CN105683382A - 利用来自短柄草属泛素1c基因的调节元件的转基因表达用构建体 - Google Patents

利用来自短柄草属泛素1c基因的调节元件的转基因表达用构建体 Download PDF

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Abstract

提供了利用调节元件在植物细胞和/或植物组织中表达转基因的构建体和方法，所述调节元件包括分离自二穗短柄草泛素基因的启动子和/或3’-UTR。在一个实施方案中，提供表达载体，其中泛素基因的调控元件与多接头序列可操作连接。依照一个实施方案，提供了植物、植物组织或植物细胞，包含与非泛素转基因可操作连接的启动子。

Description

利用来自短柄草属泛素1C基因的调节元件的转基因表达用构建体
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年8月30日提交的美国临时专利申请No.61/872,134的优先权，通过提述将上述申请全部并入本申请。
通过提述并入以电子方式提交的材料
通过提述将其全部内容并入与此申请同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列，其如下：建立于2014年8月15日的名称为“Brach_UBI_1C_SEQ_LIST_ST25”的一个64KB的ACII(文本)文件”。
背景
植物转化是一种有吸引力的用于将农艺学上期望性状或特性导入不同作物物种中的技术。开发具有特定的期望性状的植物物种，和/或将植物物种修饰为具有特定的期望性状。通常，期望性状的例子包括：提高营养价值质量，增加产量，赋予抗虫性或抗病性，增加干旱和胁迫耐受性，提高园艺质量(例如，着色和生长)，赋予除草剂抗性，使得可能从植物生产在工业上有用的化合物和/或材料的能力，和/或使得可能生产药品。
通过植物转化技术来生产包含堆叠在单个基因组基因座处的多个转基因的转基因植物。植物转化技术导致转基因导入植物细胞中、在植物基因组中含有转基因的稳定整合拷贝的能育转基因植物的恢复、并且通过转基因的转录和翻译的后续转基因表达导致具有期望性状和表型的转基因植物。堆叠中的每个转基因一般需要独立的启动子用于基因表达，因此在转基因堆叠中需使用多个启动子。
经常由于需要共表达调节同一性状的多个转基因而重复使用同一启动子来驱动多个转基因的表达。然而，重复使用包含享有高水平序列同一性的序列的多个启动子可能导致基于同源性的基因沉默(HBGS)。观察到转基因植物(Peremartietal.,2010)中当在转基因中使用重复的DNA序列时频繁出现HBGS。另外，在土壤杆菌中，已经证明由于质粒的重组和不稳定性，在转基因构建体中重复使用相似的DNA序列是困难的。
本文描述了与玉米泛素1启动子享有低水平序列同一性或同源性的泛素调节元件(例如，启动子和3’-UTR)。进一步描述了利用泛素调节元件的构建体和方法。
概述
本文公开了用于在植物细胞和/或植物组织中表达转基因的构建体和方法。在一个实施方案中，从柳枝稷(Panicumvirgatum)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、或粟(Setariaitalica)基因组中纯化泛素基因调节元件，并且将其与不和该调节元件天然连接的序列重组，从而创制用于在对于所述泛素调节序列而言非天然的植物细胞中表达转基因的表达载体。在一个实施方案中，提供了表达载体，其中泛素基因的调节元件与多接头序列可操作地连接。这样的表达载体使得基因或基因盒以与泛素基因调节序列的可操作连接状态插入到所述载体中变得容易。
在一个实施方案中，提供了构建体，其包含柳枝稷、二穗短柄草、或粟泛素启动子。在一个实施方案中，提供了基因表达盒，其包含与转基因可操作连接的柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素启动子。在一个实施方案中，基因表达盒包含与转基因可操作连接的柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素5’-UTR。在一个实施方案中，基因表达盒包含与启动子可操作连接的柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素5’-UTR。在一个实施方案中，基因表达盒包含与转基因可操作连接的柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素内含子。在一个实施方案中，基因表达盒包含与启动子可操作连接的柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素内含子。在一个实施方案中，构建体包含含有柳枝稷、二穗短柄草、或粟泛素3’-UTR的基因表达盒。在一个实施方案中，基因表达盒包含与转基因可操作连接的柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素3’-UTR。在一个实施方案中，基因表达盒包含至少一个、两个、三个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、或更多个转基因。
在一个实施方案中，基因表达盒独立地包含：a)柳枝稷、二穗短柄草、或粟泛素启动子，b)柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素内含子，c)柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素5’-UTR，以及d)柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素3’-UTR。
根据一个实施方案，提供了核酸载体，其包含与非泛素转基因可操作连接的启动子，其中所述启动子由SEQIDNO:15或与SEQIDNO:15具有90％序列同一性的序列组成。在另一个实施方案中，所述核酸载体包括基因盒，其中所述基因盒包含启动子、非泛素转基因和3'非翻译区，其中所述启动子由与转基因的第一端可操作连接的SEQIDNO:15组成，其中所述转基因的第二端与由SEQIDNO:4组成的3'非翻译序列可操作连接。
本文公开了种植利用柳枝稷、二穗短柄草、或粟启动子、5’-UTR、内含子、和3’-UTR表达转基因的植物的方法。本文还公开了培养利用柳枝稷、二穗短柄草或粟启动子、5’-UTR、内含子、和3’-UTR表达转基因的植物组织和细胞的方法。
根据一个实施方案，提供了包含与非泛素转基因可操作连接的启动子的植物、植物组织、或植物细胞，其中所述启动子包含SEQIDNO:1。根据一个实施方案，提供了包含与转基因可操作连接的SEQIDNO:1、或与SEQIDNO:1具有90％序列同一性的序列的非短柄草属(non-Brachypodium)植物或植物细胞。在一个实施方案中，所述植物为玉米品种。在一个实施方案中，提供了包含与非泛素转基因可操作连接的启动子的植物、植物组织、或植物细胞，其中所述启动子由SEQIDNO:15或SEQIDNO:40组成。在一个实施方案中，提供了包含基因盒的非短柄草属植物或植物细胞，其中所述基因盒包含与转基因可操作连接的启动子，且其中所述启动子由SEQIDNO:15组成。在另一个实施方案中，所述启动子与转基因的第一端可操作连接，其中所述转基因的第二端与由SEQIDNO:4组成的3'非翻译序列可操作连接。
附图简述
图1显示了玉米泛素(ZMUbi1)蛋白质序列与用于启动子鉴定的二穗短柄草和粟泛素序列的蛋白质比对。ZmUbi1蛋白质序列在本文中公开为SEQIDNO:22。粟Ubi2蛋白质序列在本文中公开为SEQIDNO:23。二穗短柄草Ubi1启动子序列在本文中公开为SEQIDNO:24。二穗短柄草Ubi1C蛋白质序列在本文中公开为SEQIDNO:25。共有序列在本文中公开为SEQIDNO:26。
图2显示了玉米泛素(ZMUbi1)启动子多核苷酸序列与本文中鉴定的二穗短柄草和粟泛素启动子多核苷酸的比对。玉米泛素1(Zm-Ubi)启动子序列在本文中公开为SEQIDNO:27。二穗短柄草Ubi1启动子序列在本文中公开为SEQIDNO:16。二穗短柄草Ubi1-C启动子序列在本文中公开为SEQIDNO:15。粟Ubi2启动子序列在本文中公开为SEQIDNO:17。
图3为显示合成的粟泛素2启动子遗传元件的质粒图谱。
图4为显示合成的二穗短柄草泛素1C启动子遗传元件和侧翼无缝克隆突出端位置的质粒图谱。
图5为显示合成的二穗短柄草泛素1启动子遗传元件和侧翼无缝克隆突出端位置的质粒图谱。
图6为显示含有融合于PhiYFP报告基因的粟泛素2(SI-Ubi2)启动子的表达载体的质粒图谱。
图7为显示含有融合于PhiYFP报告基因的二穗短柄草泛素1C启动子的表达载体的质粒图谱。
图8为显示含有融合于PhiYFP报告基因的二穗短柄草泛素1启动子的表达载体的质粒图谱。
图9为显示含有融合于PhiYFP报告基因的OSAct1(水稻肌动蛋白1)启动子的表达载体的质粒图谱。
图10为显示含有融合于PhiYFP报告基因的ZMUbi1启动子的表达载体的质粒图谱。
图11为显示利用Gateway技术用来建立二元表达载体的二元目标载体的质粒图谱。
图12为显示二元表达载体的质粒图谱，该二元表达载体含有粟泛素2(SI-Ubi2)启动子，其融合于含有ST-LS1内含子的黄色荧光蛋白(PhiYFP)标志物基因编码区，之后为包含来自马铃薯的StPinII3'UTR的片段。
图13为显示二元表达载体的质粒图谱，该二元表达载体含有二穗短柄草泛素1C启动子，其融合于含有ST-LS1内含子的黄色荧光蛋白(PhiYFP)标志物基因编码区，之后为包含来自马铃薯的StPinII3'UTR的片段。
图14为显示二元表达载体的质粒图谱，该二元表达载体含有二穗短柄草泛素1启动子，其融合于含有ST-LS1内含子的黄色荧光蛋白(PhiYFP)标志物基因编码区，之后为包含来自马铃薯的StPinII3'UTR的片段。
图15为显示二元表达载体的质粒图谱，该二元表达载体含有OSAct1启动子，其融合于含有ST-LS1内含子的黄色荧光蛋白(PhiYFP)标志物基因编码区，之后为包含来自马铃薯的StPinII3'UTR的片段。
图16为显示二元表达载体的质粒图谱，该二元表达载体含有ZMUbi1启动子，其融合于含有ST-LS1内含子的黄色荧光蛋白(PhiYFP)标志物基因编码区，之后为包含来自马铃薯的StPinII3'UTR的片段。
图17显示了T0叶中的YFP表达，其中YFP由如图12、13、14、15、和16描绘的跨物种泛素启动子和OsAct1启动子驱动。
图18显示了T0叶中的AAD1表达，其中AAD1由如图12、13、14、15、和16描绘的ZmUbi1启动子驱动。
图19显示了由新颖的二穗短柄草和粟启动子驱动的瞬时YFP表达，与由ZMUbi1和OSAct1启动子驱动的YFP表达比较。
图20显示了由新颖的二穗短柄草和粟启动子驱动的愈伤组织中的YFP表达，与由ZMUbi1和OSAct1启动子驱动的YFP表达比较。
图21显示了由新颖的二穗短柄草和粟启动子驱动的根组织中的YFP表达，与由ZMUbi1和OSAct1启动子驱动的YFP表达比较。
图22为显示合成的柳枝稷泛素1启动子遗传元件和侧翼无缝克隆突出端位置的质粒图谱。
图23为显示合成的柳枝稷泛素13’UTR遗传元件和侧翼无缝克隆突出端位置的质粒图谱。
图24为显示合成的二穗短柄草泛素1C3’UTR遗传元件和侧翼无缝克隆突出端位置的质粒图谱。
图25为显示合成的二穗短柄草泛素13’UTR遗传元件和侧翼无缝克隆突出端位置的质粒图谱。
图26为显示合成的粟泛素2(SI-Ubi2)3’UTR遗传元件和侧翼无缝克隆突出端位置的质粒图谱。
图27为显示含有融合于PhiYFP报告基因的柳枝稷泛素1启动子和3’UTR的表达载体的质粒图谱。
图28为显示含有融合于PhiYFP报告基因的二穗短柄草泛素1C启动子和3’UTR的表达载体的质粒图谱。
图29为显示含有融合于PhiYFP报告基因的粟泛素2启动子和3’UTR的表达载体的质粒图谱。
图30为显示含有融合于PhiYFP报告基因的二穗短柄草泛素1启动子和3’UTR的表达载体的质粒图谱。
图31为显示二元表达载体的质粒图谱，该二元表达载体含有二穗短柄草泛素1C启动子，融合于含有ST-LS1内含子的黄色荧光蛋白(PhiYFP)标志物基因编码区，之后为包含二穗短柄草泛素1C3’UTR的片段。
图32为显示二元表达载体的质粒图谱，该二元表达载体含有柳枝稷泛素1启动子，融合于含有ST-LS1内含子的黄色荧光蛋白(PhiYFP)标志物基因编码区，之后为包含柳枝稷泛素13’UTR的片段。
图33为显示二元表达载体的质粒图谱，该二元表达载体含有粟泛素2启动子，融合于含有ST-LS1内含子的黄色荧光蛋白(PhiYFP)标志物基因编码区，之后为包含粟泛素23’UTR的片段。
图34为显示二元表达载体的质粒图谱，该二元表达载体含有二穗短柄草泛素1启动子，融合于含有ST-LS1内含子的黄色荧光蛋白(PhiYFP)标志物基因编码区，之后为包含二穗短柄草泛素13’UTR的片段。
图35呈现了二穗短柄草泛素1C编码序列和推定的启动子(ATG的上游序列)。上游启动子序列加下划线，5’-UTR序列以大写字母表示，内含子加框，Ubi1CDS为斜体，3’-UTR(加有下划线)和转录终止序列在TAA(翻译终止密码子)的下游。
图36呈现了二穗短柄草泛素1编码序列和推定的启动子。上游启动子加下划线，5’UTR序列以大写字母表示，内含子加框，CDS为斜体，3’-UTR(加有下划线)和转录终止序列在TAA(翻译终止密码子)的下游。
图37呈现了粟泛素2编码序列和推定的启动子。上游启动子加下划线，5’UTR序列以大写字母表示，内含子加框，CDS为斜体，3’-UTR(加有下划线的)和转录终止序列在TAA(翻译终止密码子)的下游。
图38呈现了柳枝稷(Switchgrass)泛素1编码序列和推定的启动子。上游启动子加下划线，5’UTR序列以大写字母表示，内含子加框，CDS为斜体，3’-UTR(加有下划线)和转录终止序列在TAA(翻译终止密码子)的下游。
发明详述
定义
在描述和要求本发明时，下列术语将根据下文陈述的定义使用。
如本文中使用的术语“大约”意指比言明的值或值的范围大或小10％，但不意图将任何值或值的范围仅仅指定这个更宽的定义。在每个值或值的范围之前的术语“大约”同样意图涵盖所陈述的绝对值或值的范围的实施方案。
如本文中使用的，术语“回交”是指其中育种者使杂交后代与亲本之一杂交，例如，第一代杂种F1与F1杂种的亲本基因型之一杂交的过程。
“启动子”是能够结合细胞中的RNA聚合酶并启动编码序列的下游(3'方向)转录的DNA调节区。启动子可含有被转录因子识别的特异性序列。这些因子可与启动子DNA序列结合，导致RNA聚合酶的募集。为了定义本发明的目的，启动子序列在其3'端以转录起始位点为界，并向上游(5'方向)延伸，以包含为启动高于背景的可检测水平的转录所需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列内可见转录起始位点(通过例如核酸酶S1作图来方便地界定)、以及负责结合RNA聚合酶的蛋白结合结构域(共有序列)。启动子可与其他表达控制序列(包括增强子和阻抑物序列)可操作地关联。
为本公开的目的，“基因”包括编码基因产物(如上所述)的DNA区域，也包括所有调节基因产物之产生的DNA区域，无论这类调控序列是否位于编码和/或转录序列的附近。因此，基因包括，而不一定限于，启动子序列、终止子、翻译调节序列(如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、隔离子、边界元件、复制起点、核基质附着位点和基因座控制区。
如本文中使用的术语“天然的”或“自然的”定义了在自然界中发现的状况。“天然DNA序列”是通过自然手段或传统育种技术产生的而不是通过基因工程(例如，使用分子生物学/转化技术)产生的存在于自然界中的DNA序列。
如本文中使用的“转基因”定义为编码基因产物(包括，例如但不限于mRNA)的核酸序列。在一个实施方案中，转基因为外源核酸，其中转基因序列已通过基因工程导入通常未发现所述转基因的宿主细胞(或其后代)中。在一个实例中，转基因编码在工业上或药学上有用的化合物、或编码期望的农艺性状的基因(例如，除草剂抗性基因)。在又另一个实例中，转基因为反义核酸序列，其中所述反义核酸序列的表达抑制靶核酸序列的表达。在一个实施方案中，转基因是内源核酸，其中所述内源核酸的额外基因组拷贝是期望的，或者是相对于宿主生物中的靶核酸序列处于反义取向的核酸。
如本文中使用的术语“非泛素转基因”是与玉米泛素1编码序列(SEQIDNO:27)具有小于80％序列同一性的任何转基因。
如本文中定义的“基因表达”是包含在基因中的信息到基因产物的转化。
如本文中定义的“基因产物”是由基因产生的任何产物。例如，基因产物可以是基因直接转录的产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、干扰RNA、核酶、结构RNA或任何其他类型的RNA)或mRNA翻译产生的蛋白质。基因产物还包括修饰过的RNA，例如通过加帽、多聚腺苷酸化、甲基化和编辑修饰过的RNA，以及修饰的蛋白质，例如通过甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP核糖基化、豆蔻酰化(myristilation)和糖基化修饰的蛋白质。基因表达可能受到外部信号的影响，例如细胞、组织、或生物被暴露于可增加或降低基因表达的物质。基因表达也可以在从DNA到RNA再到蛋白质的途径中的任何位置受到调节。基因表达的调节发生的方式有，例如，对转录、翻译、RNA运输和加工的控制；对于中间分子比如mRNA的降解；或在特定蛋白分子已经产生之后对它们的活化、失活化、区室化、或降解，或上述方式的组合。基因表达可以在RNA水平或蛋白质水平上通过本领域已知的任何方法来测量，这些方法包括但不限于，Northern印迹、RT-PCR、Western印迹，或体外、原位或体内蛋白活性测定。
如本文中使用的，术语“内含子”定义为包含在基因(或表达的感兴趣核苷酸序列)中的任何被转录但不被翻译的核酸序列。内含子包括表达的DNA序列之内的非翻译核酸序列、以及从所述DNA序列转录的RNA分子中的相应序列。本文中描述的构建体还可以含有强化翻译和/或mRNA的稳定性的序列，如内含子。一种这样的内含子的实例是拟南芥组蛋白H3变体的基因II的第一内含子或任何其他公知的内含子序列。内含子可与启动子序列联合使用来强化翻译和/或mRNA的稳定性。
如本文中使用的，术语“5’非翻译区”或“5’-UTR”定义为前mRNA或成熟mRNA的5’端中的非翻译区段。例如，在成熟mRNA上，5’-UTR一般在其5’端上包含7-甲基鸟苷帽，且涉及许多过程，如剪接、多腺苷酸化、mRNA朝向细胞质输出、翻译机构识别mRNA的5’端、以及保护mRNA免于降解。
如本文中使用的，术语“转录终止子”定义为前mRNA或成熟mRNA的3’端中的转录区段。例如，超过“多腺苷酸化信号”位点的更长DNA段被转录为mRNA。这个DNA序列常常含有用于将前mRNA正确加工为成熟mRNA的一个或多个转录终止信号。
如本文中使用的，术语“3’非翻译区”或“3’-UTR”定义为前mRNA或成熟mRNA的3’端中的非翻译区段。例如，在成熟的mRNA上，这个区域包含多聚(A)尾，并且已知其在mRNA稳定性、翻译起始、和mRNA输出中具有多种作用。
如本文中使用的，术语“多腺苷酸化信号”指示存在于mRNA转录物中的一种核酸序列，其允许转录物在多聚(A)聚合酶的存在下在多腺苷酸化位点上(例如位于多聚(A)信号的下游的10到30个碱基的多腺苷酸化位点上)多腺苷酸化。许多多腺苷酸化信号在本领域是已知的，并可用于本发明。示例序列AAUAAA及其变体，正如描述于LokeJ.等人的(2005)PlantPhysiology138(3)；1457-1468。
如本文中使用的术语“分离的”意指已经从其自然环境中移出，或者已经与该化合物最初形成时存在的其他化合物分开。术语“分离的”包括从天然来源分离的物质，以及在宿主细胞中重组表达之后回收的物质(例如，核酸和蛋白质)，或化学合成的化合物，如核酸分子、蛋白质、和肽类。
如本文中使用的术语“纯化的”涉及分子或化合物以这样的形式分离：基本上不含通常在天然或自然环境中与所述分子或化合物相关联的污染物，或相对于在所述化合物最初形成时存在的其他化合物而言在浓度上高度富集；该术语还意指作为与原始组成中其他组分分离的结果，在纯度上已经增加。术语“纯化的核酸”在本文中用来描述已经从其他生物化合物(包括但不限于，多肽、脂质和碳水化合物)分离、分开产生、或纯化出来，同时影响组分的化学或功能变化(例如，通过移除蛋白质污染物并使连接核酸与染色体中的其余DNA的化学键断裂，可将核酸从染色体中纯化出来)的核酸序列。
如本文中使用的，术语“基于同源性的基因沉默”或“HBGS”为通用术语，包括转录基因沉默和转录后基因沉默两者。非连锁的沉默基因座对靶基因座的沉默作用可以是转录抑制(转录基因沉默；TGS)或mRNA降解(转录后基因沉默；PTGS)的结果，二者分别是由对应于启动子的双链RNA(dsRNA)或对应于转录序列的双链RNA的产生所导致的。每一过程涉及独特的细胞组分，这表明dsRNA诱导的TGS和PTGS很可能是从某个古老的共同机制的多样化而来。然而，迄今为止TGS和PTGS的严格比较是难于实现的，因为这种比较通常依赖于对独特的沉默基因座的分析。由于产生对应于不同靶基因的启动子和转录序列的dsRNA，单转基因基因座可以说既可触发TGS又可触发PTGS。
如本文中使用的，术语“核酸分子”、“核酸”、或“多核苷酸”(所有这三个术语彼此同义)是指核苷酸的聚合形式，其可包括RNA、cDNA、基因组DNA、和合成形式的有义和反义链、及其混合聚合物。“核苷酸”可以指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或这两种类型核苷酸的任一者的修饰形式。除非另外指明，核酸分子通常长度为至少10个碱基。前述术语可以指具有不确定长度的RNA或DNA分子。所述术语包括DNA的单链和双链形式。核酸分子可以包括天然存在的核苷酸和/或修饰核苷酸，藉由天然存在和/或非天然存在的核苷酸联接而连接在一起。
正如本领域技术人员易于理解的，核酸分子可被化学修饰或生物化学修饰，或者可以含有非天然或衍生的核苷碱基。这些修饰包括，例如，标记物、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(例如，如不带电联接(unchargedlinkage)的修饰：例如甲基膦酸盐、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；带电连接(chargedlinkage)的修饰：例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；悬垂部分的修饰：例如肽类；嵌入剂修饰：例如吖啶、补骨脂素等；螯合剂修饰；烷化剂(alkylator)修饰；和修饰的连接：例如α异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑结构，包括单链的、双链的、部分双链体的、三链体的、发夹形的(hairpinned)、圆形的、挂锁形的结构。
转录以5’到3’的方式沿着DNA链行进。这意味着通过向生长中的链的3’端连续添加5'-核糖核苷三磷酸而产生RNA(消除焦磷酸盐是必不可少的)。在线性或环形核酸分子中，如果离散元件(例如，特定的核苷酸序列)结合到或会结合到同一核酸上另一个元件的5’方向，则所述离散元件可称为处于相对所述另一个元件的“上游”。类似地，如果离散元件结合到或将要结合到同一核酸上另一个元件的3’方向，则所述离散元件可处于相对于所述另一个元件的“下游”。
如本文中使用的，术语“碱基位置”是指在指定核酸之内的给定碱基或核苷酸残基的位置。指定的核酸可通过与参考核酸的比对来定义。
如本文中使用的，术语“杂交”是指其中寡核苷酸及其类似物通过互补碱基之间的氢键杂交的过程，所述氢键包括Watson-Crick、Hoogsteen或反Hoogsteen氢键。通常，核酸分子由含氮碱基组成，所述碱基为嘧啶(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))。这些含氮碱基在嘧啶和嘌呤之间形成氢键，并且嘧啶与嘌呤的键合被称为“碱基配对”。更具体地，A会与T或U键合，而G会与C键合。“互补”指在两条不同的核酸序列或同一核酸序列的两个不同区域之间发生的碱基配对。
如本文中使用的，术语“可特异性杂交”和“特异性互补”是指足够的互补程度，使得在寡核苷酸与DNA或RNA靶标之间发生稳定的和特异性的结合。寡核苷酸不必与其特异性杂交的靶序列100％互补。当寡核苷酸与靶DNA或RNA分子的结合干扰DNA或RNA的正常功能，并且存在足够的互补程度以避免在期望特异性结合的条件(例如对于体内测定或系统的情形而言，生理条件)下的寡核苷酸与非靶序列的非特异性结合时，所述寡核苷酸是可特异性杂交的。这样的结合称为特异性杂交。导致具体的严格程度的杂交条件会根据选择的杂交方法的性质和杂交的核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na+和/或Mg2+浓度)有助于杂交的严格性，尽管洗涤时间也影响严格性。关于得到特定严格程度所需要的杂交条件的考虑论述于Sambrook等(编),MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,1-3卷,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989,第9章和第11章中。
