CN112794890A - 一种开花调控蛋白ELF3-β及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，公开了一种开花调控蛋白ELF3‑β及其编码基因与应用，本发明克隆的野生型拟南芥(Col‑0)中ELF3‑β基因如SEQ ID NO:2所示，其所编码的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。本发明明确了拟南芥ELF3基因新转录方式ELF3‑β的转录起始位点和基因序列，证明了ELF3‑β基因参与调控植物开花和光形态建成过程，并发挥与已知转录方式ELF3‑α相反的作用，能够促进植株提早开花和下胚轴伸长。

Description

一种开花调控蛋白ELF3-β及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种新的开花调控蛋白ELF3-β及其编码基因与应用。本发明也涉及利用RACE技术获得同一基因的不同转录起始位点及对应的新转录本的方法。

背景技术

植物通过感受外界环境和内源信号的变化，促进营养生长向生殖生长转变。此过程中，准确地把握开花时间是繁殖成功的关键。研究表明光周期、环境温度、春化、赤霉素、年龄和自主途径构成了拟南芥开花时间的主要调控网络。光周期途径将各种外部光、温度等信号整合至由生物钟调控的内源计时机制中，使植物能够精确地测量周围环境的周期变化，进而启动或者抑制开花。

拟南芥ELF3基因首次被鉴定是源于一类对光周期不敏感的早花突变体elf3，过表达ELF3的植株开花显著延迟。在生物钟调控网络中，ELF3与多种蛋白结合发挥作用。ELF3与PHYB和COP1相互作用，招募不同蛋白将生物钟与光响应和光形态建成通路连接起来。ELF3与COP1-GI形成蛋白复合体，使COP1降解GI，抑制开花激活因子CO和FT的表达。抑制FT作用的SVP与ELF3相互作用，并在ELF3过表达植株中积累，这与ELF3过表达株的晚开花表型一致。ELF3与PIF4互作，阻碍其下游靶基因的转录激活，调控开花和下胚轴伸长。

近年来发现，参与光温响应调控拟南芥开花的众多基因，在转录水平、转录后、蛋白翻译及翻译后等多个方面受到影响。其中，光敏色素PHYB可诱导拟南芥全基因组范围内2000多个基因的可变启动子选择，即一个基因可能不止一个转录起始位点，单个基因可以产生多种Pre-mRNA。光敏色素通过调控可变启动子改变蛋白质的定位从而适应光环境的变化。在光周期途径中，PHYB与ELF3相互作用将光信号传递至生物钟系统。利用可变转录起始位点影响生长发育，可能是调节植物对环境因素反应的一种广泛存在的机制。为探索ELF3基因的不同转录起始位点，本专利基于拟南芥ELF3基因的结构和序列，使用RACE技术(Rapid amplification of cDNA ends，cDNA末端快速扩增)克隆获得了其内含子区域编码的新转录本ELF3-β，验证了ELF3不同转录起始位点的基因在调控开花和光形态建成中有相反的功能，为可变转录起始位点调控植物生长发育和响应环境提供了新的实验证据，对于解析植物成花转变提供了新的观点。

发明内容

本发明的目的在于鉴定拟南芥ELF3基因的不同转录起始位点，提供了一种新的拟南芥开花调控蛋白ELF3-β及其编码基因与应用，明确了其在调节植物开花和光形态建成过程中的功能。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

根据TAIR数据库(https://www.arabidopsis.org)中拟南芥ELF3基因(AT2G25930)的全长基因组序列信息(序列见SEQ ID NO:4)，在其第二个内含子和第四个外显子上设计一对基于PCR的特异性引物，具体DNA序列如下所示：正向引物ELF3-F1：5′-TGATTGGCTATGTATTCTTGTTTCTT-3′，反向引物ELF3-R1：5′-GATGATTTCCTGAAGGAGGAG-3′(序列见SEQID NO:7和SEQ ID NO:8)。以野生型拟南芥(Col-0)叶片的cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测得到清晰的单个条带。在反转录cDNA过程中使用的引物是Oligo(dT)₁₈，发现拟南芥ELF3基因的第二个内含子区存在编码的mRNA且带Poly A尾。

