CN110468135B

CN110468135B - 大豆节律性表达启动子GmPRR9b1及其应用

Info

Publication number: CN110468135B
Application number: CN201910809066.8A
Authority: CN
Inventors: 徐小冬; 谢启光; 王禹; 袁力
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2019-08-29
Filing date: 2019-08-29
Publication date: 2021-04-20
Anticipated expiration: 2039-08-29
Also published as: CN110468135A

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及大豆节律性表达启动子GmPRR9b1及其应用。本发明提供一种大豆近日节律性表达启动子GmPRR9b1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该启动子可驱动目标基因在持续光照条件下近24小时节律性表达，且表达峰值在下午，可用于在各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物中近24小时节律性表达目标基因，并使目标基因表达峰值出现在下午。

Description

大豆节律性表达启动子GmPRR9b1及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及大豆近日节律性表达启动子GmPRR9b1及其应用，该启动子的表达峰值出现在下午。

背景技术

环境中光照、温度等条件随着地球自转产生昼夜节律性变化，生物钟(Circadianclock)是生物适应外界环境节律性变化的重要调控机制。生物钟调控的节律具有三个主要特性：一是内源性，二是可以被光温等环境信号驯化和重置，三是具有温度补偿现象。植物生物钟分为输入途径、核心振荡器和输出途径三个部分。输入途径主要包括光、温度和营养等环境信号；生物钟核心振荡器是多重“转录-翻译反馈调控环路”构成的精细调控机制；输出途径包括基因的节律性表达、蛋白的修饰、下胚轴节律性伸长和胁迫响应等过程，涉及植物生长发育和代谢等众多生物学进程。

植物生物钟核心组分可以直接或以复合体形式结合靶基因启动子区DNA序列，调控基因的转录。已有报道拟南芥CCA1可以结合EE和CBS顺式作用元件，其主要发挥转录抑制的活性；ChIP-seq实验结果表明，在持续光照条件下CCA1可以结合在超过1000个基因的启动子区。CCA1的靶基因参与众多生长发育生物过程和胁迫响应，表明CCA1在调控基因转录和植物生长发育及抗逆方面发挥重要功能。清晨表达的RVE8同样可以结合EE顺式作用元件，其可以激活靶基因的表达。

目前植物生物钟组分在调控农作物等植物的生长发育和胁迫应答过程中的功能机制和应用仍有待进一步研究，因此，开发植物节律性表达启动子对于调控植物基因的表达和植物的节律性具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供大豆近日节律性表达启动子GmPRR9b1，该启动子的表达峰值出现在下午，可用于在植物中近日节律性表达目标基因。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供大豆近日节律性表达启动子GmPRR9b1，其具有如下任一种核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸所获得的具有同等功能的由(1)衍生的核苷酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少70％同源性，且具有同等功能的由(1)衍生的核苷酸序列；优选地，所述同源性为至少80％；更优选为至少90％；

(4)在严格条件下能够与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

大豆GmPRR9b1基因(基因号：Glyma07g05530)的功能和表达调控机制目前尚不明确，本发明发现大豆GmPRR9b1基因的上游序列可调控基因呈现近日节律性表达趋势，但是，选取GmPRR9b1基因上游不同长度的序列片段，其驱动基因节律性表达的相位和表达强度明显不同。本发明通过大量筛选和验证实验发现序列如SEQ ID NO.1所示的启动子可高效驱动基因呈现明显的近日节律性表达，且表达峰值在下午。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开序列如SEQ ID NO.1所示的启动子GmPRR9b1，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到启动子GmPRR9b1的突变序列。具体地，这种突变方式可为如下至少一种：将第120位的C取代为T，将第131位的A取代为T，将第182位的T取代为A。

第二方面，本发明提供含有所述启动子GmPRR9b1的表达盒或载体。

本发明中，所述含有启动子GmPRR9b1的表达盒可以为在启动子GmPRR9b1的下游可操作地连接任意目标基因序列得到的表达单元。

本发明中，所述含有启动子GmPRR9b1的载体可以为克隆载体、表达载体、整合载体或转座子等任意本领域已知的载体，只要含有启动子GmPRR9b1的载体均在本发明的保护范围内。