如本文中使用的，“严格条件”涵盖这样的条件：在该条件下，只有当杂交分子与DNA靶之间的错配小于50％时才发生杂交。“严格条件”包括另外的具体严格性水平。因此，如本文中使用的，“中等严格性”条件为具有50％以上序列错配的分子不会杂交的条件；“高严格性”条件为具有20％以上错配的分子不会杂交的条件；“极高严格性”条件为具有10％以上错配的序列不会杂交的条件。在特定的实施方案中，严格条件可包括：在65℃杂交，然后在65℃用0.1xSSC/0.1％SDS洗涤40分钟。以下是代表性的非限制性杂交条件：
·极高严格性：在5xSSC缓冲液中65℃下杂交16小时；在2xSSC缓冲液中室温下洗涤两次，每次15分钟；再在0.5xSSC缓冲液中65℃下洗涤两次，每次20分钟。
·高严格性：在5-6xSSC缓冲液中65-70℃杂交16-20小时；在2xSSC缓冲液中在室温下洗涤两次，每次5-20分钟；再在1xSSC缓冲液中55-70℃洗涤两次，每次30分钟。
·中等严格性：在6xSSC缓冲液中室温到55℃杂交16-20小时；再在2x-3xSSC缓冲液中室温到55℃下洗涤至少两次，每次20-30分钟。
在一个实施方案中，可特异性杂交的核酸分子可在极高严格性杂交条件下保持结合。在一个实施方案中，可特异性杂交的核酸分子可在高严格性杂交条件下保持结合。在一个实施方案中，可特异性杂交的核酸分子可在中等严格性杂交条件下保持结合。
如本文中使用的，术语“寡核苷酸”是指短的核酸聚合物。寡核苷酸可通过切割较长核酸区段、或通过使单独的核苷酸前体聚合而形成。自动合成仪能够合成长度高达几百个碱基对的寡核苷酸。由于寡核苷酸可与互补的核苷酸序列结合，故它们可用作检测DNA或RNA的探针。由DNA组成的寡核苷酸(寡脱氧核糖核苷酸)可用于PCR——一种用于扩增小DNA序列的技术中。在PCR中，寡核苷酸一般被称为“引物”，其允许DNA聚合酶延伸寡核苷酸并复制互补链。
如本文中使用的，术语“聚合酶链式反应”或“PCR”定义了如1987年7月28日公告的美国专利No.4,683,195中所描述的扩增微量核酸、RNA和/或DNA的程序或技术。通常，需要知晓感兴趣区域的末端或在此之外的序列信息，以便能够设计寡核苷酸引物；这些引物与有待扩增的模板的相对链在序列上相同或相似。两个引物的5’端核苷酸可与扩增材料的末端一致。PCR可用来扩增特异性RNA序列、来自总的基因组DNA的特异性DNA序列、和从总的细胞RNA、噬菌体或质粒序列转录的cDNA，等等。一般可参见Mullis等,ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.,51:263(1987)；Erlich编辑,PCRTechnology,(StocktonPress,NY,1989)。
如本文中使用的，术语“引物”是指当条件适合于引物延伸产物的合成时，能够充当沿着互补链合成的起始点的寡核苷酸。合成条件包括四种不同的脱氧核糖核苷三磷酸、以及至少一种聚合诱导剂(诸如逆转录酶或DNA聚合酶)的存在。这些物质处于适合的缓冲液中，所述缓冲液可包括作为辅因子、或在不同的适当温度下影响pH等条件的组分。引物优选地是单链序列，使得扩增效率最优化，但也可以利用双链序列。
如本文中使用的，术语“探针”是指与靶序列杂交的寡核苷酸。在或型测定程序中，探针与位于两个引物的退火位点之间的靶部分杂交。探针包含约八个核苷酸、约十个核苷酸、约十五个核苷酸、约二十个核苷酸、约三十个核苷酸、约四十个核苷酸、或约五十个核苷酸。在一些实施方案中，探针包含从约八个核苷酸到约十五个核苷酸。探针可进一步包含可检测标记，例如，荧光团(异硫氰酸荧光素，等)。可检测标记可直接共价附接到探针寡核苷酸上，例如位于探针的5’端或探针的3’端。包含荧光团的探针还可进一步包含淬灭剂，例如，BlackHoleQuencherTM、IowaBlackTM，等。
如本文中使用的，术语“序列同一性”或“同一性”可以互换地使用，指两个序列以指定比较窗口上的最大对应性对齐时，两个序列中相同的核酸残基数。
如本文中使用的，术语“序列同一性百分比”是指通过在比较窗口上比较两个最优对齐的序列(例如核酸序列或氨基酸序列)而确定的值，其中为了实现两个序列的最优对齐，该比较窗口中的序列部分相比于参考序列(不包含添加或缺失)可以包含添加或缺失(即，空位)。通过确定在两个序列中出现相同核酸或氨基酸残基的位置的数目来产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数，结果乘以100产生序列同一性的百分比，从而计算出该百分比。用于比较的序列比对方法是熟知的。各种程序和比对算法例如描述于Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins和Sharp(1988)Gene73:237-44；Higgins和Sharp(1989)CABIOS5:151-3；Corpet等(1988)NucleicAcidsRes.16:10881-90；Huang等(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson等(1994)MethodsMol.Biol.24:307-31；Tatiana等(1999)FEMSMicrobiol.Lett.174:247-50。
美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLASTTM；Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10)可从几个来源获得，包括美国国家生物技术信息中心(Bethesda,MD)，并且在互联网上也可供与几种序列分析程序结合使用。如何使用该程序确定序列同一性的描述可在互联网的BLASTTM的“帮助”部分获得。为了比较核酸序列，可以采用利用默认参数的BLASTTM(Blastn)程序的“Blast2序列”函数。在用这种方法评估时，与参考序列具有较大相似性的核酸序列将显示出同一性百分比的增加。
如本文中使用的，术语“可操作连接”指已被置于相互之间的功能关系中的两种组分。在有关调节序列和编码序列的情况下使用时，术语“可操作连接”意味着该调节序列影响该连接的编码序列的表达。“调节序列”、“调节元件”、或“控制元件”是指影响转录的周期和水平/量、RNA加工或稳定性、或相关编码序列的翻译的核酸序列。调节序列可包括启动子；翻译前导序列；5'和3'非翻译区，内含子；增强子；茎环结构；抑制子结合序列；终止序列；多腺苷酸化识别序列等。具体的调节序列可位于与其可操作连接的编码序列的上游和/或下游。并且，与编码序列可操作连接的具体调节序列可位于双链核酸分子的相关互补链上。连接可通过合适的限制性位点处的连接作用(ligation)来完成。如果这样的位点不存在，则根据常规做法使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。然而，可操作连接的元件不需要是毗连的。
如本文中使用的，术语“转化”涵盖所有可将核酸分子导入这种细胞中的技术。实例包括但不限于：用病毒载体转染；用质粒载体转化；电穿孔；脂质体转染；显微注射(Mueller等(1978)Cell15:579-85)；土壤杆菌介导的转移；直接DNA摄取；晶须介导的转化；和微粒轰击。
如本文中使用的，术语“转导”是指病毒将核酸转移到细胞中的过程。
如本文中使用的术语“多接头”或“多克隆位点”定义核酸序列上成簇的三个或更多个2型限制酶位点，彼此之间相距10个核苷酸以内。包含多接头的构建体用于核酸序列(诸如基因的编码区)的插入和/或切除。
如本文中使用的，术语“限制性内切核酸酶”和“限制酶”是指多种细菌酶，它们各自切割双链DNA上的特异性核苷酸序列或附近。2型限制酶在同一位点识别和切割DNA，2型限制酶包括但不限于XbaI、BamHI、HindIII、EcoRI、XhoI、SalI、KpnI、AvaI、PstI和SmaI。
术语“载体”与术语“构建体”、“克隆载体”和“表达载体”可互换使用，意指一种媒介物，可用其将DNA或RNA序列(例如，外来序列)导入宿主细胞中，从而转化宿主并促进导入序列的表达(例如转录和翻译)。“非病毒载体”意图表示任何不包含病毒或反转录病毒的载体。在一些实施方案中，“载体”为包含至少一个DNA复制起点和至少一个选择标志物基因的DNA序列。实例包括但不限于质粒、粘粒、噬菌体、细菌人工染色体(BAC)、或携带外源DNA进入细胞的病毒。载体还可包括一个或多个基因、反义分子、和/或选择标志物基因和本领域已知的其他遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，由此导致细胞表达核酸分子和/或由该载体编码的蛋白质。
术语“质粒”定义能够在原核或真核宿主细胞中进行常染色体复制的环链核酸。该术语包括可为DNA或RNA并且可为单链或双链的核酸。质粒的定义还可包括对应于细菌复制起点的序列。
如本文中使用的术语“选择标志物基因”定义编码蛋白质的基因或其他表达盒，所述蛋白质可以帮助鉴定这样的细胞：该细胞中插入有选择标志物基因。例如，“选择标志物基因”涵盖报告基因以及在植物转化中使用的、例如用于保护植物细胞免受选择剂的影响或提供针对选择剂的抗性/耐受性的基因。在一个实施方案中，只有那些接收功能性选择标志物的细胞或植物才能在有选择剂的条件下分化或生长。选择剂的实例可以包括，例如包括大观霉素、新霉素、卡那霉素、巴龙霉素、庆大霉素、和潮霉素之类的抗生素。这些选择标志物包括表达赋予抗生素卡那霉素抗性的酶的新霉素磷酸转移酶基因(nptII)，和针对有关抗生素新霉素、巴龙霉素、庆大霉素和G418的基因，或表达赋予潮霉素抗性的酶的潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)。其他选择标志物基因可以包括编码除草剂抗性的基因，包括bar或pat(针对草胺磷或膦丝菌素的抗性)、乙酰乳酸合酶(ALS，针对抑制剂诸如磺酰脲类(SU)、咪唑啉酮类(IMI)、三唑并嘧啶类(TP)、嘧啶氧基苯甲酸类(POB)、和阻止支链氨基酸合成第一步的磺酰基氨基羰基三唑啉酮类的抗性)、草甘膦、2,4-D、和金属抗性或敏感性。可用作选择标志物基因的“报告基因”的实例包括表达的报告基因蛋白的视觉观察，所述报告基因蛋白例如编码的蛋白质：β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、DsRed、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、碱性磷酸酶等。短语“标志物阳性”是指已被转化而包含选择标志物基因的植物。
如本文中使用的，术语“可检测标志物”是指能够检测的标记，例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螫合剂、或酶。可检测标志物的实例包括但不限于下列各项：荧光标记(例如，FITC、罗丹明、镧系磷光体)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、生物素基；由二级报道分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、附加表位)。在一个实施方案中，可检测标志物可通过不同长度的间隔臂附接，以降低潜在的空间位阻。
如本文中使用的，术语“检测”以最广义使用，包括特异性分子的定性和定量测量，例如特异性多肽的测量。
如本文中使用的，术语“盒”、“表达盒”和“基因表达盒”是指可在特异的限制性位点插入核酸或多核苷酸中或通过同源重组插入核酸或多核苷酸中的DNA区段。如本文中使用的，DNA区段包括编码感兴趣多肽的多核苷酸，所述盒和限制性位点被设计为确保所述盒按照适于转录和翻译的正确阅读框插入。在一个实施方案中，表达盒可包含编码感兴趣多肽的多核苷酸，并且除了所述多核苷酸之外，还具有便于特定宿主细胞转化的元件。在一个实施方案中，基因表达盒还可包括允许编码感兴趣多肽的多核苷酸在宿主细胞中增强表达的元件。这些元件可包括但不限于：启动子、最小启动子、增强子、应答元件、终止子序列、多聚腺苷酸化序列，等。
如本文中使用的“接头”或“间隔区”是使两个分开的实体彼此结合的键、分子或分子基团。接头和间隔区可为两个实体提供最佳间距，或者可进一步提供允许两个实体彼此分开的不稳定连接。不稳定连接包括可光裂解的基团、酸不稳定性部分、碱不稳定性部分和酶可裂解的基团。
如本文中使用的，术语“对照”是指为比较目的而在分析程序中使用的样品。对照可为“阳性”的或“阴性”的。例如，在分析程序的目的是检测细胞或组织中的差异表达的转录物或多肽的情况下，通常优选包括阳性对照，例如来自表现出期望的表达的已知植物的样品，以及阴性对照，例如来自缺乏该期望的表达的已知植物的样品。
如本文所使用的，术语“植物”包括整个植物及植物的任何后代、细胞、组织、或部分。可用于本发明中的植物类别通常与适合于诱变的高等和低等植物类别一样宽，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类和多细胞藻类。因此，“植物”包括双子叶和单子叶植物。术语“植物部分”包括植物的任何部分，包括，例如但不限于：种子(包括成熟种子和未成熟种子)；植物插条；植物细胞；植物细胞培养物；植物器官(如花粉、胚、花、果实、芽(shoot)、叶、根、茎、和外植体)。植物组织或植物器官可以是种子、原生质体、愈伤组织、或者任何其他被组织成一定结构或功能单元的植物细胞群。植物细胞或组织培养物可能能够再生出具有该细胞或组织所来源的植物的生理学和形态学特征的植物，并且可能能够再生出与该植物具有基本上相同的基因型的植物。与之相反，一些植物细胞不能再生而产生植物。植物细胞或组织培养物中的可再生细胞可以是胚、原生质体、分生组织细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、须、花、果仁、穗、穗轴、壳、或茎。
植物部分包括可收获的部分和可用于繁殖后代植物的部分。可用于繁殖的植物部分包括，例如但不限于：种子；果实；插条；苗；块茎；和根砧木。植物的可收获部分可以是植物的任何有用部分，包括，例如但不限于：花；花粉；苗；块茎；叶；茎；果实；种子；和根。
植物细胞是植物的结构和生理的单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单细胞或细胞聚集体的形式(例如，松散型(friable)愈伤组织和培养细胞)，也可以是更高级的有组织单元(例如，植物组织、植物器官、和植物)的一部分。因此，植物细胞可以是原生质体、配子产生细胞、或可以再生成完整植物的细胞或细胞集合。这样，种子，因其包含多个植物细胞并能够再生为完整植物，在本文的实施方案中被认为是“植物细胞”。
如本文中使用的术语“原生质体”是指其细胞壁已经被完全或部分去除的植物细胞，其脂质双层膜裸露，因此包括细胞壁已经完全去除的原生质体、以及其细胞壁仅被部分去除的原生质球，但并非仅限于此。原生质体一般为没有细胞壁的分离的植物细胞，具有再生为细胞培养物或完整植物的潜能。
除非另外特别地解释，本文中使用的全部技术术语和科学术语具有与属于本公开的领域之内的普通技术人员通常所理解的相同的含义。可以在以下出版物中找到分子生物学中常见术语的定义：例如，Lewin,GenesV,OxfordUniversityPress,1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew等(编),TheEncyclopediaofMolecularBiology,BlackwellScienceLtd.,1994(ISBN0-632-02182-9)；和Meyers(编),MolecularBiologyandBiotechnology:AComprehensiveDeskReference,VCHPublishers,Inc.,1995(ISBN1-56081-569-8)。
实施方案
如本文中公开的，提供了新颖的重组构建体，它们使用来自柳枝稷、二穗短柄草、或粟的泛素基因的调节序列来表达非泛素转基因。这些构建体可用来转化包括植物细胞在内的细胞，以便产生在其细胞中表达转基因的基因产物的完整生物。
调节元件
用于基础研究或生物技术应用的植物启动子通常是单向的，其仅仅指导一个已融合在其3’端(下游)的基因。代谢工程和性状堆叠常常需要将多个基因导入植物中，因此，在转基因作物中一般需要多个启动子来驱动多个基因的表达。
转基因产品的开发变得日益复杂，其需要在单基因座中堆叠多个转基因。传统上，每个转基因的表达通常都需要启动子，其中需要多个启动子来在一个基因堆叠中表达不同的转基因。这经常导致在一个转基因堆叠内重复使用相同的启动子，以使得用于表达单一多基因性状的不同转基因获得表达模式的相似水平。已知由相同启动子驱动的多基因构建体可导致基因沉默，结果降低转基因产物在田间的效用。由于启动子重复导致的转录因子(TF)结合位点的过量可引起内源TFs的消耗，从而导致转录失活。转基因的沉默将很可能不良地影响产生的转基因植物表达转基因的性能。转基因内的重复序列可引起基因座内(intra-locus)同源重组，导致多核苷酸重排。
使用多样化的启动子表达基因堆叠中的不同转基因是有利的。在一个实施方案中，从不同植物物种获得的多样化的组成型泛素能驱动多个转录单位，包括RNAi、人工miRNA、或发夹环RNA序列的转录。
提供了利用组成型泛素(Ubi1)启动子在植物中表达非泛素转基因的方法和构建体。在一个实施方案中，启动子可以是二穗短柄草泛素1C(Ubi1C)启动子。
CTGCTCGTTCAGCCCACAGTAACACGCCGTGCGACATGCAGATGCCCTCCACCACGCCGACCAACCCCAAGTCCGCCGCGCTCGTCCACGGCGCCATCCGCATCCGCGCGTCAACGTCATCCGGAGGAGGCGAGCGCGATGTCGACGGCCACGGCGGCGGCGGACACGACGGCGACGCCCCGACTCCGCGCGCGCGTCAAGGCTGCAGTGGCGTCGTGGTGGCCGTCCGCCTGCACGAGATCCCCGCGTGGACGAGCGCCGCCTCCACCCAGCCCCTATATCGAGAAATCAACGGTGGGCTCGAGCTCCTCAGCAACCTCCCCACCCCCCCTTCCGACCACGCTCCCTTCCCCCGTGCCCCTCTTCTCCGTAAACCCGAGCCGCCGAGAACAACACCAACGAAAGGGCGAAGAGAATCGCCATAGAGAGGAGATGGGCGGAGGCGGATAGTTTCAGCCATTCACGGAGAAATGGGGAGGAGAGAACACGACATCATACGGACGCGACCCTCTAGCTGGCTGGCTGTCCTAAAGAATCGAACGGAATCGCTGCGCCAGGAGAAAACGAACGGTCCTGAAGCATGTGCGCCCGGTTCTTCCAAAACACTTATCTTTAAGATTGAAGTAGTATATATGACTGAAATTTTTACAAGGTTTTTCCCCATAAAACAGGTGAGCTTATCTCATCCTTTTGTTTAGGATGTACGTATTATATATGACTGAATATTTTTTATTTTCATTGAATGAAGATTTTCGACCCCCCAAAAATAAAAAACGGAGGGAGTACCTTTGTGCCGTGTATATGGACTAGAGCCATCGGGACGTTTCCGGAGACTGCGTGGTGGGGGCGATGGACGCACAACGACCGCATTTTCGGTTGCCGACTCGCCGTTCGCATCTGGTAGGCACGACTCGTCGGGTTCGGCTCTTGCGTGAGCCGTGACGTAACAGACCCGTTCTCTTCCCCCGTCTGGCCATCCATAAATCCCCCCTCCATCGGCTTCCCTTTCCTCAATCCAGCACCCTGATT(SEQIDNO:1)
在一个实施方案中，启动子可以是二穗短柄草泛素1(Ubi1)启动子。
GGCGTCAGGACTGGCGAAGTCTGGACTCTGCAGGGCCGAACTGCTGAAGACGAAGCAGAGGAAGAGAAAGGGAAGTGTTCGACTTGTAATTTGTAGGGGTTTTTTTTAGAGGAACTTGTAATTTGTAGGTGGGCTGGCCTCGTTGGAAAAACGATGCTGGCTGGTTGGGCTGGGCCGATGTACGCTTGCAAACAACTTGTGGCGGCCCGTTCTGGACGAGCAGGAGTTTCTTTTTTGTTCTCACTTTTCTGGTCTTCTTTAGTTACGGAGTACCTTTTGTTTTTTAAAGGAGTTACCTTTTTTTTAGGAATTCTTTAGTTACCTTTCGCTTGCTCTCAAAAAATATTTAACTTTCGCTTTTTTTCATTTTAATTTTTGCAACTATTTACGAGTTTCATGAATGCTTATTTTCCAGCATATCATTATTTGCAAGTATTTTTATGCCGTATGTATTGGACGAGAGCCATCGGGACTGTTCCAGAGACTGCGTGGTGGGGACGGCTCCCAACCGCCTTTTCTATCTCTGTTCGCATCCGGTGGCCGACTTGGCTCGCGCGTGAGCCGTGACGTAACAGACTTGGTCTCTTCCCCATCTGGCCATCTATAAATTCCCCCATCGATCGACCCTCCCTTTCC(SEQIDNO:2)
在一个实施方案中，启动子可以是粟泛素2(Ubi2)启动子。
TGCGTCTGGACGCACAAGTCATAGCATTATCGGCTAAAATTTCTTAATTTCTAAATTAGTCATATCGGCTAAGAAAGTGGGGAGCACTATCATTTCGTAGAACAAGAACAAGGTATCATATATATATATATATATAATATTTAAACTTTGTTAAGTGGAATCAAAGTGCTAGTATTAATGGAGTTTCATGTGCATTAAATTTTATGTCACATCAGCAATTTTGTTGACTTGGCAAGGTCATTTAGGGTGTGTTTGGAAGACAGGGGCTATTAGGAGTATTAAACATAGTCTAATTACAAAACTAATTGCACAACCGCTAAGCTGAATCGCGAGATGGATCTATTAAGCTTAATTAGTCCATGATTTGACAATGTGGTGCTACAATAACCATTTGCTAATGATGGATTACTTAGGTTTAATAGATTCGTCTCGTGATTTAGCCTATGGGTTCTGCTATTAATTTTGTAATTAGCTCATATTTAGTTCTTATAATTAGTATCCGAACATCCAATGTGACATGCTAAAGTTTAACCCTGGTATCCAAATGAAGTCTTATGAGAGTTTCATCACTCCGGTGGTATATGTACTTAGGCTCCGTTTTCTTCCACCGACTTATTTTTAGCACCCGTCACATTGAATGTTTAGATACTAATTAGAAGTATTAAACGTAGACTATTTACAAAATCCATTACATAAGACGAATCTAAACGGCGAGACGAATCTATTAAACCTAATTAGTCCATGATTTGACAATGTGTTGCTACAGTAAACATTTGCTAATGATGGATTAATTAGGCTTAATAGATTCGTCTCGCCGTTTAGCCTCCACTTATGTAATGGGTTTTCTAAACAATCTACGTTTAATACTCCTAATTAGTATCTAAATATTCAATGTGACACGTGCTAAAAATAAGTCAGTGGAAGGAAGAGAACGTCCCCTTAGTTTTCCATCTTATTAATTGTACGATGAAACTGTGCAGCCAGATGATTGACAATCGCAATACTTCAACTAGTGGGCCATGCACATCAGCGACGTGTAACGTCGTGAGTTGCTGTTCCCGTAG(SEQIDNO:3)
在一个实施方案中，启动子可以是柳枝稷(Switchgrass)泛素1启动子。
TTGAATTTTAATTTCAAATTTTGCAGGGTAGTAGTGGACATCACAATACATATTTAGAAAAAGTTTTATAATTTTCCTCCGTTAGTTTTCATATAATTTTGAACTCCAACGATTAATCTATTATTAAATATCCCGATCTATCAAAATAATGATAAAAATTTATGATTAATTTTTCTAACATGTGTTATGGTGTGTACTATCGTCTTATAAAATTTCAACTTAAAACTCCACCTATACATGGAGAAATGAAAAAGACGAATTACAGTAGGGAGTAATTTGAACCAAATGGAATAGTTTGAGGGTAAAATGAACTAAACAATAGTTTAGGAGGTTATTCAGATTTTAGTTATAGTTGAGAGGAGTAATTTAGACTTTTTCCTATCTTGAATTGTTGACGGCTCTCCTATCGGATATCGGATGGAGTCTTTCAGCCCAACATAACTTCATTCGGGCCCAAACGTTCGTCCATCCAGCCTAGGGAGAACATTTTGCCCATGATATCTGTTTTTCTTTTTTTCTATTTTCACTGGTATTATAGGAGGGAAATATACAACGTGTTCACCTTTGGTTTCATTCTTGTTCCATCTGAATTTATCTAAAACTGTGTTTGAACTTCGTAAGAATTTTGTTCGATCTGTCCGGTACATCGTGTTGATAGGTGGCCTCCGAGATTCTTCTTTTTAACCGGCAAAGTAAAATAATCTCAGCTCCAGCCTAACGTCAATTATCAGAGAGAGAAAAAAATATTTTTTTATGATTGATCGGAAACCAACCGCCTTACGTGTCGATCCTGGTTCCTGGCCGGCACGGCGGAGGAAAGCGACCGACCTCGCAACGCCGGCGCACGGCGCCGCCGTGTTGGACTTGGTCTCCCGCGACTCCGTGGGCCTCGGCTTATCGCCGCCGCTCCATCTCAACCGTCCGCTTGGACACGTGGAAGTTGATCCGTCGCGCACCAGCCTCGGAGGTAACCTAACTGCCCGTACTATAAATCCGGGATCCGGCCTCTCCAATCCCCATCGCCA(SEQIDNO:35)
