CN106414742A - 玉米调节元件及其用途 - Google Patents

Abstract

提供了使用玉米叶绿素a/b结合基因调节元件在植物细胞和/或植物组织中表达转基因的构建体和方法。

Description

玉米调节元件及其用途

优先权声明

本专利申请要求获得于2014年1月23日提交的题为“玉米调节元件及其用途”(ZEA MAYS REGULATORY ELEMENTS AND USES THEREOF)的美国临时专利申请系列号61/930,738的申请日之利益。

技术领域

本发明一般地涉及植物分子生物学领域，更具体地，涉及在植物中表达转基因的领域。

背景

许多植物物种能够被转基因转化，以引入农艺学期望的性状或特征。开发和/或修饰植物物种使之具有特定的期望性状。一般地，期望的性状包括，例如，提高营养价值质量、增加产量、赋予病虫害抗性、提高干旱和胁迫耐受性、提高园艺品质(例如，色素沉着和生长)、赋予除草剂抗性、使之能够从植物生产工业上有用的化合物和/或材料，和/或使之能够生产药物。

通过植物转化技术产生包含堆叠在单一基因组座位中的多个转基因的转基因植物物种。植物转化技术导致转基因引入到植物细胞中，回收在植物基因组中稳定整合了转基因拷贝的能育转基因植物，随后通过转基因的转录和翻译进行转基因表达，从而产生具有期望性状和表型的转基因植物。然而，人们期望有这样的机制，可以用来产生转基因植物物种，以高表达被工程化为性状堆叠(trait stack)的多个转基因。

同样，人们也期望有这样的机制，可以用来在植物的特定组织或器官中表达转基因。例如，通过用病原体抗性基因转化植物基因组从而使病原体抗性蛋白在植物的根部强烈表达，可能可以提高植物对土壤源性病原体感染的抗性。或者，可能期望在处于特定生长或发育阶段(例如细胞分裂或伸长期)的植物组织中表达转基因。此外，可能期望在植物的叶和茎组织中表达转基因。

本文描述了玉米叶绿素a/b结合基因启动子调节元件。还描述了使用玉米叶绿素a/b结合基因启动子调节元件的构建体和方法。

公开

本文公开了用于在植物细胞和/或植物组织中表达转基因的序列、构建体和方法。在一个实施方案中，本公开涉及一种基因表达盒，其包括与转基因可操作连接的启动子，其中该启动子包含在严格条件下与多核苷酸探针杂交的多核苷酸，多核苷酸探针包含与SEQ ID NO:2的互补物有至少90％同一性的序列。在进一步的实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO:2具有至少90％的序列同一性的多核苷酸。在额外的实施方案中，启动子包含含有内含子的多核苷酸。在其它实施方案中，内含子与SEQ ID NO:5具有至少90％的序列同一性。在一个实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性的多核苷酸。在其它实施方案中，该可操作连接的转基因编码多肽或小RNA基因。在后续的实施方案中，该转基因选自下组：杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合蛋白转基因、和选择标志物转基因。在另外一个实施方案中，该基因表达盒包括3'-非翻译区。在一个实施方案中，该3'-非翻译区与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少90％的序列同一性。在另外一个实施方案中，该基因表达盒进一步包括5'-非翻译区。在另一个实施方案中，该5'-非翻译区包含与SEQ ID NO:19具有至少90％的序列同一性的多核苷酸。在一个实施方案中，重组载体包括所述基因表达盒。在该实施方案的进一步的方面中，该重组载体从下组中选出：质粒、粘粒、细菌人工染色体、病毒和噬菌体。在一个实施方案中，转基因细胞包括该基因表达盒。在该实施方案的后续方面中，该转基因细胞是转基因植物细胞。在一个实施方案中，转基因植物包括转基因植物细胞。在实施方案的进一步的方面中，转基因植物是单子叶植物或双子叶植物。在该实施方案的其它方面中，单子叶植物从下组选出：玉米植物，水稻植物，和小麦植物。在一个实施方案中，从转基因植物获得转基因种子。在后续的实施方案中，启动子是组织优选的启动子。在一个实施方案中，组织优选的启动子是叶、壳(husk)、茎、或须(silk)组织优选的启动子。在另外一个实施方案中，启动子包括SEQ ID NO:2的核苷酸1-1,887的多核苷酸序列。

在一个实施方案中，本公开涉及包含合成多核苷酸的转基因细胞，所述合成多核苷酸在严格条件下与这样的多核苷酸探针杂交，该多核苷酸探针包含与SEQ ID NO:2的互补物具有至少90％同一性的序列。在另外一个实施方案中，合成多核苷酸与SEQ ID NO:2具有至少90％的序列同一性。在另一个实施方案中，该合成多核苷酸包括含有内含子的多核苷酸。在另一个实施方案中，内含子与SEQ ID NO:5具有至少90％的序列同一性。在一个实施方案中，合成多核苷酸包含这样的多核苷酸，该多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性。在进一步的实施方案中，转基因细胞是转基因植物细胞。在后续的实施方案中，转基因植物细胞是通过植物转化方法产生的。在额外的实施方案中，植物转化方法选自下组：土壤杆菌介导的转化方法，生物射弹转化方法，碳化硅转化方法，原生质体转化方法，和脂质体转化方法。在一个实施方案中，转基因植物包含转基因植物细胞。在进一个实施方案中，转基因植物是单子叶植物或双子叶植物。在其它实施方案中，单子叶植物从下组选出：玉米植物，水稻植物，和小麦植物。在一个实施方案中，从转基因植物获得转基因种子。在额外的实施方案中，启动子是组织优选的启动子。在后续的实施方案中，组织优选的启动子是叶、壳、茎或须组织优选的启动子。在另一个实施方案中，合成多核苷酸包括SEQ ID NO:2的核苷酸1-1,887的多核苷酸序列。

在一个实施方案中，本公开涉及纯化的多核苷酸启动子，其中该启动子包括在严格条件下与如下所述的多核苷酸探针杂交的多核苷酸，该多核苷酸探针包含与SEQ ID NO:2的互补物具有至少90％同一性的序列。在进一步的实施方案中，纯化的多核苷酸与SEQ ID NO:2具有至少90％的序列同一性。在额外的实施方案中，该纯化的多核苷酸启动子包括含有内含子的多核苷酸。在其它实施方案中，内含子与SEQ ID NO:5具有至少90％的序列同一性。在一个实施方案中，纯化的多核苷酸启动子包含与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性的多核苷酸。在另一个实施方案中，纯化的多核苷酸与转基因可操作连接。在随后的实施方案中，该可操作连接的转基因编码多肽或者小RNA。在一个实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的所述纯化多核苷酸序列，所述转基因与3'-非翻译区可操作连接。在一个实施方案中，3'-非翻译区包括与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少90％序列同一性的多核苷酸。在一个实施方案中，该基因表达盒包括与转基因可操作连接的纯化多核苷酸，其中该纯化多核苷酸是SEQ ID NO:19的5'-非翻译区。在另一个实施方案中，所述5'-非翻译区包含与SEQ ID NO:19具有至少90％的序列同一性的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述转基因选自下组：杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合蛋白转基因、和选择标志物转基因。在一个实施方案中，重组载体包括该基因表达盒。在额外的实施方案中，该重组载体从下组中选出：质粒载体、粘粒载体、和BAC载体。在一个实施方案中，转基因细胞包括该基因表达盒。在后续的实施方案中，该转基因细胞是转基因植物细胞。在一个实施方案中，转基因植物包括该转基因植物细胞。在额外的实施方案中，转基因植物是单子叶植物或双子叶植物。在更进一步的实施方案中，单子叶植物从下组选出：玉米植物，水稻植物，和小麦植物。在一个实施方案中，从转基因植物获得转基因种子。在后续的实施方案中，纯化的多核苷酸序列促进转基因的组织优选表达。在额外的实施方案中，纯化的多核苷酸序列促进转基因的叶、壳、茎或须组织优选表达。在其它实施方案中，纯化的多核苷酸包括SEQ ID NO:2的核苷酸1-1,887的多核苷酸序列。

在一个实施方案中，本公开涉及在转基因植物中表达异源编码序列的方法，该方法包括：

a)用基因表达盒转化植物细胞，基因表达盒包含：包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的序列的多核苷酸序列，该多核苷酸序列与异源编码序列可操作连接，该异源编码序列与3’非翻译区可操作连接；

b)分离包含该基因表达盒的转化植物细胞；

c)将该转化植物细胞再生为转基因植物；和

d)获得该转基因植物，其中该转基因植物包括含有包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列的基因表达盒。

在额外的实施方案中，多核苷酸序列包含内含子。在其它实施方案中，内含子与SEQ ID NO:5具有至少90％的序列同一性。在一个实施方案中，多核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性。在进一步的实施方案中，异源编码序列选自下组：杀虫剂抗性编码序列、除草剂耐性编码序列、氮利用效率编码序列、水分利用效率编码序列、营养品质编码序列、DNA结合蛋白编码序列、和选择标志物编码序列。在额外的实施方案中，植物细胞的转化利用植物转化方法。在另外的实施方案中，植物转化方法选自下组：土壤杆菌介导的转化方法，生物射弹转化方法，碳化硅转化方法，原生质体转化方法，和脂质体转化方法。在其它的实施方案中，转基因植物是单子叶转基因植物或双子叶转基因植物。在进一步的实施方案中，单子叶转基因植物从下组选出：玉米植物，水稻植物，和小麦植物。在一个实施方案中，从转基因植物获得转基因种子。在进一步的实施方案中，异源编码序列在组织中优先表达。在另外一个实施方案中，异源编码序列在叶、壳、茎或须组织中优先表达。在其它实施方案中，该多核苷酸包括SEQ ID NO:2的核苷酸1-1,887的序列。

在一个实施方案中，本公开涉及分离包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的序列的多核苷酸序列的方法，该方法包括：

a)鉴定包含与SEQ ID NO:2的至少90％序列同一性的多核苷酸序列；

b)产生多个寡核苷酸引物序列，其中所述寡核苷酸引物序列结合包含与SEQ ID NO:2的至少90％序列同一性的多核苷酸序列；

c)用从上述多个寡核苷酸引物序列中选出的寡核苷酸引物序列从DNA样品中扩增包含与SEQ ID NO:2的至少90％序列同一性的多核苷酸序列；和

d)分离包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的序列的多核苷酸序列。

在额外的实施方案中，多核苷酸序列包含内含子。在其它实施方案中，内含子与SEQ ID NO:5具有至少90％的序列同一性。在一个实施方案中，多核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性。在额外的实施方案中，包含与SEQ ID NO:2的至少90％同一性的分离多核苷酸序列序列与转基因可操作连接。在进一步的实施方案中，该可操作连接的转基因编码多肽。在一个实施方案中，基因表达盒包括与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列，该多核苷酸序列与转基因可操作连接，该转基因与3'-非翻译区可操作连接。在一个实施方案中，3'-非翻译区包括与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少90％序列同一性的多核苷酸。在进一步的实施方案中，转基因选自下组：杀虫剂抗性编码序列、除草剂抗性编码序列、氮利用效率编码序列、水分利用效率编码序列、营养品质编码序列、DNA结合蛋白编码序列、和选择标志物编码序列。在一个实施方案中，重组载体包括该基因表达盒。在进一步的实施方案中，载体选自下组：质粒载体、粘粒载体、和BAC载体。在一个实施方案中，转基因细胞包括该基因表达盒。在额外的实施方案中，该转基因细胞是转基因植物细胞。在一个实施方案中，转基因植物包括该转基因植物细胞。在额外的实施方案中，转基因植物是单子叶植物或双子叶植物。在进一步的实施方案中，单子叶植物从下组选出：玉米植物，水稻植物，和小麦植物。在一个实施方案中，从转基因植物获得转基因种子。在其它实施方案中，分离的多核苷酸包括SEQ ID NO:2的核苷酸1-1,887的多核苷酸序列。

在一个实施方案中，本公开涉及用于制造包含与SEQ ID NO:2的至少90％序列同一性的合成多核苷酸序列的方法，该方法包括：

a)鉴定包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列；

b)分离包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列；

c)限定多个包含与SEQ ID NO:2的至少90％序列同一性的多核苷酸序列；

d)合成包含与SEQ ID NO:2的至少90％序列同一性的多核苷酸序列；和

e)制造包含与SEQ ID NO:2的至少90％序列同一性的合成多核苷酸序列。

在进一步的实施方案中，所述合成包括：

a)鉴定包含与SEQ ID NO:2的至少90％序列同一性的多核苷酸序列；

b)产生多个寡核苷酸引物序列，其中这些寡核苷酸引物序列结合包含

与SEQ ID NO:2的至少90％序列同一性的多核苷酸序列；

c)连接所述多个寡核苷酸引物序列以合成包含与SEQ ID NO:2的至少

90％序列同一性的多核苷酸序列。

在额外的实施方案中，该合成的多核苷酸序列包含内含子。在其它实施方案中，内含子与SEQ ID NO:5具有至少90％的序列同一性。在一个实施方案中，合成的多核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性。在额外的实施方案中，合成的多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:2的至少90％序列同一性，并与转基因可操作连接。在另外一个实施方案中，可操作连接的转基因编码多肽。在一个实施方案中，基因表达盒包括该包含与SEQ IDNO:2的至少90％序列同一性的合成的多核苷酸序列，该合成的多核苷酸序列与转基因可操作连接，该转基因与3’-非翻译区可操作连接。在一个实施方案中，3’-非翻译区包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少90％序列同一性的多核苷酸。在另外一个实施方案中，转基因选自下组：杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合蛋白转基因、和选择标志物转基因。在一个实施方案中，重组载体包括该基因表达盒。在额外的实施方案中，重组载体选自下组：质粒载体、粘粒载体和BAC载体。在一个实施方案中，转基因细胞包括该基因表达盒。在进一步的实施方案中，转基因细胞是转基因植物细胞。在一个实施方案中，转基因植物包括该转基因植物细胞。在进一步的实施方案中，转基因植物是单子叶植物。在其它实施方案中，单子叶植物选自下组：玉米植物、小麦植物和水稻植物。在一个实施方案中，从转基因植物获得转基因种子。在其它实施方案中，合成多核苷酸包括SEQ ID NO:2的核苷酸1-1,887的多核苷酸序列。

在一个实施方案中，构建体包括基因表达盒，所述基因表达盒包括SEQ IDNO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,或SEQ ID NO:4的玉米叶绿素a/b结合基因启动子。在一个实施方案中，基因表达盒包括与转基因或异源编码序列可操作连接的SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,或SEQ ID NO:4的玉米叶绿素a/b结合基因启动子。在一个实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR。在一个实施方案中，基因表达盒包括与启动子可操作连接的SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR。在进一步的实施方案中，基因表达盒包括与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,或SEQ IDNO:4的玉米叶绿素a/b结合基因启动子可操作连接的SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:8的玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR。在一个实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的SEQ ID NO:19的玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR。在一个实施方案中，基因表达盒包括与启动子可操作连接的SEQ ID NO:19的玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR。在进一步的实施方案中，基因表达盒包括与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,或SEQ ID NO:4的玉米叶绿素a/b结合基因启动子可操作连接的SEQ ID NO:19的玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR。在一个实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的玉米叶绿素结合基因内含子。在一个实施方案中，基因表达盒包括与启动子可操作连接的SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的玉米叶绿素结合基因内含子。在一个实施方案中，基因表达盒包括与转基因或异源编码序列可操作连接的SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,或SEQ IDNO:4的玉米叶绿素a/b结合基因启动子。在一个实施方案中，基因表达盒包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个转基因。

在一个实施方案中，基因表达盒独立地包括a)SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的玉米叶绿素a/b结合基因启动子，b)SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的玉米叶绿素结合基因内含子，c)SEQ ID NO:7或SEQID NO:8的玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR，和d)SEQ ID NO:19的玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR。

本文公开了使用SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,或SEQ IDNO:4的玉米叶绿素结合基因启动子；SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的内含子，SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的3’-UTR，和SEQ ID NO:19的5’–UTR来栽培表达转基因的植物的方法。本文还公开了使用SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,或SEQ ID NO:4的玉米叶绿素结合基因启动子；SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的内含子，SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的3’-UTR，和SEQID NO:19的5’–UTR来培养表达转基因的植物组织和细胞的方法。在一个实施方案中，本文公开的方法包括在植物叶和茎进行组织特异性基因表达。

在一个实施方案中，基因表达盒包括从玉米叶绿素a/b结合基因获得的SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,或SEQ ID NO:4的启动子多核苷酸序列。

附图简述

图1的示意性流程图显示了使用结合二代测序(NGS)的转录概貌分析方法在玉米中鉴定高表达基因的过程。

图2显示了全长玉米叶绿素a/b结合基因启动子(SEQ ID NO:1)与修饰的玉米叶绿素a/b结合基因启动子(SEQ ID NO:3)比较的比对结果，该比对显示的重复多核苷酸序列被除去，从而产生修饰的玉米叶绿素a/b结合基因启动子序列。

图3显示的pDAB114438的载体质粒图，描绘了一个基因表达盒，其包括控制cry34Ab1报告基因表达的全长玉米叶绿素a/b结合基因启动子调节元件(标记为“ZmCAB启动子”)。

图4显示了pDAB101556对照质粒的图，其含有yfp报告基因，代替测试启动子构建体pDAB114438中的cry34Ab1报告基因作为感兴趣基因。yfp基因表达被玉米泛素-1(ZmUbi1)启动子所驱动，并以玉米Per5(ZmPer5)3’-UTR为终止。

图5显示了阳性对照载体pDAB108746的图，其含有cry34Ab1报告基因，由ZmUbi1启动子驱动并以马铃薯PinII(StPinII)3’-UTR为终止。

图6显示了pDAB120165的载体质粒图，描绘了一个基因表达盒，其包括修饰的玉米叶绿素a/b结合基因启动子调节元件，控制cry34Ab1报告基因的表达。

图7显示了pDAB120166的载体质粒图，描绘了一个基因表达盒，其包括全长玉米叶绿素a/b结合基因启动子(标记为“ZmCAB启动子”)和修饰的玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR(SEQ ID No.8)调节元件，控制cry34Ab1报告基因的表达。

实施本发明的模式

定义

如本文所使用的，冠词“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非在上下文中清晰且明确地另有规定。

如本文所使用的，术语“回交”是指如下的过程，其中育种者将杂交后代与其亲本之一杂交，例如第一代杂交体F1与F1杂交体的亲本基因型之一杂交。

如本文所使用的，术语“内含子”是指基因(或者被表达的感兴趣核苷酸序列)中包含的任何被转录但不被翻译的核酸序列。内含子包括被表达的DNA序列内的非翻译核酸序列，以及从其转录的RNA分子中的相应序列。

本文所述的构建体还可以包含可增强翻译和/或mRNA稳定性的序列，例如内含子。这样的一个内含子的实例是拟南芥组蛋白变异体基因II的第一内含子，或者任何其它公知的内含子序列。内含子可以和启动子序列组合使用，以提高翻译和/或mRNA稳定性。