第三方面，本发明提供含有所述启动子GmPRR9b1或所述表达盒或所述载体的宿主细胞、工程菌或转化植物细胞。

本发明中，所述工程菌包括但不限于大肠杆菌、农杆菌等。

上述转化植物细胞为非繁殖性植物细胞。

第四方面，本发明提供所述启动子GmPRR9b1或所述表达盒或所述载体或所述宿主细胞、工程菌或转化植物细胞在调控基因近日节律性表达中的应用。

上述调控基因近日节律性表达可为使得基因的表达呈现近日节律性或提高基因的近日节律性表达水平。

第五方面，本发明提供所述启动子GmPRR9b1或所述表达盒或载体或所述宿主细胞、工程菌或转化植物细胞在植物近日节律性调控中的应用。

第六方面，本发明提供所述启动子GmPRR9b1或所述表达盒或载体或所述宿主细胞、工程菌或转化植物细胞在制备转基因植物或植物种质资源改良中的应用。

本发明中，所述植物包括作物、林木、蔬菜、花卉或牧草。

优选地，所述植物为作物。所述作物包括但不限于大豆、玉米、水稻、棉花等。更优选地，所述植物为大豆。

第七方面，本发明提供一种调控基因近日节律性表达的方法，其为将所述基因可操作性地连接于所述启动子GmPRR9b1的下游，以启动子GmPRR9b1驱动所述基因的表达。

第八方面，本发明提供一种调控植物近日节律性的方法，其为将含有启动子GmPRR9b1的表达盒或载体导入植物中，驱动植物基因的近日节律性表达。

第九方面，本发明提供用于特异性扩增所述启动子GmPRR9b1的引物，其具有如SEQID NO.2-3所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO.2：正向引物：5’-AGATCTCTTTAGCAGATTTG-3’；

SEQ ID NO.3：反向引物：5’-ACCATCCGCGGCAGAAACCTC-3’。

第十方面，本发明提供含有如SEQ ID NO.2-3所示的引物的试剂盒。

本发明的有益效果至少包括：本发明首次分离了大豆基因GmPRR9b1的启动子，该启动子具有驱动基因进行近24小时节律性表达的功能，且能够使得基因的表达峰值在下午。GmPRR9b1启动子可用于在各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物中近日节律性表达目标基因，并使目标基因的表达峰值出现在下午，在植物的节律性调控、具有优良性状的转基因植物构建和育种中具有较高的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例2中pH2GW7Δ-GmPRR9b1:LUC在大豆发状根中表达的生物发光信号检测结果；其中，A为发状根明场成像；B为发状根的生物发光成像；C为明场和生物发光成像重叠的结果。

图2为本发明实施例2中pH2GW7Δ-GmPRR9b1:LUC在大豆发状根中表达的节律性分析结果；其中，A为节律性表达的曲线图；B为节律性表达的周期分析。

图3为本发明实施例3中利用qRT-PCR检测大豆叶片和发状根中大豆GmPRR9b1基因节律表达；其中，Leaves代表叶片，Hairy roots代表发状根。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，其中，pENTR-LUC质粒可购自addgene(https://www.addgene.org/17473/)。

实施例1大豆GmPRR9b1启动子的克隆

利用正向引物5’-gttgagAGATCTCTTTAGCAGATTTG-3’(SEQ ID NO.4)和反向引物5’-ctctggtgACCATCCGCGGCAGAAACCTC-3’(SEQ ID NO.5)从大豆基因组中PCR扩增获得长度为2916bp的GmPRR9b1启动子，经测序验证，GmPRR9b1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。为方便后续与载体连接，PCR产物两端分别带有Bgl II和BstE II的酶切位点及保护碱基。

上述PCR扩增体系(总体积为20μl)的组成如下：

PCR扩增程序如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃3min，共28个循环；72℃10min。

