CN106103722A

CN106103722A - 新型玉米泛素启动子

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Publication number: CN106103722A
Application number: CN201480076567.5A
Authority: CN
Inventors: S·库马尔; M·古普塔; T·R·赖特; S·M·杰恩; D·A·史密斯; D·阿拉贝德
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Corteva Agriscience LLC
Priority date: 2013-12-31
Filing date: 2014-12-31
Publication date: 2016-11-09
Also published as: ZA201604651B; MX2016008754A; KR20160105451A; US20180171345A1; US9725730B2; BR102014033033A2; UY35926A; TW201527313A; AU2014373774A1; IL246510A0; WO2015103356A1; MX358830B; US20170275637A1; AU2014373774B2; CA2935242A1; AP2016009323A0; CL2016001673A1; US9885054B2; US20150184176A1; PH12016501296A1

Abstract

玉米栽培种B73泛素‑1(玉米栽培种B73 Ubi‑1)启动子在植物中驱动组成型转基因的高水平表达。在多基因构建体中反复使用相同的玉米栽培种B73 Ubi‑1启动子还会导致基因沉默，从而使转基因产物有效性降低。提供了基因调控启动子元件、构建体，和使用来自不同的玉蜀黍属物种大刍草v2(Z.luxurians v2)的Ubi‑1启动子的基因调节元件在植物细胞和/或植物组织中表达转基因的方法。

Description

新型玉米泛素启动子

相关专利申请相互参考

本申请要求根据35USC§119(e)获得于2013年12月31日提交的美国临时专利申请系列号61/922,534的利益，其全部公开内容通过提述并入本文。

援引电子提交的序列表

序列表的正式拷贝已作为ASCII格式序列表通过EFS-Web电子提交，文件名为“75666_ST25.txt”，创建于2014年12月30日，大小为13.5千字节，并与本说明书同时提交。该ASCII格式文档中包含的序列表是本说明书的一部分，并且其全部内容通过提述并入本文。

发明领域

本发明一般地涉及植物分子生物学领域，更具体地，涉及在植物中表达转基因的领域。

背景

许多植物物种能够被转基因转化，以引入农艺学期望的性状或特征。开发和/或修饰植物物种使之具有特定的期望性状。一般地，期望的性状包括，例如，提高营养价值品质、增加产量、赋予病虫害抗性、提高干旱和胁迫耐受性、提高园艺品质(例如，色素沉着和生长)、赋予除草剂抗性、能够从植物生产工业上有用的化合物和/或材料，和/或赋予生产药物的能力。

通过植物转化技术产生在单个基因组座位上堆叠多个转基因的转基因植物物种。植物转化技术将转基因引入到植物细胞中，回收在植物基因组中稳定整合了转基因拷贝的能育的转基因植物，随后通过转基因的转录和翻译进行转基因表达，从而产生具有期望性状和表型的转基因植物。不过，能够产生高表达以性状堆叠的形式工程构建的多个转基因的转基因植物物种的办法是令人期望的。

类似地，能够在植物的特定组织或器官中表达转基因的办法也是令人期望的。例如，通过用病原体抗性基因转化植物基因组从而使病原体抗性蛋白在植物的根部强烈表达，可能实现植物对土壤源性病原体感染的抗性提高。或者，可能期望在处于特定生长或发育阶段，例如细胞分裂或伸长期，的植物组织中表达转基因。

本文描述了大刍草(Zea luxurians)Ubi-1启动子调节元件，其包括启动子、上游启动子、5’-UTR和内含子。进一步描述了使用该基因调节元件的构建体和方法。

概要

本文公开了用于在植物细胞和/或植物组织中表达转基因的启动子、构建体和方法。在一个实施方案中，转基因的表达包括使用启动子。在一个实施方案中，启动子包含多核苷酸序列。在一个实施方案中，启动子多核苷酸序列包含上游启动子，5'-非翻译区(5'-UTR)或前导序列，和内含子。在一个实施方案中，启动子多核苷酸序列包含泛素-1基因(Ubi-1)。在一个实施方案中，启动子多核苷酸序列包含大刍草(Z.luxurians)的Ubi-1基因。

在一个实施方案中，构建体包括基因表达盒，所述基因表达盒包含从大刍草Ubi-1基因获得的启动子多核苷酸序列。在一个实施方案中，来自大刍草的Ubi-1启动子多核苷酸序列包括上游启动子区，5'-UTR或前导序列，和内含子。在一个实施方案中，构建体包括基因表达盒，所述基因表达盒包含从大刍草Ubi-1基因获得的启动子多核苷酸序列，该启动子多核苷酸序列与来自杯水母属(Phialidium)物种的黄色荧光蛋白编码基因(PhiYFP)的内含子融合。在一个实施方案中，构建体包括基因表达盒，该基因表达盒包含来自大刍草Ubi-1基因的启动子多核苷酸序列，所述启动子多核苷酸序列与来自杯水母属物种的黄色荧光蛋白编码基因(PhiYFP)的内含子融合，随后是来自玉米过氧化物酶5基因(ZmPer5)的3’-非翻译区(3’-UTR)。所得的多核苷酸序列包括新的启动子基因调控元件。

在一个实施方案中，基因表达盒包括与转基因或异源编码序列可操作连接的基因启动子调节元件。在一个实施方案中，基因表达盒包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个转基因。

本文公开了培植植物的方法，所述植物使用新型基因启动子调节元件(例如，上游启动子，5’-UTR和内含子)表达转基因。本文还公开了培养植物组织和细胞的方法，所述植物组织和细胞使用新的基因启动子调节元件表达转基因。在一个实施方案中，本文公开的方法包括植物叶、根、愈伤组织和花粉中的组成型基因表达。本文还公开了纯化包含新的基因启动子调节元件的多核苷酸序列的方法。

附图简述

图1显示构成玉米栽培种B73Ubi-1基因的示意性的新型启动子。该启动子包括上游元件、5’-UTR或前导序列，和内含子。该上游元件位于转录起始位点(TSS)的5’上游，用长箭头指示。该上游元件由调节元件(例如TATA盒，用短箭头指示)和热休克元件(用星号指示)构成。

图2显示了载体pDAB105711的质粒图，其包括PCR扩增的大刍草v2Ubi-1基因的启动子序列。

图3显示了玉米栽培种B73Ubi-1基因对照启动子(SEQ ID NO:1)的多核苷酸序列，上游启动子区用下划线指示，5’-UTR/前导序列用阴影指示，内含子区用小写字母指示。

图4显示了大刍草v2 Ubi-1启动子(SEQ ID NO:2)的多核苷酸序列，上游启动子区用下划线指示，5’-UTR/前导序列用阴影指示，内含子区用小写字母指示。

图5显示了大刍草v2的上游启动子区(SEQ ID NO:4)与玉米栽培种B73的对照上游启动子序列(SEQ ID NO:3)的多核苷酸序列比对。

图6显示了大刍草v2的5’-UTR/前导区(SEQ ID NO:6)与玉米栽培种B73的对照5’-UTR/前导序列(SEQ ID NO:5)的多核苷酸序列比对。

图7显示了大刍草v2的内含子区(SEQ ID NO:8)与玉米栽培种B73的对照内含子序列(SEQ ID NO:7)的多核苷酸序列比对。

图8显示了二元表达构建体pDAB105748的载体图，其包括插入在目的载体pDAB10197中的对照入门载体pDAB105742(玉米栽培种B73)。

图9显示了二元表达构建体pDAB105744的载体图，其包括插入在目的载体pDAB10197中的入门载体pDAB105738(大刍草v2)。

图10显示了二元表达构建体pDAB105748(玉米栽培种B73)和pDAB105744(大刍草v2)的PhiYFP基因在T_o植物愈伤组织中的表达。

图11显示了二元表达构建体pDAB105748(玉米栽培种B73)、pDAB105744(大刍草v2)和阴性对照的PhiYFP基因在T₁植物花粉中的表达。

图12显示了二元表达构建体pDAB112854的载体图，其包含由ZmUbi-1启动子v2驱动的PhiYFP报告基因和ZmPer5 3’-UTR；以及由大刍草v2驱动的AAD-1v3基因和ZmLip 3'-UTR v1。

详细说明

定义

如本文所使用的，除非在上下文中清晰且明确地指出，否则冠词“一”、“一个”和“该”包括复数指代。

如本文所使用的，术语“回交”是指如下的过程，其中育种者将杂交后代与其中一个亲本杂交，例如第一代杂交体F1与F1杂交体的亲本基因型的其中一个杂交。

如本文所使用的，术语“内含子”是指基因(或者被表达的感兴趣核苷酸序列)中包含的任何被转录但不被翻译的核酸序列。内含子包括被表达的DNA序列内的非翻译核酸序列，以及从其转录的RNA分子中的相应序列。

本文所述的构建体还可以包含可增强翻译和/或mRNA稳定性的序列，例如内含子。这样的一个内含子的实例是拟南芥组蛋白H3变异体基因II的第一内含子，或者任何其它公知的内含子序列。内含子可以和启动子序列组合使用，以提高翻译和/或mRNA稳定性。

如本文所使用的，术语“5’非翻译区”或“5’-UTR”是指前mRNA或成熟mRNA 5’端的非翻译区段。例如，在成熟的mRNA上，5’-UTR通常在其5’端有一个7-甲基鸟苷帽，并且参与许多过程，例如剪接、多酰苷酸化、mRNA外排到细胞质、mRNA的5’端被翻译机构识别，和保护mRNA免于降解。

如本文所使用的，术语“3’非翻译区”或“3’-UTR”是指前mRNA或成熟mRNA 53’端的非翻译区段。例如，在成熟的mRNA上，这个区域具有多-(A)尾巴，并且已知在mRNA稳定性、翻译起始和mRNA外转运中具有多种功能。

如本文所使用的，术语“多腺苷酸化信号”是指mRNA转录本中存在的核酸序列，其在多-(A)聚合酶存在时允许转录本的多酰苷酸化位点(例如位于多-(A)信号下游10-30个碱基)多酰苷酸化。许多多酰苷酸化信号是本领域已知的，并可用于本发明。一个示例性序列包括AAUAAA及其变异体，如Loke J.,et al.,(2005)Plant Physiology 138(3)；1457-1468所述。

如本文所使用的，术语“分离的”是指与该组分自然存在的生物体细胞中的其它生物组分(即，其它染色质和染色质外DNA)分离的生物组分(包括核酸或蛋白质)。

如本文所使用的，在指示核酸分子时，术语“纯化的”不需要绝对的纯(例如，同质的制备物)。相反，它表示该序列比其在天然的细胞环境中相对更纯。例如，核酸的“纯化”水平在浓度或基因表达水平上应当比自然水平大至少2-5倍。

请求保护的DNA分子可以从总DNA或总RNA中直接分离。此外，cDNA克隆不是自然存在的，但优选地通过对部分纯化的、天然存在的物质(信使RNA)进行操作而得。从mRNA构建cDNA文库涉及创制合成的物质(cDNA)。单个cDNA克隆能够通过对携带cDNA文库的细胞进行克隆选择而从合成文库中纯化。因此，包括从mRNA构建cDNA文库和纯化不同cDNA克隆的过程会产出纯化大约10⁶倍的天然信息。类似地，启动子DNA序列可以被克隆到质粒中。这种质粒不是天然存在的，而是优选地通过对部分纯化的、天然存在的物质例如基因组DNA文库进行操作而获得的。因此，在这些技术中，优选地使纯化放大至少1个数量级，在一些实施方案中，放大2个或3个数量级，在其它实施方案中，放大4个或5个或更多个数量级。

类似地，纯化表示组分DNA序列发生了化学或功能上的改变。“被纯化”的核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。术语“纯化的”还包括通过重组DNA方法在宿主细胞(例如植物细胞)中制备的核酸和蛋白质，以及化学合成的核酸分子、蛋白质和肽。

术语“重组的”意思是其中发生了遗传重组的细胞或生物体。它还包括通过人为干预被人工或合成(即非自然的)改变的分子(例如，载体、质粒、核酸、多肽或小RNA)。对分子进行改变可以在其自然环境或状态下执行或者从其自然环境或状态下移除。

如本文所使用的，术语“表达”是指多核苷酸被转录成mRNA(包括小RNA分子)的过程，和/或被转录的mRNA(也称作“转录本”)被随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。基因表达可能受到外部信号的影响，例如细胞、组织或生物体暴露于可增加或降低基因表达的试剂。基因的表达还可以在从DNA到RNA到蛋白质的通路的任何位置被调节。基因表达的调节通过例如控制转录、翻译、RNA转运和加工、中间分子如mRNA的降解，或者通过在特定蛋白质分子被制造出后使它们激活、失活、区室化或降解，或者通过它们的组合，而发生。基因表达可以在RNA水平或蛋白质水平通过本领域已知的任何方法进行测量，包括但不仅限于，Northern印迹、RT-PCR、Western印迹、或者体外、原位或体内蛋白活性测定。

如本文所使用的，术语“基于同源性的基因沉默”或“HBGS”是通用术语，其包括转录基因沉默和转录后基因沉默。靶基因座被非连锁的沉默基因座沉默可以由转录抑制(转录基因沉默；TGS)或mRNA降解(转录后基因沉默；PTGS)导致，它们分别是由于产生了相应于启动子或转录序列的双链RNA(dsRNA)。每个过程涉及不同的细胞组分，这表明dsRNA诱导的TGS和PTGS很可能来自于一个共同的古老机制的多样化。然而，难以进行对TGS和PTGS的严格比较，因为这一般依赖于对不同沉默基因座的分析。单个转基因座位可以被描述为可触发TGS和PTGS二者，因为它会产生相应于不同靶基因的启动子和被转录序列的dsRNA。

如本文所使用的，术语“核酸分子”、“核酸”或“多核苷酸”(所有这三个术语彼此之间是同义的)是指多聚体形式的核苷酸，其可以包括RNA、cDNA、基因组DNA的有义和反义链，及其合成形式和混合聚合物。“核苷酸”可以指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或或任一种核苷酸的修饰形式。除非另外指出，否则核酸分子的长度通常为至少10个碱基。该术语可以指不定长度的RNA或DNA分子。该术语包括单链和双链形式的DNA。核酸分子可以包括天然存在的和/或经过修饰的核苷酸，藉由天然存在的和/或非天然存在的核苷酸键连而连接在一起。

