CN105814207A

CN105814207A - 玉米调节元件及其用途

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Publication number: CN105814207A
Application number: CN201480068068.1A
Authority: CN
Inventors: M·古普塔; N·埃兰戈; K·N·穆图拉曼; J·贝林格; S·班尼特; H·吴; S·戈尔曼; A·渥尔登
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Corteva Agriscience LLC
Priority date: 2013-10-15
Filing date: 2014-10-15
Publication date: 2016-07-27
Also published as: EP3058073A1; AU2014337463A1; RU2016118631A; US20150106977A1; US10047367B2; AP2016009215A0; AU2017234672B2; WO2015057788A1; EP3058073A4; AR098032A1; KR20160067974A; IL245134A0; AU2017234672A1; AU2014337463B2; BR102014025574A2; JP2016533179A; EP3058073B1; UY35783A; CA2927342A1

Abstract

提供了用于在植物细胞和/或植物组织中表达转基因的载体构建体和方法，所述方法使用从玉米分离的基因调节元件，包括启动子、5’?UTR和/或3’?UTR。

Description

玉米调节元件及其用途

相关申请相互参考

本申请要求获得于2013年10月15日提交的美国临时专利申请No.61/890,901在35U.S.C.5§119(e)下的利益，其全部内容通过引用并入本申请。

电子提交材料的引用参考

本文引用与本文同时提交的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列列表的全部内容作为参考，其标识如下：一个11.4KB ASCII(文本)文件，名称为“74275”，创建于2014年10月1日。

发明领域

本发明一般地涉及植物分子生物学领域，更具体地，涉及在转基因植物中表达基因。

背景

植物转化是一种用于在不同作物植物物种中引入农艺学期望性状或特征的有吸引力的技术。开发和/或修饰植物物种使其具有特定的期望性状。一般地，期望的性状包括，例如，提高营养价值品质、增加产量、赋予有害生物或昆虫抗性、抗病性、提高干旱和胁迫耐受性、提高园艺品质(例如，色素沉着和生长)、赋予除草剂耐受性、使之能够从植物生产工业上有用的化合物和/或材料，和/或使之能够生产药物。

通过植物转化技术来产生包含堆叠在单个基因组座位处的多个转基因的转基因植物。植物转化技术导致转基因被引入到植物细胞中，回收在植物基因组中稳定整合了转基因拷贝的能育的转基因植物，随后通过转基因的转录和翻译进行转基因表达，从而产生具有期望性状和表型的转基因植物。堆叠的每一个转基因通常需要独立的启动子用于植物内的基因表达，因此在转基因堆叠中要使用多个启动子。

当需要共表达多个用于调节同一性状的转基因时，经常会导致同一启动子被重复使用以驱动多个转基因的表达。然而，重复使用包含具有高水平序列同一性的序列的启动子，可能会导致基于同源性的基因沉默(HBGS)。当在转基因中使用重复DNA序列时，已经观察到在转基因植物中经常会发生HBGS(Peremarti et al.,2010)。此外，在转基因构建体中反复使用相似的DNA序列已经证明在土壤杆菌中具有挑战性，因为质粒会重组和不稳定。

本文描述了玉米调节元件(例如，启动子、5’-UTR和3’-UTR)。进一步描述了使用玉米调节元件的构建体和方法。

概要

本文公开了用于在植物细胞和/或植物组织中表达转基因的纯化多核苷酸、载体、构建体和方法。在一个实施方案中，从玉米基因组纯化叶绿素a/b基因的调节元件，并将其与不是天然与所述调节元件连接的序列重组，从而产生用于在对该叶绿素a/b调节元件而言非天然的植物细胞中表达转基因的表达载体。在一个实施方案中，提供了表达载体，其中叶绿素a/b基因的调节元件与多接头序列可操作连接。这种表达载体使基因、转基因、或基因盒易于以与叶绿素a/b基因调节序列可操作连接的状态插入到载体中。

在一个实施方案中，提供包括SEQ ID NO:1的玉米叶绿素a/b启动子和5’非翻译区(5’-UTR)的构建体。在一个实施方案中，提供基因表达盒，其包括与转基因可操作连接的SEQ ID NO:1的玉米叶绿素a/b启动子。在一个实施方案中，构建体包括基因表达盒，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的玉米叶绿素a/b 3’UTR。在一个实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的玉米叶绿素a/b 3’UTR。在一个实施方案中，基因表达盒包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多个转基因。

在一个实施方案中，基因表达盒独立地包括a)SEQ ID NO:1的玉米叶绿素a/b启动子，b)SEQ ID NO:2的玉米叶绿素a/b 3’UTR和c)SEQ ID NO:3的玉米叶绿素a/b 3’UTR。

根据一个实施方案，提供包括与非叶绿素a/b转基因可操作连接的启动子的核酸载体，其中该启动子由SEQ ID NO:1或者与SEQ ID NO:1具有90％序列同一性的序列组成。在进一步的实施方案中，核酸载体包括基因盒，其中该基因盒包括启动子、非叶绿素a/b转基因、和3’非翻译区，其中该启动子由与转基因第一末端可操作连接的SEQ ID NO:1组成，其中该转基因的第二末端与由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3组成的3’非翻译区操作连接。

本文公开了培育使用玉米叶绿素a/b启动子和3’-UTR表达转基因的植物的方法。本文还公开了培养使用玉米启动子和3’-UTR表达转基因的植物组织和细胞的方法。在一个实施方案中，本文公开的方法包括在植物茎、叶、穗轴(cob)、须(silk)、籽粒(kernel)、茎、壳(husk)和花粉组织中的组织特异性基因表达。

在进一步的实施方案中，本文公开了提高第二基因表达盒中包含的感兴趣基因的过表达的方法。相应地显示了，SEQ ID NO:1的玉米启动子、以及SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的玉米3’-UTR可以提高位于不同的第二基因表达盒内的感兴趣基因的表达，该第二基因表达盒位于第一基因表达盒的附近(第一基因表达盒确实含有SEQ ID NO:1的玉米启动子和SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的玉米3’-UTR，且该第二基因表达盒不含有SEQ ID NO:1的玉米启动子和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的玉米3’-UTR)。在一些实施方案中，第一基因表达盒距离第二基因表达盒约1,000bp,2,000bp,3,000bp,4,000bp,5,000bp,6,000bp,7,000bp,8,000bp,9,000bp,10,000bp,12,000bp,或15,000bp。在其他实施方案中，感兴趣的第二基因的表达被提高约1.25倍，1.5倍，1.75倍，2倍，2.5倍，3.0倍，或3.5倍，其中位于附近的第一基因表达盒包括SEQ ID NO:1的玉米启动子和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的玉米3’-UTR。

根据一个实施方案，提供包括与非叶绿素a/b转基因操作连接的启动子的植物、植物组织或植物细胞，其中该启动子包括SEQ ID NO:1。根据一个实施方案，提供包括与转基因操作连接的SEQ ID NO:1，或者与SEQ ID NO:1具有90％序列同一性的序列的植物或植物细胞。在一个实施方案中，植物是玉米品种。在一个实施方案中，提供包括与非叶绿素a/b转基因操作连接的启动子的植物、植物组织或植物细胞，其中该启动子由SEQ ID NO:1组成。在一个实施方案中，提供包括基因表达盒的植物或植物细胞，其中该基因表达盒包括与转基因操作连接的启动子，进一步其中该启动子由SEQ ID NO:1组成。在进一步的实施方案中，启动子与转基因的第一末端操作连接，其中该转基因的第二末端与由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3组成的3’非翻译序列操作连接。

附图简述

图1的示意性流程图显示了使用下一代测序(NGS)的转录概貌分析方法在玉米中鉴定高表达基因的过程。

图2显示SEQ ID NO:1的玉米启动子及控制cry34Ab1报告基因表达的StPinII 3’-UTR调节元件之pDAB114410载体质粒图。

图3显示SEQ ID NO:1的玉米启动子和控制PhiYFP报告基因表达的SEQ ID NO:2调节元件的3’-UTR之pDAB116008载体质粒图。

图4显示pDAB101556对照载体的图，其包含YFP报告基因，代替了试验启动子构建体pDAB114410中存在的cry34Ab1报告基因。YFP基因的表达受玉米泛素-1(ZmUbi1)启动子和玉米Per5(ZmPer5)3’-UTR的控制。

图5显示包含受ZmUbi1启动子驱动的cry34Ab1报告基因及StPinII3’-UTR的阳性对照载体pDAB108746的图。

图6显示包含控制cry34Ab1报告基因表达的SEQ ID NO:1玉米启动子及3’-UTR SEQ ID NO:3调节元件的一个版本的pDAB120167载体质粒图。

详细说明

定义

在描述和要求保护本发明时，将根据下文给出的定义使用如下的术语。

如本文所使用的，术语“约”意思是比所述的数值或数值范围大或小10％，而并不意图给这个更广泛的定义指定任何数值或数值范围。前面带有术语“约”的每一个数值或数值范围还意图包括所述绝对数值或数值范围的实施方案。

如本文所使用的，术语“回交”是指这样的过程，其中育种者将杂交后代与亲本之一杂交，例如第一代杂交体F1与F1杂交体的亲本基因型之一杂交。

“启动子”是能够在细胞中结合RNA聚合酶并引起下游(3’方向)编码序列转录的DNA调节区域。启动子可以含有被转录因子识别的特异序列。这些因子可以结合启动子DNA序列，导致RNA聚合酶的招募。为限定本发明的目的，启动子序列的3’端以转录起始位点(例如核糖体结合位点)为边界，并向上游(5’方向)延伸以包含为引发高于背景的可检测水平的转录所需的最少数目的碱基或元件。在启动子序列内会发现转录起始位点(方便地，用例如核酸酶S1定位加以限定)以及负责RNA聚合酶结合的蛋白结合域(共有序列)。启动子可以和其它表达控制序列(包括增强子和阻遏物序列)操作性地关联。

为本公开的目的，“基因”包括编码基因产物(见下文)的DNA区域，以及调节基因产物产生的区域，无论这些调节序列是否与编码和/或转录序列毗邻)。因此，基因包括，但不必仅限于，启动子序列、终止子、翻译调节序列如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点，增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制原点、基质附着位点和基因座控制区域。

如本文所使用的，术语“天然的”或“自然的”是限定在自然中发现的条件。“天然DNA序列”是自然存在的DNA序列，它是通过自然方法或传统育种技术产生的，而不是通过遗传工程(例如使用分子生物学/转化技术)产生的。

如本文中所使用的，“转基因”被定义为编码基因产物(包括例如但不仅限于mRNA)的核酸序列。在一个实施方案中，转基因是外源核酸，其中该转基因序列通过遗传工程被引入到通常不会发现该转基因的宿主细胞(或其后代)中。在一个实例中，转基因编码工业上或药学上有用的化合物，或者编码期望农艺学性状的基因(例如，除草剂耐受性基因)。在又一个实例中，转基因是反义核酸序列，其中该反义核酸序列的表达会抑制靶核酸序列的表达。在一个实施方案中，转基因是内源核酸，其中想要获得该内源核酸的额外基因组拷贝，或者转基因是相对于宿主生物体内的靶核酸序列呈反义方向的核酸。

如本文所使用的，术语“非叶绿素a/b转基因”是任何这样的转基因，其编码与玉米叶绿素a/b编码序列(SEQ ID NO:17)所编码的蛋白质具有小于90％序列同一性的蛋白质。