因为拟南芥ELF3基因第二个内含子可能编码的mRNA不在拟南芥基因组注释基因中，利用RACE技术获得内含子区域存在的基因。根据

RACE 5′/3′Kit试剂盒说明书指导，选择已知序列信息的内含子区域设计5′RACE和3′RACE的基因特异性引物，具体DNA序列如下所示：5′RACE引物ELF3-R2：gattacgccaagcttAGCATAGATAACAATGCAAAGGACGGGCT，3′RACE引物ELF3-F2:gattacgccaagcttGCAGAGGATAAGCTGCGCTGTAAGCTAG(序列见SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10)。以野生型拟南芥(Col-0)叶片总RNA为模板，利用试剂盒中自带的反转录接头引物及试剂，合成带有接头的cDNA第一链。使用巢式PCR的方法，在反应体系中分别加入5′RACE或3′RACE的基因特异性引物、5′RACE或3′RACE对应的cDNA，以及试剂盒中提供的其余反应所需试剂，进行第一次PCR反应，所得产物稀释50倍后作为第二次PCR反应的模板，同样按照说明书中指导，加入正确的引物和试剂进行反应。第二次PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，利用NuceloSpin Gel and PCR Clean-Up Kit试剂盒进行胶纯化，分别回收5′RACE和3′RACE的目标产物。将纯化的PCR产物连接在LineareizedpRACE vector上，转化至感受态细胞中，在含有氨苄的固体培养基上培养过夜，挑取阳性克隆送公司测序。利用CLC Genomics Workbench软件对测序结果进行比对和拼接，获得拟南芥ELF3基因的另一种转录方式，命名为ELF3-β。ELF3-β的转录起始位点位于ELF3第二个内含子，mRNA全长1907bp，其中编码区全长837bp，起始密码子ATG位于ELF3的第四个外显子，编码长度278个氨基酸的蛋白质(序列见SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:1)。为了后续描述中易于区分，将拟南芥ELF3基因已报道的全长转录方式命名为ELF3-α。综上说明，拟南芥ELF3基因可以转录两种mRNA，分别是ELF3-α和ELF3-β。

将ELF3-β和ELF3-α基因的CDS全长序列(序列见SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6)分别克隆和构建于拟南芥过表达载体。将构建好的表达载体利用农杆菌浸花法转化野生型拟南芥(Col-0)，获得转基因T₁和T₂代阳性苗。在长日照条件下，与对照植株相比，ELF3-α转基因株系开花显著延迟且莲座叶数增加，与已报道内容相符；而ELF3-β转基因株系则呈现出与之相反的表型，开花显著提前和莲座叶数目减少。此外，在12h光照/12h黑暗条件下，与对照植株相比，ELF3-α转基因幼苗下胚轴缩短，而ELF3-β转基因幼苗下胚轴明显伸长。说明ELF3-β基因在响应光信号调控拟南芥开花和光形态建成中发挥作用。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》。

序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆的野生型拟南芥(Col-0)中ELF3-β基因编码的蛋白序列，编码278个氨基酸。

序列表SEQ ID NO:2是本发明克隆的野生型拟南芥(Col-0)中ELF3-β基因的CDS序列，其片段长度为837bp。

序列表SEQ ID NO:3是本发明克隆的野生型拟南芥(Col-0)中ELF3-β基因的mRNA序列，其片段长度为1993bp。

序列表SEQ ID NO:4是野生型拟南芥(Col-0)中ELF3基因的全长基因组序列，其片段长度为4381bp。

序列表SEQ ID NO:5是野生型拟南芥(Col-0)中ELF3-α基因的mRNA序列，其片段长度为2749bp。

序列表SEQ ID NO:6是野生型拟南芥(Col-0)中ELF3-α基因的CDS序列，其片段长度为2088bp。

序列表SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8是本发明检测拟南芥ELF3基因不同转录起始位点的引物的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10是本发明克隆拟南芥ELF3基因内含子区域新转录本的3′RACE和5′RACE基因特异性引物的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12是本发明克隆ELF3-β基因全长CDS序列的引物的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14是本发明克隆ELF3-α基因全长CDS序列的引物的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:15是基因构建于过表达载体的测序引物的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17是本发明中实时荧光定量PCR实验检测表达量的ELF3-β基因特异性引物的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19是本发明中实时荧光定量PCR实验检测表达量的AtActin内参基因引物的核苷酸序列。

本发明提供一种具有调控植物开花功能的ELF3-β蛋白，该蛋白是如下(a)或(b)：

(a)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(b)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有调控植物开花功能或活性的蛋白变体。