如本文所使用的，术语“5’非翻译区”或“5’-UTR”是指前mRNA或成熟mRNA5’端的非翻译区段。例如，在成熟的mRNA上，5’-UTR通常在其5’端包含一个7-甲基鸟苷帽，并且参与许多过程，例如剪接、多聚腺苷酸化、mRNA转运到细胞质、mRNA的5’端被翻译机构识别，和保护mRNA免于降解。

如本文所使用的，术语“3’非翻译区”或“3’-UTR”是指前mRNA或成熟mRNA3’端的非翻译区段。例如，在成熟的mRNA上，这个区域包含多聚-(A)尾巴，并且已知在mRNA稳定性、翻译起始和mRNA转运中具有多种功能。

如本文所使用的，术语“多聚腺苷酸化信号”是指mRNA转录本中存在的一种核酸序列，其允许在多聚-(A)聚合酶存在时，转录本的多聚腺苷酸化位点(例如位于多聚-(A)信号下游10-30个碱基)被多聚腺苷酸化。众多多聚腺苷酸化信号是本领域已知的，并可用于本发明。一个示例性序列包括AAUAAA及其变异体，如Loke J.,et al.,(2005)Plant Physiology 138(3)；1457-1468所述。

如本文所使用的，术语“分离的”是指生物组分(包括核酸或蛋白质)已经与该组分自然出现的生物的细胞中的其它生物组分(即，其它染色质和染色质外DNA)分开。

如本文所使用的，在指核酸分子时，术语“纯化的”不需要绝对的纯(例如，均质的制备物)；相反，它意味着该序列比其在天然的细胞环境中相对地更纯(与自然水平相比，这个水平应当高至少2-5倍，例如就浓度或基因表达水平而言)。DNA分子可以从总DNA或总RNA直接获得。此外，cDNA克隆不是天然存在的，但优选地通过对部分纯化的、天然存在的物质(信使RNA)进行操作而得。从mRNA构建cDNA文库涉及合成物质(cDNA)的创制。单个cDNA克隆能够通过对携带cDNA文库的细胞进行克隆选择而从合成文库中纯化。因此，包括从mRNA构建cDNA文库和纯化不同cDNA克隆的过程会使天然信息纯化大约10⁶倍。类似地，启动子DNA序列可以被克隆到质粒中。这种质粒不是天然存在的，而是优选地通过对部分纯化的、天然存在的物质例如基因组DNA文库进行操作而获得的。因此，在这些技术中，优选纯化至少1个数量级，在一些实施方案中，纯化2个或3个数量级，在其它实施方案中，纯化4个或5个或更多个数量级。

类似地，纯化表示组分DNA序列发生了化学或功能上的改变。已“纯化”的核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。术语“纯化的”还包括通过重组DNA方法在宿主细胞(例如植物细胞)中制备的核酸和蛋白质，以及化学合成的核酸分子、蛋白质和肽。

术语“重组的”意思是其中发生了遗传重组的细胞或生物体。它还包括通过人为干预被人工地或合成地(即非自然地)改变的分子(例如，载体、质粒、核酸、多肽或小RNA)。对分子的改变可以在其自然环境或状态下或者离开其自然环境或状态的条件下进行。

如本文所使用的，术语“表达”是指多核苷酸被转录成mRNA(包括小RNA分子)的过程，和/或被转录的mRNA(也称作“转录本”)被随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。基因表达可能受到外部信号，例如细胞、组织或生物体暴露于可增加或降低基因表达的作用剂，的影响。基因的表达调节还可以发生在从DNA到RNA到蛋白质的通路上的任何位置。调节基因表达的实现方式有例如：对转录、翻译、RNA转运和加工的控制；中间分子如mRNA的降解；或者特定蛋白质分子生成后的激活、失活、区室化或降解，或者上述的组合。基因表达可以在RNA水平或蛋白质水平通过本领域已知的任何方法测量，包括但不仅限于，Northern印迹、RT-PCR、Western印迹、或者体外、原位或体内蛋白活性测定。

如本文所使用的，术语“基于同源性的基因沉默”或“HBGS”是通用术语，其包括转录基因沉默和转录后基因沉默。非连锁的沉默基因座对靶基因座的沉默可以由转录抑制(转录基因沉默；TGS)或mRNA降解(转录后基因沉默；PTGS)导致，它们分别是产生了对应于启动子或转录序列的双链RNA(dsRNA)的结果。每个过程涉及不同的细胞组分，这表明dsRNA诱导的TGS和PTGS很可能来自于一个古老的共同机制的多样化。然而，TGS和PTGS难以进行严格比较，因为这样的比较一般依赖于对独特的沉默基因座的分析。单个转基因座位可能会因为产生对应于不同靶基因的启动子和被转录序列的dsRNA而被描述为可触发TGS和PTGS二者。

如本文所使用的，术语“核酸分子”、“核酸”或“多核苷酸”(所有这三个术语彼此之间是同义的)是指多聚体形式的核苷酸，其可以包括RNA、cDNA、基因组DNA的有义和反义链，及其合成形式和混合聚合物。“核苷酸”可以指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或或任一种核苷酸的修饰形式。除非另外指出，否则核酸分子的长度通常为至少10个碱基。该术语可以指不定长度的RNA或DNA分子。该术语包括单链和双链形式的DNA。核酸分子可以包括由天然存在的和/或非天然存在的核苷酸接头连接在一起的天然存在的和/或修饰的核苷酸。

核酸分子可以被化学修饰或者生物化学修饰，或者可以包含非天然的或衍生化的核苷酸碱基，这是本领域技术人员可以容易理解的。这样的修饰包括，例如，标记物、甲基化、一个或多个天然发生的核苷酸被类似物取代、核苷酸内部修饰(例如不带电的连接：例如，甲基膦酸酯，磷酸三酯，磷酰胺，氨基甲酸酯等；带电荷的连接：例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等；悬垂部分：例如，肽、嵌入剂：例如，吖啶，补骨脂素等；螯合剂；烷化剂；和修饰的键：例如，α异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑构象，包括单链、双链、部分双链体、三链体(triplexed)，发夹式(hairpinned)，环状和挂锁构象。

转录沿着DNA链沿着5’-3’的方式前进。这意味着，RNA是通过向生长链的3’端顺次添加核糖核苷酸-5’-三磷酸(要求清除焦磷酸)而生成的。在线性或环状核酸分子中，如果离散的元件(例如，特定的核苷酸序列)键合或者将要键合于相同核酸上的其他元件的5’方向上，则称其位于该其他元件的“上游”。类似地，如果离散的元件键合或者将要键合于相同核酸上的其他元件的3’方向上，则称其位于该其他元件的“下游”。

如本文所使用的，术语“碱基位置”是指给定碱基或核苷酸残基在指定核酸内的位置。指定的核酸可以通过与参考核酸进行比对加以定义。

如本文所使用的，术语“杂交”是指这样的过程，其中多核苷酸或寡核苷酸和它们的类似物通过互补碱基之间的氢键键合杂交，氢键键合包括Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键。一般地，核酸分子由含氮碱基组成，其是嘧啶(胞嘧啶(C)，尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))。这些含氮碱基在嘧啶与嘌呤之间形成氢键，嘧啶与嘌呤的键合被称作“碱基配对”。更具体地，A与T或U氢键键合，G与C键合。“互补”是指两个不同核酸序列或同一核酸序列的两个不同区域之间发生的碱基配对。

如本文所使用的，术语“特异性杂交”或“特异性互补”是指足够程度的互补性，从而在寡核苷酸/多核苷酸和DNA或RNA靶之间发生稳定而特异的结合。寡核苷酸/多核苷酸不需要与靶序列100％互补才能特异性杂交。当寡核苷酸/多核苷酸与靶DNA或RNA分子的结合会干扰靶DNA或RNA的正常功能，并且有足够程度的互补性从而在特异性结合所期望的条件下，例如在体内测定或系统的生理条件下，避免寡核苷酸/多核苷酸与非靶序列发生非特异性结合时，寡核苷酸/多核苷酸是可以特异性杂交的。这种结合被称作特异性杂交。导致特定严格程度的杂交条件随着所选杂交方法的本质和杂交核酸序列的组成和长度而改变。一般地，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(特别是Na⁺和/或Mg²⁺浓度)对杂交严格性有贡献，尽管清洗次数也会影响严格性。关于获得特定严格程度所需的杂交条件的计算在Sambrooket al.(ed.),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,第1-3卷,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中有讨论。

如本文所使用的，术语“严格条件”包括如下条件，其中只有当杂交分子和DNA靶之间的错配小于50％时才会发生杂交。“严格条件”包括进一步特定水平的严格性。因此，如本文所使用的，“中等严格”条件是指序列错配超过50％的分子不会杂交的条件；“高严格”条件是指序列错配超过20％的序列不会杂交的条件；“极高严格”条件是指序列错配超过10％的序列不会杂交的条件。

在特定的实施方案中，严格条件可以包括在65℃杂交，随后在65℃用0.1x SSC/0.1％SDS清洗40分钟。下面是代表性的、非限制性的杂交条件：

·极高严格性：在5x SSC缓冲液中65℃杂交16个小时；在2x SSC缓冲液中室温下清洗2次，每次15分钟；和在0.5x SSC缓冲液中65℃清洗2次，每次20分钟。

·高严格性：在5-6x SSC缓冲液中65-70℃杂交16-20个小时；在2x SSC缓冲液中室温下清洗2次，每次5-20分钟；和在1x SSC缓冲液中55-70℃清洗2次，每次30分钟。

·中等严格性：在6x SSC缓冲液中在室温-55℃杂交16-20个小时；在2-3x SSC缓冲液中室温下清洗至少2次，每次20-30分钟。

在一个实施方案中，可特异性杂交的核酸分子能够在极高严格性杂交条件下保持结合。在一个实施方案中，可特异性杂交的核酸分子能够在高严格性杂交条件下保持结合。在一个实施方案中，可特异性杂交的核酸分子能够在中等严格性杂交条件下保持结合。

如本文所使用的，术语“寡核苷酸”是指短核酸聚合体。寡核苷酸可以通过切割长核酸区段或者通过聚合单个核苷酸前体而形成。自动合成仪允许合成长度达数百个碱基对的寡核苷酸。因为寡核苷酸可以结合互补的核苷酸序列，所以它们可用作检测DNA或RNA的探针。由DNA构成的寡核苷酸(寡脱氧核糖核苷酸)可以用在聚合酶链式反应中，聚合酶链式反应是一种用于扩增小DNA序列的技术。在聚合酶链式反应中，寡核苷酸通常被称作“引物”，其允许DNA聚合酶延伸寡核苷酸并复制互补链。

如本文所使用的，术语“聚合酶链式反应”或“PCR”是指这样的程序或技术，其中微量的核酸、RNA和/或DNA被扩增，如美国专利4,683,195所述。一般地，来自感兴趣区域末端或超过该末端的序列信息必须可得，才能设计寡核苷酸引物；这些引物在序列上与待扩增模板的相对链相同或相似。两个引物的5’端核苷酸可以和被扩增材料的末端一致。PCR可用于扩增特定的RNA序列，从总基因组DNA中扩增特定的DNA序列，和从总细胞RNA、噬菌体或质粒序列中转录cDNA，等。一般地参见Mullis et al.,Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.,51:263(1987)；Erlich编辑,PCR Technology,(Stockton Press,NY,1989)。

如本文所使用的，术语“引物”是指当条件适合于合成引物延伸产物时，能够作为沿着互补链的合成起始点的寡核苷酸。合成条件包括存在四种不同的脱氧核糖核苷酸三磷酸和至少一种聚合诱导剂例如逆转录酶或DNA聚合酶。它们存在于合适的缓冲液中，缓冲液包括辅助因子或可以在各种合适的温度下影响例如pH等条件的成分。引物优选地是单链序列，从而可以使扩增效率优化，但是也可以使用双链序列。

如本文所使用的，术语“探针”是指与靶序列杂交的寡核苷酸或多核苷酸序列。在或式的测定程序中，探针与靶上两个引物退火位点之间的部分杂交。探针包括大约8个核苷酸，大约10个核苷酸，大约15个核苷酸，大约20个核苷酸，大约30个核苷酸，大约40个核苷酸，或者大约50个核苷酸。在一些实施方案中，探针包括大约8个核苷酸-大约15个核苷酸。

在Southern印迹测定程序中，探针与附着在膜上的DNA片段杂交。在这种测定中，探针包括大约10个核苷酸，大约100个核苷酸，大约250个核苷酸，大约500个核苷酸，大约1,000个核苷酸，大约2,500个核苷酸，或者大约2,500个核苷酸。

探针可以进一步包括可检测的标记，例如放射性标记、生物素化标记、荧光团(异硫氰酸荧光素，等)。可检测的标记可以直接共价连接到探针寡核苷酸上，例如位于探针的5’端或探针的3’端。包含荧光团的探针还进一步包括淬灭剂，例如Black Hole Quencher^TM,Iowa Black^TM等。

如本文所使用的，术语“序列同一性”或“同一性”可以互换使用，指当两个序列通过以在特定比较窗口上实现最大的对应度的方式比对时，两个序列中相同的核酸残基。

如本文所使用的，术语“百分比序列同一性”是指通过比较在比较窗口上最佳比对的序列(例如，核酸序列或氨基酸序列)确定的数值，其中为了使两个序列实现最佳比对，一个序列在比较窗口中的部分与参考序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，缺口)。百分数是如下计算的：确定两个序列中出现相同核酸或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数，所得结果乘以100，从而产生百分比序列同一性。用于比对序列用于比较的方法是众所周知的。各种程序和比对算法在下列文献中有描述，例如：Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins andSharp(1988)Gene 73:237-44；Higgins and Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Corpetet al.(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang et al.(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson et al.(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatianaet al.(1999)FEMS Microbiol.Lett.174:247-50。

美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLAST^TM；Altschulet al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10)可以从多个来源获得，包括美国国家生物技术信息中心(Bethesda,MD)和在互联网上，供与多种序列分析程序结合使用。关于如何使用该程序确定序列同一性的描述可以在互联网上在BLAST^TM的“帮助”部分获得。对于核酸序列的比较，可以使用默认参数执行BLAST^TM程序的“BLAST 2序列”功能(Blastn)。当使用这种方法进行评估时，与参考序列的相似性越大的核酸序列将显示越高的百分比同一性。

如本文所使用的，术语“可操作连接”是指核酸被置于与另一个核酸的功能关系中。一般地，“可操作连接”可能意味着连接的核酸是毗邻的。连接可以通过在方便的限制位点实施连接作用来实现。如果不存在这样的位点，那么合成的寡核苷酸衔接子或接头与核酸连接或退火，并用于连接毗邻的多核苷酸片段。然而，可操作连接的元件不必是毗邻的。

如本文所使用的，“启动子”是指一段DNA区域，其一般位于基因的上游(向着基因的5’区)，是触发和驱动基因转录所需要的。启动子可以允许它所控制的基因被合适地激活或阻遏。启动子可能含有被转录因子识别的特定序列。这些因子可以结合启动子DNA序列，导致RNA聚合酶(一种从基因的编码区合成RNA的酶)的招募。启动子一般是指位于基因上游的全部基因调节元件，包括上游启动子、5’-UTR、内含子和前导序列。

如本文所使用的，术语“上游启动子”是指一段足以指导转录起始的连续多核苷酸序列。如本文所使用的，上游启动子包括转录起始的位点，其具有多个序列基序，包括TATA盒、起始子序列(initiator sequence)、TFIIB识别元件和其它启动子基序(Jennifer,E.F.et al.,(2002)Genes&Dev.,16:2583-2592)。上游启动子提供了RNA聚合酶II(一种多亚基酶)与基础或通用转录因子如TFIIA,B,D,E,F和H的作用位点。这些因子组装成转录前起始复合体，其催化从DNA模板合成RNA。

上游启动子的激活通过调节性DNA序列元件的额外序列实现，各种蛋白质与该额外序列结合并随后与转录起始复合体接触从而激活基因表达。这些基因调节元件序列与特定的DNA结合因子相互作用。这些序列基序有时被称作顺式元件。这样的顺式元件与组织特异性或发育特异性转录因子结合，它们单独或者组合地可以在转录水平上决定启动子的时空表达模式。这些顺式元件在对可操作连接基因的控制类型方面可以有很大不同。一些元件会响应环境响应(例如温度、湿度、和伤口)使可操作连接基因的转录增加。其它顺式元件可以响应发育提示(例如萌发、种子成熟和开花)或者响应空间信息(例如组织特异性)。参见例如Langridge et al.,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:3219-23。这些顺式元件与转录起始点的距离各不相同，一些顺式元件(称作邻近元件)与最小核心启动子区域毗邻，而其它元件可以位于启动子上游或下游数千碱基的位置(增强子)。

“DNA结合转基因”是编码DNA结合蛋白的多核苷酸编码序列。DNA结合蛋白随后能够结合另一个分子。结合蛋白能够结合，例如，DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)，和/或蛋白分子(蛋白质结合蛋白)。在蛋白质结合蛋白的情况下，它能够结合自身(形成同源二聚体、同源三聚体，等)和/或它能够结合一个或多个不同的蛋白分子。结合蛋白可以具有超过一种结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合和蛋白结合活性。

DNA结合蛋白的实例包括：大范围核酸酶、锌指、CRISPR和TALE结合结构域，它们能够被“工程化”而结合预定的核苷酸序列。典型地，工程化的DNA结合蛋白(例如锌指、CRISPR或TALE)是非天然存在的蛋白质。用于工程化DNA结合蛋白的方法的非限制性实例是设计和选择。设计的DNA结合蛋白是自然界中不存在的蛋白质，其设计/组成主要缘自合理的标准(rationalcriteria)。用于设计的合理标准包括应用替换规则(substitution rule)和计算机化算法对存储现有ZFP，CRISPR，和/或TALE设计和结合数据的数据库中的信息进行处理。参见例如美国专利6,140,081；6,453,242；和6,534,261；另见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496和美国公开No.20110301073,20110239315和20119145940。

“锌指DNA结合蛋白”(或结合结构域)是通过一个或多个锌指以序列特异性的方式结合DNA的蛋白质或较大蛋白质的结构域，其中锌指是结合结构域中其结构通过锌离子的配位而被稳定化的氨基酸序列区域。术语“锌指DNA结合蛋白”经常缩写为锌指蛋白或ZFP。锌指结合结构域可以被“工程化”而结合预定的核苷酸序列。用于工程化锌指蛋白的方法的非限制性实例是设计和选择。设计的锌指蛋白是在自然界中不存在的蛋白，其设计/组成主要来自合理的标准。用于设计的合理标准包括应用替换规则(substitutionrule)和计算机化算法对存储现有ZFP设计和结合数据的数据库中的信息进行处理。参见例如美国专利6,140,081；6,453,242；6,534,261和6,794,136；另见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。