在一个实施方案中，提供了包含泛素启动子的核酸构建体。在一个实施方案中，所述泛素启动子是柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素启动子。在一个实施方案中，提供了包含启动子的核酸构建体，其中所述启动子与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、或SEQIDNO:35至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％相同。在一个实施方案中，提供了包含与多接头可操作连接的泛素启动子的核酸构建体。在一个实施方案中，提供了包含与非泛素转基因可操作连接的泛素启动子的基因表达盒。在一个实施方案中，所述启动子由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、或SEQIDNO:35组成。在说明性实施方案中，基因表达盒包含与转基因的5'端可操作连接的泛素启动子，其中所述转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因、或它们的组合。
除了启动子之外，3’非翻译基因区(即，3’UTR)或终止子是转录终止和mRNA的多腺苷酸化所需要的。正确的转录终止和mRNA的多腺苷酸化对于转基因的稳定表达是重要的。转录终止对于多基因堆叠更为关键，以免转录通读到下一个转基因中。类似地，非多腺苷酸化的异常RNA(aRNA)是植物RNA依赖性RNA聚合酶(RdRPs)将aRNA转化为双链RNA(dsRNA)的底物，从而导致小RNA的产生和转基因的沉默。因此，强转录终止子对于单基因和多基因堆叠都很有用。虽然启动子对于驱动转录是必要的，但3’-UTR基因区能终止转录并起始用于翻译和蛋白质合成的所得mRNA转录物的多腺苷酸化。3’-UTR基因区有助于转基因的稳定表达。
根据一个实施方案，提供了包含泛素转录终止子的核酸构建体。在一个实施方案中，所述泛素转录终止子是柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素转录终止子。在一个实施方案中，提供了包含转录终止子的核酸构建体，其中所述转录终止子与SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、或SEQIDNO:36至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％相同。在一个实施方案中，提供了包含与多接头可操作连接的泛素转录终止子的核酸构建体。在一个实施方案中，提供了包含与非泛素转基因的3'端可操作连接的泛素转录终止子的基因表达盒。在一个实施方案中，所述转录终止子由SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、或SEQIDNO:36组成。在说明性实施方案中，基因表达盒包含与转基因可操作连接的泛素转录终止子，其中所述转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因、或它们的组合。在一个实施方案中，提供了包含与多接头序列、非泛素转基因、或二者的组合可操作连接的转录终止子的核酸载体，其中所述转录终止子包含SEQIDNO:4或与SEQIDNO:4具有90％序列同一性的序列。在一个实施方案中，转录终止子长度小于1kb，在另一个实施方案中，转录终止子由SEQIDNO:4的3’UTR序列组成。
在一个实施方案中，提供了核酸构建体，其包含如本文中所述的泛素启动子和3’-UTR。在一个实施方案中，所述核酸构建体包含泛素3’-UTR。在一个实施方案中，所述泛素3’-UTR是柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素3’-UTR。
在一个实施方案中，3’-UTR可以是二穗短柄草泛素1C(Ubi1C)3’-UTR。
GTTTGTCAAAAACTGGCCTACAGTCTGCTGCCCCTGTTGGTCTGCCCCTTGGAAGTAGTCGTGTCTATGGTTATGTGAGAAGTCGTTGTGTTCTTTCTAATCCCGTACTGTTTGTGTGAACATCTGCTGCTGTCGTATTGCATCGTGAAGAATCCTGTTATGAATAAGTGAACATGAACCTTGTTCTGTGATTACGGCTTCGTGGTTATGCGAACGTTCTTACAAACGCAATTGCACCTGATGTAAAATCGTTTTTGCTAGCTGTATGGAACAAGTGCTCATGATGTTCATGCAAGATGCAATTCCAGCTTTTGTTGGTTTGTCATCTTTGTACTGTGCTTACCGCACATAAAGATTGCATCTTGCTTATTGCTTTGTTGCTTTGGTGCTCGTCCGCTTCTCCTTGCACCTTATCAAACCTTTGTTTAGATTCTCTTCTTATAGCACTTGGTAACTCTCAGCTTTACAACGCCAGTACTGTTTCTGAAATTTCATGACTGATAAAGCTGATAGATGGAGTACTAATATATGACATCTTTCCATAAATGTTCGGGTGCAGAGATATGGAGGCCCCAGGATCCTATTTACAGGATGAACCTACCTGGGCCGCTGTACGCATGACATCCGCGAGCAAGTCTGAGGTTCTCAATGTACACATGAAATTGATTTTTGCTGCGTTTGGCTTGGCTGATCGTTGCATTTGTTCTGATTCATCAGAGTTAAATAACGGATATATCAGCAAATATCCGCAGCATCCACACCGACCACACGTCCGGTTAACAGAGTCCCCCTGCCTTGCTTTAATTATTACGGAGTACTCCGCTATTAATCCTTAGATATGTTTCGAAGGAACTCAAACCTTCCTCCATCTGCAAATCTCAGTGCTTCAAAACTGGAATTAGATAATTGAAACCTTCATTCGGTTGCAATTCACAACTGCAAATTGAACAGCACTGTCAATTTCAATTTCGGGTTCACGATTCCACCGATAGGTTGACATGATCCATGATCCACCCATTGTACAAC(SEQIDNO:4)
在一个实施方案中，3’-UTR可以是二穗短柄草泛素1(Ubi1)3’-UTR。
GCTTCTGCCGAACTGGTTCACAGTCTGCTGCCCTTGGTGGTCTGCCCCTTAGTGGTCATGCCTTTTGTTATGTGTCTTGCGTCCCAATCCTGTATCGTTTGTGTGAACATCTCTGCTGCTGTATAGCAGCTTGAATCCTGTTATGAATTTGTGAACCTGAACCTTGTTCCGTGAATCATGTTATGAATAAGTGAACCTGAACCTTGTTCCGTGATTATTGTTACAATCTGTTGTGCCGTATGGTTGGTCGTGTGTGATTTATGTTGAACTGGAGAACCAAGTTCGTTCCAGGACATATTGCAACCTAAGCTAAACCATGTAGAACTACTTGTTCTGGGAGACATAAAACGTCATTTTTATGCATTCGTAACATTTAAGCATACTACAATAATTGTATTGTCCTTTTCCTACTCATCCTTGAAACCATATGCCTCTTCTCAGCGCCTCTACATGCAGTGTGCTCAGAACAAACAGGCCCTGCCAGCTGCTTTTCAATTTTCCAATTAATAACCACAATAGTCGGACTATGGCATCTGTGGGTGACTATGCAAGATGTTGCTGTCAGGTCTCTGAAACTTTTCCCATGTATCTGTTGAAATTACCCAGTAAATTCATGCCTCTATTTAATCTGGCATGGTTGATTTTCAAACAGAATGTGTTTTTTTTTGTTCTGGAAGCTATATTGGTAAATAAATACAAAGCTGGAGTGTGATTATATTTCCAACAGATATTCAAGAAAATCTCAGTTGATTTATTTACTACTGTAGTATATATATATATCTTACAGTTGACTTCTCATATTTCAAACGACATGTGAGCACATTGTTCAGTTTCTTAGGATGTGTTGTGTGCTCAAAGGTGTAATTTTGCATTCTGCCCTCCGAGTAAACACTACACGTATTTTTTTGAGTGGCAGTGCATTTGATTACAAGGCAACAACAACAAAAACCTATGGCAAGATATCCTTCTTAGAGGCTGCCAGGATCATTTTGACTGAACTATGTAAGGCTGAAGAAAAGG(SEQIDNO:5)
在一个实施方案中，3’-UTR可以是粟泛素2(Ubi2)3’-UTR。
GCCCATCGGTCATGGATGCTTCTACTGTACCTGGGTCGTCTGGTCTCTGCCTGTGTCACCTTTGAAGTACCTGTGTCGGGATTGTGTTTGGTCATGAACTGCAGTTTGTCTTTGATGTTCTTTTGTCTGGTCTTATGAACTGGTTGTATCTGTATGTTTACTGTAAACTGTTGTTGCGGTGCAGCAGTATGGCATCCGAATGAATAAATGATGTTTGGACTTAAATCTGTACTCTGTTTGTTTTCGGTTATGCCAGTTCTATATTGCCTGAGATCAGAATGTTTAGCTTTTGAGTTCTGTTTGGCTTGTGGTCGACTCCTGTTTCTTACTTGAGGCGTAACTCTGTTCTGGCAAACTCAAATGTCTAACTGAATGTTTTAGGACTTAATTGTTGGACAGATTAACGTGTTTGGTTTGTTTCTAGATTGTGATTCGGAAGGCTTGTTAGTTGTGGAATCAAGGAGAGCAGCTAGGTCTGTGCAGAACGTTATTTTGGATTTAAGCCTTCTCAGATTATGCCATTACTCTAAACCTAATGATATCATATTTCACTCGGGGATGTTGGAGTAGTCTTTTCTTTCTCCTGCAGACAAAATGATTTTGCTTTCGTGTGTGTACATGATTTTGTGCAACTGTTGCAACAACTGAAGTAGACAAGTTTTGACCTCACCAGAAGAATGAAAAAGATTTTGGAATTTGTTACATCGACAAACCATTGTAACTTGGCCCATCAGAATGCACAGAAGAGCGGCTACAAATTGACATGCGTTGCAAACTTTGCAATAGTTGATGCACATGTTTGCCATTGCCTGCCAGTCTTAGGAAAAGTGTGTGGTTCGAGAAATCTAAGCATATGTGCTCTGCTCACATTGCGTGGAACCCACACAGCTTTGTCACACTCTTGTCCACTCCAGAAGTCATTCCTGGCGCTGTTTACCCCTGGTAAAAGGTAACCGAAAACTTCTCAAGGCTGTACCCAAAACTGGAAGGAAATTTGGAGGAAATCTTTGCTTTTGATCGGCTCACTCTTTC(SEQIDNO:6)
在一个实施方案中，3’-UTR可以是柳枝稷(Switchgrass)泛素13’-UTR。
GCCTAGTGCTCCTGAGTTGCCTTTTGTCGTTATGGTCAACCTCTGGTTTAAGTCGTGTGAACTCTCTGCATTGCGTTGCTAGTGTCTGGTTGTGGTTGTAATAAGAACATGAAGAACATGTTGCTGTGGATCACATGACTTTTTTTTTTGAACCGGAAGATCACATGACTTTCATGGCTTTAAGTTCCTGAACTCTGAAATCTGGACCCCTTTTTAAGCTCTGAACTCATCATTCTTGCATTTACATCTGGTGTTGATCTTATTGATGTGATGCAGTCCTGCTGAAATAGTCAATGTAGATTCATGACTGACTGATTGCGTTTATGGTGTGTATGTTGTTAACAAGCTGAAGGTCGTGTGGTGTCTTTCCAGTTAGACGAAGTGTGCTTTATTGTAGCGTGTAGTGCTGCTGGATGATTGATGAACTGAAACATTCTGCATTTAGCAACTAGCGAGCCAAAGGTGATGACTGAGTTTCTGTAGACCTGTTTTTTTATGCCCATGGTCGTTCTTCAATTGCACTTGATTTTCACATTAGCTGGATCATAATCTGAGCAGACTACTCAAAAGTACAAAGTTCATCTTCGCTATGACGCTTTGCCACTAGGATTTTCTTTGTATGATTTGTTTACAAATCCTGTAATCTAGTCAAAAGAAAAGCCAAAATTTTTCTTTGTATGATTTGTTTACAAATCCTCTAATCTAGTCAAAGAAAAGCCAAATTTATCCCTCCTGGTCCCCTACATCACGTAGCTATGTGGCCCGCAAGCAGATGAAAGCAGCCCCGTCAGCCGACGCCGACGCCGACGCCAACACATCCTGCTCCTCCCTCGCCGGCGCCGGCGCCGGCGAGGCCGCACCGCCGCTGCCCCGTGGCCGCAGGCACACGGTGCCGCACTGCCGCCGCCCCGTGGCCGCAGGCACACGGTGCCGCACTGCCGCCGCCTCCCCTTCCGGCATTGCCGGACGGCTGGGCTACTGTCCCCGCCGCCTTCCCAAT(SEQIDNO:36)
在一个实施方案中，提供了核酸构建体，其包含如本文中所述的泛素启动子和3’-UTR，其中所述3’-UTR与SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、或SEQIDNO:36至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％相同。在一个实施方案中，提供了包含如本文中所述的泛素启动子和3’-UTR的核酸构建体，其中所述泛素启动子和3'-UTR可操作连接于多接头的相反末端。在一个实施方案中，提供了包含如本文中所述的泛素启动子和3’-UTR的基因表达盒，其中所述泛素启动子和3'-UTR可操作连接于非泛素转基因的相反末端。在一个实施方案中，3’-UTR由SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、或SEQIDNO:36组成。在一个实施方案中，提供了包含如本文中所述的泛素启动子和3’-UTR的基因表达盒，其中所述泛素启动子包含SEQIDNO:2A且3'-UTR包含SEQIDNO:4，其中所述启动子和3'-UTR可操作连接于非泛素转基因的相反末端。在一个实施方案中，3’-UTR由SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、或SEQIDNO:36组成。在一个实施方案中，所述启动子由SEQIDNO:2A、15或40组成，并且3’-UTR由SEQIDNO:4组成。在说明性实施方案中，基因表达盒包含与转基因可操作连接的泛素3’-UTR，其中所述转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因、或它们的组合。在另一个实施方案中，所述转基因与泛素启动子和自柳枝稷、二穗短柄草、或粟分离的相同泛素基因的3’-UTR可操作连接。
在一个实施方案中，提供了载体，其包含第一转基因和/或多接头以及第二转基因和/或多接头，其中所述第一转基因和/或多接头与包含选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、和SEQIDNO:35的序列的启动子可操作连接、并且与包含选自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、或SEQIDNO:36的序列的3’-UTR可操作连接，并且所述第二转基因和/或多接头与包含选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、和SEQIDNO:35的序列的启动子可操作连接，并且与包含选自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、或SEQIDNO:36的序列的3’-UTR可操作连接；进一步地，其中第一转基因和/或多接头与第二转基因和/或多接头的启动子来源于来自不同植物物种的Ubi基因。在另一个实施方案中，所述载体提供有第三转基因和/或多接头，其中所述第三转基因和/或多接头与包含选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、和SEQIDNO:35的序列的启动子可操作连接、并且与包含选自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、或SEQIDNO:36的序列的3’-UTR可操作连接，进一步地，其中第三转基因的启动子和/或多接头来源于来自与第一和第二转基因和/或多接头的启动子不同的植物物种的Ubi基因。
转基因表达还可被位于启动子序列下游的内含子区所调节。启动子和内含子两者都能调节转基因表达。启动子对于驱动转录是必要的，而内含子的存在能增加表达水平，从而产生用于翻译和蛋白质合成的mRNA转录物。内含子基因区有助于转基因的稳定表达。
在一个实施方案中，提供了包含如本文中所述的泛素启动子和内含子的核酸构建体。在一个实施方案中，内含子与启动子的3'端可操作连接。在一个实施方案中，提供了包含泛素内含子的核酸构建体，所述泛素内含子与分离自柳枝稷、二穗短柄草或粟的泛素启动子的3’端，或这种启动子序列的衍生物的3'端可操作连接。在一个实施方案中，所述泛素内含子是柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素内含子，或这种内含子序列的衍生物。
在一个实施方案中，内含子可以是二穗短柄草泛素1C内含子。
GTATGCAGCCTCGCTTCCTCCTCGCTACCGTTTCAATTCTGGAGTAGGTCGTAGAGGATACCATGTTGATTTGACAGAGGGAGTAGATTAGATACTTGTAGATCGAAGTGCGGATGTTCCATGGTAGATGATACCATGTTGATTTCGATTAGATCGGATTAAATCTTTGTAGATCGAAGTGCGCATGTTCCATGAATTGCCTGTTACCAGTAGATTCAAGTTTTTCTGTGTTATAGAGGTGGGATCTACTCGTTGAGATGATTAGCTCCTAGAGGACACCATGCCGTTTTGGAAAATAGATCAGAACCGTGTAGATCGATGTGAGCATGTGTTCCTGTAGATCCAAGTTCTTTCGCATGTTACTAGTTGTGATCTATTGTTTGTGTAATACGCTCTCGATCTATCCGTGTAGATTTCACTCGATTACTGTTACTGTGGCTTGATCGTTCATAGTTGTTCGTTAGGTTTGATCGAACAGTGTCTGAACCTAATTGGATATGTATTCTTGATCTATCAACGTGTAGGTTTCAGTCATGTATTTATGTACTCCCTCCGTCCCAAATTAACTGACGTGGATTTTGTATAAGAATCTATACAAATCCATGTCAGTTAATTCGGGATGGAGTACCATATTCAATAATTTGTTTATTGCTGTCCACTTATGTACCATATGTTTGTTGTTCCTCATGTGGATTCTACTAATTATCATTGATTGGTGATCTTCTATTTTGCTAGTTTCCTAGCTCAATCTGGTTATTCATGTAGATGTGTTGTTGAAATCGGAGACCATGCTTGTTATTAGATAGTTTATTGCTTATCAGTTTCATGTTCTGGTTGATGCAACACATATTCATGTTCGCTATCTGGTTGCTGCTTGATATTCTCTGATTTACATTCATTATAAGAATATATTCTGCTCTGGTTGTTGCTTCTCATGACTTTACCTACTCGGTAGGTGACTTACCTTTTGGTTTACAATTGTCAACTATGCAG(SEQIDNO:7)
在一个实施方案中，内含子可以是二穗短柄草泛素1(Ubi1)内含子。
GTATGTAGCCTCTCGATTCCTCCTCAGCCCTGCCCTCGATTTGGTGTACGCGTTGAGATGATGATCTCGTAGATGTCTAGATGACACCATGTCGATTTGAAATAGATCAGATCCGTGTAGATCGATGAGCTCCTGTGTACCTGTGGATTCAAGTTATTTTCGCATGCTATTGTTGTGATCTACTAGATCTAGTGTGTGTATTCTATGCTATCGATTTCTCCGTGTAGATTTCACTCGATTACTGTTACTGTGGCTTGATCGGCCATAGATGTTGGTTAAGGTTTGATCGGTTAGTGTTTGAACCTGCGTGGATATCTAGCATCCATCTATTATCGTGTAGGTTTCGAACAAACAAGCACTATTATTGTACTGATGGTTCGTCTATGGTTGGTTTTGACCGTTTTAGTGTTGAACGAGCCTTCTGTATTTGTTTATTGCTGTCCAGTGATGTACCATGTTCGTTGAGTGTCGGATTATACTAATTATTGTTGATTGATAATCTTGTAGTTTGCTTTTCCTAATTTATTTATCGTAGTCCTGATTTGCCTCAGCTGTGCCTCACCCGTGCGATGGTCAATCAACTTGTTAGCCCAATCTGCTTAATCATGTACATTTGTTGTTAGAATCAGAGATCAAGCCAATTAGCTATCTTATTGCTTATCTGTTCCATGTTCTGATCGATGTAACAGTCTACACTTTTGCTCTGTGCTACTTGATTAAAACATTCTGACTTAAATTCATGATTGGAAGTTTCAGATCTGATTGTTGCCTTACTTGACTAATATCTATTCATGTGACACCTCTCTGTCTTGGTAACTTACCGCTGTTTGTTTGTAATTTCTGACTATGCAG(SEQIDNO:8)
在一个实施方案中，内含子可以是粟泛素2(Ubi2)内含子1。
GTCACGGGTTCCTTCCCCACCTCTCCTCTTCCCCACCGCCATAAATAG(SEQIDNO:9)
在一个实施方案中，内含子可以是粟泛素2(Ubi2)内含子2。
GTACGGCGATCGTCTTCCTCCTCTAGATCGGCGTGATCTGCAAGTAGTTGATTTGGTAGATGGTTAGGATCTGTGCACTGAAGAAATCATGTTAGATCCGCGATGTTTCTGTTCGTAGATGGCTGGGAGGTGGAATTTTTGTGTAGATCTGATATGTTCTCCTGTTTATCTTGTCACGCTCCTGCGATTTGTGGGGATTTTAGGTCGTTGATCTGGGAATCGTGGGGTTGCTTCTAGGCTGTTCGTAGATGAGGTCGTTCTCACGGTTTACTGGATCATTGCCTAGTAGATCAGCTCGGGCTTTCGTCTTTGTATATGGTGCCCATACTTGCATCTATGATCTGGTTCCGTGGTGTTACCTAGGTTTCTGCGCCTGATTCGTCCGATCGATTTTGTTAGCATGTGGTAAACGTTTGGTCATGGTCTGATTTAGATTAGAGTCGAATAGGATGATCTCGATCTAGCTCTTGGGATTAATATGCATGTGTCACCAATCTGTTCCGTGGTTAAGATGATGAATCTATGCTTAGTTAATGGGTGTAGATATATATGCTGCTGTTCCTCAATGATGCCGTAGCTTTTACCTGAGCAGCATGGATCCTCCTGTTACTTAGGTAGATGCACATGCTTATAGATCAAGATATGTACTGCTACTGTTGGAATTCTTTAGTATACCTGATGATCATCCATGCTCTTGTTACTTGTTTTGGTATACTTGGATGATGGCATGCTGCTGCTTTTTGTTGATTTGAGCCCATCCATATCTGCATATGTCACATGATTAAGATGATTACGCTGTTTCTGTATGATGCCATAGCTTTTATGTGAGCAACATGCATCCTCCTGGTTATATGCATTAATAGATGGAAGATATCTATTGCTACAATTTGATGATTATTTTGTACATACGATGATCAAGCATGCTCTTCATACTTTGTTGATATACTTGGATAATGAAATGCTGCTGCACGTTCATTCTATAGCACTAATGATGTGATGAACACGCACGACCTGTTTGTGGCATCTGTTTGAATGTGTTGTTGCTGTTCACTAGAGACTGTTTTATTAACCTACTGCTAGATACTTACCCTTCTGTCTGTTTATTCTTTTGCAG(SEQIDNO:10)