本发明还提供编码上述ELF3-β蛋白的ELF3-β基因，该基因是如下(1)～(7)中的至少一种：

(1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(2)与(1)核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(3)与(1)核苷酸序列具有至少50％同源性的核苷酸序列；

(4)与(1)核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但在序列上不同的核苷酸序列；

(5)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或者，由于一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少50％同源性的氨基酸序列；

(6)(1)-(5)任何一个的核苷酸序列的活性片段；

(7)与(1)-(5)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

含有上述的ELF3-β基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

用于克隆上述ELF3-β基因的引物对(如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示)也属于本发明的保护范围。

含有上述基因的重组表达载体、转基因细胞系或载体工程菌也属于本发明的保护范围。

上述的ELF3-β蛋白、上述的ELF3-β基因或上述的重组表达载体、转基因细胞系或载体工程菌中的至少一种在植物育种中的应用。

上述的ELF3-β蛋白、上述的ELF3-β基因或上述的重组表达载体、转基因细胞系或载体工程菌中的至少一种在调控植物开花方面的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

利用现有的植物生物技术，结合PCR扩增和RACE技术，在野生型拟南芥(Col-0)中确定了ELF3基因的不同转录起始位点，克隆和分离了新的转录本ELF3-β基因，将其转基因植株与相同条件下生长的对照植株和ELF3-α转基因植株相比，明确了其促进转基因植物提前开花的功能，缩短生育期，并且调控幼苗下胚轴的伸长生长，影响植物光形态建成过程，可用于植物基因工程领域调控花期等。本发明的技术方案对于探索植物不同转录起始位点具有重要意义，为利用可变转录起始位点调节植物生长发育提供基因资源和理论依据。

附图说明

图1、拟南芥ELF3基因内含子区域PCR扩增引物位置示意图及产物胶图。

图2、拟南芥ELF3基因5′RACE和3′RACE PCR扩增引物位置示意图。

图3、拟南芥ELF3基因两种转录方式示意图。附图标记说明：ELF3-α基因从转录起始位点1位置开始转录，ELF3-β基因从转录起始位点2位置开始转录。

图4、ELF3-β转基因植株与对照植株和ELF3-α转基因植株的开花表型对比图。附图标记说明：β-OE1、β-OE2为过表达ELF3-β基因的拟南芥株系，α-OE1为过表达ELF3-α基因的拟南芥株系，Vector control是过表达空载的拟南芥对照株系。

图5、ELF3-β转基因植株与对照植株和ELF3-α转基因植株中ELF3-β相对表达量的对比图。附图标记说明：**代表p<0.01。

图6、ELF3-β转基因植株与对照植株和ELF3-α转基因植株的开花时间对比图。附图标记说明：***代表p<0.001。

图7、ELF3-β转基因植株与对照植株和ELF3-α转基因植株的莲座叶数目对比图。附图标记说明：***代表p<0.001。

图8、ELF3-β转基因植株与对照植株和ELF3-α转基因植株的下胚轴表型对比图。附图标记说明：A图是不同株系的下胚轴生长表型；B图是对应株系下胚轴长度的统计分析，***代表p<0.001。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但不用来限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂供应商处购买得到的。

实施例1：拟南芥ELF3基因新转录方式ELF3-β的鉴定和确认

以野生型拟南芥(Col-0)为材料，选取50mg幼嫩叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨，使用植物总RNA提取试剂盒(购自成都福际生物，中国)，按照说明书步骤提取RNA样品。再通过1％琼脂糖凝胶电泳和核酸检测仪(Nanodrop 2000)检测RNA质量和浓度。以拟南芥总RNA作为模板，使用

Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digesterplus)反转录试剂盒(购自上海翊圣生物，中国)合成cDNA第一链，其中20μL反应体系含有1μg的总RNA。反应全程在冰上操作，体系及步骤如下：

