas de
Western blotting e plantas com o nível de expressão desejado são selecionadas. Linhagens homozigóticas são geradas. O rendimento da semente das linhagens homozigóticas é comparado com as linhagens de controle. Transformação de Arroz
[0250] Os candidatos constitutivos e promotores específicos de semente para uso em monocotiledôneas podem ser usados nos cassetes de expressão para o gene de ISY em arroz e são listados na TABELA 2. Os versados na técnica entenderão que outros promotores podem ser selecionados para expressão.
[0251] O exemplo do cassete de expressão na TABELA 11 pode ser usado para transformar o gene de ISY em arroz. O cassete de expressão pode ser inserido em um vetor binário que também contém um cassete de expressão para um marcador selecionável, tal como o marcador selecionável higromicina. O vetor binário é transformado em uma cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens.
[0252] Na preparação para a transformação do arroz, o calo de cultivar de arroz Nipponbare é iniciado a partir de sementes maduras, descascadas, esterilizadas na superfície em meio de indução de calo de sal basal N6 (N6-CI; contém por litro 3,9 g de mistura de sal basal CHU (N6) (Catálogo Sigma # C1416); 10 ml de vitaminas N6 100X (contém no volume final de 500 mL, 100 mg de glicina, 25 mg de ácido nicotínico, 25 mg de cloridrato de piridoxina e 50 mg de cloridrato de tiamina); 0,1 g de mio-inositol; 0,3 g de ácido casamino (hidrolisado de caseína); 2,88 g de prolina; 10 ml de 100X 2,4-D, 30 g de sacarose, pH 5,8 com 4 g de gelrite ou fitagel). Aproximadamente 100 sementes são usadas para cada transformação. A frequência de indução de calo é avaliada após 21 dias de cultura no escuro a 27 ± 1ºC. A indução de calo do escutelo com uma alta frequência (de cerca de 96% da indução de calo total) é observada.
[0253] O vetor de transformação de arroz é transformado na cepa AGL1 de Agrobacterium. A cepa de Agrobacterium resultante é ressuspensa em 10 mL de meio MG/L (5 g de triptona, 2,4 g de extrato de levedura, 5 g de manitol, 5 g de Mg2SO4, 0,25 g de K2HPO4, 1 g de ácido glutâmico e 1 g de NaCl) para uma OD600 final de 0,3. Calos embriogênicos escutelares de aproximadamente vinte e um dias de idade são cortados em cerca de 2-3 mm de tamanho e são infectados com Agrobacterium contendo o vetor de transformação durante 5 min.
Após a infecção, os calli são secos em papel de filtro estéril e transferidos para meio de co-cultivo (N6-CC; contém por litro 3,9 g de mistura de sal basal de CHU (N6); 10 ml de vitaminas N6 100X; 0,1 g de mio-inositol; 0,3 g de ácido casamino; 10 ml de 100X 2,4-D, 30 g de sacarose, 10 g de glicose, pH 5,2 com 4 g de gelrite ou fitagel e 1 mL de acetoseringona (19,6 mg/mL de estoque)). Calli co- cultivados são incubados no escuro durante 3 dias a 25ºC.
Após três dias de co- cultivo, os calli são lavados abundantemente em água destilada estéril para remover as bactérias.
É realizada uma lavagem final com uma solução de timentina (250 mg/L) e os calli são secos em papel de filtro estéril.
Os calos são transferidos para meios de seleção (N6-SH; contém por litro 3,9 g de mistura de sal basal CHU (N6), 10 ml de 100x vitaminas N6, 0,1 g de mio-inositol, 0,3 g de ácido de casamino, 2,88 g de prolina, 10 ml de 100x, 2,4-D, 30 g de sacarose, pH 5,8 com 4 g de fitagel e 500 µL de higromicina (concentração de estoque: 100 mg/ml) e incubados no escuro durante duas semanas a 27 ± 1ºC.
Os calli transformados que sobrevivem à pressão de seleção e que proliferam no meio N6-SH são subcultivados no mesmo meio para uma segunda rodada de seleção.
Esses calli são mantidos sob as mesmas condições de crescimento durante mais duas semanas.
O número de plantas regenerado após 30 dias no meio N6-SH é avaliado e a frequência calculada.
Após 30 dias, os calli em proliferação são transferidos para o meio de regeneração (meio N6-RH; contém por litro 4,6 g de mistura de sal MS, 10 ml de 100x vitaminas MS (vitaminas MS contém em 500 mL de volume final 250 mg de ácido nicotínico, 500 mg de cloridrato de piridoxina, 500 mg de cloridrato de tiamina, 100 mg de glicina), 0,1 g de mio- inositol, 2 g de hidrolisado de caseína, 1 ml de solução de 1.000 x 1-ácido naftilacético (NAA; contém em 200 mL de volume final 40 mg de NAA e 3 mL de 0,1 N de NaOH), 20 ml de 50x cinetina (contém em 500 mL de volume final 50 mg de cinetina e 20 mL de 0,1 N de HCl), 30 g de sacarose, 30 g de sorbitol, pH 5,8 com 4 g de fitagel e 500 µl de um estoque de higromicina de 100 mg/mL). A regeneração das plântulas desses calli ocorre após cerca de 4-6 semanas.
As plantas enraizadas são transferidas para péletes de turfa durante uma semana para permitir o endurecimento das raízes.
As plantas são, em seguida, mantidas em sacos lacráveis para aclimatização.
As plantas são transferidas para vasos e cultivadas em uma estufa até a maturidade.
[0254] A semente é colhida de cada panícula (geração T1) e o rendimento de sementes por planta é calculado. A semente T1 é cultivada em uma estufa para produzir a semente T2. A massa da semente total por planta é coletada para comparar o rendimento de sementes dos transgênicos com as plantas de controle de tipo selvagem Exemplo 6. Identificação de homólogos e/ou ortólogos de Camelina ISY em outras espécies de cultura
[0255] O genoma Brassica napus de cultivar ZS11 foi pesquisado por ortólogos do gene de ISY de Camelina usando pesquisas BLAST. Os quatro melhores ortólogos estão listados na TABELA 12 com cálculos de sua homologia percentual com o gene Csa15g017550.1 que codifica as proteínas de 134 (SEQ ID NO: 2) e 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5). Um alinhamento CLUSTAL é mostrado na FIG. 14.
[0256] O genoma de referência da soja (Glycine max Williams 82) foi pesquisado por ortólogos do gene de ISY de Camelina usando pesquisas BLAST. Os quatro melhores ortólogos estão listados na TABELA 12 com cálculos de sua homologia percentual com o gene Csa15g017550.1 que codifica as proteínas de 134 (SEQ ID NO: 2) e 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5). Um alinhamento CLUSTAL é mostrado na FIG. 15.
[0257] O genoma de referência de milho (Zea mays B73) foi pesquisado por ortólogos do gene de ISY de Camelina usando pesquisas BLAST. Os 5 melhores ortólogos estão listados na TABELA 12 com cálculos de sua homologia percentual com o gene Csa15g017550.1 que codifica as proteínas de 134 (SEQ ID NO: 2) e 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5). Um alinhamento CLUSTAL é mostrado na FIG. 16.
[0258] Um alinhamento CLUSTAL das proteínas de 134 (SEQ ID NO: 2) e 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) de Csa15g017550 com os ortólogos de colza, soja e milho listados na TABELA 12 é mostrado na FIG. 17. Os resíduos conservados em todas as proteínas incluem uma cisteína no resíduo 40, uma leucina no resíduo 59, uma cisteína no resíduo 98 e uma cisteína no resíduo 138, todos com base na numeração da proteína Csa15g017550 de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5). Além disso, uma cisteína é conservada no resíduo 25 (com base na numeração da proteína Csa15g017550 de 168 aminoácidos, SEQ ID NO: 5) para todas as proteínas, exceto a proteína truncada Csa15g017550 de 134 aminoácidos (SEQ ID NO: 2). TABELA 12. Ortólogos para o gene Camelina Csa15g017550 em Colza, Soja e Milho Cultura Gene ID1 Proteína ID Tamanho % de % de e/ou SEQ ID de homolo- homolo- NO de proteína gia para gia para proteína codifica- proteína proteína da em SEQ em SEQ (amino- ID NO: 22 ID NO: ácidos) 53 Camelina Csa15g017550.1 SEQ ID NO: 134 100 79,8 (SEQ ID NO: 1) 2 Camelina Csa15g017550.1 SEQ ID NO: 168 79,8 100 (SEQ ID NO: 6) 5
Colza XM_013858728.2 XP_0137141 175 41,1 54,3 (SEQ ID NO: 68) 82 (SEQ ID NO: 69) Colza XM_013819595.2 XP_0136750 175 39,4 52,6 (SEQ ID NO: 70) 49 (SEQ ID NO: 71) Colza XM_013863271 XP_0137187 175 40,6 53,7 (SEQ ID NO: 72) 25 (SEQ ID NO: 73) Colza XM_013819594.2 XP_0136750 188 40,0 52,0 (SEQ ID NO: 74) 48 (SEQ ID NO: 75)
Soja XM_003550884 XP_0035509 183 18,0 23,0 (SEQ ID NO: 88) 32.1 (SEQ ID NO: 89)
Soja XM_006579602 XP_0065796 183 16,4 22,4 (SEQ ID NO: 90) 65.1 (SEQ ID NO: 91) Soja NM_001249068.2 NP_0012359 187 17,6 22,5 (SEQ ID NO: 92) 97 (SEQ ID NO: 93) Soja XM_006604661 XP_0066047 183 15,3 16,4 (SEQ ID NO: 94) 24 (SEQ ID NO: 95)
Milho NM_001150116 NP_0011435 217 13,8 15,6 (SEQ ID NO: 98) 88 (SEQ ID NO: 99) Milho NM_001154951 NP_0011484 228 15,4 21,1 (SEQ ID NO: 100) 23 (SEQ ID NO: 101) Milho NM_001155569 NP_0011490 211 16,1 22,3 (SEQ ID NO: 102) 41 (SEQ ID NO: 103) Milho XM_008657627 XP_0086558 195 15,4 19,0 (SEQ ID NO: 104) 49 (SEQ ID NO: 105) Milho XM_008670754 XP_0086689 176 16,5 23,0 (SEQ ID NO: 106) 76 (SEQ ID NO: 107) 1 Os IDs do gene Csa são do navegador do genoma Camelina sativa (site://www.camelinadb.ca/prairiegold/cgi-bin/gbrowse/camelina/); 2Homologia percentual sobre a proteína total de SEQ ID NO: 2 foi determinada usando a função de alinhamento ALIGNX do pacote de software Vector NTI (ThermoFisher). 3Homologia percentual sobre a proteína total de
SEQ ID NO: 5 foi determinada usando a função de alinhamento ALIGNX do pacote de software Vector NTI (ThermoFisher).
[0259] Um constructo de transformação foi preparado para expressar um dos ortólogos de colza para o gene de ISY de Camelina (sequência do gene XM_013819595.2, SEQ ID NO: 70 que codifica a sequência da proteína XP_013675049, SEQ ID NO: 71) na colza. O constructo de transformação de pMBXS1274 (FIG. 18A, SEQ ID NO: 193) expressa um fragmento de gene que codifica a proteína de 175 aminoácidos na SEQ ID NO: 71 expressada a partir do promotor constitutivo CaMV35S duplamente aprimorado (2X 35S). O constructo de pMBXS1274 foi transformado em colza como descrito acima e linhagens 93 T0 foram isoladas.
[0260] Um alinhamento de múltiplas sequências de Clustal Omega foi examinado para identificar um fragmento de gene menor para expressão que produziria uma proteína de colza de comprimento similar à sequência ISY Camelina de 134 aminoácidos (SEQ ID NO: 2). FIG. 17 mostra alinhamentos de múltiplos ortólogos com as proteínas de ISY Camelina, incluindo 175 aminoácidos SEQ ID NO: 71, o ortólogo de colza escolhido para expressão. Um fragmento de proteína de 138 aminoácidos de SEQ ID NO: 71 foi identificado que era similar em comprimento, e alinhado com a proteína de ISY Camelina de 134 aminoácidos em SEQ ID NO: 2 (FIG. 15). O primeiro aminoácido desse fragmento de proteína foi uma leucina (L). O primeiro códon da sequência do gene que codifica a proteína foi assim alterado para que codificasse uma metionina em vez de uma leucina resultando em SEQ ID NO: 194 (sequência do gene) e SEQ ID NO: 195 (sequência da proteína). O constructo de pMBXS1277 (FIG. 18B, SEQ ID NO: 196) foi preparado, o qual contém o fragmento de DNA de SEQ ID NO: 194 expresso a partir do promotor constitutivo CaMV35S duplamente aprimorado (2X 35S). O constructo de pMBXS1277 foi transformada em colza como descrito acima e as linhagens T0 foram isoladas. Exemplo 7. Expressão de CCP1 em colza usando promotores constitutivos e específicos para sementes e identificação de genes regulados positivamente com homologia a genes da família de inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase com maior rendimento de sementes e peso de semente individual opcionalmente reduzido
[0261] O vetor pMBXO58 (FIG. 3), modificado para expressão constitutiva de CCP1, foi transformado na cepa de Agrobacterium GV3101 (pMP90). A cepa resultante foi usada para transformar Brassica napus cv DH12075 como descrito acima. Foram obtidas linhagens transgênicas que são resistentes ao herbicida bialafos.
[0262] A triagem de plantas transgênicas de colza que expressa o gene CCP1 para identificar plantas com maior rendimento foi realizada como segue. As sementes T1 de várias linhagens independentes foram cultivadas em um delineamento em blocos completo aleatorizado em uma estufa mantida a 24ºC durante o dia e 18ºC durante a noite. A geração T2 de semente de cada linhagem foi colhida. O rendimento de sementes de cada planta foi determinado colhendo todas as sementes maduras de uma planta e secando-as em um forno com convecção mecânica ajustado a 22ºC durante dois dias. O peso de toda a semente colhida foi registrado. O peso de 1000 sementes foi medido para determinar o peso individual das sementes. O teor de óleo das sementes pode ser medido usando procedimentos publicados para a preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos (Malik et al. 2015, Plant Biotechnology Journal, 13, 675-688). Uma série de linhagens T1 foi progredida para a geração T3 para gerar linhagens homozigóticas seguidas pelo volume de sementes na estufa para produzir sementes suficientes para testes de campo. Esses testes de campo foram realizados em Saskatchewan na estação de cultivo de 2017. A melhor linhagem de colza desenvolvida nesses experimentos foi a linhagem MW82 que apresentou um aumento estatisticamente significativo no rendimento de sementes de 13% em comparação com uma planta controle. O peso de 1000 sementes desta linhagem (um indicador do tamanho da semente), em comum com as outras linhagens CCP1 testadas, foi aproximadamente 20% menor do que o peso de 1000 sementes das plantas de controle. Este tamanho reduzido da semente foi consistente entre as linhagens CCP1 testadas nos testes de campo. Esses dados indicam que a expressão constitutiva de CCP1 em colza resulta em fenótipos similares aos observados em Camelina, ou seja, rendimento de sementes aumentado e menor tamanho de sementes.