在一个实施方案中，内含子可以是柳枝稷(Switchgrass)泛素内含子。
GTACTCCTACCTAATCCTCCTTAACTGATCTCTCCTCTATCACGTTGGTAATCTTCGAATGATCTGCTGCCTGGCTCGCTGTTCCCCCTCGTTATGCACTGTTTCCATCACGAGTTTTTTTTTTCATCATCTAATCTATGCGGTTGCGGAAGAATTGTGGCTAGTGGAGTAGTTTTCTGTGCTTGATCGGTAGATTCGATGTGTGGGTGTATGGATGTTTTCTGAAAAGTTGCTGGATTAGTTTACGCTTTCAGGCCGCAGGTCTGTTCGAAATTGATTATGAAGTCTATATGCTTTGGATCTATCGATTTCCAGTTTTATTCAGATGTAGGCCAAAAAATTGTCGGCATTTGTGTGGAATTAGTTGGCCTTTAGGTCTGCACATTCATGGTGACGGCACAGTTGCTGCTGGCTGTTGCGTGGGACGAGTTATTATAGTTGTTTTTGTTTTTCCCTGATTGATTCACATTTTCAATGATAACTAGCCTTTGTCACCTAACCAAGTCCAGGTTGATCCTATCTGTGTTCTTCAGCTACCAGTTTGCATAGATGATGGTGTATTCGATTGCTTTAGTAGGCCTTCTGATTTCACATCTAATTCTGTCATGAATATAGATAACTTTACATGCTTTTGATATACTTTATATTTGAACTGTTCACTGTCCAGCCTATTTTGGATAATTGAGTGCATTGGCTTTTGATGCCTGAATTATTCACATGTTCCTGGATAATTGACCTGTGTCACCTAGTTGACTGTTTTTTGAGGTGCCACCCGTCTGTTCAGCTGATTTGTGTATTCGATTGCTCTAGTTAATCTTTTGATTATGCAGCTAGTGCTTTGTCATATGTAGCTTTATAGGCTTCTGATGTCCTTGGATATAGTTCAGTCTACTTGTCAAGTTGCTTTACAAGTAGTAGCTCTGATTCTATTTGGCTTCCTGAGTCAGAGCTTTGCAAATTGCTTGTTGTTACATTACATCATATTACTTGAATTGCAGTTATTTAATGGTTGGATTGTTGCTGTTTACTTCTACATTTTTTGCTGTTTTATATTATACTAAAATGTTTGTGTTGCTGCTTTTCAG(SEQIDNO:37)
在一个实施方案中，提供了包含如本文中所述的泛素启动子和内含子的核酸构建体，其中所述内含子与SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、或SEQIDNO:37至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％相同。在一个实施方案中，提供了包含如本文中所述的泛素启动子、内含子序列和多接头的核酸构建体，其中所述启动子和内含子与多接头可操作连接。在一个实施方案中，提供了包含如本文中所述的泛素启动子、内含子序列和非泛素转基因的基因表达盒，其中所述启动子和内含子与所述转基因的5'端可操作连接。任选地，所述构建体包含与非泛素转基因或多接头的3'端可操作连接的3’-UTR。在一个实施方案中，所述启动子和3’-UTR序列选自本文中所述的那些，并且所述内含子序列由SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、或SEQIDNO:37组成。在一个实施方案中，基因表达盒包含与启动子可操作连接的泛素内含子，其中所述启动子为柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素启动子，或为源自植物(例如，玉米泛素1启动子)、病毒(例如，木薯叶脉花叶病毒启动子)或细菌(例如，根癌土壤杆菌δmas)的启动子。在说明性实施方案中，基因表达盒包含与转基因可操作连接的泛素内含子，其中所述转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因、或它们的组合。
转基因表达还可受到位于启动子序列下游的5’-UTR区的调节。启动子和5’-UTR两者都能调节转基因表达。启动子对于驱动转录是必要的，而5’-UTR的存在能增加表达水平，结果产生用于翻译和蛋白质合成的mRNA转录物。5’-UTR基因区有助于转基因的稳定表达。
在一个实施方案中，提供了包含如本文中所述的泛素启动子和5’-UTR的核酸构建体。在一个实施方案中，5’-UTR与启动子的3'端可操作连接。在一个实施方案中，提供了包含泛素5’-UTR的核酸构建体，所述泛素5’-UTR与分离自柳枝稷、二穗短柄草或粟的泛素启动子的3'端、或这种启动子序列的衍生物的3'端可操作连接。在另一个实施方案中，5’-UTR的3'端与来自柳枝稷、二穗短柄草或粟的泛素内含子的5'端可操作连接，如本文所述。
在一个实施方案中，5’-UTR可以是二穗短柄草泛素1C(Ubi1C)5’-UTR。
CCGATCGAAAAGTCCCCGCAAGAGCAAGCGACCGATCTCGTGAATCTCCGTCAAG(SEQIDNO:11)
在一个实施方案中，5’-UTR可以是二穗短柄草泛素1(Ubi1)5’-UTR。
CCAATCCAGCACCCCCGATCCCGATCGAAAATTCTCCGCAACAGCAAGCGATCGATCTAGCGAATCCCCGTCAAG(SEQIDNO:12)
在一个实施方案中，5’-UTR可以是粟泛素2(Ubi2)5’-UTR1。
AGAAATATCAACTGGTGGGCCACGCACATCAGCGTCGTGTAACGTGGACGGAGGAGCCCCGTGACGGCGTCGACATCGAACGGCCACCAACCACGGAACCACCCGTCCCCACCTCTCGGAAGCTCCGCTCCACGGCGTCGACATCTAACGGCTACCAGCAGGCGTACGGGTTGGAGTGGACTCCTTGCCTCTTTGCGCTGGCGGCTTCCGGAAATTGCGTGGCGGAGACGAGGCGGGCTCGTCTCACACGGCACGGAAGAC(SEQIDNO:13)
在一个实施方案中，5’-UTR可以是粟泛素2(Ubi2)5’-UTR2。
CCGACCCCCTCGCCTTTCTCCCCAATCTCATCTCGTCTCGTGTTGTTCGGAGCACACCACCCGCCCCAAATCGTTCTTCCCGCAAGCCTCGGCGATCCTTCACCCGCTTCAAG(SEQIDNO:14)
在一个实施方案中，5’-UTR可以是柳枝稷(Switchgrass)泛素5’-UTR。
CAAGTTCGCGATCTCTCGATTTCACAAATCGCCGAGAAGACCCGAGCAGAGAAGTTCCCTCCGATCGCCTTGCCAAG(SEQIDNO:38)。
在一个实施方案中，提供了包含如本文中公开的泛素启动子和5’-UTR的核酸构建体，其中所述5’-UTR与SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、或SEQIDNO:38至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％相同。在一个实施方案中，提供了包含泛素启动子和与多接头可操作连接的5’-UTR的核酸构建体，其中所述启动子与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、或SEQIDNO:35至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％相同。在一个实施方案中，提供了包含泛素启动子和与非泛素转基因可操作连接的5’-UTR序列的基因表达盒，其中所述启动子与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、或SEQIDNO:35至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％相同。任选地，所述构建体可进一步包含如本文中公开的泛素内含子，其与5’-UTR的3'端及非泛素转基因的5'端可操作连接；而且所述构建体任选地还可包含与非泛素转基因的3'端可操作连接的3’-UTR。在一个实施方案中，所述启动子、内含子和3’-UTR序列选自本文中所述的那些，且所述5’-UTR序列由SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、或SEQIDNO:38组成。在一个实施方案中，3'-UTR由SEQIDNO:11组成。
在一个实施方案中，基因表达盒包含与启动子可操作连接的泛素5’-UTR，其中所述启动子为柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素启动子，或为源自植物(例如，玉米泛素1启动子)、病毒(例如，木薯叶脉花叶病毒启动子)或细菌(例如，根癌土壤杆菌δmas)的启动子。在说明性实施方案中，基因表达盒包含与转基因可操作连接的泛素5’-UTR，其中所述转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因、或它们的组合。
在一个实施方案中，提供了核酸构建体，其包含启动子和多接头以及任选地下列元件中的一种或多种：
a)5'非翻译区；
b)内含子；和
c)3'非翻译区，
其中
所述启动子由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、或SEQIDNO:35或与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、或SEQIDNO:35具有98％序列同一性的序列组成；
所述5'非翻译区由SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、或SEQIDNO:38或与SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、或SEQIDNO:38具有98％序列同一性的序列组成；
所述内含子由SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、或SEQIDNO:37或与SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、或SEQIDNO:37具有98％序列同一性的序列组成；
所述3'非翻译区由SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、或SEQIDNO:36或与SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、或SEQIDNO:36具有98％序列同一性的序列组成；进一步地，其中所述启动子与所述多接头可操作连接，并且每个任选元件当存在时也与启动子及多接头二者可操作连接。
在一个实施方案中，提供了核酸构建体，其包含启动子和非泛素转基因以及任选地下列元件中的一种或多种：
a)5'非翻译区；
b)内含子；和
c)3'非翻译区，
其中
所述启动子由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、或SEQIDNO:35或与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、或SEQIDNO:35具有98％序列同一性的序列组成；
所述5'非翻译区由SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、或SEQIDNO:38或与SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、或SEQIDNO:38具有98％序列同一性的序列组成
所述内含子由SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、或SEQIDNO:37或与SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、或SEQIDNO:37具有98％序列同一性的序列组成
所述3'非翻译区由SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、或SEQIDNO:36或与SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、或SEQIDNO:36具有98％序列同一性的序列组成；进一步地，其中所述启动子与所述转基因可操作连接，并且每个任选元件当存在时也与启动子和转基因二者可操作连接。在另一个实施方案中，提供了包含上文刚才公开的核酸构建体的转基因细胞。在一个实施方案中，所述转基因细胞为植物细胞，并且在另一个实施方案中提供了植物，其中所述植物包含所述转基因细胞。
根据一个实施方案，转基因表达被与内含子和5’-UTR区可操作连接的启动子所调节，其中所述内含子和5’-UTR区位于所述启动子序列的下游。与内含子和5’-UTR区可操作连接的启动子可用来驱动转基因表达。启动子对于驱动转录是必要的，而内含子和5’-UTR的存在能增加表达水平，从而产生用于翻译和蛋白质合成的mRNA转录物。
在一个实施方案中，基因表达盒包含与5’-UTR和内含子区可操作连接的启动子。在一个实施方案中，基因表达盒包含与泛素5’-UTR和泛素内含子可操作连接的泛素启动子。在一个实施方案中，与5’-UTR和内含子区可操作连接的泛素启动子是与内含子和5’-UTR可操作连接的柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素启动子。
在一个实施方案中，与5’-UTR和内含子可操作连接的启动子可以是与内含子和5’-UTR可操作连接的二穗短柄草泛素1C(Ubi1C)启动子。在一个实施方案中，所述启动子包含或为SEQIDNO:15的序列：
CTGCTCGTTCAGCCCACAGTAACACGCCGTGCGACATGCAGATGCCCTCCACCACGCCGACCAACCCCAAGTCCGCCGCGCTCGTCCACGGCGCCATCCGCATCCGCGCGTCAACGTCATCCGGAGGAGGCGAGCGCGATGTCGACGGCCACGGCGGCGGCGGACACGACGGCGACGCCCCGACTCCGCGCGCGCGTCAAGGCTGCAGTGGCGTCGTGGTGGCCGTCCGCCTGCACGAGATCCCCGCGTGGACGAGCGCCGCCTCCACCCAGCCCCTATATCGAGAAATCAACGGTGGGCTCGAGCTCCTCAGCAACCTCCCCACCCCCCCTTCCGACCACGCTCCCTTCCCCCGTGCCCCTCTTCTCCGTAAACCCGAGCCGCCGAGAACAACACCAACGAAAGGGCGAAGAGAATCGCCATAGAGAGGAGATGGGCGGAGGCGGATAGTTTCAGCCATTCACGGAGAAATGGGGAGGAGAGAACACGACATCATACGGACGCGACCCTCTAGCTGGCTGGCTGTCCTAAAGAATCGAACGGAATCGCTGCGCCAGGAGAAAACGAACGGTCCTGAAGCATGTGCGCCCGGTTCTTCCAAAACACTTATCTTTAAGATTGAAGTAGTATATATGACTGAAATTTTTACAAGGTTTTTCCCCATAAAACAGGTGAGCTTATCTCATCCTTTTGTTTAGGATGTACGTATTATATATGACTGAATATTTTTTATTTTCATTGAATGAAGATTTTCGACCCCCCAAAAATAAAAAACGGAGGGAGTACCTTTGTGCCGTGTATATGGACTAGAGCCATCGGGACGTTTCCGGAGACTGCGTGGTGGGGGCGATGGACGCACAACGACCGCATTTTCGGTTGCCGACTCGCCGTTCGCATCTGGTAGGCACGACTCGTCGGGTTCGGCTCTTGCGTGAGCCGTGACGTAACAGACCCGTTCTCTTCCCCCGTCTGGCCATCCATAAATCCCCCCTCCATCGGCTTCCCTTTCCTCAATCCAGCACCCTGATTCCGATCGAAAAGTCCCCGCAAGAGCAAGCGACCGATCTCGTGAATCTCCGTCAAGGTATGCAGCCTCGCTTCCTCCTCGCTACCGTTTCAATTCTGGAGTAGGTCGTAGAGGATACCATGTTGATTTGACAGAGGGAGTAGATTAGATACTTGTAGATCGAAGTGCGGATGTTCCATGGTAGATGATACCATGTTGATTTCGATTAGATCGGATTAAATCTTTGTAGATCGAAGTGCGCATGTTCCATGAATTGCCTGTTACCAGTAGATTCAAGTTTTTCTGTGTTATAGAGGTGGGATCTACTCGTTGAGATGATTAGCTCCTAGAGGACACCATGCCGTTTTGGAAAATAGATCAGAACCGTGTAGATCGATGTGAGCATGTGTTCCTGTAGATCCAAGTTCTTTCGCATGTTACTAGTTGTGATCTATTGTTTGTGTAATACGCTCTCGATCTATCCGTGTAGATTTCACTCGATTACTGTTACTGTGGCTTGATCGTTCATAGTTGTTCGTTAGGTTTGATCGAACAGTGTCTGAACCTAATTGGATATGTATTCTTGATCTATCAACGTGTAGGTTTCAGTCATGTATTTATGTACTCCCTCCGTCCCAAATTAACTGACGTGGATTTTGTATAAGAATCTATACAAATCCATGTCAGTTAATTCGGGATGGAGTACCATATTCAATAATTTGTTTATTGCTGTCCACTTATGTACCATATGTTTGTTGTTCCTCATGTGGATTCTACTAATTATCATTGATTGGTGATCTTCTATTTTGCTAGTTTCCTAGCTCAATCTGGTTATTCATGTAGATGTGTTGTTGAAATCGGAGACCATGCTTGTTATTAGATAGTTTATTGCTTATCAGTTTCATGTTCTGGTTGATGCAACACATATTCATGTTCGCTATCTGGTTGCTGCTTGATATTCTCTGATTTACATTCATTATAAGAATATATTCTGCTCTGGTTGTTGCTTCTCATGACTTTACCTACTCGGTAGGTGACTTACCTTTTGGTTTACAATTGTCAACTATGCAG(SEQIDNO:15)
在一个实施方案中，与5’-UTR和内含子可操作连接的启动子可以是与5’-UTR和内含子可操作连接的二穗短柄草泛素1(Ubi1)启动子。在一个实施方案中，所述启动子包含或为SEQIDNO:16的序列:
GGCGTCAGGACTGGCGAAGTCTGGACTCTGCAGGGCCGAACTGCTGAAGACGAAGCAGAGGAAGAGAAAGGGAAGTGTTCGACTTGTAATTTGTAGGGGTTTTTTTTAGAGGAACTTGTAATTTGTAGGTGGGCTGGCCTCGTTGGAAAAACGATGCTGGCTGGTTGGGCTGGGCCGATGTACGCTTGCAAACAACTTGTGGCGGCCCGTTCTGGACGAGCAGGAGTTTCTTTTTTGTTCTCACTTTTCTGGTCTTCTTTAGTTACGGAGTACCTTTTGTTTTTTAAAGGAGTTACCTTTTTTTTAGGAATTCTTTAGTTACCTTTCGCTTGCTCTCAAAAAATATTTAACTTTCGCTTTTTTTCATTTTAATTTTTGCAACTATTTACGAGTTTCATGAATGCTTATTTTCCAGCATATCATTATTTGCAAGTATTTTTATGCCGTATGTATTGGACGAGAGCCATCGGGACTGTTCCAGAGACTGCGTGGTGGGGACGGCTCCCAACCGCCTTTTCTATCTCTGTTCGCATCCGGTGGCCGACTTGGCTCGCGCGTGAGCCGTGACGTAACAGACTTGGTCTCTTCCCCATCTGGCCATCTATAAATTCCCCCATCGATCGACCCTCCCTTTCCCCAATCCAGCACCCCCGATCCCGATCGAAAATTCTCCGCAACAGCAAGCGATCGATCTAGCGAATCCCCGTCAAGGTATGTAGCCTCTCGATTCCTCCTCAGCCCTGCCCTCGATTTGGTGTACGCGTTGAGATGATGATCTCGTAGATGTCTAGATGACACCATGTCGATTTGAAATAGATCAGATCCGTGTAGATCGATGAGCTCCTGTGTACCTGTGGATTCAAGTTATTTTCGCATGCTATTGTTGTGATCTACTAGATCTAGTGTGTGTATTCTATGCTATCGATTTCTCCGTGTAGATTTCACTCGATTACTGTTACTGTGGCTTGATCGGCCATAGATGTTGGTTAAGGTTTGATCGGTTAGTGTTTGAACCTGCGTGGATATCTAGCATCCATCTATTATCGTGTAGGTTTCGAACAAACAAGCACTATTATTGTACTGATGGTTCGTCTATGGTTGGTTTTGACCGTTTTAGTGTTGAACGAGCCTTCTGTATTTGTTTATTGCTGTCCAGTGATGTACCATGTTCGTTGAGTGTCGGATTATACTAATTATTGTTGATTGATAATCTTGTAGTTTGCTTTTCCTAATTTATTTATCGTAGTCCTGATTTGCCTCAGCTGTGCCTCACCCGTGCGATGGTCAATCAACTTGTTAGCCCAATCTGCTTAATCATGTACATTTGTTGTTAGAATCAGAGATCAAGCCAATTAGCTATCTTATTGCTTATCTGTTCCATGTTCTGATCGATGTAACAGTCTACACTTTTGCTCTGTGCTACTTGATTAAAACATTCTGACTTAAATTCATGATTGGAAGTTTCAGATCTGATTGTTGCCTTACTTGACTAATATCTATTCATGTGACACCTCTCTGTCTTGGTAACTTACCGCTGTTTGTTTGTAATTTCTGACTATGCAG(SEQIDNO:16)
在一个实施方案中，与5’-UTR和内含子可操作连接的启动子可以是与5’-UTR和内含子可操作连接的粟泛素2(Ubi2)启动子。在一个实施方案中，所述启动子包含或为SEQIDNO:17的序列:
TGCGTCTGGACGCACAAGTCATAGCATTATCGGCTAAAATTTCTTAATTTCTAAATTAGTCATATCGGCTAAGAAAGTGGGGAGCACTATCATTTCGTAGAACAAGAACAAGGTATCATATATATATATATATATAATATTTAAACTTTGTTAAGTGGAATCAAAGTGCTAGTATTAATGGAGTTTCATGTGCATTAAATTTTATGTCACATCAGCAATTTTGTTGACTTGGCAAGGTCATTTAGGGTGTGTTTGGAAGACAGGGGCTATTAGGAGTATTAAACATAGTCTAATTACAAAACTAATTGCACAACCGCTAAGCTGAATCGCGAGATGGATCTATTAAGCTTAATTAGTCCATGATTTGACAATGTGGTGCTACAATAACCATTTGCTAATGATGGATTACTTAGGTTTAATAGATTCGTCTCGTGATTTAGCCTATGGGTTCTGCTATTAATTTTGTAATTAGCTCATATTTAGTTCTTATAATTAGTATCCGAACATCCAATGTGACATGCTAAAGTTTAACCCTGGTATCCAAATGAAGTCTTATGAGAGTTTCATCACTCCGGTGGTATATGTACTTAGGCTCCGTTTTCTTCCACCGACTTATTTTTAGCACCCGTCACATTGAATGTTTAGATACTAATTAGAAGTATTAAACGTAGACTATTTACAAAATCCATTACATAAGACGAATCTAAACGGCGAGACGAATCTATTAAACCTAATTAGTCCATGATTTGACAATGTGTTGCTACAGTAAACATTTGCTAATGATGGATTAATTAGGCTTAATAGATTCGTCTCGCCGTTTAGCCTCCACTTATGTAATGGGTTTTCTAAACAATCTACGTTTAATACTCCTAATTAGTATCTAAATATTCAATGTGACACGTGCTAAAAATAAGTCAGTGGAAGGAAGAGAACGTCCCCTTAGTTTTCCATCTTATTAATTGTACGATGAAACTGTGCAGCCAGATGATTGACAATCGCAATACTTCAACTAGTGGGCCATGCACATCAGCGACGTGTAACGTCGTGAGTTGCTGTTCCCGTAGAGAAATATCAACTGGTGGGCCACGCACATCAGCGTCGTGTAACGTGGACGGAGGAGCCCCGTGACGGCGTCGACATCGAACGGCCACCAACCACGGAACCACCCGTCCCCACCTCTCGGAAGCTCCGCTCCACGGCGTCGACATCTAACGGCTACCAGCAGGCGTACGGGTTGGAGTGGACTCCTTGCCTCTTTGCGCTGGCGGCTTCCGGAAATTGCGTGGCGGAGACGAGGCGGGCTCGTCTCACACGGCACGGAAGACGTCACGGGTTCCTTCCCCACCTCTCCTCTTCCCCACCGCCATAAATAGCCGACCCCCTCGCCTTTCTCCCCAATCTCATCTCGTCTCGTGTTGTTCGGAGCACACCACCCGCCCCAAATCGTTCTTCCCGCAAGCCTCGGCGATCCTTCACCCGCTTCAAGGTACGGCGATCGTCTTCCTCCTCTAGATCGGCGTGATCTGCAAGTAGTTGATTTGGTAGATGGTTAGGATCTGTGCACTGAAGAAATCATGTTAGATCCGCGATGTTTCTGTTCGTAGATGGCTGGGAGGTGGAATTTTTGTGTAGATCTGATATGTTCTCCTGTTTATCTTGTCACGCTCCTGCGATTTGTGGGGATTTTAGGTCGTTGATCTGGGAATCGTGGGGTTGCTTCTAGGCTGTTCGTAGATGAGGTCGTTCTCACGGTTTACTGGATCATTGCCTAGTAGATCAGCTCGGGCTTTCGTCTTTGTATATGGTGCCCATACTTGCATCTATGATCTGGTTCCGTGGTGTTACCTAGGTTTCTGCGCCTGATTCGTCCGATCGATTTTGTTAGCATGTGGTAAACGTTTGGTCATGGTCTGATTTAGATTAGAGTCGAATAGGATGATCTCGATCTAGCTCTTGGGATTAATATGCATGTGTCACCAATCTGTTCCGTGGTTAAGATGATGAATCTATGCTTAGTTAATGGGTGTAGATATATATGCTGCTGTTCCTCAATGATGCCGTAGCTTTTACCTGAGCAGCATGGATCCTCCTGTTACTTAGGTAGATGCACATGCTTATAGATCAAGATATGTACTGCTACTGTTGGAATTCTTTAGTATACCTGATGATCATCCATGCTCTTGTTACTTGTTTTGGTATACTTGGATGATGGCATGCTGCTGCTTTTTGTTGATTTGAGCCCATCCATATCTGCATATGTCACATGATTAAGATGATTACGCTGTTTCTGTATGATGCCATAGCTTTTATGTGAGCAACATGCATCCTCCTGGTTATATGCATTAATAGATGGAAGATATCTATTGCTACAATTTGATGATTATTTTGTACATACGATGATCAAGCATGCTCTTCATACTTTGTTGATATACTTGGATAATGAAATGCTGCTGCACGTTCATTCTATAGCACTAATGATGTGATGAACACGCACGACCTGTTTGTGGCATCTGTTTGAATGTGTTGTTGCTGTTCACTAGAGACTGTTTTATTAACCTACTGCTAGATACTTACCCTTCTGTCTGTTTATTCTTTTGCAG(SEQIDNO:17)
在一个实施方案中，与5’-UTR和内含子可操作连接的启动子可以是与5’-UTR和内含子可操作连接的柳枝稷(Switchgrass)泛素启动子。在一个实施方案中，所述启动子包含或为SEQIDNO:39的序列
TTGAATTTTAATTTCAAATTTTGCAGGGTAGTAGTGGACATCACAATACATATTTAGAAAAAGTTTTATAATTTTCCTCCGTTAGTTTTCATATAATTTTGAACTCCAACGATTAATCTATTATTAAATATCCCGATCTATCAAAATAATGATAAAAATTTATGATTAATTTTTCTAACATGTGTTATGGTGTGTACTATCGTCTTATAAAATTTCAACTTAAAACTCCACCTATACATGGAGAAATGAAAAAGACGAATTACAGTAGGGAGTAATTTGAACCAAATGGAATAGTTTGAGGGTAAAATGAACTAAACAATAGTTTAGGAGGTTATTCAGATTTTAGTTATAGTTGAGAGGAGTAATTTAGACTTTTTCCTATCTTGAATTGTTGACGGCTCTCCTATCGGATATCGGATGGAGTCTTTCAGCCCAACATAACTTCATTCGGGCCCAAACGTTCGTCCATCCAGCCTAGGGAGAACATTTTGCCCATGATATCTGTTTTTCTTTTTTTCTATTTTCACTGGTATTATAGGAGGGAAATATACAACGTGTTCACCTTTGGTTTCATTCTTGTTCCATCTGAATTTATCTAAAACTGTGTTTGAACTTCGTAAGAATTTTGTTCGATCTGTCCGGTACATCGTGTTGATAGGTGGCCTCCGAGATTCTTCTTTTTAACCGGCAAAGTAAAATAATCTCAGCTCCAGCCTAACGTCAATTATCAGAGAGAGAAAAAAATATTTTTTTATGATTGATCGGAAACCAACCGCCTTACGTGTCGATCCTGGTTCCTGGCCGGCACGGCGGAGGAAAGCGACCGACCTCGCAACGCCGGCGCACGGCGCCGCCGTGTTGGACTTGGTCTCCCGCGACTCCGTGGGCCTCGGCTTATCGCCGCCGCTCCATCTCAACCGTCCGCTTGGACACGTGGAAGTTGATCCGTCGCGCACCAGCCTCGGAGGTAACCTAACTGCCCGTACTATAAATCCGGGATCCGGCCTCTCCAATCCCCATCGCCACAAGTTCGCGATCTCTCGATTTCACAAATCGCCGAGAAGACCCGAGCAGAGAAGTTCCCTCCGATCGCCTTGCCAAGGTACTCCTACCTAATCCTCCTTAACTGATCTCTCCTCTATCACGTTGGTAATCTTCGAATGATCTGCTGCCTGGCTCGCTGTTCCCCCTCGTTATGCACTGTTTCCATCACGAGTTTTTTTTTTCATCATCTAATCTATGCGGTTGCGGAAGAATTGTGGCTAGTGGAGTAGTTTTCTGTGCTTGATCGGTAGATTCGATGTGTGGGTGTATGGATGTTTTCTGAAAAGTTGCTGGATTAGTTTACGCTTTCAGGCCGCAGGTCTGTTCGAAATTGATTATGAAGTCTATATGCTTTGGATCTATCGATTTCCAGTTTTATTCAGATGTAGGCCAAAAAATTGTCGGCATTTGTGTGGAATTAGTTGGCCTTTAGGTCTGCACATTCATGGTGACGGCACAGTTGCTGCTGGCTGTTGCGTGGGACGAGTTATTATAGTTGTTTTTGTTTTTCCCTGATTGATTCACATTTTCAATGATAACTAGCCTTTGTCACCTAACCAAGTCCAGGTTGATCCTATCTGTGTTCTTCAGCTACCAGTTTGCATAGATGATGGTGTATTCGATTGCTTTAGTAGGCCTTCTGATTTCACATCTAATTCTGTCATGAATATAGATAACTTTACATGCTTTTGATATACTTTATATTTGAACTGTTCACTGTCCAGCCTATTTTGGATAATTGAGTGCATTGGCTTTTGATGCCTGAATTATTCACATGTTCCTGGATAATTGACCTGTGTCACCTAGTTGACTGTTTTTTGAGGTGCCACCCGTCTGTTCAGCTGATTTGTGTATTCGATTGCTCTAGTTAATCTTTTGATTATGCAGCTAGTGCTTTGTCATATGTAGCTTTATAGGCTTCTGATGTCCTTGGATATAGTTCAGTCTACTTGTCAAGTTGCTTTACAAGTAGTAGCTCTGATTCTATTTGGCTTCCTGAGTCAGAGCTTTGCAAATTGCTTGTTGTTACATTACATCATATTACTTGAATTGCAGTTATTTAATGGTTGGATTGTTGCTGTTTACTTCTACATTTTTTGCTGTTTTATATTATACTAAAATGTTTGTGTTGCTGCTTTTCAG(SEQIDNO:39)
在一个实施方案中，提供了包含与内含子和5’-UTR可操作连接的启动子的核酸构建体。在一个实施方案中，所述构建体包含与SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、或SEQIDNO:39至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％相同的启动子。在一个实施方案中，提供了包含与多接头可操作连接的泛素启动子序列的核酸构建体，所述泛素启动子序列包含或为与SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、或SEQIDNO:39至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％相同的序列。任选地，所述构建体可进一步包含与多接头的3'端可操作连接的3’-UTR。在一个实施方案中，提供了包含与非泛素转基因可操作连接的泛素启动子序列的基因表达盒，其中所述启动子序列包含或为与SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、或SEQIDNO:39至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％相同的序列。任选地，所述构建体可进一步包含与非泛素转基因的3'端可操作连接的3’-UTR。在一个实施方案中，3’-UTR序列由SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、或SEQIDNO:36组成。在说明性实施方案中，其中所述转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因、或它们的组合。在一个实施方案中，所述转基因是除草剂抗性基因。在一个实施方案中，提供了包含1、2、3或4个启动子序列的载体，这些启动子序列独立地选自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、或SEQIDNO:36。
在一个实施方案中，基因表达盒包含泛素启动子、泛素5’-UTR、泛素内含子、和泛素3’-UTR。在一个实施方案中，泛素启动子、泛素5’-UTR、泛素内含子、和泛素3’-UTR可以各自独立地是：柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素启动子；柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素5’-UTR；柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素内含子；以及柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素3’-UTR。在一个实施方案中，基因表达盒包含：a)启动子，其中所述启动子与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、或SEQIDNO:36至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％相同；b)3’-UTR，其中所述3’-UTR与SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、或SEQIDNO:37至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％相同；c)5’-UTR，其中所述5’-UTR与SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、或SEQIDNO:38至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％相同；或d)内含子，其中所述内含子与SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、或SEQIDNO:39至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％相同。
例如，基因表达盒可包括启动子、内含子、和5’-UTR，其中所述启动子是多核苷酸SEQIDNO:1，所述内含子是多核苷酸SEQIDNO:7，所述5’-UTR是多核苷酸SEQIDNO:11。同样，基因表达盒可包括启动子、内含子、和5’-UTR，其中所述启动子是多核苷酸SEQIDNO:2，所述内含子是多核苷酸SEQIDNO:8，所述5’-UTR是多核苷酸SEQIDNO:12。此外，基因表达盒可包括启动子、内含子、和5’-UTR，其中所述启动子是多核苷酸SEQIDNO:3，所述内含子是多核苷酸SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10，所述5’-UTR是多核苷酸SEQIDNO:13。另外，基因表达盒可包括启动子、内含子、和5’-UTR，其中所述启动子是多核苷酸SEQIDNO:35，所述内含子是多核苷酸SEQIDNO:37，所述5’-UTR是多核苷酸SEQIDNO:38。
例如，基因表达盒可包括启动子、内含子、5’-UTR、和3’-UTR，其中所述启动子是多核苷酸SEQIDNO:1，所述内含子是多核苷酸SEQIDNO:7，所述5’-UTR是多核苷酸SEQIDNO:11，所述3’-UTR是多核苷酸SEQIDNO:4。同样，基因表达盒可包括启动子、内含子、5’-UTR、和3’-UTR，其中所述启动子是多核苷酸SEQIDNO:2，所述内含子是多核苷酸SEQIDNO:8，所述5’-UTR是多核苷酸SEQIDNO:12，所述3’-UTR是多核苷酸SEQIDNO:5。此外，基因表达盒可包括启动子、内含子、5’-UTR、和3’-UTR，其中所述启动子是多核苷酸SEQIDNO:3，所述内含子是多核苷酸SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10，所述5’-UTR是多核苷酸SEQIDNO:13或14，所述3’-UTR是多核苷酸SEQIDNO:6。另外，基因表达盒可包括启动子、内含子、5’-UTR、和3’-UTR，其中所述启动子是多核苷酸SEQIDNO:35，所述内含子是多核苷酸SEQIDNO:37，所述5’-UTR是多核苷酸SEQIDNO:38，所述3’-UTR是多核苷酸SEQIDNO:36。
另外，基因表达盒可包括启动子、和3’-UTR，其中所述启动子是多核苷酸SEQIDNO:1，且所述3’-UTR是SEQIDNO:6。在一个实施方案中，基因表达盒可包括启动子和3’-UTR，其中所述启动子是多核苷酸SEQIDNO:1而3’-UTR是SEQIDNO:5。在一个实施方案中，基因表达盒可包括启动子和3’-UTR，其中所述启动子是多核苷酸SEQIDNO:1，且3’-UTR是SEQIDNO:4。在一个实施方案中，基因表达盒可包括启动子和3’-UTR，其中所述启动子是多核苷酸SEQIDNO:35，且3’-UTR是SEQIDNO:36。
在一个实施方案中，基因表达盒包含与非泛素转基因可操作连接的泛素启动子、泛素5’-UTR、和泛素3’-UTR。在一个实施方案中，基因表达盒包含与非泛素转基因可操作连接的泛素启动子、泛素内含子、泛素5’-UTR、和泛素3’-UTR。
当基因表达盒包含一个或多个转基因时，启动子、内含子、5’-UTR和3’-UTR可与基因表达盒之内的不同转基因可操作连接。在说明性实施方案中，基因表达盒包含与转基因可操作连接的泛素启动子，其中所述转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因、或它们的组合。在说明性实施方案中，基因表达盒包含与转基因可操作连接的泛素启动子、内含子、和5’-UTR，其中所述转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因、或它们的组合。在说明性实施方案中，基因表达盒包含与转基因可操作连接的泛素3’-UTR，其中所述转基因编码可提高杀虫剂抗性、除草剂耐受性、氮利用效率、水分利用效率、营养品质或它们的组合的基因产物。
泛素内含子和5’-UTR可与基因表达盒内的不同启动子可操作连接。在说明性实施方案中，启动子来源于植物(例如，玉米泛素1启动子)、病毒(例如，木薯叶脉花叶病毒启动子)或细菌(例如，根癌土壤杆菌δmas)。在说明性实施方案中，基因表达盒包含与转基因可操作连接的泛素启动子，其中所述转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因、或它们的组合。
在一个实施方案中，载体包含如本文中公开的基因表达盒。在一个实施方案中，载体可以是质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体、病毒、或在直接转化或基因打靶中使用的切割的多核苷酸片段，如供体DNA。
根据一个实施方案，提供了包含重组基因盒的核酸载体，其中所述重组基因盒包含与多接头序列、非泛素转基因、或它们的组合可操作连接的基于泛素的启动子。在一个实施方案中，所述重组基因盒包含与非泛素转基因可操作连接的基于泛素的启动子。在一个实施方案中，所述重组基因盒包含与多接头序列可操作连接的如本文中公开的基于泛素的启动子。所述多接头以一定的方式与基于泛素的启动子可操作连接，使得编码序列插入到所述多接头的限制性位点之一中后会可操作地连接上，从而允许在载体转染到宿主细胞中时表达该编码序列。
根据一个实施方案，基于泛素的启动子包含SEQIDNO:1或与SEQIDNO:1具有90％、95％或99％序列同一性的序列。根据一个实施方案，所述启动子序列的总长度不超过1.5、2、2.5、3或4kb。根据一个实施方案，基于泛素的启动子由SEQIDNO:1或与SEQIDNO:1具有90％、95％或99％序列同一性的1029bp序列组成。
根据一个实施方案，提供了包含基因盒的核酸载体，所述基因盒的组成为SEQIDNO:15、非泛素转基因、和3'-UTR，其中SEQIDNO:15与非泛素转基因的5'端可操作连接，而3'-UTR与非泛素转基因的3'端可操作连接。在另一个实施方案中，3'非翻译序列包含SEQIDNO:4或与SEQIDNO:4具有90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。根据一个实施方案，提供了包含基因盒的核酸载体，所述基因盒的组成为SEQIDNO:15或与SEQIDNO:15具有90％、95％、或99％序列同一性的2077bp序列、非泛素转基因和3'-UTR，其中SEQIDNO:15与非泛素转基因的5'端可操作连接，而3'-UTR与非泛素转基因的3'端可操作连接。在另一个实施方案中，3'非翻译序列包含SEQIDNO:4或与SEQIDNO:4具有90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。在另一个实施方案中，3'非翻译序列由SEQIDNO:4、或与SEQIDNO:4具有90％、95％、或99％序列同一性的1026bp序列组成。
根据一个实施方案，所述核酸载体进一步包含编码选择标志物的序列。根据一个实施方案，所述重组基因盒与土壤杆菌T-DNA边界可操作连接。根据一个实施方案，所述重组基因盒进一步包含第一和第二T-DNA边界，其中第一T-DNA边界与基因构建体的一端可操作连接，且所述第二T-DNA边界与基因构建体的另一端可操作连接。所述第一和第二土壤杆菌T-DNA边界可独立地选自来源于细菌菌株的T-DNA边界序列，所述T-DNA边界序列选自合成胭脂碱的土壤杆菌T-DNA边界、合成章鱼碱(ocotopine)的土壤杆菌T-DNA边界、合成琥珀碱的土壤杆菌T-DNA边界、或它们的任何组合。在一个实施方案中，提供了土壤杆菌菌株，其选自胭脂碱合成菌株、甘露碱合成菌株、琥珀碱合成菌株、或章鱼碱合成菌株，其中所述菌株包含质粒，其中所述质粒包含与选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:15或与SEQIDNO:1或SEQIDNO:15具有90％、95％、或99％序列同一性的序列可操作连接的转基因。
感兴趣的且适合用于当前公开的构建体中的转基因包括但不限于，赋予下列各项的编码序列：(1)对害虫或疾病的抗性，(2)对除草剂的抗性，和(3)增值性状，如公开于WO2013116700(DGT-28)、US20110107455(DSM-2)、美国专利8,283,522(AAD-12)；7,838,733(AAD-1)；5,188,960；5,691,308；6,096,708；和6,573,240(Cry1F)；美国专利6,114,138；5,710,020；和6,251,656(Cry1Ac)；美国专利6,127,180；6,624,145和6,340,593(Cry34Ab1)；美国专利6,083,499；6,548,291和6,340,593(Cry35Ab1)中，其公开内容并入本文。根据一个实施方案，所述转基因编码选择标志物或赋予杀虫剂抗性、除草剂耐受性、氮利用效率、水分利用效率、或营养品质的基因产物。
根据一个实施方案，提供了包含基因盒的核酸载体，其中所述基因盒包含与转基因的5'端可操作连接的启动子区，其中转基因的3'端与3'非翻译区连接。在一个实施方案中，所述启动子区包含SEQIDNO:1或与SEQIDNO:1具有90％、95％、或99％序列同一性的序列。根据一个实施方案，所述启动子区由SEQIDNO:1或SEQIDNO:15组成。在一个实施方案，3'非翻译序列包含SEQIDNO:4或与SEQIDNO:4具有90％、95％、99％或100％序列同一性的序列，并且在一个实施方案中，3'非翻译序列由SEQIDNO:4、或与SEQIDNO:4具有90％、95％、或99％序列同一性的1026bp序列组成。
根据一个实施方案，提供了包含基因盒的核酸载体，其中所述基因盒包含与5'非翻译区的5'端可操作连接的启动子区，其中5'非翻译区的3'端与转基因的5'端可操作连接，其中转基因的3'端与3'非翻译区连接。在一个实施方案中，所述启动子区包含或为SEQIDNO:1或与SEQIDNO:1具有90％、95％或99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，所述启动子区由SEQIDNO:1或与SEQIDNO:1具有90％、95％或99％序列同一性的1029bp序列组成。根据一个实施方案，所述5'非翻译序列包含或为SEQIDNO:11或与SEQIDNO:11具有90％序列同一性的序列。根据一个实施方案，所述5'非翻译序列由SEQIDNO:11或与SEQIDNO:11具有90％序列同一性的55bp序列组成。在一个实施方案中，所述3'非翻译序列包含或为SEQIDNO:4或与SEQIDNO:4具有90％、95％或99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，所述3'非翻译序列由SEQIDNO:4或与SEQIDNO:4具有90％、95％或99％序列同一性的1026bp序列组成。在另一个实施方案中，所述核酸载体进一步包含插入在所述5'非翻译区与所述转基因之间、并且与所述启动子和所述转基因可操作连接的泛素内含子。在一个实施方案中，所述泛素内含子包含或为SEQIDNO:7或与SEQIDNO:7具有90％、95％或99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，所述泛素内含子由SEQIDNO:7或与SEQIDNO:7具有90％、95％或99％序列同一性的993bp序列组成。