如本文所定义的，“基因表达”是基因中含有的信息被转变成基因产物。

如本文所定义的，“基因产物”是由基因产生的任何产物。例如，基因产物可以是基因的直接转录产物(例如mRNA,tRNA,rRNA,小rRNA，反义RNA,干扰RNA,核糖体,结构RNA或任何其它类型的RNA)或者由mRNA反义产生的蛋白质。基因产物还包括通过例如加帽、多腺苷酸化、甲基化和编辑等处理被修饰的RNA，和通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、豆蔻酰化和糖基化被修饰的蛋白质。基因表达会受到外部信号的影响，例如，细胞、组织或生物体暴露于可增加或减少基因表达的作用剂。还可以在从DNA到RNA到蛋白质的通路中的任何位置调节基因表达。基因表达调控通过，例如，对转录、翻译、RNA转运和加工、中间分子例如mRNA的降解进行控制，或者通过在特定蛋白分子已经产生之后使其活化、失活、区室化或降解，或者上述者的组合而发生。基因表达可以通过本领域已知的任何方法，包括但不仅限于，Northern印迹、RT-PCR法、Western印迹，ELISA测定，，或者体外、原位或体内蛋白质活性测定，在RNA水平或蛋白质水平进行测量。

如本文所使用的，术语“小RNA”是指数种类型的非编码核糖核苷酸(ncRNA)。术语“小RNA”描述了在细菌细胞、动物、植物和真菌中产生的短链ncRNA。这些短链的ncRNA可以在细胞内自然产生，或者可以通过表达该短链ncRNA的外源序列的引入而产生。小RNA序列不直接编码蛋白质，并且与其他RNA具有功能上的差异，体现在小RNA仅被转录但不被翻译。小RNA序列参与其他细胞功能，包括基因表达和修饰。小RNA分子通常由约20-30个核苷酸构成。小RNA序列可以来源于更长的前体。前体形成可以在自我互补的区域中彼此对折的结构；它们然后被动物体内的核酸酶Dicer、植物中的DCL1、或者其它加工小RNA分子的酶加工。

有许多类型的小RNA存在于自然界或者人工产生，包括微小RNA(miRNAs)，小干扰RNA(siRNAs)，反义RNA，短发夹RNA(shRNA)，和小核仁RNA(snoRNA)。某些类型的小RNA，例如微小RNA和siRNA，在基因沉默和RNA干扰(RNAi)是重要的。基因沉默是一种基因调控，其中通常会表达的基因被细胞内元件(在这种情况下是小RNA)所“关闭”。通常由该遗传信息形成的蛋白质由于干扰而不能形成，并且该基因编码的信息的表达被阻断。

如本文所使用的，术语“小RNA”包括在文献中描述的RNA分子，如“细小RNA(“tiny RNA”)(Storz,(2002)Science 296:1260-3；Illangasekare et al.,(1999)RNA 5:1482-1489)；原核“小RNA”(sRNA)(Wassarman et al.,(1999)Trends Microbiol.7:37-45)；真核“非编码RNA(ncRNA)”；“微小RNA(miRNA)”；“小非编码mRNA(snmRNA)”；“功能性RNA(fRNA)”；“转运RNA(tRNA)”；“催化性RNA”[例如，核酶，包括自酰化核酶(Illangaskare et al.,(1999)RNA 5:1482-1489)；“小核仁RNA(snoRNAs)”；“tmRNA”(也称作“10SRNA”,Muto et al.,(1998)Trends Biochem Sci.23:25-29；和Gillet et al.,(2001)Mol Microbiol.42:879-885)；RNAi分子包括但不仅限于“小干扰RNA(siRNA)”,“核糖核酸内切酶制备的siRNA(e-siRNA)”,“短发夹RNA(shRNA)”,和“小瞬时调节的RNA(stRNA)”；“diced siRNA(d-siRNA)”,和适体、寡核苷酸和其他包含至少一个尿嘧啶碱基的合成核酸。

如本文所使用的，术语“内含子”的定义是基因(或者被表达的感兴趣核苷酸序列)中包含的任何被转录但不被翻译的核酸序列。内含子包括被表达的DNA序列内的非翻译核酸序列，以及从上述DNA转录的RNA分子中的相应序列。

本文所述的构建体还可以包含可增强翻译和/或mRNA稳定性的序列，例如内含子。这样的一个内含子的实例是拟南芥组蛋白H3变异体基因II的第一内含子，或者任何其它公知的内含子序列。内含子可以和启动子序列组合使用，以提高翻译和/或mRNA稳定性。

如本文所使用的，术语“5’非翻译区”或“5’-UTR”的定义是前mRNA或成熟mRNA 5’端的非翻译区段。例如，在成熟的mRNA上，5’-UTR通常在其5’端有一个7-甲基鸟苷帽，并且参与许多过程，例如剪接、多腺苷酸化、mRNA外排到细胞质、mRNA的5’端被翻译机器识别，和保护mRNA免于降解。

如本文所使用的，术语“转录终止子”的定义是前mRNA或成熟mRNA3’端的转录区段。例如，越过“多腺苷酸化信号”位点的较长DNA段被转录为前mRNA。这样的DNA序列通常含有一个或多个转录终止信号，用于将前mRNA适当地加工成成熟的mRNA。

如本文所使用的，术语“3’非翻译区”或“3’-UTR”的定义是前mRNA或成熟mRNA 53’端的非翻译区段。例如，在成熟的mRNA上，这个区域具有多-(A)尾巴，并且已知在mRNA稳定性、翻译起始和mRNA外转运中具有多种功能。

如本文所使用的，术语“多腺苷酸化信号”指的是mRNA转录本中存在的核酸序列，其在多-(A)聚合酶存在时允许转录本在多腺苷酸化位点(例如位于多-(A)信号下游10-30个碱基)处被多腺苷酸化。许多多腺苷酸化信号是本领域已知的，并可用于本发明。一个示例性序列包括AAUAAA及其变异体，如Loke J.,et al.,(2005)Plant Physiology 138(3)；1457-1468所述。

如本文所使用的，术语“分离的”意思是与其自然环境中分开，或者与该组分首次形成时存在的其它化合物分开。术语“分离的”包括从天然来源分离的材料，以及在宿主细胞内重组表达制备后回收的材料(例如核酸和蛋白质)，或者化学合成的化合物，例如核酸分子、蛋白质和肽。

如本文所使用的，术语“纯化的”是指这样的形式的分子或化合物，其实质上游离于在天然或自然环境中通常与该分子或化合物关联的污染物，或者与该化合物首次形成时存在的其它化合物相比在浓度上相当大地富集，并且意味着由于与原始组合物的其它组分分离而使纯度增加。本文使用的术语“纯化的核酸”是描述这样的核酸序列，其与其它生物化合物分离或者分离产生，或者与这些化合物生物化合物纯化分开，包括但不仅限于多肽、脂质和碳水化合物，同时会影响组分中的化学或功能改变(例如，核酸可以通过除去蛋白质污染物和断裂连接该核酸与染色体中其余DNA的化学键而从染色体中纯化)。

如本文所使用的，术语“基于同源性的基因沉默”或“HBGS”是通用术语，包括转录基因沉默和转录后基因沉默。靶基因座被非连锁的致沉默基因座(silencing locus)所沉默可以是转录抑制(转录基因沉默；TGS)或mRNA降解(转录后基因沉默；PTGS)的结果，转录抑制和mRNA降解分别是由于产生了相应于启动子或转录序列的双链RNA(dsRNA)所导致的。这两个过程各自涉及迥异的细胞组分，提示dsRNA诱导的TGS和PTGS很可能来自于某个古老共同机制的趋异化。然而，难以实现对TGS和PTGS的严格比较，因为这一般依赖于对不同的致沉默基因座的分析。可以说单个转基因座位能触发TGS和PTGS二者，因为会产生相应于不同靶基因的启动子和被转录序列的dsRNA。

如本文所使用的，术语“核酸分子”、“核酸”或“多核苷酸”(所有这三个术语彼此之间是同义的)是指多聚体形式的核苷酸，可以包括RNA、cDNA、基因组DNA的有义和反义链，及其合成形式和混合聚合物。“核苷酸”可以指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或或任一种核苷酸的修饰形式。除非另外指出，否则核酸分子的长度通常为至少10个碱基。该属于可以指不定长度的RNA或DNA分子。该术语包括单链和双链形式的DNA。核酸分子可以包括天然存在的核苷酸和/或修饰的核苷酸，该修饰的核苷酸由天然存在的和/或非天然存在的核苷酸联接连接在一起。

核酸分子可以被化学修饰或者生物化学修饰，或者可以包含非天然的或衍生化的核苷酸碱基，这是本领域技术人员可以容易理解的。这些修饰包括，例如，标签、甲基化、一个或多个天然发生的核苷酸被类似物取代、核苷酸内部修饰(例如不带电的连接：例如，甲基膦酸酯，磷酸三酯，磷酰胺，氨基甲酸酯等；带电荷的连接：例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等；悬垂部分：例如，肽；嵌入剂：例如，吖啶，补骨脂素等；螯合剂；烷化剂；和修饰的键：例如，α异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑构象，包括单链、双链、部分双链体、三链体(triplexed)，发夹式(hairpinned)，圆形和挂锁构象。

转录沿着DNA链沿着5’-3’的方式推进。这意味着，RNA是通过向生长中的链的3’端顺次添加核糖核苷酸-5’-三磷酸(要求去除焦磷酸)而产生的。在线性或环状核酸分子中，如果个别元件(例如，特定的核苷酸序列)键合在或者将要键合在相同核酸上的其他元件的5’方向上，则其称作位于该其他的元件的“上游”。类似地，如果个别元件键合在或者将要键合在相同核酸上的其他元件的3’方向上，则其称作位于该其他元件的“下游”。

如本文所使用的，术语“碱基位置”是指给定碱基或核苷酸残基在指定核酸内的位置。指定的核酸可以通过与参考核酸进行比对加以定义。

如本文所使用的，术语“杂交”是指这样的过程，其中寡核苷酸和它们的类似物通过互补碱基之间的氢键杂交，氢键包括Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键。一般地，核酸分子包括含氮碱基，其是嘧啶(胞嘧啶(C)，尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))。这些含氮碱基在嘧啶与嘌呤之间形成氢键，嘧啶与嘌呤的键合称作“碱基配对”。更具体地，A与T或U氢键键合，G与C键合。“互补”是指两个不同核酸序列或同一核酸序列的两个不同区域之间发生的碱基配对。

如本文所使用的，术语“可特异性杂交”或“特异性互补”是指足够程度的互补性，使得在寡核苷酸和DNA或RNA靶之间发生稳定而特异的结合。特异性杂交不需要寡核苷酸与其靶序列100％互补。当寡核苷酸与靶DNA或RNA分子的结合会干扰靶DNA或RNA的正常功能，并且有足够程度的互补性从而在特异性结合所期望的条件下(例如在体内测定或系统的生理条件下)避免寡核苷酸与非靶序列发生非特异性结合时，寡核苷酸是可以特异性杂交的。这种结合被称作特异性杂交。导致特定严格程度的杂交条件随着所选杂交方法的性质和杂交核酸序列的组成和长度而改变。一般地，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(特别是Na⁺和/或Mg²⁺浓度)对杂交严格性有贡献，但清洗次数也会影响严格性。关于获得特定严格程度所需的杂交条件的计算在Sambrooket al.(ed.),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,第1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989，第9和11章中有讨论。