[0263] Tecido de plantas com maior rendimento de sementes e peso de sementes individual opcionalmente reduzido foram colhidos como segue. Tecido foliar de plantas em estágio vegetativo e tecido de semente em desenvolvimento de linhagens de maior rendimento foram colhidos para análises de RNA Seq para identificar genes de colza regulados positivamente que têm alguma homologia de sequência com genes da família de genes de inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase ou as categorias de ontologia genética listadas na TABELA 16. As análises de RNA Seq foram realizadas por meio de um fornecedor contratado e os dados de expressão de genes diferenciais foram obtidos e analisados para genes regulados positivamente e regulados negativamente. Os resultados dos experimentos de RNA-SEQ são descritos no Exemplo 18.
[0264] Transformações similares foram realizadas com o constructo de pMBXO84 (FIG. 4, SEQ ID NO: 96) modificado para expressão específica de semente de CCP1. As linhagens transgênicas foram obtidas e avançadas conforme descrito acima para as linhagens transformadas com pMBXO58. As linhagens homozigotas foram cultivadas em um teste de campo durante a temporada de crescimento de 2018 em Elm Creek, Manitoba, Canadá. As melhores linhagens continham um aumento estatisticamente significativo de 11% no rendimento de sementes em comparação com as plantas de controle, sem diferença significativa no tamanho da semente. As análises de RNA SEQ em tecido colhido dessas linhagens podem ser realizadas para identificar genes relacionados a ISY ou genes nas categorias de ontologia genética listadas na TABELA 16. Exemplo 8. Expressão de CCP1 em soja usando promotores constitutivos e específicos de semente e identificação de genes regulados positivamente com homologia a genes da família de inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase em linhagens com maior rendimento de sementes e tamanho de semente opcionalmente reduzido
[0265] Para expressar CCP1 a partir de um promotor constitutivo em soja, o vetor linear com base em pJAZZ (Lucigen) pMBXO74 (FIG. 20A, SEQ ID NO: 128) foi usado. Um fragmento de DNA contendo o promotor CaMV 35S, o gene CCP1, e a sequência de terminação de polyA CaMV foi excisado de pMBXO74 por digestão com as enzimas de restrição Apa I e Swa I (FIG. 20A) e um fragmento de DNA de 2,7 kb foi isolado e co-bombardeado com um cassete de higromicina em culturas embriogênicas de soja como descrito acima.
[0266] Outro cassete de expressão constitutivo para CCP1 foi preparado e o fragmento excisado Eco RI/Hind III usado para bombardeio é mostrado na FIG. 20B (pMBXO92, SEQ ID NO: 129). Este cassete de expressão contém um códon do gene CCP1 otimizado para expressão em soja e foi co- bombardeado com um cassete de higromicina em culturas embriogênicas de soja como descrito acima.
[0267] Para expressar CCP1 a partir de um promotor específico de semente em soja, o vetor linear com base em pJAZZ (Lucigen) pMBXO75 (FIG. 20C, SEQ ID NO: 130) foi usado. Um fragmento de DNA contendo o promotor do gene de isoforma A da oleosina de soja, o gene CCP1 e a sequência de terminação de isoforma A da oleosina de soja foi excisado de pMBXO75 por digestão com a enzima de restrição Sma I (FIG. 20C) e um 2,2 kb, o fragmento de promotor da oleosina Sma I-de terminação de oleosina CCP1 foi excisado e co-bombardeado com um cassete de higromicina em culturas embriogênicas de soja.
[0268] Plantas de soja das transformações de pMBXO74, pMBXO92 e pMBXO75 foram geradas conforme descrito acima e cultivadas por várias gerações.
[0269] Tecido de plantas com maior rendimento de sementes e/ou ramificação aumentada e peso de semente individual opcionalmente reduzido foram colhidos como segue.
[0270] Tecido foliar de plantas em estágio vegetativo e tecido de semente em desenvolvimento de linhagens de maior rendimento foram colhidos, o RNA foi extraído, e as análises de RNASeq foram realizadas por meio de um fornecedor contratado. Dados de expressão de gene diferencial foram obtidos e analisados para genes regulados positivamente e regulados negativamente. Os resultados desses experimentos de RNA SEQ são descritos no Exemplo 15. Exemplo 9. Expressão de CCP1 em arroz usando promotores constitutivos e específicos de semente e identificação de genes regulados positivamente com homologia a genes da família de inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase em linhagens com maior rendimento de sementes e tamanho de semente opcionalmente reduzido
[0271] Vários promotores foram escolhidos para a expressão de gene CCP1 em arroz com base em seus perfis de expressão experimental ou in silico preditos em sementes de arroz.
[0272] Um constructo de transformação de pMBXS1091 (FIG. 21)
contendo o promotor do gene da isoenzima 1 insolúvel da beta-frutofuranosidase do arroz (CIN1) que direciona a expressão de CCP1 fundida a um marcador myc foi preparado. O promotor CIN1 foi escolhido com base em dados de expressão in silico mostrando expressão ao longo de vários estágios de desenvolvimento, mas com maior expressão na inflorescência e sementes (Projeto de Anotação do Genoma de Arroz; site://rice.plantbiology.msu.edu/cgi- bin/ORF_infopage.cgi?orf=LOC_Os02g33110.1).
[0273] O arroz foi transformado com o constructo de pMBXS1091 como descrito acima usando calo de cultivar de arroz Nipponbare. A regeneração de plântulas a partir de calli transformados foi realizada e as plantas enraizadas foram transferidas para péletes de turfa para permitir o endurecimento das raízes. As plantas foram, em seguida, mantidas em sacos lacráveis para aclimatização. As plantas foram transferidas para vasos e cultivadas em uma estufa até a maturidade. O número de rebentos e panículas nestes transformantes primários em comparação com as linhagens de controle de tipo selvagem são mostrados na TABELA 13. TABELA 13. Comparação do número de rebentos e panículas produzidos em transformantes primários de arroz transgênico transformado com pMBXS1091 em comparação com controles de tipo selvagem Rebentos Panículas Número % de maior Número % de maior controle de tipo controle de tipo Linhagem selvagem1 selvagem2 NB-E (tipo selvagem) 29 26 100 NB-D (tipo selvagem) 36 100 22 NB-C (tipo selvagem) 24 0 P1091-8B 81 225 48 185
P1091-9B 51 142 43 165 P1091-2C 61 169 38 146 P1091-8A 48 133 35 135 P1091-1A 53 147 32 123 P1091-8C 51 142 30 115 P1091-11C 43 119 29 112 P1091-2A 32 29 112 P1091-2B 35 29 112 P1091-6A 48 133 28 108 P1091-9D 36 100 28 108 P1091-10F 57 158 27 104 P1091-11B 42 117 27 104 P1091-4A 48 133 27 104 P1091-4B 34 27 104 P1091-3B 29 26 100 P1091-7A 71 197 26 100 P1091-10E 30 24 P1091-12B 31 24 P1091-11A 32 23 P1091-9A 43 119 21 P1091-10A 34 20 P1091-1D 24 17 P1091-2E 39 108 16 P1091-2D 36 100 10 P1091-4C 58 161 9 P1091-1B 23 7 P1091-1E 19 7 P1091-5A 28 6 P1091-9C 45 125 4 P1091-10C 63 175 0 P1091-10D 46 128 0 P1091-4D 33 0 P1091-5C 31 0 1 A % para o controle de tipo selvagem foi calculada usando a melhor planta de tipo selvagem que produziu mais rebentos.
Apenas % para valores de controle iguais ou maiores que 100% é mostrada. 2A % para o controle de tipo selvagem foi calculada usando a melhor planta de tipo selvagem que produziu a maioria das panículas. Apenas % para valores de controle iguais ou maiores que 100% é mostrada.
[0274] A semente é colhida de cada panícula (geração T1) e o rendimento de sementes por planta é calculado. A semente T1 é cultivada em uma estufa para produzir a semente T2. A massa da semente total por planta é coletada para comparar o rendimento de sementes dos transgênicos com as plantas de controle de tipo selvagem. Amostras de tecido de planta foram coletadas para extração de RNA, o RNA foi extraído, e as análises de RNASeq foram realizadas por meio de um fornecedor contratado. Os dados de expressão de gene diferencial podem ser analisados para genes regulados positivamente e negativamente, com um foco na identificação de genes da família de genes do inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase ou das categorias de ontologia genética listadas na TABELA 16. Exemplo 10. A expressão aumentada de CCP1 em milho usando promotores constitutivos e específicos de semente e identificação de genes regulados positivamente com homologia a genes da família de inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase em linhagens com maior rendimento de sementes e tamanho de semente opcionalmente reduzido
[0275] Para a transformação de milho, um vetor binário contendo um promotor, o gene CCP1 e um terminador é construído. Os promotores constitutivos apropriados para o milho incluem promotores de monocotiledôneas listados na TABELA 2. Por exemplo, um cassete de expressão contendo o promotor de intron híbrido cab5/hsp70 (SEQ ID NO: 64) operacionalmente ligado ao gene CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii, operacionalmente ligado ao terminador nos do gene de nopalina sintetase pode ser usado. Um cassete de expressão para um marcador selecionável, tal como o gene bar que confere resistência ao herbicida bialafos, está incluído.
[0276] Para a expressão específica de semente, um vetor binário contendo um promotor, o gene CCP1 e um terminador é construído. Os promotores específicos de sementes apropriados incluem promotores de monocotiledôneas listados na TABELA 2. Por exemplo, um cassete de expressão contendo o promotor da isoenzima 1 insolúvel de β-frutofuranosidase de milho (CIN1) (SEQ ID NO: 66) operacionalmente ligado ao gene CCP1 de Chlamydomonas reinhardtii, operativamente ligado ao terminador nos do gene da nopalina sintetase pode ser utilizado. Um cassete de expressão para um marcador selecionável, tal como o gene bar que confere resistência ao herbicida bialafos, está incluído.
[0277] Em preparação para a transformação, o vetor binário é transformado em uma cepa de Agrobacterium tumefaciens, tal como cepa EHA101 de A. tumefaciens. A transformação de milho mediada por Agrobacterium pode ser realizada seguindo um procedimento previamente descrito (Frame et al. (2006), Agrobacterium Protocols, Wang K., ed., Vol. 1, pp 185-199, Humana Press) como descrito acima.
[0278] Linhagens de calo embriogênico resistentes ao bialafos são regeneradas como descrito acima e transferidas para o solo. As plantas são cultivadas em uma estufa para produzir sementes T1. A semente T1 é cultivada no solo em uma estufa para produzir a semente T2. A massa da semente total por planta é coletada para comparar o rendimento de sementes dos transgênicos com as plantas de controle de tipo selvagem.
[0279] O RNA é extraído e as análises de RNASeq são realizadas por meio de um fornecedor contratado. Os dados de expressão de gene diferencial podem ser analisados para genes regulados positivamente e negativamente, com um foco na identificação de genes a partir da família de genes do inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase ou das categorias de ontologia genética listadas na TABELA 16. Exemplo 11. Uso de edição de genoma para alterar a expressão de gene de ISY em Camelina, ou ortólogos do gene de ISY de Camelina em outras culturas
[0280] A expressão de gene de ISY pode ser modificada substituindo as sequências de promotor nativas a montante da sequência de codificação por um promotor contendo um perfil de expressão específico de tecido mais forte ou mais ideal. Exemplos de promotores úteis para este propósito estão listados nas TABELA 1 e TABELA 2. Para aumentar a concentração do produto do gene, um promotor mais forte do que o nativo é usado. A especificidade do tecido de expressão do promotor também pode ser modificada, para aumentar ou reduzir os tipos de tecidos onde o gene é expresso.
[0281] A substituição do promotor nativo pode ser alcançada usando uma enzima de edição do genoma para fazer os cortes de filamento duplo direcionados para remover o promotor nativo (Promotor 1) (FIG. 22). Um novo promotor (Promotor 2) é, em seguida, inserido por meio de um mecanismo de reparo direcionado por homologia (HDR), no qual o novo promotor é flanqueado por sequências de DNA com homologia às regiões a montante e a jusante do promotor nativo original (Promotor 1). Em uma modalidade, essas regiões de flanqueamento do promotor podem, adicionalmente, ser flanqueadas por sequências alvo guia e locais PAM adjacentes para permitir a liberação do promotor por Cas9 a partir de um constructo ou outro DNA.
[0282] Existem vários métodos para alcançar quebras de filamento duplo no DNA genômico, incluindo o uso de nucleases de dedo de zinco (ZFN), nucleases efetoras similares a ativadores de transcrição (TALENs), meganucleases modificadas, e o sistema CRISPR/Cas (CRISPR é um acrônimo para clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeats e Cas uma abreviação para proteína associada a CRISPR) (para revisão, ver Khandagale & Nadaf (2016), Plant Biotechnol Rep, 10: 327-343). A edição do genoma mediada por CRISPR/Cas é o mais fácil desses métodos de implementar, uma vez que tudo o que é necessário é a enzima Cas9 e um único RNA guia (sgRNA) com homologia à modificação alvo para direcionar a enzima Cas9 para o local de corte desejado para clivagem. Os métodos de ZFN, TALENs e meganucleases modificadas requerem um design mais complexo e engenharia de proteínas para ligar a sequência de DNA para permitir a edição. Por esse motivo, o sistema mediado por CRISPR/Cas tornou-se o método de escolha para edição de genoma.
[0283] O sgRNA usado no sistema CRISPR/Cas é uma quimera de RNA sintético criada pela fusão de crRNA com tracrRNA. A sequência guia, localizada na extremidade 5' do sgRNA, confere especificidade ao DNA alvo. Portanto, ao modificar a sequência guia, é possível criar sgRNAs com diferentes especificidades alvo. O comprimento canônico da sequência guia é de ~20 pb. Em plantas, os sgRNAs foram expressos usando promotores de RNA polimerase III de plantas, tais como U6 e U3. Os plasmídeos de expressão de Cas9 para uso nos métodos da invenção podem ser construídos conforme descrito na técnica.
[0284] Será evidente para os versados na técnica que qualquer um desses sistemas pode ser usado para gerar as quebras de filamento duplo necessárias para a excisão do promotor neste exemplo.
