CN1609216A - 光诱导表达Gacab启动子及不同区段的表达功能 - Google Patents

Abstract

本发明分离获得了金华中棉捕光叶绿素a/b蛋白复合体基因Gacab编码区5′上游的表达调控序列1009bp(SEQ ID NO：1)。对该表达调控序列及不同区段的系统分析发现，其中－199bp～－1bp为Gacab基因的基本启动子，－504bp～－199bp间包含正调控元件，－1009bp～－504bp间包含负调控元件。因此：1)其5′端缺失的504bp片段至少在单子叶植物中与CaMV35S启动子一样地有用；2)通过对Gacab启动子的进一步修饰(包括插入、缺失、置换、重复等)或与其它启动子融合，可望获得良好的光诱导和叶片特异表达启动子，这在植物基因工程中的应用中具有重要的实践意义和巨大的市场经济价值。

Description

光诱导表达Gacab启动子及不同区段的表达功能

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域。更具体地说，本发明涉及来自金华中棉Gacab基因5′上游的启动子及其不同区段的表达调控序列，由其构建的植物表达载体及其驱动外源基因在植物中的瞬时表达。本发明还涉及用该植物表达载体转化的宿主细胞或愈伤组织以及由其制备的转基因植物。

背景技术

光是影响植物生长发育的重要因子之一，光照条件在很大程度上影响着高等植物的形态建成、细胞和亚细胞分化及基因表达。如拟南芥能够根据不同的光照条件，将环境和内源信号结合调控基因的表达，通过两条显著不同的发育途径即暗形态建成(skotomorphogenesis)和光形态建成(Photomorphogenesis)，表现出不同的基因表达模式和多态性，从而达到最佳生长状态(von Arnim & Deng.Rev.Plant Physiol.Plant Mol Biol.1996，47：215-243)。

植物光形态建成同时需要大量结构、代谢和调控基因的表达。其中一部分基因在光下生长的幼苗中表达很高，但在暗中生长的幼苗中表达很低甚至不表达，称之为光诱导基因(light-inducible gene)。由于光质、光量、光周期和光的方向等因素的变化，光诱导基因的表达水平会有很大差异。这些基因的表达同时具有组织特异性，一般在叶中的表达很高，在根中检测不到。光诱导基因的转录调控是光调控植物生长发育的重要机制之一(Millar & Kay.Proc Natl Acad Sci USA.1996，93：15491-15496；Terzaghi &Cashmore.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol.1995，46：445-474；Tobin& Kehoe.Semin Cell Biol.1994，5：335-346)，因此研究植物体中特异表达的光诱导基因调控序列及其所包含的光应答元件(light responsive element，LREs)，有助于揭示光如何调控植物生长发育的机理。

植物捕光叶绿素a/b蛋白复合体(chlorophyll a/b binding protein，CAB)基因是一类典型的光诱导型基因。cab的转录可以被远红光激活，参与转录调控的光信号主要由光敏色素家族的红光受体传导。Millar和Kay(Millar& Kay.Proc Natl Acad Sci USA.1996，93：15491-15496)研究拟南芥(Arabidopsis thaliana)cab表达证明，除了光受体传导的光信号，拟南芥cab的准确表达还受昼夜节律和来自发育系统信号的协同调控。业已证明小麦(Triticum aestivum)、矮牵牛(Petunia hybrida)及拟南芥等植物的cab基因的启动子表现为光依赖性和组织特异性，并对启动子中包含的顺式元件进行了分离和功能研究(Cecillia，et al.Plant J.1993，3：509-518；Gidoni，et al.Mol Gen Genet.1989，215：337-344；Ha & An.Proc Natl Acad Sci USA.1988，85：8017-8021；Degenhardt & Tobin.Plant Cell.1996，8：31-41；Yadav，et al.Plant J.2002，31：741-753)。在拟南芥cab1基因5’上游1396bp的序列中，至少存在三个光依赖性的顺式作用元件，其中两个位于-253～-158 bp和-1396～-766bp，是启动子光诱导和组织特异性必须的，-321～-253 bp则具有增强子的作用(Ha & An.Proc Natl Acad Sci USA.1988，85：8017-8021)。Cecillia等(Cecillia，et al.Plant J.1993，3：509-518)发现小麦cab1启动子中268bp DNA片段(-357～-89bp)是一个光反应和组织特异性的增强子，由三个序列截然不同的元件组成。

