CN114807128B - 一种lncRNA-BTRL及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种lncRNA‑BTRL及其应用。所述lncRNA‑BTRL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明采用SEQ ID NO.2‑5的PCR引物序列扩增得到一种新的调控分蘖的IncRNA，通过提高作物中该lncRNA‑BTRL的表达可以有效提高作物的分蘖数，进而提高作物的产量。本发明提供的lncRNA‑BTRL在作物高产育种领域具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种lncRNA-BTRL及其应用。
背景技术
lncRNA是基因组中长度大于200bp的长链非编码RNA，主要由RNA聚合酶II转录而来并且经过多聚腺苷酸化、剪接等加工过程。根据其在基因组的位置，lncRNA可分为senselncRNA(正义lncRNA)、antisense lncRNA(反义lncRNA)、intronic lncRNAs(基因内lncRNA)和intergenic lncRNA(基因间区lncRNA)。lncRNA具有时间、组织特异性和相对低表达特性，可作为蛋白支架、诱饵、向导和增强子等，促进或抑制基因表达，是植物中一种非常重要的转录后调控机制。随着RNA-seq技术和生物信息学鉴定手段的完善，lncRNA在作物分蘖、春化、株高、抗病、抗逆等多种生命活动中的调控作用也逐步被揭示。
分蘖与作物产量水平显著相关，且具有较大的遗传力。生长素、独脚金内酯等植物激素，MOC1、TAD1、OsTB1等蛋白编码基因均可直接调控分蘖，进而影响产量水平。转录后调控层面，水稻lncRNA-LAIR已被证实能显著提高水稻分蘖、穗分枝和产量。但迄今为止，来源于大麦的分蘖调控相关lncRNA鲜见报道。鉴于lncRNA在株型和产量调控中的巨大潜力，迫切需要充分挖掘和开发属于本国知识产权的新的分蘖调控lncRNA，服务于多种作物以高产为目标的分子设计育种工作。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种lncRNA-BTRL及其应用。
第一方面，本发明提供一种lncRNA-BTRL，所述lncRNA-BTRL的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
本发明进一步提供用于扩增所述lncRNA-BTRL引物组合，所述引物组合包括如SEQID NO.2-5所示的核苷酸序列。
本发明进一步提供包括所述lncRNA-BTRL的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。
本发明进一步提供包括所述生物材料的试剂盒。
本发明进一步提供所述的lncRNA-BTRL，或所述的生物材料，或所述的试剂盒在提高植物的分蘖数中的应用。
本发明进一步提供所述的lncRNA-BTRL，或所述的生物材料，或所述的试剂盒在调控植物的株型或产量中的应用。
第二方面，本发明提供一种调控植物株型或产量的方法，包括：
调控植物中lncRNA-BTRL的表达水平；所述lncRNA-BTRL的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
进一步地，通过提高所述lncRNA-BTRL的表达水平，提高所述植物的分蘖数；和/或，降低所述植物的株高。
进一步地，通过构建包含所述lncRNA-BTRL的过表达载体，转导至所述植物中进行表达，以提高所述lncRNA-BTRL的表达水平。
进一步地，所述植物包括拟南芥、大麦、水稻或小麦中的一种或多种。
本发明具有如下有益效果：
本发明利用RACE技术，结合巢式PCR扩增手段，克隆得到了1个参与分蘖形成和发育途径的长链非编码lncRNA-BTRL。lncRNA-BTRL全长1834bp，具有典型的5’帽子结构和3’多聚腺苷酸尾巴，与大麦现有注释基因无重叠，属于基因间区lncRNA。
本发明通过构建lncRNA-BTRL全长序列的过表达载体，并进行水稻、大麦稳定遗传转化及阳性转基因株系筛选，获得lncRNA-BTRL过表达阳性水稻株系和大麦株系，其分蘖数显著增加，株高显著降低，最终产量显著提升。
本发明提供了一个参与大麦、水稻分蘖调控和产量形成的新lncRNA-BTRL，为作物高产育种奠定了分子基础，为其他麦类lncRNA发掘提供借鉴，具有重要的生物学意义和潜在育种应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的lncRNA-BTRL的克隆图；其中，A为5’race检测结果；B为3’race检测结果；C为全长扩增检测结果。
图2为本发明实施例2提供的lncRNA-BTRL在多寡分蘖大麦的分蘖节不同发育时期的表达模式图；其中，A为生物信息学预测表达水平；B为RT-qPCR检测表达水平。