[0285] Neste exemplo, o sistema CRISPR/Cas é usado. Existem muitas variações do sistema CRISPR/Cas que podem ser usadas para esta tecnologia, incluindo o uso de Cas9 de tipo selvagem de Streptococcus pyogenes (Tipo II Cas) (Barakate & Stephens (2016), Frontiers in Plant Science, 7: 765; Bortesi & Fischer (2015), Biotechnology Advances 5:33, 41; Cong et al. (2013), Science, 339: 819; Rani et al. (2016), Biotechnology Letters, 1-16; Tsai et al. (2015 ), Nature Biotechnology, 33: 187), o uso de um Tru-gRNA/Cas9 em que mutações fora do alvo foram significativamente diminuídas (Fu et al. (2014), Nature Biotechnology, 32: 279; Osakabe et al. (2016), Scientific Reports, 6: 26685; Smith et al. (2016), Genome Biology, 17: 1; Zhang et al. (2016), Scientific Reports, 6: 28566), uma alta especificidade Cas9 (S. pyogenes Cas9 mutado) com pouca ou nenhuma atividade fora do alvo (Kleinstiver et al. (2016), Nature 529: 490; Slaymaker et al. (2016), Science, 351: 84), os Sistemas Cas Tipo I e Tipo III em que múltiplas proteínas Cas precisam ser expressas para conseguir a edição (Li et al. (2016), Nucleic Acids Research, 44: e34; Luo et al. (2015), Nucleic Acids Research, 43: 674), o sistema Cas Tipo V usando a enzima Cpf1 (Kim et al. (2016), Nature Biotechnology, 34: 863; Toth et al. (2016), Biology Direct, 11:46; Zetsche et al. (2015), Cell, 163: 759), edição guiada por DNA usando a enzima NgAgo Agronaute de Natronobacterium gregoryi que emprega DNA guia (Xu et al. (2016), Genome Biology, 17: 186), e o uso de um sistema de dois vetores, em que Cas9 e cassetes de expressão de gRNA são transportados em vetores separados (Cong et al. (2013), Science, 339: 819).
[0286] Será evidente para os versados na técnica que qualquer uma das enzimas CRISPR pode ser usada para gerar as quebras de filamento duplo necessárias para a excisão do promotor neste exemplo. Há um trabalho em andamento para descobrir novas variantes das enzimas CRISPR que, quando descobertas, também podem ser usadas para gerar as quebras de filamento duplo em torno dos promotores nativos dos genes ISY.
[0287] Neste exemplo, o sistema CRISPR/Cas9 é usado. FIG. 22 detalha uma estratégia para a substituição do promotor na frente de uma sequência ISY nativa usando CRISPR/Cas9 e um mecanismo de reparo direcionado homólogo. Um sgRNA contendo o Guia # 1 e o Guia # 2 é usado para extirpar o promotor a ser substituído (Promotor 1). Um novo cassete de promotor (Promotor 2), flanqueado por sequências com homologia à região a montante e a jusante do Promotor 1, é introduzido e é inserido no local anteriormente ocupado pelo Promotor 1 usando o mecanismo de reparação direcionado homólogo.
[0288] Será evidente para os versados na técnica que muitos promotores diferentes estão disponíveis para expressão em plantas. As TABELA 1 e TABELA 2 listam algumas das opções adicionais para uso em dicotiledôneas e monocotiledôneas que podem ser usadas como promotores de substituição para a estratégia de edição do genoma.
[0289] A estratégia de substituição do promotor mostrada na FIG. 22 também pode ser realizada em outras culturas contendo ortólogos do gene de ISY de Camelina para modificar a expressão do ortólogo, incluindo soja, milho e colza. O promotor nativo na frente de ortólogos do gene de ISY de Camelina em soja, milho e colza listado na TABELA 12 pode ser substituído por um promotor diferente usando métodos de edição de genoma, tal como o método CRISPR- Cas. Exemplo 12. Expressão de ortólogos para o gene de ISY de Camelina, ou genes com homologia para inibidores de invertase de plantas/inibidores de pectina metilesterase identificados em linhagens CCP1, em soja
[0290] Para a transformação de soja com ortólogos no gene de ISY de Camelina Csa15g017550 descrito na TABELA 12, ou para a transformação de genes com homologia em inibidores de invertase de plantas/inibidores de pectina metilesterase ou genes dentro das categorias de GO da TABELA 16 que foram identificados usando os procedimentos descrito no Exemplo 8 e Exemplo 15 para CCP1 que superexpressa linhagens de soja, um cassete de expressão contendo um promotor, o gene de interesse e uma sequência de poliadenilação é preparado. Promotores adequados para dicotiledôneas estão listados na TABELA 1. Por exemplo, um cassete de expressão pode conter o promotor CaMV 35S constitutivo (SEQ ID NO: 108), o gene de ISY e a sequência de poliadenilação CaMV. Um fragmento de DNA contendo o cassete é purificado e co-bombardeado com um cassete de higromicina em culturas embriogênicas de soja.
[0291] Os fragmentos de DNA purificados são introduzidos em culturas embriogênicas de cultivares de soja Glycine max X5 e Westag97 via biolística, para obter plantas transgênicas. A transformação, seleção e regeneração da planta de soja são realizadas conforme descrito acima.
[0292] Embriões transformados germinados são transferidos para o solo como descrito acima e cultivados em fotoperíodo de 18 h a uma intensidade de luz de 300-400 µmol m-2 s-1.
[0293] Sementes T1 são colhidas e plantadas no solo e cultivadas em um gabinete de crescimento controlado a 26/24ºC (dia/noite), fotoperíodo de 18 h a uma intensidade de luz de 300-400 µmol m-2 s-1. As plantas são cultivadas até a maturidade e a semente T2 é colhida. O rendimento de sementes por planta e o teor de óleo das sementes são medidos.
[0294] Existem também métodos de transformação mediados por Agrobacterium para soja que podem ser usados para gerar plantas transgênicas similares que expressam o gene de ISY. Exemplo 13. Expressão de ortólogos para o gene de ISY de Camelina, ou genes com homologia para inibidores de invertase de plantas/inibidores de pectina metilesterase identificados em linhagens CCP1, em arroz e milho
[0295] Para a transformação de arroz com genes com homologia para inibidores de invertase de plantas/inibidores de pectina metilesterase identificados usando os procedimentos descritos no Exemplo 9 para linhagens de superexpressão de CCP1, um vetor binário contendo um cassete de expressão com um promotor, o gene de interesse, e uma sequência de poliadenilação, bem como, um cassete de expressão para um marcador selecionável, tal como o marcador de resistência à higromicina, é preparado. O ISY e o cassete de resistência à higromicina podem ser co-localizados em um vetor binário ou, alternativamente, posicionados em dois vetores binários separados que podem ser co-bombardeados.
[0296] Vários promotores são escolhidos para a expressão de genes com homologia a inibidores de invertase de plantas/inibidores de pectina metilesterase em arroz com base em seus perfis de expressão experimental ou in silico preditos em sementes de arroz e são mostrados na TABELA 2, acima. Será evidente para os versados na técnica que a TABELA 2 não é uma lista exaustiva de promotores que podem ser usados para expressão em arroz e que existem muitos promotores adicionais que trabalhariam na prática da invenção, dependendo da especificidade do tecido desejada para expressão do transgene.
O promotor do gene de ADP-glicose pirofosforilase (AGPase) do arroz (TABELA 2, SEQ ID NO: 55) foi escolhido uma vez que foi demonstrado que é expresso na semente, bem como, no floema dos tecidos vegetativos do arroz (Qu and Takaiwa (2004), Plant Biotechnology Journal, 2: 113-125). O promotor do gene da glutelina C do arroz (GluC) (TABELA 2, promotor com SEQ ID NO: 56) demonstrou ser expresso em todo o endosperma da semente de arroz (Qu et al. (2008), Journal of Experimental Biology, 59: 2417-2424). O promotor do gene da isoenzima 1 insolúvel de beta-frutofuranosidase do arroz (CIN1) (TABELA 2, SEQ ID NO: 57) foi escolhido com base em dados de expressão in silico mostrando expressão ao longo de vários estágios de desenvolvimento, mas com maior expressão na inflorescência e sementes (Projeto de Anotação do Genoma de Arroz; site://rice.plantbiology.msu.edu/cgi- bin/ORF_infopage.cgi?Orf=LOC_Os02g33110.1). O constructo de transformação preparado é transformado em calo de cultivar de arroz Nipponbare usando transformação mediada por Agrobacterium como descrito acima.
[0297] As plântulas são regeneradas a partir de calli e transferidas para péletes de turfa e, em seguida, solo conforme descrito acima. As plantas são cultivadas em uma estufa até a maturidade antes da colheita das sementes (geração T1). A semente T1 é cultivada em uma estufa para produzir a semente T2. A massa da semente total por planta é coletada para comparar o rendimento de sementes dos transgênicos com as plantas de controle de tipo selvagem.
[0298] Para a transformação de milho com ortólogos para o gene de ISY de Camelina Csa15g017550 descrito na TABELA 12, ou para a transformação de genes com homologia em inibidores de invertase de plantas/inibidores de pectina metilesterase identificados usando os procedimentos descritos no Exemplo 10 para linhagens de superexpressão de CCP1 de milho, um vetor binário contendo um promotor, o gene de interesse e um terminador é construído. Os promotores apropriados incluem os promotores de monocotiledôneas listados na TABELA 2. Por exemplo, um cassete de expressão contendo o promotor de intron híbrido cab5/hsp70 (SEQ ID NO: 64) operacionalmente ligado ao gene de ISY, operacionalmente ligado ao terminador nos do gene de nopalina sintase pode ser usado. Um cassete de expressão para um marcador selecionável, tal como o gene bar que confere resistência ao herbicida bialafos, está incluído. Em preparação para a transformação, o vetor binário é transformado em uma cepa de Agrobacterium tumefaciens, tal como cepa EHA101 de A. tumefaciens. A transformação de milho mediada por Agrobacterium pode ser realizada seguindo um procedimento previamente descrito (Frame et al. (2006), Agrobacterium Protocols, Wang K., ed., Vol. 1, pp 185-199, Humana Press) como descrito acima. As plantas são regeneradas conforme descrito acima e são transferidas para o solo. As plantas são cultivadas em uma estufa para produzir sementes T1. A semente T1 é cultivada no solo em uma estufa para produzir a semente T2. A massa da semente total por planta é coletada para comparar o rendimento de sementes dos transgênicos com as plantas de controle de tipo selvagem. Exemplo 14. Expressão de gene de ISY de Camelina, seus ortólogos ou genes com homologia a inibidores de invertase de plantas/inibidores de pectina metilesterase, em plantas em combinação com genes CCP1
[0299] O gene de ISY de Camelina, genes ortólogos ou genes com homologia a inibidores de invertase de plantas/inibidores de pectina metilesterase podem ser co-expressos em uma planta com um gene CCP1, colocando cassetes de expressão para o gene de ISY de Camelina, um gene ortólogo ou um gene com homologia a um inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase e o gene CCP1 no mesmo vetor de transformação e transformando a planta. Os cassetes de gene podem conter uma variedade de promotores diferentes para controlar a expressão, incluindo promotores específicos de semente, promotores constitutivos, promotores específicos de folha, ou outros promotores específicos de tecido que serão evidentes para os versados na técnica. Um cassete de expressão para um marcador selecionável, tal como o gene bar, que fornece resistência ao herbicida bialafos, também está incluído. O marcador selecionável é escolhido com base na planta a ser transformada.
[0300] Quatro exemplos dados aqui são constructos, nos quais a expressão de ambos os genes é controlada pelo promotor e terminadores CaMV35S constitutivos, a expressão de ambos os genes é controlada por promotores de oleosina específicos de sementes e terminadores de oleosina correspondentes, o Camelina ISY, gene ortólogo, ou gene com homologia a um inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase, a expressão é controlada pelo promotor 35S e o gene CCP1 é controlado pelo promotor de oleosina, e o gene de ISY de Camelina, gene ortólogo ou gene com homologia a um inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase, a expressão é controlada pelo promotor da oleosina e o gene CCP1 é controlado pelo promotor constitutivo.
Esses vetores (constructos A, B, C e D na TABELA 14) são projetados para transformação em dicotiledôneas, incluindo Camelina e colza, cujos procedimentos de transformação são descritos acima.
A co- transformação de constructos A e B na mesma planta pode fornecer benefícios de rendimento aprimorados.
TABELA 14. Exemplo de cassetes de expressão para co-expressão de um gene de ISY ou CWII com CCP1 Cons- Cassete de expressão 1 Cassete de expressão 2 tructo promotor gene termina- promotor gene termina- dor dor A CaMV35S gene de ISY CaMV35S CaMV35S CCP1 CaMV35S constitutivo de Camelina constitutivo ou gene com homologia a inibidor de invertase de plantas/inibi- dor de pectina metilesterase B oleosina gene de ISY oleosina oleosina CCP1 oleosina específica de Camelina específica de ou gene com de semente homologia a semente inibidor de invertase de plantas/inibi- dor de pectina metilesterase
C CaMV35S gene de ISY CaMV35S oleosina CCP1 oleosina constitutivo de Camelina específica ou gene com de homologia a semente inibidor de invertase de plantas/inibi- dor de pectina metilesterase D oleosina gene de ISY oleosina CaMV35S CCP1 CaMV35S específica de Camelina constitutivo de ou gene com semente homologia a inibidor de invertase de plantas/inibi- dor de pectina metilesterase
[0301] Será evidente para os versados na técnica que a co- expressão de genes ISY ou CWII e CCP1 também pode ser alcançada por co- transformação de vetores separados que contêm um cassete de expressão de ISY ou CWII em um plasmídeo e um cassete de expressão de CCP1 em outro plasmídeo e triagem dos transformantes quanto à presença de ambos os cassetes de expressão. Também será evidente para os versados na técnica que a co-expressão de genes ISY ou CWII e CCP1 pode ser alcançada cruzando plantas que expressam os genes individuais para obter uma planta que expressa ambos os genes.
[0302] Os vetores selecionados de A, B, C e/ou D (TABELA 14) podem ser otimizados para transformação em soja substituindo o cassete de expressão de barra por um cassete de expressão que codifica o gene de higromicina. Um fragmento de DNA contendo o gene CCP1, gene de ISY ou CWII, e cassetes de expressão de gene de resistência à higromicina podem ser excisados e introduzidos na soja usando o método biolístico descrito acima. Em alguns casos, pode ser desejável otimizar a expressão do promotor para CCP1 e ISY ou o gene com homologia a um inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase. Os promotores para a expressão destes transgenes podem ser selecionados daqueles listados na TABELA 1, dependendo da especificidade do tecido desejada para a expressão, ou podem ser selecionados a partir de qualquer outro promotor que forneça uma boa expressão em dicotiledôneas.
[0303] Os vetores selecionados de A, B, C e/ou D (TABELA 14) podem ser otimizados para transformação em arroz substituindo o cassete de expressão de barra por um cassete de expressão que codifica o gene de higromicina. Em alguns casos, pode ser desejável otimizar os promotores que direcionam a expressão de ISY ou do gene com homologia a um inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase e genes CCP1 usando um promotor específico de monocotiledônea, tais como os descritos na TABELA 2, acima, ou qualquer outro promotor que forneça boa expressão em monocotiledôneas. A escolha do promotor pode ser ditada pela especificidade do tecido desejada para a expressão. Os vetores binários modificados são introduzidos em uma cepa de Agrobacterium, tal como a cepa de Agrobacterium AGL1, e o procedimento de transformação de arroz descrito acima é seguido.