在其它实例中，一个或多个核酸酶的DNA结合结构域包括天然存在的或工程化的(非天然存在的)TAL效应物DNA结合结构域。参见例如美国公开No.20110301073。黄单胞菌属的植物病原菌已知会在重要作物中导致多种疾病。黄单胞菌的致病性依赖于一种保守的III型分泌(T3S)系统，其向植物细胞内注入多种不同的效应物蛋白。这些注射的蛋白包括转录激活子样(TALEN)效应物，其模拟植物转录激活子并操控植物的转录组(见Kay et al.,(2007)Science 318:648-651)。这些蛋白含有DNA结合结构域和转录激活结构域。其中一种最良好表征的TAL效应物是来自野油菜黄单胞菌病原变种Vesicatoria的AvrBs3(见Bonas et al.,(1989)Mol Gen Genet 218:127-136和WO2010079430)。TAL效应物含有一种由串联重复构成的中心结构域，每个重复含有大约34个氨基酸，这些重复对于这些蛋白质的DNA结合特异性是关键的。此外，它们含有核定位序列和酸性转录激活结构域(综述见SchornackS,et al.,(2006)J Plant Physiol 163(3):256-272)。此外，在植物病原细菌青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)中，已经发现了两个基因，命名为brg11和hpx17，与青枯雷尔氏菌生物型菌株GMI1000和生物型4菌株RS1000的黄单胞菌AvrBs3家族同源(参见Heuer et al.,(2007)Appl and Enviro Micro73(13):4379-4384)。这些基因彼此之间的核苷酸序列有98.9％相同，差异在于hpx17的重复结构域中有1,575bp的缺失。然而，两种基因产物与黄单孢菌AvrBs3家族蛋白的序列同一性均小于40％。参见例如美国专利公开No.20110301073。

这些TAL效应物的特异性取决于在串联重复序列中发现的序列。重复序列包含大约102bp并且各重复序列之间通常有91-100％的同源性(Bonas etal.,同上)。重复序列的多态性通常位于12位和13位，并且12位和13位的超变残基的身份与TAL效应物的靶序列中连续核苷酸的身份之间似乎是一一对应的(参见Moscou and Bogdanove,(2009)Science 326:1501和Boch et al.,(2009)Science 326:1509-1512)。在实验上，对于这些TAL效应物的DNA识别的天然密码已经被确定：12和13位的HD序列导致与胞嘧啶(C)结合，NG结合T，NI结合A、C、G或T，NN结合A或G，和ING结合T。这些DNA结合性重复序列已经被组装成具有新的重复序列组合和数目的蛋白质，并制造出了能够在植物细胞中与新序列相互作用并激活非内源性报告基因表达的人工转录因子(Boch et al.,同上)。已经有人把工程化的TAL蛋白连接到FokI切割半结构域，从而产生TAL效应物结构域核酸酶融合物(TALEN)，该融合物在酵母报告测定(基于质粒的靶)中显示活性。

CRISPR(成簇的、规律间隔的短回文重复序列)/CAS(CRISPR相关)核酸酶系统是新近被工程化的、基于可用于基因组工程化的细菌系统的核酸酶系统。它部分地基于许多细菌和古细菌的适应性免疫应答。当病毒或质粒侵入细菌时，入侵者DNA的区段通过“免疫”响应被转化成CRISPR RNA(crRNA)。然后，这种crRNA通过部分互补的区域与称作tracrRNA的另一种类型的RNA关联，引导Cas9核酸酶到靶DNA中称作“原间隔物(protospacer)”的与crRNA同源的区域。Cas9切割该DNA，从而在crRNA转录本内含有的20-核苷酸引导序列所指定的位点处在双链断裂(DSB)处产生平末端。Cas9同时需要crRNA和tracrRNA才能进行位点特异性的DNA识别和切割。这个系统现在已经被工程化，使得crRNA和tracrRNA可以被组合成一个分子(“单引导RNA”)，并且该单引导RNA的crRNA等价部分可以被工程化从而将Cas9核酸酶引导到任何期望序列的靶标(参见Jinek et al.,(2012)Science 337,816-821页,Jinek et al.,(2013),eLife 2:e00471,和David Segal,(2013)eLife2:e00563)。因此，CRISPR/CAS系统可以被工程化，从而在基因组的期望靶点处创建DSB，并通过使用修复抑制剂影响DSB的修复从而增加容易出错的修复。

在其它实例中，DNA结合转基因是位点特异性的核酸酶，其包括工程化的(非天然存在的)大范围核酸酶(也称作归巢核酸内切酶)。归巢核酸内切酶或大范围核酸酶的识别序列如I-SceI,I-CeuI,PI-PspI,PI-Sce,I-SceIV,I-CsmI,I-PanI,I-SceII,I-PpoI,I-SceIII,I-CreI,I-TevI,I-TevII和I-TevIII是已知的。另见美国专利5,420,032；美国专利6,833,252；Belfort et al.,(1997)NucleicAcids Res.25:3379–30 3388；Dujon et al.,(1989)Gene 82:115–118；Perler et al.,(1994)Nucleic Acids Res.22,11127；Jasin(1996)Trends Genet.12:224–228；Gimble et al.,(1996)J.Mol.Biol.263:163–180；Argast et al.,(1998)J.Mol.Biol.280:345–353和New England Biolabs目录。此外，归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性可以人为改变，从而结合非天然的靶位点。参见例如Chevalier et al.,(2002)Molec.Cell 10:895-905；Epinat et al.,(2003)Nucleic Acids Res.5 31:2952-2962；Ashworth et al.,(2006)Nature 441:656-659；Paques et al.,(2007)Current Gene Therapy 7:49-66；美国专利公开No.20070117128。归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA结合结构域可以与其核酸酶背景作为一个整体加以改变(即，使得核酸酶包含同源切割结构域)，或者可以和异源切割结构域融合。

如本文所使用的，术语“转化”包括所有能够将核酸分子引入到细胞内的技术。实例包括，但不仅限于：病毒载体转染；质粒载体转化；电穿孔；脂质体转染；显微注射(Mueller et al.(1978)Cell 15:579-85)；土壤杆菌介导的转移；直接DNA摄入；WHISKERS^TM介导的转化；和生物射弹。这些技术可同时用于植物细胞的稳定转化和瞬时转化。“稳定转化”是指核酸片段引入到宿主生物体的基因组内，导致在遗传上稳定的继承。一旦被稳定转化，核酸片段便稳定地整合进宿主生物体和任何后代的基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”生物。“瞬时转化”是指核酸片段被引入到宿主生物体的细胞核或含DNA的细胞器中，引起基因表达但不会在遗传上稳定的继承。

如本文所使用的，术语“转导”是指病毒将核酸转移到细胞内的过程。

如本文所使用的，术语“转基因”是指外源核酸序列。在一个实例中，转基因是基因序列(例如，除草剂抗性基因)，编码工业或制药上有用的化合物的基因，或者编码期望农艺学性状的基因。在另外的实施例中，转基因是小RNA，例如反义核酸序列，其中该小RNA序列的表达会抑制靶核酸序列的表达。转基因可以含有与转基因可操作连接的调节序列(例如，启动子、内含子或3’-UTR)。在一些实施方案中，感兴趣的核酸是转基因。然而，在其它实施方案中，感兴趣的核酸是内源核酸，其中内源核酸的额外基因组拷贝是期望的，或者是与宿主生物体中靶核酸序列处于反义取向的核酸。

如本文所使用的，术语“小RNA”指多种类型的非编码核糖核酸(ncRNA)。术语小RNA描述的是在细菌细胞、动物、植物和真菌中产生的ncRNA短链。这些ncRNA短链可以在细胞内自然产生，或者可以通过引入表达短链或ncRNA的外源序列而产生。小RNA序列不直接编码蛋白质，而且在功能上与其它RNA有差异，体现在小RNA序列仅被转录而不被翻译。小RNA序列参与其它细胞功能，包括基因表达和修饰。小RNA分子通常由大约20-30个核苷酸组成。小RNA序列可以从较长的前体得到。前体在自我互补的区域内会形成彼此回折的结构；它们然后被动物中的核酸酶切丁酶(Dicer)或者植物中的核酸酶DCL1加工处理。

有许多类型的小RNA天然存在或者人工产生，包括微小RNA(miRNA)，短干扰RNA(siRNA)，反义RNA，短发夹RNA(shRNA)，和小核仁RNA(snoRNA)。某些类型的小RNA，例如微小RNA和siRNA，在基因沉默和RNA干扰(RNAi)中是重要的。基因沉默是一种基因调控过程，其中通常被表达的基因被细胞内元件(在这种情况下，是小RNA)所“关闭”。在正常情况下由该遗传信息形成的蛋白质由于干扰而不会形成，并且该基因中编码的信息被阻断而不能表达。

如本文所使用的，术语“小RNA”包括下列文献中描述的RNA分子，如“小RNA(tiny RNA)”(Storz,(2002)Science 296:1260-3；Illangasekare et al.,(1999)RNA 5:1482-1489)；原核“小RNA”(sRNA)(Wassarman et al.,(1999)Trends Microbiol.7:37-45)；真核“非编码RNA(ncRNA)”；“微RNA(miRNA)”；“小非mRNA(snmRNA),”“功能性RNA(fRNA),”“转运RNA(tRNA),”“催化性RNA”[例如核酶，包括自催化核酶(Illangaskare et al.,(1999)RNA5:1482-1489)；“小核仁RNA(snoRNAs),”“tmRNA”(也称作“10S RNA,”Mutoet al.,(1998)Trends Biochem Sci.23:25-29；和Gillet et al.,(2001)MolMicrobiol.42:879-885)；RNAi分子，包括但不仅限于，“小干扰RNA(siRNA),”“核酸内切酶制备的siRNA(e-siRNA),”“短发夹RNA(shRNA),”和“小时间调节的RNA(stRNA),”“切丁的(diced)siRNA(d-siRNA),”和适体、寡核苷酸和其它包含至少一个尿嘧啶碱基的合成核酸。

如本文所使用的，术语“载体”是指被引入到细胞内从而产生转化细胞的核酸分子。载体可以包括允许它在宿主细胞内复制的核酸序列，例如复制起点。实例包括，但不仅限于，质粒、粘粒、噬菌体、细菌人工染色体(BAC)，或可携带外来DNA进入细胞的病毒。载体还可以包括一个或多个基因、反义分子和/或选择标志物基因和本领域已知的其它遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，借此导致细胞表达核酸分子和/或由该载体编码的蛋白质。载体可以任意地包括帮助核酸分子进入细胞内的材料(例如脂质体)。

如本文所使用的，术语“盒”、“表达盒”和“基因表达盒”是指能够被插入到核酸或多核苷酸的特定限制位点处或者通过同源重组被插入的DNA区段。如本文所使用的，该DNA区段包括含有编码感兴趣的小RNA或多肽的感兴趣基因的多核苷酸，并且该盒和限制位点的设计确保盒以正确的阅读框被插入，以保证转录和翻译。在一个实施方案中，表达盒可包括编码感兴趣的小RNA或多肽的多核苷酸，并除该多核苷酸之外可具有其他元件以促进特定宿主细胞的转化。在一个实施方案中，基因表达盒还可以包括如下元件，其允许在宿主细胞中增强编码感兴趣的小RNA或多肽的多核苷酸的表达。这些元件可以包括，但不仅限于：启动子，最小启动子，增强子，应答元件，内含子，5'非翻译区序列，3'非翻译区序列，终止子序列，多聚腺苷酸化序列，等。

如本文所使用的，术语“异源编码序列”用于指示任何这样的多核苷酸，其编码或者最终编码在宿主生物体中通常不存在、并且在合适的条件下能够在宿主细胞中表达的肽或蛋白质或其等价氨基酸序列，例如酶。故而，“异源编码序列”可以包括一个或多个拷贝的在宿主细胞中通常不存在的编码序列，从而使细胞表达额外拷贝的在细胞中通常不存在的编码序列。异源编码序列可以是RNA或者其任何类型例如mRNA；DNA或其任何类型如cDNA，或RNA/DNA杂交体。编码序列的实例包括但不限于全长转录单元，其包括例如编码序列、内含子、启动子区、5′-UTR、3′-UTR和增强子区等特征。

“异源编码序列”还包括肽或酶的编码部分，即肽或酶的cDNA或mRNA序列，以及全长转录单元的编码部分，即包含内含子和外显子的基因，以及编码酶或编码其等价氨基酸序列的“密码子优化”序列、截短的序列和其它形式的变化序列，只要该等价氨基酸序列可产生功能性蛋白。这样的等价氨基酸序列可以具有一个或多个氨基酸缺失，该缺失可在N端、C端或内部。也包括截短的形式，只要它们具有本文所述的催化能力即可。

如本文所使用的，术语“对照”是指在分析程序中用于比较目的的样品。对照可以是“阳性”或“阴性”。例如，当分析程序的目的是检测细胞或组织中差异表达的转录本或多肽时，一般优选地包含阳性对照，例如来自已知显示期望表达的植物的样品，和阴性对照，例如来自已知缺少期望表达的植物的样品。

如本文所使用的，术语“植物”包括整株植物和植物部分，包括但不仅限于，植物细胞和植物组织，例如叶、茎、根、花、花粉和种子。可以在本发明中使用的植物类别一般广泛地包括适合于诱变的高等和低等植物，包括被子植物，裸子植物，蕨类植物和多细胞藻类。因此，“植物”包括双子叶和单子叶植物。双子叶植物的实例包括烟草，拟南芥，大豆，番茄，木瓜，芥花(canola)，向日葵，棉花，苜蓿，马铃薯，葡萄，木豆，豌豆，芸苔属(Brassica)，鹰嘴豆，甜菜，油菜，西瓜，甜瓜，辣椒，花生，南瓜，萝卜，菠菜，倭瓜，西兰花，卷心菜，胡萝卜，花椰菜，芹菜，大白菜，黄瓜，茄子，和生菜。单子叶植物的实例包括玉米，大米，小麦，甘蔗，大麦，黑麦，高粱，兰花，竹，香蕉，香蒲，百合，燕麦，洋葱，小米和黑小麦。

如本文所使用的，术语“植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、插枝、细胞或组织培养物，或者植物的任何其它部分或产物。在一个实施方案中，植物材料包括子叶和叶。在一个实施方案中，植物材料包括根组织和其它位于地下的植物组织。

如本文所使用的，术语“选择标志物基因”是指在植物转化中被任选地用于例如保护植物细胞免于选择剂的伤害或者提供对选择剂的抗性/耐受性的基因。此外，“选择标志物基因”包括报告基因。只有那些接受了功能性可选择标志物的细胞或植物才能够在具有选择剂的条件下分裂或生长。选择剂的实例包括，例如，抗生素，包括壮观霉素，新霉素，卡那霉素，巴龙霉素，庆大霉素，和潮霉素。这些选择标志物包括新霉素磷酸转移酶基因(npt II)，其表达的酶可赋予对卡那霉素抗生素的抗性，和以及针对相关抗生素新霉素、巴龙霉素、庆大霉素和G418的基因，或者潮霉素磷酸转移酶(hpt)的基因，其表达的酶可赋予对潮霉素的抗性。其它选择标志物基因可以包括编码除草剂抗性的基因，包括bar或pat(抵抗草铵膦铵盐或草胺膦)，乙酰乳酸合成酶(ALS，抵抗抑制剂例如磺酰脲类(SU)，咪唑啉酮类(IMI)，三唑并嘧啶(TP)，嘧啶氧基苯甲酸(pyrimidinyloxybenzoate)(POB)，和磺酰羰基三唑啉酮，其可阻止支链氨基酸合成的第一步，草甘膦，2,4-D和金属抗性或敏感性。可以用来作为选择标志物基因的“报告基因”的实例包括可以视觉观察所表达报告基因的蛋白，例如编码β葡糖苷酸酶(GUS)、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白蛋白(YFP)、DsRed、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、碱性磷酸酶和类似物的蛋白质。短语“标志物阳性”是指已经被转化为包含选择标志物基因的植物。

如本文所使用的，术语“可检测标志物”是指能够检测的标志物，例如放射性同位素，荧光化合物，生物发光化合物，化学发光化合物，金属螯合剂，或酶。可检测标志物物的实例包括但不限于下述者：荧光标志物(例如，FITC，罗丹明，镧系磷光体)，酶标志物(例如辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，萤光素酶，碱性磷酸酶)，化学发光，生物素基团，可以被第二报告分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列，第二抗体的结合位点，金属结合结构域，附加表位)。在一个实施方案中，可检测标志物可以介由各种长度的间隔臂附接，以便减少潜在的空间位阻。

如本文所使用的，术语“检测”使用其最广泛的含义，包括对特定分子的定性和定量测量，例如对特定多肽的测量。

除非另有具体说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域普通技术人员所公知的相同的含义。分子生物学常用术语的定义可以在列文献中找到，例如：Lewin,Genes V,Oxford University Press,1994；Kendrew et al.(编辑),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell ScienceLtd.,1994；和Meyers(编辑),Molecular Biology and Biotechnology:AComprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995。

调节元件

用于基础研究和生物技术应用的植物启动子一般是单向的，仅指导融合在其3’端(下游)的转基因的表达，从而在植物内强烈表达转基因，用于代谢工程化和性状堆叠。因此，需要有能够在转基因作物中驱动多个基因表达的新型启动子。本文公开的启动子能够指导融合在其3’端(下游)的第一基因的表达。

转基因产品的开发日益复杂，要求强表达转基因并在单个基因座中堆叠多个转基因。传统上，每个转基因的表达通常需要独特的启动子，需要多个启动子以表达一个基因堆叠内的不同转基因。随着基因堆叠规模的增加，这往往导致人们为了表达单一多基因性状而重复使用相同的启动子，以期获得不同转基因的表达模式的相似水平。已知受相同启动子驱动的多基因构建体会导致基因沉默，导致转基因产物在大田中有效的效力降低。由于启动子重复而产生的过多的转录因子(TF)结合位点会导致内源TF的枯竭，从而使转录失活。转基因沉默很可能对为表达转基因而产生的转基因植物的性能带来不利影响。转基因内的重复序列会导致基因座位内的同源重组，进而导致多核苷酸重排。

组织特异性(即，组织优先型)或器官特异性启动子驱动基因在某些组织中表达，例如在植物的果仁(kernel)、根、叶或绒毡层(tapetum)。组织和发育阶段特异性启动子驱动基因在植物发育过程中在特定的组织或者特定的时期表达。转基因植物产业中的某些应用需要组织特异性启动子，组织特异性启动子的可取之处在于它们允许异源基因以组织和/或发育阶段选择性的方式特异性表达，以不同方式指示异源基因在某一器官、组织和/或时间的表达，而不在其他器官、组织和/或时间表达。例如，通过用病原体抗性基因转化植物基因组，使病原体抗性蛋白在植物根部强烈表达，可以增加植物对土壤传播的病原体感染的抗性。或者，在处于特定生长或发育阶段(例如细胞分裂或伸长期)的植物组织中表达转基因可能是可取的。另一个应用是使用组织特异性启动子的好处，由此例如可以将编码农学性状的转基因的表达限制在发育中的木质部中。在鉴定组织特异性启动子中现存的一个特别的问题是如何确定潜在的最重要的基因及其相应的启动子，以及如何将它们与细胞的特定发育特性相关联。另一个问题是克隆所有相关的顺式作用转录控制元件，从而使克隆的DNA片段以期望的特异表达方式驱动转录。考虑到这样的控制元件的位置远离翻译启动或起始位点，选用来包含启动子的多核苷酸的大小对于提供启动子多核苷酸序列的表达水平和表达模式具有重要意义。一个特别的问题是鉴定与植物的特定细胞类型、发育阶段和/或功能相关、并且在其它植物组织中不表达的组织特异性启动子。