核酸分子可以被化学修饰或者生物化学修饰，或者可以包含非天然的或衍生化的核苷酸碱基，这是本领域技术人员可以容易理解的。这些修饰包括，例如，标签、甲基化、一个或多个天然发生的核苷酸用类似物取代、核苷酸内部修饰(例如不带电的连接：例如，甲基膦酸酯，磷酸三酯，磷酰胺，氨基甲酸酯等；带电荷的连接：例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等；悬垂部分：例如，肽；嵌入剂：例如，吖啶，补骨脂素等；螯合剂；烷化剂；和修饰的键：例如，α异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑构象，包括单链、双链、部分双链体、三链体(triplexed)，发针式(hairpinned)，圆形和挂锁构象。

转录沿着DNA链沿着5’-3’的方式前进。这意味着，RNA的制备是通过向生长链的3’端顺次添加核糖核苷酸-5’-三磷酸(要求清除焦磷酸)。在线性或环状核酸分子中，如果离散的元件(例如，特定的核苷酸序列)键合或者将要键合于相同核酸上的其他元件的5’方向，则其被称作位于该其他元件的“上游”。类似地，如果离散的元件键合或者将要键合于相同核酸上的其他元件的3’方向，则其被称作位于该其他元件的“下游”。

如本文所使用的，术语“碱基位置”是指给定碱基或核苷酸残基在指定核酸内的位置。指定的核酸可以通过与参考核酸进行比对加以定义。

如本文所使用的，术语“杂交”是指多核苷酸或寡核苷酸和它们的类似物通过互补碱基之间的氢键键合而杂交的过程，氢键包括Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键。一般地，核酸分子包括含氮碱基，含氮碱基是嘧啶(胞嘧啶(C)，尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或者嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))。这些含氮碱基在嘧啶与嘌呤之间形成氢键，嘧啶与嘌呤的键合称作“碱基配对”。更具体地，A与T或U氢键键合，G与C键合。“互补”是指两个不同核酸序列或同一核酸序列的两个不同区域之间发生的碱基配对。

如本文所使用的，术语“可特异性杂交”或“特异性互补”是指足够程度的互补性，使得在寡核苷酸/多核苷酸和DNA或RNA靶之间发生稳定而特异的结合。寡核苷酸/多核苷酸不需要与靶序列100％互补才能特异性杂交。当寡核苷酸/多核苷酸与靶DNA或RNA分子的结合会干扰靶DNA或RNA的正常功能，并且存在足够程度的互补性以避免寡核苷酸/多核苷酸在特异性结合所期望的条件下(例如在体内测定或系统的生理条件下)与非靶序列发生非特异性结合时，寡核苷酸/多核苷酸是可特异性杂交的。这种结合被称作特异性杂交。导致特定严格程度的杂交条件随着所选杂交方法的性质和杂交核酸序列的组成和长度而改变。一般地，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(特别是Na⁺和/或Mg²⁺浓度)对杂交严格度有贡献，但清洗次数也会影响严格度。关于获得特定严格程度所需的杂交条件的计算在Sambrooket al.(ed.),Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第2版,第1-3卷,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中有讨论。

如本文所使用的，术语“严格条件”包括如下条件，其中只有当杂交分子和DNA靶之间的错配小于50％时才会发生杂交。“严格条件”包括进一步特定水平的严格性。因此，如本文所使用的，“中等严格”条件是指序列错配超过50％的分子不会杂交的条件；“高严格”条件是指序列错配超过20％的序列不会杂交的条件；和“极高严格”条件是指序列错配超过10％的序列不会杂交的条件。在特定的实施方案中，严格条件可以包括在65℃杂交，随后在65℃用0.1x SSC/0.1％SDS清洗40分钟。下面是代表性的、非限制性的杂交条件：

·极高严格性：在5x SSC缓冲液中65℃杂交16个小时；在2x SSC缓冲液中室温下清洗2次，每次15分钟；和在0.5x SSC缓冲液中65℃清洗2次，每次20分钟。

·高严格性：在5-6x SSC缓冲液中65-70℃杂交16-20个小时；在2x SSC缓冲液中室温下清洗2次，每次5-20分钟；和在1x SSC缓冲液中55-70℃清洗2次，每次30分钟。

·中等严格性：在6x SSC缓冲液中在室温-55℃杂交16-20个小时；在2-3x SSC缓冲液中室温下清洗至少2次，每次20-30分钟。

在一个实施方案中，可特异性杂交的核酸分子能够在极高严格性杂交条件下保持结合。在一个实施方案中，可特异性杂交的核酸分子能够在高严格性杂交条件下保持结合。在一个实施方案中，可特异性杂交的核酸分子能够在中等严格性杂交条件下保持结合。

如本文所使用的，术语“寡核苷酸”是指短核酸多聚体。寡核苷酸可以通过切割长核酸区段或者通过聚合单个核苷酸前体而形成。自动合成仪允许合成长度达数百个碱基对的寡核苷酸。因为寡核苷酸可以结合互补的核苷酸序列，所以它们被用作检测DNA或RNA的探针。由DNA构成的寡核苷酸(寡脱氧核糖核苷酸)可以用在聚合酶链式反应中，这是一种用于扩增小DNA序列的技术。在聚合酶链式反应中，寡核苷酸通常被称作“引物”，其允许DNA聚合酶延伸寡核苷酸并复制互补链。

如本文所使用的，术语“聚合酶链式反应”或“PCR”是指一种微量的核酸、RNA和/或DNA被扩增的程序或技术，其中，如美国专利No.4,683,195所述。一般地，来自感兴趣区域末端或超过该末端的序列信息必须可得，才能设计寡核苷酸引物；这些引物在序列上与待扩增模板的相对链相同或相似。两个引物的5’端核苷酸可以和被扩增材料的末端一致。PCR可用于扩增特定的RNA序列，从总基因组DNA中扩增特定的DNA序列，和从总细胞RNA、噬菌体或质粒序列中转录cDNA，等。一般地参见Mullis et al.,Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.,51:263(1987)；Erlich编辑,PCR Technology,(Stockton Press,NY,1989)。

如本文所使用的，术语“引物”是指当条件适合于合成引物延伸产物时，能够作为沿着互补链的合成起始点的寡核苷酸。合成条件包括四种不同的脱氧核糖核苷酸三磷酸和至少一种聚合诱导剂例如逆转录酶或DNA聚合酶的存在。它们处于合适的缓冲液中，该缓冲液包括辅助因子或可以在各种合适的温度下影响条件(例如pH等)的成分。引物优选地是单链序列，从而可以使扩增效率最佳，但是也可以使用双链序列。

如本文所使用的，术语“探针”是指与靶序列杂交的寡核苷酸或多核苷酸序列。在或类测定程序中，探针与位于两个引物退火位点之间的靶部分杂交。探针包括大约8个核苷酸，大约10个核苷酸，大约15个核苷酸，大约20个核苷酸，大约30个核苷酸，大约40个核苷酸，或者大约50个核苷酸。在一些实施方案中，探针包括大约8个核苷酸-大约15个核苷酸。

在Southern印迹测定程序中，探针与附着在膜上的DNA片段杂交。在这种测定中，探针包括大约10个核苷酸，大约100个核苷酸，大约250个核苷酸，大约500个核苷酸，大约1,000个核苷酸，大约2,500个核苷酸，或者大约2,500个核苷酸。

探针可以进一步包括可检测的标签，例如放射性标签、生物素化标签、荧光团(异硫氰酸荧光素，等)。可检测的标签可以直接共价连接到探针寡核苷酸上，例如位于探针的5’端或探针的3’端。包含荧光团的探针还进一步包括淬灭剂(例如BlackHole Quencher^TM,Iowa Black^TM等)。

如本文所使用的，术语“序列同一性”或“同一性”可以互换使用，指当通过比对两个序列以在特定比较窗口上实现最大的相应度时，两个序列中相同的核酸残基。

如本文所使用的，术语“百分比序列同一性”是指通过比较在比较窗口上最佳比对的序列(例如，核酸序列或氨基酸序列)而确定的数值，其中为了使两个序列实现最佳比对，一个序列在比较窗口中的部分与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，可以包含添加或缺失(即，缺口)。通过确定两个序列中出现相同核酸或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数，所得结果乘以100计算出百分数，从而产生百分比序列同一性。比对序列以供比较的方法是众所周知的。各种程序和比对算法在下列文献中有描述，例如：Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins and Sharp(1988)Gene 73:237-44；Higgins and Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Corpetet al.(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang et al.(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson et al.(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana et al.(1999)FEMSMicrobiol.Lett.174:247-50。

美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLAST^TM；Altschuletal.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10)可以从多个来源访问，包括美国国家生物技术信息中心(Bethesda,MD)和在互联网上，用于和多种序列分析程序结合使用。关于如何使用该程序确定序列同一性的描述可以在互联网上在BLAST^TM的“帮助”部分获得。对于核酸序列的比较，可以使用默认参数执行BLAST^TM程序的“BLAST 2序列”功能(Blastn)。当使用这种方法进行评估时，与参考序列的相似性越大的核酸序列将显示更高的百分比同一性。

如本文所使用的，术语“可操作连接”是指核酸被置于与另一个核酸的功能关系中。一般地，“可操作连接”可以表示被连接的各核酸是毗连的。连接可以通过在方便限制位点处进行连接作用来实现。如果不存在这些位点，则用合成的寡核苷酸衔接子或结构与核酸进行连接作用或退火，并用于连接毗连的多核苷酸片段。然而，元件不必是毗连的才能可操作连接。

如本文所使用的，“启动子”是指一段DNA区域，其一般位于基因的上游(朝着基因的5’区)，并且是触发和驱动基因转录所需要的。启动子可以允许它所控制的基因被合适地激活或抑制。启动子可能含有被转录因子识别的特定序列。这些因子可以结合启动子DNA序列，导致RNA聚合酶被招募，这种酶从基因的编码区合成RNA。启动子一般指位于基因上游的全部基因调节元件，包括上游启动子、5’-UTR、内含子和前导序列。

如本文所使用的，术语“上游启动子”是指足够指导转录起始的一段毗连的多核苷酸序列。如本文所使用的，上游启动子包括转录起始位点，其具有多个序列基序，包括TATA盒、起始子序列(initiator sequence)、TFIIB识别元件(BRE)和其它启动子基序(Jennifer,E.F.et al.,(2002)Genes&Dev.,16:2583-2592)。上游启动子提供了RNA聚合酶II(一种多亚基酶)与基础或一般转录因子如TFIIA,B,D,E,F和H的作用位点。这些因子组装成转录前-起始复合体，后者催化从DNA模板合成RNA。

上游启动子的激活是通过加入调节性DNA序列元件，多种蛋白质与调节性DNA序列元件结合，并随后与转录起始复合体接触从而激活基因表达。这些基因调节元件序列与特定的DNA结合因子相互作用。这些序列基序有时被称作顺式元件。这些顺式元件与组织特异性或发育特异性转录因子结合，它们可以单独或者组合地在转录水平上决定启动子的时空表达模式。这些顺式元件对可操作连接基因的控制类型可能差异很大。一些元件会响应环境响应(例如温度、湿度、和致伤)使可操作连接基因的转录增加。其它顺式元件可以响应发育线索(例如萌发、种子成熟和开花)或者响应空间信息(例如组织特异性)。参见例如Langridge et al.,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:3219-23。这些顺势元件的位置与转录起始点的距离并不相同，一些顺式元件(称作邻近元件)与最小核心启动子区域毗邻，而其它元件可以位于启动子上游或下游数千碱基的位置(增强子)。

如本文所使用的，术语“转化”包括所有能够将核酸分子引入到细胞内的技术。实例包括，但不仅限于：病毒载体转染；质粒载体转化；电穿孔；脂质体转染；显微注射(Mueller et al.(1978)Cell 15:579-85)；土壤杆菌介导的转移；直接DNA摄入；WHISKERS^TM介导的转化；和微射弹轰击。这些技术可用于植物细胞的稳定转化和瞬时转化二者。“稳定转化”是指核酸片段引入到宿主生物体的基因组内，导致在遗传上稳定的继承。一旦被稳定转化，核酸片段便稳定地整合进宿主生物体和任何后代的基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”生物。“瞬时转化”是指核酸片段被引入到宿主生物体的细胞核或含DNA的细胞器中，引起基因表达但不会在遗传上稳定的继承。

如本文所使用的，术语“转导”是指病毒将核酸转移到细胞内的过程。

如本文所使用的，术语“转基因”是指外源核酸序列。在一个实例中，转基因是基因序列(例如，除草剂抗性基因)，编码工业或制药上有用的化合物的基因，或者编码期望农艺学性状的基因。在另外的实施例中，转基因是反义核酸序列，其中该反义核酸序列的表达会抑制靶核酸序列的表达。转基因可以含有与转基因可操作连接的调节序列(例如，启动子、内含子或3’-UTR)。在一些实施方案中，感兴趣的核酸是转基因。然而，在其它实施方案中，感兴趣的核酸是内源核酸，其中该内源核酸的额外基因组拷贝是期望的，或者是与宿主生物体中的靶核酸序列处于反义取向的核酸。

如本文所使用的，术语“载体”是指被引入到细胞内从而产生转化细胞的核酸分子。载体可以包括允许它在宿主细胞内复制的核酸序列，例如复制原点。实例包括，但不仅限于，质粒、粘粒、噬菌体、细菌人工染色体(BAC)，或可携带外来DNA进入细胞的病毒。载体还可以包括一个或多个基因、反义分子和/或选择标志物基因和本领域已知的其它遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，借此导致细胞表达核酸分子和/或由该载体编码的蛋白质。载体可以任意地包括帮助核酸分子进入细胞内的材料(例如脂质体)。

如本文所使用的，术语“盒子”、“表达盒”和“基因表达盒”是指能够被插入到核酸或多核苷酸的特定限制位点处或者通过同源重组插入核酸或多核苷酸的DNA区段。DNA区段包括含有感兴趣基因的多核苷酸，感兴趣基因编码感兴趣的小RNA或多肽，并且该盒子和限制位点被设计成确保盒子以正确的阅读框被插入，以保证转录和翻译。在一个实施方案中，表达盒可包括编码感兴趣的小RNA或多肽的多核苷酸，并可具有除该多核苷酸之外的促进特定宿主细胞的转化的元件。在一个实施方案中，基因表达盒还可以包括如下元件，其允许在宿主细胞中增强编码感兴趣的小RNA或多肽的多核苷酸的表达。这些元件可以包括，但不仅限于：启动子，最小启动子，增强子，应答元件，内含子，5'非翻译区序列，3'非翻译区序列，终止子序列，多腺苷酸化序列，等。