[0304] Os vetores selecionados de A, B, C e/ou D (TABELA 14) podem ser otimizados para transformação em milho usando um promotor específico de monocotiledônea, tais como os descritos na TABELA 2, ou qualquer outro promotor que forneça boa expressão em monocotiledôneas, para conduzir a expressão de ISY ou do gene com homologia para um inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase e genes CCP1. A escolha do promotor pode ser ditada pela especificidade do tecido desejada para a expressão. Os vetores binários modificados são introduzidos em uma cepa de Agrobacterium, tal como cepa EHA101 de A. tumefaciens, e o procedimento de transformação de milho descrito acima é seguido. Exemplo 15. Identificação de genes regulados positivamente e negativamente em linhagens de soja que expressam o gene CCP1 usando sequenciamento de RNA
[0305] As linhagens de geração T2 de soja selecionadas, produzidas conforme descritas nos Exemplos 5 e 8, foram cultivadas em uma câmara de crescimento para gerar amostras para análises por sequenciamento de RNA. A TABELA 15 mostra as linhagens que foram selecionadas para análises, o tipo de tecido coletado e classifica as linhagens em grupos para fins de análises.
As amostras foram colhidas no estágio indicado e rapidamente congeladas em nitrogênio líquido.
As amostras foram armazenadas a -80ºC.
O RNA foi extraído usando o kit de RNA da Planta Omega Bio-Tek E.Z.N.A e enviado a um provedor de serviços contratado que realizou o sequenciamento de RNA e o processamento de dados.
TABELA 15. Amostras de Glycine max usadas nas análises de RNA- seq Grupo Tecido* Linhagem** CCP1 A Folha Controle de tipo selvage de - Westag B Folha Linhagem nula - C Folha pMBXO74 (35S-CCP1, + heterozigoto) C-1 Folha pMBXO74 (35S-CCP1, + homozigoto) D Semente em Controle de Westag - maturação E Semente em Linhagem nula - maturação F Semente em pMBXO74 (35S-CCP1, + maturação heterozigoto) F-1 Semente em pMBXO74 (35S-CCP1, + maturação homozigoto) L Semente em Controle de Westag - maturação M Semente em Linhagem nula - maturação P Semente em pMBXO75 (pOle-CCP1, + maturação homozigoto) H Semente em Controle de Westag - desenvolvimento J Semente em Linhagem nula -
desenvolvimento K Semente em pMBXO75 (pOle-CCP1, + desenvolvimento homozigoto) *Os estágios do tecido colhido são os seguintes: folha, folha expandida no estágio V6 coletada de plantas com 5,5 semanas de idade; semente verde amarelada em maturação, 1,2-1,3 cm de tamanho coletada de plantas com 8 semanas de idade; desenvolvimento de sementes verdes, 1 cm de tamanho coletado de plantas com 7 semanas de idade ** Linhagem nula gerada por meio de segregação.
[0306] Devido a sua possível relação com a função do gene de ISY de Camelina, os termos de Ontologia Genética (GO) listados na TABELA 16 foram investigados. O objetivo deste trabalho foi pesquisar o genoma Glycine max para genes que foram diferencialmente expressos em CCP1 + linhagens que pudessem estar associados a um ou mais desses termos de GO. Quase todos os genes dentro do conjunto de dados de RNA-seq tiveram um melhor hit BLAST correspondente no genoma Arabidopsis thaliana, que é muito bem anotado em relação aos termos de GO associados. Portanto, para cada um dos termos de GO na TABELA 16, uma lista de genes de Arabidopsis thaliana associados ao termo de GO foi feita. Todos os genes dentro do genoma Glycine max que tinham um daqueles genes de Arabidopsis thaliana como seu melhor hit BLAST foram, em seguida, identificados. Entre esses genes Glycine max, alguns foram regulados positivamente ou negativamente nas linhagens CCP1 de uma forma estatisticamente significativa; ou seja, um teste de Tukey sugeriu que a probabilidade era maior do que 90% de que as médias dos níveis de transcrição nas linhagens transgênicas versus de tipo selvagem fossem diferentes. Genes expressos diferencialmente em folhas:
[0307] Houve um grande número de mudanças muito significativas no tecido foliar colhido, especialmente na linhagem homozigótica (C-1) em comparação com o controle de tipo selvagem (A) (para informações sobre a linhagem, ver TABELA 15). Os genes regulados positivamente e negativamente juntamente com a comparação correspondente às alterações de dobra são mostrados na TABELA 17. Apenas as comparações em que a diferença de dobra entre as duas linhagens C-1 e A excede 2 são mostradas. É importante notar que os genes cuja expressão também foi regulada positivamente ou negativamente na linhagem nula (B) em comparação com a linhagem de controle (A) foram excluídos a partir da consideração porque podem não ter sido um resultado da adição do gene CCP1 para a planta. TABELA 16. Categorias de Ontologia Genética usadas para investigar dados de sequenciação de RNA Categoria de GO Descrição GO:0030570 Atividade de pectato liase GO:0030599 Atividade de pectinesterase GO:0046910 Atividade do inibidor de pectinesterase GO:0052793 Atividade de pectina acetilesterase
[0308] Para classificar e examinar a relação dos genes expressos diferencialmente em linhagens de CCP1 + soja nessas categorias de Ontologia Genética (GO), uma árvore filogenética (cladograma) (FIG. 23) foi criada usando o programa CLUSTAL Omega (site://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). O gene de ISY de Camelina também foi incluído para determinar se algum dos genes de soja diferencialmente expressos era similar ao gene de ISY de Camelina. Usando a árvore filogenética (FIG. 23), bem como, os alinhamentos de múltiplas sequências CLUSTAL Omega, as proteínas codificadas pelos genes diferencialmente expressos foram agrupadas em cinco grupos (FIG. 23 e TABELA 17). Na árvore filogenética (FIG. 23), a proteína codificada pelo gene de ISY de Camelina agrupado com as proteínas de soja no grupo 2, que são classificadas com os termos de GO de pectinesterases ou inibidores de parede celular/vacuolares de frutosidase 1. As proteínas do grupo 2 foram investigadas mais de perto com alinhamentos de sequência e o gene de ISY de Camelina pareceu ser mais parecido com os inibidores de parede celular/vacuolares de frutosidase 1 (Genes NP_001237215.2 e NP_001235420.1; FIGURAS 25 e 26).
[0309] Os alinhamentos de proteínas em cada um dos outros agrupamentos filogenéticos na TABELA 17 foram realizados e mostram um alto grau de similaridade (FIGURAS 24, 27, 28 e 29). TABELA 17. Genes Glycine max expressos diferencialmente da superfamília do inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase em CCP1 + linhagem homozigótica (C-1) e linhagem nula (B) versus de tipo selvagem (A)
Locus Proteína ID Locus A.
Descrição A.
Dobra Dobra Grupo Glycine thaliana thaliana (C-1)/A B/A* atribuído na max árvore filogené- tica LOC10078 XP_0035269 AT1G67750 Pectato liase 3,937 0,133 7082 81.1 provável 5 (SEQ ID NO: 141) LOC10078 XP_0065897 AT5G04310 Pectato liase 4,172 DNP 9303 07.1 (SEQ ID NO: 142) 1 LOC10078 XP_0035359 AT4G13710 Pectato liase 106.093 DNP 1845 58.1 provável 15 (SEQ ID NO: 143) LOC10080 XP_0035557 AT1G04680 Pectato liase 16.906 DNP 8253 14.4(SEQ ID provável 1 NO: 144)
LOC10081 XP_0035438 AT3G29090 Pectinesterase 0,079 DNP 0259 34.1 31 (SEQ ID NO: 145) LOC10078 XP_0065877 AT3G29090 Pectinesterase 4.297 DNP 6786 35.1 31 (SEQ ID NO: 146) 2 LOC10050 NP_0012372 AT1G47960 Inibidor de 0,003 DNP 0640 15.2 parede (SEQ ID NO: celular/vacuolar 147) de fructosidase 1 LOC10030 NP_0012354 AT1G47960 Inibidor de 0,016 DNP 6719 20.1 parede
(SEQ ID NO: celular/vacuolar 148) de fructosidase 1
LOC10077 XP_0035174 AT1G62770 Inibidor de 0,191 DNP 6636 32.1 pectinesterase 9 (SEQ ID NO: 149) LOC10081 XP_0035307 AT1G14890 Proteína da 2.328 DNP 2251 73.1 superfamília do (SEQ ID NO: inibidor de 150) invertase de 3 plantas/pectina metilesterase LOC10080 XP_0035252 AT1G14890 Proteína da 4.499 DNP 3842 40.1 superfamília do (SEQ ID NO: inibidor de 151) invertase de plantas/pectina metilesterase
LOC10080 XP_0035314 AT5G09760 Inibidor de 44.942 DNP 1231 08.1 pectinesterase (SEQ ID NO: /pectinesterase 152) provável 51 LOC10077 XP_0035267 AT5G53370 Inibidor de 25.882 DNP 6752 11.1 pectinesterase/ 4 (SEQ ID NO: pectinesterase 153) provável 61 LOC10081 XP_0035536 AT2G45220 Inibidor de 192.005 DNP 3592 58.2 pectinesterase/ (SEQ ID NO: pectinesterase 154) provável 17
LOC10077 XP_0259819 AT3G14310 Inibidor de 14.818 DNP 5 6623 66.1 pectinesterase/
(SEQ ID NO: pectinesterase 3 155) LOC10077 XP_0035287 AT3G14310 Inibidor de 23.049 DNP 7646 39.1 pectinesterase/ (SEQ ID NO: pectinesterase 3 156) *DNP = não passou no teste de Tukey com P < 0,1 (alteração da dobra não significativamente diferente de 1,00). Ver TABELA 15 para obter a explicação das amostras.
[0310] Uma análise adicional foi realizada com os dados de Glycine max RNA-seq, em que o pacote DESeq2 do Bioconductor R foi usado para determinar a expressão diferencial. Nessas análises, a filtragem usou um tratamento estatístico diferente e genes adicionais de interesse foram identificados. No método de filtragem alternativo, o teste de Tukey não foi usado para filtrar os dados, mas sim todas as comparações para as quais σ/μ < 0,75 para ambas as linhagens que foram retidas (μ é o valor médio das leituras normalizadas para uma linhagem particular e σ é seu desvio padrão). Apenas as comparações em que as duas contagens de leitura médias das análises de RNA- Seq adicionadas para > 2,00 foram mantidas.
[0311] Os genes que preencheram esses critérios e que se enquadram nas categorias de GO listadas na TABELA 16 são mostrados na TABELA 18. Na TABELA 18, apenas as comparações em que a diferença de dobra entre as duas linhagens comparadas excede 1,5 são incluídas. TABELA 18. Genes Glycine max expressos diferencialmente a partir da superfamília do inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase em folhas colhidas de CCP1 + e linhagens nulas versus linhagem de controle de tipo selvagem* Locus Glycine Proteína ID Locus A. Descrição de DobraC DobraB/ max thaliana A. thaliana 1/A A LOC100808438 XP_003555884.1 AT3G53190 Pectato liase 4,25 0,24 (SEQ ID NO: 159) provável 12 LOC100815062 XP_003541430.1 AT3G53190 Pectato liase 49,89 (SEQ ID NO: 160) provável 12 LOC100782388 XP_003551943.1 AT1G67750 Pectato liase 35,65
(SEQ ID NO: 157) provável 5 LOC100816256 XP_006591479.1 AT1G67750 Pectato liase 34,37 (SEQ ID NO: 158) provável 5 LOC100789303 XP_006589707.1 AT5G04310 Pectato liase 4,17 (SEQ ID NO: 142) LOC100779940 NP_001242543.1 AT5G63180 Pectato liase 2,14 (SEQ ID NO: 170) provável 22 LOC100802068 XP_003556544.1 AT3G55140 Pectato liase 0,61 (SEQ ID NO: 171) LOC100777128 XP_003528738.1 AT1G53840 Pectinesterase 1,51 0,58 (SEQ ID NO: 172) 1 LOC100814987 XP_003551027.1 AT3G43270 Inibidor de 2,17 (SEQ ID NO: 173) pectinesterase/ pectinesterase provável 32 LOC100801231 XP_003531408.1 AT5G09760 Inibidor de 44,94 (SEQ ID NO: 152) pectinesterase/ pectinesterase provável 51 LOC100777500 XP_003546532.1 AT4G33220 Inibidor de 0,47 (SEQ ID NO: 174) pectinesterase/ pectinesterase provável 44 LOC100816190 XP_003517421.1 AT5G47500 Pectinesterase 870.46 (SEQ ID NO: 168) provável 68 LOC100810031 XP_003538735.1 AT5G47500 Pectinesterase 262.40 (SEQ ID NO: 167) provável 68 LOC100796327 XP_003550907.1 AT5G47500 Pectinesterase 245.06 (SEQ ID NO: 166) provável 68 LOC100793773 XP_003524409.1 AT5G19730 Pectinesterase 64,24 (SEQ ID NO: 162) provável 53 LOC100819675 XP_003524299.2 AT5G09760 Inibidor de 48,82 (SEQ ID NO: 164) pectinesterase/ pectinesterase provável 51 LOC100802832 XP_006584808.1 AT5G19730 Pectinesterase 47,04
(SEQ ID NO: 163) provável 53 LOC100808236 XP_006578909.1 AT5G53370 Inibidor de 38,78 (SEQ ID NO: 165) pectinesterase/ pectinesterase provável 61 LOC100793314 XP_003516527.2 AT5G19730 Pectinesterase 28,80 (SEQ ID NO: 161) provável 53 LOC100777646 XP_003528739.1 AT3G14310 Inibidor de 23,05 (SEQ ID NO: 156) pectinesterase/ pectinesterase 3 LOC100776623 XP_025981966.1 AT3G14310 Inibidor de 14,82 (SEQ ID NO: 155) pectinesterase/ pectinesterase 3 LOC100786786 XP_006587735.1 AT3G29090 Pectinesterase 4,30 (SEQ ID NO: 146) 31 LOC100776222 XP_003527461.1 AT1G41830 Similar a SKU 6 2,55 (SEQ ID NO: 175) LOC100789567 XP_003527069.1 AT1G53840 Pectinesterase 0,51 (SEQ ID NO: 176) 1 LOC100816686 XP_003546521.1 AT5G20740 Inibidor de 173.35 (SEQ ID NO: 169) pectinesterase 3 LOC100305900 NP_001238450.1 AT5G62350 Subunidade A 4,23 (SEQ ID NO: 177) da proteína de replicação A de 32 kDa LOC100812251 XP_003530773.1 AT1G14890 Proteína da 2,33 (SEQ ID NO: 150) superfamília do inibidor de invertase de plantas/pectina metilesterase LOC100776636 XP_003517432.1 AT1G62770 Inibidor de 0,19 (SEQ ID NO: 149) pectinesterase
LOC100306719 NP_001235420.1 AT1G47960 Inibidor 0,02 (SEQ ID NO: 148) vacuolar/ parede celular de fructosidase 1 LOC100500640 NP_001237215.2 AT1G47960 Inibidor 0,00 0,53 (SEQ ID NO: 147) vacuolar/ parede celular de fructosidase 1 LOC100776478 XM_006587593.3 AT5G45280 Pectina 0,63 (SEQ ID NO: 178) acetilesterase 11 LOC100781246 XP_014624577.1 AT4G19420 Pectina 0,61 (SEQ ID NO: 179) acetilesterase 8 *As linhagens são identificadas na TABELA 15.
