CN101056975A - 用于植物的启动子分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在植物中调节基因表达的多核苷酸分子。具体地讲，本发明涉及从大豆(Glycine max)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)中分离的启动子，所述启动子可用于调节异源多核苷酸分子在植物中的基因表达。本发明也涉及含有所述异源多核苷酸分子的表达构建体和转基因植物。

Description

用于植物的启动子分子
                       发明背景
本申请要求于2004年9月14日申请的美国临时专利申请第60/609,770号的优先权，所述临时申请的全部公开内容通过引用结合到本文中。
                       发明领域
本发明涉及分子生物学领域，更准确地讲涉及用于在植物中表达转基因的多核苷酸分子。本发明涉及从大豆(Glycine max)中分离的P-Gm.701202739和P-Gm.701209813启动子，还涉及从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中分离的P-At.TT2启动子。这些启动子可用于在农作物中表达具有农学重要性的转基因。
                       发明背景
植物遗传工程的目标之一是产生具有重要农学特征或性状的植物。遗传工程的最新进展已经为含有和表达外源基因的转化植物提供了必要工具。植物转化和再生方面的技术进展，使得研究人员能够从异源来源或天然来源提取外源多核苷酸分子(例如基因)，并将该多核苷酸分子掺入到植物基因组中。然后，在植物细胞中表达该基因，显示出附加特征或性状。在一种方法中，某种基因在正常情况下并不表达它的植物细胞或植物组织中的表达，可以赋予所需表型效应。在另一种方法中，某种基因或基因部分以反义方向转录，可以通过阻止或抑制内源基因的表达而产生所需效应。
启动子是包含5′调节元件的多核苷酸分子，在活细胞中的总体基因表达上起重要作用。植物中起作用的分离的启动子可用于通过遗传工程方法改变植物表型。该方法中产生转基因植物的第一步包括将各种遗传元件装配成多核苷酸构建体。该构建体包括可转录多核苷酸分子(目标基因)，当它通过与目标基因操作性连接的启动子在植物细胞中表达(转录)时，赋予所需表型。构建体中的启动子对于其中同时含有的目标基因来说可以是同源或异源的。再通过各种植物转化方法，将构建体导入植物细胞中，产生转化植物细胞，从转化植物细胞再生转基因植物。启动子控制着与其操作性连接的目标基因的表达，因此能影响由转基因在植物中表达而赋予的特征或性状。
为了产生具有不同优良特性的转基因植物，最好是具有多种启动子以提供基因表达，使得基因以产生所需效应所必需的数量而被有效转录。遗传改良种质的商业化发展业已进步到可以将多种性状引入农作物的阶段，这一方法通常称为基因堆积方法(gene stackingapproach)。在该方法中，可以将赋予不同目标性状的多个基因引入植物。通常，在将多个基因引入植物时，重要的是每个基因都被调节或控制以达到优化表达，这导致对多种调节元件的需求。基于这些方面和其它方面的考虑，基因表达和调节元件多样性的优化控制在植物生物技术中显然是很重要的。
多种不同类型或类别的启动子都可用于植物遗传工程。可以根据时间范围、发育范围、转基因表达水平或组织特异性等特征，对启动子进行分类。例如，称为组成型启动子的启动子能够在多种组织中有效转录操作性连接的基因并表达这些基因。通过以所需方式(例如组成型、组织增强型或发育诱导型)分离有待转录和表达的基因上游5′调节区，可以获得不同类型的启动子。
大量的在植物细胞中有活性的启动子在文献中已有记载。它们包括在根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)根瘤诱导质粒上携带的胭脂碱合酶(nos)启动子和章鱼碱合酶(ocs)启动子以及花椰菜花叶病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒(Cauliflower Mosaic Virus，CaMV)19S或35S启动子(美国专利5,352,605)，具有复制增强子的CaMV 35S启动子(美国专利5,164,316、5,196,525、5,322,938、5,359,142和5,424,200)和玄参花叶病毒(Figwort Mosaic Virus，FMV)35S启动子(美国专利5,378,619)。这些启动子和许多其它启动子已经用于产生构建体，用于在植物中进行转基因的表达。以下美国专利文献中描述了其它有用的启动子：5,391,725、5,428,147、5,447,858、5,608,144、5,614,399、5,633,441、6,232,526和5,633,435，所述文献全部通过引用结合到本文中。
为了产生植物油和其它性状，基因在种子中表达也需要启动子。种皮是母本源组织。一旦发生受精，种皮负责通过保护胚并提供充足养分而维持种子内受精生命的完整性，直到出现利于生长的条件时。本发明描述了在种皮中表达的启动子。
尽管先前的工作已经提供了大量启动子，用于指导在转基因植物中的转录，但是仍然需要具有有利表达特性的新启动子。具体地讲，需要能够指导外源基因在种子中表达的启动子，用于产生油。许多先前已鉴定的启动子在转基因植物中无法提供所需表达模式或表达水平，以完全实现所选种子特异性油相关基因表达的益处。因此，植物遗传工程领域需要用于含油种子的新启动子。
                       发明概述
本发明涉及在种皮中表达的启动子。种皮启动子可用于产生具有所需种子性状的转基因植物。它们包括但不限于改变养分摄入、碳贮藏、代谢和转运、碳/氮生物合成、苯丙酸(phenylpropanoid)生物合成、种子组成或大小、含油量、蛋白质品质或微量营养素品质。
在一个实施方案中，本发明提供启动子，它包含与选自SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5的多核苷酸序列及其片段基本同源的多核苷酸序列，而且能够调节操作性连接的多核苷酸分子的转录。在具体的实施方案中，本发明提供包含与任何上述序列具有至少约70％序列同一性的多核苷酸序列，包括与SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：5序列中的任何一个或多个序列或其片段具有约75％、80％、83％、85％、88％、90％、92％、94％、95％、96％、98％、99％或更高序列同一性的序列，而且能够调节操作性连接的多核苷酸分子的转录，例如具有启动子活性。在具体的实施方案中，本文所提供的序列片段定义为包含任何本文所述启动子序列的至少约30、40、50、75、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、600、750、800或更多个连续核苷酸，例如SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：5的核酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供包含本文所述启动子的植物表达构建体，例如包含与选自SEQ ID NO：1、2和5的多核苷酸序列或其任何片段或其区域基本同源的多核苷酸序列，其中所述启动子与可转录多核苷酸分子操作性连接，而所述可转录多核苷酸分子又与3′转录终止多核苷酸分子操作性连接。
在又一个实施方案中，本发明提供用植物表达构建体稳定转化的转基因植物，所述构建体包含启动子，所述启动子包含与选自SEQID NO：1、2和5的多核苷酸序列或其任何片段基本同源的多核苷酸序列，其中所述启动子与可转录多核苷酸分子操作性连接，而所述可转录多核苷酸分子又可以与3′转录终止多核苷酸分子操作性连接。
在另一个实施方案中，本发明提供植物油的制备方法，该方法包括以下步骤：将本发明启动子掺入到含油种子植物基因组中，其中本发明启动子是与可转录多核苷酸分子操作性连接的，所述可转录多核苷酸分子使油和/或蛋白质含量发生改变；栽培含油种子植物以收获含油种子；从所收获的含油种子中提取油和/或蛋白质。