提供了使用玉米叶绿素a/b结合基因启动子调节元件在植物中表达转基因的方法和构建体。在一个实施方案中，启动子可以是全长的玉米叶绿素a/b结合基因启动子：

GCACAAAATACATAAAACTAGATTAGAAAAGGAAGAGAATACGCCAAATTGCAGCTTAATCAATTAGACGATTTAGTCCTGTTTTTACGAAACAATTGTTTAAGATAACATTAGGACATGTACAATATGTGTCTTTGGATGTGTTTAAGGAGTAAATGTAAAAAAAATAGATACGTCTCTTAACGAAGTCATTGTGTCTTGGCTCTATGCTCGAGACGGAGAAATAGCTAATTGATTAATTTAATTTATTGAATGTTCTTATTGGTGTAATGAATATAGTAAGGCACTGGCCTTATACTTGGAGTTTGGCATGTCTTATGCTATGTTGCAAACAGGCCCGGTCTTGACATTTCGGGGGCCCTAAGAGAAAATTTATATAGAGGTCCTATACGAAAATTTGAGTCTGTTATTTTTTCAACTTTTAAATAATATATGAAAAATAAAAAATTGATGATTTACATAATTTTATTCAAAATGATATGACTGGAAATATTGTTACAGTATTTTATGAGTCGTAAAATTATATAAATTATGTAATATACATTTGTTTTGACTTTTGAGAGAGTATTTTTACTTTTAATTTGTCAAACTAGCCTAAACCTTAAAATACACAGTAAACCAAATCTAAATACATTAGATCAAATTTTCTGAAAATAAAGTTCAGCAAACTAAACTAGGATTAATCAATGTAGGTTATTAGGGTCGACCCTTCGGTAGGCTAGAATTAAGCAACGCGATAGGCACAGGTGTACAACACCTTTCGTCCTTCCCACGTCAATTTTAGGGCCTGTTTGGTTCACGGCTAATTATGCCACACTTTGCCTAAGGTTAGTCGTCCGAATTGAAGAACTAACCTTATGCAGAAAAGTTAGGCAAAGTATGGCAAGTTAGGTAGTAAACCAAACAGGCCAAAGTATTTGTCATCAAGCAGACGGTTGCGCGACCTCAAAGAGATGATTGCTAGAAAATAAAGAGACGCAACAAAAGAATGAAAATATAGATTTATCTATAACTTATATGCATTTGATATAAGATAGATAAATGGGAGCCCTACGAACCTTGAGGCTCTGAGCAGTCGCATATCCTGCACACCCTTGGCGCCGGCCCTGGTTGCAAATATGCAATTGTGTCCTTATCCGCGACTGGTCACGAGGCTAGGATTGATCGAAAGCTGCCGATGAGAAATGGCAAGGGCGGCATGCTGTGGCCTTTTTTTTACGGTCTGTCAGGACAACTGAAAAGTTACAAATTTATAGTGGTTGTAAACAGCAACACGTTAAAAAGTCGATTATCAGTTTCACAGAAAGAGGTCGTTAAAACCGCCAGCAAGCTTGTTTCACTATCAGTCTGTCGCTAAGACAATCTCTTTCACCAAAAATACAATTTGCTTTCTTGCCGTTGCTTCAAGTGAAAATCTTAATGTTTTAAATTAAAATATGTGGCTCTACGTAGGAAAAAATAATTCAATCGAGTCTCATTTCATAAAAAAAATTTGGTCAAAAAATTATACACCATCTCGCTCAAGTGACTCAAATATACTAAACGGTACTGAGCTGTCTTATAATATAAATTTGATTTACTGTTAGAATATGATGTTTTATGAGTGCACTAAATTCTATAAAATATATTTATTTTTAAATTATAAGATATTTTTATAGGTCTGCTCTTAGAGAGAGCTAAAAAAGAGAGAGGCTGTCTGAAGAAAAATCCATAACCAACGCAAAATCCCGGGCGCCCAATCAGCCTTCTCCGCGGAGATTCCTAGCCTCAGCCAGAGCTACCTCATCTGCGTGAGGCTCCGGTGGCGCCAAGTGTTCCGGCATCCCGGACGCACCAATGGCATCCGAGCAACAGATCTTTTCTGCAACAACGCTTCGCGTCGCGGCGGTGTTTCCCTCCATCTGCTCTGCTCTTTAAATACCTCCGTCGTCTCCTCGTCTCCACAGCATCTCAAGTCTTCACACTCCTCGCCATCACATAAAACCAGTGCAAGCAGAAGCAGCGCA(SEQ ID NO:1)

在一个实施方案中，启动子可以是全长的玉米叶绿素a/b结合基因上游启动子：

GCACAAAATACATAAAACTAGATTAGAAAAGGAAGAGAATACGCCAAATTGCAGCTTAATCAATTAGACGATTTAGTCCTGTTTTTACGAAACAATTGTTTAAGATAACATTAGGACATGTACAATATGTGTCTTTGGATGTGTTTAAGGAGTAAATGTAAAAAAAATAGATACGTCTCTTAACGAAGTCATTGTGTCTTGGCTCTATGCTCGAGACGGAGAAATAGCTAATTGATTAATTTAATTTATTGAATGTTCTTATTGGTGTAATGAATATAGTAAGGCACTGGCCTTATACTTGGAGTTTGGCATGTCTTATGCTATGTTGCAAACAGGCCCGGTCTTGACATTTCGGGGGCCCTAAGAGAAAATTTATATAGAGGTCCTATACGAAAATTTGAGTCTGTTATTTTTTCAACTTTTAAATAATATATGAAAAATAAAAAATTGATGATTTACATAATTTTATTCAAAATGATATGACTGGAAATATTGTTACAGTATTTTATGAGTCGTAAAATTATATAAATTATGTAATATACATTTGTTTTGACTTTTGAGAGAGTATTTTTACTTTTAATTTGTCAAACTAGCCTAAACCTTAAAATACACAGTAAACCAAATCTAAATACATTAGATCAAATTTTCTGAAAATAAAGTTCAGCAAACTAAACTAGGATTAATCAATGTAGGTTATTAGGGTCGACCCTTCGGTAGGCTAGAATTAAGCAACGCGATAGGCACAGGTGTACAACACCTTTCGTCCTTCCCACGTCAATTTTAGGGCCTGTTTGGTTCACGGCTAATTATGCCACACTTTGCCTAAGGTTAGTCGTCCGAATTGAAGAACTAACCTTATGCAGAAAAGTTAGGCAAAGTATGGCAAGTTAGGTAGTAAACCAAACAGGCCAAAGTATTTGTCATCAAGCAGACGGTTGCGCGACCTCAAAGAGATGATTGCTAGAAAATAAAGAGACGCAACAAAAGAATGAAAATATAGATTTATCTATAACTTATATGCATTTGATATAAGATAGATAAATGGGAGCCCTACGAACCTTGAGGCTCTGAGCAGTCGCATATCCTGCACACCCTTGGCGCCGGCCCTGGTTGCAAATATGCAATTGTGTCCTTATCCGCGACTGGTCACGAGGCTAGGATTGATCGAAAGCTGCCGATGAGAAATGGCAAGGGCGGCATGCTGTGGCCTTTTTTTTACGGTCTGTCAGGACAACTGAAAAGTTACAAATTTATAGTGGTTGTAAACAGCAACACGTTAAAAAGTCGATTATCAGTTTCACAGAAAGAGGTCGTTAAAACCGCCAGCAAGCTTGTTTCACTATCAGTCTGTCGCTAAGACAATCTCTTTCACCAAAAATACAATTTGCTTTCTTGCCGTTGCTTCAAGTGAAAATCTTAATGTTTTAAATTAAAATATGTGGCTCTACGTAGGAAAAAATAATTCAATCGAGTCTCATTTCATAAAAAAAATTTGGTCAAAAAATTATACACCATCTCGCTCAAGTGACTCAAATATACTAAACGGTACTGAGCTGTCTTATAATATAAATTTGATTTACTGTTAGAATATGATGTTTTATGAGTGCACTAAATTCTATAAAATATATTTATTTTTAAATTATAAGATATTTTTATAGGTCTGCTCTTAGAGAGAGCTAAAAAAGAGAGAGGCTGTCTGAAGAAAAATCCATAACCAACGCAAAATCCCGGGCGCCCAATCAGCCTTCTCCGCGGAGATTCCTAGCCTCAGCCAGAGCTACCTCATCTGCGTGAGGCTCCGGTGGCGCCAAGTGTTCCGGCATCCCGGACGCACCAATGGCATCCGAGCAACAGATCTTTTCTGCAACAACGCTTCGCGTCGCGGCG(SEQ ID NO:2)

在一个实施方案中，启动子可以是修饰的玉米叶绿素a/b结合基因启动子：

GCACAAAATACATAAAACTAGATTAGAAAAGGAAGAGAATACGCCAAATTGCAGCTTAATCAATTAGACGATTTAGTCCTGTTTTTACGAAACAATTGTTTAAGATAACATGGCCTTATACTTGGAGTTTGGCATGTCTTATGCTATGTTGCAAACAGGCCCGGTCTTGACATTTCGGGGGCCCTAAGAGAAAATTTATATAGAGGTCCTATACGAAAATTTGAGTCTGTTATTTTTTCAACTTTTAAATAATATATGAAAAATAAAAAATTGATGATTTACATAATTTTATTCAAAATGATATGACTGGAAATATTGTTACAGTATTTTATGAGTCGTAAAATTATATAAATTATGTAATATACATTTGTTTTGACTTTTGAGAGAGTATTTTTACTTTTAATTTGTCAAACTAGCCTAAACCTTAAAATACACAGTAAACCAAATCTAAATACATTAGATCAAATTTTCTGAAAATAAAGTTCAGCAAACTAAACTAGGATTAATCAATGTAGGTTATTAGGGTCGACCCTTCGGTAGGCTAGAATTAAGCAACGCGATAGGCACAGGTGTACAACACCTTTCGTCCTTCCCACGTCAATAAAGTATTTGTCATCAAGCAGACGGTTGCGCGACCTCAAAGAGATGATTGCTAGAAAATAAAGAGACGCAACAAAAGAATGAAAATATAGATTTATCTATAACTTATATGCATTTGATATAAGATAGATAAATGGGAGCCCTACGAACCTTGAGGCTCTGAGCAGTCGCATATCCTGCACACCCTTGGCGCCGGCCCTGGTTGCAAATATGCAATTGTGTCCTTATCCGCGACTGGTCACGAGGCTAGGATTGATCGAAAGCTGCCGATGAGAAATGGCAAGGGCGGCATGCTGTGGCCTTTTTTTTACGGTCTGTCAGGACAACTGAAAAGTTACAAATTTATAGTGGTTGTAAACAGCAACACGTTAAAAAGTCGATTATCAGTTTCACAGAAAGAGGTCGTTAAAACCGCCAGCAAGCTTGTTTCACTATCAGTCTGTCGCTAAGACAATCTCTTTCACCAAAAATACAATTTGCTTTCTTGCCGTTGCTTCAAGTGAAAATCTGAGCTAAAAAAGAGAGAGGCTGTCTGAAGAAAAATCCATAACCAACGCAAAATCCCGGGCGCCCAATCAGCCTTCTCCGCGGAGATTCCTAGCCTCAGCCAGAGCTACCTCATCTGCGTGAGGCTCCGGTGGCGCCAAGTGTTCCGGCATCCCGGACGCACCAATGGCATCCGAGCAACAGATCTTTTCTGCAACAACGCTTCGCGTCGCGGCGGTGTTTCCCTCCATCTGCTCTGCTCTTTAAATACCTCCGTCGTCTCCTCGTCTCCACAGCATCTCAAGTCTTCACACTCCTCGCCATCACATAAAACCAGTGCAAGCAGAAGCAGCGCA(SEQ ID NO:3)

在一个实施方案中，启动子可以是修饰的玉米叶绿素a/b结合基因上游启动子：

GCACAAAATACATAAAACTAGATTAGAAAAGGAAGAGAATACGCCAAATTGCAGCTTAATCAATTAGACGATTTAGTCCTGTTTTTACGAAACAATTGTTTAAGATAACATGGCCTTATACTTGGAGTTTGGCATGTCTTATGCTATGTTGCAAACAGGCCCGGTCTTGACATTTCGGGGGCCCTAAGAGAAAATTTATATAGAGGTCCTATACGAAAATTTGAGTCTGTTATTTTTTCAACTTTTAAATAATATATGAAAAATAAAAAATTGATGATTTACATAATTTTATTCAAAATGATATGACTGGAAATATTGTTACAGTATTTTATGAGTCGTAAAATTATATAAATTATGTAATATACATTTGTTTTGACTTTTGAGAGAGTATTTTTACTTTTAATTTGTCAAACTAGCCTAAACCTTAAAATACACAGTAAACCAAATCTAAATACATTAGATCAAATTTTCTGAAAATAAAGTTCAGCAAACTAAACTAGGATTAATCAATGTAGGTTATTAGGGTCGACCCTTCGGTAGGCTAGAATTAAGCAACGCGATAGGCACAGGTGTACAACACCTTTCGTCCTTCCCACGTCAATAAAGTATTTGTCATCAAGCAGACGGTTGCGCGACCTCAAAGAGATGATTGCTAGAAAATAAAGAGACGCAACAAAAGAATGAAAATATAGATTTATCTATAACTTATATGCATTTGATATAAGATAGATAAATGGGAGCCCTACGAACCTTGAGGCTCTGAGCAGTCGCATATCCTGCACACCCTTGGCGCCGGCCCTGGTTGCAAATATGCAATTGTGTCCTTATCCGCGACTGGTCACGAGGCTAGGATTGATCGAAAGCTGCCGATGAGAAATGGCAAGGGCGGCATGCTGTGGCCTTTTTTTTACGGTCTGTCAGGACAACTGAAAAGTTACAAATTTATAGTGGTTGTAAACAGCAACACGTTAAAAAGTCGATTATCAGTTTCACAGAAAGAGGTCGTTAAAACCGCCAGCAAGCTTGTTTCACTATCAGTCTGTCGCTAAGACAATCTCTTTCACCAAAAATACAATTTGCTTTCTTGCCGTTGCTTCAAGTGAAAATCTGAGCTAAAAAAGAGAGAGGCTGTCTGAAGAAAAATCCATAACCAACGCAAAATCCCGGGCGCCCAATCAGCCTTCTCCGCGGAGATTCCTAGCCTCAGCCAGAGCTACCTCATCTGCGTGAGGCTCCGGTGGCGCCAAGTGTTCCGGCATCCCGGACGCACCAATGGCATCCGAGCAACAGATCTTTTCTGCAACAACGCTTCGCGTCGCGGCG(SEQ ID NO:4)

在一个实施方案中，基因表达盒包括启动子。在一个实施方案中，该启动子是本主题公开的玉米叶绿素a/b结合基因启动子。在一个实施方案中，基因表达盒包括启动子，其中该启动子与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,或SEQ ID NO:4至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。在一个实施方案中，基因表达盒包括玉米叶绿素a/b结合基因启动子，其与转基因可操作连接。在一个实施方案中，基因表达盒包括玉米叶绿素a/b结合基因启动子，其可以驱动两个或更多个转基因的表达。在一个例证性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。

转基因的表达也可以被位于启动子序列下游的内含子区调节。启动子和内含子都能够调节转基因的表达。启动子是驱动转录必需的，而内含子的存在可以增加表达水平，导致产生mRNA转录本以供翻译和蛋白质合成。内含子基因区帮助转基因的稳定表达。

在一个实施方案中，基因表达盒包括内含子。在一个实施方案中，基因表达盒包括来自玉米叶绿素a/b结合基因的内含子。在一个实施方案中，内含子可以是玉米叶绿素a/b结合基因内含子(1)：

GTGTTTCCCTCCATCTGCTCTGCTCTTTAAATACCTCCGTCGTCTCCTCGTCTCCACAG(SEQ ID NO:5)

在一个实施方案中，内含子可以是玉米叶绿素a/b结合基因内含子(2)：

GTGGAGGCGCCACCGCCCACCGGCCACCGCTGCGGATATCTAG(SEQ ID NO:6)

在一个实施方案中，基因表达盒包括内含子，其中该内含子与SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。在一个实施方案中，基因表达盒包括与启动子可操作连接的来自玉米叶绿素a/b结合基因的内含子，其中该启动子是玉米基因启动子，或者是来自植物(例如，玉米叶绿素结合基因启动子或玉米泛素1启动子)、病毒(例如木薯花叶病毒启动子)或者细菌(例如根癌土壤杆菌delta mas)的启动子。在一个例证性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的来自玉米叶绿素a/b结合基因的内含子，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。

转基因表达还可以被位于基因编码序列下游的3’-非翻译基因区(即3’-UTR)调节。启动子和3’-UTR均调节转基因表达。虽然启动子是驱动转录必需的，但3’-UTR基因区能够终止转录并引发所得mRNA转录本的多聚腺苷酸化，以用于翻译和蛋白质合成。3’-UTR基因区帮助转基因的稳定表达。在一个实施方案中，3’-UTR可以是全长玉米叶绿素a/b结合基因的3’-UTR：

GGGGGTGGAGGCGCCACCGCCCACCGGCCACCGCTGCGGATATCTAGGTGTTCGGATGCACGTGAGCGCGCACTGGTTCCAGTTTGTACCATGATGTAAATTACTTACCGTACCAGGGTTCAATCGGCAAGGAAGAATTGTTGTGTTCACTGTCTTGGGCAGTCTCTTGGTCCAATATGAATCAACTTACACAGCATCTCCAAAAACTTCTAAAATTACTAGCTGAATGCCCGTGCGTTGCAACGGGAATATATAATACCAGTATACTACGATAACTTATATACAAAATGTATGTTATATCGTTATGAGAAAATGTTTCATAACCAATTTATGATTCTGGTCATACATAAATTTTGTTATTTATAGTCTATCTGTTTCACCACTACATTGCAACCATCAGTATCATGCAGACTTCGATATATGTTACGATTTGTATGGTCTCATTATTGGAGAGCACGTTCCACACATACCGGAAGAAATTTTCTCGTACATCGTTAGTCATCAGACACGTACCACCATACACTTTTGCTTAAACAAAAATGCAAGTGTGTGTTTGCGAAGAGAATTAAAGGCAAGTCGACACAAAAGCTACCCCAACGGTGGCGAGGATGACGAACTGGTCATTTTTGTCGGTCCTCCCCTGCGTCACCTCTGGCGCCAAGATGACGCCATAGTCCTCGATATAGTAATCGTCGAACGCGCGCGACATACCGAGTACTGATGACTCTTGGCTGGGCTGTAAAACGAAGTGCACCCCGGGCTCATCAGCAAGGTAGTACCCCTGGTCGTTGCACTACCGGATGCGCTACTACTCTACATGCATCGTGTTCGAGGATACTCATACAACGTCAGCAACGGCTATCGTCTCAGTGCACAAGAATTCATGCCTAGTCAGTAGCGACTTACGTGGCTGGTTGGGCTTCAGGTGAACGATGAGCTGGACAACGTGATGGCGTCGTCGTCGAATGCAGTGCCCAGAACAACCCGAAAGTCGCCGACG(SEQ ID NO:7)