[0312] A ferramenta de alinhamento de múltiplas sequências Clustal Omega foi usada para criar uma árvore filogenética (cladograma) (FIG. 30) com todas as sequências de proteína de soja listadas na TABELA 18 e o gene de ISY de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5). Genes expressos diferencialmente nas linhagens de CCP1 + soja com expressão regulada positivamente maior do que 100 vezes, bem como, todos os genes regulados negativamente são rotulados na FIG. 30. A árvore filogenética (FIG. 30) e os alinhamentos de sequência da proteína de ISY Camelina com as proteínas na TABELA 18 mostraram que as correspondências mais próximas à proteína de ISY são dois inibidores de parede celular/vacuolar de frutosidase 1 [NP_001237215.2 (SEQ ID NO: 147) e NP_001235420.1 (SEQ ID NO: 148)] e uma pectinesterase [XP_006587735.1 (SEQ ID NO: 146)]. Genes expressos diferencialmente em sementes:
[0313] Três tipos diferentes de amostras de sementes foram analisados no experimento de RNA SEQ com foco em sementes: sementes em maturação colhidas a partir de plantas transformadas com o constructo do promotor constitutivo 35S (pMBXO74, FIG. 20A, SEQ ID NO: 128) e controles apropriados, bem como, sementes em desenvolvimento e maturação a partir de um constructo do promotor específico de semente de oleosina (pMBXO75, FIG. 20C, SEQ ID NO: 130) e controles apropriados. Informações adicionais sobre as amostras são descritas na TABELA 15.
[0314] Para amostras de sementes, as análises de dados de RNA- seq foram realizadas com o pacote DESeq2 de Bioconductor R para determinar a expressão diferencial. Nestas análises, o teste de Tukey não foi usado para filtrar os dados, mas sim todas as comparações para as quais σ/μ < 0,75 para ambas as linhagens foram retidas (μ é o valor médio das leituras normalizadas para uma linhagem particular e σ é seu desvio padrão). Apenas as comparações em que as duas contagens de leitura médias das análises de RNA-Seq somadas para > 2,00 foram retidas.
[0315] Os genes que preencheram esses critérios e que se enquadram nas categorias de GO listadas na TABELA 16 são mostrados na TABELA 19. Na TABELA 19, apenas comparações nas quais a diferença de dobra entre as duas linhagens comparadas excede 1,5 são incluídas. TABELA 19. Genes Glycine max expressos diferencialmente a partir da superfamília do inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase de sementes em maturação e desenvolvimento de CCP1 + linhagens nulas versus a linhagem de controle de tipo selvagem* Locus Glycine Proteína ID Locus A. Descrição Dobra Dobra Dobra max thaliana de A. F1/D P/L K/H thaliana LOC100802068 XP_003556 AT3G55140 Pectato liase 0,53
544.1 (SEQ ID NO: 171) LOC100814679 XP_003523 AT5G63180 Pectato liase 0,35 0,63
121.1 (SEQ provável 22 ID NO: 180) LOC100101868 XP_003549 AT5G63180 Pectato liase
832.1 (SEQ provável 22 ID NO: 181) LOC100799009 XP_014618 AT3G55140 Pectato liase 1,97
078.1 (SEQ ID NO: 182) LOC100801813 XP_003534 AT4G33220 Inibidor de 3,65 1,63
983.1 (SEQ pectineste- ID NO: 183) rase/ pectineste- rase provável 44 LOC100784642 XP_003547 AT1G53840 Pectines- 3,25
912.1 (SEQ terase 1 ID NO: 184) LOC100808236 XP_006578 AT5G53370 Inibidor de 2,83
909.1 (SEQ pectines- ID NO: 165) terase/ pectines- terase provável 61 LOC106796002 XP_014622 AT5G53370 Inibidor de 2,74 1,99
597.1 (SEQ pectines- ID NO: 185) terase/ pectines- terase provável 61 LOC100776222 XP_003527 AT1G41830 Similar a 2,33
461.1 SKU 6 (SEQ ID NO: 175) LOC100776752 XP_003526 AT5G53370 Inibidor de 2,23 1,66
711.1 pectines- (SEQ ID terase/ NO: 153) pectines- terase provável 61 LOC100777500 XP_003546 AT4G33220 Inibidor de 1,92
532.1 pectines- (SEQ ID terase/ NO: 174) pectines- terase provável 44
LOC100789567 XP_003527 AT1G53840 Pectines- 1,87 1,88
069.1 (SEQ terase 1 ID NO: 176) LOC102666380 XP_006593 AT2G26440 Inibidor de 0,41
974.1 (SEQ pectines- ID NO: 186) terase/ pectines- terase provável 12 LOC100819675 XP_003524 AT5G09760 Inibidor de 1,52
299.2 (SEQ pectines- ID NO: 164) terase/ pectines- terase provável 51 LOC100815836 XP_006573 AT1G11580 Inibidor de 0,43
891.1 (SEQ pectines- ID NO: 187) terase/ pectines- terase 18 LOC100777646 XP_003528 AT3G14310 Inibidor de 1,89
739.1 pectines- (SEQ ID terase/ NO: 156) pectines- terase 3 LOC100791264 XP_003521 AT3G62820 Proteína da 0,51
571.1 (SEQ superfamília ID NO: 188) do inibidor de invertase de plantas/ pectina metilesterase LOC100797734 XP_003533 AT2G01610 Inibidor de 1,70
952.1 (SEQ pectines- ID NO: 189) terase 7 LOC100776636 XP_003517 AT1G62770 Inibidor de 0,55
432.1 pectines- (SEQ ID terase 9 NO: 149) LOC100795394 XP_003529 AT1G47960 Inibidor 1,64
510.2 (SEQ vacuolar/ ID NO: 190) parede celular de fructosidase 1 LOC100776478 XM_006587 AT5G45280 Pectina 6,49
593.3 (SEQ acetileste- ID NO: 178) rase 11 LOC100788448 XP_006604 AT3G62060 Pectina 1,59
776.1 (SEQ acetileste- ID NO: 191) rase 6 LOC100780171 XP_014623 AT4G19420 Pectina 0,12
997.1 (SEQ acetileste- ID NO: 192) rase 8 *As linhagens são identificadas na TABELA 15. Não houve alterações de dobra significativas nas linhagens nulas para os genes na TABELA 19 e, portanto, as linhagens nulas não são mostradas na TABELA 19.
[0316] A ferramenta de alinhamento de múltiplas sequências Clustal Omega foi usada para criar árvores filogenéticas (cladogramas) com as sequências de soja listadas na TABELA 19 e o gene de ISY de 168 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) para as sementes em maturação de linhagens transformadas com pMBXO74 (Linhagem homozigótica 35S-CCP1) em comparação com o controle de tipo selvagem Westag (comparação de F1/D na TABELA 19, FIG. 31), sementes em maturação de linhagens transformadas com pMBXO75 (promotor de oleosina - linhagem homozigótica CCP1) em comparação com Westag (comparação de P/L na TABELA 19, FIG. 32), e sementes em desenvolvimento de linhagens transformadas com pMBXO75 (promotor de oleosina - linhagem homozigótica CCP1) em comparação com Westag (comparação de K/H na TABELA 19, FIG. 33). Nas FIGURAS 31-33, genes diferencialmente expressos em CCP1 + linhagens de soja com expressão regulada positivamente maior que 100 vezes, bem como, todos os genes regulados negativamente são rotulados.
[0317] Para a semente em maturação de linhagens transformadas com pMBXO74 (comparação de F1/D na TABELA 19, FIG. 31), a árvore filogenética e alinhamentos de sequência subsequentes de proteínas codificadas pelos genes diferencialmente expressos com a proteína de ISY Camelina foram usados para encontrar os genes mais similares a ISY. XP_014622597.1 (SEQ ID NO: 185, um inibidor de pectinesterase/pectinesterase provável 61) e XP_003527069.1 (SEQ ID NO: 176, uma pectinesterase 1) foram as proteínas correspondentes mais próximas na árvore filogenética. Curiosamente, o gene que codifica XP_003527069.1 (SEQ ID NO: 176) foi encontrado para ser diferencialmente expresso em ambas as folhas (TABELA 18, comparação de C1/A, regulado negativamente) e tecido de semente em maturação (TABELA 19, comparação de F1/D, regulado positivamente) de linhagens transformadas com pMBXO74.
[0318] Para a semente em maturação de linhagens transformadas com pMBXO75 (comparação de P/L na TABELA 19, FIG. 32), a árvore filogenética e alinhamentos de sequência subsequentes de proteínas codificadas pelos genes diferencialmente expressos com a proteína de ISY Camelina foram usados para encontrar os genes mais similares a ISY. As proteínas XP_003523121.1 (SEQ ID NO: 180, um pectato liase provável) e XP_003521571.1 (SEQ ID NO: 188, uma proteína da superfamília do inibidor de invertase de plantas/pectina metilesterase) foram identificadas, ambas são codificadas por genes regulados negativamente nas linhagens transformadas de pMBXO75. Curiosamente, o gene que codifica XP_003523121.1 (SEQ ID NO: 180) também é regulado negativamente na semente em maturação de linhagens transformadas com pMBXO74 (comparação de F1/D na TABELA 19).
[0319] Para a semente em desenvolvimento de linhagens transformadas com pMBXO75 (comparação de K/H na TABELA 19, FIG. 33), a árvore filogenética e alinhamentos de sequência subsequentes de proteínas codificadas pelos genes diferencialmente expressos com a proteína de ISY Camelina foram usados para encontrar os genes mais similares a ISY. As proteínas XP_014618078.1 (SEQ ID NO: 182, um pectato liase), XP_003528739.1 (SEQ ID NO: 156, um inibidor de pectinesterase/pectinesterase 3) e XP_003526711.1 (SEQ ID NO: 153, um inibidor de pectinesterase provável/ pectinesterase 61) foram identificados.
[0320] Curiosamente, o gene que codifica XP_003528739.1 (SEQ ID NO: 156), também foi encontrado para ser regulado positivamente nas folhas colhidas de linhagenss transformadas com pMBXO74 em comparação com controles de tipo selvagem (comparação de C1/A, TABELA 18). O gene que codifica XP_003526711.1 (SEQ ID NO: 153) foi encontrado para ser regulado positivamente em ambas as sementes em maturação de linhagens transformadas com pMBXO74 (comparação de F1/D) e sementes em desenvolvimento de linhagens transformadas com pMBXO75 (comparação de K/H).
[0321] Genes expressos diferencialmente listados nas TABELAS 18 e 19 que estão presentes em várias amostras e/ou tipos de tecido podem ser particularmente interessantes como alvos para manipulação genética por meio de edição de genoma ou outros métodos. A TABELA 20 resume os genes Glycine max e suas proteínas codificadas que são expressos diferencialmente em amostras de RNA SEQ colhidas de mais de uma amostra ou tipo de tecido. Por exemplo, SEQ ID NO: 174, 176 e 178 são proteínas codificadas por genes diferencialmente expressos que são regulados negativamente em tecido foliar de linhagens transformadas com pMBXO74 em comparação com controles de tipo selvagem (comparação de C1/A), mas são regulados positivamente em tecido de semente madura (Comparação de F1/D). Isso pode ser indicativo de alguma mudança na partição de carbono entre as folhas e o tecido da semente. Assim, os alvos listados na TABELA 20 podem representar alvos preferidos para engenharia para aumentar o rendimento de sementes e/ou produtividade da planta. TABELA 20. Genes Glycine max expressos diferencialmente que aparecem em múltiplas amostras das TABELAS 18 e 19 Genes expressos diferencialmente em ambas folhas e sementes maduras de linhagens transformadas com pMBXO74 (comparações de C1/A e F1/D) Locus Glycine Proteína ID Locus A. Descri- Dobra Dobra Dobra Dobra max thaliana ção de A. C1/A F1/D P/L K/H thaliana LOC100802068 XP_0035565 AT3G55140 Pectato 0,61 0,53
44.1 (SEQ liase ID NO: 171)
LOC100808236 XP_0065789 AT5G53370 Inibidor de 38,78 2,83
09.1 (SEQ pectines- ID NO: 165) terase/ pectines- terase provável 61 LOC100776222 XP_0035274 AT1G41830 Similar a 2,55 2,33
61.1 SKU 6 (SEQ ID NO: 175) LOC100777500 XP_0035465 AT4G33220 Inibidor de 0,47 1,92
32.1 pectines- (SEQ ID NO: terase/ 174) pectines- terase provável 44 LOC100789567 XP_0035270 AT1G53840 Pectines- 0,51 1,87 1,88
69.1 (SEQ terase 1 ID NO: 176) LOC100776478 XM_006587 AT5G45280 Pectina 0,63 6,49
593.3 (SEQ acetiles- ID NO: 178) terase 11 Genes expressos diferencialmente em sementes maduras de linhagens transformadas com pMBXO74 e pMBXO75 (comparações de F1/D e P/L) Locus Glycine Proteína ID Locus A. Descri- Dobra Dobra Dobra Dobra max thaliana ção de A. C1/A F1/D P/L K/H thaliana LOC100814679 XP_0035231 AT5G63180 Pectato 0,35 0,63
21.1 (SEQ liase ID NO: 180) provável 22
LOC100801813 XP_0035349 AT4G33220 Inibidor de 3,65 1,63
83.1 (SEQ pectines- ID NO: 183) terase/ pectines- terase provável 44 Genes expressos diferencialmente em ambas folhas de linhagens transformadas com pMBXO74 (comparação de C1/A) e sementes em desenvolvimento de linhagens transformadas com pMBXO75 (comparação de K/H) Locus Glycine Proteína ID Locus A. Descri- Dobra Dobra Dobra Dobra max thaliana ção de A. C1/A F1/D P/L K/H thaliana LOC100789567 XP_0035270 AT1G53840 Pectines- 0,51 1,87 1,88
69.1 (SEQ terase 1 ID NO: 176) LOC100777646 XP_0035287 AT3G14310 Inibidor de 23,05 1,89
39.1 pectines- (SEQ ID NO: terase/ 156) pectines- terase 3 LOC100776636 XP_0035174 AT1G62770 Inibidor de 0,19 0,55
32.1 pectines- (SEQ ID NO: terase 9 149) Genes expressos diferencialmente em ambas as sementes maduras de linhagens transformadas com pMBXO74 (comparação de F1/D) e sementes em desenvolvimento de linhagens transformadas com pMBXO75 (comparação de K/H) Locus Glycine Proteína ID Locus A. Descri- Dobra Dobra Dobra Dobra max thaliana ção de A. C1/A F1/D P/L K/H thaliana
LOC106796002 XP_0146225 AT5G53370 Inibidor de 2,74 1,99
97.1 (SEQ pectines- ID NO: 185) terase/ pectines- terase provável 61 LOC100776752 XP_0035267 AT5G53370 Inibidor de 2,23 1,66
11.1 pectines- (SEQ ID NO: terase/ 153) pectines- terase provável 61 LOC100789567 XP_0035270 AT1G53840 Pectines- 0,51 1,87 1,88
69.1 (SEQ terase 1 ID NO: 176) Exemplo 16. Criação de linhagens de soja com genes superexpressos identificados nas TABELAS 17, 18, 19 e 20
[0322] As linhagens de soja podem ser modificadas para superexpressar os genes, ou combinações dos genes, identificados nas TABELAS 17, 18, 19 e 20 através da criação de um cassete de expressão com um promotor operacionalmente ligado ao gene de interesse operacionalmente ligado a uma sequência de terminação. Para a expressão constitutiva, um promotor tal como o promotor do vírus do mosaico da couve-flor (SEQ ID NO: 108) pode ser usado. Para a expressão principalmente em tecido verde, um promotor tal como o promotor cab5 de soja (TABELA 1, SEQ ID NO: 42) pode ser usado. Para a expressão específica da semente, um promotor tal como o promotor da oleosina de soja (TABELA 1, SEQ ID NO: 50) pode ser usado. A soja pode ser transformada com cassetes de expressão que superexpressam as sequências gênicas identificadas nas TABELAS 17, 18, 19 e 20 usando os procedimentos descritos no Exemplo 5. Alvos genéticos na TABELA 20, que foram encontrados para serem expressos diferencialmente em mais de uma amostra colhida ou tipo de tecido, podem ser alvos preferenciais para este exercício.