实施例2利用大豆GmPRR9b1启动子驱动LUC基因的表达

将实施例1中PCR克隆得到GmPRR9b1启动子的切胶回收产物用Bgl II和BstE II双酶切。将载体pENTR-1A-LUC⁺(为便于连接目的片段，pENTR-1A-LUC⁺为在质粒pENTR-LUC的基础上修改多克隆位点得到，参见Xie Q,et al.(2014)LNK1 and LNK2 aretranscriptional coactivators in the Arabidopsis circadian oscillator.PlantCell 26(7):2843-2857.)用Bgl II和BstE II双酶切，载体酶切片段回收后与GmPRR9b1启动子的回收片段用T4 DNA连接酶(Thermo公司，货号EL0014)连接。获得中间载体pENTR-GmPRR9b1:LUC，再利用LR反应试剂盒(Thermo公司，货号11791019)将其重组至植物表达载体pH2GW7Δ(Xie Q,et al.(2014)LNK1 and LNK2 are transcriptional coactivatorsin the Arabidopsis circadian oscillator.Plant Cell 26(7):2843-2857.)，并转化至大肠杆菌DH5α中扩繁，获得重组植物表达载体pH2GW7Δ-GmPRR9b1:LUC。

大肠杆菌感受态细胞的转化和载体鉴定的具体操作如下：

(1)配置含抗生素的LB固体培养基；

(2)将超低温冰箱中保存的感受态细胞在冰浴中融化，加入5μl连接产物或LR反应产物，轻轻混匀，冰浴中静置25分钟；

(3)42℃水浴锅中热激90秒，然后立即在冰浴中静置5分钟；

(4)加入500μl LB液体培养基，37℃摇床振荡培养1小时(转速为150rpm)；

(5)取100μl细菌恢复培养液均匀涂于筛选培养基上，37℃倒置培养约15小时，挑取3个单菌落摇培；

(6)提取质粒后酶切鉴定并测序。

将鉴定正确的重组植物表达质粒转化发根农杆菌K599，得到阳性转化发根农杆菌K599。

利用发根农杆菌介导的转化方法，将pH2GW7Δ-GmPRR9b1:LUC转入大豆WS82，通过生物发光信号筛选获得转化pH2GW7Δ-GmPRR9b1:LUC的发状根(图1)。

发根农杆菌介导大豆转化的具体方法如下：

(1)取出氯气熏蒸法灭菌12个小时的大豆种子，置于超净工作台吹净剩余氯气后，用无菌的超纯水浸泡约16小时，备用；

(2)挑取带有pH2GW7Δ-GmPRR9b1:LUC的发根农杆菌K599单克隆在试管中用液体YEP培养基培养，再转至锥形瓶中振荡培养至菌液OD₆₀₀约为1.0。4000rpm离心10分钟收集菌体，重悬于转化介质(1/10X Gamborg B₅盐,30g/L蔗糖,3.9g/L MES,pH 5.4.灭菌后加入40mg/L乙酰丁香酮)中；

(3)切下吸涨后大豆的胚根，以下胚轴为外植体，将外植体在重悬菌液中浸入30分钟，完成侵染后在滤纸上吸干浸染液，将侵染后的大豆外植体置于共培养培养基(1/10XGamborg B₅盐,30g/L蔗糖,3.9g/L MES,4.25g/L琼脂,pH 5.4.灭菌后加入Cysteine400mg/L,and 40mg/L乙酰丁香酮)上避光培养3天；

(4)将共培养后的大豆外植体的下胚轴插入发根诱导培养基(1X Gamborg B₅盐,30g/L蔗糖,and 0.59g/L MES,7g/L琼脂，pH5.7.灭菌后加入Cefotaxime 100mg/L)中，长日照条件培养10-14天诱导发根。