图3为本发明实施例3提供的lncRNA-BTRL在三叶一心期不同组织的表达模式图；其中，B表示Bowman，G表示GSHO1990。
图4为本发明实施例4提供的lncRNA-BTRL过表达载体构建示意图。
图5为本发明实施例4提供的lncRNA-BTRL过表达水稻阳性株系的分子检测图；其中line1-6和line8为纯合株系(竖向为1个株系)，仅包含部分检测结果。
图6为本发明实施例4提供的lncRNA-BTRL过表达大麦阳性株系的分子检测图；其中line2，line3，line6为纯合株系(横向为1个株系)，仅包括部分检测结果。
图7为本发明实施例4提供的lncRNA-BTRL过表达水稻阳性株系的表达水平图；其中，Kitaake表示野生型水稻株系，其余均为过表达阳性株系。
图8为本发明实施例4提供的lncRNA-BTRL过表达大麦阳性株系的表达水平图；其中，G.P.表示野生型大麦株系，其余均为过表达阳性株系。
图9为本发明实施例4提供的lncRNA-BTRL过表达水稻和大麦阳性株系表型图示；其中，A为水稻阳性株系(WT左，过表达右)；B为大麦阳性株系(WT左，过表达右)。
图10为本发明实施例4提供的lncRNA-BTRL过表达水稻阳性株系的表型统计箱型图；其中，WT为野生型水稻株系，line1-8为阳性水稻株系；左图为分蘖数，右图为株高。
图11为本发明实施例4提供的lncRNA-BTRL过表达大麦阳性株系的表型统计箱型图；其中，WT为野生型大麦株系，line1-7为阳性大麦株系；左图为分蘖数，右图为株高。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所涉及的实验方法，若无特殊说明，均为本领域常规方法。
以下实施例中所涉及的试剂耗材和仪器等，若无特殊说明，均为可市售购得的产品。
以下实施例中的定量试验、酶活测定实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
以下实施例中所使用的供试材料为：多分蘖大麦品种Bowman(野生型)及其寡分蘖突变体GSHO1990(以下简称为突变体)，种子均来自四川农业大学小麦研究所。水稻转基因受体材料为Kitaake,大麦转基因受体材料为Golden Promise,均由公司提供。
实施例1
1、大麦样品采集
大麦于10月下旬种植于田间，各播种20行，于二叶期、二叶一心期、三叶一心期、四叶一心期和五叶一心期对分蘖节、根、茎、叶、腋芽部位进行取样，迅速冻存于液氮，保存于-80℃备用。
2、Race获得lncRNA-BTRL全长序列
(1)总RNA提取
使用杭州联川生物公司的Plant Tissue Kit(LCS,TRK-1001)，提取大麦Bowman和GSHO1990分蘖发育5个关键时期(二叶期、二叶一心期、三叶一心期、四叶一心期和五叶一心期)的分蘖节总RNA。要求RNA样品新鲜，提取的RNA完整度好，浓度较高。
(2)确定lncRNA-BTRL已知序列
根据生物信息学预测的lncRNA-BTRL部分序列，用南京诺唯赞公司的P505高保真酶进行PCR扩增。反应体系和反应程序按说明书推荐，一般采用35-40个循环。PCR产物用Bioflux胶回收试剂盒回收，连接至pEASY-Blunt中间载体并进行测序确认。
在上述lncRNA-BTRL已知序列的基础上，设计Race扩增的特异GSP引物(SEQ IDNO.2-5)：
第一轮5’端GSP引物序列为：GGGGCATGGAATTTACAGGCGGTG；第二轮5’端GSP引物序列为：CAGGCCGGTGGCAAGCACTATTCA；第一轮3’端GSP引物序列为：TGCAGATGTCAATCGTGGAAGCGG；第二轮3’端GSP引物序列为：CAAGTATTATATCCCTGTCAAAGCC。
(3)Race cDNA制备
使用Takara公司的RACE 5’/3’Kit，进行Race实验：
①按下列体积配制Buffer Mix用于cDNA合成反应，在微型离心机上短暂旋转，室温放置。用于第6步实验
表1 Buffer Mix配置
②在单独的微量离心管tube中加入下列试剂：
表2反应体系
③混合组分，在微型离心机上短暂旋转。
④72℃孵育3min，42℃冷却2min。冷却后，14,000rpm下离心10sec，把试剂收集在管底。
⑤为了补齐5‘RACE cDNA合成反应液，每个反应添加1μl的SMARTer II AOIigonucleotide。
⑥按下列体积配制5‘RACE和3‘RACE cDNA合成反应液。室温下按下列顺序混合：
表3 5‘RACE和3‘RACE cDNA合成反应液
⑦取第6步的Master Mix 8μl，加入到第4步的变性RNA(3’RACE cDNA)或第5步的变性RNA(5’RACE cDNA)中。每个cDNA合成反应的总体积为20μl。
⑧轻柔吹打混匀，短暂离心收集组分于管底。在空气孵育箱thermal cycler中，42℃孵育90min。后70℃加热10min。