如本文所使用的，术语“异源编码序列”用于指示任何编码、或者最终编码肽或蛋白质或其等价氨基酸序列(例如酶)的多核苷酸，所述肽或蛋白质或其等价氨基酸序列在宿主生物体中通常不存在，并且在合适的条件下能够在宿主细胞中表达。这样，“异源编码序列”可以包括一个或多个拷贝的在宿主细胞中通常不存在的编码序列，从而使细胞表达额外拷贝的在细胞中通常不存在的编码序列。异源编码序列可以是RNA或者其任何类型(例如mRNA)，DNA或其任何类型(例如cDNA)，或RNA/DNA的杂交体。编码序列的实例包括，但不仅限于，全长转录单元，其包括例如编码序列、内含子、启动子区、5′-UTR、3′-UTR和增强子区等特征。

“异源编码序列”还包括肽或酶的编码部分(即cDNA或mRNA序列)，全长转录单元的编码部分(即包含内含子和外显子的基因)，编码酶或者编码其等价氨基酸序列的“密码子优化”序列、截短的序列和其它具有改变的序列的形式，前提是该等价氨基酸序列可产生功能性蛋白。这样的等价氨基酸序列可以具有一个或多个氨基酸缺失，该缺失在N端、C端或内部。也设想了截短的形式，只要它们具有本文所述的催化能力即可。

如本文所使用的，术语“对照”是指在分析程序中用于比较目的的样品。对照可以是“阳性”或“阴性”。例如，当分析程序的目的是检测细胞或组织中差异表达的转录本或多肽时，一般优选地包含阳性对照，例如来自已知显示期望表达的植物的样品，和阴性对照，例如来自已知缺少期望表达的植物的样品。

如本文所使用的，术语“植物”包括植物和植物部分，包括但不仅限于，植物细胞和植物组织，例如叶、愈伤组织、茎、根、花、花粉和种子。可以在本发明中使用的植物类别宽泛到包括适合于诱变的高等和低等植物，包括被子植物，裸子植物，蕨类植物和多细胞藻类。因此，“植物”包括双子叶和单子叶植物。双子叶植物的实例包括烟草，拟南芥，大豆，番茄，木瓜，芥花(canola)，向日葵，棉花，苜蓿，马铃薯，葡萄，木豆，豌豆，芸苔(Brassica)，鹰嘴豆，甜菜，油菜，西瓜，甜瓜，辣椒，花生，南瓜，萝卜，菠菜，倭瓜，西兰花，卷心菜，胡萝卜，花椰菜，芹菜，大白菜，黄瓜，茄子，和莴苣。单子叶植物的实例包括玉米，大米，小麦，甘蔗，大麦，黑麦，高粱，兰花，竹，香蕉，香蒲，百合，燕麦，洋葱，小米和黑小麦。

如本文所使用的，术语“植物部分”是指叶、愈伤组织、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、插条、细胞或组织培养物，或者植物的任何其它部分或产物。在一个实施方案中，植物材料包括子叶和叶。在一个实施方案中，植物材料包括根组织和其它位于地下的植物组织。

如本文所使用的，术语“选择标志物基因”是指在植物转化中被任选地用于例如保护植物细胞免于选择剂的伤害或者提供对选择剂的抗性/耐受性的基因。此外，“选择标志物基因”意图包括报告基因。只有那些接受了功能性的选择标志物的细胞或植物才能够在具有选择剂的条件下分裂或生长。选择剂的实例可包括，例如，抗生素，包括壮观霉素，新霉素，卡那霉素，巴龙霉素，庆大霉素，和潮霉素。这些选择标志物包括新霉素磷酸转移(nptII)，其表达的酶可赋予对抗生素卡那霉素的抗性，和针对相关抗生素新霉素、巴龙霉素、庆大霉素和G418的基因，或者潮霉素磷酸转移酶(hpt)的基因，其表达的酶可赋予对潮霉素的抗性。其它选择标志物基因可以包括编码除草剂抗性的基因，包括bar或pat(抵抗草铵膦铵盐或膦丝菌素)，乙酰乳酸合酶(ALS，抵抗抑制剂例如磺酰脲类(SU)，咪唑啉酮类(IMI)，三唑并嘧啶(TP)，嘧啶氧基苯甲酸(pyrimidinyloxybenzoate)(POB)，和磺酰羰基三唑啉酮，其可阻止支链氨基酸合成的第一步，草甘膦，2,4-D和金属抗性或敏感性。可以用来作为选择标志物基因的“报告基因”的实例包括可以视觉观察所表达报告基因的蛋白，例如编码β葡糖苷酸酶(GUS)、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白蛋白(YFP)、DsRed、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、碱性磷酸酶和类似物的蛋白质。短语“标志物阳性”是指已经被转化为包含选择标志物基因的植物。

如本文所使用的，术语“可检测标志物”是指能够检测的标记，例如放射性同位素，荧光化合物，生物发光化合物，化学发光化合物，金属螯合剂，或酶。可检测标记物的实例包括，但不仅限于，下述者：荧光标记(例如，FITC，罗丹明，镧系磷光体)，酶标记(例如辣根过氧化物酶，β半乳糖苷酶，萤光素酶，碱性磷酸酶)，化学发光，生物素基团，可以被第二报告分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列，第二抗体的结合位点，金属结合结构域，附加表位)。在一个实施方案中，可检测标记物可以附加各种长度的间隔臂，以减少潜在的空间位阻。

如本文所使用的，术语“检测”使用其最广泛的含义，包括对特定分子的定性和定量测量，例如测量特定的多肽。

除非另有具体说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域普通技术人员所公知的相同的含义。分子生物学常用术语的定义可以在列文献中找到，例如：Lewin,Genes V,Oxford University Press,1994；Kendrew et al.(编辑),TheEncyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.,1994；和Meyers(编辑),Molecular Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference,VCHPublishers,Inc.,1995。

启动子作为基因表达调节元件

用于基础研究或生物技术应用的植物启动子一般是单向的，指导融合到其3'端(下游)的转基因的组成型表达。代谢工程和性状堆叠通常需要在植物体内强表达转基因。此外，在转基因作物中通常需要多个新启动子来驱动多个基因的表达。本文公开了能够指导融合在其3’端的转基因的表达的组成型启动子。

转基因产品的开发日益复杂，需要强表达转基因并在单个基因座中堆叠多个转基因。传统上，每个转基因的表达通常需要一个独特的启动子，其中在一个基因堆叠内需要多个启动子来表达不同的转基因。随着基因堆叠规模的增加，这经常导致为了表达单个多基因性状而重复使用相同的启动子，以获得不同转基因的相似水平的表达模式。

已知受相同启动子驱动的多基因构建体会导致基因沉默，导致转基因产物在大田中有效的效力降低。由于启动子重复而产生的过多的转录因子(TF)结合位点会导致内源TF的枯竭，从而使转录失活。转基因沉默很可能对为表达转基因而产生的转基因植物的性能带来不利影响。转基因内的重复序列会导致基因座位内的同源重组，进而导致多核苷酸重排。

除了组成型启动子，组织特异性或者器官特异性启动子驱动基因在特定的组织中，如在谷粒、根、叶、愈伤组织、花粉或植物的绒毡层中表达。组织和发育阶段特异的启动子驱动基因在特定的组织中或者在植物发育过程的特定时间段内表达。组织特异性启动子对于转基因植物产业的某些应用是需要的，并且是期望的，因为它们允许在不同组织和/或在选定的发育阶段中特异性地表达异源基因，指示异源基因在各种器官、组织和/或在不同时间内差异性表达，而非在其他情况下表达。

例如，可以通过用病原抗性基因转化植物基因组，使得病原体抗性蛋白在植物中强烈表达，来实现增强植物对土壤传播的病原体的感染的抵抗力。或者，可能期望在处于特定生长或发育阶段，例如细胞分裂或伸长期，的植物组织中表达转基因。另一个应用是使用组织特异性启动子的可取之处，使得启动子能够将编码农艺性状的转基因的表达限制在发育中的植物部分(即，根，叶，愈伤组织，或花粉)中。

本文所述的启动子可望成为制备含有多个基因的商业转基因构建体的工具。这些启动子还提供了在细菌宿主内的结构稳定性和在植物细胞中的功能稳定性，例如减少转基因沉默，从而为转基因表达创造条件。具有不同表达范围的启动子，也可以通过使用本文所述的方法获得。相比于多次使用单个启动子的转基因构建体，本申请中描述的多样化启动子构建体更加适合转基因事件的下游分子分析。使用本文描述的多样化启动子还可以减少在用锌指技术进行靶定过程中转基因多基因座位的重排(SHUKLA等人.2009)。

玉米和大刍草泛素-1启动子

玉米Ubi-1启动子已经成为生物技术产业的标准手段，主要用于在玉米中稳定高表达转基因(CHRISTENSEN and QUAIL 1996；CHRISTENSEN et al.1992；TOKI etal.1992)。每个转基因的充分表达通常需要一个特定的启动子。在一个基因堆叠中通常需要多个启动子来表达不同的转基因。这种范式经常导致重复使用玉米Ubi-1启动子，因为它有令人期望的高水平蛋白质表达和组成型表达模式。

然而，在转基因座位内故意引入重复的序列也会对转基因的表达和稳定性产生不期望的负面影响(FLADUNG and KUMAR 2002；KUMAR and FLADUNG 2000a；KUMAR andFLADUNG 2000b；KUMAR and FLADUNG 2001a；KUMAR and FLADUNG 2001b；KUMAR andFLADUNG 2002；METTE et al.1999；MOURRAIN et al.2007)。多个转基因协调表达这一挑战可以使用启动子多样化方法来解决，其中不同的启动子用于驱动具有相同的表达概貌的不同转基因(PEREMARTI et al.2010)。本申请描述了通过从不同的玉蜀黍属物种中鉴定和纯化新启动子而获得的多样化Ubi-1启动子序列。

植物基因中基因表达的转录起始和调节受到多个DNA序列元件的指导，这些序列元件集合排列成一个较大的序列，称为启动子。真核启动子通常由最小核心启动子和上游调节序列构成。核心启动子是足以指导转录的准确起始的最小一段连续DNA序列。植物中的核心启动子一般包括与转录起始相关的规范区(canonical region)，例如CAAT和TATA框(共有序列TATAWAW)。TATA框元件通常位于转录起始位点(TSS)上游大约20-35个碱基对(bp)。核心启动子的激活由上游调节序列实现，它们结合各种蛋白质，随后与转录起始复合体相互作用，从而激活基因表达。这些调节元件包括确定启动子时空表达模式的DNA序列。

参考图1，玉米Ubi-1基因启动子来自于玉米近交细胞系B73。玉米Ubi-1启动子包括位于TSS 5’上游的大约895bp的DNA序列(即，上游元件)。此外，玉米Ubi-1启动子包括位于TSS 3’下游的大约1093bp的DNA序列(参见美国专利5,510,474)。因此，玉米Ubi-1启动子的总DNA序列包括大约2000个碱基对(kb)。

玉米Ubi-1启动子的上游元件包括位于TSS 5’上游大约30bp的TATA框(图1和3)。此外，该上游元件包括位于TSS 5’直接上游的两个重叠的热休克共有元件。一个82bp的5’-UTR或前导序列位于TSS的3’直接下游，随后是内含子，其从碱基83延伸到1093(图1和3)。

以前的工作已经描述了由玉米Ubi-1启动子调节的基因和/或转基因的基因表达增加。例如，氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因与玉米Ubi-1启动子的转录融合使得CAT在玉米原生质体中的活性是由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动的表达的超过10倍(CHRISTENSEN andQUAIL 1996；CHRISTENSEN et al.1992)。

除了对照玉米Ubi-1启动子之外，本申请还描述了新型玉米Ubi-1启动子。与来自玉米基因型栽培种B73的对照Ubi-1启动子不同，该新型Ubi-1启动子来自一种不同的玉蜀黍属物种——大刍草(Zea luxurians)。本文中使用的大刍草Ubi-1启动子具有2型(v2)基因型。还提供了使用包含多核苷酸序列的玉米或大刍草Ubi-1启动子的构建体和方法。在一个实施方案中，启动子可以包括来自玉米栽培种B73Ubi-1基因的多核苷酸，如下：

GTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAGCATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACATATTTTTTTTGTCACACTTGTTTGAAGTGCAGTTTATCTATCTTTATACATATATTTAAACTTTACTCTACGAATAATATAATCTATAGTACTACAATAATATCAGTGTTTTAGAGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGGTCTAAAGGACAATTGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCCTTTTTTTTTGCAAATAGCTTCACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTTTATAGACTAATTTTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTTTAGTTTTTTTATTTAATAGTTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAGTGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTAAGAAATTAAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCTGTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGCCGGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCACGGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCCTCCACACCCTCTTTCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGCGCACACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGCTTCAAGGTACGCCGCTCGTCCTCCCCCCCCCCCCCCCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCCATGCATGGTTAGGGCCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACGTCAGACACGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTCCGCAGACGGGATCGATTTCATGATTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGCCCTTTTCCTTTATTTCAATATATGCCGTGCACTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGCTTTTTTTTGTCTTGGTTGTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATTCTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAATTTTGGATCTGTATGTGTGTGCCATACATATTCATAGTTACGAATTGAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGCGGGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGCTTTTTGTTCGCTTGGTTGTGATGATGTGGTGTGGTTGGGCGGTCGTTCATTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGTATTTATTAATTTTGGAACTGTATGTGTGTGTCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGTGGGTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATATGCAGCATCTATTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTTTTATAATTATTTCGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGATTTTTTTAGCCCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCTGCA(SEQ IDNO:1)