在一个实施方案中，3’-UTR可以是修饰的玉米叶绿素a/b结合基因的3’-UTR：

GGGGGTGGAGGCGCCACCGCCCACCGGCCACCGCTGCGGATATCTAGGTGTTCGGATGCACGTGAGCGCGCACTGGTTCCAGTTTGTACCATGATGTAAATTACTTACCGTACCAGGGTTCAATCGGCAAGGAAGAATTGTTGTGTTCACTGTCTTGGGCAGTCTCTTGGTCCAATATGAATCAACTTACACAGCATCTCCAAAAACTTCTAAAATTACTAGCTGAATGCCCGTGCGTTGCAACGGGAATATATAATACCAGTATACTACGATAACTTATATACAAAATGTATGTTATATCGTTATGAGAAAATGTTTCATAACCAATTTATGATTCTGGTCATACATAAATTTTGTTATTTATAGTCTATCTGTTTCACCACTACATTGCAACCATCAG(SEQ ID NO:8)

在一个实施方案中，基因表达盒包括3’-UTR。在一个实施方案中，3’-UTR可以是玉米叶绿素a/b结合基因的3’-UTR。在一个实施方案中，基因表达盒包括3’-UTR，其中该3’-UTR与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。在一个实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因的3’-UTR。在一个例证性实施方案中，基因表达盒包括来自与转基因可操作连接的3’-UTR，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，基因表达盒包括从玉米叶绿素a/b结合基因纯化的启动子、内含子和3’-UTR。在一个实施方案中，基因表达盒包括：a)启动子，其中该启动子与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,或SEQ ID NO:4至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同；b)内含子，其中该内含子与SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同；和/或c)3’-UTR，其中该3’-UTR与SEQ ID NO:7或SEQID NO:8至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。

例如，基因表达盒可以包括启动子和3’-UTR二者，其中该启动子是SEQID NO:1的多核苷酸，3’-UTR是SEQ ID NO:7的多核苷酸。在另一个实施方案中，基因表达盒可以包括启动子和3’-UTR二者，其中该启动子是SEQ IDNO:1的多核苷酸，3’-UTR是SEQ ID NO:8的多核苷酸。在后续的实施方案中，基因表达盒可以包括启动子和3’-UTR二者，其中该启动子是SEQ ID NO:2的多核苷酸，3’-UTR是SEQ ID NO:7的多核苷酸。在另外一个实施方案中，基因表达盒可以包括启动子和3’-UTR二者，其中该启动子是SEQ ID NO:2的多核苷酸，3’-UTR是SEQ ID NO:8的多核苷酸。

在进一步的实施方案中，基因表达盒可以包括启动子和3’-UTR二者，其中该启动子是SEQ ID NO:3的多核苷酸，3’-UTR是SEQ ID NO:7的多核苷酸。在另外一个实施方案中，基因表达盒可以包括启动子和3’-UTR二者，其中该启动子是SEQ ID NO:3的多核苷酸，3’-UTR是SEQ ID NO:8的多核苷酸。在一个实施方案中，基因表达盒可以包括启动子和3’-UTR二者，其中该启动子是SEQ ID NO:4的多核苷酸，3’-UTR是SEQ ID NO:7的多核苷酸。在另外一个实施方案中，基因表达盒可以包括启动子和3’-UTR二者，其中该启动子是SEQ ID NO:4的多核苷酸，3’-UTR是SEQ ID NO:8的多核苷酸。

在另一个实施方案中，基因表达盒可以包括启动子、内含子和3’-UTR，其中该启动子是SEQ ID NO:1的多核苷酸，内含子是SEQ ID NO:5的多核苷酸，3’-UTR是SEQ ID NO:7的多核苷酸。在进一步的实施方案中，基因表达盒可以包括启动子、内含子和3’-UTR，其中该启动子是SEQ ID NO:1的多核苷酸，内含子是SEQ ID NO:5的多核苷酸，3’-UTR是SEQ ID NO:8的多核苷酸。在额外的实施方案中，基因表达盒可以包括启动子、内含子和3’-UTR，其中该启动子是SEQ ID NO:3的多核苷酸，内含子是SEQ ID NO:5的多核苷酸，3’-UTR是SEQ ID NO:7的多核苷酸。在进一步的实施方案中，基因表达盒可以包括启动子、内含子和3’-UTR，其中该启动子是SEQ ID NO:3的多核苷酸，内含子是SEQ ID NO:5的多核苷酸，3’-UTR是SEQ ID NO:8的多核苷酸。

在另一个实施方案中，基因表达盒可以包括启动子、内含子和3’-UTR，其中该启动子是SEQ ID NO:2的多核苷酸，内含子是SEQ ID NO:5的多核苷酸，3’-UTR是SEQ ID NO:7的多核苷酸。在进一步的实施方案中，基因表达盒可以包括启动子、内含子和3’-UTR，其中该启动子是SEQ ID NO:2的多核苷酸，内含子是SEQ ID NO:5的多核苷酸，3’-UTR是SEQ ID NO:8的多核苷酸。在额外的实施方案中，基因表达盒可以包括启动子、内含子和3’-UTR，其中该启动子是SEQ ID NO:4的多核苷酸，内含子是SEQ ID NO:5的多核苷酸，3’-UTR是SEQ ID NO:7的多核苷酸。在进一步的实施方案中，基因表达盒可以同时包括启动子、内含子和3’-UTR，其中该启动子是SEQ ID NO:4的多核苷酸，内含子是SEQ ID NO:5的多核苷酸，3’-UTR是SEQ ID NO:8的多核苷酸。

在一个实施方案中，5’-UTR可以是修饰的玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR：

CATCTCAAGTCTTCACACTCCTCGCCATCACATAAAACCAGTGCAAGCAGAAGCAGCGCA(SEQ ID NO:19)

在一个实施方案中，提供核酸构建体，其包括5’-UTR，其中该5’-UTR与SEQ ID NO:19至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。在一个实施方案中，基因表达盒包括5’-UTR。在一个实施方案中，5’-UTR可以是玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR。在一个实施方案中，基因表达盒包括5’-UTR，其中该5’-UTR与SEQ ID NO:19至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。在一个实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR。在一个例证性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的5’-UTR，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，基因表达盒包括从玉米叶绿素a/b结合基因纯化的启动子、内含子和5’-UTR。在一个实施方案中，基因表达盒包括：a)启动子，其中该启动子与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,或SEQ ID NO:4至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同；b)内含子，其中该内含子与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同；和/或c)5’-UTR，其中该5’-UTR与SEQ ID NO:19至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。

例如，基因表达盒可以包括启动子和5’-UTR二者，其中该启动子是SEQID NO:1的多核苷酸，5’-UTR是SEQ ID NO:19的多核苷酸。在随后的实施方案中，基因表达盒可以包括启动子和5’-UTR二者，其中该启动子是SEQ IDNO:2的多核苷酸，5’-UTR是SEQ ID NO:19的多核苷酸。

在进一步的实施方案中，基因表达盒可以包括启动子和5’-UTR二者，其中该启动子是SEQ ID NO:3的多核苷酸，5’-UTR是SEQ ID NO:19的多核苷酸。在另外的实施方案中，基因表达盒可以包括启动子和5’-UTR二者，其中该启动子是SEQ ID NO:4的多核苷酸，5’-UTR是SEQ ID NO:19的多核苷酸。

在另一个实施方案中，基因表达盒可以包括启动子、内含子和5’-UTR，其中该启动子是SEQ ID NO:2的多核苷酸，内含子是SEQ ID NO:5的多核苷酸，5’-UTR是SEQ ID NO:19的多核苷酸。在进一步的实施方案中，基因表达盒可以包括启动子、内含子和5’-UTR，其中该启动子是SEQ ID NO:4的多核苷酸，内含子是SEQ ID NO:5的多核苷酸，5’-UTR是SEQ ID NO:19的多核苷酸。

当基因表达盒包含一个或多个转基因时，启动子、内含子、3’-UTR和/或5’-UTR可以和基因表达盒内的不同转基因可操作连接。在一个例证性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米基因启动子(SEQ ID NO:1,SEQID NO:2,SEQ ID NO:3,或SEQ ID NO:4)，其中该转基因可是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。在一个例证性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米基因启动子(SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,或SEQ ID NO:4)、内含子(SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6)和5’-UTR(SEQ ID NO:19)，其中该转基因可是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。在一个例证性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米基因3’-UTR(SEQ ID NO:7或SEQID NO:8)，其中该转基因可是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。在另一个例证性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米基因5’-UTR(SEQ ID NO:19)，其中该转基因可是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，载体包括如本文所公开的基因表达盒。在一个实施方案中，载体可以是质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体、病毒或者在转化或基因靶向中使用的切离多核苷酸片段，例如供体DNA。

在一个实施方案中，细胞或植物包含如本文公开的基因表达盒。在一个实施方案中，细胞或植物包括含有如本文公开的基因表达盒的载体。在一个实施方案中，载体可以是质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体、或病毒。借此，包含如本文所公开基因表达盒的细胞或植物分别是转基因细胞或转基因植物。在一个实施方案中，转基因植物可以是单子叶植物。在一个实施方案中，转基因单子叶植物可以是，但不仅限于，小麦、水稻、高粱，燕麦，黑麦，香蕉，甘蔗，和小米。在一个实施方案中，转基因植物可以是双子叶植物。在一个实施方案中，转基因双子叶植物可以是，但不仅限于，大豆、棉花、向日葵、和芥花。实施方案还包括来自如本文公开的转基因植物的转基因种子。

在一个实施方案中，基因表达盒包括两个或多个转基因。该两个或多个转基因与如本文公开的玉米叶绿素a/b结合基因启动子、内含子或3’-UTR可操作连接。在一个实施方案中，基因表达盒包括一个或多个转基因。在具有一个或多个转基因的实施方案中，至少一个转基因与本公开的玉米叶绿素a/b结合基因启动子、内含子或3’-UTR可操作连接。

选择标志物

选定的表达载体中可以包含各种选择标志物(也称为报告基因)，以允许鉴定和选择被转化的植物(“转化体”)。有多种方法可供用于确认选择标志物在转化植物中的表达，包括例如DNA测序、PCR(聚合酶链式反应)、Southern印迹、RNA印迹、用于检测从载体表达的蛋白质的免疫学方法，例如介导膦丝菌素抗性的沉淀蛋白，或者视觉观察其它蛋白质，例如编码β葡糖苷酸酶(GUS)、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、DsRed、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、碱性磷酸酶等的报告基因(参见Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,ColdSpring Harbor Press,N.Y.,2001)。

选择标志物基因用于选择被转化的细胞或组织。选择标志物基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物抗性的基因。除草剂抗性基因一般编码对除草剂不敏感的修饰的靶蛋白，或者编码在除草剂在植物中发挥作用之前将其降解或脱毒的酶。例如，已经通过使用编码突变型靶酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因而获得了对草甘膦的抗性。EPSPS的基因和突变体是众所周知的，并且在下文中有进一步的描述。已经通过使用编码pat或DSM-2、腈水解酶、aad-1或aad-12基因的细菌基因实现了对草铵膦、溴苯腈和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的抗性，这些基因可以分别对上述三种除草剂脱毒。

在一个实施方案中，除草剂可以抑制生长点或分生组织，包括咪唑啉酮或磺酰脲，并且用于抵抗/耐受这些除草剂的乙酰羟酸合酶(AHAS)和乙酰乳酸合酶(ALS)等基因是众所周知的。草甘膦耐性基因分别包括突变的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)和dgt-28基因(通过引入重组核酸和/或对天然EPSP基因的各种形式的体内诱变)，aroA基因和草甘膦乙酰转移酶(GAT)基因。对其它含膦化合物的抗性基因包括来自链霉菌属，包括吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)和产绿色链霉菌(Streptomyces viridichromogenes)，的bar基因，和吡啶氧基(pyridinoxy)或苯氧基(phenoxy)丙酸和环己酮(ACC酶抑制剂编码基因)。可赋予对环己二酮和/或芳氧基苯氧基丙酸(aryloxyphenoxypropanoic acid)(包括盖草能，禾草灵，噁唑禾草灵，吡氟禾草灵，精喹禾灵)的抗性的示例性基因包括乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)——Acc1-S1，Acc1-S2和Acc1-S3的基因。在一个实施方案中，除草剂能够抑制光合作用，包括三嗪(psbA和1s+基因)或苄腈(腈水解酶基因)。

在一个实施方案中，选择标志物包括，但不仅限于，编码下述者的基因：新霉素磷酸转移酶II；氰胺水合酶；天冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸合酶；色氨酸脱羧酶；二氢吡啶二羧酸合酶和脱敏的天冬氨酸激酶；bar基因；色氨酸脱羧酶；新霉素磷酸转移酶(NEO)；潮霉素磷酸转移酶(HPT或HYG)；二氢叶酸还原酶(DHFR)；膦丝菌素乙酰转移酶；2,2-二氯丙酸脱卤素酶；乙酰乳酸合酶；5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-磷酸合酶(aroA)；卤代芳腈酶(haloarylnitrilase)；乙酰辅酶A羧化酶；二氢蝶酸合酶(sul I)；和32kD光系统II多肽(psbA)。

实施方案还包括编码对下述者的抗性的基因：氯霉素；甲氨蝶呤；潮霉素；壮观霉素；溴苯腈；草甘膦；和膦丝菌素。

上述的选择标志物基因的列表并不意味着有限制性。本发明可以包含任何报告或选择标志物基因。

选择标志物基因被合成以便在植物中最佳表达。例如，在一个实施方案中，基因的编码序列已经通过密码子优化而修饰，以提高在植物中的表达。选择标志物基因可以被优化以便在特定的植物物种中表达，或者，可以被修饰以便在双子叶或单子叶植物中最佳表达。可以从感兴趣的特定植物物种中以表达量最大的蛋白质的频率最高的密码子中确定出植物优选的密码子。在一个实施方案中，选择标志物基因被设计成在植物中以更高的水平表达，从而产生更高的转化效率。对于植物基因优化的方法是众所周知的。关于合成多核苷酸序列的优化和制造的指导可见于，例如，WO2013016546，WO2011146524，WO1997013402，美国专利6166302和美国专利5,380,831。转基因

公开的方法和组合物可用于在植物基因组中表达多核苷酸基因序列。因此，编码除草剂抗性、昆虫抗性、营养、抗生素或治疗性分子的基因的表达可以被植物启动子驱动。

在一个实施方案中，本公开的玉米叶绿素a/b结合基因调节元件与基因编码多核苷酸序列组合或可操作连接，该基因编码多核苷酸序列可提供对草甘膦或其他除草剂的抗性或耐受性，和/或提供对选择昆虫或疾病的抗性或耐受性，和/或营养增强，和/或改进农艺学特征，和/或提供用于在饲料、食品、工业、医药或其它用途中有用的蛋白质或其它产品。转基因可以在植物基因组中与两个或多个感兴趣的核酸序列“堆叠”。堆叠可以通过例如使用两个或多个事件的常规植物育种实现，用含有感兴趣序列的构建体转化植物，转基因植物的再转化，或者通过同源重组的靶向整合添加新的性状。

这些感兴趣的多核苷酸序列包括，但不仅限于，下面提供的实例：

1.赋予对害虫或疾病抗性的基因或编码序列(例如iRNA)

(A)植物疾病抗性基因。植物防御经常通过植物中疾病抗性基因(R)的产物与病原体中相应的无毒性(Avr)基因的产物的特异相互作用而被激活。可以用克隆的抗性基因转化植物品种，从而工程构建对特定病原体株有抗性的植物。这些基因的实例包括：提供黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)抗性的番茄Cf-9基因(Jones et al.,1994Science 266:789)；，提供丁香假单胞杆菌番茄致病变种抗性的番茄Pto基因，其编码一种蛋白激酶(Martin et al.,1993Science 262:1432)，和提供丁香假单胞菌抗性的拟南芥RSSP2基因(Mindrinoset al.,1994Cell 78:1089)。

(B)苏云金芽孢杆菌蛋白质、其衍生物或以其为模本的人造多肽，例如Btδ-内毒素基因的多核苷酸序列(Geiser et al.,1986Gene 48:109)和植物杀虫(VIP)基因(见，例如，Estruch et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93:5389-94)。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可以从美国典型培养物保藏中心(Rockville,Md.)购得，ATCC登录号为40098，67136，31995和31998。

(C)植物凝集素，例如，多种君子兰(Clivia miniata)甘露糖结合性植物凝集素基因的核苷酸序列(Van Damme et al.,1994Plant Molec.Biol.24:825)。

(D)维生素结合蛋白质，例如亲和素及亲和素同源物，其可用作针对昆虫类害虫的杀幼虫剂。见美国专利No.5,659,026。

(E)酶抑制剂，例如蛋白酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。这些基因的实例包括水稻半胱氨酸蛋白质酶抑制剂(Abe et al.,1987J.Biol.Chem.262:16793)，烟草蛋白酶抑制剂I(Huub et al.,1993Plant Molec.Biol.21:985)，和α-淀粉酶抑制剂(Sumitani et al.,1993Biosci.Biotech.Biochem.57:1243)。

(F)昆虫特异性激素或信息素，例如蜕皮激素和保幼激素或其变体、基于它们的模拟物，或其拮抗剂或激动剂，例如杆状病毒表达的克隆保幼激素酯酶，保幼激素的失活子(Hammock et al.,1990Nature 344:458)。

(G)昆虫特异性肽或神经肽，其在表达时会扰乱受影响的害虫的生理机能(J.Biol.Chem.269:9)。这些基因的实例包括昆虫利尿激素受体(Regan,1994)，在太平洋折翅蠊(Diploptera punctata)中鉴定的咽侧体抑制素(allostatin)(Pratt,1989)，和昆虫特异性麻痹神经毒素(美国专利No.5,266,361)。

(H)在自然界中由蛇、马蜂等产生的昆虫特异性毒液，例如蝎子昆虫毒性肽(Pang,1992Gene 116:165)。

(I)负责超富集单萜、倍半萜、甾体、异羟肟酸、苯丙烷衍生物或其它具有杀虫活性的非蛋白质分子的酶。

(J)参与生物活性分子修饰(包括翻译后修饰)的酶；例如糖酵解酶、蛋白质水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶，无论是天然的还是人造的。这些基因的实例包括马蹄莲(callas)基因(PCT公开的申请WO 93/02197)，几丁质酶编码序列(其可以从例如ATCC以登录号3999637和67152获得)，烟草钩虫几丁质酶(Kramer et al.,1993Insect Molec.Biol.23:691)，和欧芹ubi4-2多聚泛素基因(Kawalleck et al.,1993Plant Molec.Biol.21:673)。