⑨添加90μl Tricine-EDTA Buffer稀释第一链cDNA合成反应产物
⑩得到可用于3’RACE-ready cDNA和5’RACE-ready cDNA。cDNA样本于-20℃下保存。
(4)5’-RACE PCR和3’-RACE PCR反应
①按下列体积配制PCR Master Mix，5’RACE和3’RACE可以使用相同的MasterMix，按下列体积混合试剂：
表4 PCR Master Mix配置
②按下表配制PCR反应液。按下面顺序把各组分加入到0.5ml PCR管中，轻柔混匀。
表5 PCR反应液配置
③采用常规方法，对PCR产物进行电泳检测，单一条带分别回收，并进行克隆测序。其中全长序列由DNAMAN将两端Race所得序列与已知序列拼接而成。
全长扩增引物如下(SEQ ID NO.6-7)：
F：5’-ACGCAGAGTCCATGAACGCT-3’；
R:5’-ACAAAGTGTTATATATTTCCTTGCA-3’。
lncRNA-BTRL的Race电泳结果及全长扩增结果如图1所示，序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2 lncRNA-BTRL在多寡分蘖材料间的表达模式分析
1、总RNA提取流程和实施例1相同，共获得Bowman和GSHO1990从二叶期到五叶一心期，共10份分蘖节RNA。
2、反转录制备cDNA
使用Takara公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录获得cDNA，具体操作步骤如下：
(1)冰上融化RNA模板，5×gDNA Eraser Buffer，gDNA Eraser
(2)RNA热变性，反应体系如下：
表6 RNA热变性体系
(3)42℃2min(或者室温5min)
(4)逆转录体系配置，反应体系如下：
表7逆转录反应体系
PCR仪上37℃孵育15min，85℃热处理5sec，瞬时离心处理后-20℃保存。
(5)荧光定量检测lncRNA-BTRL在多寡分蘖材料间的表达模式
按照荧光定量试剂盒(Takara公司)进行，具体反应体系如下：
表8荧光定量PCR反应体系
其中，荧光定量PCR反应条件为：95℃；3min；95℃2s，60℃2s，此步骤收集荧光信号，41个循环，然后进行溶解曲线分析，温度60-95℃，收集荧光信号。
定量引物序列如下(SEQ ID NO.8-9)：
BTRL-Q-F：GGGGAGAAGAGAGTGGAAAGAGGA；
BTRL-Q-F：AGGAGGGAACGAAGAAAGTGAGTG；
双内参引物序列如下(SEQ ID NO.10-13)：
GAPDH-F：CCGTTCATCACCACCGACTA；
GAPDH-R：GCAACCTCCTTCTCACCGAA；
U6-F：GTTCCTCTGGGGGCATCTGGTTA；
U6-R：ATTTATGCGTATCATCCCTGTGC。
荧光定量结果显示，lncRNA-BTRL从二叶一期到四叶一心期，在野生型大麦Bowman中的表达水平均显著或极显著高于寡分蘖突变体GSHO1990，与预测数据基本一致(见图2)。表明lncRNA-BTRL很可能参与分蘖发育过程，其高表达与多分蘖性状相关。
实施例3 lncRNA-BTRL在三叶一心期多组织间表达模式分析
本实施例参照和实施例2中相同的流程、方法和引物。其中，总RNA由三叶一心期的Bowman和GSHO1990的分蘖节、腋芽、根、茎、叶中提取获得。
荧光定量结果显示，lncRNA-BTRL在野生型大麦Bowman和寡分蘖突变体GSHO1990中，均呈现组织特异表达特性。即，lncRNA-BTRL高表达于分蘖节和腋芽部位，中低表达于根、茎、叶等部位(见图3)。表明lncRNA-BTRL特异表达于分蘖发生关键时期和关键部位，参与分蘖发育和形成，是重要的株型调控lncRNA分子。
实施例4
1、lncRNA-BTRL过表达载体构建
本发明通过双酶切(NcoⅠ和BGIⅡ)的方法线性化过表达载体PCAMBIA1301原始质粒。首先将lncRNA-BTRL全长序列的1834个核苷酸连接到中间载体pEASY-blunt上，克隆阳检并测序确认；后通过同源重组法，将lncRNA-BTRL全长序列构建到线性化的过表达载体PCAMBIA1301上(见图4)。通过液氮冷冻法，将成功构建并测序的表达载体质粒转化到农杆菌菌株AGL1中，并进行阳性检测。保存成功构建的表达载体质粒于-80℃；40％甘油1:1保存其农杆菌菌液于-80℃。
其中，同源重组法的同源臂引物序列为(SEQ ID NO.14-15)：
BTRL-P1301-F：CGGGGGACTCTTGACCATACGCAGAGTCCATGAACGCT；
BTRL-P1301-R：TAGAAATTTACCCTCAGATCTACAAAGTGTTATATATTTCCTTGCA。