[0323] As linhagens de soja também podem ser modificadas para superexpressar os genes identificados nas TABELAS 17, 18, 19 e 20 usando uma estratégia de substituição de promotor com o sistema CRISPR/Cas. Neste sistema, o promotor nativo na frente de um gene é substituído por um promotor mais forte, ou um promotor com um padrão de expressão diferente, usando uma estratégia similar à descrita na FIG. 22 e Exemplo 11.
[0324] O sistema CRISPR/Cas também pode ser usado para inserir um novo cassete de expressão no genoma da planta contendo um promotor operacionalmente ligado a um gene identificado nas TABELAS 17, 18 e 19, operacionalmente ligado a uma sequência de terminação. Para este procedimento, um ou mais sgRNAs são usados com a enzima Cas para gerar uma quebra de filamento duplo. O novo cassete de expressão, flanqueado por sequências com homologia ao local de inserção do genoma da planta, é inserido usando o mecanismo de reparo direcionado por homologia da planta. Exemplo 17. Criação de linhagens de soja com atividade reduzida de genes identificados nas TABELAS 17, 18, 19 e 20
[0325] As linhagens de soja podem ser modificadas para expressão reduzida de um ou mais genes listados nas TABELAS 17, 18, 19 e 20 usando tecnologia de antissentido ou tecnologia de RNAi. Um método preferido é usar a edição de genoma, tal como a tecnologia de edição de genoma CRISPR/CAS.
[0326] Para reduzir a expressão de um gene de planta nativo, o sistema CRISPR/Cas pode ser usado para substituir o promotor nativo na frente de um gene por um promotor mais fraco usando uma estratégia similar à descrita na FIG. 22 e Exemplo 11. A expressão de pectinesterase (XP_003543834.1, SEQ ID NO: 145), o inibidor de parede celular/vacuolar de frutosidase 1 (NP_001237215.2, SEQ ID NO: 147 e NP_001235420.1, SEQ ID NO: 148), e/ou os genes do inibidor de pectinesterase (XP_003517432.1, SEQ ID NO: 149) podem ser reduzidos usando esta estratégia. Outros alvos úteis para regulação negativa ou deleção incluem XP_003556544.1 (SEQ ID NO: 171), XP_003523121.1 (SEQ ID NO: 180), XP_003546532.1 (SEQ ID NO: 174), XP_003527069.1 (SEQ ID NO: 176), XP_006593974.1 (SEQ ID NO: 186), XP_006573891.1 (SEQ ID NO: 187), XP_003521571.1 (SEQ ID NO: 188), XM_006587593.3 (SEQ ID NO: 178) e XP_014623997.1 (SEQ ID NO: 192).
[0327] Alternativamente, o sistema CRISPR/Cas pode ser usado para enfraquecer a força de um promotor, induzindo uma mutação em uma região importante do promotor e permitindo que ocorra a junção de extremidade não homóloga (NHEJ).
[0328] Alternativamente, a atividade de uma proteína pode ser reduzida ou eliminada pela remoção, inserção ou alteração de um ou mais pares de base na sequência de um gene. Isso pode ser alcançado projetando um sgRNA com sua sequência guia de ~20 pb visando a região do gene a ser modificada. Com a enzima CRISPR/Cas, o sgRNA pode ser usado para criar INDELs (inserção ou deleção de um pequeno número de bases). A nuclease Cas faz uma quebra de filamento duplo perto da ligação do sgRNA e a via de reparo de DNA propensa a erros, com junção de extremidade não homóloga, corrige a quebra criando uma mutação. Mutações fora da estrutura podem levar à eliminação da atividade da enzima. As mutações de inserção ou deleção na estrutura podem reduzir a atividade da proteína. As atividades de pectinesterase (XP_003543834.1, SEQ ID NO: 145), o inibidor de parede celular/vacuolar de frutosidase 1 (NP_001237215.2, SEQ ID NO: 147 e NP_001235420.1, SEQ ID NO: 148), e/ou os genes do inibidor de pectinesterase (XP_003517432.1, SEQ ID NO: 149) na TABELA 17 podem ser reduzidos ou eliminados usando esta estratégia. Outros alvos úteis para regulação negativa ou deleção incluem XP_003556544.1 (SEQ ID NO: 171), XP_003523121.1 (SEQ ID NO: 180), XP_003546532.1 (SEQ ID NO: 174), XP_003527069.1 (SEQ ID NO: 176), XP_006593974.1 (SEQ ID NO: 186), XP_006573891.1 (SEQ ID NO: 187), XP_003521571.1 (SEQ ID NO: 188), XM_006587593.3 (SEQ ID NO: 178) e XP_014623997.1 (SEQ ID NO: 192).
[0329] Os alvos genéticos na TABELA 20, expressos em mais de uma amostra ou tipo de tecido, podem ser alvos preferidos para este exercício. Exemplo 18. Identificação de genes regulados positivamente e negativamente em linhagens de colza que expressam o gene CCP1 usando sequenciamento de RNA
[0330] As linhagens de geração T4 de colza selecionadas que expressam o gene CCP1 (TABELA 21), produzidas conforme descrito no Exemplo 5, foram escolhidas para análises por sequenciamento de RNA. Essas linhagens foram cultivadas em campo em um local no Canadá durante a primavera/verão de 2017. A TABELA 21 mostra as linhagens que foram selecionadas para análises, o tipo de tecido coletado, e classifica as linhagens em grupos para fins de análises. As amostras foram colhidas no estágio indicado e rapidamente congeladas em nitrogênio líquido. As amostras foram armazenadas a -80ºC. O RNA foi extraído usando o kit de isolamento de RNA de plantas Agilent e enviado a um provedor de serviços contratado que realizou o sequenciamento de RNA e o processamento de dados. Genes expressos diferencialmente a partir destas análises são mostrados na TABELA 22. TABELA 21. Amostras de Brassica napus usadas nas análises de RNA-seq Grupo Tecido1 Linhagem Adição de CCP1 Rendimento de nitrogê- sementes nio2 aumentado em relação ao controle3 Q Folha Controle de tipo 150% - - selvagem BN00 R Folha MW82 (pMBXO58, 35S- 150% + 13,1%* CCP1 homozigoto) S Síliqua Controle de tipo 150% - - selvagem BN00 T Síliqua MW82 (pMBXO58, 35S- 150% + 13,1%* CCP1 homozigoto) U Folha Controle de tipo 50% - - selvagem BN00 W Folha MW82 (pMBXO58, 35S- 50% + 8,7%* CCP1 homozigoto) X Síliqua Controle de tipo 50% - - selvagem BN00 Y Síliqua MW82 (pMBXO58, 35S- 50% + 8,7%* CCP1 homozigoto) 1 Os estágios do tecido colhido são os seguintes: folha, folha recém-expandida de plantas de colza com 39 dias de idade; Síliqua, desenvolvendo Síliqua coletado 15 dias após a floração; 2 50% ou 150% do nitrogênio necessário para fornecer um rendimento de colza de 40 alqueires por acre. Fertilizante AGROTAIN (R) usado. 3Estatisticamente significativo, P < 0,1. O mapa de plasmídeo pMBXO58 é mostrado na FIG. 3.
[0331] A fim de analisar genes na mesma família que o gene de ISY
(Csa15g017550.1; SEQ ID NO: 6), os termos de GO listados na TABELA 16 foram investigados.
Os genes regulados positivamente e negativamente resultantes, juntamente com a comparação correspondente à mudança de dobra, são dados na TABELA 22. Apenas comparações em que a diferença de dobra entre as duas linhagens excede 1,5 estão incluídas.
TABELA 22. Genes de Brassica napus expressos diferencialmente a partir da superfamília do inibidor de invertase de plantas/inibidor de pectina metilesterase em CCP1 + linhagens versus tipo selvagem GO:0030570 atividade de pectato liase Locus B. napus Descrição Mudança de dobra* Folha Folha Síliqua Síliqua R/Q W/U T/S Y/X LOC106367786 pectato liase provável 12 3,2 LOC106361318 pectato liase provável 18 0,49 LOC106363861 pectato liase provável 1 2,9 LOC106452978 pectato liase provável 8 2,1 LOC106430113 pectato liase provável 9 1,7
GO:0030599 atividade de pectinesterase
Locus B. napus Descrição Mudança de dobra Folha Folha Síliqua Síliqua R/Q W/U T/S Y/X LOC111205093 pectinesterase provável 29 0,41
GO:0046910 atividade do inibidor de pectinesterase
Locus B. napus Descrição Mudança de dobra Folha Folha Síliqua Síliqua R/Q W/U T/S Y/X LOC106447685 inibidor de pectinesterase/ 2,0 pectinesterase provável 34 LOC106371735 inibidor de pectinesterase/ 1,8 pectinesterase provável 64
LOC106416267 inibidor de pectinesterase/ 1,8 pectinesterase 18 LOC106412069 inibidor de pectinesterase/ 1,6 pectinesterase 18 LOC106434483 inibidor de pectinesterase/ 0,66 pectinesterase provável 16 LOC106347212 proteína da superfamília do inibidor 1,6 de invertase de plantas/pectina metilesterase LOC106392321 inibidor de pectinesterase 6 2,9 LOC106436652 inibidor de pectina metilesterase 1 1,7 LOC106450421 inibidor de pectinesterase 6 0,51 LOC111205564 inibidor de pectinesterase 6 0,48 LOC106397464 inibidor de pectinesterase 10 1,5 GO:0052793 atividade de pectina acetilesterase Locus B. napus Descrição Mudança de dobra Folha Folha Síliqua Síliqua R/Q W/U T/S Y/X LOC106368499 pectina acetilesterase 6 0,67 LOC106450464 pectina acetilesterase 3 1,8 LOC106450462 pectina acetilesterase 3 1,6 LOC106377080 pectina acetilesterase 7 1,6 *Grupos descritos na TABELA 21.
[0332] Uma filtragem alternativa dos genes foi realizada para ver se algum novo gene apareceu. Neste caso, o teste de Tukey não foi usado para filtrar os dados, mas sim todas as comparações para as quais σ/μ < 0,75 para ambas as linhagens foram retidas, onde μ é o valor médio das leituras normalizadas para uma linhagem particular e σ é o seu desvio padrão. Os genes regulados positivamente e negativamente obtidos com este método de filtragem, junto com a comparação correspondente à mudança de dobra, são dados na TABELA 23. Apenas as comparações em que a diferença de dobra entre as duas linhagens excede 2,0 são incluídas. TABELA 23. Genes de Brassica napus expressos diferencialmente das categorias de GO na TABELA 16 em CCP1 + linhagens versus tipo selvagem GO:0030570 atividade de pectato liase
Locus B. napus Descrição Mudança de dobra* R/Q W/U T/S Y/X LOC106367786 pectato liase provável 12 3,2 -- -- -- LOC106422643 pectato liase provável 22 3,2 -- -- -- LOC106363861 pectato liase provável 1 2,9 -- -- -- LOC106409544 pectato liase provável 5 2,5 -- -- -- LOC106419852 pectato liase provável 1, variante 2,3 -- -- -- transcrita X1 LOC106436935 pectato liase provável 18 2,2 -- -- -- LOC106381139 pectato liase provável 5 2,2 -- -- -- LOC106370994 pectato liase provável 1 2,1 -- -- -- LOC106361318 pectato liase provável 18 0,50 -- -- -- LOC106352880 pectato liase provável 13 -- 2,4 -- -- LOC106452978 pectato liase provável 8 -- -- 2,1 -- LOC111208330 pectato liase provável 18 -- -- 2,1 --
GO:0030599 atividade de pectinesterase
Locus B. napus Descrição Mudança de dobra R/Q W/U T/S Y/X LOC106447685 inibidor de pectinesterase/ 2,0 -- -- -- pectinesterase provável 34 LOC106365512 inibidor de pectinesterase/ 0,43 -- -- -- pectinesterase provável 41 LOC111205093 pectinesterase provável 29 -- -- -- 0,41
GO:0046910 atividade do inibidor de pectinesterase
Locus B. napus Descrição Mudança de dobra R/Q W/U T/S Y/X LOC106392321 inibidor de pectinesterase tipo 6 2,9 -- -- -- LOC106365512 inibidor de pectinesterase/ 0,43 -- -- -- pectinesterase provável 41
GO:0052793 atividade de pectina acetilesterase Locus B. napus Descrição Mudança de dobra R/Q W/U T/S Y/X LOC106377080 pectina acetilesterase 7 2,1 -- -- -- LOC106416258 pectina acetilesterase tipo 6 2,1 -- -- -- LOC106450464 pectina acetilesterase tipo 3 -- 0,44 -- -- *Grupos descritos na TABELA 21. Exemplo 19. Identificação de genes regulados positivamente e negativamente em linhagens de Camelina sativa que expressam o gene CCP1 usando o sequenciamento de RNA
[0333] Linhagens de Camelina sativa homozigotas selecionadas que expressam o gene CCP1 (TABELA 24) foram escolhidas para análises por sequenciamento de RNA. Essas linhagens foram cultivadas em campo em um local no Canadá durante a primavera/verão de 2016. A TABELA 24 mostra as linhagens que foram selecionadas para análises, o tipo de tecido coletado, e classifica as linhagens em grupos para fins de análises. As amostras foram colhidas no estágio indicado e rapidamente congeladas em nitrogênio líquido. As amostras foram armazenadas a -80ºC. O RNA foi extraído de folhas recém- expandidas (33 dias após o plantio) e síliquas em desenvolvimento (15 dias após a floração) usando o kit de isolamento de RNA de plantas Agilent e enviado a um provedor de serviços contratado que realizou o sequenciamento de RNA e o processamento de dados. TABELA 24. Amostras de Camelina sativa usadas nas análises de RNA-seq Grupo Tecido* Linhagem CCP1 A Folha MI116 + B Folha WT43 ─ C Folha NJ01 + D Folha NJ02 + E Folha WTSU ─ F Síliqua MI116 + G Síliqua WT43 ─
H Síliqua NJ01 + I Síliqua NJ02 + J Síliqua WTSU ─ Folha, folhas recém-expandidas 33 dias após o plantio; Síliqua, síliquas colhidos 15 dias após a floração. WT43, abreviatura para cultivar Camelina sativa 10CS0043 que foi isolada em um programa de melhoramento em Agriculture and Agri-Food Canada (Malik et al., 2018, Plant Cell Reports, 37, 1367). MI116, linhagem obtida após transformação da cultivar Camelina WT43 com o plasmídeo pMBXO58 (FIG. 3). WTSU, abreviatura para cultivar Camelina sativa Suneson (Malik et al., 2018, Plant Cell Reports, 37, 1367). NJ01 e NJ02, linhagens obtidas após transformação de cultivar Camelina Suneson com o plasmídeo pMBXO58.