(K)刺激信号转导的分子。这些分子的实例包括绿豆钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列(Botella et al.,1994Plant Molec.Biol.24:757)，和玉米钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列(Griess et al.,1994Plant Physiol.104:1467)。

(L)疏水矩肽(hydrophobic moment peptide)。见例如美国专利Nos.5,659,026和5,607,914，后者教导了赋予疾病抗性的人造抗微生物肽。

(M)膜透性酶，通道形成剂或通道阻断剂，例如杀菌肽-β裂解肽类似物(Jaynes et al.,1993Plant Sci.89:43)，其使转基因烟草植物对青枯病有抗性。

(N)病毒侵袭性蛋白质或由其衍生的复杂毒素。例如，在经转化的植物细胞中，病毒衣壳蛋白的积累可赋予针对该衣壳蛋白所来源的病毒以及相关病毒所致的病毒感染和/或疾病发展的抗性。已经给转化植物赋予了衣壳蛋白介导的，针对苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草条纹病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的抗性。参见，例如，Beachy et al.(1990)Ann.Rev.Phytopathol.28:451。

(O)昆虫特异性抗体或由其衍生的免疫毒素。因此，靶向昆虫肠道关键代谢功能的抗体可以使受影响的酶失活，杀死昆虫。例如，Taylor等人(1994)，在第七届国际分子植物-微生物相互作用研讨会(Seventh Int'l.Symposium onMolecular Plant Microbe Interactions)上的第497号摘要显示了转基因烟草中通过产生单链抗体片段的酶失活。

(P)病毒特异性抗体。见例如Tavladoraki et al.(1993)Nature 266:469，其显示了表达重组抗体基因的转基因植物被保护免于病毒攻击。

(Q)由病原体或寄生物自然产生的发育阻滞(developmental-arrestive)蛋白质。因此，真菌内切α-1,4-D多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁的均聚-α-1,4-D-半乳糖醛酸而促进真菌定殖和植物营养素释放(Lamb et al.,1992)Bio/Technology 10:1436。Toubart等(1992Plant J.2:367)描述了豆类内切多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的编码基因的克隆和表征。

(R)由植物自然产生的发育阻滞(developmental-arrestive)蛋白质，例如大麦核糖体失活基因，其提供了增加的针对真菌疾病的抗性(Longemann etal.,1992).Bio/Technology 10:3305。

(S)RNA干扰，其中用RNA分子抑制靶基因的表达。一个实施例中的RNA分子是部分或完全双链的，其触发沉默响应，导致dsRNA被切割成小的干扰RNA，它们随后被纳入到靶向复合体中，靶向复合体破坏同源的mRNA。见例如Fire等人，美国专利6,506,559；Graham等人，美国专利6,573,099。

赋予除草剂耐性的基因

(A)编码针对抑制生长点或分生组织的除草剂，例如咪唑啉酮类(imidazalinone)、磺酰苯胺类(sulfonanilide)或磺酰脲类除草剂的抗性或耐受性的基因。这类基因的实例编码一种突变乙酰乳酸合酶(ALS)(Lee et al.,1988EMBOJ.7:1241)，其也称乙酰羟酸合酶(AHAL)酶(Miki et al.,1990Theor.Appl.Genet.80:449)。

(B)一种或多种额外的编码针对草甘膦抗性或耐受性的基因，所述抗性或耐受性是由突变体EPSP合酶和aroA基因赋予的，或者是通过一些基因如DGT 28、2mEPSPS、GAT(草甘膦乙酰转移酶)或GOX(草甘膦氧化酶)和其它膦酰基化合物，如草胺膦(pat、bar和dsm-2基因)，和芳氧基苯氧基丙酸和环己二酮(ACC酶抑制剂编码基因)所致的代谢失活而获得的。见例如美国专利No.4,940,835，其公开了可赋予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。编码突变体aroA基因的DNA分子能够以ATCC登录号39256获得，突变体基因的核苷酸序列在美国专利No.4,769,061中公开。欧洲专利申请No.0 333033和美国专利No.4,975,374公开了可赋予除草剂如L-草铵膦抗性的谷氨酰胺合酶基因的核苷酸序列。欧洲专利申请No.0 242 246提供了草铵膦乙酰转移酶基因的核苷酸序列。De Greef et al.(1989)Bio/Technology 7:61中描述了表达编码草铵膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生。赋予针对芳氧基苯氧基丙酸和环己二酮如稀禾定和甲禾灵(haloxyfop)的抗性的示例性基因是Accl-S1,Accl-S2和Accl-S3基因，如Marshall et al.(1992)Theor.Appl.Genet.83:435所述。

(C)编码针对可抑制光合作用的除草剂例如三嗪(psbA和gs+基因)和苄腈(腈水解酶基因)的抗性的基因。Przibilla et al.(1991)Plant Cell 3:169描述了使用编码突变体psbA基因的质粒转化衣藻。在美国专利No.4,810,648中公开了腈水解酶基因的核苷酸序列，含有这些基因的DNA分子可以通过ATCC登录号53435、67441和67442获得。Hayes et al.(1992)Biochem.J.285:173中描述了编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达。

(D)编码针对可结合羟基苯基丙酮酸二加氧酶(HPPD)的除草剂的抗性基因，HPPD是催化对-羟基苯基丙酮酸(HPP)转化形成尿黑酸的反应的酶。这包括例如异噁唑(EP418175,EP470856,EP487352,EP527036,EP560482,EP682659,美国专利No.5,424,276)，特别是异噁唑草酮，其是玉米的选择性除草剂，二酮腈(diketonitrile)(EP496630,EP496631)，特别是2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1,3-二酮和2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2苯基)丙烷-1,3-二酮，三酮类(EP625505，EP625508，美国专利No.5,506,195)，特别是磺草酮、和pyrazolinate等除草剂。在植物中产生过量HPPD的基因能够提供针对这些除草剂的耐受性或抗性，包括例如美国专利Nos.6,268,549和6,245,968和美国专利申请公开No.20030066102中描述的基因。

(E)编码针对苯氧基生长素除草剂，如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受性的基因，其也可以赋予针对芳氧基苯氧基丙酸类(AOPP)除草剂的抗性或耐受性。这些基因的实例包括α-酮戊二酸依赖性的双加氧酶(aad-1)基因，如美国专利No.7,838,733所述。

(F)编码针对苯氧基生长素除草剂如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受性的基因，其也可以赋予针对吡啶基氧基生长素除草剂，如氟草烟或绿草定的抗性或耐受性。这些基因的实例包括α-酮戊二酸依赖性的双加氧酶(aad-12)基因，如WO2007/053482-A2所述。

(G)编码针对麦草畏的抗性或耐受性的基因(见例如美国专利公开No.20030135879)。

(H)编码针对抑制原卟啉原氧化酶(PPO)的除草剂的抗性或耐受性的基因(见美国专利No.5,767,373)。

(I)提供针对可结合光系统II反应中心(PS II)核心蛋白质的三嗪除草剂(例如莠去津)和尿素衍生物(如敌草隆)除草剂的抗性或耐受性的基因。见Brussian et al.,(1989)EMBO J.1989,8(4):1237-1245。

可赋予或贡献数量叠加性状(Value Added Trait)的基因

(A)修饰的脂肪酸代谢，例如通过用反义基因或硬脂酰-ACP去饱和酶转化玉米或芸苔属植物从而增加植物的硬脂酸含量(Knultzon et al.,1992)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 89:2624。

(B)降低的植酸含量

(1)引入植酸酶编码基因，如黑曲霉植酸酶基因(Van Hartingsveldt et al.,1993Gene 127:87)，提高植酸降解，向被转化植物添加更多游离磷酸盐。

(2)可引入降低植酸含量的基因。在玉米中，这可以通过，例如，克隆然后重新导入如下所述的单个等位基因的相关DNA来实现：该单个等位基因导致以植酸水平低为特征的玉米突变体的原因(Raboy et al.,1990Maydica35:383)。

(C)改良的碳水化合物组成，例如通过用编码改变淀粉的分支模式的酶的基因转化植物而实现。这些酶的实例包括，粘液链球菌(Streptococcusmucus)果糖基转移酶基因(Shiroza et al.,1988)J.Bacteriol.170:810，枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(Steinmetz et al.,1985Mol.Gen.Genel.200:220)，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(Pen et al.,1992Bio/Technology 10:292)，番茄转化酶基因(Elliot et al.,1993Plant Mol.Biol.21:515 524),大麦淀粉酶基因(Sogaard et al.,1993J.Biol.Chem.268:22480)，和玉米胚乳淀粉分支酶II(Fisher et al.,1993Plant Physiol.102:10450)。

转化

用于转化植物的合适方法包括任何能够将DNA引入到细胞内的方法，例如但不仅限于：电穿孔(参见例如美国专利5,384,253)；微粒射弹(参见例如美国专利5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861；和6,403,865)；土壤杆菌介导的转化(参见例如美国专利5,635,055；5,824,877；5,591,616；5,981,840；和6,384,301)；和原生质体转化(参见例如美国专利5,508,184)。这些方法可用于稳定转化或瞬时转化植物。

DNA构建体可以使用下述技术直接引入到植物细胞的基因组DNA中，例如用碳化硅纤维搅动(参见，例如，美国专利5,302,523和5,464,765)，或者DNA构建体可以使用生物射弹方法，例如DNA粒子轰击，直接引入到植物组织中(参见，例如，Klein et al.,(1987)Nature 327:70-73)。或者，DNA构建体可以通过纳米颗粒转化引入到植物细胞中(参见，例如，美国专利公开No.2009/0104700)。

此外，基因转移可以使用非土壤杆菌或病毒实现，例如根瘤菌NGR234、苜蓿中华根瘤菌、中慢生根瘤菌、马铃薯X病毒、花椰菜花叶病毒和木薯叶脉花叶病毒和/或烟草花叶病毒，参见例如，Chung et al.,(2006)Trends Plant Sci.11(1):1-4。

通过这些转化技术的应用，几乎任何植物物种的细胞都可以被稳定地转化，并且这些细胞可以通过众所周知的技术发育成转基因植物。例如，美国专利5,846,797；5,159,135；5,004,863和6,624,344中描述了特别可用于棉花转化内容的技术；例如美国专利5,750,871中描述了特别用于转化芸苔属植物的技术；美国专利6,384,301中描述了用于转化大豆的技术；美国专利7,060,876和5,591,616和国际PCT公开WO 95/06722中描述了用于转化玉米的技术。

在将外源核酸递送到受体细胞之后，通常要鉴定出转化细胞用于进一步的培养和植物再生。为了提高鉴定转化体的能力，可能期望采用选择标志物基因，与用于产生转化体的转化载体一起使用。在示例性实施方案中，可以通过将细胞暴露于一种或多种选择剂对被转化的细胞群体进行测定，或者可以根据期望的标记基因性状对细胞进行筛选。

对于在暴露于选择剂时存活的细胞，或者在筛选测定中被评定为阳性的细胞，可以在支持植物再生的培养基中加以培养。在一个实施方案中，可以对任何合适的植物组织培养基进行修改，使之包含更多的物质，例如生长调节剂。组织可以维持在含有生长调节剂的基础培养基中，直到可以获得足够的组织用于开始植物再生工作，或者经过重复多轮的人工选择，直到组织的形态适合于再生为止(例如，至少2周)，然后将它们转移到有助于芽形成的培养基中。周期性地转移培养物，直到发生充分的芽形成。一旦形成芽，便将它们转移到有助于根形成的培养基中。一旦形成了足够的根，可将植物转移到土壤中，用于进一步的生长和成熟。

为了确认再生植物中存在包含所提供构建体的期望核酸，可以多种测定。这样的测定可以包括：分子生物学测定，例如Southern和Northern印迹和PCR；生物化学测定，例如通过免疫学方法(ELISA，western印迹，和/或LC-MS MS分光光度法)或者通过酶促功能检测蛋白质产物的存在；植物部分测定法，例如叶或根测定；和/或分析整个再生植物的表型。

可以通过例如PCR扩增，使用例如特异针对感兴趣的核酸分子的寡核苷酸引物对转基因事件进行筛选。PCR基因分型被理解为包括，但不仅限于，对分离自于预计含有整合在基因组内的感兴趣核酸分子的宿主植物愈伤组织的基因组DNA进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，随后进行常规克隆和PCR扩增产物序列分析。PCR基因分型方法已经有充分描述(参见，例如，Rios et al.(2002)Plant J.32:243-53)，并且可应用于来自任何植物物种或组织类型(包括细胞培养物)的基因组DNA。一组结合靶序列和引入序列的寡核苷酸引物可以在PCR扩增反应中顺次使用或复用。可以产生设计为结合靶位点、引入核酸序列、和/或两者之组合的寡核苷酸引物。因此，PCR基因分型策略可以包括，例如但不仅限于：扩增植物基因组中的特有序列；扩增植物基因组中的多个特有序列；扩增植物基因组中的非特有序列；和上述的任意组合。本领域的技术人员可以设计出其它的引物和扩增反应的组合来查询基因组。例如，可以设计一组正向和反向寡核苷酸引物，使之与引入核酸序列的边界之外的靶标特有序列退火。

正向和反向寡核苷酸引物可被设计为与引入的核酸分子特异性退火，例如在引入的核酸分子中包含的感兴趣核苷酸序列内的编码区的相应序列处退火，或者在该核酸分子的其它部分退火。引物可以和本文描述的引物联合使用。寡核苷酸引物可以根据期望的序列合成，并且是可商购的(例如，从Integrated DNATechnologies,Inc.,Coralville,IA)。扩增之后可以进行克隆和测序，或者对扩增产物直接进行序列分析。在一个实施方案中，在PCR扩增中使用特异针对基因靶标的寡核苷酸引物。

表达转基因的方法

在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培植包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子的植物。在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培植包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因内含子的植物。在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培植包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子和内含子的植物。在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培植包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR的植物。在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培植包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子、内含子和3’-UTR的植物。在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培植包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR的植物。在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培植包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子、内含子和5’-UTR的植物。在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培植包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子的植物。在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培植包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因内含子的植物。在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培植包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子和内含子的植物。在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培植包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR的植物。在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培植包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子和玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR的植物。在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培植包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR的植物。在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培植包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子和玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR的植物。

在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培养包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子的植物组织或植物细胞。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培养包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因内含子的植物组织或植物细胞。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培养包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子和内含子的植物组织或植物细胞。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培养包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR的植物组织或植物细胞。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培养包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子和玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR的植物组织或植物细胞。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培养包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子、内含子和3’-UTR的植物组织或植物细胞。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培养包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR的植物组织或植物细胞。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培养包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子和玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR的植物组织或植物细胞。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培养包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子、内含子和5’-UTR的植物组织或植物细胞。

在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培育包含基因表达盒的植物，所述基因表达盒包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子。在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培育包含基因表达盒的植物，所述基因表达盒包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因内含子。在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培育包含基因表达盒的植物，所述基因表达盒包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子和内含子。在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培育包含基因表达盒的植物，所述基因表达盒包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR。在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培育包含基因表达盒的植物，所述基因表达盒包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子和玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR。在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培育包含基因表达盒的植物，所述基因表达盒包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子、内含子和3’-UTR。在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培育包含基因表达盒的植物，所述基因表达盒包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR。在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培育包含基因表达盒的植物，所述基因表达盒包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子和玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR。在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培育包含基因表达盒的植物，所述基因表达盒包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子、内含子和5’-UTR。

在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培育包含基因表达盒的植物组织或植物细胞，所述基因表达盒包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培育包含基因表达盒的植物组织或植物细胞，所述基因表达盒包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因内含子。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培育包含基因表达盒的植物组织或植物细胞，所述基因表达盒包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子和内含子。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培育包含基因表达盒的植物组织或植物细胞，所述基因表达盒包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培育包含基因表达盒的植物组织或植物细胞，所述基因表达盒包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子和玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培育包含基因表达盒的植物组织或植物细胞，所述基因表达盒包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子、内含子和3’-UTR。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培育包含基因表达盒的植物组织或植物细胞，所述基因表达盒包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培育包含基因表达盒的植物组织或植物细胞，所述基因表达盒包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子和玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培育包含基因表达盒的植物组织或植物细胞，所述基因表达盒包含与至少一个转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子、内含子和5’-UTR。

在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括玉米叶绿素a/b结合基因启动子(也包括上游启动子)。在一个实施方案中，玉米叶绿素a/b结合基因启动子可以是SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,或SEQ ID NO:4。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括含有玉米叶绿素a/b结合基因启动子的基因表达盒，其中该启动子与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ IDNO:3,或SEQ ID NO:4至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含这样的基因表达盒，其包括与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子。在一个示例性实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含这样的基因表达盒，其包括与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含含有内含子的基因表达盒。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含含有玉米叶绿素a/b结合基因内含子的基因表达盒。在一个实施方案中，玉米叶绿素a/b结合基因内含子是SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的多核苷酸。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括含有内含子的基因表达盒，其中该内含子与SEQID NO:5或SEQ ID NO:6至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。在一个实施方案中，基因表达盒包括与启动子可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因内含子，其中该启动子是玉米启动子，或者来源于植物(例如，玉米叶绿素a/b结合基因启动子或玉米泛素1启动子)、病毒(例如，木薯叶脉花叶病毒)或细菌(例如根癌土壤杆菌deltamas)的启动子。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含这样的基因表达盒，其包含与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因内含子。在例证性实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含这样的基因表达盒，其包含与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因内含子，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含含有玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR的基因表达盒。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含含有玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR的基因表达盒。在一个实施方案中，玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR是SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的多核苷酸。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含含有玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR的基因表达盒，其中该玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。在一个实施方案中，基因表达盒包含与启动子可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR，其中该启动子是玉米叶绿素a/b结合基因启动子，或者来自植物(例如，玉米泛素1启动子)、病毒(例如，木薯叶脉花叶病毒)或细菌(例如根癌土壤杆菌delta mas)的启动子。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含这样的基因表达盒，其包含与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR。在例证性实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含这样的基因表达盒，其包含与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含含有玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR的基因表达盒。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含含有玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR的基因表达盒。在一个实施方案中，玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR是SEQ ID NO:19的多核苷酸。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含含有玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR的基因表达盒，其中该玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR与SEQ IDNO:19至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。在一个实施方案中，基因表达盒包含与启动子可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR，其中该启动子是玉米叶绿素a/b结合基因启动子，或者来自植物(例如，玉米泛素1启动子)、病毒(例如，木薯叶脉花叶病毒)或细菌(例如根癌土壤杆菌delta mas)的启动子。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含这样的基因表达盒，其包含与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR。在例证性实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含这样的基因表达盒，其包含与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含含有与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子和玉米叶绿素结合基因内含子的基因表达盒。当基因表达盒含有两个或更多个转基因时，所述启动子、内含子、3’-UTR和5’-UTR可以和基因表达盒内的不同转基因可操作连接。在一个例证性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。在一个例证性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因内含子，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含含有与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子、玉米叶绿素a/b结合基因内含子和玉米叶绿素结合基因3’-UTR的基因表达盒。当基因表达盒含有两个或更多个转基因时，所述启动子、内含子、和3’-UTR可以和基因表达盒内的不同转基因可操作连接。在一个例证性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。在一个例证性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因内含子，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。在一个例证性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含含有与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子、玉米叶绿素a/b结合基因内含子、玉米叶绿素结合基因3’-UTR和玉米叶绿素结合基因5’-UTR的基因表达盒。当基因表达盒含有两个或更多个转基因时，启动子、内含子、3’-UTR和5’-UTR可以和基因表达盒内的不同转基因可操作连接。在一个例证性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。在一个例证性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因内含子，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。在一个例证性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，使用本文所述方法的转基因表达是在植物的叶和茎组织中表达。在一个实施方案中，转基因表达包括在植物的叶和茎组织中表达超过1个转基因。在一个实施方案中，培植如本文所述的转基因植物的方法包括叶与茎优选的转基因表达。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达转基因的方法包括叶与茎优选的组织，以及叶与茎优选的细胞。在一个实施方案中，叶与茎优选的表达包括玉米的叶与茎优选表达。