根据下面的发明详述和附图，本发明的上述方面和其它方面将会是显而易见的。
                        序列简述
SEQ ID NO：1是大豆P-Gm.701202739启动子的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：2是大豆P-Gm.701209813启动子的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：3-4是引物序列。
SEQ ID NO：5是拟南芥P-At.TT2启动子的多核苷酸序列。
                         附图简述
图1显示pMON65410。
图2显示pMON65409。
图3显示pMON65427。
图4显示pMON65431。
图5显示pMON65432。
                         发明详述
下面提供定义和方法，以便更好地限定本发明并指导本领域普通技术人员实施本发明。除非另有说明，否则术语应理解为相关领域普通技术人员的常规用法。
本文所用的术语“多核苷酸分子”是指基因组来源或合成来源的单链或双链DNA或RNA，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的多聚体，阅读方向从5′(上游)端到3′(下游)端。
本文所用的术语“多核苷酸序列”是指多核苷酸分子的序列。采用37CFR§1.822所提出的DNA碱基命名法。
启动子
本文所用的术语“启动子”是指多核苷酸分子，在其天然状态下位于可读框(或蛋白质编码区)翻译起始密码子的上游或5′，并且参与RNA聚合酶II和其它蛋白质(反式作用转录因子)的识别和结合，以起始转录。“植物启动子”是在植物细胞中起作用的天然或非天然启动子。组成型植物启动子在植物发育过程中的大多数或所有植物组织中都具有功能。任何植物启动子都可用作5′调节元件，以调节与其操作性连接的一个或多个特定基因的表达。当启动子与可转录多核苷酸分子操作性连接时，它通常引起可转录多核苷酸分子的转录，其转录方式类似于该启动子正常连接的方式。植物启动子可以包括通过操作已知启动子而产生的启动子，包括人工启动子、嵌合启动子或杂合启动子。这些启动子也可与一个或多个启动子顺式顺式元件组合，例如通过在具有自身部分或全部调节元件的活性启动子中加入异源调节元件。因此，本发明包括嵌合启动子或杂合启动子的设计、构建和使用，所述启动子包含SEQ ID NO：1、2或5中的至少一个顺式元件，用于调节操作性连接的多核苷酸序列的表达。
本文所用的术语“顺式元件”是指顺式作用转录调节元件，所述元件具有总体控制基因表达的特点。顺式元件可起到结合转录因子(调节转录的反式作用蛋白因子)的作用。一些顺式元件结合不止一个转录因子，而转录因子可以与不止一个顺式元件以不同亲和力相互作用。本发明的启动子最好含有具有基因表达能力或能够调节基因表达的顺式元件。许多技术都可鉴定顺式元件，所述技术包括缺失分析，即从启动子5′端或其内部缺失一个或多个核苷酸；采用DNA酶I足迹法进行DNA结合蛋白分析，甲基化干扰，电泳迁移率变动分析，通过连接介导的PCR进行体内基因组足迹法，以及其它常规分析；或者通过常规DNA序列比较方法，与已知顺式元件基序进行DNA序列相似性分析。可通过诱变(或取代)一个或多个核苷酸，或者通过其它常规方法，进一步研究顺式元件的精细结构。可通过化学合成法，或者通过从包含所述元件的启动子中分离得到顺式元件，而且也可以用含有有用的限制酶位点(以便进行后续操作)的附加侧翼核苷酸合成顺式元件。
在一个实施方案中，本发明的启动子包含多个顺式元件，它们各自对基因表达的总体控制具有不同特点。在一个优选的实施方案中，用专门为鉴定序列内的顺式元件、结构域或基序而设计的计算机程序，来鉴定来自SEQ ID NO：1、2或5多核苷酸分子的顺式元件。顺式元件可以根据不同的条件，对基因表达进行正调节或负调节。因此，本发明包括本文所公开的启动子的顺式元件。
本文所用的术语“基本同源”是指通常已证实与本文所述的启动子具有基本的％序列同一性的多核苷酸分子。尤其重要的是这样的多核苷酸分子：所述多核苷酸分子在植物中行使功能，指导转录，并且与本文所述启动子的多核苷酸序列具有至少约70％序列同一性、至少约80％序列同一性、至少约90％序列同一性、或甚至更高的序列同一性，例如98％或99％序列同一性。能够调节操作性连接的可转录多核苷酸分子的转录、并且与本文所述启动子的多核苷酸序列基本同源的多核苷酸分子，包括在本发明的范围之内。
本文所用的术语“％序列同一性”是指当两个序列进行最佳比对时(在比较窗口内，具有合适的核苷酸插入、缺失或空位总数小于20％的参考序列)，参考多核苷酸分子(或其互补链)与待测多核苷酸分子(或其互补链)相比的线状多核苷酸序列中的相同核苷酸百分比。用于比对一个比较窗口的最佳序列比对是本领域技术人员众所周知的，可以采用诸如以下的工具来实施：Smith和Waterman的局部同源性算法，Needleman和Wunsch的同源性比对算法，Pearson和Lipman的搜索相似性方法，优选这些算法都用计算机来执行，例如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，这些都是市售的GCGWisconsinPackage(Accelrys Inc.，San Diego，CA)的组成部分。待测序列和参考序列比对区段的“同一性分数”是两个比对序列共享的相同组分数除以参考序列区段(即完整的参考序列或参考序列中较小的指定部分)的总组分数。％序列同一性表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是比较全长多核苷酸序列或其部分，或者是比较较长的多核苷酸序列。
本文所用的术语“同源性”是指根据％核苷酸位置同一性来确定的多核苷酸序列之间的相似性水平或％同一性，即序列相似性或同一性。本文所用的术语同源性也指不同多核苷酸分子之间相似功能特性的概念，例如具有相似功能的启动子可具有同源的顺式元件。当多核苷酸分子在某些条件下可以特异性杂交而形成双链体分子时，这些多核苷酸分子就是同源的。在这些条件(称为严格性条件)下，一个多核苷酸分子可用作探针或引物，以鉴定与其具有同源性的其它多核苷酸分子。术语“严格性条件”就其功能定义为：按照以下文献中论述的具体杂交方法，使核酸探针与靶核酸(即与特定的目标核酸序列)杂交：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，第1、2和3卷.J.F.Sambrook，D.W.Russell和N.Irwin，Cold Spring HarborLaboratory Press，2000(本文中称为Sambrook等)。因此，可以利用本发明核苷酸序列与多核苷酸分子片段的互补序列段选择性地形成双链体分子的能力。根据所考虑的应用方法，最好采用不同杂交条件，以得到探针对靶序列的不同选择程度。对于需要高选择性的应用方法，通常最好采用相对高的严格性条件以形成杂合体，例如可选择相对低盐和/或高温条件，例如约0.02M至约0.15M NaCl，温度约50℃至约70℃。高严格性条件例如是用高严格性洗涤缓冲液(0.2X SSC，0.1％SDS，65℃)洗涤杂交滤膜至少两次。本领域技术人员已知促进DNA杂交的合适的中等严格性条件，例如用6.0X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，约45℃，再用2.0X SSC在50℃进行洗涤。另外，洗涤步骤中的盐浓度可以选择低严格性(约2.0X SSC，50℃)至高严格性(约0.2XSSC，50℃)。另外，洗涤步骤中的温度可以从低严格性条件(室温，约22℃)升高至高严格性条件(约65℃)。温度和盐都可变动，或者温度或盐浓度中的一项保持恒定，而改变另一项。这样的选择条件使得在探针和模板或靶链之间几乎不会产生错配。通过杂交检测多核苷酸分子，是本领域技术人员众所周知的，美国专利4,965,188和5,176,995介绍了杂交分析的示例性方法。
也可通过计算机程序来比对多核苷酸序列，并估计多核苷酸分子在某些严格性条件下形成双链体分子的能力，确定同源性。不同来源的共享高度同源性的多核苷酸分子称为“同源物”。