2、lncRNA-BTRL转基因水稻和大麦株系阳性检测
(1)将上述过表达载体送往公司，进行水稻和大麦遗传转化，受体分别为Kitaake和Golden Promise，公司返回T0代幼苗。
(2)SDS法提取转基因植株DNA
用SDS法按株系编号提取转基因植株叶片的基因组DNA，提取野生型叶片为对照组。基因组DNA提取采用改良SDS法，具体如下：
①分别将样品装入2.0ml离心管中，立即用液氮冷冻后存放于-80℃超低温冰箱；65℃提前提前加热SDS提取液；
②在磨样仪上将材料磨成粉末，用移液枪吸700ul提前预热好的SDS提取液，剧烈摇晃，使提取液充分混合样品，在65℃水浴锅中反应30min，每隔5min翻动一下；
③将处理好的混合液置于冰上或者冰箱中10min使冷却；
④在冷却后的混合液中加入350ul冷冻的6M醋酸铵，-20℃放置20min；
⑤充分摇晃混匀，4℃，10000r/min离心15min；
⑥用移液枪吸500-600μl上清液到干净的离心管中，避免吸取到底部的沉淀造成杂质干扰；加入同体积的异丙醇轻轻摇晃混匀，-20℃冷冻30min以上；
⑦室温条件下，10000r/min离心10min，丢弃废液，小心不要倒出管底的DNA；
⑧加入100μl预冷的-70℃酒精，洗涤杂质，室温条件下10000r/min离心5min，丢弃废液，重复此操作2次；
⑨干燥DNA，使酒精完全挥发，加入100μl灭菌水充分溶解；
⑩用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带。
3)潮霉素和特异引物阳性检测
公司共返回30株水稻T0代幼苗和10株大麦T0代幼苗。经潮霉素引物和lncRNA-BTRL特异引物检测，其中25株T0代水稻幼苗和7株T0代大麦幼苗被判定为阳性事件。
其中，潮霉素检测引物序列为(SEQ ID NO.16-17)：
Hyg-F：ATCCGGTCGGCATCTACTCT；
Hyg-R：TCTCGAGCTTTCGCAGATCC。
其中，lncRNA-BTRL特异引物序列为(SEQ ID NO.18-19)：
BTRL-positive-F：TGGTGATCCATGAAAGAAGGCA；
BTRL-positive-R：GGCGAACAACAAGGAACACAT。
将上述T0代水稻和大麦幼苗分别种植于温室，按转化事件分单株收种。T1和T2代均进行阳性鉴定并收获阳性株系，其中特异引物检测的部分阳性结果见图5和图6。进一步通过RT-qPCR，对水稻T2代部分阳性株系和大麦T2代阳性株系的lncRNA-BTRL过表达水平进行检测(图7和图8)。定量结果表明，lncRNA-BTRL过表达水稻阳性株系和大麦阳性株系普遍表达水平较高，遗传转化效果显著。
其中，所用lncRNA-BTRL定量引物序列如下(SEQ ID NO.20-21)：
BTRL-Q-F：GGGGAGAAGAGAGTGGAAAGAGGA；
BTRL-Q-F：AGGAGGGAACGAAGAAAGTGAGTG；
双内参引物序列如下(SEQ ID NO.22-25)：
GAPDH-F:CCGTTCATCACCACCGACTA；
GAPDH-R；GCAACCTCCTTCTCACCGAA；
U6-F：GTTCCTCTGGGGGCATCTGGTTA；
U6-R：ATTTATGCGTATCATCCCTGTGC。
3、lncRNA-BTRL转基因水稻和大麦阳性株系表型调查
(1)表型鉴定
调查过表达水稻和大麦阳性株系的株高(cm)、穗长(cm)、穗颈长(cm)、旗叶长、宽(cm)、分蘖数(个)，分蘖角度(°)、穗粒数(粒)、抽穗开花期(天)等重要农艺性状并记录(同时记录野生型对照株系的农艺性状)。采集灌浆期典型的过表达单株和野生型单株图片，如图9所示。
(2)数据分析
剔除表型数据中的异端值，采用Excel 2019进行数据记录，并通过SPSS和Excel进行数据统计和显著性检验。分析结果表明，与对应野生型株系相比，过表达lncRNA-BTRL能极显著增加大麦和水稻阳性株系的分蘖数，并降低其株高(图10和图11)。分蘖是产量三要素中穗数的重要决定因素，其改变势必对作物产量水平产生显著影响。因而，该实例中转基因实验进一步表明，lncRNA-BTRL是一个在分蘖调控中起重要作用的长链非编码RNA分子，在未来水稻、大麦等多物种的分子设计育种和产量提升方面，有着广阔的发展和应用前景。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种lncRNA-BTRL及其应用
<130> KHP221111997.3
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1851
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
acgcagagtc catgaacgct gcagcgaggt ttccagcgca gtgacaacat gacaaccaag 60