在一个实施方案中，启动子可以包括来自大刍草v2 Ubi-1基因的多核苷酸序列，如下：

GACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAAAGAGCATTGCATGTCTAAGGTATCAAAAATTATCACATATTTTTTTTGTCACACTTGTTTAAAGTGCAGTTTATCTATCTCTATATACATATTTAAACTCCACTTTATAAATAATATAGTCTATAATACTAAAATAATATCAGTGTTTTAGATGATCATATAAGTGAACTGCTAGACATGATCTAAAGGACAACCGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTACCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCTCTGTTTTTTTTTCAAATAGCTTGACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCATTTAGGATTTAGGGTTGATGGTTTCTATAGACTAATTTTTTAGTACATCTATTTTATTATTTTTAATTTTTAAATTAAGAAAACTGAAACTCTATTTTAGTTTTTTTATTTAATAATTTAGATATAAAATGAAATAAAATAAATTTACTACAAATTAAACAAATACCCTTTAAGGAATTAAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATTATGACAGCCTGTTCAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGACGCTGCCTCTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGCCGGCCTCCTCCTCCTATCACGGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTTCCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCCTCCACACCCTCTTTCCCCAACCTGTGTTGTTAGGAGCGCACACACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGCTTCAAGGTACGCCGCTCATCCTCCTCCTCCCTCCCCCTCTCTACCTTATCTAGATCGGCGATCCGGTCCATGGTTAGGGCCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACATCAGACACGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGCGAATCCAGGGATGGCTCTAGCCGTTCCGCAGACGGGTTCGATTTCATGATTTTTTTTGTTTCGTTTCACATAGGGTTTGGTTTGCCCTTTTCCTTTATTTCCTTATATGCTGTGCACTTTTTGTCGGGTCATCTTGTCATGCTTTTTTTAAATCTTGGTTGTGATGATGTGCTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAATTCTGGATCTGTATGTGTGTGCCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATTATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGCGGGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGCTTTTTTTTCGCTTGGTTGTGATGATGCGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAATTCTGGATCTGTATGTGTGTGCCATACATCTTGATAGTTACGAGTTTAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTCGATGTGGGTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATATGCAGCATCTATTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTTTTATAATTATTTTGACCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGATTTTTTTAGCCTTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGGGCTGTTTCTTTTTGTTGACGCTCACCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCTGCAG(SEQ ID NO:2)

对本文所描述的启动子通过克隆以及随后的DNA序列同源性分析进行了表征，以鉴定启动子的特定区域(即，上游的启动子，5’-UTR，和内含子区域)。提供了使用组成型玉米或大刍草Ubi-1启动子在植物中表达转基因的构建体和方法，其包括上游启动子区，5-UTR或前导区，和内含子。在一个实施方案中，启动子可以包括来自玉米栽培种B73Ubi-1基因的上游启动子多核苷酸序列，如下：

GTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAGCATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACATATTTTTTTTGTCACACTTGTTTGAAGTGCAGTTTATCTATCTTTATACATATATTTAAACTTTACTCTACGAATAATATAATCTATAGTACTACAATAATATCAGTGTTTTAGAGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGGTCTAAAGGACAATTGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCCTTTTTTTTTGCAAATAGCTTCACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTTTATAGACTAATTTTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTTTAGTTTTTTTATTTAATAGTTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAGTGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTAAGAAATTAAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCTGTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGCCGGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCACGGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCCTCCACACCCTCTT(SEQ ID NO:3)

在另一个实施方案中，启动子可以包括来自大刍草v2 Ubi-1基因的上游启动子多核苷酸序列，如下：

GACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAAAGAGCATTGCATGTCTAAGGTATCAAAAATTATCACATATTTTTTTTGTCACACTTGTTTAAAGTGCAGTTTATCTATCTCTATATACATATTTAAACTCCACTTTATAAATAATATAGTCTATAATACTAAAATAATATCAGTGTTTTAGATGATCATATAAGTGAACTGCTAGACATGATCTAAAGGACAACCGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTACCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCTCTGTTTTTTTTTCAAATAGCTTGACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCATTTAGGATTTAGGGTTGATGGTTTCTATAGACTAATTTTTTAGTACATCTATTTTATTATTTTTAATTTTTAAATTAAGAAAACTGAAACTCTATTTTAGTTTTTTTATTTAATAATTTAGATATAAAATGAAATAAAATAAATTTACTACAAATTAAACAAATACCCTTTAAGGAATTAAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATTATGACAGCCTGTTCAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGACGCTGCCTCTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGCCGGCCTCCTCCTCCTATCACGGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTTCCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCCTCCACACCCTCTT(SEQ ID NO:4)

其他的基因调节元件

转基因表达还可以受到位于上游启动子序列3’下游的5’-UTR和/或内含子区的调节。包含与5'-UTR和/或内含子可操作连接的上游启动子区的启动子能够调节转基因的表达。上游启动子是驱动转录必需的，而5'-UTR和/或内含子的存在能够增加表达水平，导致产生更多的mRNA转录物用于翻译和蛋白质合成。在上游启动子多核苷酸序列中添加5'-UTR和/或内含子能够帮助转基因的稳定表达。

此外，包含上游启动子多核苷酸序列的组成型启动子的后面可以跟随5’-UTR或前导序列，以帮助转基因在植物内的表达。在一个实施方案中，启动子可以包括来自玉米栽培种B73Ubi-1基因的5’-UTR或前导多核苷酸序列，如下：

TCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGCGCACACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGCTTCAAG(SEQ ID NO:5)

在另一个实施方案中，启动子可以包括来自大刍草v2 Ubi-1基因的5’-UTR或前导多核苷酸序列，如下：

TCCCCAACCTGTGTTGTTAGGAGCGCACACACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGCTTCAAG(SEQ ID NO:6)

进一步地，包含上游启动子多核苷酸序列后随5’-UTR或前导序列的组成型启动子还可以后随内含子，以帮助转基因在植物内的表达。在一个实施方案中，启动子可以包括来自玉米栽培种B73Ubi-1基因的内含子多核苷酸序列，如下：

GTACGCCGCTCGTCCTCCCCCCCCCCCCCCCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCCATGCATGGTTAGGGCCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACGTCAGACACGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTCCGCAGACGGGATCGATTTCATGATTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGCCCTTTTCCTTTATTTCAATATATGCCGTGCACTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGCTTTTTTTTGTCTTGGTTGTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATTCTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAATTTTGGATCTGTATGTGTGTGCCATACATATTCATAGTTACGAATTGAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGCGGGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGCTTTTTGTTCGCTTGGTTGTGATGATGTGGTGTGGTTGGGCGGTCGTTCATTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGTATTTATTAATTTTGGAACTGTATGTGTGTGTCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGTGGGTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATATGCAGCATCTATTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTTTTATAATTATTTCGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGATTTTTTTAGCCCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCTGCA(SEQ ID NO:7)

在另一个实施方案中，启动子可以包括来自大刍草v2 Ubi-1基因的内含子多核苷酸序列，如下：

GTACGCCGCTCATCCTCCTCCTCCCTCCCCCTCTCTACCTTATCTAGATCGGCGATCCGGTCCATGGTTAGGGCCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACATCAGACACGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGCGAATCCAGGGATGGCTCTAGCCGTTCCGCAGACGGGTTCGATTTCATGATTTTTTTTGTTTCGTTTCACATAGGGTTTGGTTTGCCCTTTTCCTTTATTTCCTTATATGCTGTGCACTTTTTGTCGGGTCATCTTGTCATGCTTTTTTTAAATCTTGGTTGTGATGATGTGCTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAATTCTGGATCTGTATGTGTGTGCCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATTATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGCGGGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGCTTTTTTTTCGCTTGGTTGTGATGATGCGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAATTCTGGATCTGTATGTGTGTGCCATACATCTTGATAGTTACGAGTTTAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTCGATGTGGGTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATATGCAGCATCTATTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTTTTATAATTATTTTGACCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGATTTTTTTAGCCTTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGGGCTGTTTCTTTTTGTTGACGCTCACCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCTGCAG(SEQ IDNO:8)

转基因和报告基因表达盒

转基因表达还可以受到基因表达盒的调节。在一个实施方案中，基因表达盒包括启动子。在一个实施方案中，基因表达盒包括Ubi-1启动子。在一个实施方案中，基因表达盒包括来自植物的Ubi-1启动子。在一个实施方案中，基因表达盒包括来自大刍草v2的Ubi-1启动子。

在一个实施方案中，基因表达盒包括大刍草v2 Ubi-1启动子，其中该启动子与SEQID NO:2至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。在一个实施方案中，基因表达盒包括组成型启动子，例如大刍草v2 Ubi-1启动子，其与报告基因或转基因可操作连接。在一个实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的组成型启动子，其中该转基因可以是杀虫抗性转基因，除草剂耐受性转基因，氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养品质转基因，DNA结合转基因，选择标志物转基因，或其组合。在一个实施方案中，包含组成型启动子的基因表达盒可以驱动一个或多个转基因或报告基因的表达。在一个实施方案中，包含组成型启动子的基因表达盒可以驱动两个或多个转基因或报告基因的表达。

在一个实施方案中，基因表达盒包括大刍草v2 Ubi-1启动子，其中上游启动子序列与SEQ ID NO:4至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。在一个实施方案中，基因表达盒包括组成型启动子，例如大刍草v2 Ubi-1上游启动子，其与报告基因或转基因可操作连接。在一个实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的组成型上游启动子，其中该转基因可以是杀虫抗性转基因，除草剂耐受性转基因，氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养品质转基因，DNA结合转基因，选择标志物转基因，或其组合。在一个实施方案中，包含组成型上游启动子的基因表达盒可以驱动一个或多个转基因或报告基因的表达。在一个实施方案中，包含组成型上游启动子的基因表达盒可以驱动两个或更多个转基因或报告基因的表达。在进一步的实施方案中，上游启动子可以包括内含子。在一个实施方案中，上游启动子可以包括与报告基因或转基因可操作连接的内含子序列。在另一个实施方案中，上游启动子可以包括5’-UTR或前导序列。在一个实施方案中，上游启动子可以包括与报告基因或转基因可操作连接的5’-UTR或前导序列。在另外一个实施方案中，上游启动子可以包括5’-UTR或前导序列和内含子序列。在一个实施方案中，上游启动子可以包括与报告基因或转基因可操作连接的5’-UTR或前导序列和内含子序列。

在一个实施方案中，基因表达盒包括大刍草v2 Ubi-1启动子，其中该5’-UTR或前导序列与SEQ ID NO:6至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。在一个实施方案中，基因表达盒包括来自编码泛素-1蛋白的玉米基因的5’-UTR或前导序列，其与启动子可操作连接，其中该启动子是大刍草v2 Ubi-1启动子，或者来自植物(例如玉米或大刍草泛素-1启动子)、病毒(例如木薯叶脉花叶病毒启动子)，或细菌(例如土壤杆菌delta mas)的启动子。在一个例示性实施方案中，基因表达盒包括大刍草v1 5’-UTR或前导序列，其来自编码泛素-1蛋白的大刍草基因，并与转基因可操作连接，其中该转基因可以是杀虫抗性转基因，除草剂耐受性转基因，氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养品质转基因，DNA结合转基因，选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，基因表达盒包括大刍草v2 Ubi-1启动子，其中内含子序列与SEQ ID NO:8至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。在一个实施方案中，基因表达盒包括来自编码泛素-1蛋白的玉米基因的内含子，其与启动子可操作连接，其中该启动子是大刍草v2 Ubi-1启动子，或者来自植物(例如玉米或大刍草泛素-1启动子)、病毒(例如木薯叶脉花叶病毒启动子)，或细菌(例如土壤杆菌deltamas)的启动子。在一个例示性实施方案中，基因表达盒包括来自编码泛素-1蛋白的玉米基因的内含子，其与转基因可操作连接，其中该转基因可以是杀虫抗性转基因，除草剂耐受性转基因，氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养品质转基因，DNA结合转基因，选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，载体可以包括如本文所述的基因表达盒。在一个实施方案中，载体可以是质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体、病毒、或用于直接转化或基因靶定的切离的多核苷酸片段，例如供体DNA。

在一个实施方案中，细胞或植物包括如本文所述的基因表达盒。在一个实施方案中，细胞或植物包括包含如本申请中公开的基因表达盒的载体。在一个实施方案中，载体可以是质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体、或病毒。据此，包含基因表达盒的细胞或植物分别是转基因细胞或转基因植物。

在一个实施方案中，转基因植物可以是单子叶植物或双子叶植物。转基因单子叶植物的实施方案可以是，但不仅限于，大刍草、小麦、水稻、高粱、燕麦、黑麦、香蕉、甘蔗、和小米。转基因双子叶植物的实施方案可以是，但不仅限于大豆、棉花、向日葵、或芥花。实施方案还包括来自转基因植物的转基因种子，如本文所述的。

选择标志物

各种选择标志物，也称为报告基因，可以整合到所选表达载体中，以允许鉴定和选择被转化的植物(“转化体”)。有多种方法可用于确认选择标志物在转化的植物中的表达，包括例如DNA测序、聚合酶链式反应(PCR)、Southern印迹、RNA印迹、用于检测从载体表达的蛋白质的免疫学方法，例如介导膦丝菌素抗性的沉淀蛋白，或者视觉观察其它蛋白质，例如编码β-葡糖苷酸酶(GUS)、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、

DsRed、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、碱性磷酸酶等的报告基因(参见Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold SpringHarbor Press,N.Y.,2001，其全部内容通过引用并入本文)。

选择标志物基因用于选择被转化的细胞或组织。选择标志物基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物抗性的基因。除草剂抗性基因一般编码经过修饰的对除草剂不敏感的靶蛋白，或者编码在除草剂在植物中发挥作用之前将其降解或脱毒的酶。例如，已经通过使用编码突变型靶酶，5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，的基因而获得了对草甘膦的抗性。EPSPS的基因和突变体是众所周知的，并且在下文中有进一步的描述。对草胺膦铵盐、溴苯腈和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的抗性已经通过使用编码pat或DSM-2、腈水解酶、aad-1或aad-12基因的细菌基因得以实现，这些基因可以将各自的除草剂脱毒。