可以采用本领域技术人员众所周知的方法，鉴定具有类似于本文所述启动子的活性的目标启动子。例如，可以采用目标细胞或目标组织，构建cDNA文库，并筛选鉴定具有类似于本文所述启动子的表达模式的基因。再用经过鉴定的基因的cDNA序列来分离基因的启动子，用于进一步表征。参见例如美国专利6,096,950、5,589,583和5,898,096，所述文献通过引用结合到本文中。或者，转录概况分析技术或电子RNA印迹技术(transcriptional profiling or electronicnorthern technique)可用于鉴定具有类似于本文所述启动子的表达模式的基因。一旦鉴定出了这些基因，就可分离出它们的启动子，用于进一步表征。参见例如美国专利6,506,565和6,448,387，所述文献通过引用结合到本文中。电子RNA印迹技术是基于计算机的序列分析，该分析可根据研究人员鉴定的参数，对来自多个cDNA文库的序列进行电子仪器比较，所述参数包括多个cDNA文库中EST群体的丰度，或专门针对来自一个文库或组合文库的EST系列。转录概况分析技术是一种用于上千个基因的基因表达概况的系统监测的高通量方法。这一基于DNA芯片的技术将上千个cDNA序列排列在支持物表面上。这些排列同时与标记的cDNA探针群体(所述探针是从不同细胞或组织类型的RNA样品制备的)杂交，使得可以直接比较分析表达。该方法可用于分离调节序列，例如与这些基因相关的启动子。
在另一个实施方案中，可以修饰本文所公开的启动子。本领域技术人员可制造在多核苷酸序列中具有变异的启动子。可以修饰或改变SEQ ID NO：1、2或5所示的本发明启动子的多核苷酸序列，以加强它们的控制特性。多核苷酸序列的一个优选改变方法就是采用PCR，修饰所选核苷酸或序列区。这些方法是本领域技术人员众所周知的。在基于PCR的DNA修饰方法中，可通过模板序列的插入、缺失或取代，从而修饰序列。“变异体”是含有以下变化的启动子：其中原始启动子的一个或多个核苷酸缺失、添加和/或取代，优选同时基本保持启动子功能。例如，可以从启动子的5′端或3′端缺失一个或多个碱基对，以产生“截短的”启动子。也可以在启动子内部插入、缺失或取代一个或多个碱基对。就启动子片段而论，变异型启动子可以包括影响与其操作性连接的最小启动子转录的变化。最小启动子即基础启动子是能够募集和结合基础转录机器的多核苷酸分子。真核细胞基础转录机器的一个实例是RNA聚合酶II复合体及其辅助蛋白。可以通过例如标准DNA诱变技术制备变异型启动子，或者通过化学方法合成变异型启动子或其部分。
可以通过许多方法设计或改造新的嵌合启动子。许多启动子含有激活、增强或限定启动子强度和/或特异性的顺式元件。例如，启动子可含有限定转录起始位点的“TATA”盒以及位于转录起始位点上游并能调节转录水平的其它顺式元件。例如，可通过将第一启动子片段(其中含有来自一个启动子的激活物顺式元件)与第二启动子片段(其中含有来自另一个启动子的激活物顺式元件)融合，制备嵌合启动子；所得嵌合启动子可增加操作性连接的可转录多核苷酸分子的表达。可以构建启动子，使启动子片段或元件是操作性连接的，例如通过将这样的片段放置在最小启动子上游。本发明的顺式元件和片段可用于构建这样的嵌合启动子。本发明的嵌合启动子和变异型启动子的构建方法，包括但不限于将不同启动子或启动子重复部分或区域的控制元件组合起来(参见例如美国专利4,990,607、5,110,732和5,097,025，所有这些文献都通过引用结合到本文中)。本领域技术人员熟知介绍大分子(例如多核苷酸分子、质粒等)的构建、操作和分离、以及重组生物的产生和多核苷酸分子的筛选分离的具体条件和方法的标准来源资料。
在另一个实施方案中，包含SEQ ID NO：1、2或5所示的多核苷酸序列的启动子包括能够调节操作性连接的可转录多核苷酸分子的任何长度的所述多核苷酸序列。例如，SEQ ID NO：1、2或5所公开的启动子可以是截短的或部分缺失的，并且依然能够调节操作性连接的多核苷酸分子的转录。在一个相关实施方案中，本文所公开的启动子的顺式元件可以赋予特定特异性，例如能够赋予在某些组织中增强操作性连接的多核苷酸分子的表达，因而也能够调节操作性连接的多核苷酸分子的转录。因此，包含SEQ ID NO：1、2或5所示多核苷酸序列的启动子的任何片段、部分或区域，都可用作调节性多核苷酸分子，包括但不限于本文所公开的多核苷酸分子的顺式元件或基序。可联合采用取代、缺失、插入或它们的任何组合，以产生最终构建体。
多核苷酸构建体
本文所用的术语“构建体”是指任何来源的、且能够基因组整合或自主复制的任何重组多核苷酸分子，例如质粒、粘粒、病毒、自主复制的多核苷酸分子、噬菌体或线状或环状单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子，包含其中一个或多个多核苷酸分子以功能操作性方式连接的多核苷酸分子。
本文所用的术语“操作性连接(的)(operably linked)”是指第一多核苷酸分子(例如启动子)与第二可转录多核苷酸分子(例如目标基因)连接起来，经过该连接，这两个多核苷酸分子的排列方式使得第一多核苷酸分子能影响第二多核苷酸分子的功能。优选这两个多核苷酸分子是单个毗连多核苷酸分子的一部分，更优选是相邻的。例如，如果启动子在细胞中调节或介导目标基因的转录的话，启动子则与目标基因操作性连接。
本文所用的术语“可转录多核苷酸分子(transcribablepolynucleotide molecule)”是指能够转录成为RNA分子的任何多核苷酸分子。将构建体导入细胞，其方式使得可转录多核苷酸分子转录成为功能性mRNA分子，后者再翻译，因而表达成为蛋白质产物，这样的方法是已知的。也可构建能够表达反义RNA分子的构建体，以便抑制特定目标RNA分子的翻译。对于本发明的实践，制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法都是本领域技术人员众所周知的(参见例如Sambrook等)。
本发明的构建体通常含有启动子、可转录多核苷酸分子和3′转录终止多核苷酸分子，它们依次操作性连接。另外，构建体可以包括但不限于来自植物基因的3′-非翻译区(3′UTR)(例如增加mRNA的mRNA稳定性的3′UTR，例如马铃薯PI-II终止区或者章鱼碱或胭脂碱合酶3′终止区)的额外调节性多核苷酸分子。构建体可以包括但不限于mRNA多核苷酸分子的5′非翻译区(5′UTR)，它在翻译起始中起到重要作用，并且也可以是植物表达构建体中的遗传元件。例如，已经证明，来源于热激蛋白基因的非翻译5′前导序列多核苷酸分子能增强植物中的基因表达(参见例如美国专利5,659,122和5,362,865；美国公布的申请2002/0192812，所述文献通过引用结合到本文中)。这些另外的上游和下游调节性多核苷酸分子的来源相对于启动子构建体中存在的其它元件，是天然或异源的。
因此，本发明构建体包含SEQ ID NO：1、2或5中提供的那些启动子或如上所述经过修饰的那些启动子，所述启动子是与可转录多核苷酸分子操作性连接的，在将所述构建体导入植物细胞后，能指导所述可转录多核苷酸分子以所需水平或在所需组织或以某种发育模式的转录。在某些情况下，所述可转录多核苷酸分子包含基因的蛋白质编码区，所述启动子提供待翻译和表达为蛋白产物的功能性mRNA分子的转录。也可以构建各种构建体，用于反义RNA分子或其它类似抑制性RNA的转录，以便抑制目标宿主细胞中的特异性RNA分子的表达。
用于掺入本发明构建体的示例性可转录多核苷酸分子包括例如来源于不是目标基因物种的DNA分子或基因，或者甚至起源于相同物种的基因或存在于相同物种的基因，但是通过不是经典繁殖或育种技术的遗传工程方法掺入受体细胞中。外源基因或遗传元件是指导入受体细胞的任何基因或DNA分子。外源DNA中所包括的DNA类型可以包括植物细胞中已存在的DNA，来自其它植物的DNA，来自不同生物体的DNA或外部产生的DNA，例如含有基因的反义信息的DNA分子或编码基因的人工形式或修饰形式的DNA分子。