轻轻混匀，42℃孵育2min，冰上静置2min。

向上述反应液中依次加入以下成分：

轻轻混匀，25℃孵育5min，55℃孵育60min，85℃孵育5min，-20℃保存。

从TAIR公共数据库下载拟南芥ELF3基因的的全长基因组序列信息(SEQ ID NO:4)，观察基因结构发现ELF3基因有4个外显子和3个内含子，其中第二个内含子较长。利用SnapGene软件在第二个内含子和第四个外显子上设计一对特异性扩增引物(图1)，正向引物ELF3-F1：TGATTGGCTATGTATTCTTGTTTCTT(SEQ ID NO:7)，反向引物ELF3-R1：GATGATTTCCTGAAGGAGGAG(SEQ ID NO:8)。利用此组引物对获得的拟南芥cDNA进行PCR扩增，使用2×Flash Hot Start MasterMix(购自康为世纪，中国)，PCR反应体系(20μL)：10μL2×Flash Hot Start MasterMix(包含DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs和染料等)，10μM的正向和反向引物各1μL，cDNA模板1μL，ddH₂O补齐至20μL。反应程序为：98℃预变性3min；35个扩增循环，包括98℃变性10s、52℃退火1min、72℃延伸15s；循环完成后72℃延伸10min，20℃保温5min。取PCR扩增产物8μL，经过1％琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像仪观察获得如图1所示的清晰条带。因为PCR扩增使用的模板是由Oligo(dT)₁₈合成的cDNA第一链，cDNA没有内含子序列，说明在第二个内含子和第四个外显子上设计的这对特异性引物可以扩增获得一段mRNA。利用NCBI网站Primer-BLAST在线工具对此引物对的特异性进行检测发现，在拟南芥注释基因组中没有对应基因。

根据拟南芥ELF3基因已知的第二个内含子序列，使用

RACE 5′/3′Kit(Clontech，日本)试剂盒，获得目标转录本的5′端(5′RACE-PCR)和3′端(3′RACE-PCR)序列，具体操作步骤按照RACE试剂盒说明书。方法如下：

首先，合成RACE-Ready cDNA。利用已获得的拟南芥总RNA，在单独的微量离心管中加入下列试剂：

轻轻混匀，72℃孵育3min，42℃孵育2min，冰上静置2min。

在每个5′RACE cDNA合成反应液中添加1μL的SMARTer II AOIigonucleotide。

再向上述反应液中分别依次加入以下成分：

轻轻混匀，42℃孵育90min，70℃孵育10min，-20℃保存。

其次，进行5′-RACE PCR和3′-RACE PCR反应，产物为5′cDNA和3′cDNA片段。根据拟南芥ELF3基因内含子区域已知序列，结合基因特异性引物设计要求，在保证引物长度、GC含量和Tm值的基础上，在引物5′端增加15个碱基的同源序列“GATTACGCCAAGCTT”，设计5′RACE基因特异性引物(5′GSP)是ELF3-R2：gattacgccaagcttAGCATAGATAACAATGCAAAGGACGGGCT(SEQ ID NO:10)，3′引物(3′GSP)是ELF3-F2:gattacgccaagcttGCAGAGGATAAGCTGCGCTGTAAGCTAG(SEQ ID NO:9)(图2)。按照如下步骤配制PCR反应液：

本发明中所述PCR扩增反应分为两次，第一次PCR反应体系是25μL，完全按照上述试剂比例配制反应液，程序优选为：94℃预变性3min；5个扩增循环，包括94℃变性30s、67℃退火30s、72℃延伸3min；5个扩增循环，包括94℃变性30s、65℃退火30s、72℃延伸3min；25个扩增循环，包括94℃变性30s、63℃退火30s、72℃延伸3min；循环完成后72℃延伸5min，20℃保温5min。第一次PCR所得产物稀释50倍后作为第二次PCR反应的模板，其余试剂相同，程序优选为：94℃预变性3min；25个扩增循环，包括94℃变性30s、64℃退火30s、72℃延伸5min；循环完成后72℃延伸5min，20℃保温5min。PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，使用RACE试剂盒中自带的NuceloSpin Gel and PCR Clean-Up Kit分别纯化回收5′RACE和3′RACE产物。

第三步，对PCR产物进行鉴定和测序。将胶回收后的RACE产物利用无缝克隆技术构建于RACE试剂盒中的LineareizedpRACE vector。按照如下步骤操作：