在一个实施方案中，除草剂可以抑制生长点或分生组织，包括咪唑啉酮或磺酰脲，且用于抵抗/耐受这些除草剂的乙酰羟酸合酶(AHAS)和乙酰乳酸合酶(ALS)的基因。草甘膦抗性基因分别包括突变的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)和dgt-28基因(通过引入重组核酸和/或各种形式的天然EPSP基因的体内诱变)，aroA基因和草甘膦乙酰转移酶(GAT)基因。对其它含膦化合物的抗性基因包括来自链霉菌属，包括吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)和Streptomyces viridichromogenes，的BAR基因，和吡啶氧基(pyridinoxy)或苯氧基(phenoxy)丙酸和环己酮(ACC酶抑制剂编码基因)。可赋予对环己二酮和/或芳氧苯氧丙酸(aryloxyphenoxypropanoic acid)(包括盖草能，禾草灵，噁唑禾草灵，吡氟禾草灵，精喹禾灵)的抗性的示例性基因包括乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)——Acc1-S1，Acc1-S2和Acc1-S3的基因。在一个实施方案中，除草剂能够抑制光合作用，包括三嗪(psbA和1s+基因)或苄腈(腈水解酶基因)。

在一个实施方案中，选择标志物包括，但不仅限于，编码如下的基因：新霉素磷酸转移酶II；氨腈水合酶；天冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸合酶；色氨酸脱羧酶；二氢吡啶二羧酸合酶和脱敏的天冬氨酸激酶；bar基因；色氨酸脱羧酶；新霉素磷酸转移酶(NEO)；潮霉素磷酸转移酶(HPT或HYG)；二氢叶酸还原酶(DHFR)；膦丝菌素乙酰转移酶；2,2-二氯丙酸脱卤素酶；乙酰羟酸合成酶；5-烯醇丙酮酸-莽草酸-磷酸合酶(aroA)；卤代乙腈；乙酰辅酶A羧化酶；二氢蝶酸合酶(sul I)；和32kD光系统II多肽(psbA)。

实施方案还包括编码对如下者的抗性的基因：氯霉素；甲氨蝶呤；潮霉素；壮观霉素；溴苯腈；草甘膦；和膦丝菌素。

上述的选择标志物基因的列表并不意味着有限制性。本发明可以包含任何报告或选择标志物基因。

选择标志物基因以在植物中最佳表达为目的而合成。例如，在一个实施方案中，基因的编码序列已经被密码子优化修饰，以提高在植物中的表达。选择标志物基因可以被优化用于在特定的植物物种中表达，或者，可以被修饰用于在双子叶或单子叶植物中最佳表达。植物优选的密码子可以从感兴趣的特定植物物种中以表达量最大的蛋白质的频率最高的密码子中确定。在一个实施方案中，选择标志物基因被设计成在植物中以更高的水平被表达，从而产生更高的转化效率。对于植物基因优化的方法是众所周知的。关于合成多核苷酸序列的优化和制造的指导可见于，例如，WO2013016546，WO2011146524，WO1997013402，美国专利6166302和美国专利5,380,831，其内容通过引用并入本文。

转基因

公开的方法和组合物可用于在植物基因组中表达多核苷酸基因序列。因此，编码除草剂抗性、昆虫抗性、营养、抗生素或治疗性分子的基因的表达可以被新型启动子驱动。

在一个实施方案中，本公开的组成型启动子调节元件与一个或多个编码多核苷酸序列的基因组合或可操作连接，该基因可提供对草甘膦、2,4-D、草铵膦或其他除草剂的抗性或耐受性，提供对选择昆虫或疾病的抗性或耐受性，和/或营养增强，改良的农学特征，用于在饲料、食品、工业、医药或其它用途中有用的蛋白质或其它产品。转基因可以在植物基因组中与两个或多个感兴趣的核酸序列“堆叠”。堆叠可以通过例如使用两个或多个事件的传统植物育种，用含有感兴趣序列的构建体转化植物，转基因植物的再转化，或者通过同源重组的靶向整合添加新的性状，来实现。

这些感兴趣的多核苷酸序列包括，但不仅限于，下面提供的实例：

1.赋予害虫或疾病抗性的转基因或编码序列(例如iRNA)

(A)植物疾病抗性基因。植物防御经常通过植物中疾病抗性基因(R)的产物与病原体中相应的无毒性(Avr)基因的产物的特异相互作用而被激活。可以用克隆的抗性基因转化植物品种，从而工程构建对特定病原体株有抗性的植物。这些基因的实例包括：提供黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)抗性的番茄Cf-9基因(Jones et al.,1994Science 266:789)；，提供丁香假单胞杆菌番茄致病变种抗性的番茄Pto基因，其编码一种蛋白激酶(Martin et al.,1993Science 262:1432)，和提供丁香假单胞菌抗性的拟南芥RSSP2基因(Mindrinos et al.,1994Cell 78:1089)。

(B)苏云金芽孢杆菌蛋白质、其衍生物或以其为模本的人造多肽，例如Btδ-内毒素基因的多核苷酸序列(Geiser et al.,1986Gene 48:109)和植物杀虫(VIP)基因(见，例如，Estruch et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93:5389-94)。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可以从美国典型培养物保藏中心(Rockville,Md.)购得，ATCC登录号为40098，67136，31995和31998。

(C)植物凝集素，例如，多种君子兰(Clivia miniata)甘露糖结合性植物凝集素基因的核苷酸序列(Van Damme et al.,1994Plant Molec.Biol.24:825)。

(D)维生素结合蛋白质，例如亲和素及亲和素同源物，其可用作针对昆虫类害虫的杀幼虫剂。见美国专利5,659,026。

(E)酶抑制剂，例如蛋白酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。这些基因的实例包括水稻半胱氨酸蛋白质酶抑制剂(Abe et al.,1987J.Biol.Chem.262:16793)，烟草蛋白酶抑制剂I(Huub et al.,1993Plant Molec.Biol.21:985)，和α-淀粉酶抑制剂(Sumitani et al.,1993Biosci.Biotech.Biochem.57:1243)。

(F)昆虫特异性激素或信息素，例如蜕皮激素和保幼激素或其变体、基于它们的模拟物，或其拮抗剂或激动剂，例如杆状病毒表达的克隆保幼激素酯酶，保幼激素的失活子(Hammock et al.,1990Nature 344:458)。

(G)昆虫特异性肽或神经肽，其在表达时会扰乱受影响的害虫的生理机能(J.Biol.Chem.269:9)。这些基因的实例包括昆虫利尿激素受体(Regan,1994)，在太平洋折翅蠊(Diploptera punctata)中鉴定的咽侧体抑制素(allostatin)(Pratt,1989)，和昆虫特异性麻痹神经毒素(美国专利No.5,266,361)。

(H)在自然界中由蛇、马蜂等产生的昆虫特异性毒液，例如蝎子昆虫毒性肽(Pang,1992Gene 116:165)。

(I)负责超富集单萜、倍半萜、甾体、异羟肟酸、苯丙烷衍生物或其它具有杀虫活性的非蛋白质分子的酶。

(J)参与生物活性分子修饰(包括翻译后修饰)的酶；例如糖酵解酶、蛋白质水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶，无论是天然的还是人造的。这些基因的实例包括马蹄莲(callas)基因(PCT公开的申请WO 93/02197)，几丁质酶编码序列(其可以从例如ATCC以登录号3999637和67152获得)，烟草钩虫几丁质酶(Kramer et al.,1993InsectMolec.Biol.23:691)，和欧芹ubi4-2多聚泛素基因(Kawalleck et al.,1993PlantMolec.Biol.21:673)。

(K)刺激信号转导的分子。这些分子的实例包括绿豆钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列(Botella et al.,1994Plant Molec.Biol.24:757)，和大刍草钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列(Griess et al.,1994Plant Physiol.104:1467)。

(L)疏水矩肽(hydrophobic moment peptide)。见例如美国专利Nos.5,659,026和5,607,914，后者教导了赋予疾病抗性的人造抗微生物肽。

(M)膜透性酶，通道形成剂或通道阻断剂，例如杀菌肽-β裂解肽类似物(Jaynes etal.,1993Plant Sci.89:43)，其使转基因烟草植物对青枯病有抗性。

(N)病毒侵袭性蛋白质或由其衍生的复杂毒素。例如，在经转化的植物细胞中，病毒衣壳蛋白的积累可赋予针对该衣壳蛋白所来源的病毒以及相关病毒所致的病毒感染和/或疾病发展的抗性。已经给转化植物赋予了衣壳蛋白介导的，针对苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草条纹病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的抗性。参见，例如，Beachy et al.(1990)Ann.Rev.Phytopathol.28:451。

(O)昆虫特异性抗体或由其衍生的免疫毒素。因此，靶向昆虫肠道关键代谢功能的抗体可以使受影响的酶失活，杀死昆虫。例如，Taylor等人(1994)，在第七届国际分子植物-微生物相互作用研讨会(Seventh Int'l.Symposium on Molecular Plant MicrobeInteractions)上的第497号摘要显示了转基因烟草中通过产生单链抗体片段的酶失活。

(P)病毒特异性抗体。见例如Tavladoraki et al.(1993)Nature 266:469，其显示了表达重组抗体基因的转基因植物被保护免于病毒攻击。

(Q)由病原体或寄生物自然产生的发育阻滞(developmental-arrestive)蛋白质。因此，真菌内切α-1,4-D多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁的均聚-α-1,4-D-半乳糖醛酸而促进真菌定殖和植物营养素释放(Lamb et al.,1992)Bio/Technology 10:1436。Toubart等(1992Plant J.2:367)描述了豆类内切多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的编码基因的克隆和表征。

(R)由植物自然产生的发育阻滞(developmental-arrestive)蛋白质，例如大麦核糖体失活基因，其提供了增加的针对真菌疾病的抗性(Longemann et al.,1992).Bio/Technology 10:3305。

(S)RNA干扰，其中用RNA分子抑制靶基因的表达。一个实施例中的RNA分子是部分或完全双链的，其触发沉默响应，导致dsRNA被切割成小的干扰RNA，它们随后被纳入到靶向复合体中，靶向复合体破坏同源的mRNA。见例如Fire等人，美国专利6,506,559；Graham等人，美国专利6,573,099。

2.赋予除草剂抗性的基因

(A)编码针对抑制生长点或分生组织的除草剂，例如咪唑啉酮类(imidazalinone)、磺酰苯胺类(sulfonanilide)或磺酰脲类除草剂的抗性或耐受性的基因。这类基因的实例编码一种突变ALS酶(Lee et al.,1988EMBOJ.7:1241)，其也称AHAL酶(Miki et al.,1990Theor.Appl.Genet.80:449)。

(B)一种或多种额外的编码针对草甘膦抗性或耐受性的基因，所述抗性或耐受性是由突变体EPSP合酶和aroA基因赋予的，或者是通过一些基因如DGT-28、2mEPSPS、GAT(草甘膦乙酰转移酶)或GOX(草甘膦氧化酶)和其它膦酰基化合物，如草胺膦(pat，bar，和dsm-2基因)，和芳氧基苯氧基丙酸和环己二酮(ACC酶抑制剂编码基因)所致的代谢失活而获得的。见例如美国专利4,940,835，其公开了可赋予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。编码突变体aroA基因的DNA分子能够以ATCC登录号39256获得，突变体基因的核苷酸序列在美国专利4,769,061中公开。欧洲专利申请No.0 333 033和美国专利4,975,374公开了可赋予除草剂如L-草铵膦抗性的谷氨酰胺合酶基因的核苷酸序列。欧洲专利申请No.0 242 246提供了草铵膦乙酰转移酶基因的核苷酸序列。De Greef et al.(1989)Bio/Technology 7:61中描述了表达编码草铵膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生。赋予针对芳氧基苯氧基丙酸和环己二酮如稀禾定和甲禾灵(haloxyfop)的抗性的示例性基因是Accl-S1,Accl-S2和Accl-S3基因，如Marshall et al.(1992)Theor.Appl.Genet.83:435所述。

(C)编码针对可抑制光合作用的除草剂例如三嗪(psbA和gs+基因)和苄腈(腈水解酶基因)的抗性的基因。Przibilla et al.(1991)Plant Cell 3:169描述了使用编码突变体psbA基因的质粒转化衣藻。在美国专利4,810,648中公开了腈水解酶基因的核苷酸序列，含有这些基因的DNA分子可以通过ATCC登录号53435、67441和67442获得。Hayes et al.(1992)Biochem.J.285:173中描述了编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达。

(D)编码针对可结合羟基苯基丙酮酸二加氧酶(HPPD)的除草剂的抗性基因，HPPD是催化对-羟基苯基丙酮酸(HPP)转化形成尿黑酸的反应的酶。这包括例如异噁唑(EP418175,EP470856,EP487352,EP527036,EP560482,EP682659,美国专利5,424,276)，特别是异噁唑草酮，其是大刍草的选择性除草剂，二酮腈(diketonitrile)(EP496630,EP496631)，特别是2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1,3-二酮和2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2苯基)丙烷-1,3-二酮，三酮类(EP625505，EP625508，美国专利5,506,195)，特别是磺草酮、和pyrazolinate等除草剂。在植物中产生过量HPPD的基因能够提供针对这些除草剂的耐受性或抗性，包括例如美国专利6,268,549和6,245,968和美国专利申请公开No.2003/0066102中描述的基因。

(E)编码针对苯氧基生长素除草剂，如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受性的基因，其也可以赋予针对芳氧基苯氧基丙酸类(AOPP)除草剂的抗性或耐受性。这些基因的实例包括α-酮戊二酸依赖性的双加氧酶(aad-1)基因，如美国专利7,838,733所述。

(F)编码针对苯氧基生长素除草剂如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受性的基因，其也可以赋予针对吡啶基氧基生长素除草剂，如氟草烟或绿草定的抗性或耐受性。这些基因的实例包括α-酮戊二酸依赖性的双加氧酶(aad-12)基因，如WO2007/053482-A2所述。

(G)编码针对麦草畏的抗性或耐受性的基因(见例如美国专利公开0030135879)。

(H)编码针对抑制原卟啉原氧化酶(PPO)的除草剂的抗性或耐受性的基因(见美国专利No.5,767,373)。

(I)提供针对可结合光系统II反应中心(PS II)核心蛋白质的三嗪除草剂(例如莠去津)和尿素衍生物(如敌草隆)除草剂的抗性或耐受性的基因。见Brussian et al.,(1989)EMBO J.1989,8(4):1237-1245。

3.可赋予或贡献数量叠加性状(Value Added Trait)的基因

(A)修饰的脂肪酸代谢，例如通过用反义基因或硬脂酰-ACP去饱和酶转化玉米或芸苔属植物从而增加植物的硬脂酸含量(Knultzon et al.,1992)Proc.Nat.Acad.Sci.USA89:2624。