可以采用所述标记基因，将本发明的启动子掺入构建体中，然后在稳定植物系统中，用提供基因表达指示的瞬时分析进行测试。本文所用的术语“标记基因”是指任何可转录多核苷酸分子，其表达可用某种方法进行筛选或评分。用瞬时测定法测试标记基因表达的方法是本领域技术人员已知的。采用各种植物、组织和DNA转移系统瞬时表达标记基因已有报道。例如，瞬时分析类型可以包括但不限于在任何瞬时植物试验中，采用任何目标植物物种，通过组织的电穿孔或微粒轰击进行的直接基因转移。这样的瞬时系统包括但不限于来源于不同组织的原生质体的电穿孔或特定目标组织的微粒轰击。本发明包括使用任何瞬时表达系统，以评价与任何可转录多核苷酸分子(包括但不限于所选报道基因、标记基因或农学目标基因)操作性连接的启动子或启动子片段。考虑用于测试瞬时通过合适转移系统，植物组织的实例包括但不限于叶基组织、愈伤组织、子叶、根、胚乳、胚、花组织、花粉和表皮组织。
任何可评分或可筛选的标记基因都可用于瞬时测定。用于本发明启动子或启动子片段的瞬时分析的优选标记基因包括GUS基因(美国专利5,599,670，所述文献通过引用结合到本文中)或GFP基因(美国专利5,491,084，所述文献通过引用结合到本文中)。将含有与标记基因操作性连接的启动子或启动子片段的构建体转移到组织中，通过合适机制，根据标记对这些组织进行分析。采用定量或定性分析作为工具，评价稳定植物中的启动子或启动子片段(当操作性连接有农学目标基因时)的潜在表达概况。
因此，在一个优选的实施方案中，将SEQ ID NO：1、2或5所示的本发明多核苷酸分子或其片段、变异体或衍生物掺入到构建体中，使得本发明的启动子与提供可选择、可筛选或可评分标记的可转录多核苷酸分子操作性连接。用于实施本发明的标记包括但不限于编码以下酶和蛋白的可转录多核苷酸分子：β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、萤光素酶(LUC)、赋予抗生素抗性的蛋白或赋予除草剂耐受性的蛋白。有用的抗生素抗性标记，包括编码赋予卡那霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)、链霉素或壮观霉素(aad，spec/strep)和庆大霉素(aac3和aacC4)抗性的蛋白的标记，是本领域已知的。已经证明了转基因植物耐受的除草剂，本发明的方法可用于包括但不限于草甘膦、草铵膦(glufosinate)、磺酰脲类、咪唑啉酮类、溴苯腈、delapon、cyclohezanedione、原卟啉原(protoporphyrionogen)氧化酶抑制剂和异氟草类除草剂(isoxasflutole herbicides)。编码除草剂耐受性相关蛋白的多核苷酸分子是本领域已知的，包括但不限于编码5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的多核苷酸分子，描述于美国专利5,627,061、5,633,435和6,040,497；aroA，描述于美国专利5,094,945，具有草甘膦耐受性；编码溴苯腈腈水解酶的多核苷酸分子(Bxn)，描述于美国专利4,810,648，具有溴苯腈耐受性；编码八氢番茄红素去饱和酶的多核苷酸分子(crtl)，描述于Misawa等，PlantJ.，4：833-840(1993)和Misawa等，Plant J.，6：481-489(1994)，具有达草灭(norflurazon)耐受性；编码乙酰羟酸合酶的多核苷酸分子(AHAS，aka ALS)，描述于Sathasiivan等，Nucl.Acids Res.，18：2188-2193(1990)，具有磺酰脲类除草剂耐受性；bar基因，描述于DeBlock等，EMBO J.，6：2513-2519(1987)，具有草铵膦和双丙氨酰膦耐受性。
在一个优选的实施方案中，将SEQ ID NO：1、2或5所示的本发明多核苷酸分子或其片段、变异体或衍生物掺入到构建体中，使本发明的启动子与可转录多核苷酸分子(即农学目标基因)操作性连接。本文所用的术语“农学目标基因”是指包括但不限于提供优良特性的基因的可转录多核苷酸分子，所述特性涉及植物形态学、生理学、生长和发育、产量、营养增加、抗病或抗虫、或环境或化学品耐受性。农学目标基因的表达最好是为了得到重要的农学性状。给农作物提供优良农学性状的农学目标基因可以是例如包括但不限于具有以下特性的遗传元件：除草剂抗性(美国专利5,633,435和5,463,175)、产量增加(美国专利5,716,837)、病害虫防治(美国专利6,063,597、6,063,756、6,093,695、5,942,664和6,110,464)、真菌病抗性(美国专利5,516,671、5,773,696、6,121,436、6,316,407和6,506,962)、病毒抗性(美国专利5,304,730和6,013,864)、线虫抗性(美国专利6,228,992)、细菌病抗性(美国专利5,516,671)、淀粉产量(美国专利5,750,876和6,476,295)、改变的油产量(美国专利6,444,876)、高油产量(美国专利5,608,149和6,476,295)、改变的脂肪酸含量(美国专利6,537,750)、高蛋白产量(美国专利6,380,466)、果实成熟(美国专利5,512,466)、增加的动物和人类营养(美国专利5,985,605和6,171,640)、生物聚合物(美国专利5,958,745和美国公布的申请2003/0028917)、环境胁迫抗性(美国专利6,072,103)、药用肽(美国专利6,080,560)、改良的加工性状(美国专利6,476,295)、改良的可消化性(美国专利6,531,648)、低棉子糖(美国专利6,166,292)、工业用酶的生产(美国专利5,543,576)、改善的口味(美国专利6,011,199)、固氮(美国专利5,229,114)、杂交种子的生产(美国专利5,689,041)和生物燃料的生产(美国专利5,998,700)，上述专利所记载的遗传元件和转基因都通过引用结合到本文中。
或者，可转录多核苷酸分子可以通过编码非转录RNA分子而影响上述表型，所述RNA分子引起内源基因表达的靶向抑制，例如通过反义、RNAi或共抑制介导的机制。RNA也可以是催化性RNA分子(即核酶)，该分子经工程化以切割所需内源mRNA产物。因此，编码表达目标表型或形态学变化的蛋白质或mRNA的任何多核苷酸分子，都可用于实施本发明。
本发明的构建体通常是双Ti质粒边界DNA构建体，所述构建体具有从根瘤土壤杆菌中分离的Ti质粒的右边界区(RB或AGRtu.RB)和左边界区(LB或AGRtu.LB)，包含T-DNA以及土壤杆菌细胞提供的转移分子，允许将T-DNA整合到植物细胞基因组中。构建体还含有可在细菌细胞中提供复制功能和抗生素选择的质粒骨架DNA区段，例如大肠杆菌(E.coli)复制起点(例如ori322)，宿主范围广的复制起点(例如oriV或oriRi)和选择标记的编码区(例如编码赋予壮观霉素或链霉素抗性的Tn7氨基糖苷腺苷转移酶(aadA)的Spec/Strp，或庆大霉素(Gm，Gent)选择标记基因)。对于植物转化来说，宿主细菌菌株通常是根瘤土壤杆菌ABI、C58或LBA4404，但是，植物转化领域技术人员已知的其它菌株也可用于本发明。
转化植物和植物细胞
本文所用的术语“转化(的)”是指已经导入外源多核苷酸分子(例如构建体)的细胞、组织、器官或生物体。优选所导入的多核苷酸分子整合到受体细胞、组织、器官或生物体的基因组DNA上，使所导入的多核苷酸分子可以遗传给后代。“转基因”或“转化”细胞或生物体也包括细胞或生物体的后代，以及通过采用这样的转基因植物作为杂交亲本的育种程序而产生的后代，所述后代因存在外源多核苷酸分子而表现出改变的表型。可以通过任何植物转化方法，将含有本发明启动子的植物转化构建体导入植物中。在本发明的实践中，通过将植物表达构建体导入植物基因组中而转化植物的方法与材料可以包括任何熟知的且已证明的方法，包括电穿孔，参见美国专利5,384,253；微弹轰击法(microprojectile bombardment)，参见美国专利5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861和6,403,865；土壤杆菌介导的转化，参见美国专利5,635,055、5,824,877、5,591,616、5,981,840和6,384,301；和原生质体转化，参见美国专利5,508,184，所有上述文献都通过引用结合到本文中。