ttcaacagcc tcatagcaca ctacatccga aattgattgc ccaaattatt ttctacaata 120
gcttttatta tggtgatcca tgaaagaagg cagtcctata atttggtcgc tggatggaag 180
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tctctctctc atgctgcaga tgtcaatcgt ggaagcggaa aatacctggg gagtagagaa 1560
tcaattagta tagcggattg atggggagta gagaatcaat tagtatagcg gattgatggg 1620
gagtagagaa tcaattagta tagcagattg atgtaattat tattttgtat tattaatata 1680
aagaacttta tatataagaa caatgactac caccatggct ttgacaggga tataatactt 1740
gtaacagtga gaaagagttg tattttatcg aaattactct ctttcttata tatatttttt 1800
attaggtgtt tgcctataaa actatgatgc aaggaaatat ataacacttt g 1851
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<400> 2
ggggcatgga atttacaggc ggtg 24
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<213> Artificial Sequence
<400> 3
caggccggtg gcaagcacta ttca 24
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<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
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tgcagatgtc aatcgtggaa gcgg 24
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<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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ggggagaaga gagtggaaag agga 24
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atttatgcgt atcatccctg tgc 23
Claims (9)
1.一种lncRNA-BTRL，其特征在于，所述lncRNA-BTRL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种引物组合，其特征在于，所述引物组合包括如SEQ ID NO.2-5所示的核苷酸序列。
3.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包括如权利要求1所示的lncRNA-BTRL；所述生物材料为表达盒或载体。
4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求3所述的生物材料。
5.权利要求1所述的lncRNA-BTRL或权利要求3所述的生物材料或权利要求4所述的试剂盒在提高植物的分蘖数中的应用；
所述植物为大麦或水稻。
6.权利要求1所述的lncRNA-BTRL或权利要求3所述的生物材料或权利要求4所述的试剂盒在调控植物的株高中的应用；
所述植物为大麦或水稻。
7.一种调控植物分蘖数或株高的方法，其特征在于，包括：
调控植物中lncRNA-BTRL的表达水平；所述lncRNA-BTRL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述植物为大麦或水稻。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，通过提高所述lncRNA-BTRL的表达水平，提高所述植物的分蘖数；和/或，降低所述植物的株高。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，通过构建包含所述lncRNA-BTRL的过表达载体，转导至所述植物中进行表达，以提高所述lncRNA-BTRL的表达水平。
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