在未来植物基因工程研究中，为了更经济有效的发挥外源基因的作用，或避免基因产物对受体生物及环境产生副作用，需要外源基因只在特定的组织或器官中定时、定量地表达，研究组织特异表达和诱导型启动子已成为现代分子生物学研究的热点之一。

发明内容

本发明从金华中棉(Gossypium arboreum var.jinhua)(中国农业科学院国家种质库，#00008200)中分离获得了1009bp的中棉Gacab基因5’上游的表达调控序列，用其构建植物表达载体并转入植物，证明来自中棉Gacab基因的启动子具有光诱导和叶片特异性表达的功能。

因此，本发明克隆了金华中棉(下文中除非特别说明，“中棉”和“金华中棉”都指金华中棉)光诱导基因cab的启动子，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明涉及来自中棉Gacab基因的启动子的光诱导和叶片特异性表达及不同区段驱动β-葡糖醛酸苷酶(GUS)报告基因在植物中瞬时表达的特性，它有望为植物基因工程提供更佳的启动元件。

根据本发明的一个方面，本发明根据已知的陆地棉(Gossypium hirstum)cab基因编码区序列(GenBank登录号：X54090)，利用加接头法，通过PCR从中棉基因组中扩增出中棉Gacab基因5’上游的表达调控序列，并将其不同长度的片断克隆到植物表达载体上，以农杆菌介导的叶盘法转化烟草品种NC89，获得转基因植株。通过检测GUS基因的表达，发现来自中棉Gacab基因的启动子驱动GUS基因在转基因烟草中具有光诱导和叶片特异性表达的功能。

在根据本发明此方面的一个优选实施方案中，其中所说的中棉Gacab基因启动子指金华中棉光诱导基因cab全长启动子，具有如SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其功能等同物或变异体，其中所述的功能等同物或变异体包含相应于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行的置换、加入、重复或缺失。对本发明提供的核苷酸序列进行缺失、添加和/或取代一个或几个核苷酸，定义为功能性衍生物，这种功能性衍生物可通过本领域内熟知的技术如定点突变、人工合成等方法产生，它们仍具有通过本领域内熟知技术可验证的功能。

根据本发明此方面的这一优选实施方案，其中所构建的植物表达载体为pcab1000，农杆菌介导的叶盘转化法及转基因植株的GUS检测按本领域的已知技术进行(参见Horsch，et al.1985，227：1229-1231；Jefferson，et al.EMBO J.1987，6：3901-3907)。

对根据本发明此方面的这一优选实施方案，所用的转基因受体植物是水稻(Oryza sativa)或烟草(Nicotiana tabacum)，但并不限于水稻或烟草，它可以是任一裸子植物或被子植物，如单子叶植物和双子叶植物，并包括植物细胞、愈伤组织、整株植株及其部分。

本发明的中棉Gacab基因启动子是棉属植物中分离获得的第一个cab启动子，因此，本发明除构建了1009bp全长启动子外，还分别构建了199bp、504bp、779bp的5’端缺失型中棉Gacab启动子，通过检测其驱动GUS基因的表达发现：199bp、504bp、779bp和1009bp的中棉Gacab启动子都可以驱动GUS基因在水稻愈伤组织中瞬时表达，其中504bp中棉Gacab启动子表达强度明显高于CaMV35S启动子。

根据本发明此方面的一个优选实施方案，其中所说的779bp、504bp、199bp的5’端缺失型中棉Gacab启动子，分别具有如SEQ ID NO：2、3、4所示的核苷酸序列或其功能等同物或其变异体，其中所述的功能等同物或变异体包含分别对应于SEQ ID NO：2、3、4所示的核苷酸序列进行的置换、加入、重复或缺失。

根据本发明此方面的这一优选实施方案，其中所说的779bp、504bp、199bp的5’端缺失型中棉Gacab基因启动子均以PCR法扩增获得，构建的相应植物表达载体分别为pcab800、pcab500及pcab200。

根据本发明的另一方面，本发明通过分析中棉Gacab全长启动子及不同的5’端缺失型启动子驱动GUS基因在水稻愈伤组织中的瞬时表达，推测相应于SEQ ID NO：1中的-199bp～-1bp为Gacab基因的基本启动子，-504bp～-199bp间包含正调控元件，-1009bp～-504bp强烈抑制基因表达，包含负调控元件。

在根据本发明此方面的一个优选实施方案中，其中可用本发明的启动子驱动的基因为GUS基因，但不限于GUS基因，它可以是抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗除草剂、抗虫、抗逆以及与产量或质量性状有关的任一目的基因。