(B)降低的植酸含量

(1)引入植酸酶编码基因，如黑曲霉植酸酶基因(Van Hartingsveldt et al.,1993Gene 127:87)，提高植酸降解，向被转化植物添加更多游离磷酸盐。

(2)可引入降低植酸含量的基因。在玉米中，这可以通过，例如，克隆然后重新导入如下所述的单个等位基因的相关DNA来实现：该单个等位基因导致以植酸水平低为特征的玉米突变体的原因(Raboy et al.,1990Maydica 35:383)。

(C)改良的碳水化合物组成，例如通过用编码改变淀粉的分支模式的酶的基因转化植物而实现。这些酶的实例包括，粘液链球菌(Streptococcus mucus)果糖基转移酶基因(Shiroza et al.,1988)J.Bacteriol.170:810，枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(Steinmetz et al.,1985Mol.Gen.Genel.200:220)，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(Pen et al.,1992Bio/Technology 10:292)，番茄转化酶基因(Elliot et al.,1993),大麦淀粉酶基因(Sogaard et al.,1993J.Biol.Chem.268:22480)，和玉米胚乳淀粉分支酶II(Fisher etal.,1993Plant Physiol.102:10450)。

转化

用于转化植物的合适方法包括任何能够将DNA引入到细胞内的方法，例如但不仅限于：电穿孔(参见例如美国专利5,384,253)；微粒射弹(参见例如美国专利5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861；和6,403,865)；土壤杆菌介导的转化(参见例如美国专利5,635,055；5,824,877；5,591,616；5,981,840；和6,384,301)；和原生质体转化(参见例如美国专利5,508,184)。这些方法可用于稳定转化或瞬时转化植物。

DNA构建体可以使用下述技术直接引入到植物细胞的基因组DNA中，例如用碳化硅纤维搅动(参见，例如，美国专利5,302,523和5,464,765)，或者DNA构建体可以使用生物射弹方法，例如DNA粒子轰击，直接引入到植物组织中(参见，例如，Klein et al.,(1987)Nature 327:70-73)。或者，DNA构建体可以通过纳米颗粒转化引入到植物细胞中(参见，例如，美国专利公开No.2009/0104700，通过提述将其整体并入本文)。

此外，基因转移可以使用非土壤杆菌或病毒实现，例如根瘤菌NGR234、苜蓿中华根瘤菌、中慢生根瘤菌、马铃薯X病毒、花椰菜花叶病毒、木薯叶脉花叶病毒和/或烟草花叶病毒，参见例如，Chung et al.,(2006)Trends Plant Sci.11(1):1-4。

通过这些转化技术的应用，几乎任何植物物种的细胞都可以被稳定地转化，并且这些细胞可以通过众所周知的技术发育成转基因植物。例如，美国专利5,846,797；5,159,135；5,004,863和6,624,344中描述了特别可用于棉花转化内容的技术；例如美国专利5,750,871中描述了特别用于转化芸苔属植物的技术；美国专利6,384,301中描述了用于转化大豆的技术；美国专利7,060,876和5,591,616和国际PCT公开WO 95/06722中描述了用于转化大刍草的技术。

在将外源核酸递送到受体细胞之后，通常要鉴定出转化细胞用于进一步的培养和植物再生。为了提高鉴定转化体的能力，可能期望采用选择标志物基因，与用于产生转化体的转化载体一起使用。在示例性实施方案中，可以通过将细胞暴露于一种或多种选择剂对被转化的细胞群体进行测定，或者可以根据期望的标记基因性状对细胞进行筛选。

对于在暴露于选择剂时存活的细胞，或者在筛选测定中被评定为阳性的细胞，可以在支持植物再生的培养基中加以培养。在一个实施方案中，可以对任何合适的植物组织培养基进行修改，使之包含更多的物质，例如生长调节剂。植物组织可以维持在含有生长调节剂的基础培养基中，直到可以获得足够的组织用于开始植物再生工作，或者经过重复多轮的人工选择，直到组织的形态适合于再生为止(例如，至少2周)，然后可以将组织转移到有助于芽形成的培养基中。周期性地转移培养物，直到发生充分的芽形成。一旦形成芽，便将它们转移到有助于根形成的培养基中。一旦形成了足够的根，可将植物转移到土壤中，用于进一步的生长和成熟。

为了确认再生植物中存在包含所提供构建体的期望核酸，可以多种测定。这样的测定可以包括：分子生物学测定，例如Southern和Northern印迹和PCR；生物化学测定，通过免疫学方法如ELISA，western印迹，和/或LC-MS MS分光光度法，或者通过酶促功能检测蛋白质产物的存在，例如通过植物部分测定法，例如叶、愈伤组织或花粉测定；和/或分析整个再生植物的表型。

可以通过例如PCR扩增，使用特异针对感兴趣的核酸分子的寡核苷酸引物对转基因事件进行筛选。PCR基因分型被理解为包括，但不仅限于，对分离和/或纯化自预计含有整合在基因组内的感兴趣核酸分子的宿主植物组织的基因组DNA进行PCR扩增，随后进行常规克隆和PCR扩增产物序列分析。PCR基因分型方法已经有充分描述(参见，例如，Rios et al.(2002)Plant J.32:243-53)，并且可应用于来自任何植物物种或组织类型(包括细胞培养物)的基因组DNA。一组结合靶序列和引入序列的寡核苷酸引物可以在PCR扩增反应中顺次使用或复用。可以产生设计为结合靶位点、引入核酸序列、和/或这两种类型的核酸序列之组合的寡核苷酸引物。因此，PCR基因分型策略可以包括，例如但不仅限于：扩增植物基因组中的特有序列；扩增植物基因组中的多个特有序列；扩增植物基因组中的非特有序列；和上述的任意组合。本领域的技术人员可以设计出其它的引物和扩增反应的组合来查询基因组。例如，可以设计一组正向和反向寡核苷酸引物，使之与引入核酸序列的边界之外的靶标特有序列退火。

正向和反向寡核苷酸引物可被设计为与引入的核酸分子特异性退火，例如在引入的核酸分子中包含的感兴趣核苷酸序列内的编码区的相应序列处退火，或者在该核酸分子的其它部分退火。引物可以和本文描述的引物联合使用。寡核苷酸引物可以根据期望的序列合成，并且是可商购的(例如，从Integrated DNA Technologies,Inc.,Coralville,IA)。扩增之后可以进行克隆和测序，或者对扩增产物直接进行序列分析。在一个实施方案中，在PCR扩增中使用特异针对基因靶标的寡核苷酸引物。

表达转基因的方法

在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培植包含与至少一个转基因可操作连接的大刍草v2 Ubi-1启动子(SEQ ID NO:2)的植物。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培养包含与至少一个转基因可操作连接的大刍草v2 Ubi-1启动子(SEQ ID NO:2)的植物组织或植物细胞。

在一个实施方案中，在植物中表达至少一种转基因的方法包括培植包含与至少一个转基因可操作连接的大刍草v2 Ubi-1启动子(SEQ ID NO:2)的基因表达盒的植物。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一种转基因的方法包括培养包含与至少一个转基因可操作连接的大刍草v2 Ubi-1启动子(SEQ ID NO:2)的基因表达盒的植物组织或植物细胞。

在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，其包括与转基因可操作连接的大刍草v2 Ubi-1启动子(SEQ ID NO:2)。其中，该大刍草v2 Ubi-1启动子(SEQID NO:2)包括上游启动子(SEQ ID NO:4)、5’-UTR(SEQ ID NO:6)、和内含子(SEQ ID NO:8)。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，其包括大刍草v2 Ubi-1上游启动子(SEQ ID NO:4)、5’-UTR(SEQ ID NO:6)、和内含子(SEQ ID NO:8)。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，其包括大刍草v2 Ubi-1上游启动子(SEQ ID NO:4)、5’-UTR(SEQ ID NO:6)、和大刍草v2 Ubi-1基因的内含子(SEQ ID NO:8)。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，其包括大刍草v2 Ubi-1上游启动子(SEQ ID NO:4)、5’-UTR(SEQ ID NO:6)和大刍草v2 Ubi-1基因的内含子(SEQ IDNO:8)。

在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括大刍草v2 Ubi-1启动子。在一个实施方案中，大刍草v2 Ubi-1启动子可以是SEQ ID NO:2。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，所述基因表达盒包含启动子，其中该启动子与SEQ IDNO:2至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，所述基因表达盒包含与转基因可操作连接的大刍草v2 Ubi-1启动子。在一个示例性实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，所述基因表达盒包含与转基因可操作连接的大刍草v2 Ubi-1启动子，其中该转基因可以是杀虫抗性转基因，除草剂耐受性转基因，氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养品质转基因，DNA结合转基因，选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括大刍草v2 Ubi-1上游启动子。在一个实施方案中，大刍草v2 Ubi-1上游启动子可以是SEQ ID NO:4。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，所述基因表达盒包含上游启动子，其中该上游启动子与SEQ ID NO:4至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，其包含与转基因可操作连接的大刍草v2 Ubi-1上游启动子。在一个示例性实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，其包含与转基因可操作连接的大刍草v2 Ubi-1上游启动子，其中该转基因可以是杀虫抗性转基因，除草剂耐受性转基因，氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养品质转基因，DNA结合转基因，选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括Ubi-1内含子。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括大刍草v2 Ubi-1 5’-UTR或前导序列。在一个实施方案中，大刍草v2 Ubi-1 5’-UTR或前导序列可以是SEQ ID NO:6的多核苷酸。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，所述基因表达盒含有5’-UTR或前导序列，其中该5’-UTR或前导序列与SEQ ID NO:6至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。在一个实施方案中，基因表达盒包括与启动子可操作连接的大刍草v2 Ubi-1 5’-UTR或前导序列，其中该启动子是泛素启动子，或者来自植物(例如大刍草泛素-1启动子)、病毒(例如木薯叶脉花叶病毒启动子)，或细菌(例如土壤杆菌delta mas)的启动子。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，所述基因表达盒含有与转基因可操作连接的大刍草v2 Ubi-1 5’-UTR或前导序列。在一个示例性实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，所述基因表达盒含有与转基因可操作连接的大刍草v2 Ubi-1 5’-UTR或前导序列，其中该转基因可以是杀虫抗性转基因，除草剂耐受性转基因，氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养品质转基因，DNA结合转基因，选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括Ubi-1内含子。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括大刍草v2 Ubi-1内含子。在一个实施方案中，大刍草v2 Ubi-1内含子可以是SEQ ID NO:8的多核苷酸。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，所述基因表达盒含有内含子，其中该内含子与SEQ ID NO:8至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。在一个实施方案中，基因表达盒包括与启动子可操作连接的大刍草v2 Ubi-1内含子，其中该启动子是泛素启动子，或者来自植物(例如玉米或大刍草泛素-1启动子)、病毒(例如木薯叶脉花叶病毒启动子)，或细菌(例如土壤杆菌delta mas)的启动子。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，所述基因表达盒含有与转基因可操作连接的大刍草v2 Ubi-1内含子。在一个示例性实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括基因表达盒，所述基因表达盒含有与转基因可操作连接的大刍草v2 Ubi-1内含子，其中该转基因可以是杀虫抗性转基因，除草剂耐受性转基因，氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养品质转基因，DNA结合转基因，选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括与转基因可操作连接的大刍草v2 Ubi-1上游启动子、Ubi-1内含子和Ubi-1 5’-UTR。当基因表达盒包括2个或更多个转基因时，该大刍草v2 Ubi-1上游启动子、Ubi-1内含子和Ubi-1 5’-UTR可以和基因表达盒内的不同转基因可操作连接。在一个示例性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的大刍草v2 Ubi-1启动子，其中该转基因可以是杀虫抗性转基因，除草剂耐受性转基因，氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养品质转基因，DNA结合转基因，选择标志物转基因，或其组合。在一个示例性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的大刍草v2Ubi-1内含子，其中该转基因可以是杀虫抗性转基因，除草剂耐受性转基因，氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养品质转基因，DNA结合转基因，选择标志物转基因，或其组合。在一个实施方案中，基因表达盒包括与启动子可操作连接的大刍草v2 Ubi-1内含子，其中该启动子是泛素启动子，或者来自植物(例如玉米或大刍草泛素-1启动子)、病毒(例如木薯叶脉花叶病毒启动子)，或细菌(例如土壤杆菌delta mas)的启动子。在一个示例性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的大刍草v2 U bi-1 5’-UTR，转基因可以是杀虫抗性转基因，除草剂耐受性转基因，氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养品质转基因，DNA结合转基因，选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括含有如本文所述的组成型基因启动子调节元件的载体。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括含有如本文所述的与转基因可操作连接的组成型基因启动子调节元件的载体。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括含有如本文所述的基因表达盒的载体。在一个实施方案中，载体可以是质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体、或病毒片段。

在一个实施方案中，根据本文公开方法的植物、植物组织或植物细胞可以是单子叶植物。该单子叶植物、植物组织或植物细胞可以是，但不仅限于，大刍草，水稻，小麦，甘蔗，大麦，黑麦，高粱，兰花，竹子，香蕉，香蒲，百合，燕麦，洋葱，小米，和黑小麦。

在另一个实施方案中，根据本文公开方法的植物、植物组织或植物细胞可以是双子叶植物。该双子叶植物、植物组织或植物细胞可以是，但不仅限于，油菜，芥花(canola)，印度芥，埃塞俄比亚芥，大豆，向日葵和棉花。

关于遗传修饰植物的产生，用于将植物基因工程的方法是本领域众所周知的。例如，已经开发了许多用于植物转化的方法，包括用于双子叶植物以及单子叶植物的生物和物理转化方案(例如Goto-Fumiyukiet al.,Nature Biotech 17:282-286(1999)；Miki etal.,Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.和Thompson,J.E.编辑,CRC Press,Inc.,Boca Raton,第67-88页(1993))。此外，用于植物细胞或组织转化和植物再生的载体和体外培养方法可以在例如下列文献中获取：Gruber etal.,Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.和Thompson,J.E.编辑,CRC Press,Inc.,Boca Raton,第89-119页(1993)。

本领域的技术人员会意识到，在外源序列稳定组入到转基因植物体内并被确认可以工作之后，可以通过有性杂交将它引入到其它植物中。可以使用大量标准育种技术中的任一种，取决于待杂交的物种。