专门用于转化双子叶植物的方法是本领域技术人员众所周知的。用这些方法进行转化和植物再生，已经在许多农作物中有介绍，包括但不限于棉花(Gossypium hirsntum)、大豆(Glycine max)、花生(Arachis hypogaea)、苜蓿(Medicago sativa)和芸苔属(Brassica)成员。本领域技术人员显而易见的是，可以采用和改进许多转化方法，用于从许多目标双子叶农作物产生稳定的转基因植物。
专门用于转化单子叶植物的方法是本领域技术人员众所周知的。用这些方法进行转化和植物再生，已经在许多农作物中有介绍，包括但不限于大麦(Hordeum vulgarae)；玉米(Zea mays)；燕麦(Avenasativa)；鸭茅(Dactylis glomerata)；水稻(Oryza sativa，包括印度变种和日本变种)；高粱(Sorghum bicolor)；甘蔗(Saccharum sp)；苇状羊茅(Festuca arundinacea)；草坪草(Agrostis)；和小麦(Triticumaestivum)。本领域技术人员显而易见的是，可以采用和改进许多转化方法，用于从许多目标单子叶农作物产生稳定的转基因植物。
许多种子、坚果和种仁都含油，可以提取这些油，用于烹饪(作为其它食物成分，作为营养补充剂)，作为生产肥皂、润肤油和护发油、洗涤剂、涂料的原料，以及作为某些基于石油的润滑剂和燃料的代用品。本文所用的这些种子、坚果和种仁统称为“含油种子”(National Sustainable Agriculture Information Service(ATTRA)，Fayetteville，AR)。常用作含油种子的种子、坚果和种仁见表1。
                         表1.含油种子、坚果和种仁
 杏核(Apricot stones)   黑茶藨子(Black currant)   辣椒(Red pepper)
 鳄梨(Avocado)   霍霍巴(Jojoba)   巴西坚果(Brazil nut)
 棉籽(Cotton seed)   咖啡(Coffee)   西番莲果(Passion fruit)
 越桔(Billberry)   可可(Cocoa)   美洲山核桃(Pecan)
 琉璃苣(Borage)   芫荽(Coriander)   开心果(Pistachio)
 异株荨麻(Stinging nettle)   葛缕子籽(Caraway seed)   油菜籽(Rape seed)
 山毛榉果(Beech nut)   南瓜籽(Pumpkin seed)   蓖麻籽(Castor bean)
 金盏花(Calendula)   亚麻籽(Linseed)   沙棘(Sea buckthorn)
 腰果(Cashew nut)   肉豆蔻(Mace)   芥菜籽(Mustard seed)
 干椰肉(Copra(driedcoconut))   玉米籽(Corn seed)   芝麻籽(Sesame seed)
 红花(Safflower)   澳洲坚果(Macadamia nut)   大豆(Soybean)
 花生(Groundnut)   杏仁(Almonds)   向日葵籽(Sunflower seed)
 大戟(Spurge)   甜瓜籽(Melon seed)   Tropho plant
 橡胶种子(Rubber seed)   罂粟(Poppy)   番茄籽(Tomato seed)
 蔷薇果(Rose hip)   肉豆蔻(Nutmeg)   葡萄籽(Grape seed)
 大麻(Hemp)   月见草(Evening primrose)   胡桃(Walnut)
 榛子(Hazelnut)   印度楝种子(Neem seed)   柑橘籽(Citrus seed)
 悬钩子(Raspberry)   小葵子(Niger seed)   油菜(Canola)
 接骨木(Elderberry)   棕榈仁(Palm kernel)
在另一个实施方案中，本发明提供植物油的制备方法，该方法包括以下步骤：将本发明启动子掺入到含油种子植物基因组中，其中本发明启动子是与可转录多核苷酸分子操作性连接的，所述可转录多核苷酸分子使油和/或蛋白质含量发生改变；栽培含油种子植物以收获含油种子；从所收获的含油种子中提取油和/或蛋白质。
对转化植物中存在的目标基因、表达水平和/或本发明启动子所赋予的特性进行分析。本领域技术人员知道，许多方法都可用于分析转化植物。例如，植物分析方法包括但不限于DNA印迹法或RNA印迹法、基于PCR的方法、生化分析法、表型筛选法、田间评价法和免疫诊断测定法。
本发明的种子可以从能育转基因植物收获，用于培育产生本发明转化植物后代，包括含有本发明构建体并表达农学目标基因的杂交植物系。
本发明的启动子提供植物组织的差异表达，优选在至少一种植物种子组织(包括种皮、胚、糊粉和内胚乳)中。在本文中，启动子是指“种子增强型启动子”。
术语“微量营养素含量”是指种子中的微量营养素含量，即维生素A、E、K、生育酚、生育三烯酚或类胡萝卜素含量，表示为每重量单位。
术语“含油量”是指油水平，可以通过例如低分辨率1H核磁共振(NMR)(Tiwari等，JAOCS，51：104-109(1974)或Rubel，JAOCS，71：1057-1062(1994))或近红外透射(NIT)光谱(Orman等，JAOCS，69(10)：1036-1038(1992)；Patrick等，JAOCS，74(3)：273-276(1997))而测得。
术语“蛋白质品质”是指无论是游离的还是掺入在蛋白质中的一种或多种必需氨基酸水平，即组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸水平。
本文所用的术语“油组成”是指样品中不同脂肪酸或油组分的比例。这样的样品可以是植物或植物部分，例如种子。这样的样品也可以是一批植物部分。
在一个优选的实施方案中，本文所用的术语“％含量”是指某一特定组分相对于其它类似相关组分的总重量百分比。
本文所用的术语“增加的油”或“油增加”包括油产量增加或油组成改变。
下面的实施例用于证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例所公开的技术代表本发明人发明的技术，能够很好地用于实施本发明。然而，本领域技术人员应当理解，根据本说明书，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以在所公开的具体实施方案中进行许多改变，但仍得到相同或相似的结果，因此附图中提供或显示的所有内容都是说明性的而非限制性的。
                       实施例
实施例1：启动子P-Gm.701202739和P-Gm.701209813的分离
通过文库扣除和电子RNA印迹技术，使用PhytoSeq数据库SOYMON035，鉴定出用于种皮表达的EST增强型。从大豆栽培品种A3244中提取DNA，用于构建GenomeWalker(BD Biosciences，PaloAlto，CA)文库。通过PCR扩增，从GenomeWalker文库中分离出两个来自上述EST的启动子：701202739H1(0.76kb)和701209813H1(0.78kb)。
克隆推定的大豆种皮启动子5′-上游调节序列，经过证实这些序列是：P.701202739H1(SEQ ID NO：1)(pMON57315)和701209813H1(SEQ ID NO：2)(pMON57314)。
实施例2：启动子P-At.TT2的分离
拟南芥TT2基因编码R2R3MYB结构域蛋白，该蛋白质参与发育中的种皮内原花色素的积蓄。首先通过用BLAST针对孟山都(Monsanto)拟南芥序列数据库ArabGDNA搜索编码序列(AJ299452)，鉴定出启动子序列，该数据库ArabGDNA包括所有来源的所有拟南芥基因组序列。Pl Clone MOK9(AB015477)含有TT2编码序列(碱基对64541-67240)。设计引物，从拟南芥基因组DNA(Strain ID CS3176)扩增TT2编码区上游序列(对应于Pl MOK9的碱基对64658-65620)。将TT2的预测ATG转变成NcoI位点，并将SrfI位点添加到第二引物的5′端，便于进行克隆。引物序列是SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。将启动子序列(SEQ ID NO：5)克隆到PCR2.1 Topo(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，得到pMON65418。