根据本发明的另一方面，本发明根据以上实验推测：通过对中棉Gacab启动子的进一步修饰，包括置换、加入、重复、缺失，或与其他启动子融合，可望获得对植物基因工程具有重要意义的高效的光诱导特异表达启动子。

因此，根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种来自中棉Gacab基因的表达调控元件，其特征在于它含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或其片断，或其片断以任何方式的组合，或其功能等同物或变异体，其中所述的功能等同物或变异体包含对相应于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行的置换、加入、重复或缺失。该表达调控元件还可含有其他启动子，并与之连接形成一种融合启动子。优选的是，本发明所述的来自中棉Gacab基因的表达调控元件是含有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的启动子。更优选的是，本发明所述的来自中棉Gacab基因的表达调控元件是含有SEQID NO：3所示的核苷酸序列的启动子。还有更优选的是，本发明所述的来自中棉Gacab基因的表达调控元件是含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的启动子。甚至更优选的是，本发明所述的来自中棉Gacab基因的表达调控元件是含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的启动子。另外，本发明所述的来自中棉Gacab基因的表达调控元件可以是含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列片断-1009bp～-504bp的负调控元件。此外，本发明所述的来自中棉Gacab基因的表达调控元件还可以是含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列片断-504bp～-199bp的正调控元件。

根据本发明的第二个方面，本发明提供了一种植物表达载体，其特征在于它含有上述任一种来自中棉Gacab基因的表达调控元件。优选的是，本发明所说的植物表达载体还含有目的基因的编码序列，其中该目的基因选自抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗除草剂、抗虫、抗逆以及与产量或品质性状有关的结构和调控基因。优选的是本发明所述的植物表达载体是图3-1所示的质粒pcab1000。更优选的是，本发明所述的植物表达载体是图3-2所示的质粒pcab800。本发明另一优选的植物表达载体是图3-3所示的质粒pcab500。本发明还有另一优选的植物表达载体是图3-4所示的质粒pcab200。

根据本发明的第三个方面，本发明提供了一种转化的宿主细胞，其特征在于它含有上述任一种植物表达载体。其中该宿主细胞可来源于任何一种裸子植物和被子植物。最优选的是，该宿主细胞来源于水稻或烟草。

根据本发明的第四个方面，本发明提供了一种转化的植物愈伤组织，其特征在于它含有上述任一种植物表达载体。其中该植物愈伤组织可来源于任何一种裸子植物和被子植物。最优选的是，该植物愈伤组织来源于水稻或烟草。

根据本发明的第五个方面，本发明提供了一种制备转基因植物的方法以及由此制备的转基因植物，包括从上述任一种转化的植物细胞或上述任一种转化的愈伤组织再生成转基因植物。

附图说明

图1：中棉cab基因启动子PCR产物电泳图，大小为1009bp。其中，M：λDNA/EcoR I+Hind III；1：中棉cab启动子产物；

图2：中间载体pcab1、pcab0.8、pcab0.5及pcab0.2的构建；

图3：植物表达载体pcab1000、pcab800、pcab500、pcab200的构建及质粒图谱；

图3-1、图3-2、图3-3、图3-4分别表示pcab1000、pcab800、pcab500、pcab200植物表达载体的构建流程及基因表达盒；

图4：不同长度的金华中棉cab启动子(Gacab P)驱动gus基因在水稻愈伤组织中瞬时表达的愈伤组织照片。其中，a、b、c、d和e分别表示转pcab200、pcab500、pcab800、pcab1000及pBin121的水稻愈伤组织的GUS组织化学检测结果。pcab200、pcab500、pcab800、pcab1000四种不同长度的Gacab P都能驱动gus基因的表达，但表达水平有差异，其中转pcab500愈伤组织的GUS表达水平最高，且明显高于pBin121中35S启动子的表达强度，pcab200、pcab800和pcab1000的表达强度减弱。因pcab200仅包含TATA box和CAAT box，故可认为-197bp～-1bp为Gacab的基本启动子；-504bp～-197bp间包含Gacab启动子的正调控元件，增强基因的表达；-1009bp～-504bp间存在负调控元件，抑制启动子的活性；

图5.金华中棉Gacab启动子驱动gus在烟草不同器官中稳定表达的GUS组织化学分析照片。其中，a：根；b：叶片；Gacab P驱动gus基因在叶片表达，在根中gus基因不表达，表现明显的组织特异性；