如本文所使用的，术语“严格条件”包括这样的条件，其中只有当杂交分子和DNA靶之间的错配小于50％时才会发生杂交。“严格条件”包括进一步特定水平的严格性。例如，如本文所使用的，“中等严格”条件是指序列错配超过50％的分子不会杂交的条件；“高严格”条件是指序列错配超过20％的序列不会杂交的条件；“极高严格”条件是指序列错配超过10％的序列不会杂交的条件。

在特定的实施方案中，严格条件可以包括在65℃杂交，随后在65℃用0.1x SSC/0.1％SDS清洗40分钟。下面是代表性的、非限制性的杂交条件：

·极高严格性：在5x SSC缓冲液中65℃杂交16个小时；在2xSSC缓冲液中室温下清洗2次，每次15分钟；和在0.5x SSC缓冲液中65℃清洗2次，每次20分钟。

·高严格性：在5-6x SSC缓冲液中65-70℃杂交16-20个小时；在2x SSC缓冲液中室温下清洗2次，每次5-20分钟；和在1x SSC缓冲液中55-70℃清洗2次，每次30分钟。

·中等严格性：在6x SSC缓冲液中在室温-55℃杂交16-20个小时；在2x-3x SSC缓冲液中室温下清洗至少2次，每次20-30分钟。

在一个实施方案中，可特异性杂交的核酸分子能够在极高严格性杂交条件下保持结合。在一个实施方案中，可特异性杂交的核酸分子能够在高严格性杂交条件下保持结合。在一个实施方案中，可特异性杂交的核酸分子能够在中等严格性杂交条件下保持结合。

如本文所使用的，术语“寡核苷酸”是指短的核酸聚合物。寡核苷酸可以通过切割长核酸区段或者通过聚合核苷酸前体个体而形成。自动合成仪允许合成长度达数百个碱基对的寡核苷酸。因为寡核苷酸可以结合互补的核苷酸序列，故被用作检测DNA或RNA的探针。由DNA构成的寡核苷酸(寡脱氧核糖核苷酸)可以用在PCR中，聚合酶链式反应是一种用于扩增小DNA序列的技术。在PCR中，寡核苷酸通常被称作“引物”，其允许DNA聚合酶延伸寡核苷酸并复制互补链。

如本文所使用的，术语“聚合酶链式反应”或“PCR”指如下的程序或技术，其中微量的核酸、RNA和/或DNA被扩增，如美国专利No.4,683,195所述。一般地，来自感兴趣区域末端或该末端以外的序列信息必须可得，才能设计寡核苷酸引物；这些引物在序列上与待扩增模板的相对链相同或相似。两个引物的5’端核苷酸可以和被扩增材料的末端一致。PCR可用于扩增特定的RNA序列，从总基因组DNA中扩增特定的DNA序列，和从总细胞RNA、噬菌体或质粒序列中转录cDNA，等。一般地参见Mullis et al.,Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.,51:263(1987)；Erlich编辑,PCR Technology,(Stockton Press,NY,1989)。

如本文所使用的，术语“引物”是指当条件适合于合成引物延伸产物时，能够作为沿着互补链的合成起始点的寡核苷酸。合成条件包括存在四种不同的脱氧核糖核苷酸三磷酸和至少一种聚合诱导剂，例如逆转录酶或DNA聚合酶。它们存在于合适的缓冲液中，该缓冲液包括辅助因子或可以在各种合适的温度下影响条件例如pH等的成分。引物优选地是单链序列，从而可以使扩增效率最佳，但是也可以使用双链序列。

如本文所使用的，术语“探针”是指与靶序列杂交的寡核苷酸序列。在或类型的测定程序中，探针与位于两个引物退火位点之间的靶部分杂交。探针包括约8个核苷酸，约10个核苷酸，约15个核苷酸，约20个核苷酸，约30个核苷酸，约40个核苷酸，或者约50个核苷酸。在一些实施方案中，探针包括约8个核苷酸至约15个核苷酸。

探针可以进一步包括可检测的标签，例如荧光团(异硫氰酸荧光素等)。可检测的标签可以直接共价连接到探针寡核苷酸上，例如位于探针的5’端或探针的3’端。包含荧光团的探针还进一步包括淬灭剂，例如Black Hole Quencher^TM,Iowa Black^TM等。

如本文所使用的，术语“序列同一性”或“同一性”可以互换使用，并且指当通过比对在特定比较窗口上实现最大的相应度时两个序列中相同的核酸残基或氨基酸残基。

如本文所使用的，术语“百分比序列同一性”是指通过比较在比较窗口上最佳比对的序列(例如，核酸序列或氨基酸序列)确定的数值，其中一个序列在比较窗口中的部分与参考序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，缺口)，以便使两个序列实现最佳比对。百分数的计算是通过确定两个序列中出现相同核酸或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数，所得结果乘以100，从而产生百分比序列同一性。用于比对序列用于比较的方法是众所周知的。各种程序和比对算法在下列文献中有描述，例如：Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins andSharp(1988)Gene 73:237-44；Higgins and Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Corpetet al.(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang et al.(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson et al.(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana et al.(1999)FEMS Microbiol.Lett.174:247-50。

美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLAST^TM；Altschulet al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10)可以从多个来源获得，包括美国国家生物技术信息中心(Bethesda,MD)和在因特网上，用于和多种序列分析程序结合使用。关于如何使用该程序确定序列同一性的描述可以在互联网上在BLAST^TM的“帮助”部分获得。对于核酸序列的比较，可以使用默认参数执行BLAST^TM程序的“BLAST 2序列”功能(Blastn)。当使用这种方法进行评估时，与参考序列的相似性越大的核酸序列将显示越高的百分比同一性。

如本文所使用的，术语“可操作连接”是指两个组分被布置成彼此在功能上相关。术语“可操作连接”在用于指称调节序列和编码序列时，意思是调节序列会影响所连接的编码序列的表达。“调节序列”、“调节元件”或“控制元件”是指可影响转录的时限和水平/量、RNA加工或稳定性、或者相关编码序列的翻译的核酸序列。调节序列可以包括启动子；翻译前导序列；5’和3’非翻译区；内含子；增强子；茎环结构；阻遏物结合序列；终止序列；多腺苷酸化识别序列等。某个调节序列可以位于与之可操作连接的编码序列的上游和/或下游。另外，与编码序列可操作连接的某个调节序列可以位于双链核酸分子的相关互补链上。连接可以通过在便宜的限制位点处的连接作用实现。如果这些位点不存在，那么根据常规做法使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。然而，可操作连接的元件不必是毗邻的。

如本文所使用的，术语“转化”涵盖所有能够将核酸分子引入到细胞内的技术。实例包括，但不仅限于：病毒载体转染；质粒载体转化；电穿孔；脂质体转染；显微注射(Mueller et al.(1978)Cell 15:579-85)；土壤杆菌介导的转移；直接DNA摄入；WHISKERS^TM介导的转化；和微射弹轰击。转化可以是稳定的，其中核酸分子被整合到植物的基因组中，并随后一代一代地传递。相反，转化可以是瞬时的，其中核酸分子位于细胞的细胞质或细胞核中，并被整合到植物的基因组内。这种瞬时转化体可导致从核酸分子上存在的编码序列表达蛋白质或基因产物。

如本文所使用的，术语“转导”是指病毒将核酸转移到细胞内的过程。

如本文所使用的，术语“多接头”或“多克隆位点”的定义是一群1个或多个2型限制酶位点。相邻对的限制位点在核酸序列上彼此之间的距离在10个核苷酸之内。包含多接头的构建体用于插入和/或切除核酸序列，例如基因的编码序列，核糖体结合序列、内含子、或5’-UTR。

如本文所使用的，术语“限制性核酸内切酶”和“限制性酶”是指多种细菌酶，每一种酶在特定的核苷酸序列处或其附近切割双链DNA。2型限制性酶可识别并在相同位点进行切割，包括但不仅限于XbaI,BamHI,HindIII,EcoRI,XhoI,SalI,KpnI,AvaI,PstI和SmaI。

术语“载体”与术语“构建体”、“克隆载体”和“表达载体”可互换使用，意指能够将DNA或RNA序列(例如外来基因)引入到宿主细胞内，从而转化宿主并促进被引入的序列的表达(例如，转录和翻译)的媒介。“非病毒载体”意图指任何不包括病毒或逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，“载体”是包含至少一个DNA复制原点和至少一个选择标志物基因的DNA序列。实例包括，但不仅限于，质粒、粘粒、噬菌体、细菌人工染色体(BAC)，或可携带外来DNA进入细胞的病毒。载体还可以包括一个或多个基因、反义分子和/或选择标志物基因和本领域已知的其它遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，借此导致细胞表达核酸分子和/或由该载体编码的蛋白质。术语“质粒”的定义是能够在原核生物或真核生物宿主细胞内自主复制的环形链核酸。该术语包括的核酸可以是DNA或RNA，并且可以是单链或双链。该质粒定义还包括相应于细菌复制原点的序列。

如本文所使用的，术语“选择标志物基因”定义这样的基因或其它表达盒，其编码的蛋白质可以帮助鉴定其中插入了该选择标志物基因的细胞。例如，“选择标志物基因”包括报告基因，以及在植物转化中用于，例如，保护植物细胞免于被选择剂破坏或提供对选择剂的抗性/耐受性的基因。在一个实施方案中，只有那些接受了功能性可选择标志物的细胞或植物才能够在具有选择剂的条件下分裂或生长。选择剂的实例包括，例如，抗生素，包括壮观霉素，新霉素，卡那霉素，巴龙霉素，庆大霉素，和潮霉素。这些选择标志物包括新霉素磷酸转移(npt II)，其表达的酶可赋予对抗生素卡那霉素的抗性，和用于相关抗生素新霉素、巴龙霉素、庆大霉素和G418的基因，或者用于潮霉素磷酸转移酶(hpt)的基因，其表达的酶可赋予对潮霉素的抗性。其它选择标志物基因可以包括编码除草剂耐受性的基因，包括bar或pat(抵抗草铵膦铵盐或草胺膦)，乙酰乳酸合成酶(ALS，抵抗抑制剂例如磺酰脲类(SU)，咪唑啉酮类(IMI)，三唑并嘧啶(TP)，嘧啶氧基苯甲酸(pyrimidinyloxybenzoate)(POB)，和磺酰羰基三唑啉酮，其可阻止支链氨基酸合成的第一步，草甘膦，2,4-D和金属抗性或敏感性。可以用来作为选择标志物基因的“报告基因”的实例包括可以目视观察所表达报告基因的蛋白，例如编码β葡糖苷酸酶(GUS)、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白蛋白(YFP)、DsRed、β半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、碱性磷酸酶和类似物的蛋白质。短语“标志物阳性”是指已经被转化为包含选择标志物基因的植物。

如本文所使用的，术语“可检测标志物”是指能够检测的标签，例如放射性同位素，荧光化合物，生物发光化合物，化学发光化合物，金属螯合剂，或酶。可检测标记物的实例包括，但不仅限于，以下：荧光标记(例如，FITC，罗丹明，镧系磷光体)，酶标记(例如辣根过氧化物酶，β半乳糖苷酶，萤光素酶，碱性磷酸酶)，化学发光，生物素基团，可以被第二报告分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列，第二抗体的结合位点，金属结合结构域，表位标签)。在一个实施方案中，可检测标记物可以通过各种长度的间隔臂附着，以减少潜在的空间位阻。