实施例3：用于转化拟南芥的构建体
pMON65410(T-Gm.701202739-0:3:1::GUS)
pMON57315用PstI和NcoI进行消化，从pMON57315上切取含有P-Gm.701202739-0:3:1的698bp片段。将该片段与已用Sse8387I和NcoI消化的pMON69802连接在一起。所得质粒含有驱动大肠杆菌uidA基因的P-Gm.701202739-0:3:11并具有油菜籽蛋白3′UTR(napin 3′UTR)，该质粒称为pMON65410。用已知方法测定核酸序列，证明克隆连接的完整性。该载体随后用于转化拟南芥。
pMON65409(P-Gm.7012009813-0:3:1::GUS)
pMON57314用PstI和NcoI进行消化，从pMON57314上切取含有P-Gm.701209813-0:3:1的704bp片段。将该片段与已用Sse8387I和NcoI消化的pMON69802连接在一起。所得质粒含有驱动大肠杆菌uidA基因的P-Gm.701209813-0:3:11并具有油菜籽蛋白3′UTR，该质粒称为pMON65409。用已知方法测定核酸序列，证明克隆连接的完整性。该载体随后用于转化拟南芥。
根据Bent等，Science，265：1856-1860(1994)或Bechtold等，C.R.Acad.Sci，Life Sciences，316：1194-1199(1993)，获得了转基因拟南芥植物。将含有转化载体pMON65410或pMON65409的根瘤土壤杆菌菌株ABI培养物在LB(10％细菌用胰蛋白胨、5％酵母膏和10％NaCl/卡那霉素(75mg/L)、氯霉素(25mg/L)和壮观霉素(100mg/L))上培养过夜。将细菌培养物离心，重悬于5％蔗糖+.05％Silwet-77溶液中。将整株拟南芥植物的地上部分(在约5-7周龄)浸泡在所得溶液中2-3秒。用纸巾吸干植株上的过量溶液。将浸泡过的植株侧放在加罩平板上，移到19℃培养室。16-24小时后，打开罩子，让植株直立向上。当植株达到成熟度时，停止浇水2-7天后收获种子。所收获的种子通过不锈钢筛网(40孔/英寸)，除去碎屑。将所收获的种子放入纸质钱袋(papercoin envelope)中在室温下贮藏，直至分析用。
用蒸气相消毒方案，对拟南芥种子进行表面消毒。将装有种子的开口容器放入干燥器中，干燥器里还放有一个装有100ml家用漂白剂的烧杯。将3ml浓HCl加入到漂白剂中，立即密封干燥器。密封干燥器后，抽真空进行氯气熏蒸消毒。种子保持几小时。将消过毒的种子播种到补充了50mg/L草甘膦的的拟南芥出芽培养基(MSSalts(1X)、蔗糖(1％)、肌醇(100mg/L)、硫胺素-HCl(1mg/L)、吡哆醇-HCl(500mg/L)、烟酸(500mg/L)、MES pH 5.7(0.05％)和Phytagar(0.7％))中。
实施例4：转基因拟南芥植物中启动子的表征
采用组织化学染色法，分析用pMON65409或pMON65410转化的拟南芥植物中β-葡糖醛酸糖苷酶(大肠杆菌uidA基因的产物)的表达。将16株草甘膦抗性幼苗移栽到2英寸花盆(装有MetroMix 200)内，每个花盆移栽一株幼苗，在上述条件下培育，直到最初结的长角果开始变干。从每株T1植物上切取组织(莲座叶、茎生叶、茎、花、花芽和发育中的长角果)，随后进行组织化学染色。从每株T1植物上切取组织(莲座叶、茎生叶、茎、花、花芽和发育中的长角果)，随后进行组织化学染色。
将如上所述制备的组织在含有以下成分的溶液中于37℃保温24小时：50mM NaPO4(pH7.2)、100μM铁氰化钾、100μM亚铁氰化钾、0.03％Triton X-100、20％甲醇和2.5mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡糖醛酸(X-gluc)。通过在70％乙醇/30％H2O中、在37℃保温过夜，除去染色组织中的叶绿素。立即对染色组织拍照，或者将其移到70％乙醇/30％甘油(v/v)溶液中，于4℃保存，直到进行拍照。
对于pMON65409，所筛选的5个植株中有5株(5/5)在至少一个时间点检测到种子的活性水平。对于pMON65410，所筛选的5个植株中有5株(5/5)在至少一个时间点检测到种子的活性水平。
实施例5：用于转化油菜(Canola)的构建体
pMON65431(P-Gm.701202739-0:3:1::GUS)
pMON57315用NotI和NcoI进行消化，从pMON57315上切取含有P-Gm.701202739-0:3:1的745bp片段。将该片段与已用NotI和NcoI消化的pMON65424连接在一起。所得质粒含有驱动大肠杆菌uidA基因的P-Gm.701202739-0:3:11并具有油菜籽蛋白3′UTR，该质粒称为pMON65431。用已知方法测定核酸序列，证明克隆连接的完整性。该载体随后用于转化油菜。
pMON65432(T-Gm.701209813-0:3:1::GUS)
pMON57314用NotI和NcoI进行消化，从pMON57314上切取含有P-Gm.701209813-0:3:1的746bp片段。将该片段与已用NotI和NcoI消化的pMON65424连接在一起。所得质粒含有驱动大肠杆菌uidA基因的P-Gm.701209813-0:3:11并具有油菜籽蛋白3′UTR，该质粒称为pMON65432。用已知方法测定核酸序列，证明克隆连接的完整性。该载体随后用于转化油菜。
pMON65427(P-At.TT2-0:3:2::GUS)
pMON65418用SmaI和NcoI进行消化，从pMON65418上切取含有P-At.TT2-0:3:2的966bp片段。将该片段与已用PmeI和NcoI消化的pMON65424连接在一起。所得质粒含有驱动大肠杆菌uidA基因的P-At.TT2-0:3:21并具有油菜籽蛋白3′UTR，该质粒称为pMON65427。用已知方法测定核酸序列，证明克隆连接的完整性。该载体随后用于转化油菜。
将载体pMON65422、65431和pMON65432导入根瘤土壤杆菌菌株ABI中，用于转化到欧洲油菜(Brassica napus)中。采用Moloney和Radke的美国专利5,720,871所述方案，转化油菜植物。简而言之，将欧洲油菜(B.napus)cv Ebony的种子种在2英寸花盆内，花盆内装有Metro Mix 350(The Scotts Company，Columbus，OH)。让各植株在24℃培养室中生长，经过16/8小时光周期，光强度400μEm-2sec-1(HID灯)。2-1/2周后，将各植株移栽到6英寸花盆内，在培养室中于白天15℃/夜晚10℃的温度进行培育，16/8小时光周期，光强度800μEm-2sec-1(HID灯)。
刚好在抽薹之前，或者在抽薹时但开花之前，从植株上切取梢头四节，如下进行表面消毒：70％v/v乙醇1分钟，2％w/v次氯酸钠20分钟，用无菌去离子水清洗3次。将6-7个茎段切成5mm圆片，保持底端的方向。
将用于转化油菜的土壤杆菌培养物在含有50mg/L卡那霉素、24mg/L氯霉素和100mg/L壮观霉素的2ml Luria肉汤LB(10％细菌用胰蛋白胨、5％酵母膏和10％NaCl)中，在24℃摇床上培养过夜。用MS培养基(Murashige和Skoog，Physiol.Plant.，15：473-497，1962)制备1∶10的稀释液，得到约9×108细胞/ml。给茎的圆片(外植体)接种1.0ml土壤杆菌，过量部分从外植体上吸去。将外植体底部朝下放置在装有以下成分的培养基平板上：1/10MS盐、B5维生素(1％肌醇、0.1％硫胺素HCl、0.01％烟酸、0.01％吡哆醇HCl)、3％蔗糖、0.8％琼脂，pH 5.7，1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤(BA)。平板上再铺上1.5ml含有以下成分的培养基：MS盐、B5维生素、3％蔗糖，pH 5.7，4.0mg/L对氯苯氧基乙酸、0.005mg/L激动素，再盖上无菌滤纸。