图6.转基因烟草经光、暗培养后金华中棉Gacab启动子驱动gus在烟草叶片中表达的照片。其中，a和b表示光诱导条件下转基因烟草叶片中的GUS组织化学分析；c和d表示暗培养条件下转基因烟草叶片中的GUS组织化学分析暗处理的叶片中没有GUS出现，而在光处理的叶片中有gus基因的高效表达，表现明显的光诱导特性。

具体实施方案

下面提供如下实施例进一步说明本发明，应理解本文提供的实施例仅仅是对本发明技术方案的举例性解释，而不构成对本发明范围的限制。本领域的技术人员在不偏离本发明精神的前提下可对本发明的技术方案作出各种修改或变化，这些修改或变化应在本发明要求保护的范围内。

实施例1：金华中棉Gacab基因启动子的克隆及序列的测定

1.1金华中棉Gacab基因启动子的克隆

取1～3克金华中棉鲜叶片，加等量Al₂O₃用液氮研磨，将粉末置于50ml离心管中，加入20ml DNA提取缓冲液(100mM Tris.HCl pH8.0，500mM NaCl，10mMβ-巯基乙醇，50mM EDTA pH8.0)，剧烈振荡1分钟，加入4ml 10％ SDS，轻轻混匀，于65℃加热10～20分钟，至颜色翠绿，加入冰冷5M KAc 4ml，冰上放置30分钟，然后在4℃、12000rpm离心15分钟，取上清，用0.6倍异丙醇沉淀后，用Rnase处理，纯化得到基因组DNA备用。

按照TaKaRa LA PCR^TM in vitro Cloning Kit(TaKaRa公司，产品目录号为#DRR015)说明书，取上述制备的基因组DNA 2.5μg，用Hind III 37℃彻底消化3～6h后，将整个消化产物用乙醇沉淀回收，溶于10μL去离子水中，与具有如下序列的Hind III衔接头(adaptor)(TaKaRa LA PCR^TM invitro Cloning Kit中含有该衔接头)连接，以此为模板，用具有如下序列的引物Cassette primer C1/p-R1和Cassette primer C2/p-R2进行两轮巢式PCR，其中引物Cassette primer C1和Cassette primer C2由TaKaRa LAPCR^TM in vitro Cloning Kit提供，引物p-R1和p-R2为本发明根据已知的陆地棉cab基因编码区序列合成。

PCR引物：

HindIII adaptor：

5′HO GTACA TATTG TCGTI AGAAC GCGTA AIACG ACTCA CTATA GGGAG

A3′

3′CATGT ATAAC AGCAA TCTTG CGCAT TATGC TGAGT GATAT CCCTC

TTCGA OH 5′

Cassette primer C1：

5′GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA 3′

p-R1：5′AGAACTTCACTGCCTTACCGGCGAATGATG 3′

Cassette primer C2：

5′CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA 3′

p-R2：5′GAGCCATGGTTGTAGAGGCCATTGTGAAGC 3′

扩增条件为：94℃，30″，55℃，2′，72℃，1′，循环数30个。PCR获得约1kb片段(图1)，回收PCR产物连接到pMD18-T-vector(TaKaRa公司，产品目录号为#D5o4A)中，命名为pcabP(图2)。

1.2金华中棉Gacab启动子序列的测定

pcabP测序结果表明：PCR扩增所得金华中棉Gacab启动子的序列，从起始密码子ATG上游第一个碱基起，长度为1009碱基对(序列如SEQID No：1)。序列分析证实，中棉Gacab启动子与Genebank中所有登录序列都没有明显的同源性。

根据真核生物基因启动子结构的一般特征，CAAT box的序列为： C (T)A_2～5 G(T)NGA_2～4TT；TATA box 的序列为：T C(G)TATA T(A)A_1～3 C(T)A。据此推测在Profilin2启动子的-86～-80处存在一个TATA box，在-142～-136处有一个CAAT box，见序列SEQ ID No：1。