根据一个实施方案，提供了包含基因盒的核酸载体，其中所述基因盒包含与转基因的5'端可操作连接的启动子区，其中转基因的3'端与3'非翻译区连接。在一个实施方案中，所述启动子区包含SEQIDNO:40或与SEQIDNO:40具有90％、95％或99％序列同一性的序列。
CTGCTCGTTCAGCCCACAGTAACACGCCGTGCGACATGCAGATGCCCTCCACCACGCCGACCAACCCCAAGTCCGCCGCGCTCGTCCACGGCGCCATCCGCATCCGCGCGTCAACGTCATCCGGAGGAGGCGAGCGCGATGTCGACGGCCACGGCGGCGGCGGACACGACGGCGACGCCCCGACTCCGCGCGCGCGTCAAGGCTGCAGTGGCGTCGTGGTGGCCGTCCGCCTGCACGAGATCCCCGCGTGGACGAGCGCCGCCTCCACCCAGCCCCTATATCGAGAAATCAACGGTGGGCTCGAGCTCCTCAGCAACCTCCCCACCCCCCCTTCCGACCACGCTCCCTTCCCCCGTGCCCCTCTTCTCCGTAAACCCGAGCCGCCGAGAACAACACCAACGAAAGGGCGAAGAGAATCGCCATAGAGAGGAGATGGGCGGAGGCGGATAGTTTCAGCCATTCACGGAGAAATGGGGAGGAGAGAACACGACATCATACGGACGCGACCCTCTAGCTGGCTGGCTGTCCTAAAGAATCGAACGGAATCGCTGCGCCAGGAGAAAACGAACGGTCCTGAAGCATGTGCGCCCGGTTCTTCCAAAACACTTATCTTTAAGATTGAAGTAGTATATATGACTGAAATTTTTACAAGGTTTTTCCCCATAAAACAGGTGAGCTTATCTCATCCTTTTGTTTAGGATGTACGTATTATATATGACTGAATATTTTTTATTTTCATTGAATGAAGATTTTCGACCCCCCAAAAATAAAAAACGGAGGGAGTACCTTTGTGCCGTGTATATGGACTAGAGCCATCGGGACGTTTCCGGAGACTGCGTGGTGGGGGCGATGGACGCACAACGACCGCATTTTCGGTTGCCGACTCGCCGTTCGCATCTGGTAGGCACGACTCGTCGGGTTCGGCTCTTGCGTGAGCCGTGACGTAACAGACCCGTTCTCTTCCCCCGTCTGGCCATCCATAAATCCCCCCTCCATCGGCTTCCCTTTCCTCAATCCAGCACCCTGATTCCGATCGAAAAGTCCCCGCAAGAGCAAGCGACCGATCTCGTGAATCTCCGTCAAG(SEQIDNO:40)
根据一个实施方案，所述启动子区由SEQIDNO:40或与SEQIDNO:40具有90％、95％或99％序列同一性的1084bp序列组成。根据一个实施方案，所述启动子区由SEQIDNO:40组成。在一个实施方案中，所述3'非翻译序列的由SEQIDNO:4或与SEQIDNO:4具有90％、95％或99％序列同一性的1026bp序列组成，在一个实施方案中，所述3'非翻译序列由SEQIDNO:4组成。
在一个实施方案中，提供了包含如本文中公开的基因表达盒的细胞或植物。在一个实施方案中，细胞或植物包含含有如本文中公开的基因表达盒的载体。在一个实施方案中，载体可以是质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体、或病毒。由此，包含如本文中公开的基因表达盒的细胞或植物分别是转基因细胞或转基因植物。在一个实施方案中，转基因植物可以是单子叶植物。在一个实施方案中，转基因单子叶植物可以是，但不限于，玉米、小麦、水稻、高粱、燕麦、黑麦、香蕉、甘蔗、和粟。在一个实施方案中，转基因植物可以是双子叶植物。在一个实施方案中，转基因双子叶植物可以是，但不限于，大豆、棉花、向日葵、和芸苔。一个实施方案还包括来自如本文中公开的转基因植物的转基因种子。
在一个实施方案中，基因表达盒包含两个或更多个转基因。所述两个或更多个转基因可能不与相同的启动子、内含子、或如本文中公开的5’-UTR或3’-UTR可操作连接。在一个实施方案中，基因表达盒包含一个或多个转基因。在具有一个或多个转基因的实施方案中，至少一个转基因与主题公开的启动子、内含子、5’-UTR、或3’-UTR可操作连接。
选择标志物
可以将各种选择标志物(亦称报告基因)纳入选定的表达载体中，以允许鉴定并选择经转化的植物(转化体)。可以用来确认选择标志物在经转化植物中表达的方法有很多，包括例如DNA测序和PCR(聚合酶链式反应)、Southern印迹法、RNA印迹法、用于检测从载体中表达出来的蛋白质(例如介导膦丝菌素抗性的沉淀蛋白质)的免疫学方法，或其他蛋白质的视觉观察，所述其他蛋白质如报告基因编码的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、DsRed、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、碱性磷酸酶，等(参阅Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ThirdEdition,ColdSpringHarborPress,N.Y.,2001,其全部内容通过提述并入本文)。
利用选择标志物基因来选择转化的细胞或组织。选择标志物基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因。除草剂抗性基因通常编码对该除草剂不敏感的修饰的靶蛋白，或编码在植物中在该除草剂起作用之前降解该除草剂或将该除草剂脱毒的酶。例如，已通过使用编码突变体靶酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因而获得了对草甘膦的抗性。针对EPSPS的基因和突变体是熟知的，并且在下文进一步描述。已经通过使用编码使对应的除草剂脱毒的pat或DSM-2、腈水解酶、aad-1、或aad-12基因的细菌基因获得了对草铵膦、溴苯腈、以及2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的抗性。
在一个实施方案中，除草剂，包括包括咪唑啉酮或磺酰脲，可以抑制生长点或分生组织，并且针对这些除草剂的抗性/耐受性的基因，乙酰羟酸合酶(AHAS)和乙酰乳酸合酶(ALS)，是公知的。草甘膦抗性基因包括突变体5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)和dgt-28基因(分别通过引入天然EPSP基因、aroA基因和草甘膦乙酰转移酶(GAT)基因的重组核酸和/或各种形式的体内诱变)。其他膦酰基化合物的抗性基因包括来自链霉菌属物种(包括吸水链霉菌和绿色产色链霉菌)的bar基因、以及吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮(ACC酶抑制剂编码基因)。赋予对环己二酮和/或芳氧基苯氧基丙酸(包括氟吡甲禾灵、禾草灵、精恶唑禾草灵、吡氟禾草灵、喹禾灵)抗性的示例性基因包括乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)基因，--Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3。在一个实施方案中，除草剂可以抑制光合作用，包括三嗪(psbA和1s+基因)或苄腈(腈水解酶基因)。
在一个实施方案中，选择标志物基因包括但不限于，编码下列物质的基因：新霉素磷酸转移酶II；氰酰胺水合酶；天冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸合成酶；色氨酸脱羧酶；二氢吡啶二羧酸合酶和脱敏型天冬氨酸激酶；bar基因；色氨酸脱羧酶；新霉素磷酸转移酶(NEO)；潮霉素磷酸转移酶(HPT或HYG)；二氢叶酸还原酶(DHFR)；膦丝菌素乙酰转移酶；2,2-二氯丙酸脱卤酶；乙酰羟酸合酶；5-烯醇丙酮酰-莽草酸-磷酸合酶(aroA)；卤代芳基腈水解酶；乙酰辅酶A羧化酶；二氢蝶酸合酶(sulI)；和32kD光合体系II多肽(psbA)。
一个实施方案还包括编码对下列物质的抗性的基因：氯霉素；甲氨蝶呤；潮霉素；大观霉素；溴苯腈；草甘膦；和膦丝菌素。
以上列出的选择标志物基因并非意味着限制。本发明涵盖任何报告基因或选择标志物基因。
合成选择标志物基因，以实现在植物中的最优表达。例如，在一个实施方案中，基因的编码序列已通过密码子优化进行修饰，以增强在植物中的表达。可以为了在特定的植物物种中表达而优化选择标志物基因，或者可以为了在双子叶或单子叶植物中最优表达而修饰选择标志物基因。可以从特定植物物种中表达量最大的蛋白质中频率最高的密码子确定出植物优选的密码子。在一个实施方案中，选择标志物基因被设计为以较高水平在植物中表达，从而导致较高的转化效率。用于基因的植物优化的方法是熟知的。关于合成的DNA序列的优化和生产的指导可例如在WO2013016546、WO2011146524、WO1997013402、美国专利6166302、美国专利5380831中找到，将它们通过提述并入本文。
转化
用于植物转化的适合方法包括任何将DNA导入细胞中的方法，例如但不限于：电穿孔(参见，例如，美国专利5,384,253)；微粒轰击(参见，例如，美国专利5,015,580,5,550,318,5,538,880,6,160,208,6,399,861、和6,403,865)；土壤杆菌介导的转化(参见，例如，美国专利5,635,055,5,824,877,5,591,616；5,981,840、和6,384,301)；和原生质体转化(参见，例如，美国专利5,508,184)。
可以使用诸如利用碳化硅纤维搅动的技术(参见，例如，美国专利5,302,523和5,464,765)将DNA构建体直接导入到植物细胞的基因组DNA中，或者可以使用生物射弹法如DNA粒子轰击将DNA构建体直接导入到植物组织中(参见，例如，Klein等人(1987)Nature327:70-73)。或者，可通过纳米颗粒转化将DNA构建体导入植物细胞中(参见，例如，美国专利公开20090104700，通过提述将其全文并入本文)。
此外，基因转移可以使用非土壤杆菌的细菌或病毒，例如根瘤菌菌种NGR234，苜蓿中华根瘤菌、百脉根根瘤菌、马铃薯病毒X、花椰菜花叶病毒和木薯叶脉花叶病毒和/或烟草花叶病毒来实现，参见，例如Chung等人(2006)TrendsPlantSci.11(1):1-4。
通过转化技术的应用，几乎任何植物物种的细胞均可稳定转化，并且可通过熟知的技术使这些细胞发育为转基因植物。例如，美国专利5,846,797、5,159,135、5,004,863、和6,624,344中描述了在棉花转化背景下可能特别有用的技术；例如在美国专利5,750,871中描述了用于转化芸苔属植物的技术；用于转化大豆的技术例如描述于美国专利6,384,301中；用于转化玉米的技术例如描述于美国专利7,060,876和5,591,616、以及国际PCT公开WO95/06722中。
在完成外源核酸到受体细胞的递送之后，通常把转化的细胞鉴定出来用于进一步培养和植物再生。为了提高鉴定转化体的能力，可能期望与产生转化体用的转化载体一道使用选择标志物基因。在说明性实施方案中，可通过使细胞暴露于一种或多种选择剂来测定转化的细胞群，或者可筛选所述细胞的期望标志物基因性状。
对于暴露于选择剂后存活的细胞、或者在筛选测定中已被评分为阳性的细胞，可以在支持植物再生的培养基中进行培养。在一个实施方案中，可通过加入其他物质，如生长调节剂来改良任何适合的植物组织培养基。可将组织维持在具有生长调节剂的基本培养基上，直到可得到足以启动植物再生工作的组织为止，或者进行重复多轮的手工选择，直到组织的形态适合于再生为止(例如，至少2周)，然后转移到有助于芽形成的培养基中。定期转移培养物，直到已经发生充分的芽形成为止。一旦形成芽，将它们转移到有助于根形成的培养基中。一旦形成足够的根，可将植物转移到土壤中，以便进一步生长和成熟。
为了证实提供在再生植物中的包含期望核酸的构建体的存在，可进行多种测定。这样的测定可包括：分子生物学测定，如Southern和northern印迹以及PCR；生物化学测定，如检测蛋白质产物的存在，例如通过免疫学手段(ELISA、western印迹、和/或LC-MSMS分光光度法)或借助于酶功能；植物部分测定，如叶或根测定；和/或再生的全植物的表型分析。
可例如通过使用对感兴趣核酸分子特异的寡核苷酸引物进行PCR扩增来筛选转基因事件。PCR基因分型理解为包括但不限于：对来源于分离的宿主植物愈伤组织(预期该愈伤组织含有整合到基因组中的感兴趣核酸分子)的基因组DNA的聚合酶链式反应(PCR)扩增，然后进行PCR扩增产物的标准克隆和序列分析。PCR基因分型方法已有详尽的描述(参见，例如，Rios等(2002)PlantJ.32:243-53)，并可应用于来源于任何植物物种或组织类型(包括细胞培养物)的基因组DNA。在PCR扩增反应中可按顺序使用、或者复用与靶序列和导入序列两者都结合的寡核苷酸引物的组合。可产生旨在与靶位点、导入的核酸序列、和/或这两者的组合退火的寡核苷酸引物。因此，PCR基因分型策略可包括，例如但不限于：植物基因组中特异性序列的扩增；植物基因组中的多个特异性序列的扩增；植物基因组中的非特异性序列的扩增；以及任何前述项的组合。本领域技术人员可设计其他引物组合和扩增反应来探查基因组。例如，可以设计一组正向和反向寡核苷酸引物，令它们退火到对导入的核酸序列的边界之外的靶标而言为特异性的核酸序列。
可设计特异性地退火到导入的核酸分子的正向和反向寡核苷酸引物，例如，退火到导入的核酸分子中包含的某个感兴趣核苷酸序列内的编码区的相应序列；或所述核酸分子的其他部分。引物可以结合本文中描述的引物使用。寡核苷酸引物可根据期望的序列来合成并且可商购(例如，来自IntegratedDNATechnologies,Inc.,Coralville,IA)。扩增之后可以进行扩增产物的克隆和测序、或直接序列分析。在一个实施方案中，PCR扩增中使用对基因靶标特异性的寡核苷酸引物。
表达转基因的方法
在一个实施方案中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括种植这样的植物：该植物包含与至少一个转基因可操作连接的泛素启动子。在一个实施方案中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括种植这样的植物：该植物包含与至少一个转基因可操作连接的泛素5’-UTR。在一个实施方案中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括种植这样的植物：该植物包含与至少一个转基因可操作连接的泛素内含子。在一个实施方案中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括种植这样的植物：该植物包含与至少一个转基因可操作连接的泛素启动子、泛素5’–UTR、和泛素内含子。在一个实施方案中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括种植这样的植物：该植物包含与至少一个转基因可操作连接的泛素3’-UTR。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养这样的植物组织或植物细胞：所述植物组织或植物细胞包含与至少一个转基因可操作连接的泛素启动子。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养这样的植物组织或植物细胞：所述植物组织或植物细胞包含与至少一个转基因可操作连接的泛素5’-UTR。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养这样的植物组织或植物细胞：所述植物组织或植物细胞包含与至少一个转基因可操作连接的泛素内含子。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养这样的植物组织或植物细胞，所述植物组织或植物细胞包含与至少一个转基因可操作连接的泛素启动子、泛素5’–UTR、和泛素内含子。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养这样的植物组织或植物细胞，所述植物组织或植物细胞包含与至少一个转基因可操作连接的泛素3’-UTR。
在一个实施方案中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括种植包含含有与至少一个转基因可操作连接的泛素启动子的基因表达盒的植物。在一个实施方案中，泛素启动子由选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:35、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、和SEQIDNO:39的序列或与选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:35、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、和SEQIDNO:39的序列具有90％、95％或99％序列同一性的序列组成。在一个实施方案中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括种植包含含有与至少一个转基因可操作连接的泛素内含子的基因表达盒的植物。在一个实施方案中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括种植包含含有与至少一个转基因可操作连接的泛素5’-UTR的基因表达盒的植物。在一个实施方案中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括种植包含含有与至少一个转基因可操作连接的泛素启动子、泛素5’–UTR、和泛素内含子的基因表达盒的植物。在一个实施方案中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括种植包含含有与至少一个转基因可操作连接的泛素3’-UTR的基因表达盒的植物。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含含有与至少一个转基因可操作连接的泛素启动子的基因表达盒的植物组织或植物细胞。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含含有与至少一个转基因可操作连接的泛素内含子的基因表达盒的植物组织或植物细胞。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含含有与至少一个转基因可操作连接的泛素5’-UTR的基因表达盒的植物组织或植物细胞。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含含有与至少一个转基因可操作连接的泛素启动子、泛素5’–UTR、和泛素内含子的基因表达盒的植物组织或植物细胞。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含含有与至少一个转基因可操作连接的泛素3’-UTR的基因表达盒的植物组织或植物细胞。
转基因植物
在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含泛素启动子。在一个实施方案中，泛素启动子可以是柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素启动子。在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有启动子的基因表达盒，其中所述启动子与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:35具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％相同，其中所述启动子与非泛素转基因可操作连接。在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:35、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、和SEQIDNO:39的序列或与选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:35、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、和SEQIDNO:39的序列具有90、95或995序列同一性的序列的基因表达盒。在说明性实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有与转基因可操作连接的泛素启动子的基因表达盒，其中所述转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因、或它们的组合。
在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有3’-UTR的基因表达盒。在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有泛素3’-UTR的基因表达盒。在一个实施方案中，所述泛素3’-UTR是柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素3’-UTR。在一个实施方案中，3’-UTR可以是二穗短柄草泛素1C(Ubi1C)3’-UTR、二穗短柄草泛素13’-UTR、或粟泛素3’-UTR。
在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有内含子的基因表达盒，其中所述内含子与SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、或SEQIDNO:37具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％相同。在一个实施方案中，基因表达盒包含与启动子可操作连接的泛素内含子，其中所述启动子为柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素启动子，或为源自植物(例如，玉米泛素1启动子)、病毒(例如，木薯叶脉花叶病毒启动子)或细菌(例如，根癌土壤杆菌δmas)的启动子。在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含与转基因可操作连接的泛素内含子的基因表达盒。在说明性实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有与转基因可操作连接的泛素内含子的基因表达盒，其中所述转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因、或它们的组合。
在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有5’-UTR的基因表达盒，其中所述5’-UTR与SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14或SEQIDNO:38至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％相同。在一个实施方案中，基因表达盒包含与启动子可操作连接的泛素内含子，其中所述启动子为柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素启动子，或为源自植物(例如，玉米泛素1启动子)、病毒(例如，木薯叶脉花叶病毒启动子)或细菌(例如，根癌土壤杆菌δmas)的启动子。在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含与转基因可操作连接的泛素5’-UTR的基因表达盒。在说明性实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有与转基因可操作连接的泛素5’-UTR的基因表达盒，其中所述转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因、或它们的组合。