2-3天共培养后，将外植体移入深的培养平板中，其中装有MS盐、B5维生素、3％蔗糖，0.8％琼脂，pH 5.7，1mg/L BA，500mg/L羧苄青霉素，50mg/L头孢噻肟，200mg/L卡那霉素或175mg/L庆大霉素，用于选择。每个平板放入7个外植体。3周后，将它们转移到新鲜培养基中，每板5个外植体。将外植体在25℃培养室中培养，持续光照(冷光)。
将转化植株在22℃培养室中培育几周，16-8小时光-暗周期，光强度220μEm-2sec-1，然后移入温室。将植株在温室内保持在标准条件下。授粉后，在不同阶段收获发育中的种子，贮藏在-70℃。收获成熟种子，在受控条件(温度约为17℃，湿度约为30％)下贮藏。
实施例6：转基因油菜植物中启动子的表征
从用pMON65427、pMON65431或pMON65432转化的各R0植株中，在授粉后的不同时间点，收获多达5个长角果。将长角果用18号针头划开，让染色液接触到发育中的种子。将长角果在含有以下成分的溶液中于37℃保温约24小时：50mM NaPO4(pH 7.2)、100μM铁氰化钾、100μM亚铁氰化钾、0.03％Triton X-100、20％甲醇和2.5mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡糖醛酸(X-gluc)。通过在70％乙醇/30％H2O中、在37℃保温过夜，除去染色组织中的叶绿素。立即对染色组织拍照，或者将其移到70％乙醇/30％甘油(v/v)溶液中，于4℃保存，直到进行拍照。根据样品是否呈蓝色记录为阳性(+)或阴性(-)。
对于pMON65431，所筛选的10个植株中有6株(6/10)在至少一个时间点检测到种子的活性水平。各转化子的时程数据见表2和表3。
表2.发育中的油菜种子的P-Gm.701202739-0:3:1表达
  授粉后的天数
  构建体   事件   3   6   9   12   15   20   25   30   35   40
  pMON65431   BN_G2244   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  pMON65431   BN_G2245   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  pMON65431   BN_G2246   +   +   +   +   +   -   -   -   -   -
  pMON65431   BN_G2308   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  pMON65431   BN_G2309   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  pMON65431   BN_G2310   +   +   +   +   +   +   +   -   -   -
  pMON65431   BN_G2311   -   +   +   +   +   +   -   -   -   -
  pMON65431   BN_G2312   +   -   +   -   +   +   -   -   -   -
  pMON65431   BN_G2352   -   +   +   +   +   -   -   -   -   -
  pMON65431   BN_G2353   +   +   +   +   +   +   -   -   -   -
  对照   SP30052   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
表3.发育中的油菜种子的P-Gm.701209813-0:3:1表达
  授粉后的天数
  构建体   事件#   3   6   9   12   15   20   25   30   35   40
  pMON65432   BN_G2064   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  pMON65432   BN_G2065   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  pMON65432   BN_G2152   -   -   -   -   -   +   -   -   -   -
  pMON65432   BN_G2153   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  pMON65432   BN_G2154   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  pMON65432   BN_G2155   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  pMON65432   BN_G2156   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  pMON65432   BN_G2157   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  pMON65432   BN_G2158   -   -   -   -   -   -   -   -   +   -
  pMON65432   BN_G2160   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  对照   SP30052   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
对于pMON65427，所筛选的10个植株中有10株(10/10)在至少一个时间点检测到的种子活性水平。各转化子的时程数据见表4。
表4.发育中的油菜种子的P-At.TT-0:3:2表达
  授粉后的天数
  构建体   3   6   9   12   15   20   25   30   35   40
  pMON65427   -   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  pMON65427   -   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  pMON65427   -   -   -   -   -   -   +   +   -   -
  pMON65427   -   -   -   -   -   -   -   -   +   -
  pMON65427   -   -   -   -   -   -   -   +   +   +
  pMON65427   -   -   +   +   -   +   +   +   +   +
  pMON65427   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  pMON65427   -   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  pMON65427   -   -   +   -   +   +   +   +   +
  pMON65427   -   +   +   +   +   +   +   +   +
  对照   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
上文说明并描述了本发明的原理，对于本领域技术人员显而易见的是，只要不偏离这些原则，可以对本发明的安排和细节进行修改。我们要求保护所附权利要求书的精神和范围内的所有修改。本说明书中引用的所有出版物和公开的专利文件都通过引用结合到本文中，其程度如同每个出版物或专利申请都通过具体和单独的引用结合到本文中一样。
                             序列表
<110>Monsanto Technology LLC
     Ruezinsky，Diane M.