如本文所使用的，术语“检测”使用其最广泛的含义，包括对特定分子的定性和定量测量，例如测量特定的多肽。

如本文所使用的，术语“盒”、“表达盒”和“基因表达盒”是指能够被插入到核酸或多核苷酸的特定限制位点处或者通过同源重组被插入的DNA区段。DNA区段包括编码感兴趣多肽的多核苷酸，并且该盒子和限制位点被设计成确保盒子以正确的阅读框被插入，以保证转录和翻译。在一个实施方案中，表达盒可包括编码感兴趣多肽的多核苷酸，并具有除该多核苷酸之外的元件以促进特定宿主细胞的转化。在一个实施方案中，基因表达盒还可以包括如下元件，其允许在宿主细胞中增强编码感兴趣多肽的多核苷酸的表达。这些元件可以包括，但不仅限于：启动子，最小启动子，增强子，应答元件，终止子序列，多腺苷酸化序列，等。

如本文所使用的，术语“接头”或“间隔子”是将两个分离的实体彼此连接的键、分子或分子基团。接头和间隔子可以为两个实体提供最佳的空间间隔，或者可以进一步提供不稳定的连接，以允许两个实体彼此分离。不稳定的连接包括光可裂解(photocleavable)基团，酸不稳定部分，碱不稳定部分和酶可裂解基团。

如本文所使用的，术语“对照”是指在分析程序用于比较目的的样品。对照可以是“阳性”或“阴性”。例如，当分析程序的目的是检测细胞或组织中差异表达的转录本或多肽时，一般优选地包含阳性对照，例如来自已知显示期望表达的植物的样品，和阴性对照，例如来自已知缺少期望表达的植物的样品。

如本文所使用的，术语“植物”包括整株植物和其任何后代，细胞，组织，或植物的一部分。可以在本发明中使用的植物类别一般广泛地包括高等和低等植物，其适合于诱变，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)，裸子植物，蕨类植物和多细胞藻类。因此，“植物”包括双子叶和单子叶植物。术语“植物部分”包括植物的任何部分，包括例如但不仅限于：种子(包括成熟种子和未成熟种子)；植物插枝；植物细胞；植物细胞培养物；植物器官(例如，花粉、胚、花、果实、芽、叶、根、茎、和外植体)。植物组织或植物器官可以是种子、原生质体、愈伤组织，或者任何其他被组织为结构或功能单位的植物细胞群。植物细胞或组织培养物可能能够再生出具有该细胞或组织所来源的植物的生理学和形态学特征的植物，并且能够再生出具有与该植物基本上相同的基因型的植物。与此相反，一些植物细胞不能被再生而产生植物。植物细胞或组织培养物中可再生的细胞可以是胚、原生质体、分生细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、须(silk)、花、果仁、穗、穗轴、壳、或茎杆。

植物部分包括可收获的部分和可用于繁殖后代植物的部分。可用于繁殖的植物部分包括，例如但不限于：种子；果实；插条；幼苗；块茎；和砧木。植物的可收获部分可以是植物的任何有用部分，包括例如但不仅限于：花；花粉；幼苗；块茎；叶；茎；果实；种子；和根。

植物细胞是植物的结构和生理单元，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以处于分离的单细胞或细胞聚集体的形式(例如，松散的愈伤组织和培养的细胞)，并且可以是更高的有组织单元的一部分(例如，植物组织，植物器官，和植物)。因此，植物细胞可以是原生质体，配子产生细胞，或者能够再生成整株植物的细胞或细胞集合。因此，包含多个植物细胞并能够再生成为整株植物的种子，在本实施方案中被认为是“植物细胞”。

如本文所使用的，术语“原生质体”是指细胞壁被完全或部分地除去、脂双层膜裸露的植物细胞，因此包括细胞壁被完全除去的原生质体，和仅有部分细胞壁被除去原生质球，但不仅限于此。通常情况下，原生质体是不具有细胞壁的分离植物细胞，其具有再生成为细胞培养物或完整植物的潜力。

除非另有具体说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域普通技术人员所公知的相同的含义。分子生物学常用术语的定义可以在列文献中找到，例如：Lewin,Genes V,Oxford University Press,1994；Kendrew et al.(编辑),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell ScienceLtd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Meyers(编辑),Molecular Biology andBiotechnology:A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。

实施方案

如本文所公开的，提供了使用来自玉米叶绿素a/b基因的调节序列表达非叶绿素a/b转基因的新型重组构建体。这些构建体可用于转化细胞，包括植物细胞，以产生在其细胞内表达转基因产物的完整生物体。

用于基础研究和生物技术应用的植物启动子一般是单向的，仅指导融合在其3’端(下游)的一个基因。对于代谢工程和性状堆叠，经常有必要在植物中引入多个基因，因此，通常在转基因作物中需要多个启动子来驱动多个基因的表达。

转基因产品的开发正变得越来越复杂，需要在单个基因座中堆叠多个转基因。传统上，每个转基因的表达通常需要启动子，需要多个启动子以表达一个基因堆叠内的不同转基因。随着基因堆叠规模的增加，这经常导致在一个转基因堆叠中重复使用相同的启动子，以获得不同转基因的相似水平的表达模式，用于表达单个多基因性状。已知被相同启动子驱动的多基因构建体会导致基因沉默，导致在大田中产生的有效转基因产物减少。由于启动子重复而产生的过多的转录因子(TF)结合位点会导致内源TF的耗竭，从而使转录失活。转基因沉默很可能会不利地影响被产生用于表达转基因的转基因植物的性能。转基因内的重复序列会导致基因座位内的同源重组，其导致多核苷酸的重排。

而且，组织特异性(即，组织优先型)或器官特异性启动子驱动基因在某些组织中表达，例如在植物的籽粒(kernel)、根、叶或绒毡层(tapetum)中表达。组织和发育阶段特异性启动子驱动基因的表达，这些基因在特定的组织或者在植物发育过程中的特定时期表达。转基因植物工业中的某些应用需要组织特异性启动子，组织特异性启动子的可取之处是它们允许以组织和/或发育阶段选择性的方式特异性表达异源基因，指示异源基因在各种器官、组织和/或时间内的差异性表达，而不在其他器官、组织和/或时间表达。例如，通过用病原体抗性基因转化植物基因组从而使病原体抗性蛋白在植物根部强表达，可以实现植物对土壤传播病原体感染的抗性增加。或者，可能期望在处于特定生长或发育阶段(例如细胞分裂或延伸期)的植物组织中表达转基因。另一个应用是期望使用组织特异性启动子的场合，例如为了将编码农学性状的转基因的表达限制在发育中的木质部中。组织特异性启动子的鉴定中仍旧存在的一个具体问题是如何确定潜在的最重要的基因及其相应的启动子，以及如何将它们与细胞的特定发育特性相关联。另一个问题是克隆所有相关的顺式作用转录控制元件，从而使克隆的DNA片段以期望的特异表达方式驱动转录。一个具体的问题是，鉴定与植物的特定细胞类型、发育阶段和/或功能相关、并且在其它植物组织中不表达的组织特异性启动子。

使用多样化的启动子来表达基因堆叠中的不同转基因是可取的。在一个实施方案中，可以从玉米获得叶绿素a/b启动子来驱动多个转录单元，包括转基因、RNAi、人工miRNA或发夹环RNA序列，的转录。在进一步的实施方案中，可以从玉米获得叶绿素a/b，来在植物的叶、穗轴、须、粒、茎、外壳和花粉组织中启动驱动多个转录单元，包括转基因、RNAi、人工miRNA或发夹环RNA序列，的转录。

提供了使用从玉米分离的基因调节元件在植物中表达转基因的方法和构建体。在一个实施方案中，玉米启动子和5’-UTR可以是SEQ ID NO:1的分离启动子。

在一个实施方案中，提供了包含启动子的核酸载体(即构建体)。在一个实施方案中，启动子可以是玉米基因启动子和5’-UTR。在一个实施方案中，提供包括启动子的核酸载体，其中该启动子与SEQ ID NO:1至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％，或100％相同。在一个实施方案中，提供包括与多接头可操作连接的玉米基因启动子的核酸载体。在一个实施方案中，基因表达盒包括与转基因操作连接的玉米基因启动子。在一个例示性实施方案中，基因表达盒包括与转基因操作连接的玉米启动子，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。

除了启动子之外，mRNA的转录、终止和多腺苷酸化还需要3’非翻译基因区(即3’-UTR)或终止子。mRNA的正确转录终止及多腺苷酸化对于转基因的稳定表达是重要的。转录终止对于多基因堆叠而言更加关键，以避免转录通读到下一个转基因。类似地，非多腺苷酸化的异常RNA(aRNA)是植物RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)的底物，该酶将aRNA转变成双链RNA(dsRNA)，导致产生小RNA和转基因沉默。因此，强转录终止子是驱动转录必需的，3’-UTR基因区能够终止转录并触发所得mRNA转录本的多腺苷酸化，以用于翻译和蛋白质合成。3’-UTR基因区可以帮助转基因的稳定表达。在一个实施方案中，3’-UTR可以是SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的玉米3’-UTR。

在一个实施方案中，基因表达盒包括3’-UTR。在一个实施方案中，3’-UTR可以是玉米基因3’-UTR。在一个实施方案中，基因表达盒包括3’-UTR，其中该3’-UTR与SEQ ID NO:2至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％，或100％相同。在另一个实施方案中，基因表达盒包括3’-UTR，其中该3’-UTR与SEQ ID NO:3至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％，或100％相同。在一个实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米基因3’-UTR。在一个例示性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的3’-UTR，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，基因表达盒包括来自玉米的启动子和3’-UTR。在一个实施方案中，基因表达盒包括：a)启动子，其中该启动子与SEQ ID NO:1至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％，或100％的相同；b)3’-UTR，其中该3’-UTR与SEQ ID NO:2至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％，或100％相同；或c)3’-UTR，其中该3’-UTR与SEQ ID NO:3至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％，或100％相同。

例如，基因表达盒可以同时包括启动子和3’-UTR，其中该启动子是SEQID NO:1的多核苷酸，3’-UTR是SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的多核苷酸。

在一个实施方案中，基因表达盒包括与转基因或异源编码序列可操作连接的玉米启动子和玉米3’-UTR。当基因表达盒包含一个或多个转基因时，启动子和3’-UTR可以与基因表达盒内的不同转基因可操作连接。在一个例示性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米启动子，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。在一个例示性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米启动子和3’-UTR，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。在一个例示性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米3’-UTR，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。

玉米3’-UTR可以和基因表达盒内的不同启动子可操作连接。在一个例示性实施方案中，启动子来源于植物(例如，玉米泛素1启动子)、病毒(例如，木薯叶脉花叶病毒)或细菌(例如根癌土壤杆菌delta mas)的启动子。在一个例示性实施方案中，基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米3’-UTR，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，载体包括如本文所述的基因表达盒。在一个实施方案中，载体可以是质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体、病毒，或用于转化或基因打靶的剪切多核苷酸片段，例如供体DNA。