通过对经过工程化的植物材料选择或筛选由转化DNA上存在的标记基因所编码的性状，可以鉴定并分离出转化的植物细胞、根、叶、愈伤组织、组织或植物。例如，可以通过在含有抑制量的抗生素或除草剂(转化基因构建体可以赋予对该抗生素或除草剂的抗性)的培养基上培育工程化的植物材料来进行选择。另外，还可以通过筛选重组核酸构建体上可能存在的任何可见的标志物基因(例如，YFP,GFP,β-葡萄糖醛酸酶,荧光素酶,B或C1基因)的活性来鉴定转化细胞。这些选择和筛选方法是本领域技术人员众所周知的。

还可以使用物理和生物化学方法鉴定含有插入基因构建体的植物或植物细胞转化体。这些方法包括但不仅限于：1)Southern分析或PCR扩增，用于检测和确定重组DNA插入物的结构；2)Northern印迹、S1RNA酶保护、引物延伸或逆转录酶-RNA扩增，用于检测并检查基因构建体RNA转录本；3)酶学测定，用于检测酶或核酶活性，如果这样的基因产物由所述基因构建体编码的话；4)二代测序(NGS)分析；或5)蛋白凝胶电泳、western印迹技术、免疫沉淀或酶联免疫吸附测定(ELISA)，如果所述基因构建体的产物是蛋白质的话。也可以使用其它的技术，例如原位杂交、酶染色和免疫染色，来检测重组构建体在特定植物器官和组织中的存在或表达。实施这些实验的方法是本领域技术人员众所周知的。

使用本文公开的方法进行的基因操作的效果可以通过，例如，从感兴趣的组织中分离的RNA(例如，mRNA)的Northern印迹来进行观察。通常，如果存在mRNA或者mRNA的量增加了，则可以推定相应的转基因被表达。可以使用其它用于测量基因和/或编码多肽活性的方法。可以使用不同类型的酶测定，取决于所用的底物以及检测反应产物或副产物增加或降低的方法。此外，多肽的表达水平可以用免疫化学手段测量，通过使用ELISA,RIA,EIA和本领域技术人员众所周知的其它基于抗体的测定，例如通过电泳检测方法(无论是与染色还是印迹法联用)。作为一个非限制性的实例，在美国专利公开号2009/0093366(通过提述并入其全部内容)中描述了使用ELISA测定检测AAD-1(芳氧基链烷酸双加氧酶；参见WO2005/107437)和PAT(膦丝菌素-N-乙酰基转移酶)蛋白。转基因还可以选择性地在一些细胞类型或植物组织中表达，或者在某些发育阶段中表达。转基因还可以在基本上所有的植物组织中沿着其整个生命周期表达。然而，任何组合的表达模式也是可以使用的。

本公开还包括上述转基因植物的种子，其中该种子包括报告基因、转基因、或基因表达盒。本公开进一步包括上述转基因植物的后代、克隆、细胞系或细胞，其中所述后代、克隆、细胞系或细胞包括所述报告基因、转基因或基因构建体。

尽管已经参考具体的方法和实施方案对本发明进行了描述，但是应当意识到，在不背离本文中描述的本发明的前提下可以进行各种修改和变化。

实施例

实施例1：新型启动子鉴定和分离

使用聚合酶链式反应(PCR)从大刍草v2的Ubi-1基因扩增了新型启动子序列。设计用于扩增该新型启动子，称为大刍草v2，的寡核苷酸(表1)来自于用作对照的玉米栽培种B73Ubi-1启动子序列的保守区。从大刍草v2获得了一个PCR产物，并进行了表征。

使用Invitrogen ZeroPCR克隆试剂盒并根据制造商的使用说明，将包含新型启动子的PCR产物克隆到Topo^TM载体中。提供了一幅载体图来显示包含新型启动子PCR产物的克隆质粒。质粒pDAB105710对应于大刍草v2(图2)。

克隆之后，使用本领域技术人员已知的方法对含有PCR产物的启动子插入物进行测序。将大刍草v2的各启动子多核苷酸序列(图4)计算比对，随后分析它们与玉米栽培种B73Ubi-1对照序列(图3)的序列同源性。序列同源性分析使用本领域技术人员已知的生物信息学方法和/或软件程序，例如ClustalW或Sequencher来执行。

实施例2：新启动子表征

序列同源性分析(图3-7)，包括与玉米栽培种B73Ubi-1对照序列(SEQ ID NO:1；图3)的序列比对和比较，显示了一个供进一步表征的新Ubi-1启动子。还观察到这个获自大刍草v2的新Ubi-1启动子序列(SEQ ID NO:2；图4)包括三个不同区域的多核苷酸序列：1)上游启动子区(SEQ ID NO:4)，2)5’-UTR(SEQ ID NO:6)，和3)内含子(SEQ ID NO:8)。分析了来自大刍草v2的启动子区和特异性启动子元件与玉米栽培种B73Ubi-1对照序列的序列同源性(图5-7)。更具体地，进行序列比对来独立地比较大刍草v2启动子的上游启动子、5’-UTR和内含子区，以及TATA框和热休克元件(HSE)调节元件与玉米栽培种B73Ubi-1对照序列的相应区域(图5-7，表2)。

图5显示了大刍草v2启动子的上游启动子区与玉米栽培种B73Ubi-1对照启动子序列的上游启动子区的序列比对。图6显示了大刍草v2启动子的5’-UTR或前导序列与玉米栽培种B73Ubi-1对照启动子序列的5’-UTR或前导序列的序列比对。图7显示了大刍草v2 Ubi-1启动子的内含子区与玉米栽培种B73Ubi-1对照启动子序列的内含子序列的序列比对。

从大刍草v2得到的启动子元件与玉米栽培种B73Ubi-1序列显示92.7％的总体序列同一性(表2)。来自大刍草v2的新型启动子序列的特征确认，通常在功能性启动子中发现的大多数启动子调节元件(即，TATA框或热休克元件)在大刍草v2 Ubi-1基因的核心启动子区域内也是高度保守的(表2)。例如，图5显示了高度保守的TATA框(碱基对868-874，用下划线显示)，它被鉴定并被发现定位在新型大刍草v2 Ubi-1启动子的上游启动子区的TSS 5’上游大约50bp处。类似地，图5也显示了在本研究中分析的新型大刍草v2 Ubi-1启动子中高度保守的两个重叠的热休克元件(HSE)序列(分别为碱基对456–480和481–499，加圆圈表示)。

该新型大刍草v2 Ubi-1启动子的5’-UTR或前导序列中仅观察到低水平的变化(图4)，其与玉米栽培种B73Ubi-1对照序列有95.2％序列同源性(图6)，但是在上游启动子区(图5)和内含子区(图7)中也鉴定了序列保守性略低的区域。例如，大刍草v2 Ubi-1启动子的上游启动子区相对玉米栽培种B73Ubi-1上游启动子显示变化，其序列同源性为92.7％(表2)。大刍草v2 Ubi-1启动子的上游启动子区中鉴别出的大部分差异包括核苷酸缺失、取代和/或错配(图5)。尤其是，在大刍草v2 Ubi-1启动子中发现了位于TATA框启动子元件5’上游100bp处的一个12-13bp的缺失(图5，碱基对776-787，加框显示)。

此外，在延伸到TSS 5’上游100-200bp的Ubi-1上游启动子区内存在更多的调节基序。这些基序与转录因子结合，这些转录因子与转录起始复合体相互作用并易化其组装，提高其稳定性，或一旦转录机构开始工作，增加启动子脱离的效率(PEREMARTI et al.2010)。因此，这个调节区域内的缺失、取代和错配，例如在大刍草v2 Ubi-1启动子中观察到的(图5)，会潜在影响启动子的强度和特异性。

还在大刍草v2 Ubi-1启动子的内含子区域中鉴定出了序列变化。虽然该新型大刍草v2 Ubi-1启动子与玉米栽培种B73Ubi-1对照启动子序列享有相对保守的序列同一性水平(即，92.4％)(表2)，但大刍草v2内含子启动子序列还含有在对照序列中未能发现的两个显著的缺失，分别为17bp和8bp(图7)。该17bp缺失位于TSS 3’下游大约195bp处(碱基对120-136，加方框表示)，而该8bp缺失位于该TSS的3’下游约710bp处(碱基对627-634，加下划线表示)。

实施例3：使用新型启动子用于基因表达的载体构建

除非另外指出，否则这个实施例和后续实施例中描述的分子生物学和生物化学操作通过标准方法实施，例如在Ausubel et al.(1995)和Sambrook et al.(1989)及其更新版本中公开的。本实验中使用的构建体在下面有更详细的描述(表3)。

从大刍草物种的Ubi-1基因提取包含如前所述上游启动子、5’-UTR和内含子区的大刍草启动子，并且PCR扩增子使用QIAquick凝胶提取(Qiagen Carlsbad,CA)进行凝胶纯化。然后使用本领域已知的标准克隆技术将启动子多核苷酸序列克隆到Gateway(Invitrogen)中。通过限制性消化和测序进行确认所得的Gateway包括大刍草v2的Ubi-1启动子序列。将包括玉米栽培种B73Ubi-1启动子序列的对照入门载体也使用本领域的标准克隆技术克隆到Gateway入门载体中。

除了Ubi-1启动子序列之外，入门载体还包括来自杯水母物种的黄色荧光蛋白报告基因(PhiYFP；Shagin,D.A.,(2004)Mol Biol Evol.21；841-50)，在其序列中纳入了ST-LS1内含子(Vancanneyt,G.,(1990)Mol Gen Genet.220；245-50)，和玉米过氧化物酶5基因(ZmPer5；美国专利6,699,984)的3’-UTR区。提供了显示包含每一个启动子序列的克隆入门载体的载体图。构建体pDAB105742对应于包含玉米栽培种B73Ubi-1启动子序列的对照入门载体。构建体pDAB105738对应于包含大刍草v2 Ubi-1启动子序列的对照入门载体。这样，建立了包含大刍草Ubi-1启动子、PhiYFP基因和ZmPer5 3’-UTR的基因表达盒的入门载体。

如表3所示，构建了二元表达载体构建体，其包括受所述新启动子序列驱动并以ZmPer5 3’-UTR终止的PhiYFP报告基因。使用标准目的二元载体pDAB101917和包含如上所述的基因表达盒的入门载体通过使用标准克隆方法和重组反应构建了用于土壤杆菌介导的玉米胚转化的转化或表达载体。

二元目的载体pDAB101917包括除草剂耐受基因，草胺膦乙酰转移酶(PAT；Wehrmann et al.,1996,Nature Biotechnology 14:1274-1278)。在pDAB101917载体中，PAT基因的表达受到玉米Ubi-1启动子、5'-UTR和内含子的控制。该pDAB101917载体还包括来自玉米脂肪酶基因(ZmLip；美国专利7,179,902)的3'-UTR区。该ZmLip 3’-UTR用于终止PAT mRNA的转录。该重组反应能够将每个包含基因表达盒(即大刍草v2或玉米栽培种B73Ubi-1启动子、PhiYFP基因和ZmPer5 3’-UTR)的入门载体插入到pDAB101917目的二元载体中。入门载体被插入在pDAB101917目的载体内T-DNA边界A和B之间，并位于PAT表达盒的上游。

提供了显示二元表达载体pDAB101917的载体图，其具有基因表达盒，该表达盒包括纳入的玉米或大刍草Ubi-1启动子、PhiYFP基因和ZmPer53’-UTR。对照构建体pDAB105748对应于包含玉米栽培种B73Ubi-1启动子的基因表达盒(图8)。此外，构建体pDAB105744对应于包含大刍草v2 Ubi-1启动子序列(图9)的基因表达盒。

实施例4：植物转化

使用本领域已知的标准转化技术将二元载体构建体，pDAB105748(玉米栽培种B73)和pDAB105744(大刍草v2)，各自转化进入根癌土壤杆菌菌株EHA101中。分离细菌菌落，并提取二元质粒DNA，纯化，并通过限制酶消化进行确认。

玉米植物的转化根据Vega et al.,2008,Plant Cell Rep 27:297-305中描述的方案进行，采用土壤杆菌介导的转化和膦丝菌素乙酰转移酶基因(PAT；Wehrmann et al.,1996,Nature Biotechnology 14:1274-1278)作为选择性植物标志物。使用包含二元载体构建体(如上所述)的根癌土壤杆菌培养物转化玉米栽培种Hi-II植物，产生了第一轮T₀转基因玉米事件(表4)。在转化2.5个月之后，产生、制备并收获了未成熟的合子胚。

各个基因表达构建体的转化结果进一步如表4所述。公开了产生的胚的总数、在愈伤组织阶段和在整个植物中观察到的转基因事件的总数，以及总体转化效率百分比。由于在许多实验中胚的活力较差，二元表达构建体的总体转化效率低于先前的报道(Vega etal.,2008)。

实施例5：转基因拷贝数分析

通过水解探针测定确认PhiYFP转基因在转基因玉米植物基因组内的稳定整合。获得从愈伤组织发育而来的稳定转化的转基因玉米小植物，并分析鉴定含有全长T-链插入物的低拷贝数(即，1-2个拷贝)事件。

使用Roche Light Cycler 480^TM系统根据制造商的使用说明确定转基因拷贝数。该方法使用二重PCR反应，其在单一测定体系中采用特异针对PhiYFP基因的寡核苷酸和针对内参基因玉米转化酶(ZmInv；Genbank登录号U16123.1)的寡核苷酸。通过测量PhiYFP特异性荧光相对于ZmInv特异性荧光的强度，并与已知拷贝数标准进行比较，确定拷贝数和接合性。

用一组引物/探针扩增PhiYFP基因特异性DNA片段，该组含有用FAM^TM荧光染料标记的探针；用第二组引物/探针扩增ZmInv，该组含有用HEX^TM荧光染料标记的探针(表5)。用于拷贝数分析的引物和探针由Integrated DNA Technologies(Coralville,IA)商业合成。FAM^TM荧光基团在465/510nm光密度下激发，而HEX^TM荧光基团在533/580nm光密度下被激发。

使用表6所述的试剂准备10μl最终反应体积的PCR反应。根据表7中提出的热循环条件扩增了基因特异性DNA片段。通过测量特异针对报告基因PhiYFP的荧光与特异针对参考基因ZmInv的荧光的相对强度，与已知拷贝数的标准进行比较，确定样品的拷贝数和接合性。