轻轻混匀，50℃孵育15min，冰上静置2min。再按照Stellar Competent Cells的说明书，取2.5μL连接产物，采用热击法转化50μL感受态细胞，在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上筛选阳性克隆，每个实验分别挑取10个阳性单克隆测序确认，优先使用M13F引物测序UPM端，用M13R来测序基因特异性端。利用CLC Genomics Workbench软件对5′和3′RACE测序结果进行拼接比对，拼接结果为SEQ ID NO:3。将RACE克隆的基因序列与拟南芥ELF3基因组全长序列进行比对发现，其转录起始于ELF3基因的第二个内含子，ATG位于ELF3基因的第四个外显子，基因全长837bp，仅含有一个外显子(图3)。与文献中已报道ELF3基因的转录起始位点不同，为后续描述中易于区分，将RACE克隆的新转录本命名为ELF3-β，已报道的转录方式命名为ELF3-α。

实施例2：ELF3-β基因的CDS序列全长克隆及载体构建

根据ELF3-β和ELF3-α基因的CDS全长序列(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6)和拟南芥过表达载体序列信息，利用SnapGene软件设计扩增基因全长(去掉终止密码子)的特异性引物，载体插入位点的上下游同源序列和酶切位点加在基因正反引物序列的5'端，引物分别命名为ELF3-β-GFP-F/R(SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12)和ELF3-α-GFP-F/R(SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14)。

具体引物序列如下：

ELF3-β-GFP-F:gagaacacgggggactctagaATGGAAAGCTCAGCTGAG

ELF3-β-GFP-R:gcccttgctcaccatggatccAGGCTTAGAGGAGTCATAGCG

ELF3-α-GFP-F:gagaacacgggggactctagaATGAAGAGAGGGAAAGATGAGG

ELF3-α-GFP-R:gcccttgctcaccatggatccAGGCTTAGAGGAGTCATAGCG

以实施例1中野生型拟南芥(Col-0)的cDNA为模板，分别以ELF3-β-GFP-F/R和ELF3-α-GFP-F/R为引物，用高保真DNA聚合酶Phusion(Thermo Scientific，美国)进行PCR反应，克隆获得含有ELF3-β和ELF3-α基因CDS全长的PCR产物，按照说明书步骤操作，50μL反应液体系如下：

PCR反应的程序优选为：98℃预变性2min；30个扩增循环，包括98℃变性10s、60℃退火30s、72℃延伸2min；循环完成后72℃延伸10min，20℃保温5min。取PCR产物50μL，加入5μL10×Loading buffer，经过1％琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶成像仪观察，切割并回收目的条带。使用凝胶DNA回收试剂盒(康为世纪，中国)，按照说明书完成胶回收实验。

利用限制性内切酶Xba I、BamH I(Thermo Scientific，美国)对拟南芥过表达载体pCAMBIA1300-35S:CDS-GFP质粒^[1]进行双酶切反应，37℃反应3h，体系如下：

酶切后胶回收空载线性片段，利用ClonExpress II One Step Cloning Kit同源重组连接酶(南京诺唯赞，中国)，分别将ELF3-β和ELF3-α基因目的片段构建于拟南芥过表达载体，反应液体系如下：

X＝[0.02×克隆载体碱基对数]ng，Y＝[0.04×插入片段碱基对数]ng

参考说明书公式、片段长度和胶回收浓度计算连接反应中线性化载体和目的基因片段的用量。轻轻混匀，37℃孵育30min，连接结束产物立即置于冰上。随即转化大肠杆菌，具体步骤如下：将10μL产物加入到50μL已于冰上融化的DH5α感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min；42℃水浴热激90s，立即置于冰上静置3min；加入600μL LB培养液(无抗生素)，37℃摇床220rpm培养1h；5000rpm离心5min，弃掉500μL上清，剩余培养液重悬菌体，在含有卡那霉素抗性的LB固体平板上用灭菌涂布棒涂匀菌液；在37℃培养箱中倒置培养12-16h。过夜培养后，在转化平板上挑取若干个单克隆进行菌落PCR鉴定，使用2×Taq MasterMix(南京诺唯赞，中国)和基因特异性引物进行扩增，挑选3个鉴定出的阳性菌落分别接种于含有卡那霉素抗性的LB培养液中，利用GFP-R:CGTCGTCCTTGAAGAAGATG(SEQ ID NO:15)作为测序引物对挑选的阳性单克隆测序。测序结果表明ELF3-β和ELF3-α基因片段已构建于拟南芥过表达载体，而且ELF3-β基因CDS全长序列与实施例1中RACE克隆实验的测序拼接结果完全一致，ELF3-α基因CDS全长序列与TAIR数据库结果完全一致。