实施例2：植物表达载体pcab1000及不同长度缺失启动子表达载体的构建

2.1中间载体pcab1、pcab0.8、pcab0.5及pcab0.2的构建

以pcabP质粒DNA为模板，根据实施例1中获得的金华中棉Gacab启动子的DNA序列设计具有如下序列的引物p-F1000/p-R、p-F800/p-R、p-F500/p-R和p-F200/p-R，分别进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃，30″，50℃，1′，72℃，1′，循环数30个。所获得的PCR产物用Hind III/BamHI双酶切处理，回收目的片段；同时用Hind III/BamH I双酶切处理pBluescriptII KS(+)(Stratagene公司，产品目录号为#212207)质粒，回收2.9kb的载体片段。将载体片段与目的基因片段连接，分别获得中间载体pcab1、pcab0.8、pcab0.5及pcab0.2(图2)。

PCR引物如下：

p-R：5′CT GGATCCGGTTGTAGAGGCCATTGTG 3′

        BamH I

p-F1000：5′GC AAGCTTGTCTAATAAATAATG 3′

         Hind III

p-F800：5′GC AAGCTTAGACCAACACCACTGACT 3′

        Hind III

p-F500：5′CT AAGCTTCAACATCAAGGGAGTTGT 3′

        Hind III

p-F200：5′CT AAGCTTGTGGATTAAAGATTGCC3′

        Hind III

2.2植物表达载体pcab1000和缺失启动子表达载体pcab200、pcab500、pcab800的构建

提取pcab1、pcab0.8、pcab0.5及pcab0.2质粒DNA，用Hind III/BamHI双酶切，分别回收约1.0kb、0.8kb、0.5kb及0.2kb的目的片段，用HindIII/BamH I酶切pBI121(CLONTECH，#6018-1)回收约11.5kb载体片段，将此载体片段与四种不同长度的目的片段连接，即以不同长度的金华中棉Gacab启动子取代CaMV35S启动子，得到pcab1000(图3-1)、pcab800(图3-2)、pcab500(图3-3)及pcab200(图3-4)。

至此获得了含有金华中棉Gacab启动子全长1009bp(序列如SEQ IDNo：1)(pcab1000)及779bp(序列如SEQ ID No：2)(pcab800)、504bp(序列如SEQ ID No：3)(pcab500)和199bp(序列如SEQ ID No：4)(pcab200)共四种不同长度启动子/GUS的植物表达载体。不同植物表达载体gus基因表达盒如附图3-1、图3-2、图3-3、图3-4所示。

实施例3：Gacab启动子/GUS基因的瞬时表达

3.1水稻愈伤组织的制备

用水稻品种中花11(中国农业科学院国家种质库，#ZD-03874)按Hiei等人(Hiei Y，et al.Plant Journal，6：271～282，1994)所述制备水稻愈伤组织。先将去壳的水稻种子用70％乙醇浸泡1min，再用1％次氯酸钠溶液灭菌30min，无菌水冲洗5次，置于MS(GIBCOBRL，产品目录号为#10632-040)培养基上26℃避光培养20d，将从成熟胚盾片处长出的愈伤组织剥下，进行继代培养，直至胚性愈伤组织出现。

3.2基因枪轰击水稻愈伤组织

提取pcab1000、pcab800、pcab500、pcab200及pBin121质粒DNA1μg，轰击基因枪采用BioRad公司生产的PDS-1000/He型基因枪，使用金粉直径为0.4～1.0μm，轰击用氦气压为7 584kPa，每皿用80μg金粉和1μg质粒DNA轰击20块左右的水稻愈伤组织，其他轰击条件参照Becker等人(Becker D，et al.Plant Journal，5：299～307，1994)的方法。水稻愈伤组织在MS培养基(Murashige T & Skoog F，Physiol Plant，15：473～497，1962)上25℃培养3天，以非转化的水稻愈伤组织和转pBin121的水稻愈伤组织为对照，研究不同长度中棉Gacab启动子驱动GUS基因的瞬时表达。

3.3水稻愈伤组织GUS瞬间表达检测

将转化愈伤组织浸入适量X-gluc(Sigma公司，产品目录号为#B6650)溶液(5mg X-gluc溶于1ml二甲基甲酰胺，继续加入pH7.0、浓度为50mM的NaPO₄至终体积为10ml)中，用石蜡膜(parafilm)封口，37℃避光放置过夜，镜检前，以FAA(50％酒精85毫升：福尔马林10毫升：冰醋酸5毫升)固定15min，之后分别用75％、85％、95％、100％乙醇脱色，除去色素。结果表明，四种不同长度的中棉Gacab启动子都能驱动gus基因的表达，但表达水平有差异，其中转pcab500愈伤组织的GUS表达水平最高，且明显高于pBin121中35S启动子的表达强度，与pcab500相比，pcab200、pcab800和pcab1000的表达强度减弱，非转化愈伤组织无GUS表达(图4)。