[0334] A fim de analisar genes na mesma família que o gene de ISY (Csa15g017550.1; SEQ ID NO: 6), os termos de GO listados na TABELA 16 foram investigados. O objetivo era pesquisar o genoma Camelina sativa em busca de genes regulados diferencialmente que pudessem ser associados a um ou mais desses termos de GO. Quase todos os genes nos dados de RNA-seq tiveram um melhor hit BLAST correspondente no genoma Arabidopsis thaliana, que é muito bem anotado em relação aos termos de GO associados. Portanto, para cada um dos termos de GO acima, uma lista de genes de Arabidopsis thaliana associados a cada termo de GO foi feita, em seguida, todos os genes dentro do genoma Camelina sativa que tinham um daqueles genes de Arabidopsis thaliana como seu melhor hit BLAST foram identificados. Entre esses genes de Camelina sativa, alguns foram regulados positivamente ou negativamente nas linhagens de CCP1 de maneira estatisticamente significativa; ou seja, um teste de Tukey sugeriu que a probabilidade era maior do que 90% de que as médias dos níveis de transcrição nas linhagens transgênicas versus de tipo selvagem fossem diferentes.
[0335] Os genes regulados positivamente e negativamente, juntamente com a comparação correspondente à mudança de dobra, são dados na TABELA 25. Apenas as comparações em que a diferença de dobra entre as duas linhagens excede 1,5 são incluídas. TABELA 25. Genes de Camelina sativa expressos diferencialmente das categorias de GO na TABELA 16 em CCP1 + linhagens versus tipo selvagem GO:0030570 atividade de pectato liase Descrição Mudança de dobra*
Locus C. sativa Folha Folha Folha Síliqua Síliqua Síliqua A/B C/E D/E F/G H/J I/J LOC104734443 pectato liase 0,55 LOC104747027 pectato liase 1,7 provável 10 LOC104701382 pectato liase 2,0 provável 5 LOC104717795 pectato liase 2,4 2,3 provável 18 LOC104722501 pectato liase 2,2 2,5 provável 18 LOC104726924 pectato liase 0,57 0,60 provável 22 LOC104726926 pectato liase 0,54 0,59 provável 22 LOC104762495 pectato liase 2,1 -- provável 1 LOC104754610 pectato liase 2,0 1,8 provável 1 LOC104738994 pectato liase 1,9 provável 1 LOC104762495 pectato liase 1,7 provável 1
GO:0030599 atividade de pectinesterase
Locus C. sativa Descrição Mudança de dobra Folha Folha Folha Síliqua Síliqua Síliqua A/B C/E D/E F/G H/J I/J LOC104758734 pectinesterase 2 0,31 LOC104735956 pectinesterase 0,66 provável 29 LOC104736702 pectinesterase 1,7 putativa 52 LOC104726108 pectinesterase 0,56 QRT1
LOC104732089 pectinesterase 0,53 0,66 QRT1 LOC104742103 pectinesterase 1,8 1,9 putativa LOC104777520 pectinesterase 1,7 1,7 putativa LOC104757890 pectinesterase 1,5 1,7 putativa LOC104736040 pectinesterase 1,6 provável 53 LOC104770344 pectinesterase 1,6 provável 53
GO:0046910 atividade do inibidor de pectinesterase
Locus C. sativa Descrição Mudança de dobra Folha Folha Folha Síliqua Síliqua Síliqua A/B C/E D/E F/G H/J I/J LOC104745251 inibidor de 1,5 pectinesterase/ pectinesterase provável 25 LOC104707868 inibidor de 2,7 pectinesterase/ pectinesterase provável 41 LOC104708142 inibidor de 1,5 pectinesterase/ pectinesterase provável 51 LOC104791148 inibidor de 1,7 pectinesterase/ pectinesterase provável 34
LOC104760099 inibidor de 2,7 2,8 pectinesterase/ pectinesterase provável 7 LOC104754377 inibidor de 2,5 2,1 pectinesterase/ pectinesterase provável 7 LOC104778832 inibidor de 0,66 pectinesterase/ pectinesterase provável 6 LOC104769166 inibidor de 1,7 pectinesterase/ pectinesterase provável 51 LOC104708141 inibidor de 1,5 pectinesterase/ pectinesterase provável 51 LOC104770309 inibidor de 1,8 pectinesterase/ pectinesterase 18 LOC104728508 proteína da 2,0 superfamília do inibidor de invertase de plantas/pectina metilesterase LOC109132214 proteína da 0,37 superfamília do inibidor de invertase de plantas/pectina metilesterase
LOC104765570 proteína da 0,36 superfamília do inibidor de invertase de plantas/pectina metilesterase LOC104749039 proteína da 2,0 superfamília do inibidor de invertase de plantas/pectina metilesterase LOC104699600 proteína da 1,6 superfamília do inibidor de invertase de plantas/pectina metilesterase LOC104788614 proteína da 1,6 superfamília do inibidor de invertase de plantas/pectina metilesterase LOC104715795 proteína da 2,1 superfamília do inibidor de invertase/pectina metilesterase LOC104779478 inibidor de invertase 1,7 de plantas/pectina metilesterase LOC104714617 inibidor de 0,11 0,080 pectinesterase 10 LOC104707529 inibidor de pectina 2,1 1,7 metilesterase 1 LOC104737245 inibidor de pectina 1,8 1,5 metilesterase 1 LOC104717621 inibidor de pectina 1,6 metilesterase 1
LOC104790946 inibidor de 2,1 metilesterase 11 LOC104711196 inibidor de 2,1 pectinesterase 11 LOC104730912 inibidor de 2,7 2,0 pectinesterase 4 LOC104778832 inibidor de 0,66 pectinesterase/ pectinesterase provável 6 LOC104756693 proteína da 2,1 2,1 superfamília do inibidor de invertase de plantas/pectina metilesterase LOC104776449 proteína da 1,7 1,6 superfamília do inibidor de invertase de plantas/pectina metilesterase LOC104756686 proteína da 1,7 superfamília do inibidor de invertase de plantas/pectina metilesterase LOC104741040 proteína da 1,9 superfamília do inibidor de invertase de plantas/pectina metilesterase LOC104745508 proteína da 0,65 superfamília do inibidor de invertase de plantas/pectina metilesterase
LOC104765054 proteína da 0,62 superfamília do inibidor de invertase de plantas/pectina metilesterase LOC104777086 proteína da 0,50 superfamília do inibidor de invertase de plantas/pectina metilesterase LOC104765554 proteína tipo CASP 1,7 GO:0052793 atividade de pectina acetilesterase Locus C. sativa Descrição Mudança de dobra Folha Folha Folha Síliqua Síliqua Síliqua A/B C/E D/E F/G H/J I/J LOC104704143 Pectina 0,64 acetilesterase 6 LOC104714970 Pectina 2,0 acetilesterase 3 LOC104723107 Pectina 1,7 1,7 acetilesterase 7 LOC109124411 Pectina 1,7 acetilesterase 11 *Grupos descritos na TABELA 24.
[0336] Uma filtragem alternativa dos genes foi realizada para ver se algum novo gene apareceu. Neste caso, o teste de Tukey não foi usado para filtrar os dados, mas sim todas as comparações para as quais σ/μ < 0,75 para ambas as linhagens foram retidas, onde μ é o valor médio das leituras normalizadas para uma linhagem particular e σ é o seu desvio padrão. Os genes regulados positivamente e negativamente obtidos com o método de filtragem alterado, juntamente com a comparação correspondente à mudança de dobra, são mostrados na TABELA 26. Apenas as comparações em que a diferença de dobra entre as duas linhagens excede 2,0 são incluídas. TABELA 26. Genes de Camelina sativa expressos diferencialmente a partir das categorias de GO na TABELA 16 em CCP1 + linhagens versus tipo selvagem GO:0030570 atividade de pectato liase
Locus C. sativa Descrição Mudança de dobra* Folha Folha Folha Síliqua Síliqua Síliqua A/B C/E D/E F/G H/J I/J LOC104717795 pectato liase provável -- -- -- -- 2,4 2,3 18 LOC104722501 pectato liase provável -- -- -- -- 2,2 2,5 18 LOC104762495 pectato liase provável 1 -- -- -- -- 2,1 -- LOC104754610 pectato liase provável 1 -- -- -- -- 2,0 -- LOC104730966 pectato liase provável -- -- -- -- -- 2,3 18
GO:0030599 atividade de pectinesterase
Locus C. sativa Descrição Mudança de dobra Folha Folha Folha Síliqua Síliqua Síliqua A/B C/E D/E F/G H/J I/J LOC104781810 inibidor de -- -- -- -- 2,4 -- pectinesterase/ pectinesterase provável 35 LOC104769165 inibidor de -- -- -- -- 2,3 2,1 pectinesterase/ pectinesterase provável 51 LOC104782819 inibidor de -- -- -- -- 2,3 -- pectinesterase/ pectinesterase provável 16 LOC104779154 inibidor de -- -- -- -- 2,2 -- pectinesterase/ pectinesterase 3
LOC104780230 inibidor de -- -- -- -- 2,1 -- pectinesterase/ pectinesterase provável 32 LOC104788138 inibidor de -- -- -- -- 2,1 -- pectinesterase/ pectinesterase provável 35 LOC104728462 inibidor de -- -- -- -- 2,1 -- pectinesterase/ pectinesterase provável 61 LOC104699225 inibidor de -- -- -- -- 2,1 -- pectinesterase/ pectinesterase provável 35 LOC104709803 probable -- -- -- -- 2,1 3,4 pectinesterase/ pectinesterase inhibitor 39
GO:0046910 atividade do inibidor de pectinesterase
Locus C. sativa Descrição Mudança de dobra Folha Folha Folha Síliqua Síliqua Síliqua A/B C/E D/E F/G H/J I/J LOC104783356 proteína tipo 21 kDa -- -- -- 3,0 -- -- LOC104730912 proteína tipo 21 kDa -- -- -- -- 2,7 -- LOC104780536 proteína tipo 21 kDa -- -- -- -- 2,5 -- LOC104781810 inibidor de -- -- -- -- 2,4 -- pectinesterase/ pectinesterase provável 35
LOC104782819 inibidor de -- -- -- -- 2,3 -- pectinesterase/ pectinesterase provável 16 LOC104703885 proteína tipo 21 kDa -- -- -- -- 2,3 -- LOC104779154 inibidor de -- -- -- -- 2,2 -- pectinesterase/ pectinesterase 3 LOC104790946 proteína tipo 21 kDa -- -- -- -- 2,1 -- LOC104756693 proteína tipo 21 kDa -- -- -- -- 2,1 -- LOC104707529 proteína 21 kDa -- -- -- -- 2,1 -- LOC104788138 inibidor de -- -- -- -- 2,1 -- pectinesterase/ pectinesterase provável 35 LOC104711196 proteína tipo 21 kDa -- -- -- -- 2,1 -- LOC104728462 inibidor de -- -- -- -- 2,1 -- pectinesterase/ pectinesterase provável 61 LOC104699225 inibidor de -- -- -- -- 2,1 -- pectinesterase/ pectinesterase provável 35 LOC104709803 inibidor de -- -- -- -- -- 3,4 pectinesterase/ pectinesterase provável 39 LOC104777086 LOC104777086 não -- -- -- -- -- 0,50 caracterizado LOC104714617 proteína tipo 21 kDa -- -- -- -- -- 0,08 *Grupos descritos na TABELA 24. Exemplo 20. Plantas terrestres geneticamente modificadas que expressam os genes identificados nas TABELAS 17, 18, 19, 20, 22, 23, 25 e 26
[0337] Os resultados descritos nos Exemplos 15, 18 e 19 e os genes identificados nas TABELAS 17, 18, 19, 20, 22, 23, 25 e 26 validam o uso de expressão constitutiva e específica de semente do transportador mitocondrial codificado pelo gene de algas CCP1 em soja, colza e Camelina sativa para a identificação de alvos genéticos que regulam o metabolismo do açúcar nas plantas. Os resultados revelam novos genes que, após a expressão de CCP1, são regulados positivamente ou regulados negativamente. Por analogia com o gene de ISY, acredita-se que a regulação positiva ou negativa dos novos genes, com ou sem a expressão de gene CCP1 da alga, pode potencialmente resultar em um aumento na ramificação, rendimento de sementes e, em algumas plantas, um aumento no tamanho médio das sementes individuais também. A regulação positiva pode ser alcançada pela inserção de um cassete de expressão com um promotor operacionalmente ligado ao gene de interesse seguido por uma sequência de terminação apropriada. A regulação positiva da expressão de gene ou o padrão de expressão de gene também pode ser alcançado usando a estratégia de substituição do promotor com o sistema CRISPR similar ao descrito na FIG. 22 e Exemplo 11. A regulação negativa pode ser alcançada usando a estratégia de substituição do promotor escolhendo um promotor mais fraco ou usando CRISPR para deletar nucleotídeos para remover aminoácidos, ou para deletar ou inserir nucleotídeos para alcançar uma mutação de deslocamento de estrutura.
[0338] Dados os resultados obtidos com a versão truncada do gene de ISY de Camelina, também é possível que a expressão de versões truncadas N-terminais dos genes nas TABELAS 17, 18, 19, 20, 22, 23, 25, e 26 pode resultar em um aumento na ramificação, rendimento de sementes e, em algumas plantas, um aumento no tamanho médio de sementes individuais também. Plantas terrestres geneticamente modificadas adicionais para expressar os alvos genéticos identificados na soja
[0339] Considerando os alvos genéticos identificados na soja em particular, uma planta terrestre geneticamente modificada que compreende um gene modificado para uma proteína identificada nas TABELAS 17, 18, 19 e 20 é revelada. A proteína compreende uma ou mais das SEQ ID NOS: 141-192. O gene modificado compreende (i) um promotor e (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína. O promotor não é cognato em relação à sequência de ácido nucleico que codifica a proteína. O gene modificado é configurado de modo que transcrição da sequência de ácido nucleico seja iniciada a partir do promotor e resulte em expressão da proteína.