通过将载体pDAB108706稀释到玉米栽培种B104基因组DNA(gDNA)中以获得具有已知的pDAB108706:gDNA比值的标准品，制作了拷贝数标准品。例如，制备了具有1、2、和4个拷贝载体DNA/1个拷贝玉米栽培种B104gDNA的样品。pDAB108706的1或2拷贝稀释物与玉米栽培种LLN37gDNA标准品混合，以已知为杂合的对照玉米事件和已知为纯合的对照玉米事件(即，玉米事件278；参见PCR国际专利公开No.WO 2011/022469A2)作为对照加以验证。

采用特异针对PAT基因的寡核苷酸和特异针对内源ZmInv参考基因的寡核苷酸实施二重PCR扩增测定。使用一组引物和用FAM^TM荧光染料标记的探针(表5)，通过PCR扩增检测PAT基因特异性DNA片段。还使用第二组引物和用HEX^TM荧光染料标记的探针扩增并检测ZmInv内参/对照基因(表5)。PAT反应混合物的制备如表6所示，并根据表7中列出的条件扩增特异性片段。

表8显示了通过用不同启动子构建体转化获得的转基因植物的转基因拷贝数分析的结果。将只有具有1-2个拷贝PhiYFP转基因的植物转移到温室中，并培植用于进一步的表达分析。

实施例6：PhiYFP和PAT蛋白的ELISA定量

使用叶ELISA测定对V4-5发育期的植物进行采样。将样品收集在96孔收集管平板中，每个样品采集4个叶盘(纸张打孔器尺寸)。向每个试管添加2个4.5mm BB(Daisycorporation,Roger,AR)和200μL提取缓冲液[1xPBS，补充0.05％和0.05％BSA(MilliporeEMD Millipore Corp.,Billerica,MA)]。向每个试管再添加200μL提取缓冲液，随后通过颠倒混匀。将平板3000rpm离心5分钟。将上清液转移到保持于冰上的深孔96的相应孔中。使用96孔Maxi-Sorp平板(Thermo Fisher ScientificInc.,Rockford,IL)进行ELISA。用小鼠单克隆抗-YFP捕获抗体(OriGene TechnologiesInc.,Rockville,MD)包被平板。抗体用PBS稀释(1μg/mL)，每个孔添加150μL稀释的PBS。将平板置于4℃温育过夜。将过夜平板保持于室温20-30分钟，之后用350μL清洗缓冲液[1xPBS补充0.05％(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)]清洗4次。平板用200μL/孔封闭缓冲液[1x PBS补充0.05％BSA(Millipore)]在+37℃封闭最少1小时，随后用350μL清洗缓冲液(Tomtec QuadraWash^TM2,Tomtec,Inc.,Hamden,CT)清洗4次。

对于YFP ELISA，使用Evrogen重组Phi-YFP 1mg/mL(Axxora LLC,Farmingdale,NY)作为标准品。使用5参数拟合标准曲线(1ng/ml-0.125ng/ml标准)以确保所有数据均落在该曲线的线性部分。向孔中添加100μL标准品或样品。使用在测定缓冲液中最少1:4稀释的样品。将平板置于平板摇床(250rpm；Titer Plate摇床)上室温温育1小时，随后用350μL清洗缓冲液(Tomtec QuadraWash^TM2)清洗4次。向每个孔添加大约100μL 1μg/mL Evrogen兔多克隆抗-PhiYFP第一抗体(Axxora)。将平板置于平板摇床上以250rpm室温温育1小时，随后用350μL清洗缓冲液(Tomtec QuadraWash^TM2)清洗4次。接着，添加100μL用封闭/测定缓冲液以1:5000稀释的抗-兔IgG HRP第二抗体(Thermo Scientific)，使用Envirologix的试剂盒(Portland,ME)对PAT蛋白进行定量。ELISA使用多个稀释的植物提取物，且基本上使用由供应商提供的试剂和使用说明。

实施例7：与新型启动子可操作连接的转基因的稳定表达

在转基因植物组织中对蛋白表达进行观察。例如，观察在通过与土壤杆菌共培养而稳定转化的T₀植物的愈伤组织中的PhiYFP表达。从使用含有新型启动子pDAB105744(大刍草v2,图9)和对照启动子pDAB105748(玉米栽培种B73,图8)的二元载体构建体转化的玉米胚培植转基因植物。在使用YFP滤镜和500nm光源的立体显微镜(Leica Microsystems,Buffalo Grove,IL)下观察植物愈伤组织。图10显示了在包含pDAB105744的转基因T₀玉米植物的愈伤组织中观察到的PhiYFP稳定表达的代表性实例，并与对照pDAB105748进行比较。数据证实，如本文所述的包含pDAB105744(大刍草v2)的新型启动子能够驱动PhiYFP基因在T₀转基因植物的愈伤组织中强烈表达。

如表8所示，将含有低拷贝数(即1-2个拷贝)PhiYFP转基因的整株植物培植在温室中。一般地，每个构建体有大约5个到大约10个事件，每个事件有大约5株植物用于T₁表达分析。ELISA数据表明，与对照构建体pDAB105748(玉米栽培种B73)相比，在使用含有新型启动子pDAB105744(大刍草v2)的载体构建体的T₁大刍草植物的叶中存在PhiYFP蛋白的一致性表达。

在包含新型启动子构建体pDAB105744(大刍草v2，图9)的T₁植物中观察到的平均PhiYFP蛋白表达为大约269.9ng/mg(+/-88.0ng/mg)PhiYFP，相比之下，在包含对照构建体pDAB105748(玉米栽培种B73，图8)的对照植物中产生的PhiYFP蛋白为大约285.3ng/mg(+/-22.7ng/mg)。从这些结果可以确认，本文所述的来自大刍草v2的新型启动子可用于以高水平蛋白产生制造转基因性状。

此外，所有包含pDAB105744(大刍草v2)的T₁植物的平均PAT表达为大约209.6ng/mg(+/-28.5ng/mg)，而在包含来自玉米栽培种B73启动子的pDAB105748的对照植物中产生的PAT蛋白为大约105.8ng/mg(+/-7.4ng/mg)。总体上，所有植物的PAT蛋白表达均显著低于大刍草植物中观察到的PhiYFP基因的表达。

对于代表本文中描述的每种新启动子构建体的选定T₁转基因植物，还测量了这些植物的雄穗(tassel)的花粉中的PhiYFP蛋白表达。如图11所示，转基因花粉的图形分析确认，包含如本申请所述pDAB105744(大刍草v2)的新型启动子可在花粉中驱动PhiYFP蛋白的高表达。

实施例8:载体构建

图12中显示了二元表达载体构建体pDAB112854。该pDAB112854构建体包含PhiYFP报告基因和ZmPer5 3’-UTR，受ZmUbi-1启动子v2驱动。该pDAB112854构建体还包含AAD-1v3基因和ZmLip 3'-UTR v1，受大刍草v2驱动。

pDAB112854构建体使用标准方法学，例如Ausubel et al.(1995)、Sambrook etal.(1989)，及其更新版本中描述的方法学来创建。用于土壤杆菌介导的玉米胚转化的转化载体或表达载体使用标准克隆方法和重组反应来构建，使用标准的目的二元载体，以及包含如上所述的基因表达盒的入门载体。

实施例9：与新型启动子可操作连接的转基因的稳定植物表达

在温室中培育含有低拷贝数(即，1-2个拷贝)的PhiYFP转基因的全植物。用十五(15)个事件进行T₀表达分析，如表9(见下文)所示。所有被分析的事件均得到了强健的AAD1蛋白表达(见表9)。

将T₀单转基因拷贝植物与野生型B104玉米植物回交以得到T₁种子。将半合的T₁植物用于分析。对每种构建体的三个(3)构建体和5个(5)植物分析R3叶表达。将每个事件三个(3)事件用于其他组织类型的表达。

表10(见下文)显示了从包含新型启动子构建体的T₁转基因植物的叶组织获得的AAD1蛋白的定量测量。表10的数据确认了T₀叶表达结果(见表9)，并且进一步显示了AAD1蛋白在从含有本文所述的新型启动子的植物获得的R3叶及其他组织中一致的高表达。

Claims

1.一种基因表达盒，其包括与转基因可操作连接的启动子，其中该启动子包括与SEQID NO:2具有至少90％序列同一性的多核苷酸。

2.权利要求1的基因表达盒，其中该启动子在严格条件下与如下所述的多核苷酸探针杂交：该多核苷酸探针包含与SEQ ID NO:2的互补物的至少90％的序列同一性。

3.权利要求1的基因表达盒，其中该可操作连接的转基因编码多肽或小RNA。

4.权利要求1的基因表达盒，其中该转基因选自下组：杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、和选择标志物转基因。

5.权利要求1的基因表达盒，其进一步包括3'-非翻译区。

6.一种重组载体，其包括权利要求1的基因表达盒。

7.权利要求6的重组载体，其中该载体选自下组：质粒、粘粒、细菌人工染色体、病毒、和噬菌体。

8.一种转基因细胞，其包括权利要求1的基因表达盒。

9.权利要求8的转基因细胞，其中该转基因细胞是转基因植物细胞。

10.一种转基因植物，其包括权利要求9的转基因植物细胞。

11.权利要求10的转基因植物，其中该转基因植物是单子叶植物或双子叶植物。

12.权利要求11的转基因植物，其中该单子叶植物选自下组：玉米植物，水稻植物，和小麦植物。

13.来自权利要求10的转基因植物的转基因种子。

14.一种转基因细胞，其包含与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的合成多核苷酸。

15.权利要求14的转基因细胞，其中该合成多核苷酸在严格条件下与如下所述的多核苷酸探针杂交：该多核苷酸探针与SEQ ID NO:2的互补物包含至少90％的序列同一性。

16.权利要求14的转基因细胞，其中该转基因细胞是转基因植物细胞。

17.权利要求16的转基因细胞，其中该转基因植物细胞是通过植物转化方法产生的。

18.权利要求17的转基因细胞，其中该植物转化方法选自下组：土壤杆菌介导的转化法，生物射弹转化法，碳化硅转化法，原生质体转化法和脂质体转化法。

19.一种转基因植物，其包括权利要求14的转基因植物细胞。

20.权利要求19的转基因植物，其中该转基因植物是单子叶植物。

21.权利要求20的转基因植物，其中该单子叶植物选自下组：玉米植物，水稻植物，和小麦植物。

22.来自权利要求21的转基因植物的转基因种子。

23.一种重组载体，其包括权利要求14的基因表达盒。

24.权利要求23的重组载体，其中该载体选自下组：质粒、粘粒、细菌人工染色体、病毒和噬菌体。

25.一种用于在转基因植物中表达异源编码序列的方法，该方法包括：

a)用含有如下所述的多核苷酸序列的基因表达盒转化植物细胞：该多核苷酸序列包含与异源编码序列可操作连接的SEQ ID NO:2，该异源编码序列与3’非翻译区可操作连接；

b)分离包含该基因表达盒的转化植物细胞；

c)将该转化植物细胞再生成转基因植物；和

d)获得该转基因植物，其中该转基因植物包括所述含有包含SEQ IDNO:2的多核苷酸序列的基因表达盒。

26.权利要求25的方法，其中该异源编码序列选自下组：杀虫剂抗性编码序列、除草剂抗性编码序列、氮利用效率编码序列、水分利用效率编码序列、营养品质编码序列、DNA结合编码序列、和选择标志物编码序列。

27.权利要求25的方法，其中转化植物细胞是植物转化方法。

28.权利要求27的方法，其中该植物转化方法选自下组：土壤杆菌介导的转化法，生物射弹转化法，碳化硅转化法，原生质体转化法和脂质体转化法。

29.权利要求25的方法，其中该转基因植物是单子叶植物或双子叶转基因植物。

30.权利要求29的方法，其中该单子叶转基因植物选自下组：玉米植物，小麦植物，和水稻植物。

31.来自权利要求25的转基因植物的转基因种子。

32.权利要求25的方法，其中该异源编码序列在转基因植物组织中表达。

33.权利要求25的方法，其中该转基因植物组织是转基因植物根、芽、茎或花粉组织。

34.一种用于分离包含与SEQ ID NO:2的至少90％序列同一性的多核苷酸序列的方法，该方法包括：

a)鉴定包含与SEQ ID的至少90％序列同一性的多核苷酸序列；

b)产生多个寡核苷酸引物序列，其中该寡核苷酸引物序列能结合包含与SEQ ID的至少90％序列同一性的多核苷酸序列；

c)用选自该多个寡核苷酸引物序列的寡核苷酸引物序列从DNA样品扩增包含与SEQ ID的至少90％序列同一性的多核苷酸序列；和

d)分离包含与SEQ ID的至少90％序列同一性的多核苷酸序列。

35.权利要求34的方法，其中该包含与SEQ ID NO:2的至少90％序列同一性的分离多核苷酸序列与转基因可操作连接。

36.权利要求35的方法，其中该可操作连接的转基因编码多肽或小RNA。

37.一种纯化的多核苷酸序列，其包含与SEQ ID NO:2的至少90％的序列同一性，其中该纯化的多核苷酸序列促进转基因的表达。

38.权利要求37的纯化多核苷酸序列，其中包含与SEQ ID NO:2的至少90％序列同一性的多核苷酸探针序列在严格条件下与权利要求37的纯化多核苷酸序列杂交。

39.权利要求37的纯化多核苷酸序列，其中该纯化多核苷酸序列与转基因可操作连接。

40.权利要求39的可操作连接的转基因，其中该可操作连接的转基因编码多肽。

41.一种基因表达盒，其包含与转基因可操作连接的权利要求37的纯化多核苷酸序列，所述转基因与3’-非翻译区可操作连接。

42.权利要求41的基因表达盒，其中该转基因选自下组：杀虫剂抗性转基因、除草剂抗性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合蛋白转基因、和选择标志物转基因。

43.一种重组载体，其包括权利要求41的基因表达盒。

44.权利要求43的重组载体，其中该载体选自下组：质粒载体、粘粒载体、和BAC载体。

45.一种转基因细胞，其包括权利要求37的纯化多核苷酸序列。

46.权利要求45的转基因细胞，其中该转基因细胞是转基因植物细胞。

47.一种转基因植物，其包括权利要求46的转基因植物细胞。

48.权利要求47的转基因植物，其中该转基因植物是单子叶植物。

49.权利要求48的转基因植物，其中该单子叶植物选自下组：玉米植物，小麦植物，和水稻植物。

50.来自权利要求49的转基因植物的转基因种子。