实施例4：烟草的转化及金华中棉Gacab启动子驱动GUS基因的稳定表达

4.1 LBA4404感受态细胞的制备

挑取LBA4404(CLONTECH公司，产品目录号为#6027-1)单菌落接种于5ml YEB(含链霉素100μg/ml，蔗糖5g+蛋白胨5g+牛肉膏5g+酵母提取物1g+MgSO₄.7H₂O 0.049g/L，pH7.2)中，28℃，250rpm培养过夜。吸取2ml菌落加入50ml YEB培养基中，继续培养至OD600值约为0.6。将菌液转至无菌离心管中，冰浴30分钟，5000rpm离心5分钟，用2ml 20mM的CaCl₂重悬菌体，按每管200μl分装于无菌小离心管中。

4.2重组质粒转入LBA4404细胞

在200μl LBA4404感受态细胞中分别加入2μg重组质粒pcab1000，置冰浴5分钟，然后转至液氮中冷冻8分钟，迅速于37℃水浴中温育5分钟后，加入800μl YEB培养基，28℃ 250rpm预培养4～5小时，然后涂铺含有卡那霉素(50μg/ml)的YEB固体平板，28℃培养24～48小时。长出的农杆菌菌落带有相应的转化质粒。

4.3烟草的遗传转化

(1)农杆菌的准备：28℃过夜分别培养带有植物表达载体的农杆菌50ml，5000rpm离心5分钟，收集菌体沉淀，用液体MS培养液洗涤一次，再用MS重悬至OD600＝0.2～0.4。

(2)浸染：取烟草品种NC89(Nicotiana tabacum L.cv.NC89)(中国农业科学院国家种质库，#00002293)无菌苗叶片，用刀切成边长约0.5厘米的小方块，在农杆菌悬液中浸泡5～10分钟，然后用灭菌滤纸吸干。

(3)共培养：将叶块摆放在不加抗生素的共培养培养基(MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L)中(上面垫两层滤纸)于25℃避光共培养3天。

(4)选择培养：将叶片继代到选择培养基(MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)中在光照培养箱中(光照12小时，黑暗12小时)培养至抗性芽的出现。

(5)抗性小苗的获得：将愈伤组织转移至生根培养基(MS+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)，每隔两周继代培养一次，最后种植到装有灭菌土壤的小塑料钵中。

4.4转基因烟草GUS稳定表达的检测

取再生植株顶部的第三个叶片和根，以非转基因烟草的叶片和根为对照，按实施例3.2所述方法进行GUS组织染色，结果显示，中棉Gacab启动子驱动gus基因在叶片特异地表达，在根中gus基因不表达，非转基因烟草不同器官中无GUS表达(图5)。

实施例5：转基因烟草经光、暗培养后中棉Gacab启动子驱动gus在烟草叶片中的表达

取实施例4中获得的10株转pcab1000的烟草植株，以非转基因烟草作对照，25℃暗培养6天，在顶部第三黄化叶上取样，按实施例3.2所述方法进行GUS检测，然后将烟草置于25℃、光照时间16h、光强20001x的光照条件下，培养6天，继续在同一叶片上取样，按实施例3.2所述方法进行GUS组织化学分析。结果表明暗处理的叶片中没有GUS出现，而在光处理的叶片中有gus基因的高效表达(图6)，光、暗处理的非转基因烟草叶片中均无GUS表达。

                               序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>光诱导表达Gacab启动子及其不同区段的表达功能

<160>4

<210>1

<211>1009

<212>DNA

<213>金华中棉(Gossypium arboreum var.jinhua)