在一个实施方案中，提供包括如本文所述的基因表达盒的细胞或植物。在一个实施方案中，细胞或植物包括包含如本文所述的基因表达盒的载体。在一个实施方案中，载体可以是质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体或病毒。由此，包含如本文所述基因表达盒的细胞或植物分别是转基因细胞或转基因植物。在一个实施方案中，转基因植物可以是单子叶植物。在一个实施方案中，转基因单子叶植物可以是，但不仅限于，玉米，小麦，水稻，高粱，燕麦，黑麦，香蕉，甘蔗，和小米。在一个实施方案中，转基因植物可以是双子叶植物。在一个实施方案中，转基因双子叶植物可以是，但不仅限于，大豆，棉花，向日葵，和芥花(canola)。一个实施方案还包括来自本文所公开的转基因植物的转基因种子。

在一个实施方案中，基因表达盒包括两个或更多个转基因。该两个或更多个转基因可能不和相同的如本文公开的启动子或3’-UTR可操作连接。在一个实施方案中，基因表达盒包括一个或多个转基因。在具有一个或多个转基因的实施方案中，至少一个转基因与本公开的启动子或3’-UTR可操作连接。

选择标志物

选用的表达载体中可以纳入各种选择标志物(也被描述为报告基因)，以便能够鉴定和选择被转化的植物(“转化体”)。有多种方法可用于确认选择标志物在被转化的植物中的表达，包括例如DNA测序、PCR(聚合酶链式反应)、Southern印迹、Northern印迹、用于检测从载体表达的蛋白质(例如介导膦丝菌素抗性的沉淀蛋白)的免疫学方法，或者目视观察其它蛋白质，例如编码β葡糖苷酸酶(GUS)、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶等的报告基因(参见Sambrook,etal.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring Harbor Press,N.Y.,2001，其全部内容通过引用并入本文)。

选择标志物基因用于选择被转化的细胞或组织。选择标志物基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物抗性的基因。除草剂耐受性基因一般编码经过修饰的对除草剂不敏感的靶蛋白，或者编码在除草剂在植物中发挥作用之前将除草剂降解或脱毒的酶。例如，已经通过使用编码突变型靶酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)或DGT-28的基因而获得了对草甘膦的抗性。EPSPS的基因和突变体是众所周知的，并且在下文中有进一步的描述。已经通过使用编码pat或DSM-2、腈水解酶、aad-1或aad-12基因的细菌基因实现了对草铵膦、溴苯腈和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的抗性，上述酶可以将各自的除草剂脱毒。

在一个实施方案中，除草剂可以抑制生长点或分生组织，包括咪唑啉酮或磺酰脲，而且用于抵抗/耐受这些除草剂的乙酰羟酸合酶(AHAS)和乙酰乳酸合酶(ALS)的基因是众所周知的。草甘膦抗性基因分别包括突变的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)和dgt-28基因(通过引入重组核酸和/或各种形式的天然EPSP基因的体内诱变)，aroA基因和草甘膦乙酰转移酶(GAT)基因。对其它含膦化合物的抗性基因包括来自链霉菌属，包括吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)和Streptomyces viridichromogenes，的bar基因，和吡啶基(pyridinoxy)或苯氧基(phenoxy)丙酸和环己烷(ACC酶抑制剂编码基因)。可赋予对环己二酮和/或芳氧苯氧丙酸(aryloxyphenoxypropanoic acid)(盖草能，禾草灵，噁唑禾草灵，吡氟禾草灵，精喹禾灵)的抗性的示例性基因包括乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)——Acc1-S1，Acc1-S2和Acc1-S3的基因。在一个实施方案中，除草剂能够抑制光合作用，包括三嗪(psbA和1s+基因)或苄腈(腈水解酶基因)。

在一个实施方案中，选择标志物包括，但不仅限于，编码如下的基因：新霉素磷酸转移酶II；氨腈水合酶；天冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸合成酶；色氨酸脱羧酶；二氢吡啶二羧酸合酶和脱敏的天冬氨酸激酶；bar基因；色氨酸脱羧酶；新霉素磷酸转移酶(NEO)；潮霉素磷酸转移酶(HPT或HYG)；二氢叶酸还原酶(DHFR)；膦丝菌素乙酰转移酶；2,2-二氯丙酸脱卤素酶；乙酰乳酸合酶；5-烯醇丙酮酸-莽草酸-磷酸合酶(aroA)；卤代芳基腈水解酶；乙酰辅酶A羧化酶；二氢蝶酸合酶(sul I)；和32kD光系统II多肽(psbA)。

实施方案还包括编码对如下的抗性的基因：氯霉素；甲氨蝶呤；潮霉素；壮观霉素；溴苯腈；草甘膦；和膦丝菌素。

上述的选择标志物基因的列表并不意味着有限制性。本发明涵盖任何报告或选择标志物基因。

选择标志物基因为在植物中最佳表达而被合成。例如，在一个实施方案中，基因的编码序列已经通过密码子优化被修饰，以提高在植物中的表达。选择标志物基因可以为在特定的植物物种中表达而优化，或者，可以为在双子叶或单子叶植物中最佳表达而被修饰。植物优选的密码子可以从感兴趣的特定植物物种中表达量最大的蛋白质的频率最高的密码子确定。在一个实施方案中，设计选择标志物基因以在植物中以更高的水平表达，从而产生更高的转化效率。植物基因优化的方法是众所周知的。关于合成DNA序列的优化和生产的指导可见于，例如，WO2013016546，WO2011146524，WO1997013402，美国专利No.6166302和美国专利No.5380831，上述文献通过引用并入本文。

转化

用于转化植物的合适的方法包括任何能够将DNA引入到细胞内的方法，例如但不仅限于：电穿孔(参见例如美国专利5,384,253)；微粒轰击(参见例如美国专利5015580；5550318；5538880；6160208；6399861；和6403865)；土壤杆菌介导的转化(参见例如美国专利5635055；5824877；5591616；5981840；和6384301)；和原生质体转化(参见例如美国专利5508184)。这些方法可用于稳定转化或瞬时转化植物。

可以用来将DNA构建体直接引入到植物细胞的基因组DNA中的技术有，例如，碳化硅纤维搅动(参见，例如，美国专利5302523和5464765)，或者可以使用基因枪方法，例如DNA粒子轰击，将DNA构建体直接引入到植物组织中(参见，例如，Klein et al.,(1987)Nature 327:70-73)。作为替代，DNA构建体可以通过纳米颗粒转化引入到植物细胞中(参见，例如，美国专利公开No.20090104700，其全部内容通过引用并入本文)。

此外，基因转移可以使用非土壤杆菌的细菌或病毒来实现，例如根瘤菌NGR234、苜蓿中华根瘤菌、中慢生根瘤菌、马铃薯X病毒、花椰菜花叶病毒和木薯叶脉花叶病毒和/或烟草花叶病毒，参见例如，Chung et al.,(2006)TrendsPlant Sci.11(1):1-4。

通过这些转化技术的应用，几乎任何植物物种的细胞都可以稳定地转化，并且这些细胞可以通过众所周知的技术发育成转基因植物。例如，在美国专利5846797；5159135；5004863和6624344中描述了在棉花转化中特别有用的技术；在例如美国专利5750871中描述了特别用于转化芸薹属植物的技术；在美国专利6384301中描述了用于转化大豆的技术；和在美国专利7060876和5591616和国际PCT公开WO 95/06722中描述了用于转化玉米的技术。

在将外源核酸递送到受体细胞之后，一般鉴定出转化细胞供进一步的培养和植物再生。为了提高鉴定转化体的能力，人们可能期望采用选择标志物基因，与用于产生转化体的转化载体一起使用。在示例性实施方案中，可以通过将细胞暴露于选择剂或多种选择剂来对转化细胞群体进行测定，或者可以根据期望的标记基因性状对细胞进行筛选。

在暴露于选择剂时存活的细胞，或者在筛选测定中被打分为阳性的细胞，可以培养在支持植物再生的培养基中。在一个实施方案中，可以对任何合适的植物组织培养基进行修饰，使之包含进一步的物质例如生长调节剂。组织可以被保持在含有生长调节剂的基础培养基中，直到可以获得足够的组织用于开始植物再生的工作，或者经过重复多轮的人工选择，直到组织的外形适合于再生为止(例如，至少2周)，然后将它们转移到有助于芽苗形成的培养基中。培养物被周期性转移，直到出现了足够的芽形成。一旦形成芽，便将它们转移到有助于根形成的培养基中。一旦形成了足够的根，便将植物转移到土壤中，用于进一步的生长和成熟。

为了确认再生植物中存在包含所提供构建体的期望核酸，可以实施多种测定。这些测定可以包括：分子生物学测定，例如Southern和Northern印迹ting和PCR；生物化学测定，例如通过免疫学方法(ELISA，western印迹，和/或LC-MS MS分光光度法)或者通过酶促功能检测蛋白质产物的存在；植物部分测定法，例如叶或根测定；和/或分析整个再生植物的表型。

可以通过例如PCR扩增对转基因事件进行筛选，PCR扩增使用例如特异针对感兴趣的核酸分子的寡核苷酸引物。PCR基因分型理解为包括，但不仅限于，对来自预测含有整合在基因组内的感兴趣核酸分子的分离的宿主植物愈伤组织的基因组DNA进行聚合酶链反应(PCR)扩增，随后进行标准克隆和PCR扩增产物序列分析。PCR基因分型方法已经被充分描述(参见，例如，Rios et al.(2002)Plant J.32:243-53)，并且可应用于来自任何植物物种或组织类型(包括细胞培养物)的基因组DNA。可结合靶序列和被引入的序列的寡核苷酸引物的组合在PCR扩增反应中可以顺次使用或复用。可以产生设计为与靶位点、引入的核酸序列、和/或两者的组合退火的寡核苷酸引物。因此，PCR基因分型策略可以包括，例如但不仅限于：扩增植物基因组中的特定序列；扩增植物基因组中的多个特定序列；扩增植物基因组中的非特异性序列；和上述的任意组合。本领域的技术人员可以设计出其它引物和扩增反应的组合，用于查询基因组。例如，可设计一组正向和反向寡核苷酸引物，使之与引入的核酸序列的边界之外的靶标特有核酸序列退火。

正向和反向寡核苷酸引物可设计成特异性地与引入的核酸分子退火，例如在其中包含的感兴趣核苷酸序列的编码区的相应序列处退火，或者在该核酸分子的其它部分退火。引物可以和本文描述的引物联合使用。寡核苷酸引物可以根据期望的序列合成，并且可以商购(例如，从Integrated DNA Technologies,Inc.,Coralville,IA购买)。扩增之后可以进行克隆和测序，或者可以直接对扩增产物进行序列分析。在一个实施方案中，在PCR扩增中使用特异针对基因靶的寡核苷酸引物。

表达转基因的方法

在一个实施方案中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括培育包含与至少一个转基因可操作连接的玉米启动子的植物。在一个实施方案中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括培育包含与至少一个转基因可操作连接的玉米3’-UTR的植物。在一个实施方案中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括培育包含与至少一个转基因可操作连接的玉米启动子，和/或玉米3’-UTR的植物。

在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含与至少一个转基因可操作连接的玉米启动子的植物组织或植物细胞。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含与至少一个转基因可操作连接的玉米3’-UTR的植物组织或植物细胞。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含与至少一个转基因可操作连接的玉米启动子和/或玉米3’-UTR的植物组织或植物细胞。