在进一步的实施方案中，使用本文描述的方法的转基因表达在地上(abovethe ground)植物组织(例如，地上植物组织包括叶、壳、茎和须)中表达。在一个实施方案中，转基因表达包括在地上植物组织中表达超过一个转基因。在一个实施方案中，培植如本文所述的转基因植物的方法包括地上植物组织中的转基因表达。在一个实施方案中，描述了在地上植物组织或地上植物细胞的植物组织和植物细胞中表达转基因的方法。在一个实例中，地上植物组织的表达包括玉米地上植物组织中的表达。

在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含含有如本文所述的玉米叶绿素a/b结合基因启动子、内含子、3’-UTR或5’-UTR调节元件的载体。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含含有如本文所述的与转基因可操作连接的玉米叶绿素a/b结合基因启动子、内含子、3’-UTR或5’-UTR调节元件的载体。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包含含有如本文所述的基因表达盒的载体。在一个实施方案中，载体可以是质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体或病毒片段。

在一个实施方案中，根据本文公开方法的植物、植物组织或植物细胞可以是单子叶植物。该单子叶植物、植物组织或植物细胞可以是，但不仅限于，玉米，水稻，小麦，甘蔗，大麦，黑麦，高粱，兰花，竹子，香蕉，香蒲，百合，燕麦，洋葱，小米，和黑小麦。

在一个实施方案中，根据本文公开方法的植物、植物组织或植物细胞可以是双子叶植物。该双子叶植物、植物组织或植物细胞可以是，但不仅限于，油菜，芥花(canola)，印度芥，埃塞俄比亚芥，大豆，向日葵和棉花。

关于遗传修饰植物的产生，用于将植物基因工程的方法是本领域众所周知的。例如，已经开发了大量用于植物转化的方法，包括用于双子叶植物以及单子叶植物的生物和物理转化方案(例如Goto-Fumiyukiet al.,Nature Biotech17:282-286(1999)；Miki et al.,Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology,Glick,B.R.和Thompson,J.E.编辑,CRC Press,Inc.,BocaRaton,第67-88页(1993))。此外，用于植物细胞或组织转化和植物再生的载体和体外培养方法可以在例如下列文献中获取：Gruber et al.,Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.和Thompson,J.E.编辑,CRCPress,Inc.,Boca Raton,第89-119页(1993)。

本领域的技术人员会意识到，在外源序列稳定组入到转基因植物体内并被确认可以工作之后，可以通过有性杂交将它引入到其它植物中。可以使用大量标准育种技术中的任一种，取决于待杂交的物种。

通过对经过工程化的植物材料选择或筛选由转化DNA上存在的标记基因所编码的性状，可以鉴定并分离出转化的植物细胞、愈伤组织、组织或植物。例如，可以通过在含有抑制量的抗生素或除草剂(转化基因构建体可以赋予对该抗生素或除草剂的抗性)的培养基上培育工程化的植物材料来进行选择。另外，还可以通过筛选重组核酸构建体上可能存在的任何可见的标志物基因(例如，yfp,gfp,β-葡萄糖醛酸酶,荧光素酶,B或C1基因)的活性来鉴定转化细胞。这些选择和筛选方法是本领域技术人员众所周知的。

还可以使用物理和生物化学方法鉴定含有插入基因构建体的植物或植物细胞转化体。这些方法包括但不仅限于：1)Southern分析或PCR扩增，用于检测和确定重组DNA插入物的结构；2)Northern印迹、S1RNA酶保护、引物延伸或逆转录酶-RNA扩增，用于检测并检查基因构建体RNA转录本；3)酶学测定，用于检测酶或核酶活性，如果这样的基因产物由所述基因构建体编码的话；4)二代测序(NGS)分析；5)蛋白凝胶电泳、western印迹技术、免疫沉淀或酶联免疫吸附测定(ELISA)，如果所述基因构建体的产物是蛋白质的话。也可以使用其它的技术，例如原位杂交、酶染色和免疫染色，来检测重组构建体在特定植物器官和组织中的存在或表达。实施这些实验的方法是本领域技术人员众所周知的。

使用本文公开的方法进行的基因操作的效果可以通过，例如，从感兴趣的组织中分离的RNA(例如，mRNA)的Northern印迹来进行观察。通常，如果存在mRNA或者mRNA的量增加了，则可以推定相应的转基因被表达。可以使用其它用于测量基因和/或编码多肽活性的方法。可以使用不同类型的酶测定，取决于所用的底物以及检测反应产物或副产物增加或降低的方法。此外，多肽的表达水平可以用免疫化学手段测量，即ELISA,RIA,EIA和本领域技术人员众所周知的其它基于抗体的测定，例如通过电泳检测方法(无论是与染色还是印迹法联用)。作为一个非限制性的实例，在美国专利公开号2009/0093366中描述了使用ELISA测定检测AAD-1(芳氧基链烷酸双加氧酶；参见WO 2005/107437)和PAT(膦丝菌素-N-乙酰基转移酶)蛋白。转基因可以选择性地在一些细胞类型或植物组织中表达，或者在某些发育阶段中表达，或者转基因可以在基本上所有的植物组织中，基本上在其整个生命周期中表达。然而，任何组合的表达模式也是可以使用的。

本公开还包括上述转基因植物的种子，其中该种子包括转基因或基因表达盒。本公开进一步包括上述转基因植物的后代、克隆、细胞系或细胞，其中所述后代、克隆、细胞系或细胞包括转基因或基因构建体。

尽管已经参考具体的方法和实施方案度本发明进行了描述，但是应当意识到，在不背离本发明的前提下可以进行各种修改和变化。

实施例

实施例1：高表达调节元件的鉴定

通过使用二代测序(NGS)的转录概貌分析方法鉴定了新型玉米叶绿素a/b结合基因调节元件。然后，对这些调控元件进行鉴定、分离和克隆，以表征调节元件的表达概貌，供在转基因植物中使用。产生了用分离自苏云金杆菌的cry34Ab1基因以及aad-1选择标志物基因稳定转化的转基因玉米系，并对转基因表达水平和组织特异性进行了测定。这样，鉴定并表征了新的玉米叶绿素a/b结合基因调节元件。首次公开了供用于基因表达构建体的启动子、5′-UTR和3′-UTR调节元件。

转录概貌分析方法

从培育到不同植物生长和发育阶段的植物获得了玉米组织，用于转录概貌分析，以鉴定和选择具有期望的表达概貌的天然玉米基因的调节元件，用于在基因表达盒中使用。例如，收集了来自4个叶发育阶段(V4(一式二份)、V12和R3)和4个根发育阶段(V4和V12节点和纤维组织)、花粉、须、穗轴、未成熟的籽粒(授粉后20天)、壳和茎(V4和R1)的样品。从所有上述组织分离总mRNA，并获得了期望量的高品质mRNA。

接着，从每个mRNA样品制备cDNA文库，并使用Illumina2000(Illumina Inc.,San Diego,CA)进行高通量测序。此外，使用IlluminaRNA样品制备试剂盒根据制造商推荐的方案进行RNAseq样品制备。简而言之，使用聚-T oligo附接的珠子纯化5μg总RNA，随后在高温下使用二价阳离子将其破碎成较小的片(平均长度约为200bp)。接着，使用反转录酶和随机引物将片段化的mRNA拷贝成第一链cDNA。进一步使用DNA聚合酶I和RNA酶H将cDNA转变成双链cDNA(ds cDNA)。然后，对双链cDNA片段进行末端修复、A-加尾，然后连接到经索引的Illumina配对末端(PE)衔接子上。最后，清洗文库产物，并用15轮PCR进行富集，并纯化。将富集的文库标准化为2nM的浓度，用氢氧化钠变性，并在杂交缓冲液中稀释至12pM，装载到流动池的单个泳道上。聚簇生成、引物杂交和测序反应根据Illumina制造商推荐的测序方案进行。

然后，对测序数据进行过滤，以除去低质量读段。在过滤之后，保留了约99.9％的测序读段。将测序读段与经过注释的玉米栽培种B73基因组(可以在玉米GDB获得)进行比对。舍弃定位到玉米基因组中多于1个基因座上的测序读段，以避免在高表达基因的鉴定及其进一步的表征中发生混淆。这个步骤导致每个样品有>70％的测序读段与玉米基因组对齐。使用定量基因表达单位——每百万个定位片段中定位到外显子的千个碱基的片段数或FPKM数值，对基因进行了排序，以供进行符合基因表达构建体中使用的期望表达模式的稳定转化测试。在稳定转基因系的测试中优先排序了(prioritized)约15-20个高表达基因，其代表玉米中～0.1％的最高表达基因(图1)。

实施例2：基因调节元件鉴定

从通过前述生物信息学和转录概貌分析方法鉴定的玉米叶绿素a/b结合基因序列中提取启动子、内含子、5'-UTR和3'-UTR序列。来自玉米栽培品种B73基因组的玉米叶绿素a/b结合基因的分离和纯化序列示于SEQ ID NO:9。全长2,006bp的启动子序列(SEQ ID NO:1)包括SEQ ID NO:9的碱基对1-2006。1,887bp的上游启动子序列(SEQ ID NO:2)包括SEQ ID NO:9的碱基对1-1,887。59bp的内含子序列(SEQ ID NO:5)包括SEQ ID NO:9的碱基对1,888-1,946。60bp的5’-UTR序列(SEQ ID NO:19)包括SEQ ID NO:9的碱基对1,947-2,006。编码序列两侧的ATG和TGA翻译起始和终止密码子分别包括SEQ ID NO:9的碱基对2,007-2,009和2,802-2,804。1,000bp的3’-UTR序列(SEQ ID NO:7)包括SEQ ID NO:9的碱基对2,805-3,804。在3’-UTR中鉴定了43bp的第二内含子(SEQ ID NO:6)，其包括SEQ ID NO:9的碱基对2,809-2,851。

扩增或者合成这些DNA元件，并克隆到入门载体中。全长启动子和全长3’-UTR的大小分别为2,006bp和1,000bp。

实施例3：玉米叶绿素a/b结合基因启动子和3’-UTR序列的修饰

修饰了玉米叶绿素a/b结合基因启动子序列。鉴定并除去了重复序列，从而产生了修饰的玉米叶绿素a/b结合基因启动子序列：

GCACAAAATACATAAAACTAGATTAGAAAAGGAAGAGAATACGCCAAATTGCAGCTTAATCAATTAGACGATTTAGTCCTGTTTTTACGAAACAATTGTTTAAGATAACATGGCCTTATACTTGGAGTTTGGCATGTCTTATGCTATGTTGCAAACAGGCCCGGTCTTGACATTTCGGGGGCCCTAAGAGAAAATTTATATAGAGGTCCTATACGAAAATTTGAGTCTGTTATTTTTTCAACTTTTAAATAATATATGAAAAATAAAAAATTGATGATTTACATAATTTTATTCAAAATGATATGACTGGAAATATTGTTACAGTATTTTATGAGTCGTAAAATTATATAAATTATGTAATATACATTTGTTTTGACTTTTGAGAGAGTATTTTTACTTTTAATTTGTCAAACTAGCCTAAACCTTAAAATACACAGTAAACCAAATCTAAATACATTAGATCAAATTTTCTGAAAATAAAGTTCAGCAAACTAAACTAGGATTAATCAATGTAGGTTATTAGGGTCGACCCTTCGGTAGGCTAGAATTAAGCAACGCGATAGGCACAGGTGTACAACACCTTTCGTCCTTCCCACGTCAATAAAGTATTTGTCATCAAGCAGACGGTTGCGCGACCTCAAAGAGATGATTGCTAGAAAATAAAGAGACGCAACAAAAGAATGAAAATATAGATTTATCTATAACTTATATGCATTTGATATAAGATAGATAAATGGGAGCCCTACGAACCTTGAGGCTCTGAGCAGTCGCATATCCTGCACACCCTTGGCGCCGGCCCTGGTTGCAAATATGCAATTGTGTCCTTATCCGCGACTGGTCACGAGGCTAGGATTGATCGAAAGCTGCCGATGAGAAATGGCAAGGGCGGCATGCTGTGGCCTTTTTTTTACGGTCTGTCAGGACAACTGAAAAGTTACAAATTTATAGTGGTTGTAAACAGCAACACGTTAAAAAGTCGATTATCAGTTTCACAGAAAGAGGTCGTTAAAACCGCCAGCAAGCTTGTTTCACTATCAGTCTGTCGCTAAGACAATCTCTTTCACCAAAAATACAATTTGCTTTCTTGCCGTTGCTTCAAGTGAAAATCTGAGCTAAAAAAGAGAGAGGCTGTCTGAAGAAAAATCCATAACCAACGCAAAATCCCGGGCGCCCAATCAGCCTTCTCCGCGGAGATTCCTAGCCTCAGCCAGAGCTACCTCATCTGCGTGAGGCTCCGGTGGCGCCAAGTGTTCCGGCATCCCGGACGCACCAATGGCATCCGAGCAACAGATCTTTTCTGCAACAACGCTTCGCGTCGCGGCGGTGTTTCCCTCCATCTGCTCTGCTCTTTAAATACCTCCGTCGTCTCCTCGTCTCCACAGCATCTCAAGTCTTCACACTCCTCGCCATCACATAAAACCAGTGCAAGCAGAAGCAGCGCA(SEQ ID NO:3)

图2提供了全长玉米叶绿素a/b结合基因启动子(SEQ ID NO:1)与修饰的玉米叶绿素a/b结合基因启动子(SEQ ID NO:3)的比对结果，该比对显示出了为产生修饰的玉米叶绿素a/b结合基因启动子序列而去除的重复多核苷酸序列。

接着，对玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR序列(SEQ ID NO:7)进行修饰。3’-UTR被截短成一条400bp的多核苷酸序列，从而产生了修饰的玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR序列(SEQ ID NO:8)：

GGGGGTGGAGGCGCCACCGCCCACCGGCCACCGCTGCGGATATCTAGGTGTTCGGATGCACGTGAGCGCGCACTGGTTCCAGTTTGTACCATGATGTAAATTACTTACCGTACCAGGGTTCAATCGGCAAGGAAGAATTGTTGTGTTCACTGTCTTGGGCAGTCTCTTGGTCCAATATGAATCAACTTACACAGCATCTCCAAAAACTTCTAAAATTACTAGCTGAATGCCCGTGCGTTGCAACGGGAATATATAATACCAGTATACTACGATAACTTATATACAAAATGTATGTTATATCGTTATGAGAAAATGTTTCATAACCAATTTATGATTCTGGTCATACATAAATTTTGTTATTTATAGTCTATCTGTTTCACCACTACATTGCAACCATCAG(SEQ ID NO:8)

扩增或者合成上述DNA元件，并克隆到入门载体中。修饰的启动子和修饰的3’-UTR的长度分别为1,442bp和400bp。

实施例4：玉米叶绿素a/b结合基因启动子构建体

将全长玉米叶绿素a/b结合基因上游启动子SEQ ID NO:2与玉米叶绿素a/b结合基因内含子SEQ ID NO:5和5’-UTR序列(SEQ ID NO:19)连接，产生了全长玉米叶绿素a/b结合基因启动子SEQ ID NO:1。cry34Ab1(来自苏云金芽孢杆菌的报告基因)的表达受全长玉米叶绿素a/b结合基因启动子(SEQ IDNO:1)驱动，并被马铃薯PinII 3’-UTR(StPinII 3’-UTR v2；An et al.,(1989)PlantCell 1；115-22)终止。用引物扩增上述每个基因元件，其中引物含有最少15bp的与基因元件的侧翼DNA元件同源的重叠区。所有片段用凝胶纯化。接着，通过无缝克隆反应(Invitrogen,Carlsbad,CA)将三个片段以定向的顺序与入门载体骨架pENTR11一起组装。然后用所得的入门载体和目标载体进行LR(Invitrogen)反应，产生了最终的表达载体pDAB114438。目标载体含有选择标志物盒，其包括受全长玉米泛素-1启动子(Christensen et al.,(1992)Plant Molecular Biology 18；675-689)驱动的aad-1基因并以玉米脂肪酶3’-UTR(美国专利7,179,902)为终止。所得的构建体pDAB114438是一个异源表达构建体，含有aad-1基因表达盒和cry34Ab1基因表达构建体(图3)。

在第二种构建体中，cry34Ab1(来自苏云金芽孢杆菌的报告基因)的表达受全长玉米叶绿素a/b结合基因启动子(SEQ ID NO:1)驱动，并以修饰的玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR(SEQ ID NO:8)终止。用引物扩增每个基因元件，其中引物含有最少15bp的与基因元件的侧翼DNA元件同源的重叠区。所有片段用凝胶纯化。接着，通过无缝克隆反应(Invitrogen,Carlsbad,CA)将三个片段以定向的顺序与入门载体骨架pENTR11一起组装。然后用所得的入门载体和目标载体进行LR(Invitrogen)反应，产生了最终的表达载体pDAB120166。目标载体含有选择标志物盒，其包括受全长玉米泛素-1启动子(Christensen et al.,(1992)Plant Molecular Biology 18；675-689)驱动的aad-1基因并以玉米脂肪酶3’-UTR(美国专利7,179,902)为终止。所得构建体pDAB120166是一个异源表达构建体，含有aad-1基因表达盒和cry34Ab1基因表达构建体(图7)。

在第三种构建体中，cry34Ab1(来自苏云金芽孢杆菌的报告基因)的表达受修饰的玉米叶绿素a/b结合基因启动子驱动。将修饰的玉米叶绿素a/b结合基因上游启动子SEQ ID NO:4与玉米叶绿素a/b结合基因内含子SEQ ID NO:5和5’-UTR序列(SEQ ID NO:19)连接，产生了修饰的玉米叶绿素a/b结合基因启动子SEQ ID NO:3。cry34Ab1(来自苏云金芽孢杆菌的报告基因)的表达受修饰的玉米叶绿素a/b结合基因启动子(SEQ ID NO:3)驱动，并以马铃薯PinII3’-UTR(StPinII 3’-UTR v2；An et al.,(1989)Plant Cell 1；115-22)终止。用引物扩增每个基因元件，其中引物含有最少15bp的与该元件的侧翼DNA元件同源的重叠区。所有片段用凝胶纯化。接着，通过无缝克隆反应(Invitrogen,Carlsbad,CA)将三个片段以定向的顺序与入门载体骨架pENTR11一起组装。然后用所得入门载体和目标载体进行LR(Invitrogen)反应，产生了最终的表达载体pDAB120165。目标载体含有选择标志物盒，其包括受全长玉米泛素-1启动子(Christensen et al.,(1992)Plant Molecular Biology 18；675-689)驱动的aad-1基因并以玉米脂肪酶3’-UTR(美国专利7,179,902)为终止。所得的构建体pDAB120165是一个异源表达构建体，含有aad-1基因表达盒和cry34Ab1基因表达构建体(图6)。