<220>

<223>Gacab启动子核苷酸序列

<400>1

             AAGCTGTC TAATAAATAA TGTTAATGTT TATGGAAATG ATTATGTTTA-961

TGTTTCATCT TGTTTCTTGA TGAAGCCTAA TGAATCATAT AGTTTTCGAC ACTGATAATT-901

AGACTACTCG TGGGTATTTT TAGAAACTAT TAAGTCAATT ACATAATTAA ATTTTTGGGT-841

TTTTAAAAAT AAATTTCGAG TTTTCTTTAT AAGGGTTAAA AGGACGAGAC TTGGTATAAA-781

CTAGACCAAC ACCACTGACT AGTTGACATC AATTTAAAGT ATTTTGATAG TGCCGCAAAA-721

CAAATTAAGC CAGATTTTTA TTCGTAAGAT ATTTTACATT TATGTATTAT CAACCACTCA-661

AATCCTGTAA TTTGTATTTT TATGCTGCCA TGATTTCAGC ATCAATAAAC TTCACCAAAA-601

GAAAGGAAAA TCTATTTCAT ATGGCTCAAA GAAACTTCTT TCTATGAAAA CTCCATCTAT-541

TTTTCCATGA AAATGAAAAG GGAGGGAGAG AGAAAATCAA CATCAAGGGA GTTGTTTAAT-481

TTATCAAGTA ATATTTGTGT GTATTAATTA TAATCACTAA AAATATTGAT TGAATCACAA-421

GTGAAGATTT TATATTTAAT TCATAATTGA AAAAAATTTT AAACTTTATT TTTGAATTAT-361

TTTTCATACA AAACAATCCA TTTACCTGTT GTAGCATTGC TTCATTGTTC TAAACAAAAC-301

AAACAAAAAG GGTTCGAAAA TTTTCAACAG TCGAATTTCC GTCACTATGG TGGCCAAGCC-241

TATGATCCTT AAAAAATATT GGTAGCCTGT TAAGTGAAAT TTTGTGGATT AAAGATTGCC-181

AAGTGGACAT GCATGGCCAA CATCAAAATC TTGGAAGC TC CAATGAAATG AAAGATAGAG-121

                                       CAAT box

ATATTACGTA GATAAGGAAC CTTACTCTCA CCTT CCTATA TAATAAACGC ATCGGATTGC-61

                                     TATA box

CCCTTCAATC ACTCACCCAT CACCAACAAA ATCAACTGCT TCACAATGGC CTCTACAACC-1

<210>2

<211>779

<212>DNA

<213>金华中棉(Gossypium arboreum var.jinhua)

<220>

<223>5′端缺失型Gacab启动子核苷酸序列

<400>2

  AGACCAAC ACCACTGACT AGTTGACATC AATTTAAAGT ATTTTGATAG TGCCGCAAAA-721

CAAATTAAGC CAGATTTTTA TTCGTAAGAT ATTTTACATT TATGTATTAT CAACCACTCA-661

AATCCTGTAA TTTGTATTTT TATGCTGCCA TGATTTCAGC ATCAATAAAC TTCACCAAAA-601

GAAAGGAAAA TCTATTTCAT ATGGCTCAAA GAAACTTCTT TCTATGAAAA CTCCATCTAT-541

TTTTCCATGA AAATGAAAAG GGAGGGAGAG AGAAAATCAA CATCAAGGGA GTTGTTTAAT-481

TTATCAAGTA ATATTTGTGT GTATTAATTA TAATCACTAA AAATATTGAT TGAATCACAA-421

GTGAAGATTT TATATTTAAT TCATAATTGA AAAAAATTTT AAACTTTATT TTTGAATTAT-361

TTTTCATACA AAACAATCCA TTTACCTGTT GTAGCATTGC TTCATTGTTC TAAACAAAAC-301

AAACAAAAAG GGTTCGAAAA TTTTCAACAG TCGAATTTCC GTCACTATGG TGGCCAAGCC-241

TATGATCCTT AAAAAATATT GGTAGCCTGT TAAGTGAAAT TTTGTGGATT AAAGATTGCC-181

AAGTGGACAT GCATGGCCAA CATCAAAATC TTGGAAGC TC CAATGAAATG AAAGATAGAG-121

                                        CAAT box

ATATTACGTA GATAAGGAAC CTTACTCTCA CCTT CCTATA TAATAAACGC ATCGGATTGC-61

                                        TATA box

CCCTTCAATC ACTCACCCAT CACCAACAAA ATCAACTGCT TCACAATGGC CTCTACAACC-1

<210>3

<211>504

<212>DNA

<213>金华中棉(Gossypium arboreum var.jinhua)