在一个实施方案中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括培育包含这样的基因表达盒的植物，该基因表达盒包括与至少一个转基因可操作连接的玉米启动子。在一个实施方案中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括培育包含这样的基因表达盒的植物，该基因表达盒包括与至少一个转基因可操作连接的玉米3′-UTR。在一个实施方案中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括培育包含这样的基因表达盒的植物，该基因表达盒包括与至少一个转基因可操作连接的玉米启动子和玉米3′-UTR。在一个实施方案中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括培育包含这样的基因表达盒的植物，该基因表达盒包括与至少一个转基因可操作连接的3′-UTR。

在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含这样的基因表达盒的植物组织或植物细胞，该基因表达盒包括与至少一个转基因可操作连接的玉米启动子。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含这样的基因表达盒的植物组织或植物细胞，该基因表达盒包括与至少一个转基因可操作连接的玉米3′-UTR。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含这样的基因表达盒的植物组织或植物细胞，该基因表达盒包括与至少一个转基因可操作连接的玉米启动子和玉米3′-UTR。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含这样的基因表达盒的植物组织或植物细胞，该基因表达盒包括与至少一个转基因可操作连接的3′-UTR。

在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括玉米启动子。在一个实施方案中，玉米启动子可以是SEQ ID NO:1。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括含有启动子的基因表达盒，其中该启动子与SEQ IDNO:1至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括这样的基因表达盒，所述基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米启动子。在一个示例性实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括这样的基因表达盒，所述基因表达盒包括与转基因可操作连接的玉米启动子，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括含有3’-UTR的基因表达盒。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括含有玉米3′-UTR的基因表达盒。在一个实施方案中，玉米3′-UTR是SEQ ID NO:2的多核苷酸。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括含有3′-UTR的基因表达盒，其中该3′-UTR与SEQ ID NO:2至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。在一个实施方案中，玉米3′-UTR是SEQ ID NO:3的多核苷酸。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括含有3′-UTR的基因表达盒，其中该3′-UTR与SEQID NO:3至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％,99.8％,或100％相同。在一个实施方案中，基因表达盒包括与启动子可操作连接的玉米3′-UTR，其中该启动子是玉米启动子，或者是来源于植物(例如，玉米泛素1启动子)、病毒(例如，木薯叶脉花叶病毒)或细菌(例如根癌土壤杆菌delta mas)的启动子。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括这样的基因表达盒，其包含与转基因可操作连接的玉米3′-UTR。在一个例示性实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括这样的基因表达盒，其包含与转基因可操作连接的玉米3′-UTR，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括这样的基因表达盒，其包括与转基因可操作连接的玉米启动子和玉米3’-UTR。当基因表达盒包含2个或多个转基因时，该启动子和3’-UTR可以和基因表达盒中的不同转基因可操作连接。在一个例示性实施方案中，基因表达盒包含与转基因可操作连接的玉米启动子，其中该转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因，或其组合。

在一个实施方案中，使用本文所述方法的转基因表达是对植物叶组织特异性的。在一个实施方案中，转基因表达包括在植物叶组织中表达多于一个转基因。在一个实施方案中，培育如本文所述的转基因植物的方法包括叶特异性的转基因表达。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达转基因的方法包括叶特异性的组织和根特异性的细胞。在一个实施方案中，叶特异性表达包括玉米叶特异性表达。

在进一步的实施方案中，使用本文所述方法的转基因表达在地上植物组织(例如，地上植物组织，包括叶、壳、茎和须)中表达。在一个实施方案中，转基因表达包括在地上植物组织中表达超过一个转基因。在一个实施方案中，如本文所述的培育转基因植物的方法包括地上植物组织转基因表达。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达转基因的方法包括地上植物组织和地上植物细胞。在一个实施方案中，植物地上组织表达包括玉米植物地上植物组织表达。

在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括含有本文所公开的玉米启动子和/或玉米3’-UTR的载体。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括含有本文所公开的与转基因可操作连接的玉米启动子和/或玉米3’-UTR的载体。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞包括含有本文所公开的基因表达盒的载体。在一个实施方案中，载体可以是质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体或病毒。

在一个实施方案中，根据本文公开方法的植物、植物组织或植物细胞可以是单子叶植物。该单子叶植物、植物组织或植物细胞可以是，但不仅限于，玉米，水稻，小麦，甘蔗，大麦，黑麦，高粱，兰花，竹子，香蕉，香蒲，百合，燕麦，洋葱，小米，和黑小麦。

在一个实施方案中，根据本文公开方法的植物、植物组织或植物细胞可以是双子叶植物。该双子叶植物、植物组织或植物细胞可以是，但不仅限于，油菜籽，芥花，印度芥，埃塞俄比亚芥，大豆，向日葵和棉花。

关于遗传修饰植物的产生，植物的遗传工程方法是本领域众所周知的。例如，已经开发了大量用于植物转化的方法，包括用于双子叶植物以及单子叶植物的生物和物理转化方案(例如Goto-Fumiyukiet al.,Nature Biotech 17:282-286(1999)；Miki et al.,Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.和Thompson,J.E.编辑,CRC Press,Inc.,Boca Raton,第67-88页(1993))。此外，用于植物细胞或组织转化和植物再生的载体和体外培养方法可以在例如下列文献中获得：Gruber et al.,Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology,Glick,B.R.和Thompson,J.E.编辑,CRC Press,Inc.,Boca Raton,第89-119页(1993)。

本领域的技术人员会意识到，在外源序列被稳定纳入到转基因植物体内并被确认可以工作之后，它可以通过有性杂交被引入到其它植物中。可以使用多种标准育种技术中的任一种技术，取决于待杂交的物种。

可以通过根据转化DNA上存在的标记基因编码的性状对工程化的植物材料进行选择或筛选，来鉴定和分离被转化的植物细胞、愈伤组织、组织或植物。例如，可以通过在含有抑制量的抗生素或除草剂的培养基上培育经工程化的植物材料来进行选择，其中转化基因构建体可以赋予对所述抗生素或除草剂的抗性。另外，还可以通过筛选重组核酸载体上可能存在的任何可见标志物基因(例如，yfp,gfp,β-葡萄糖醛酸酶，荧光素酶，B或C1基因)的活性来鉴定转化细胞。这些选择和筛选方法是本领域技术人员众所周知的。

还可以使用物理和生物化学方法鉴定含有插入基因构建体的植物或植物细胞转化体。这些方法包括但不仅限于：1)用于检测和确定重组DNA插入物的结构的Southern分析或PCR扩增；2)用于检测并检查基因构建体RNA转录本的Northern印迹，S1RNA酶保护，引物延伸或逆转录酶-RNA扩增；3)用于检测酶或核酶活性的酶学测定，其中这样的基因产物由基因构建体编码；4)新一代测序(NGS)分析；5)蛋白凝胶电泳、western印迹技术、免疫沉淀或酶联免疫吸附测定(ELISA)，其中该基因构建体的产物是蛋白质。也可以使用其它的技术，例如原位杂交、酶染色和免疫染色，检测重组构建体在特定植物器官和组织中的存在或表达。进行上述所有测定的方法均是本领域技术人员众所周知的。

使用本文公开的方法进行基因操作的效果可以通过，例如，对从感兴趣的组织中分离的RNA(例如，mRNA)的Northern印迹来加以观察。通常，如果存在mRNA或者mRNA的量增加了，则可以推定相应的转基因被表达。可以使用其它测量基因和/或编码多肽活性的方法。可以使用不同类型的酶测定，取决于所用的底物和检测反应产物或副产物增加或降低的方法。此外，多肽的表达水平可以通过免疫化学方法测量，即ELISA,RIA,EIA和其它本领域技术人员众所周知的基于抗体的测定，例如通过电泳检测方法(无论是与染色还是印迹联用)。作为一个非限制性的实例，在美国专利公开No.20090093366中描述了使用ELISA测定检测AAD-1(芳氧基链烷双加氧酶；参见WO 2005/107437)和PAT(膦丝菌素-N-乙酰基转移酶)蛋白，其全部内容通过引用并入本文。转基因可以选择性地在一些细胞类型或植物组织中，或者在某些发育阶段中表达，或者转基因可以于基本上所有的植物组织中，基本上在其整个生命周期中被表达。然而，任何组合的表达模式也是可以使用的。

本公开还包括上述转基因植物的种子，其中该种子具有转基因或基因构建体。本公开进一步包括上述转基因植物的后代、克隆、细胞系或细胞，其中所述后代、克隆、细胞系或细胞包括转基因或基因构建体。

尽管已经援引具体的方法和实施方案对本发明进行了描述，但是应当意识到，在不背离本发明的前提下可以进行各种修改和变化。

实施例

实施例1：鉴定高表达的调节元件

通过使用新一代测序(NGS)的转录概貌分析方法鉴定了新型玉米调节元件。然后，对这些调控元件进行分离和克隆，以表征调节元件的表达概貌，供在转基因植物中使用。产生了用从苏云金杆菌分离的cry34Ab1报告基因和AAD-1选择标志物基因稳定转化的转基因玉米系，并对转基因表达水平和组织特异性进行了测定。这样，对新型玉米调节元件进行了鉴定和表征。首次公开了用于在基因表达构建体中使用的启动子、5′-UTR和3′-UTR调节元件。

从培育到不同植物生长和发育阶段的植物获得了玉米组织，用于转录概貌分析，以鉴定和选择具有期望的表达概貌的天然玉米基因的调节元件，用于在基因表达构建体中使用。例如，收集了来自3个叶发育阶段(V4(一式二份)、V12和R3)和根发育阶段(V4和V12节点和纤维组织)、花粉、须、穗轴、未成熟的籽粒、壳和茎(V4和R1)的样品。从所有上述组织分离总mRNA，并获得了期望量的高品质mRNA。

从每个mRNA样品制备cDNA文库，并使用Illumina2000(Illumina Inc.,San Diego,CA)进行高通量测序。此外，使用IlluminaRNA样品制备试剂盒根据制造商推荐的方案进行RNAseq样品制备。简而言之，使用聚-T oligo附接的珠子纯化5μg总RNA，随后在高温下使用二价阳离子将其破碎成较小的片(平均长度约为200bp)。使用II反转录酶和随机引物将片段化的mRNA拷贝成第一链cDNA。进一步使用DNA聚合酶I和RNA酶H将cDNA转变成双链cDNA(ds cDNA)。然后，对双链cDNA片段进行末端修复、A-加尾，然后连接到经索引的Illumina配对末端(PE)衔接子上。最后，清洗文库产物，并用15轮PCR进行富集，并纯化。将富集的文库标准化为2nM的浓度，用氢氧化钠变性，并在杂交缓冲液中稀释至12pM，装载到流动池的单个泳道上。聚簇生成、引物杂交和测序反应根据Illumina推荐的方案进行。

然后，对测序数据进行过滤，以除去低质量读段。在过滤之后，保留了约99.9％的测序读段。将测序读段与经过注释的玉米栽培种B73基因组(可以在玉米GDB获得)进行比对。舍弃定位到玉米基因组中多于1个基因座上的测序读段，以避免在高表达基因的鉴定及其进一步的表征中发生混淆。这个步骤导致每个样品有>70％的测序读段与玉米基因组对齐。使用定量基因表达单位——每百万个定位片段中定位到外显子的千个碱基的片段数或FPKM数值，对基因进行了排序，以供进行符合基因表达构建体中使用的期望表达模式的稳定转化测试。对高表达基因进行了优先排序(prioritized)以供稳定转基因系中的测试(图1)。