对筛选得到的转化pH2GW7Δ-GmPRR9b1:LUC的发状根在25℃、持续光照条件下连续检测LUC活性，转化株的LUC生物发光检测方法如下：

(1)将转化pH2GW7Δ-GmPRR9b1:LUC的发状根从外植体上切下，于12.5μM萤火虫荧光素中浸泡1分钟，使用生物发光成像仪检测生物发光；

(2)将筛选出的生物发光信号较强的发状根切为约1cm小段，放入含有固体培养基的96孔板中，每孔加入40μl萤火虫荧光素酶底物(1.25mM)，在25℃、持续光照条件下使用TopCount生物发光检测仪连续检测生物发光信号。

检测结果如图2所示，GmPRR9b1启动子驱动LUC基因在大豆的根中节律性表达(图2的A)。对发光检测数据进一步分析发现，GmPRR9b1启动子节律性表达的周期约为26小时，在下午出现表达峰值(图2的B)。

上述结果表明，GmPRR9b1启动子可用于在各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物中驱动目标基因进行近24小时基因节律性表达，并使得其表达峰值出现在下午。

实施例3大豆GmPRR9b1基因的节律性表达检测

利用qRT-PCR检测大豆叶片和发状根中大豆GmPRR9b1基因的表达情况，结果如图3所示，在持续光照条件下，大豆叶片和发状根中GmPRR9b1基因均呈现近24小时节律性表达，且表达峰值出现在下午，表明GmPRR9b1启动子可驱动植物基因进行近24小时基因节律性表达，并使得其表达峰值出现在下午。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 河南大学

<120> 大豆节律性表达启动子GmPRR9b1及其应用

<130> KHP191114326.8

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2916

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agatctcttt agcagatttg gaaatgtggt tagtgcaaga gtgttgcatg attttaaaca 60