在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有泛素启动子和泛素3’-UTR的基因表达盒。在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含泛素启动子和3’-UTR，各自独立地可以是柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素启动子以及柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素3’-UTR。在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含基因表达盒，所述基因表达盒包含：a)启动子，其中所述启动子SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:35至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％相同；b)3’-UTR，其中所述3’-UTR与SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、或SEQIDNO:36至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％相同。
在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有与转基因可操作连接的泛素启动子、泛素5’-UTR、泛素内含子、和泛素3’-UTR的基因表达盒。当基因表达盒包含两个或更多个转基因时，所述启动子、内含子、5’-UTR、和3’-UTR可与基因表达盒之内的不同转基因可操作连接。在说明性实施方案中，基因表达盒包含与转基因可操作连接的泛素启动子，其中所述转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因、或它们的组合。在说明性实施方案中，基因表达盒包含与转基因可操作连接的泛素内含子，其中所述转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因、或它们的组合。在一个实施方案中，基因表达盒包含与启动子可操作连接的泛素内含子，其中所述启动子为柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素启动子，或为源自植物(例如，玉米泛素1启动子)、病毒(例如，木薯叶脉花叶病毒启动子)或细菌(例如，根癌土壤杆菌δmas)的启动子。在说明性实施方案中，基因表达盒包含与转基因可操作连接的泛素5’-UTR，其中所述转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因、或它们的组合。在一个实施方案中，基因表达盒包含与启动子可操作连接的泛素5’-UTR，其中所述启动子为柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素启动子，或为源自植物(例如，玉米泛素1启动子)、病毒(例如，木薯叶脉花叶病毒启动子)或细菌(例如，根癌土壤杆菌δmas)的启动子。在说明性实施方案中，基因表达盒包含与转基因可操作连接的泛素3’-UTR，其中所述转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因、或它们的组合。
在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有如本文中公开的泛素启动子、5’-UTR、内含子、和/或3’-UTR的载体。在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有与非泛素转基因可操作连接的如本文中公开的泛素启动子、5’-UTR、内含子、和/或3’-UTR的载体。在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有如本文中公开的基因表达盒的载体。在一个实施方案中，载体可以是质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体、或病毒。
根据一个实施方案，提供了植物、植物组织、或植物细胞，其中所述植物、植物组织、或植物细胞包含与转基因可操作连接的非内源泛素来源的启动子序列，其中所述泛素来源的启动子序列包含序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、或SEQIDNO:35，或与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、或SEQIDNO:35具有90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，提供了植物、植物组织、或植物细胞，其中所述植物、植物组织、或植物细胞包含与非泛素转基因可操作连接的SEQIDNO:1或与SEQIDNO:1具有90％序列同一性的序列。在一个实施方案中，所述植物、植物组织、或植物细胞为双子叶或单子叶植物或来源于双子叶或单子叶植物的细胞或组织。在一个实施方案中，所述植物选自玉米、小麦、水稻、高粱、燕麦、黑麦、香蕉、甘蔗、大豆、棉花、向日葵、和芸苔。在一个实施方案中，所述植物为玉米。根据一个实施方案，所述植物、植物组织、或植物细胞包含与非泛素转基因可操作连接的SEQIDNO:1、SEQIDNO:15、或与SEQIDNO:1或SEQIDNO:15具有90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，所述植物、植物组织、或植物细胞包含与转基因可操作连接的启动子，其中所述启动子由SEQIDNO:1、SEQIDNO:15、或与SEQIDNO:1或SEQIDNO:15具有90％、95％、98％或99％序列同一性的序列组成。根据一个实施方案，包含与转基因可操作连接的非内源泛素来源的启动子序列的基因构建体被纳入植物、植物组织、或植物细胞的基因组中。
在一个实施方案中，提供了包含与转基因可操作连接的SEQIDNO:1、或与SEQIDNO:1具有90％、95％、98％或99％序列同一性的序列的非短柄草属植物、植物组织、或植物细胞。根据一个实施方案，所述非短柄草属植物、植物组织、或植物细胞为双子叶或单子叶植物，或来源于双子叶或单子叶植物的植物细胞或组织。在一个实施方案中，所述植物选自玉米、小麦、水稻、高粱、燕麦、黑麦、香蕉、甘蔗、大豆、棉花、向日葵、和芸苔。在一个实施方案中，所述植物为玉米。根据一个实施方案，与转基因可操作连接的启动子序列被纳入植物、植物组织、或植物细胞的基因组中。在一个实施方案中，所述植物、植物组织、或植物细胞进一步包含5'非翻译序列，所述5'非翻译序列包含SEQIDNO:11或与SEQIDNO:11具有90％序列同一性的序列，其中所述5'非翻译序列插入在所述启动子和所述转基因之间并且与它们可操作连接。在另一个实施方案中，所述植物、植物组织、或植物细胞进一步包含插入在所述5'非翻译序列之后的内含子序列。在一个实施方案中，所述内含子序列是分离自柳枝稷、二穗短柄草、或粟的泛素基因的内含子序列。在一个实施方案中，所述序列包含或为SEQIDNO:7。
在一个实施方案中，提供了非短柄草属植物、植物组织、或植物细胞，其包含与转基因的5'端可操作连接的SEQIDNO:1、或与SEQIDNO:1具有90％、95％、98％或99％序列同一性的序列、以及包含SEQIDNO:4或与SEQIDNO:4具有90％序列同一性的序列的3'非翻译序列，其中3'非翻译序列与所述转基因可操作连接。根据一个实施方案，所述非短柄草属植物、植物组织、或植物细胞是双子叶或单子叶植物或来源于双子叶或单子叶植物的植物组织或细胞。在一个实施方案中，所述植物选自玉米、小麦、水稻、高粱、燕麦、黑麦、香蕉、甘蔗、大豆、棉花、向日葵、和芸苔。在一个实施方案中，所述植物为玉米。根据一个实施方案，与转基因可操作连接的启动子序列被纳入植物、植物组织、或植物细胞的基因组中。在一个实施方案中，所述植物、植物组织、或植物细胞进一步包含5'非翻译序列，所述5'非翻译序列包含SEQIDNO:11或与SEQIDNO:11具有90％序列同一性的序列，其中所述5'非翻译序列插入在所述启动子和所述转基因之间并且与它们可操作连接。在另一个实施方案中，所述植物、植物组织、或植物细胞进一步包含插入在所述5'非翻译序列之后的内含子序列。在一个实施方案中，所述内含子序列是分离自柳枝稷、二穗短柄草、或粟的泛素基因的内含子序列。在一个实施方案中，5'非翻译序列由SEQIDNO:11组成。
在一个实施方案中，提供了包含与转基因可操作连接的SEQIDNO:15或与SEQIDNO:15具有90％序列同一性的序列的非短柄草属植物、植物组织、或植物细胞。在一个实施方案中，提供了包含与转基因可操作连接的启动子的非短柄草属植物、植物组织、或植物细胞，其中所述启动子由SEQIDNO:15、或与SEQIDNO:15具有90％序列同一性的序列组成。在另一个实施方案中，非短柄草属植物、植物组织、或植物细胞进一步包含柳枝稷、二穗短柄草、或粟的泛素基因的3'非翻译序列。在一个实施方案中，所述3'非翻译序列包含或为SEQIDNO:4或与SEQIDNO:4具有90％序列同一性的序列，其中所述3'非翻译序列与转基因的3'端可操作连接。
在一个实施方案中，根据本文中公开的方法的植物、植物组织、或植物细胞可以是单子叶植物。所述单子叶植物、植物组织、或植物细胞可以是，但不限于玉米、水稻、小麦、甘蔗、大麦、黑麦、高粱、兰花、竹子、香蕉、香蒲、百合、燕麦、洋葱、小米、和黑小麦。
在一个实施方案中，根据本文中公开的方法的植物、植物组织、或植物细胞可以是双子叶植物。所述双子叶植物、植物组织、或植物细胞可以是，但不限于，油菜、芸苔、芥菜、埃塞俄比亚芥、大豆、向日葵、和棉花。
关于基因修饰植物的生产，用于植物的基因工程的方法在本领域中是熟知的。例如，已经开发了用于植物转化的多种方法，包括双子叶植物以及单子叶植物的生物和物理转化方案(例如，Goto-Fumiyuki等人，NatureBiotech17:282-286(1999)；Miki等人，MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology，Glick，B.R.和Thompson，J.E.编辑，CRCPress，Inc.，BocaRaton，pp.67-88(1993))。另外，有用于植物细胞或组织转化和植物再生的载体和体外培养方法，例如，见于Gruber等人，MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology，Glick，B.R.和Thompson，J.E.编辑，CRCPress，Inc.，BocaRaton，pp.89-119(1993)。
本领域技术人员将认识到，在外源序列稳定纳入转基因植物中并证实其可操作之后，可通过有性杂交将其导入其他植物中。可以使用许多标准育种技术中的任何一种，这取决于被杂交的物种。
对于工程化的植物材料选择或筛选转化DNA上存在的标志物基因所编码的性状，来鉴定和分离转化的植物细胞、愈伤组织、组织、或植物。例如，可以将工程化的植物材料在含有抑制量的抗生素或除草剂(转化基因构建体提供对该抗生素或除草剂的抗性)的培养基上培育来实施选择。此外，还可以通过筛选重组核酸构建体上可能存在的任何可见的标志物基因(例如yfp、gfp、β葡糖苷酸酶、荧光素酶、B或C1基因)的活性，来鉴定转化的细胞。这样的选择和筛选方法对于本领域技术人员是熟知的。
还可以使用物理和生物化学方法来鉴定含有插入的基因构建体的植物或植物细胞转化体。这些方法包括但不限于：1)Southern分析或PCR扩增，用于检测和确定重组DNA插入物的结构；2)Northern印迹、S1RNA酶保护、引物延伸或逆转录酶PCR扩增，用于检测和检查基因构建体的RNA转录本；3)酶学分析，用于检测酶或核酶活性，在这类基因产物由基因构建体编码的场合；4)新一代测序分析；5)蛋白凝胶电泳、Western印迹技术、免疫沉淀、或酶联免疫吸附测定(ELISA)，当基因构建体产物是蛋白质时。其他技术，例如原位杂交、酶染色和免疫染色，也可以用于检测特定植物器官和组织中重组构建体的存在或表达。所有用于完成这些测定法的方法都是本领域技术人员熟知的。
使用本文公开的方法进行基因操作的效果可以通过例如对从感兴趣组织分离的RNA(例如，mRNA)的northern印迹来观察。通常，如果mRNA出现或mRNA量增加，可以推定对应的转基因正在表达。可以使用其它测量基因和/或编码的多肽活性的方法。根据所使用的底物、以及检测反应产物或副产物的增加或减少的方法，可以使用不同类型的酶学测定。此外，表达的多肽的水平可以通过免疫化学检测，即ELISA、RIA、EIA和其他本领域技术人员所熟知的基于抗体的测定法，例如电泳检测测定法(可以使用染色或免疫印迹)。作为一个非限制性例子，使用ELISA测定法对AAD-1(芳氧基链烷酸酯双加氧酶；参见WO2005/107437)和PAT(膦丝菌素乙酰转移酶)，EC2.3.1.183)蛋白的检测记载于美国专利公开20090093366，通过提述将其全文并入本文。转基因可以在植物的某些类型和组织中、或在不同的发育阶段选择性地表达，或者转基因可以在几乎所有植物组织中的整个生命周期内表达。然而，任何组合表达模式也是可应用的。
本发明公开还包括如上面所记载的转基因植物的种子，其中种子具有转基因或基因构建体。本发明公开进一步包括如上面所述的转基因植物的后代、克隆、细胞系或细胞，其中所述后代、克隆、细胞系或细胞具有转基因或基因构建体。
虽然已经参考特定的方法和实施方案描述了本发明，应当理解的是，可以做出各种不偏离本发明的修改和变化。
实施例1
根癌土壤杆菌的转化
将二元表达载体转化到根癌土壤杆菌菌株DAt13192(RecA阴性三重菌株)(国际专利公开No.WO2012016222)中。分离细菌菌落，分离二元质粒DNA并经由限制酶消化进行证实。
玉米转化
土壤杆菌培养启动。从甘油储液将土壤杆菌培养物划线接种在土壤杆菌(AB)基本培养基(如公开于WO2013090734中，其公开内容通过提述并入本文)上并在20℃黑暗中温育3天。然后将土壤杆菌培养物划线接种在YEP(参见WO2013090734)培养基的平板上并在20℃黑暗中温育1天。
在实验当天，制备接种培养基(参见WO2013090734)与乙酰丁香酮的混合物，混合物的体积与实验中包含植物转化构建体的细菌菌株的数目相适应。将接种培养基吸移到一次性250ml无菌烧瓶中。然后，向含有接种培养基的烧瓶中加入适宜体积的100％二甲亚砜中的1M乙酰丁香酮储液，以产生200μM的乙酰丁香酮终浓度。所需的接种培养基和1M乙酰丁香酮储液的体积在表1中列出。
表1：根据制备的构建体数目制备接种培养基/乙酰丁香酮混合物的量
对于每种构建体，从YEP平板取1-2环土壤杆菌悬浮在一次性50ml无菌离心管内的15ml的接种培养基/乙酰丁香酮混合物中，在分光光度计中在600nm(OD600)测量溶液的光密度。然后使用额外的接种培养基/乙酰丁香酮混合物将悬液稀释到0.25-0.35OD600。再将土壤杆菌悬液的管水平放置在平台摇床上，平台摇床设置为室温下约75rpm，在使用之前温育1到4小时。
穗消毒和胚分离.玉米栽培种B104授粉10-12天后收获穗。将收获的穗去壳，浸没含20％商用漂白剂(UltraGermicidalBleach，6.15％次氯酸钠)和两滴20的溶液中持续20分钟进行表面消毒，随后在层流罩内在无菌去离子水中冲洗三次。从每个穗无菌地切下未成熟合子胚(1.8–2.2mm长)并分配到一个或多个含有2.0ml的土壤杆菌悬液的微量离心管中，土壤杆菌悬液中已添加了2μl的10％S233表面活性剂。
土壤杆菌共培养.在完成胚分离动作后，将装有胚的管封闭，放置在摇摆式平台上持续5分钟。然后将管的内容物倾倒于共培养培养基平板上，用一次性无菌移液管移除液态的土壤杆菌悬浮物。将含有胚的共培养平板放置在层流罩的后部，盖子半开，历时30分钟；此后使用显微镜使胚盾片朝上定向。然后使带有胚的共培养平板放回到层流罩的后部，盖子半开，再经过15分钟。然后盖上平板，用胶带密封，放置在25℃、每天24小时光照、光强度大约60μmolm-2s-1的培养箱中。
愈伤组织选择和转基因事件的再生.在共培养阶段后，将胚转移到静息培养基(参见WO2013090734)上。将不超过36个胚移动到每个平板上。将平板放置在透明的箱中，在27℃下、每天24小时大约50μmolm-2s-1光强度的光照下温育7-10天。然后将愈伤胚转移到选择I培养基(参见WO2013090734)上。移到每个选择I平板上的愈伤胚不超过18个。将平板放置在透明的箱中，在27℃、每天24小时大约50μmolm-2s-1光强度的光照下温育7天。然后将愈伤胚转移到选择II培养基(参见WO2013090734)上。移到每个选择II培养基平板上的愈伤胚不超过12个。将平板放置在透明的箱中，在27℃、每天24小时大约50μmolm-2s-1光强度的光照下温育14天。
在这个阶段，将抗性愈伤组织移动到预再生培养基(参见WO2013090734)上。移动到每个预再生培养基平板上的愈伤组织不超过9个。将平板放置在透明的箱中，在27℃下、每天24小时大约50μmolm-2s-1光强度的光照下温育7天。然后将再生愈伤组织转移到PhytatraysTM中的再生培养基上(参见WO2013090734)。在28℃、每天16小时光照/8小时黑暗、大约150μmolm-2s-1光强度的光照下温育7-14天，直到发出芽时为止。每个PhytatrayTM中放置的愈伤组织不超过5个。然后分离具有主根的小芽并转移到芽伸长培养基(参见WO2013090734)上。将约6cm或更高的生根的小植株移栽到土壤中，并移出到生长室炼苗。
YFP瞬时表达.在转化的胚中，以及在与土壤杆菌共培养3天之后观察到瞬时YFP表达。使用YFP滤光片和500nm光源在立体显微镜(LeicaMicrosystems，BuffaloGrove，IL)下观察胚。
T0植物在温室中的转移和建立.定期将转基因植物转移到温室。将植物从PhytatraysTM移栽到充填有生长培养基(PremierTechHorticulture，ProMixBX，0581P)的小盆(T.O.Plastics，3.5”SVD，700022C)中，用湿度控制圆顶(humidome)覆盖，以帮助驯化植物。将植物放置在Conviron生长室中(28℃/24℃，16小时光周期，50-70％RH，200μmolm-2s-1光强度)，直到达到V3-V4阶段。这有助于使植物适应土壤和更苛刻的温度。然后将植物移动到温室(光暴露类型：光合(Photo)或同化(Assimilation)；高光限:1200μmolm-2s-1光合活性照射(PAR)；16小时昼长；27℃昼/24℃夜)，并从小盆移栽到5.5英寸盆中。在移栽到更大的盆中之后约1-2周，对植物取样进行生物测定。对每个事件测定一株植物。
实施例2：启动子的鉴定
使用二穗短柄草和粟作为靶基因组，在Phytozome(Goodsteinetal.,2012)数据库中对玉米泛素编码序列进行BLASTx搜索。
玉米泛素(ZMUbi1)编码序列
ATGCAGATCTTTGTGAAAACCCTGACTGGCAAGACTATCACCCTCGAGGTGGAGTCGTCTGACACCATTGACAACGTTAAGGCCAAGATCCAGGACAAGGAGGGCATCCCCCCAGACCAGCAGCGGCTCATCTTTGCTGGCAAACAGCTTGAGGACGGGCGCACGCTTGCTGACTACAACATCCAGAAGGAGAGCACCCTCCACCTTGTGCTCCGTCTCAGGGGAGGCATGCAGATCTTTGTGAAAACCCTGACCGGCAAGACTATCACCCTCGAGGTGGAGTCCTCTGACACCATTGACAACGTCAAGGCCAAGATCCAGGACAAGGAGGGCATCCCTCCAGACCAGCAGCGGCTCATCTTTGCTGGGAAGCAGCTTGAGGACGGGCGCACGCTTGCCGACTACAACATCCAGAAGGAGAGCACCCTCCACTTGGTGCTGCGCCTCAGGGGAGGCATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTGACCGGCAAGACTATCACCCTCGAGGTGGAGTCTTCAGACACCATCGACAACGTCAAGGCCAAGATCCAGGACAAGGAGGGCATTCCCCCAGACCAGCAGCGGCTCATCTTTGCTGGAAAGCAGCTTGAGGACGGGCGCACGCTTGCCGACTACAACATCCAGAAGGAGAGCACCCTCCACTTGGTGCTGCGCCTCAGGGGAGGCATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTGACCGGCAAGACTATCACCCTCGAGGTGGAGTCTTCAGACACCATCGACAATGTCAAGGCCAAGATCCAGGACAAGGAGGGCATCCCACCGGACCAGCAGCGTTTGATCTTCGCTGGCAAGCAGCTGGAGGATGGCCGCACCCTTGCGGATTACAACATCCAGAAGGAGAGCACCCTCCACCTGGTGCTCCGTCTCAGGGGTGGTATGCAGATCTTTGTGAAGACACTCACTGGCAAGACAATCACCCTTGAGGTGGAGTCTTCGGATACCATTGACAATGTCAAGGCCAAGATCCAGGACAAGGAGGGCATCCCACCCGACCAGCAGCGCCTCATCTTCGCCGGCAAGCAGCTGGAGGATGGCCGCACCCTGGCGGATTACAACATCCAGAAGGAGAGCACTCTCCACCTGGTGCTCCGCCTCAGGGGTGGCATGCAGATTTTTGTGAAGACATTGACTGGCAAGACCATCACCTTGGAGGTGGAGAGCTCTGACACCATTGACAATGTGAAGGCCAAGATCCAGGACAAGGAGGGCATTCCCCCAGACCAGCAGCGTCTGATCTTTGCGGGCAAGCAGCTGGAGGATGGCCGCACTCTCGCGGACTACAACATCCAGAAGGAGAGCACCCTTCACCTTGTTCTCCGCCTCAGAGGTGGTATGCAGATCTTTGTAAAGACCCTGACTGGAAAAACCATAACCCTGGAGGTTGAGAGCTCGGACACCATCGACAATGTGAAGGCGAAGATCCAGGACAAGGAGGGCATCCCCCCGGACCAGCAGCGTCTGATCTTCGCCGGCAAACAGCTGGAGGATGGCCGCACCCTAGCAGACTACAACATCCAAAAGGAGAGCACCCTCCACCTTGTGCTCCGTCTCCGTGGTGGTCAGTAA(SEQIDNO:18)
蛋白质比对显示在图1中。从二穗短柄草鉴定出两条与玉米泛素1蛋白对齐的序列。从粟和柳枝稷分别仅鉴定出一条与玉米泛素1蛋白对齐的序列。在预期的翻译起始位点(ATG)上游有一大约2kb的DNA序列，将其确定为推定的启动子序列的起点，并用于表达的表征。将分离自柳枝稷、二穗短柄草和粟的新启动子的多核苷酸序列比对与ZMUbi1启动子进行比对，发现它们在所述2kbDNA区上享有低水平的序列相似性(图2A-C)。
柳枝稷、二穗短柄草和粟泛素基因的UBI编码序列以及推定启动子在图35-38中有示明。
实施例3：载体构建
商业合成四个启动子序列并将其纳入质粒载体中，这些质粒载体描绘于图3(pDAB113091)、图4(pDAB113092)、图5(pDAB113066)和图22(pDAB118238)中。类似地，商业合成四个3’UTR/转录终止序列并将其纳入质粒载体中，所述质粒载体描绘于图23(pDAB118237)、图24(pDAB118207)、图25(pDAB118208)和图26(pDAB118209)中。所述序列的两端侧翼有用于无缝克隆(SeamlessCloningandAssemblyKit，Invitrogen，Carlsbad，CA)的15-18个核苷酸的同源片段，以及为了分离启动子片段而插入的II型限制性酶位点。利用PCR或II型限制性酶，获得了无缝克隆相容性的玉米Ubi1启动子(ChristensenandQuail(1996)TransgenicResearch.5；213-218；Christensenetal.,(1992)PlantMolecularBiology.18；675-689)或水稻肌动蛋白启动子(McElroyetal.,(1990)PlantCell.2；163-71)、和包含ST-LS1内含子的PhiYFP(Shaginetal.,(2004)MolBiolEvol.21；841-50)编码序列(Vancanneyt等人，(1990)MolGenGenet.220；245-50)、以及StPinII或天然3’-UTR(Anetal.,1989PlantCell.1；115-22.)片段。最后，利用无缝克隆将启动子::PhiYFP::StPinII3’-UTR片段组装而产生用于瞬时表达测试的瞬时表达载体(图6，pDAB113103；图7，pDAB113104；图8，pDAB113105；图9，pDAB113106；以及，图10，pDAB113107；图27，pDAB120403；图28，pDAB118234，图29，pDAB118235；和图30，pDAB118236)。将这些瞬时表达载体整合到含有ZmUbi1启动子和AAD-1编码序列(国际专利公开2005107437)和ZmLip3’UTR的二元载体中(Paek等人，(1998)MoleculesandCells，8(3):336-342)。通过限制酶消化和测序反应确证了生成的二元载体(图12，pDAB113117；图13，pDAB113118；图14，pDAB113119；图15，pDAB113120；图16，pDAB113121；图31，pDAB120400；图32，pDAB120404；图33，pDAB120401；以及，图34，pDAB120402)。