实施例2：从玉米序列中选择新型调节元件

通过转录概貌分析方法从表达排序高的玉米基因序列中提取了启动子、5’-UTR和3’-UTR序列。来自玉米栽培种B73基因组的玉米基因的天然序列示于SEQ ID NO:4。SEQ ID NO:4中包括了SEQ ID NO:1的637bp启动子和5’-UTR序列，以及SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的1,000bp 3’-UTR序列。

实施例3：构建体设计

合成DNA元件并克隆到入门载体中。启动子的长度为637bp，每一个3’-UTR的长度为1,000bp。使用含有与侧翼DNA元件至少15bp的重叠同源的引物扩增了SEQ ID NO:1的玉米启动子、cry34Ab1(来自苏云金芽孢杆菌的报告基因)，以及SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的玉米3’-UTR。将所有片段用凝胶纯化。将全部三个片段与入门载体骨架pENTR11一起通过无缝克隆反应(Invitrogen,Carlsbad,CA)定向组装。然后用所得到的入门质粒pDAB114494和目标载体pDAB104153进行(Invitrogen)反应，产生了最终的表达载体pDAB114410。目标载体含有选择标志物盒，该选择标志物盒包括受玉米泛素-1启动子(Christensen et al.,(1992)PlantMolecular Biology 18；675-689)驱动、并以玉米脂肪酶3’-UTR(美国专利No.7,179,902)终止的AAD-1基因。

使用上述策略设计并构建了pDAB114410构建体。该载体是一个异源基因表达构建体，包含AAD-1基因表达盒和驱动cry34Ab1基因表达盒的SEQ IDNO:1的玉米启动子和5’-UTR(图2)。

通过用PhiYFP报告基因(Shagin et al.,(2004)Mol Biol Evol 21；841-50)代替cry34Ab1基因、并用从玉米获得的SEQ ID NO:2新型1,000bp 3’-UTR序列代替StPinII 3’-UTR，使用无缝克隆反应组装了第二入门载体pDAB114494。启动子(SEQ ID NO:1)和3’-UTR(SEQ ID NO:2)元件都来自相同的玉米天然基因。在与目标载体pDAB104153进行反应之后，组装了最终的载体构建体pDAB116008。目标载体含有一个选择标志物盒，该盒包括受玉米泛素-1启动子(Christensen et al.,(1992)Plant MolecularBiology 18；675-689)驱动、并以玉米脂肪酶3’-UTR(美国专利No.7,179,902)终止的AAD-1基因。pDAB116008载体构建体是一个异源表达构建体，其含有AAD-1基因表达盒和PhiYFP基因表达盒(图3)。

组装了阴性对照构建体pDAB101556(图4)，其包含代替了pDAB114410中cry34Ab1基因的黄色荧光蛋白报告基因，和与pDAB114410相同的AAD-1表达盒。构建了阳性对照构建体pDAB108746(图5)，其包括玉米泛素-1启动子和马铃薯蛋白酶抑制物基因II 3’UTR(StPinII 3’-UTR v2；An et al.,(1989)Plant Cell 1；115-22)，控制cry34Ab1基因的表达。AAD-1盒与存在于pDAB114410中的相同。

合成含有替代3’UTR的构建体pDAB120167的DNA元件，并将其克隆到入门载体中。启动子(SEQ ID NO:1)和3'-UTR(SEQ ID NO:3)的长度分别为637bp和1,000bp。使用含有与其侧翼DNA元件至少15bp的重叠同源性的引物扩增了SEQ ID NO:1的玉米启动子、cry34Ab1(来自苏云金芽孢杆菌的报告基因)和SEQ ID NO:3的玉米3'-UTR。所有片段用凝胶纯化。将全部三个片段与入门载体骨架pENTR11一起通过无缝克隆反应(Invitrogen,Carlsbad,CA)定向组装。然后用所得的入门质粒pDAB120158和目标载体pDAB104153进行(Invitrogen)反应，产生了最终的表达载体pDAB120167。目标载体含有一选择标志物盒，该盒包括受玉米泛素-1启动子(Christensen et al.,(1992)Plant Molecular Biology 18；675-689)驱动、并以玉米脂肪酶3’-UTR(美国专利No.7,179,902)终止的AAD-1基因。所得的构建体pDAB120167是一个异源表达构建体，其包括AAD-1基因表达盒和cry34Ab1基因表达盒(图5)。

实施例4：植物转化和分子确认

根癌土壤杆菌转化

将二元表达载体转化进入根癌土壤杆菌菌株DAt13192(RecA缺陷型三元菌株)(国际专利公开WO2012016222)。选择细菌菌落，分离二元质粒DNA，并通过限制酶消化进行确认。

土壤杆菌培养物的起始

将土壤杆菌培养物从甘油储划线接种到AB基本培养基上(Gelvin,S.,2006,Agrobacterium Virulence Gene Induction,收录于Wang,K.编辑,AgrobacteriumProtocols第二版第1卷,Humana Press,79页；制备不含蔗糖，含5g/L葡萄糖和15g/L Bacto^TM琼脂)，并在黑暗中在20℃培养3天。然后，将土壤杆菌培养物划线接种到YEP培养基平板上(Gelvin,S.,2006,Agrobacterium Virulence GeneInduction,收录于Wang,K.编辑,Agrobacterium Protocols第二版第1卷,Humana Press,79页)，并在黑暗中在20℃培养1天。

在实验当天，制备温育培养基(2.2g/L MS盐,68.4g/L蔗糖,36g/L葡萄糖,115mg/L L-脯氨酸,2mg/L甘氨酸,100mg/L肌醇,0.05mg/L烟酸,0.5mg/L吡哆醛HCl,0.5mg/L硫胺HCl)与乙酰丁香酮的混合物，其体积适合于实验的规模。向温育培养基中添加1M溶在100％二甲亚砜中的乙酰丁香酮，使乙酰丁香酮的终浓度为200μM。

对于每个构建体，将来自YEP平板的1-2环土壤杆菌悬浮在无菌的一次性50ml离心管内的15ml接种培养基/乙酰丁香酮混合物中，并用分光光度计在600nm测量溶液的光密度(O.D.₆₀₀)。然后，使用额外的接种培养基/乙酰丁香酮混合物将悬浮物稀释至0.25-0.35O.D.₆₀₀。然后将土壤杆菌悬液管水平置于设定为约75rpm的平台摇床上，在使用前在室温下放置1-4个小时。

玉米转化

通过土壤杆菌介导的未成熟胚转化将实验构建体转化进玉米中，该未成熟胚从玉米栽培种B104的自交系中分离。所用方法与Ishida et al.,(1996)Nature Biotechnol 14:745–750和Frame et al.,(2006)Plant Cell Rep 25:1024–1034中公开的相似，但是有一些修改和改进，以便使该方法适用于高通量转化。美国专利申请公开No.US 2013/0157369 A1中给出了用于在玉米中产生大量转基因事件的方法的一个实例，其开始于胚胎感染和共培养步骤。

转移和在温室中建立T₀植物：

定期将转基因植物转移到温室中。植物从Phytatray^TM移植到装有生长培养基(Premier Tech Horticulture,ProMix BX)的小盆(T.O.Plastics,3.5”SVD,700022C)中，并用保湿盖(humidome)覆盖以帮助植物适应环境。将植物置于Conviron^TM生长室中(28℃/24℃，16小时光周期，50％-70％相对湿度，200μmolm^-2s^-1光强度)，直到达到V3-V4阶段。这可以帮助植物适应土壤和更苛刻的温度。然后，将植物移至温室(光暴露类型：光合或同化(Photo or Assimilation)；高光限制：1200μmol m^-2s^-1光合有效辐射(PAR)；16小时白昼长度；27℃昼/24℃夜)，并从小花盆移栽至5.5英寸的盆中。移栽到更大的盆中约1-2周后，对植物取样用于生物测定。每个事件测定一株植物。

实施例5：转基因植物/事件的分子确认

在V2-3叶期对推定的转基因玉米植物进行取样，使用cry34Ab1和AAD-1定量PCR测定检测转基因的存在。使用DNA提取试剂盒(Qiagen)按照制造商的使用说明从叶样品提取总DNA。

为了检测感兴趣的基因，使用引物/探针组对基因特异性DNA片段进行扩增，该引物/探针组包含用于cry34Ab1基因的FAM-标记荧光探针，和用于内源转化酶参考基因对照的HEX标记荧光探针。使用如下的引物用于cry34Ab1和转化酶内源参考基因扩增。

Cry34Ab1引物/探针：

正向引物：TQ.8v6.1.F:GCCATACCCTCCAGTTG(SEQ ID NO:5)

反向引物：TQ.8v6.1.R:GCCGTTGATGGAGTAGTAGATGG(SEQ IDNO:6)

探针：TQ.8v6.1.MGB.P:5’-/56-FAM/CCGAATCCAACGGCTTCA/MGB(SEQ ID NO:7)

转化酶引物:

正向引物:转化酶F:TGGCGGACGACGACTTGT(SEQ ID NO:8)

正向引物:转化酶R:AAAGTTTGGAGGCTGCCGT(SEQ ID NO:9)

转化酶探针:5’-/5HEX/CGAGCAGACCGCCGTGTACTT/3BHQ_1/-3’(SEQ ID NO:10)

接着，在最终体积为10μl的反应体系中进行PCR反应，反应体系包含5μl Roche480探针预混物(Roche Applied Sciences,Indianapolis,IN)；TQ.8v6.1.F,TQ.8v6.1.R,转化酶F,和转化酶R引物各0.4μl，从10μM储液到终浓度400nM；TQ.8v6.1.MGB.P和转化酶探针各0.4μl，从5μM储液到终浓度200nM；0.1μl 10％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)至终浓度为0.1％；2μl10ng/μl基因组DNA和0.5μl水。DNA用Roche480系统在如下条件下进行扩增：1个循环的95℃10min；40个如下3个步骤的循环：95℃10秒；58℃35秒和72℃1秒，和最终循环的4℃10秒。通过将未知样品的靶(感兴趣基因)/参考(转化酶基因)值(由480输出)与cry34Ab1拷贝数对照的靶/参考值进行比较，确定Cry34Ab1的拷贝数。

AAD-1基因的检测使用转化酶内源参考基因，按上文对cry34Ab1基因所述的实施。AAD-1引物序列如下：

AAD1正向引物:TGTTCGGTTCCCTCTACCAA(SEQ ID NO:11)

AAD1反向引物:CAACATCCATCACCTTGACTGA(SEQ ID NO:12)

AAD1探针:

5’-FAM/CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA-MGB/BHQ-3’(SEQ ID NO:13)

PhiYFP基因的检测使用转化酶内源参考基因，按上文对cry34Ab1基因所述的实施。PhiYFP引物序列如下：

PhiYFP v3正向引物:CGTGTTGGGAAAGAACTTGGA(SEQ ID NO:14)

PhiYFP v3反向引物:CCGTGGTTGGCTTGGTCT(SEQ ID NO:15)