agggaacagc cgagtctatg cctttctctc ctttcaatca gaggcagaac gtgatgcagc 120

aatgtctctc aatggaacag taaaatctgc ttccaaccac tttatgattt tgtttcattt 180

gttactgttt tttttaatta gtttggtctt tcttgcagga atattatgga cgtacactaa 240

tcgttaaaga gggtgtagag aggagtgagg actgagcctt aactggagct ttagtgtctg 300

cataatgatg gcagcaattt tggtttttta catgaatgaa gacttctagt gtgtatagct 360

gaggcatatt tgtgggactt cttcctgaac tagaaaatgc tatatcaaag aagaggtgag 420

cctgacattt cggcagttca gtaaaaatat ggattcattc tattttactt ctcttgtatt 480

tcaagttgca gtgagtgata tcaaagtatt gtagttgagt cagtttgagt tttgaattta 540

accatggcat gaatactact accattgcta caactgttgc agagaattgt gaaaatgggg 600

aagtgaataa ccttatgcag agtaaagcta ttacactaag taacagatgc cttatatagg 660

tcatcacaat ggcatgtgtg attgtgttta gaaatgcgtt tgcaagacaa tttatctcgt 720

ccaatggcta aaaaacacag aaactataat taatagtctg tttggattgg cgtctcaact 780

cttaagcata atgcttctgt gtgttttttt taaaaaaaac attttatgtg atttacatta 840

aaatgtggct cctcaactcg gatccaaaca cgctgtaagt agtttcctgt gagacgtgaa 900

aaatcacata aaatatattt ctagaagcat atccaaacat gctgtgaata gccctgtaac 960

agtagttcga gttggatata atagcagctt tgcttttcta acattggcgt ggaagtagga 1020

aaaactgtgc tttctagcta gaccattgaa gactttttcc tttatacttt ctcagcaaca 1080

cacgataaac aggttaaact tggttctata aggatgacat tatcacaagc ataggatatt 1140

attcaataaa gaattttatg ataaatatta attgctaatt tgttaaattt tattaggagc 1200

tcacaagact tctctctctc ctttttttcc cttcacacta agtcaacttt atatcttttt 1260

ggtgtattta ttttgaagga gaaaaataat atacaaaaga aattttatat ttattctata 1320

gaattcacat cttttacaca ttattttaat ttaaaatttt ctctttcatt tctctcttct 1380

aaactaaata catccttaga atgcatttgt taatatctat cacttttaat aactttttta 1440

tagtaaatta tgaatagcta aaaataatat tatataataa atacataata taaattattt 1500

actataaatt taaaatataa tttatatgtt taaattattg caaataaaaa aatattacta 1560

aattatttat aatataattt acatatttaa aaatatataa attttagtta tataaaataa 1620

atatttatta tgtgaaatta aaatatttat ttctattaac aaaaaaatat actaatctat 1680

gtcttgtcta tacacatgtc atcaatctat atactgtatg agctactgtt tgtttttttt 1740

aatctttttc cgctttacta ttttcccttc tcttttttcc ttttcctcct tttctctccc 1800

tggccatgca tatgcaggaa ctgcctagtt cttttttttc ttttccgagg gagagaacac 1860

tgcccagttc caattaaact aaacaacgtg caacttaaat ataagcttaa ttattaattt 1920

gattcgtacc ttattttaaa tagttgaatt tggtatttaa attaaaaaaa ttcatcaaat 1980

ttttataaat aaattaattt agtctttaaa tttttaagag attcaattta atcttaaaat 2040

tagaaaaaga aaaaaaacaa atcaatttaa tctacaaatt attttaaata attcttgttc 2100

ttaagtttta aaaattttaa aaataaattg actcaatttt aagaatttga gaatcaaatt 2160

aaatttttaa atttttttaa gaataaatta atttagttta aaaatttgag gatcaaattg 2220

aatcttttaa aaatcaaatt aagtcattta aaataattta gaaaataaat taaattgtta 2280

aaaataatta aacctaaata taattaatgt agcaaaaaga gaatgtgaaa atgaagaaag 2340

gaacaagaaa aaaaactgaa ttaaatttgg gatgctccac gtgttaggct gtacaccacg 2400

agatcaaagt attataaaat aaaaaccgga tatgactgtg cagaaaaata tcggccggga 2460

gagaagacgt agcgtcgcca catgtccatt gggtggaccc catgtgcaaa tattaaaata 2520

ataacggatg gttgaaatgg tgccacgtca tgacgagagt agcgatgatc tagtgaggag 2580

attttggtgg gaagatattt tcgacgattt tcgcggttgt gggcgaaagc tggctgccag 2640

cgatagtgaa tcagaatcgt aagctcgaca aagaagcaag caagtaaagg gcggtttcaa 2700

tttttttatt atatatattg aggatgaagt caatttcatt tactctgttt tcttcttcgt 2760

ttggttcctt gtgatcgatt agggttatta ttctttgtgg ttgcggaacg aagcatgctg 2820

ttgctgttcg agaatggatg agttgaacgg cgccatgacg acggagaata gcaatgcgga 2880

ggtggttcga tgggagaggt ttctgccgcg gatggt 2916

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agatctcttt agcagatttg 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

accatccgcg gcagaaacct c 21

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gttgagagat ctctttagca gatttg 26

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctctggtgac catccgcggc agaaacctc 29

Claims

1.大豆近日节律性表达启动子GmPRR9b1在调控基因在大豆中近日节律性表达中的应用，所述启动子GmPRR9b1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.大豆近日节律性表达启动子GmPRR9b1、含有所述启动子GmPRR9b1的表达盒或载体、含有所述启动子GmPRR9b1的工程菌在大豆近日节律性调控或大豆种质资源改良中的应用，所述启动子GmPRR9b1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.大豆近日节律性表达启动子GmPRR9b1、含有所述启动子GmPRR9b1的表达盒或载体、含有所述启动子GmPRR9b1的工程菌或转化植物细胞在制备转基因大豆中的应用，所述启动子GmPRR9b1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种调控基因在大豆中近日节律性表达的方法，其特征在于，将所述基因可操作性地连接于大豆近日节律性表达启动子GmPRR9b1的下游，以启动子GmPRR9b1驱动所述基因的表达，所述启动子GmPRR9b1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。