实施例4：瞬时表达测试
利用不成熟玉米(B104)胚的粒子轰击测试了瞬时表达。对于每次处理，在一块培养皿中使用四十个胚供轰击。在粒子轰击的过夜温育之后进行YFP图像分析。图19显示了从新启动子获得的YFP表达水平。数据表明，从新启动子(pDAB113103、pDAB113104、和pDAB113105)获得的YFP表达水平与从ZMUbi1启动子(pDAB113106)和OSAct1启动子(pDAB113107)获得的YFP表达水平相当，如在显微镜下目测的。在LeicaEL6000–mercurymetalhalideTM显微镜上将植物组织成像。使用Chroma42003-ZsYellow1TM滤光片捕获共聚焦和微分干涉差(DIC)图像。
实施例5：利用实时PCR估计转基因拷贝数
通过水解探针测定确证了yfp转基因在转基因玉米植物的基因组内的稳定整合。获得从愈伤组织发育的稳定转化的转基因玉米小植株，并分析以鉴定含有低拷贝数(1-2个拷贝)的全长T链插入物的事件。将鉴定的小植株移动到温室中培育。
使用RocheLightCycler480TM系统来确定转基因拷贝数。该方法利用了二重反应，在单一测定中采用对yfp基因和对内源玉米参考基因(转化酶，Genbank登录号：U16123.1)特异的寡核苷酸。通过测量yfp特异性荧光相对于转化酶特异性荧光的相对强度，与已知的拷贝数标准进行比较，确定了拷贝数和接合性。
用一个含有FAMTM荧光染料标记探针的引物/探针组扩增了yfp基因特异性DNA片段，并且用含有HEXTM荧光标记探针的第二引物/探针组扩增了转化酶(表2)。如表3所示制备了PCR反应混合物，并根据表4中所示的条件扩增了基因特异性DNA片段。通过测量报告基因特异性荧光相对于参考基因转化酶特异性荧光的相对强度，并与已知的拷贝数标准比较，确定了样品的拷贝数和接合性。
表2：正向和反向核苷酸引物和荧光探针。
(由IntegratedDNATechnologies合成，Coralville，IA)。
表3：PCR反应混合物。
表4：用于PCR扩增的热循环仪条件。
如下建立标准：将载体pDAB108706稀释到玉米B104基因组DNA(gDNA)中，获得关于pDAB108706:gDNA关系已知的标准。例如，制备了每一个拷贝玉米B104gDNA具有一个、两个、四个拷贝载体DNA的样品。针对已知为半合的对照玉米事件、以及已知为纯合的对照玉米事件(玉米事件278；参见PCT国际专利公开No.WO2011/022469A2)，验证了pDAB108706与玉米B104gDNA标准品混合的一个和两个拷贝稀释物。实施二重测定，该测定使用对AAD1基因特异的寡核苷酸和对内源玉米参考基因转化酶特异的寡核苷酸，用一个含有FAM荧光染料标记的引物/探针组扩增并检测AAD1的基因特异性DNA片段，用第二个含有HEXTM荧光标记探针的引物/探针组扩增并检测转化酶的基因特异性DNA片段(表2)。如表3中所示制备了AAD1反应混合物，并根据表4中所示的条件扩增了特异性片段。
根据制造商的指导，使用Roche480热循环仪分析了每个反应产生的荧光水平。在465/510nm光密度激发FAMTM荧光部分，在533/580nm光密度激发HEXTM荧光部分。通过将未知样品的目标/参考值(由480输出)与四个已知拷贝数的标准品[空、1拷贝(半合)、2拷贝(纯合)和4拷贝]的目标/参考值进行比较，确定了拷贝数。用不同的启动子构建体转化而获得的转基因植物的转基因拷贝数分析的结果显示在表5中。仅将具有1-2个拷贝的yfp转基因的植物转移到温室中用于进一步表达分析。
表5：从本文中描述的启动子构建体和对照构建体获得的转基因植物的转基因拷贝数估计。
构建体 阳性事件数 1-2个拷贝的yfp
pDAB113117 32 17
pDAB113118 26 13
pDAB113119 30 16
pDAB113120 43 10
pDAB113121 36 19
实施例6：与泛素启动子可操作连接的基因的表达
蛋白质提取
利用叶子的ELISA测定，在V4-5对T0植物取样。将样品收集在96孔收集管板中，对每个样品取4个叶盘(纸打孔器大小)。向每个管中加入两个4.5mmBBs和200μL提取缓冲液[1xPBS，补充有0.05％-20和0.05％BSA(MilliporeEMDMilliporeCorp.，Billerica，MA)]。为了AAD1提取，将BSA的浓度增加到0.5％。在KLECO珠磨机中以全速处理平板3分钟。向每个管添加另外200μL提取缓冲液，随后倒置混合。使平板在3000rpm旋转5分钟。上清液转移到保存在冰上的96深孔板中的相应孔中。
YFP和AAD1ELISA程序
使用96孔Maxi-Sorp板(ThermoFisherScientificInc.，Rockford，IL)进行ELISA。用小鼠单克隆抗YFP捕捉抗体(OriGeneTechnologiesInc.，Rockville，MD)包被平板。该抗体稀释在PBS中(1μg/mL)，且每个孔加入150μL稀释的PBS。平板在4℃温育过夜。将过夜平板在室温下保持20-30分钟，然后用350μL洗涤缓冲液[1xPBS，补充有0.05％-20(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)]洗涤4次。在37℃用每孔200μL封闭缓冲液[1xPBS，补充有0.05％-20和0.5％BSA(Millipore)]封闭平板至少1小时，随后用350μL洗涤缓冲液(TomtecQuadraWashTM2，Tomtec，Inc.，Hamden，CT)洗涤4次。
对于YFPELISA，使用Evrogen重组Phi-YFP1mg/mL(AxxoraLLC，Farmingdale，NY)作为标准。使用5参数拟合标准曲线(在1ng/ml和0.125ng/ml标准之间)来确保所有数据落入曲线的线性部分中。向孔中加入100μL的标准品或样品。使用样品在测定缓冲液中的至少1:4稀释物。将平板在室温下在平板摇床(250rpm；TiterPlateshaker)上温育1小时，随后用350μL洗涤缓冲液(TomtecQuadraWashTM2)洗涤4次。向每个孔中加入约100μL的1μg/mLEvrogen兔多克隆抗PhiYFP第一抗体(Axxora)。将平板在室温下在平板摇床上250rpm温育1小时，随后用350μL洗涤缓冲液(TomtecQuadraWashTM2)洗涤4次。然后，向每个孔中加入以1:5000稀释在封闭/测定缓冲液中的100μL的抗兔IgGHRP第二抗体(ThermoScientific)。在室温下在平板摇床上250rpm温育平板1小时，随后用350μL洗涤缓冲液(TomtecQuadraWashTM2)洗涤4次。将100μL的Pierce1StepUltraTMBELISA(ThermoScientific)底物加入孔中，轻轻振摇10分钟。通过加入50μL的0.4NH2SO4停止反应。在450nm处读取吸光度，使用650nm参考滤光片。
使用来自AcadiaBioSciences(Portland，ME)的试剂盒通过ELISA确定AAD1表达水平。使用提取物的多个稀释度，且使用由供应商提供的试剂和说明进行ELISA。利用可溶性总蛋白测定将蛋白质水平归一化，蛋白质水平归一化使用由ThermoScientific提供的660nm蛋白测定试剂遵照供应商的说明进行。
实施例7：全植物YFP图像分析，例示与泛素启动子可操作连接的基因的稳定表达
在温室中培育含有低拷贝数的二元质粒的全植物。在LeicaEL6000–mercurymetalhalideTM显微镜上将植物组织成像。使用Chroma42003-ZsYellow1TM滤光片捕获共聚焦和微分干涉差(DIC)图像。图20到图21分别呈现了用本文中描述的二穗短柄草泛素1C、二穗短柄草泛素1及粟泛素2启动子转化玉米胚获得的转基因T0玉米植物的愈伤组织和根组织中YFP稳定表达的代表性实例。上述启动子驱动yfp编码序列在愈伤组织(图20)和根(图21)植物组织中强劲表达。
实施例8：与泛素启动子可操作连接的基因的全植物T0稳定表达
对表达的YFP蛋白进行ELISA分析产生了额外的数据。ELISA分析进一步证实，新启动子驱动了转基因的强劲表达。图17和表6中显示了从包含新启动子构建体的转基因植物获得的YFP蛋白的定量测量。数据表明，YFP蛋白在含有新启动子(pDAB113117、pDAB113118、和pDAB113119)的植物中的表达比从OsAct1(水稻肌动蛋白1)启动子(pDAB113120)获得的YFP表达高几倍。相比而言，图18和表7显示，从所有构建体获得的AAD1表达水平相似。这是预料之中的，因为所有构建体的AAD1都是由ZmUbi1启动子驱动的。
表6：跨物种泛素启动子T0叶的YFP表达
构建体 平均值(ng/mg TSP) 统计显著性
pDAB113121 144.00173 A
pDAB113118 92.37256 AB
pDAB113119 65.30393 B
pDAB113117 55.24345 B
pDAB113120 12.77181 B
不是由相同字母连接的水平是显著不同的。
表7：跨物种泛素启动子T0叶的AAD1表达
构建体 平均值(ng/mg TSP) 统计显著性
pDAB113121 119.06932 A
pDAB113118 109.19796 A
pDAB113119 96.29021 A
pDAB113117 85.40412 A45 -->
pDAB113120 83.81594 A
不是由相同字母连接的水平是显著不同的。
实施例9：与泛素启动子和3’UTR可操作连接的基因的全植物T1稳定表达
T0单转基因拷贝植物与野生型B104玉米植物回交，以获得T1种子。将半合T1植物用于分析。V4和V12叶表达使用每个构建体五个事件、每个事件5-10株植物。其他组织类型表达使用每个构建体三个事件、每个事件3株植物。对AAD1/YFP进行了接合性分析。
从包含新启动子构建体的T1转基因植物的叶组织获得的YFP蛋白的定量测量显示在表8中。数据证实了T0叶表达结果，并且进一步表明，在含有新启动子(pDAB113117、pDAB113118、和pDAB113119)的植物的V4、V12和R3叶组织中获得了YFP蛋白的一致高表达。表8还表明，当这种新启动子与它们的天然3’UTR(pDAB120400、pDAB120401、和pDAB120402)而不是PinII3’UTR(pDAB113117、pDAB113118、和pDAB113119)结合使用时，YFP蛋白的表达增加若干倍。从含有构建体pDAB120404的植物中检测到YFP蛋白表达，证实这种构建体中所使用的新启动子和3’UTR驱动了转基因的表达
从含有驱动YFP的新泛素启动子的转基因玉米植物取样的不同组织类型(包括穗轴、壳、粒、花粉、根、须和茎)中发现了高的YFP蛋白表达(表9)。
这些数据证明，本申请请求保护的新启动子和3’UTR可驱动转基因在植物中组成性高表达，并且在生物技术应用中是有用的。
表9：在不同组织类型中的跨物种泛素启动子T1表达
本文中引用的所有参考文献(包括出版物、专利、和专利申请)通过提述将其并入本文，其程度不与本公开的明确细节相冲突，并入的程度如同每篇参考文献被单独地并且明确地指示通过提述并入，并且在本文中以其整体进行阐述。提供在本文中论述的参考文献只不过是因为它们的公开在本申请的申请日之前。在本文中不应被解释为承认本发明人因现有发明而无权先于这些公开。提供以下实施例以展示某些具体特征和/或实施方案。不应将这些实施例解释为将本公开限制到所例示的具体特征或实施方案。

Claims (27)

1.一种包含启动子的核酸载体，所述启动子可操作地连接于
i)多接头序列；
ii)非泛素转基因；或
iii)i)和ii)的组合，其中所述启动子包含SEQIDNO:1或与SEQIDNO:1具有90％序列同一性的序列。
2.权利要求1的核酸载体，其中所述启动子长度小于3kb。
3.权利要求1的核酸载体，其中所述启动子由SEQIDNO:1或与SEQIDNO:1具有90％序列同一性的序列组成。
4.权利要求1-3中任一项的核酸载体，其进一步包含编码选择标志物的序列。
5.权利要求4的核酸载体，其中所述启动子与转基因可操作连接。
6.权利要求5的核酸载体，其中所述转基因编码选择标志物或赋予杀虫剂抗性、除草剂耐受性、氮利用效率、水分利用效率、或营养品质的基因产物。
7.权利要求1-3中任一项或权利要求5的核酸载体，其进一步包含3'非翻译序列，所述3'非翻译序列包含SEQIDNO:4或与SEQIDNO:4具有90％序列同一性的序列，其中所述3'非翻译序列与所述多接头或所述转基因可操作连接。
8.权利要求1-3中任一项、或权利要求5的核酸载体，进一步包含5'非翻译序列，所述5'非翻译序列包含SEQIDNO:11或与SEQIDNO:11具有90％序列同一性的序列，其中所述5'非翻译序列插入在所述启动子序列与所述多接头或转基因之间，并且与它们可操作连接。
9.权利要求8的核酸载体，进一步包含插入在所述5'非翻译序列之后的内含子序列。
10.权利要求9的核酸载体，其中所述内含子序列包含SEQIDNO:7。
11.权利要求1的核酸载体，其中所述启动子由SEQIDNO:40或与SEQIDNO:40具有90％序列同一性的序列组成，并且所述启动子与转基因可操作连接。
12.权利要求1的核酸载体，其中所述启动子由SEQIDNO:15或与SEQIDNO:15具有90％序列同一性的序列组成，并且所述启动子与转基因可操作连接。
13.权利要求11或12的核酸载体，其进一步包含3'非翻译序列，所述3'非翻译序列包含SEQIDNO:4或与SEQIDNO:4具有90％序列同一性的序列，其中所述3'非翻译序列与所述转基因可操作连接。
14.一种非短柄草属植物，其包含与转基因可操作连接的SEQIDNO:1或与SEQIDNO:1具有90％序列同一性的序列。
15.权利要求14的植物，其中所述植物选自玉米、小麦、水稻、高粱、燕麦、黑麦、香蕉、甘蔗、大豆、棉花、向日葵、和芸苔。
16.权利要求14的植物，其中所述植物是玉米。
17.权利要求14-16中任一项的植物，其中所述转基因被插入所述植物的基因组中。
18.权利要求14的植物，进一步包含5'非翻译序列，所述5'非翻译序列包含SEQIDNO:11或与SEQIDNO:11具有90％序列同一性的序列，其中所述5'非翻译序列插入在所述启动子与所述转基因之间，并且与它们可操作连接。
19.权利要求18的植物，进一步包含插入在所述5'非翻译序列之后的内含子序列。
20.权利要求19的植物，其中所述内含子序列包含SEQIDNO:7。
21.权利要求18的植物，进一步包含3'非翻译序列，所述3'非翻译序列包含SEQIDNO:4或与SEQIDNO:4具有90％序列同一性的序列，其中所述3'非翻译序列与所述转基因可操作连接。
22.权利要求14的植物，其中所述启动子由SEQIDNO:40或与SEQIDNO:40具有90％序列同一性的序列组成，并且所述启动子与转基因可操作连接。
23.权利要求14的植物，其中所述启动子由SEQIDNO:15或与SEQIDNO:15具有90％序列同一性的序列组成，并且所述启动子与转基因可操作连接。
24.权利要求22或23的植物，其进一步包含3'非翻译序列，所述3'非翻译序列包含SEQIDNO:4或与SEQIDNO:4具有90％序列同一性的序列，其中所述3'非翻译序列与所述转基因可操作连接。
25.一种包含转录终止子的核酸载体，所述转录终止子可操作地连接于
i)多接头序列；
ii)非泛素转基因；或
iii)i)和ii)的组合，其中所述转录终止子包含SEQIDNO:4或与SEQIDNO:4具有90％序列同一性的序列。
26.权利要求25的核酸载体，其中所述转录终止子长度小于1kb。
27.权利要求26的核酸载体，其中所述转录终止子由SEQIDNO:4的3’UTR序列组成。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107881172A (zh) * 2016-09-30 2018-04-06 江汉大学 一种逆境诱导型启动子、逆境诱导型启动子植物表达载体及诱导目标基因表达方法

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2013362921B2 (en) * 2012-12-19 2018-03-01 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
MX2017012936A (es) 2015-04-15 2018-02-01 Dow Agrosciences Llc Promotor de plantas para la expresion transgenica.
US10443065B2 (en) 2015-08-17 2019-10-15 Dow Agrosciences Llc Plant promotor and 3′ UTR for transgene expression
AU2017260655B2 (en) * 2016-05-02 2022-11-03 Corteva Agriscience Llc Plant promoter and 3'UTR for transgene expression
CA3020563A1 (en) * 2016-05-02 2017-11-09 Dow Agrosciences Llc Plant promoter and 3'utr for transgene expression
CA3024452A1 (en) * 2016-05-24 2017-11-30 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
TW201805425A (zh) * 2016-06-16 2018-02-16 艾格里遺傳學股份有限公司 用於轉殖基因表現之植物啟動子與３’ｕｔｒ
EP3518657B1 (en) * 2016-10-03 2022-07-13 Corteva Agriscience LLC Plant promoter for transgene expression
WO2019005183A1 (en) * 2017-06-28 2019-01-03 Dow Agrosciences Llc PLANT PROMOTER FOR TRANSGENIC EXPRESSION
CN109486818B (zh) * 2018-11-14 2021-06-01 中国热带农业科学院三亚研究院 狗尾草u6启动子基因及应用
US11499159B2 (en) 2019-01-10 2022-11-15 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
IL301396A (en) 2020-09-30 2023-05-01 Nobell Foods Inc Recombinant milk proteins and food compositions containing them
US10894812B1 (en) 2020-09-30 2021-01-19 Alpine Roads, Inc. Recombinant milk proteins
US10947552B1 (en) 2020-09-30 2021-03-16 Alpine Roads, Inc. Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101056975A (zh) * 2004-09-14 2007-10-17 孟山都技术有限公司 用于植物的启动子分子
CN101137752A (zh) * 2005-03-08 2008-03-05 巴斯福植物科学有限公司 增强表达的内含子序列

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE68918494T2 (de) * 1988-05-17 1995-03-23 Lubrizol Genetics Inc Pflanzliches Ubiquitinpromotorsystem.
US6706948B1 (en) * 1998-03-19 2004-03-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Sugarcane UBI9 gene promoter and methods of use thereof
AU2001275433A1 (en) * 2000-06-09 2001-12-17 Prodigene, Inc. Plant ubiquitin promoter sequences and methods of use
WO2006013072A2 (en) 2004-08-02 2006-02-09 Basf Plant Science Gmbh Method for isolation of transcription termination sequences
AU2006236392B2 (en) * 2005-04-15 2011-07-21 Del Monte Fresh Produce Company Plant promoters, terminators, genes, vectors and related transformed plants
US7393948B1 (en) * 2007-04-03 2008-07-01 Ms Technologies, Inc. Ubiquitin regulatory nucleic acids, vectors, and methods of using same
CA2717818A1 (en) 2008-03-07 2009-09-11 The Governors Of The University Of Alberta Diacylglycerol acyltransferases from flax
US8168859B2 (en) * 2008-08-27 2012-05-01 Pioneer Hi Bred International Inc Ubiquitin regulatory elements
WO2010146046A1 (en) 2009-06-15 2010-12-23 Basf Plant Science Company Gmbh Hydroponic systems for generating transgenic plants
KR102003176B1 (ko) * 2011-03-25 2019-07-24 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 식물 조절 요소 및 그의 용도
WO2012159891A1 (en) 2011-05-20 2012-11-29 Syngenta Participations Ag Endosperm-specific plant promoters and uses therefor
CA2855902C (en) * 2011-12-30 2022-06-21 Dow Agrosciences Llc Construct and method for synthetic bidirectional plant promoter ubi1
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101056975A (zh) * 2004-09-14 2007-10-17 孟山都技术有限公司 用于植物的启动子分子
CN101137752A (zh) * 2005-03-08 2008-03-05 巴斯福植物科学有限公司 增强表达的内含子序列

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAVID GJ MANN.ETC: "Switchgrass (Panicum virgatum L.) polyubiquitin gene (PvUbi1 and PvUbi2) promoters for use in plant transformation", 《BMC BIOTECHNOLOGY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107881172A (zh) * 2016-09-30 2018-04-06 江汉大学 一种逆境诱导型启动子、逆境诱导型启动子植物表达载体及诱导目标基因表达方法
CN107881172B (zh) * 2016-09-30 2021-06-08 江汉大学 一种逆境诱导型启动子、逆境诱导型启动子植物表达载体及诱导目标基因表达方法

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