[0340] Em alguns exemplos, a proteína é heteróloga em relação à planta terrestre geneticamente modificada. Em alguns exemplos, a proteína é homóloga em relação à planta terrestre geneticamente modificada.
[0341] Em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada exibe expressão aumentada da proteína em comparação com uma planta terrestre de referência que não inclui o gene modificado. Em alguns destes exemplos, a expressão aumentada da proteína pode estar em um ou mais tecidos da planta terrestre geneticamente modificada, por exemplo, no tecido da folha e/ou no tecido da semente madura. Também em alguns desses exemplos, a proteína compreende uma ou mais das SEQ ID NOS: 141, 142, 143, 144, 146, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 172, 173, 175, 177, 182, 183, 184, 185, 189, 190 ou
191.
[0342] Em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada exibe diminuição da expressão da proteína em comparação com uma planta terrestre de referência que não inclui o gene modificado. Em alguns destes exemplos, a diminuição da expressão da proteína pode ser em um ou mais tecidos da planta terrestre geneticamente modificada, por exemplo, no tecido da folha e/ou no tecido da semente madura. Também em alguns destes exemplos, a proteína compreende uma ou mais das SEQ ID NOS: 145, 147, 148, 149, 171, 179, 180, 186, 187, 188 ou 192.
[0343] Em alguns exemplos, a planta terrestre geneticamente modificada exibe expressão aumentada e diminuição da expressão da proteína em comparação com uma planta terrestre de referência que não inclui o gene modificado. Em alguns destes exemplos, a expressão aumentada da proteína pode estar em um ou mais tecidos da planta terrestre geneticamente modificada, por exemplo, em tecido de semente madura, e a diminuição da expressão da proteína pode ser em um ou mais outros tecidos da planta terrestre geneticamente modificada, por exemplo, no tecido foliar. Também em alguns destes exemplos, a proteína compreende uma ou mais das SEQ ID NOS: 174, 176 ou 178. Plantas de soja geneticamente modificadas adicionais
[0344] Considerando ainda os alvos genéticos identificados na soja,
uma planta de soja geneticamente modificada que compreende um gene modificado para uma proteína identificada nas TABELAS 17, 18, 19 e 20 também é revelada. A proteína compreende uma ou mais das SEQ ID NOS: 141-192. O gene modificado compreende (i) um promotor e (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína. O gene modificado é configurado de modo que transcrição da sequência de ácido nucleico seja iniciada a partir do promotor e resulte em uma diferença na expressão da proteína em comparação com uma planta de soja de referência que não inclui o gene modificado.
[0345] Em alguns exemplos, a diferença na expressão é um aumento na expressão. Em alguns destes exemplos, o aumento na expressão pode ser em um ou mais tecidos da planta de soja geneticamente modificada, por exemplo, no tecido da folha e/ou no tecido da semente madura. Também em alguns desses exemplos, a proteína compreende uma ou mais das SEQ ID NOS: 141, 142, 143, 144, 146, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 172, 173, 175, 177, 182, 183, 184, 185, 189, 190 ou 191.
[0346] Em alguns exemplos, a diferença na expressão é uma diminuição na expressão. Em alguns destes exemplos, a diminuição na expressão pode ser em um ou mais tecidos da planta de soja geneticamente modificada, por exemplo, no tecido da folha e/ou no tecido da semente madura. Também em alguns destes exemplos, a proteína compreende uma ou mais das SEQ ID NOS: 145, 147, 148, 149, 171, 179, 180, 186, 187, 188 ou 192.
[0347] Em alguns exemplos, a diferença na expressão é tanto um aumento na expressão quanto uma diminuição na expressão. Em alguns destes exemplos, o aumento na expressão pode ser em um ou mais tecidos da planta de soja geneticamente modificada, por exemplo, em tecido de semente madura, e a diminuição na expressão pode ser em um ou mais outros tecidos da planta de soja geneticamente modificada, por exemplo, no tecido foliar. Também em alguns destes exemplos, a proteína compreende uma ou mais das SEQ ID NOS: 174, 176 ou 178.
[0348] Em alguns exemplos, a proteína compreende duas ou mais das SEQ ID NOS: 141-192, por exemplo dois, três, quatro, cinco ou mais de SEQ ID NOS: 141-192. Em alguns desses exemplos, a proteína compreende pelo menos uma das SEQ ID NOS: 141, 142, 143, 144, 146, 150, 151, 152, 153, 154,
155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 172, 173, 175, 177, 182, 183, 184, 185, 189, 190 ou 191 com expressão aumentada. Em alguns desses exemplos, a proteína compreende pelo menos uma das SEQ ID NOS: 145, 147, 148, 149, 171, 179, 180, 186, 187, 188 ou 192 com diminuição da expressão. Em alguns destes exemplos, a proteína compreende pelo menos uma das SEQ ID NOS: 174, 176 ou 178 com expressão aumentada e expressão diminuída. Em alguns destes exemplos, a proteína compreende uma combinação de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 141, 142, 143, 144, 146, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 172, 173, 175, 177, 182, 183, 184, 185, 189, 190 ou 191 com expressão aumentada, e pelo menos, uma das SEQ ID NOS: 145, 147, 148, 149, 171, 179, 180, 186, 187, 188 ou 192 com diminuição da expressão e, opcionalmente, também pelo menos uma das SEQ ID NOS: 174, 176 ou 178 com expressão aumentada e expressão diminuída.
[0349] A invenção foi descrita com referência aos exemplos de modalidades descritos acima. Modificações e alterações ocorrerão a terceiros após a leitura e compreensão deste relatório descritivo. Exemplos de modalidades que incorporam um ou mais aspectos da invenção são destinados a incluir todas essas modificações e alterações na medida em que estejam dentro do escopo das reivindicações anexas. REFERÊNCIA A UMA "LISTAGEM DE SEQUÊNCIA", UMA
TABELA OU APÊNDICE DE LISTAGEM DE PROGRAMA DE COMPUTADOR ENVIADO COMO UM ARQUIVO DE TEXTO ASCII
[0350] O material no arquivo de texto ASCII, denominado "YTEN- 59704WO-Sequences_ST25.txt", criado em 3 de Setembro de 2019, tamanho de arquivo de 577.536 bytes, é aqui incorporado por referência.

Claims (48)

REIVINDICAÇÕES
1. Planta terrestre geneticamente modificada que expressa uma proteína que tem homologia a um inibidor de invertase de plantas e/ou a um inibidor de pectina metilesterase e que aumenta o rendimento de sementes com expressão aumentada ("uma proteína de ISY"), a planta terrestre geneticamente modificada compreendendo um gene modificado para a proteína de ISY, CARACTERIZADA pelo fato de que: a proteína de ISY compreende um ou mais dentre (i) uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; (ii) um fragmento de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; (iii) um homólogo de Camelina sativa de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; ou (iv) um ortólogo de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; o gene modificado compreende (i) um promotor e (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de ISY; o promotor não é cognato em relação à sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de ISY; e o gene modificado é configurado de modo que transcrição da sequência de ácido nucleico seja iniciada a partir do promotor e resulte em expressão da proteína de ISY.
2. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de ISY compreende a proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO:
2.
3. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2 corresponde a uma ou mais dentre proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 2, proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5, proteína de ISY modificada de Camelina sativa de SEQ ID NO: 138, ou proteína de ISY modificada de Camelina sativa de SEQ ID NO: 140.
4. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de ISY compreende o fragmento de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2.
5. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que o fragmento corresponde a 114 a 133 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2.
6. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de ISY compreende o homólogo de Camelina sativa de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2.
7. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que o homólogo de Camelina sativa corresponde a uma ou mais proteínas de Camelina sativa de SEQ ID NOS: 21 a 40.
8. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de ISY compreende o ortólogo de uma proteína de ISY de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2.
9. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o ortólogo corresponde a uma ou mais (i) proteínas de colza de SEQ ID NOS: 69, 71, 73 e/ou 75; (ii) proteínas de soja de SEQ ID NOS: 89, 91, 93 e/ou 95; ou (iii) proteínas de milho de SEQ ID NOS: 99, 101, 103, 105 e/ou 107.
10. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de ISY compreende (i) (a) um resíduo de cisteína na posição 40, (b) um resíduo de leucina na posição 59, (c) um resíduo de cisteína na posição 98, e (d) um resíduo de cisteína na posição 138, com numeração de posições em relação à proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5, e (ii) uma identidade geral de pelo menos 10% com proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 2.
11. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de ISY compreende adicionalmente apenas entre 1 a 14 resíduos de aminoácidos N- terminais para o resíduo de cisteína na posição 40, com numeração de posições em relação à proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5.
12. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de ISY carece de um peptídeo de sinal N-terminal.
13. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de ISY carece de um motif de PKF.
14. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de ISY compreende (i) (a) um resíduo de cisteína na posição 25, (b) um resíduo de cisteína na posição 40, (c) um resíduo de leucina na posição 59, (d) um resíduo de cisteína na posição 98, e (e) um resíduo de cisteína na posição 138, com numeração de posições em relação à proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5, e (ii) uma identidade geral de pelo menos 10% com proteína de ISY de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5.
15. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de ISY carece de um motif de PKF.
16. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de ISY é heteróloga em relação à planta terrestre geneticamente modificada.
17. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de ISY é homóloga em relação à planta terrestre geneticamente modificada.
18. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o promotor é um promotor constitutivo.
19. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o promotor é um promotor específico de semente.
20. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene modificado é integrado ao DNA genômico da planta terrestre geneticamente modificada.
21. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene modificado é expresso de forma estável na planta terrestre geneticamente modificada.
22. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta terrestre geneticamente modificada exibe expressão aumentada da proteína de ISY em comparação com uma planta terrestre de referência que não inclui o gene modificado.
23. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta terrestre geneticamente modificada exibe rendimento de sementes, rendimento de fruto, e/ou rendimento de tubérculo aumentado em comparação com uma planta terrestre de referência que não inclui o gene modificado.
24. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta C3.
25. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta C4.
26. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta de cultura alimentícia selecionada a partir do grupo que consiste em milho, trigo, aveia, cevada, soja, painço, sorgo, batata, beterraba sacarina, pulse, grão de bico, ervilha verde, ervilha amarela, lentilha, feijão, tomate, e arroz.
27. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta de cultura oleaginosa selecionada a partir do grupo que consiste em camelina, espécies de Brassica (por exemplo, B. napus (colza), B. rapa, B. juncea e B. carinata), crambe, soja, girassol, cártamo, óleo de palma, linho, e algodão.
28. Planta terrestre geneticamente modificada que expressa um RNA que aumenta o rendimento de sementes com expressão aumentada ("um ISY RNA"), a planta terrestre geneticamente modificada compreendendo um gene modificado para o ISY RNA, CARACTERIZADA pelo fato de que: o ISY RNA compreende uma sequência contígua de códons que codificam uma proteína que tem homologia a um inibidor de invertase de plantas e/ou a um inibidor de pectina metilesterase ("uma proteína codificada"); a proteína codificada compreende um ou mais dentre (i) uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; (ii) um fragmento de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; (iii) um homólogo de Camelina sativa de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; ou (iv) um ortólogo de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2; o gene modificado compreende (i) um promotor e (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica o ISY RNA; o promotor não é cognato em relação à sequência de ácido nucleico que codifica o ISY RNA; e o gene modificado é configurado de modo que transcrição da sequência de ácido nucleico seja iniciada a partir do promotor e resulte em expressão do ISY RNA.
29. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína codificada compreende a proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2.
30. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína codificada compreende o fragmento de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2, e, adicionalmente, em que o fragmento corresponde a 114 a 133 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2.
31. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína codificada compreende o homólogo de Camelina sativa de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2, e, adicionalmente, em que o homólogo de Camelina sativa corresponde a uma ou mais proteínas de Camelina sativa de SEQ ID NOS: 21 a 40.
32. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína codificada compreende o ortólogo de uma proteína de Camelina sativa compreendendo SEQ ID NO: 2, e, adicionalmente, em que o ortólogo corresponde a uma ou mais (i) proteínas de colza de SEQ ID NOS: 69, 71, 73 e/ou 75; (ii) proteínas de soja de SEQ ID NOS: 89, 91, 93 e/ou 95; ou (iii) proteínas de milho de SEQ ID NOS:
99, 101, 103, 105 e/ou 107.
33. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína codificada compreende (i) (a) um resíduo de cisteína na posição 40, (b) um resíduo de leucina na posição 59, (c) um resíduo de cisteína na posição 98, e (d) um resíduo de cisteína na posição 138, com numeração de posições em relação à proteína de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5, e (ii) uma identidade geral de pelo menos 10% com a proteína de Camelina sativa de SEQ ID NO: 2.
34. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína codificada compreende (i) (a) um resíduo de cisteína na posição 25, (b) um resíduo de cisteína na posição 40, (c) um resíduo de leucina na posição 59, (d) um resíduo de cisteína na posição 98, e (e) um resíduo de cisteína na posição 138, com numeração de posições em relação à proteína de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5, e (ii) uma identidade geral de pelo menos 10% com a proteína de Camelina sativa de SEQ ID NO: 5.
35. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína codificada é heteróloga em relação à planta terrestre geneticamente modificada.
36. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína codificada é homóloga em relação à planta terrestre geneticamente modificada.
37. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que o promotor é um promotor constitutivo.
38. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que o promotor é um promotor específico de semente.
39. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene modificado é integrado ao DNA genômico da planta terrestre geneticamente modificada.
40. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene modificado é expresso de forma estável na planta terrestre geneticamente modificada.
41. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta terrestre geneticamente modificada exibe expressão aumentada do ISY RNA em comparação com uma planta terrestre de referência que não inclui o gene modificado.
42. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta terrestre geneticamente modificada exibe rendimento de sementes, rendimento de fruto, e/ou rendimento de tubérculo aumentado em comparação com uma planta terrestre de referência que não inclui o gene modificado.
43. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta de cultura alimentícia selecionada a partir do grupo que consiste em milho, trigo, aveia, cevada, soja, painço, sorgo, batata, beterraba sacarina, pulse, grão de bico, ervilha verde, ervilha amarela, lentilha, feijão, tomate e arroz.
44. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta terrestre geneticamente modificada é uma planta de cultura oleaginosa selecionada a partir do grupo que consiste em camelina, espécies de Brassica (por exemplo, B. napus (colza), B. rapa, B. juncea e B. carinata), crambe, soja, girassol, cártamo, óleo de palma, linho, e algodão.
45. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a sequência de ácido nucleico que codifica o ISY RNA é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1.
46. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a sequência de ácido nucleico que codifica o ISY RNA compreende SEQ ID NO: 1.
47. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a expressão do ISY RNA resulta em expressão da proteína codificada.
48. Planta terrestre geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a expressão do ISY RNA não resulta em expressão da proteína codificada.
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