组装了阴性对照构建体pDAB101556，其含有黄色荧光蛋白(YFP；Shaginet al.,(2004)Mol Biol Evol 21；841-50)报告基因，代替cry34Ab1基因(图4)，以及与pDAB114438中相同的aad-1表达盒。构建了阳性对照构建体pDAB108746，其包括控制cry34Ab1基因表达的玉米泛素-1启动子和马铃薯蛋白酶抑制基因II 3’-UTR(StPinII 3’-UTR v2；An et al.,(1989)Plant Cell 1；115-22)(图5)。aad-1盒与pDAB114438中的相同。

实施例5：植物转化和分子确认

根癌土壤杆菌的转化：

将二元表达载体转化进入根癌土壤杆菌菌株DAt13192(RecA缺陷型三元菌株)(国际专利公开No.WO2012016222)。选择细菌菌落，分离二元质粒DNA，并通过限制酶消化进行确认。

土壤杆菌培养物的起始

将土壤杆菌培养物从甘油储划线接种到AB基本培养基(Gelvin,S.,2006,Agrobacterium Virulence Gene Induction,收录于Wang,K.编辑,AgrobacteriumProtocols第二版第1卷,Humana Press,79页；制备不用蔗糖，用5g/L葡萄糖和15g/L Bacto^TM琼脂)，并在黑暗中在20℃培养3天。然后，将土壤杆菌培养物划线接种到YEP培养基平板上(Gelvin,S.,2006,AgrobacteriumVirulence Gene Induction,收录于Wang,K.编辑,Agrobacterium Protocols第二版第1卷,Humana Press,79页)，并在黑暗中在20℃培养1天。

在实验当天，制备接种培养基(2.2g/L MS盐,68.4g/L蔗糖,36g/L葡萄糖,115mg/L L-脯氨酸,2mg/L甘氨酸,100mg/L肌醇,0.05mg/L烟酸,0.5mg/L吡哆醛HCl,0.5mg/L硫胺HCl)与乙酰丁香酮的混合物，其体积适合于实验的规模。向接种培养基中添加1M溶在100％二甲亚砜中的乙酰丁香酮，使乙酰丁香酮的终浓度为200μM。

对于每个构建体，将来自YEP平板的1-2环土壤杆菌悬浮在置于无菌的一次性50ml离心管中的15ml接种培养基/乙酰丁香酮混合物中，并用分光光度计在600nm测量溶液的光密度(O.D.₆₀₀)。然后，使用额外的接种培养基/乙酰丁香酮混合物将悬浮物稀释至0.25-0.35O.D.₆₀₀。然后将土壤杆菌悬液管水平置于设定为大约75rpm的平台摇床上室温下历时1-4个小时后使用。

玉米转化

通过土壤杆菌介导的未成熟胚的转化将实验构建体转化进玉米中，该未成熟胚从玉米栽培品种B104的自交系中分离。所用方法与Ishida et al.,(1996)Nature Biotechnol 14:745–750和Frame et al.,(2006)Plant Cell Rep 25:1024–1034中公开的相似，但是有一些修改和改良，以便使该方法适用于高通量转化。美国专利申请公开No.US 2013/0157369A1中给出了用于在玉米中产生大量转基因事件的方法的一个实例，其开始于胚胎感染和共培养步骤。

分子确认

在V2-3叶期对推定的转基因玉米植物进行取样，使用cry34Ab1和aad-1定量PCR测定检测转基因的存在。使用DNA提取试剂盒(Qiagen)按照制造商的使用说明从4个叶冲孔块(punch)中提取总DNA。

为了检测感兴趣的基因，使用引物/探针组对基因特异性DNA片段进行扩增，该引物/探针组包含针对cry34Ab1基因的FAM-标记荧光探针，和针对内源转化酶参考基因对照的HEX标记荧光探针。下面的引物用于cry34Ab1和转化酶内源参考基因扩增。引物序列如下：

Cry34Ab1引物/探针:

正向引物:TQ.8v6.1.F:GCCATACCCTCCAGTTG(SEQ ID NO:10)

反向引物:TQ.8v6.1.R:GCCGTTGATGGAGTAGTAGATGG(SEQ IDNO:11)

探针:TQ.8v6.1.MGB.P:5’-/56-FAM/CCGAATCCAACGGCTTCA/MGB(SEQ ID NO:12)

转化酶引物:

正向引物:InvertaseF:TGGCGGACGACGACTTGT(SEQ ID NO:13)

反向引物:InvertaseR:AAAGTTTGGAGGCTGCCGT(SEQ ID NO:14)

转化酶探针:5’-/5HEX/CGAGCAGACCGCCGTGTACTT/3BHQ_1/-3’(SEQ ID NO:15)

然后，在最终体积为10μl的反应体系中进行PCR反应，反应体系包含5μl Roche480探针主预混物(Roche Applied Sciences,Indianapolis,IN)；来自10μM储液的TQ.8v6.1.F、TQ.8v6.1.R、InvertaseF、和InvertaseR引物各0.4μl，至终浓度为400nM；来自5μM储液的TQ.8v6.1.MGB.P和Invertase探针各0.4μl，至终浓度为200nM；0.1μl的10％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，至终浓度为0.1％；2μl的10ng/μl基因组DNA，和0.5μl水。用Roche480系统在如下条件下进行DNA扩增：1个循环的95℃ 10min；40个循环的如下3个步骤：95℃ 10秒、58℃ 35秒、和72℃ 1秒，和一个4℃ 10秒的最终循环。通过将未知样品的靶(感兴趣基因)/参考(转化酶基因)值(由480输出)与cry34Ab1拷贝数对照的靶/参考值进行比较，确定Cry34Ab1的拷贝数。

aad-1基因的检测使用转化酶内源参考基因如上文就cry34Ab1基因所描述的那样进行。aad-1引物序列如下：

AAD1正向引物:TGTTCGGTTCCCTCTACCAA(SEQ ID NO:16)

AAD1反向引物:CAACATCCATCACCTTGACTGA(SEQ ID NO:17)

AAD1探针:

5’-FAM/CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA-MGB/BHQ-3’(SEQ ID NO:18)

最后，在V4-5期对含有感兴趣基因的T₀植物进行采样，用于cry34Ab1和AAD-1叶ELISA测定。采样4个叶冲孔块。在V4-5期对另一组植物采取总根部(entire root mass)，进行这两种蛋白ELISA测定。叶和根Cry34Ab1(Agdia,Inc.,Elkart,IN)和AAD-1(Acadia BioScience)ELISA测定按照制造商的使用说明书进行。Cry34Ab1叶ELISA测定表示为ng/cm²或者每百万分数(ppm或者ng蛋白/mg总植物蛋白)，而根ELISA测定表示为ppm。用Bradford检测方法按照制造商的使用说明进行总根蛋白测定。

将T₀植物与玉米栽培品种B104非转基因转化系杂交以获得T₁种子。将每个受测的调节元件的构建体的3个转基因系或事件推进到T₁蛋白和RNA基因表达研究，然后推进到T₂种子产生。相应地，每个事件播种了30-40个T₁种子；在发育的V2-V3阶段向幼苗喷洒以杀死非转基因后代。在植物发育的多个阶段对转基因植物进行采样，用于cry34Ab1和AAD-1ELISA，具体阶段如下：叶(V4,V12和R3)；根(V4和R1)；茎(R1)；花粉(R1)；丝(R1)；穗(R3)；颗粒(R3)；和穗轴(R3)。分离所有的组织，并置于干冰包埋的试管中；然后转移到-80℃。在提取蛋白用于ELISA之前，将冷冻的组织冻干。

在V4-5期对推定的含有cry34Ab1,yfp和aad-1转基因的转基因T₁植物进行采样，用于叶ELISA测定。采样四个叶冲孔块。将叶冲孔块置于试管中，向每个含有300μl提取缓冲液(1XPBST，补充0.05％吐温20和0.5％BSA)的1.2ml管中添加一个1/8”不锈钢钢珠(Hoover Precision Products,Cumming,GA,USA)。将样品在Genogrinder^TM(SPEX SamplePrep,Metuchen,NJ)中1,500rpm处理4分钟。将样品在Sorvall Legend XFR^TM离心机中4,000rpm离心2分钟。接着，再添加300μl提取缓冲液，将样品在Genogrinder^TM中1,500rpm再处理2分钟。样品在4,000rpm再次离心7分钟。最后，收集上清液，使用市售的Cry34Ab1(Agdia,Inc.)和AAD-1(Acadia BioScience,LLC)ELISA测定试剂盒，按照制造商的使用说明，与蛋白标准品一起在不同稀释度下进行ELISA测定。用于各种组织类型ELISA的蛋白提取如下进行。在颜料搅拌器(paintshaker)中将冻干组织研磨30秒。对于需要进一步研磨的组织，研磨步骤再重复30秒。添加石榴石粉覆盖管底的弯曲部分。将粗磨组织转移到2ml管中，并填充到0.5ml标记处。向每个管中加入一个陶瓷球和0.6ml部分提取缓冲液(200μl蛋白酶抑制剂混合物，200μl 500mMEDTA，15.5mg DTT粉末，PBST至20毫升)。将全部管子保持在冰上10分钟。将冷却的管子转移到的2mL夹持件中。将样品研磨两次，每次30秒，其间在冰上冷却5分钟。接着，向样品添加40μl 10％-20和300μl提取缓冲液。将样品再研磨30秒，其间在冰上冷却5分钟。最后，将每个样品在13,000rpm离心7分钟，并将上清液小心转移至新管中，收集提取物。将提取物重悬于提取缓冲液中，并根据需要进行稀释，用于ELISA测定叶组织。

实施例6：T₀转基因植物表达筛选

Cry34Ab1的ELISA结果显示，在用构建体pDAB114438转化的T₀事件中，全长玉米叶绿素a/b结合基因启动子调节元件(SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2)驱动了Cry34Ab1的叶优先性表达。在这些事件的根组织中观察到的受全长玉米叶绿素a/b结合基因启动子调节元件驱动的Cry34Ab1的表达可以忽略不计(表1和2)。由阳性对照构建体pDAB108746产生的事件在叶和根组织中均表达Cry34Ab1。在用不含有cry34Ab1基因的阴性对照构建体pDAB101556转化的植物事件中没有观察或检测到Cry34Ab1的叶表达。所有构建体均在根和叶组织中表达aad-1基因。

而且，在T₀转基因植物中通过ELISA测定显示，修饰的玉米叶绿素a/b结合基因启动子调节元件(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)驱动了Cry34Ab1和AAD-1蛋白在叶(V4)中的表达(表3)。用pDAB120165转化的T₀转基因植物代表了修饰的玉米叶绿素a/b结合基因启动子(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)与St.PinII 3’-UTR的组合的表达，而用pDAB120166转化的T₀转基因植物代表了全长玉米叶绿素a/b结合基因启动子(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)与修饰的玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR(SEQ ID NO:8)的组合的表达。这些结果表明，本公开的启动子(SEQ ID NO:1-4)和3’-UTR(SEQ ID NO:7-8)序列可以发挥驱动基因表达盒内的转基因在T₀转基因玉米植物事件中表达的功能。

表1.显示cry34Ab1和AAD-1转基因在各种构建体事件的V4-V6玉米叶中的表达的ELISA结果。STD是标准偏差的缩写。

表2.显示cry34Ab1和AAD-1转基因在各种构建体事件的V4-6玉米根中的表达的ELISA结果。STD是标准偏差的缩写。

表3.通过ELSIA测量Cry34Ab1蛋白在T₀转基因植物叶(V4)中的表达，该表达由全长玉米叶绿素a/b结合基因启动子驱动，对于pDAB120166以玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR终止，对于pDAB120165则以修饰的玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR终止。还包括AAD-1在叶(V4)的蛋白表达。STD是标准偏差的缩写。

实施例7：T₁转基因植物表达

T₁转基因植物事件的Cry34ELISA结果表明，玉米叶绿素a/b结合基因启动子调节元件(SEQ ID NO:1)驱动Cry34Ab1在地上部分优先表达，特别是在叶、茎和壳组织中。这个数据从用构建体pDAB114438转化的T₁事件生成。而且，在这些事件的根、外壳和花粉组织中观察到的由玉米叶绿素a/b结合基因启动子调节元件(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)驱动的Cry34Ab1的表达可以忽略不计(表4)。有趣的是，在分析的事件中，Cry34Ab1在穗轴组织中显示的表达比Cry34Ab1是须组织中的表达的十分之一。在用阴性对照构建体pDAB101556转化的植物事件中没有观察到或检测到Cry34Ab1的叶表达。该构建体pDAB101556不含有cry34Ab1转基因。所有构建体均同时在根和叶组织中表达aad-1基因。

表4.在T₁转基因植物中通过ELISA测量的Cry34Ab1和AD-1蛋白在不同组织类型中的表达。STD是标准偏差的缩写。

叶(V4)的T₁Cry34Ab1ELISA结果显示，含有全长玉米叶绿素a/b结合基因启动子(SEQ ID NO:1和2)、以不同的3’-UTR作为cry34ab1基因调节元件的pDAB120166和pDAB114438转基因事件具有相似的表达范围。前一构建体pDAB120166含有与启动子来源于相同基因的修饰的玉米叶绿素a/b结合基因3’-UTR(SEQ ID NO:8)，而后一构建体pDAB114438含有St PinII 3’-UTR。T₁叶(V4)Cry34Ab1(表5)。叶(V4)组织的T₁Cry34Ab1ELISA结果还包括pDAB120165转基因事件，其含有修饰长度的玉米叶绿素a/b结合基因启动子(SEQ ID NO:3和4)和St PinII 3’-UTR作为cry34ab1基因的调节元件。pDAB120165转基因事件的ELISA结果显示，与含有全长玉米叶绿素a/b结合基因启动子(SEQ ID NO:1和2)的pDAB120166或pDAB114438相比，表达减少了大约50％-60％。构建体pDAB120165含有修饰的启动子(SEQ IDNOs:3和4)和St PinII 3’-UTR。这些结果表明，本公开的启动子(SEQ ID NO:1-4)和3’-UTR(SEQ ID NO:7-8)序列可发挥驱动基因表达盒内的转基因在转基因T₁玉米植物事件的表达的功能。

表5.通过ELSIA测量的不同构建体的T₁转基因植物中Cry34Ab1和AAD-1蛋白在叶(V4)中的表达。STD是标准偏差的缩写。

NA＝不适用

由此，鉴定并表征了新型玉米叶绿素a/b结合基因调节元件，其包括：全长玉米叶绿素a/b结合基因启动子SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；修饰的玉米叶绿素a/b结合基因启动子SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；玉米叶绿素a/b结合基因内含子SEQ ID NO:5；玉米叶绿素a/b结合基因5’-UTR SEQ IDNO:19；全长玉米叶绿素a/b结合基因3’–UTR SEQ ID NO:7；和修饰的玉米叶绿素a/b结合基因3’–UTR EQ ID NO:8。首次公开了用于基因表达构建体的新启动子调节元件。

Claims (23)

1.一种基因表达盒，其包含与转基因可操作连接的启动子，其中该启动子包含与如下所述的多核苷酸探针在严格条件下杂交的多核苷酸，该多核苷酸探针包含与SEQ ID NO:2的互补物的至少90％的序列同一性。

2.权利要求1的基因表达盒，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:2具有至少90％的序列同一性。

3.权利要求1的基因表达盒，其中该多核苷酸包含内含子。

4.权利要求3的基因表达盒，其中该内含子与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性。

5.权利要求1的基因表达盒，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性。

6.权利要求1的基因表达盒，其中该可操作连接的转基因编码多肽或小RNA基因。

7.权利要求1的基因表达盒，其中该转基因选自下组：杀虫剂抗性转基因、除草剂耐性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合蛋白转基因、和选择标志物转基因。

8.权利要求1的基因表达盒，进一步包括3'-非翻译区。

9.权利要求8的基因表达盒，其中该3'-非翻译区与SEQ ID NO:7或SEQID NO:8具有至少90％序列同一性。

10.权利要求1的基因表达盒，进一步包括3'-非翻译区，其中该5'-UTR与SEQ ID NO:19具有至少90％序列同一性。

11.一种重组载体，其包含权利要求1的基因表达盒，其中该载体选自质粒、粘粒、细菌人工染色体、病毒和噬菌体。

12.一种转基因细胞，包括权利要求1的基因表达盒。

13.权利要求12的转基因细胞，其中该转基因细胞是转基因植物细胞。

14.一种转基因植物，包括权利要求13的转基因植物细胞。

15.权利要求14的转基因植物，其中该转基因植物是单子叶植物或双子叶植物。

16.权利要求15的转基因植物，其中单子叶植物选自玉米植物、水稻植物、和小麦植物。

17.来自权利要求14的转基因植物的转基因种子。

18.权利要求1的基因表达盒，其中该启动子是组织优选的启动子。

19.权利要求1的基因表达盒，其中该组织优选的启动子是叶、壳、茎、或须组织优选的启动子。

20.权利要求1的基因表达盒，其中该启动子包含SEQ ID NO:2的核苷酸1-1,887的多核苷酸序列。

21.一种在转基因植物中表达异源编码序列的方法，该方法包括：

a)用基因表达盒转化植物细胞，该基因表达盒包含多核苷酸序列，该多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:2的至少90％的序列同一性并且与异源编码序列可操作连接，该异源编码序列与3’非翻译区可操作连接；

b)分离包含该基因表达盒的转化植物细胞；

c)使该转化植物细胞再生成转基因植物；和

d)获得该转基因植物，其中该转基因植物包括所述包含具有SEQ IDNO:2的多核苷酸序列的基因表达盒。

22.一种制造包含与SEQ ID NO:2的至少90％序列同一性的合成多核苷酸序列的方法，该方法包括：

a)鉴定包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列；

b)分离包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列；

c)定义多个包含与SEQ ID NO:2的至少90％序列同一性的多核苷酸序列；

d)合成包含与SEQ ID NO:2的至少90％序列同一性的多核苷酸序列；和

e)制造包含与SEQ ID NO:2的至少90％序列同一性的合成多核苷酸序列。

23.权利要求22的方法，其中所述合成包括：

a)鉴定包含与SEQ ID NO:2的至少90％序列同一性的多核苷酸序列；

b)产生多个寡核苷酸引物序列，其中这些寡核苷酸引物序列结合包含与SEQ ID NO:2的至少90％序列同一性的多核苷酸序列；

c)连接该多个寡核苷酸引物序列，从而合成包含与SEQ ID NO:2的至少90％序列同一性的多核苷酸序列。