实施例3：ELF3-β基因的功能分析

选取测序正确的菌液100μL加入20mL含有卡那霉素抗性的LB培养液中，37℃摇床220rpm过夜培养。使用质粒小提试剂盒提取质粒，具体操作方法依据说明书，得到35S:ELF3-β-GFP和35S:ELF3-α-GFP重组质粒，简称为ELF3-β和ELF3-α。应用冻融法分别将重组质粒ELF3-β和ELF3-α导入到农杆菌GV3101中，获得阳性农杆菌菌株。参照农杆菌介导的浸花法^[2]转化野生型拟南芥(Col-0)，略作修改，具体步骤如下：取正确的农杆菌菌株，在含有对应抗性(卡那霉素100mg/L和利福平50mg/L)的LB平板上划线，28℃培养箱中倒置培养2-3天；挑取单克隆，加入3mL含有对应抗性的LB培养液中，28℃摇床220rpm培养16-24h；取1mL菌液再加到100mL含对应抗生素的LB培养液锥形瓶中，28℃摇床220rpm培养过夜；5000rpm室温离心20min，弃掉上清，收集菌体；用等体积的转化介质(0.5×MS，5％蔗糖(g/100ml)，10μg/L 6-BA，KOH pH＝5.7)重悬菌体；待转化的拟南芥剪去角果和已经开放的花，一般选择抽薹10cm高时较好；在已重悬菌体的转化介质中加入Sillwet-77(终浓度0.025％，v/v)；将拟南芥花序浸泡于转化介质中，使用真空泵抽真空至380mmHg，浸泡7min；将侵染后的拟南芥放于22℃培养室黑暗处理过夜，次日上午恢复正常培养，等待收获种子。

收获成熟的拟南芥种子(T₁代)，保存于吸水硅胶中干燥一周，再分装适量的种子用于筛选阳性苗。在超净工作台中将消毒后的拟南芥种子播撒在抗性MS固体培养基上。具体操作步骤如下：使用75％的乙醇消毒1min，无菌ddH₂O清洗3遍，2.5％的次氯酸钠消毒5min，无菌ddH₂O清洗5遍；消毒后的种子均匀的播种在MS筛选培养基上(MS，2％蔗糖(g/100ml)，0.7％琼脂(g/100ml)，KOH pH＝5.7，20mg/L Hygromycin B，100mg/LTimentin)，4℃黑暗条件放置3天。随后，在22℃长日照条件(16h光照/8h黑暗)的培养室中生长10-12天，将正常长出4片叶的幼苗移栽至装有基质(营养土：蛭石＝1:1.5)的营养钵中，继续生长。以拟南芥种子正常照光为起始日期，统计每株拟南芥抽薹后开第一朵花所需的天数，并且记录此时拟南芥的莲座叶数。拟南芥开花后，剪取2-3片莲座叶为材料，利用实施例1中描述的试剂盒和操作步骤，获得每株植物的cDNA，并利用2×Flash Hot Start MasterMix(购自康为世纪，中国)、ELF3-β和ELF3-α基因的特异性正向引物(SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13)以及GFP反向测序引物(SEQ ID NO:15)进行PCR鉴定阳性苗。鉴定正确的拟南芥阳性苗单株收获种子(T₂代)保存于吸水硅胶中。