PhiYFP v3探针:5’FAM/CACTCCCCACTGCCT/MGB_BHQ_1/3’(SEQID NO:16)。

最后，在V4-5期对含有感兴趣基因的T₀植物进行采样，用于cry34Ab1,PhiYFP和AAD-1叶ELISA测定。采样4个叶冲孔块。对另一组植物在V4-5期进行采样，确定用于这两种蛋白ELISA测定的总根质量。叶和根Cry34Ab1(Agdia,Inc.,Elkart,IN)和AAD-1(Acadia BioScience)ELISA测定按照制造商的使用说明进行。

PhiYFP ELISA如下进行。用单克隆抗-YFP捕获抗体(Origene；Rockvile,MD)包被平板。单克隆抗-YFP捕获抗体用PBS稀释到浓度为1μg/ml，向平板的孔中加入150μl溶液，4℃温育过夜。接着，将平板加热到室温20-30分钟。平板用350μl清洗缓冲液(1X PBS和0.5％吐温20)清洗4次。然后，向平板添加200μl等份的封闭缓冲液，将平板在37℃温育至少1小时。用350μl清洗缓冲液(1X PBS和0.5％吐温20)清洗平板4次。

以系列稀释的方式向孔中添加重组表达的PhiYFP标准品(Evrogen；Moscow,Russia)。该标准的初始提供浓度为0.0313ng/ml-2ng/ml。接着，将平板置于摇床上，在室温下温育。平板用350μl清洗缓冲液(1X PBS和0.5％吐温20)清洗4次。将兔抗PhiYFP多克隆第一抗体(Evrogen:Moscow,Russia)的浓度减小到1μg/ml并添加到平板中。接着，将平板置于摇床上，在室温下温育。用350μl清洗缓冲液(1X PBS和0.5％吐温20)清洗平板4次。向平板添加抗-兔第二抗体辣根过氧化物酶(Pierce；Rockford,IL)。接着，将平板置于摇床上，在室温下温育。用350μl清洗缓冲液(1X PBS和0.5％吐温20)清洗平板4次。最后，向孔中添加辣根过氧化物酶标记抗体的Pierce 1Step UltraTMB ELISA底物，并轻柔震荡。结果用分光光度计定量。

Cry34Ab1叶ELISA测定表示为ng/cm²，而根ELISA结果表示为每百万的份数(或者ng蛋白/mg总植物蛋白)。总根蛋白测定用Bradford检测方法按照制造商的使用说明进行。

将T₀植物自交并与玉米栽培种B104非转基因转化系回交，以获得T₁种子。将每种测试调节元件构建体的56个转基因系或事件推进到T₁蛋白和RNA基因表达研究，然后推进到T₂种子产生。相应地，每个事件播种了30-40个T₁种子；在发育的V2-3阶段向幼苗喷洒以杀死非转基因分离子。在植物发育的多个阶段对转基因植物进行采样用于Cry34Ab1、PhiYFP和AAD-1ELISA，具体如下：叶(V4,V12和R3)；根(V4和R1)；茎(R1)；花粉(R1)；须(R1)；穗(R3)；未成熟籽粒(R3)；和穗轴(R3)。分离所有的组织，并置于埋在干冰中的试管中；然后转移到-80℃。在提取蛋白用于ELISA之前，将冷冻的组织冻干。

在V4-5期对推定的含有cry34Ab1、PhiYFP和AAD-1转基因的转基因T₁植物进行采样，用于叶ELISA测定。采样四个叶冲孔块。将叶块置于试管中，向每个含有300μl提取缓冲液(1XPBST，补充0.05％吐温20和0.5％BSA)的1.2ml管中添加一个1/8”不锈钢珠(Hoover Precision Products,Cumming,GA,USA)。样品在Genogrinder^TM(SPEX SamplePrep,Metuchen,NJ)中处理，1,500rpm 4分钟。样品在Sorvall Legend XFR^TM离心机中4,000rpm离心2分钟。接着，再添加300μl提取缓冲液，将样品在Genogrinder^TM中在1,500rpm再处理2分钟。样品在4,000rpm再次离心7分钟。最后，收集上清液，并使用市售的Cry34Ab1ELISA测定试剂盒(Agdia,Inc.)和AAD-1ELISA测定试剂盒(Acadia BioScience,LLC)按照制造商的使用说明与蛋白标准一起在不同稀释度下进行ELISA测定。

用于各种组织类型ELISA的蛋白提取如下所述，在颜料搅拌器(paintshaker)中研磨冻干组织30秒。对于需要进一步研磨的组织，再重复研磨步骤30秒。添加石榴石粉覆盖管底的弯曲部分。将粗磨后的组织转移到2ml管中，填充到0.5ml标记处。向每个管添加一个陶瓷球，并加入0.6ml部分提取缓冲液(200μl蛋白酶抑制剂合剂，200μl 500mMEDTA，15.5mg DTT粉末和PBST，至20毫升)。将全部管保持在冰上10分钟。将冰冷的管转移到的2mL保持件中。将样品研磨两次，每次30秒，其间在冰上冷却5分钟。接着，向样品添加40μl 10％吐温-20和300μl提取缓冲液。将样品再研磨30秒，中间在冰上冷却5分钟。最后，将每个样品在13,000rpm下离心7分钟，并将上清液小心转移至新管中，收集提取物。将提取物再次悬浮于提取缓冲液中，并按需要进行稀释，用于ELISA测定。

实施例6：T₀转基因植物表达筛选

ELISA结果显示，在用构建体pDAB114410转化的T₀事件中，从玉米分离的调节元件驱动了Cry34Ab1的叶优先表达。在这些事件的根(表1-5)中观察到的受玉米调节元件驱动的Cry34Ab1的表达较少。由对照构建体pDAB108746产生的事件在叶和根组织中均表达Cry34Ab1。在用不含有cry34Ab1基因的对照构建体pDAB101556转化的植物事件中没有观察到Cry34Ab1叶表达。所有构建体均在根和叶组织二者中表达AAD-1蛋白。在不同组织类型中，包括从含有新型玉米启动子SEQ ID NO:1及3’UTR SEQID NO:2和SEQ ID NO:3的转基因玉米植物取样的穗轴、粒、壳、花粉、须和茎样品，均发现了高phiYFP蛋白表达。这些数据证明，本申请请求保护的新型启动子和3’UTR可以在植物中驱动高的组成型转基因表达，并可用于生物技术应用。而且，还观察到pDAB114410启动子对下游基因具有增强作用，其导致AAD-1转基因在叶、穗轴、须、粒、茎、壳和花粉中与构建体pDAB101556相比显著上调。

表1.显示cry34Ab1和AAD-1转基因在各种构建体事件的T₀代的V4-V6玉米叶中的表达的ELISA测定结果

表2.显示cry34Ab1和AAD-1转基因在各种构建体事件的T₀代的V4-V6玉米根中的表达的ELISA测定结果

表3.显示cry34Ab1和AAD-1转基因在T₀叶(V4)叶样品中的表达的ELISA测定结果

表4.显示cry34Ab1和AAD-1转基因在各种构建体事件的T₁V4-6玉米根中的表达的ELISA测定结果

表5.显示yfp和AAD-1转基因在各种构建体事件的T₁叶中的表达的ELISA测定结果

这样，鉴定和表征了从玉米分离的新型玉米调节元件。首次公开了SEQID NO:1的玉米启动子和5′-UTR和SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的3′-UTR调节元件，供基因表达构建体中使用。

通过提述并入本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，以其与本公开的具体细节无不一致为限，且其并入本文的程度就如同明示每一篇参考文献一一明确通过提述并入本文，并且就如同将其全部内容在本文中陈述出一样。提供本文所讨论的参考文献只是因为它们的公开先于本申请的申请日期。本文中的任何内容都不应理解为承认本发明人无权通过发明在先而将这些公开置于本申请的日期之后。提供了以下的实施例，用于举例说明某些具体的特征和/或实施方案。这些实施例不应当被理解为将本公开限制于所例示的特定特征或实施方案。

Claims

1.一种核酸载体，其包括与

i)多接头序列；

ii)非叶绿素a/b转基因；或

iii)i)和ii)的组合

可操作连接的启动子，其中所述启动子包含SEQ ID NO:1或者与SEQ IDNO:1具有90％序列同一性的序列。

2.权利要求1的核酸载体，其中所述启动子的长度小于700bp。

3.权利要求1的核酸载体，其中所述启动子由SEQ ID NO:1或者与SEQID NO:1具有90％序列同一性的序列组成。

4.权利要求1-3中任一项的核酸载体，其进一步包括编码选择标志物的序列。

5.权利要求4的核酸载体，其中所述启动子与转基因或小RNA可操作连接。

6.权利要求5的核酸载体，其中该转基因编码选择标志物或者赋予杀虫剂抗性、除草剂耐受性、氮利用效率、水分利用效率或营养品质的基因产物。

7.权利要求1-3或5中任一项的核酸载体，其进一步包括3'非翻译序列，所述3'非翻译序列包含SEQ ID NO:2或者与SEQ ID NO:2具有90％序列同一性的序列，其中该3'非翻译序列与所述多接头、所述转基因或所述小RNA可操作连接。

8.权利要求1-3或5中任一项的核酸载体，其进一步包括3'非翻译序列，所述3'非翻译序列包含SEQ ID NO:3或者与SEQ ID NO:3具有90％序列同一性的序列，其中该3'非翻译序列与所述多接头、所述转基因或所述小RNA可操作连接。

9.权利要求1-3或5中任一项的核酸载体，其进一步包括5'非翻译序列或内含子序列。

10.一种植物，其包含与转基因或小RNA可操作连接的SEQ ID NO:1或者与SEQ ID NO:1具有90％序列同一性的序列。

11.权利要求10的植物，其中所述植物选自下组：玉米，小麦，水稻，高粱，燕麦，黑麦，香蕉，甘蔗，大豆，棉花，向日葵，拟南芥，烟草和芥花。

12.权利要求10的植物，其中所述植物是玉米。

13.权利要求10-12中任一项的植物，其中该转基因插入在所述植物的基因组中。

14.权利要求10的植物，其进一步包含3'非翻译序列，所述3'非翻译序列包含SEQ ID NO:2或者与SEQ ID NO:2具有90％序列同一性的序列，其中该3'非翻译序列与所述转基因或所述小RNA可操作连接。

15.权利要求10的植物，其进一步包括3'非翻译序列，所述3'非翻译序列包含SEQ ID NO:3或者与SEQ ID NO:3具有90％序列同一性的序列，其中该3'非翻译序列与所述转基因或所述小RNA可操作连接。

16.一种核酸载体，其包括与

i)多接头序列；

ii)非叶绿素a/b转基因；或

iii)i)和ii)的组合

可操作连接的转录终止子，其中所述转录终止子包括SEQ ID NO:2或者与SEQ ID NO:2具有90％序列同一性的序列。

17.权利要求16的核酸载体，其中所述转录终止子的长度小于1.1kb。

18.权利要求16的核酸载体，其中所述转录终止子由SEQ ID NO:2的3’UTR序列组成。

19.一种核酸载体，其包括与

i)多接头序列；

ii)非叶绿素a/b转基因；或

iii)i)和ii)的组合

可操作连接的转录终止子，其中所述转录终止子包含SEQ ID NO:3或者与SEQ ID NO:3具有90％序列同一性的序列。

20.权利要求19的核酸载体，其中所述转录终止子的长度小于1.1kb。

21.权利要求19的核酸载体，其中所述转录终止子由SEQ ID NO:3的3’UTR序列组成。