     Tzafrir，Iris
     Conner，Timothy W.
<120>用于植物的启动子分子
<130>MONS：055US
<140>未知
<141>2005-09-12
<150>U.S.60/609,770
<151>2004-09-14
<160>5
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>663
<212>DNA
<213>大豆(Glycine max)
<400>1
cgtaaacctt tttatataag ttttatccaa ctgtagtaca gatgatttag ttcactaaaa    60
ttgtttatat accttttact caagttacca ataattttct ttcagtatta tcgagagtca    120
agttagtacc gaaaaaccta ttgtattatt cttgagttac agtgcgctag gctcagcatt    180
actgagagct ttttcgatgt catcgatata aaatttaacg agatggtgga gtatttattg    240
atgaatatta agtcatcaat atacaatgag tttttgctat tacaactcag taaatctttt    300
gtgcaattaa ttattttgct ttcaattgat cccttgtgta cgttacattg atgctaatgg    360
atgaaattag ccaacagaac tcttaatatg aaaaatgaga gtatctggtc tgaaattata    420
catttttttt accatcacaa ttgaacataa aagaaggact atcacaattg ataaggatat    480
tagcaattaa ggaaatagat tccttatatt agcttccacc tcaaaactga attttgttgt    540
aattaaggaa aaaatgctga catccataat tatgagtatc tcataacgtg acaaaaaaag    600
ttaaatatct gtattttgga taaatatttt ttaagcttta ttttatttta tctgagggtc    660
ata                                                                  663
<210>2
<211>669
<212>DNA
<213>大豆(Glycine max)
<400>2
ggtatccata tcaagttctc gagtagttcc ccaccctcat cttcaattcc gcatgagctc    60
tagctctagc aacctaaatc taattaaagt ttgaaagatt atgtagagcc aaactttaag    120
tgtcaatttt cataatgagt taaaccttaa atgtcaattt tcatcacagg gtaataggat    180
tgagtgctta ggggactaac ttacaatgag gtgtcagttc gtaaatacgt gtaatgtagt    240
ctctgtcgcc aacatgtgcc acgagaaatc agtaatggtt aacctgatgt caccatggtg    300
ctcctttgca ctagaagaca tggatgcagc agaagagtgt gataagagca tgtcgaattt    360
caacagtgat ggctttgtgt tttgtttgtt cttactttag tttattttaa tcttttttta    420
ccgttctggg gcaccaagtc aaaagagttt agtcaagcac aatcgcacaa ggctctccct    480
ctctctcccc ctgtcccaca agaaagtgaa ataacaaaca cattgtctcc ttagattcct    540
ttcttttcta tttgaagcgc actctatccc agtctctctc tgatttccta tatcagctgg    600
tgggacactg gttatgtttc ttttgtcagg attctcttgc tctcactata tcaaggagga    660
gaggggaga                                                            669
<210>3
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>3
gcccgggcgg tttaccggaa ttgtatgtca atgg                                34
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>4
tcccatggtc acttttctct ctcttgtgc                                      29
<210>5
<211>964
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>5
ggtttaccgg aattgtatgt caatggtgtt aaccacatga cgtcctatac ttcatatatg    60
tggtcatgta atacatctac ttcgtgtcta cttcgtgtag ctggatatac aatgtatagt    120
aggtatgtgt gaccatgtat tctcttatac tttgtttacc tagcaatctt ttttttaaat    180
taaaataaat atgcggttta gatatgaaac tacccaacaa atttaacatt ttaaacgttc    240
ataacgtaaa acgacgtcgt tatagacaca tattttccat gtgtctgctg acttatcatc    300
ttcacggagt tgactaacac ccgttacttt gactctgaat tttgtacttt ttcttaagtt    360
gaggtatgaa attcaaataa atatgcggtt aatatatgaa aatacccaac aaattttttt    420
ggatacgaaa atacactcag aaaatagtac gggtatgaaa ataccctttt cccgtatttg    480
atacatgtct aattcggttc aaataaaccg aatatgaaaa ttttcagttt tatttcggaa    540
gttaaataaa tctagataac cgacctgaaa aacccgagtc ccgaccgaac cgaaccgaaa    600
ttaaattcgg tttaattcgg aagcatttcc aaaaaccgaa attccctaaa accgaataac    660
ccgacccgat taaaccgatt tgccgaactc ccaggcctaa attcacactt ggcttagaaa    720
aactctttgt agatgttaaa attcggtaaa attaacctca ccaaagctaa ttattaccag    780
gtgaagaaag cattaaaatt tcaaagtgtg tatgacagag gttttagaaa gcgactgatg    840
tacggacata tcaacaactc ccctataaag atactcagct aaacacaaaa acagaatcta    900
ttctcaacac aacactaaag acaattgtac caaccacaca accacaagag agagaaaagt    960
gacc                                                                 964

Claims (19)

1.一种启动子，它包含选自以下的多核苷酸序列：
(a)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5序列的多核苷酸序列，
(b)包含(a)的多核苷酸序列片段的多核苷酸序列，其能够调节操作性连接的可转录多核苷酸分子的转录；和
(c)包含与(a)或(b)的多核苷酸序列具有至少70％序列同一性的多核苷酸序列，其能够调节操作性连接的可转录多核苷酸分子的转录。
2.权利要求1的启动子，其中所述启动子包含与(a)的多核苷酸序列或(b)的片段具有约90％同一性至约99％序列同一性的多核苷酸序列。
3.权利要求1的启动子，其中所述启动子包含与(a)的多核苷酸序列或(b)的片段具有约80％同一性至约89％序列同一性的多核苷酸序列。
4.权利要求1的启动子，其中所述启动子包含与(a)的多核苷酸序列或(b)的片段具有约70％同一性至约79％序列同一性的多核苷酸序列。
5.一种构建体，它包含与可转录多核苷酸分子操作性连接的权利要求1的启动子。
6.权利要求5的构建体，其中所述可转录多核苷酸分子是农学目标基因。
7.权利要求5的构建体，其中所述可转录多核苷酸分子是标记基因。
8.用权利要求5的构建体稳定转化的转基因植物或其部分。
9.权利要求8的转基因植物，其中所述植物是选自以下的双子叶植物：烟草、番茄、马铃薯、大豆、棉花、油菜、向日葵和苜蓿。
10.权利要求8的转基因植物，其中所述可转录多核苷酸分子使所述转基因植物种子的含油量发生改变。
11.权利要求8的转基因植物，其中所述可转录多核苷酸分子使所述转基因植物种子的蛋白质品质发生改变。
12.权利要求8的转基因植物，其中所述可转录多核苷酸分子使所述转基因植物的微量营养素含量发生改变。
13.用权利要求5的构建体转化的转基因种子。
14.用权利要求5的构建体转化的转基因细胞。
15.来自权利要求13的转基因种子的油，其中所述油包含可检测核酸，所述核酸包含权利要求1的启动子。
16.来自权利要求13的转基因种子的膳食，其中所述膳食包含可检测核酸，所述核酸包含权利要求1的启动子。
17.一种制备植物油的方法，该方法包括以下步骤：
a)获取权利要求13的种子；和
b)从所述种子中提取油。
18.一种制备膳食的方法，该方法包括以下步骤：
a)荻取权利要求8的植物或其部分；和
b)从所述植物或其部分制备膳食。
19.一种制备食物或饲料的方法，该方法包括以下步骤：
a)获取权利要求8的植物或其部分；和
b)从所述植物或其部分制备食物或饲料。
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