<220>

<223>5′端缺失型Gacab启动子核苷酸序列

<400>3

                                        CAA CATCAAGGGA GTTGTTTAAT-481

TTATCAAGTA ATATTTGTGT GTATTAATTA TAATCACTAA AAATATTGAT TGAATCACAA-421

GTGAAGATTT TATATTTAAT TCATAATTGA AAAAAATTTT AAACTTTATT TTTGAATTAT-361

TTTTCATACA AAACAATCCA TTTACCTGTT GTAGCATTGC TTCATTGTTC TAAACAAAAC-301

AAACAAAAAG GGTTCGAAAA TTTTCAACAG TCGAATTTCC GTCACTATGG TGGCCAAGCC-241

TATGATCCTT AAAAAATATT GGTAGCCTGT TAAGTGAAAT TTTGTGGATT AAAGATTGCC-181

AAGTGGACAT GCATGGCCAA CATCAAAATC TTGGAAGC TC CAATGAAATG AAAGATAGAG-121

                                         CAAT box

ATATTACGTA GATAAGGAAC CTTACTCTCA CCTT CCTATA TAATAAACGC ATCGGATTGC-61

                                      TATA box

CCCTTCAATC ACTCACCCAT CACCAACAAA ATCAACTGCT TCACAATGGC CTCTACAACC-1

<210>4

<211>199

<212>DNA

<213>金华中棉(Gossypium arboreum var.jinhua)

<220>

<223>5′端缺失型Gacab启动子核苷酸序列

<400>4

                                             TTGTGGATT AAAGATTGCC-181

AAGTGGACAT GCATGGCCAA CATCAAAATC TTGGAAGC TC CAATGAAATG AAAGATAGAG-121

                                        CAAT box

ATATTACGTA GATAAGGAAC CTTACTCTCA CCTT CCTATA TAATAAACGC ATCGGATTGC-61

                                     TATA box

CCCTTCAATC ACTCACCCAT CACCAACAAA ATCAACTGCT TCACAATGGC CTCTACAACC-1

Claims (21)

1.一种来自中棉Gacab基因的基本启动子，其特征在于它由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列组成，或者是对所述序列进行一个或几个核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不变的序列。

2.一种来自中棉Gacab基因的启动子，其特征在于它含有权利要求1所述的基本启动子且由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列组成，或者是对所述序列进行一个或几个核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不变的序列。

3.一种来自中棉Gacab基因的启动子，其特征在于它含有权利要求1所述的基本启动子且由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列组成，或者是对所述序列进行一个或几个核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不变的序列。

4.一种来自中棉Gacab基因的启动子，其特征在于它含有权利要求1所述的基本启动子且由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成，或者是对所述序列进行一个或几个核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不变的序列。

5.一种来自中棉Gacab基因启动子的负调控元件，其特征在于它由SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列片断-1009bp~-504bp组成。

6.一种来自中棉Gacab基因启动子的正调控元件，其特征在于它由SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列片断-504bp~-199bp组成。

7.一种植物表达载体，其特征在于它含有权利要求1所述的来自中棉Gacab基因的基本启动子或权利要求5或6所述的来自中棉Gacab基因启动子的负调控元件或正调控元件。

8.根据权利要求7所说的植物表达载体，其特征在于它含有权利要求2-4任一项所述的来自中棉Gacab基因的启动子。

9.根据权利要求8所说的植物表达载体，其特征在于它还含有目的基因的编码序列。

10.根据权利要求9所述的植物表达载体，其特征在于所述的目的基因选自抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗除草剂、抗虫、抗逆以及与产量或品质性状有关的结构和调控基因。

11.根据权利要求7-10任一项所述的植物表达载体，其特征在于它是图3-1所示的质粒pcab1000。

12.根据权利要求7-10任一项所述的植物表达载体，其特征在于它是图3-2所示的质粒pcab800。

13.根据权利要求7-10任一项所述的植物表达载体，其特征在于它是图3-3所示的质粒pcab500。

14.根据权利要求7所述的植物表达载体，其特征在于它是图3-4所示的质粒pcab200。

15.一种转化的宿主细胞，其特征在于它含有权利要求7-14任一项所述的植物表达载体。

16.根据权利要求15的转化的宿主细胞，其特征在于该宿主细胞来源于任何一种裸子植物和被子植物。

17.根据权利要求16的转化的宿主细胞，其特征在于该宿主细胞来源于水稻或烟草。

18.一种转化的植物愈伤组织，其特征在于它含有权利要求7-14任一项的植物表达载体。

19.根据权利要求18的转化的植物愈伤组织，其特征在于该植物愈伤组织来源于任何一种裸子植物和被子植物。

20.根据权利要求19的转化的植物愈伤组织，其特征在于该植物愈伤组织来源于水稻或烟草。

21.一种制备转基因植物的方法，包括从权利要求16或17的转化的宿主细胞或权利要求18-20任一项的转化的愈伤组织再生成转基因植物。

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