根据PCR鉴定和表型统计结果，分别选择ELF3-β和ELF3-α转基因代表植株，将收获的T₂代种子重复上述MS筛选、表型统计和PCR鉴定。在长日照条件下，ELF3-β和ELF3-α转基因植株表型结果如图4所示。已报道ELF3-α基因是开花抑制因子，与对照植株相比，ELF3-α转基因株系开花显著延迟，而ELF3-β转基因株系则呈现出与之相反的表型，诱导提早开花。首先，利用实时荧光定量PCR技术检测代表植株中ELF3-β基因的表达水平。使用SnapGene软件设计ELF3-β基因特异性引物，序列如下：ELF3-β-qF:GCTGTTCAACCTAAACTATGTCTCTC(SEQID NO:16)和ELF3-β-qR:GCAGCAATAAGTTTTTGAACCTTAATCA(SEQ ID NO:17)。以对照植株、ELF3-α-OE1、ELF3-β-OE1和ELF3-β-OE2植株的cDNA为模板，反应体系为20μL，包括：0.1μLcDNA模板，5.0μL正反引物预混液(0.05μM)，10μL 2×SYBR Green Master Mix(Roche，瑞士)和4.9μL ddH₂O。利用Light Cycler 480II(Roche，瑞士)实时荧光定量PCR仪，反应程序如下：95℃5 min；95℃ 3s，60℃10 s，72℃30 s，45个循环。内参基因使用AtActin(SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19)。检测结果如图5所示，在ELF3-β-OE1和ELF3-β-OE2转基因植株中ELF3-β基因的表达水平显著高于对照植株和ELF3-α-OE1植株，说明实现了ELF3-β基因在野生型植株中的过量表达，转基因植株的早花表型是由于ELF3-β基因的变化导致的。其次，统计分析三类植株开第一朵花的时间和莲座叶数目。对照植株开第一朵花的平均时间是31.4天，ELF3-α-OE1植株是42.2天，而ELF3-β转基因株系OE1、OE2分别需要27.2、27.8天(图6)。对照植株相对应的莲座叶数是10.9片，ELF3-α-OE1植株是19.3片，而ELF3-β转基因株系OE1、OE2分别是8.8、9.5片(图7)。与对照植株相比，ELF3-β和ELF3-α转基因株系的表型截然相反，说明拟南芥ELF3基因的不同转录起始位点对植物开花发挥相反的调控作用，其中ELF3-β基因可以显著促进植物开花。

此外，对三类植株幼苗的下胚轴生长情况进行统计分析。按照实施例3中所述方法，在超净工作台中将消毒后的种子均匀播撒在特定MS培养基上(0.5×MS，3％蔗糖，0.6％琼脂，KOH pH＝5.7)。4℃春化5天后，在12h光照/12h黑暗的22℃培养室中生长。将生长7天的幼苗平铺在同样的MS培养基上进行拍照和统计，使用ImageJ软件测量下胚轴长度，每个株系至少统计30株。观察发现ELF3-β转基因株系的下胚轴明显伸长(图8A)。对照植株的下胚轴平均长度是1.8mm，ELF3-α-OE1植株是1.3mm，而ELF3-β转基因株系OE1、OE2分别是5.3、3.4mm(图8B)，说明ELF3-β基因可以显著促进植物下胚轴生长。

结合RACE实验和转基因拟南芥功能验证，明确了拟南芥ELF3基因新转录方式ELF3-β的转录起始位点和基因序列，证明了ELF3-β基因参与调控植物开花和光形态建成过程，并发挥与已知转录方式ELF3-α相反的作用，能够促进植株提早开花和下胚轴伸长。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

1.Fang,Y.and D.L.Spector,Live cell imaging of plants.Cold Spring HarbProtoc,2010.2010(2):p.pdbtop68.

2.Clough,S.J.and A.F.Bent,Floral dip:a simplified method forAgrobacterium-mediated transformationof Arabidopsis thaliana.Plant J,1998.16(6):p.735-43.

序列表

SEQ ID NO.1ELF3-β基因编码的蛋白

MESSAENVVGRLSNQGHHQQSNYMPFANNPPASPAPNGYCFPPQPPPSGNHQQWLIPVMSPSEGLIYKPHPGMAHTGHYGGYYGHYMPTPMVMPQYHPGMGFPPPGNGYFPPYGMMPTIMNPYCSSQQQQQQQPNEQMNQFGHPGNLQNTQQQQQRSDNEPAPQQQQQPTKSYPRARKSRQGSTGSSPSGPQGISGSKSFRPFAAVDEDSNINNAPEQTMTTTTTTTRTTVTQTTRDGGGVTRVIKVVPHNAKLASENAARIFQSIQEERKRYDSSKP

SEQ ID NO.2ELF3-β基因的CDS

ATGGAAAGCTCAGCTGAGAACGTAGTTGGGAGGTTGTCAAATCAAGGTCATCATCAACAATCCAACTACATGCCTTTTGCAAACAACCCACCGGCTTCACCGGCTCCAAATGGATATTGCTTTCCTCCTCAGCCTCCTCCTTCAGGAAATCATCAGCAATGGTTGATCCCTGTAATGTCTCCCTCGGAAGGACTGATATACAAGCCTCACCCAGGTATGGCACACACGGGGCATTATGGAGGATATTATGGTCATTATATGCCTACACCAATGGTAATGCCTCAATATCACCCCGGCATGGGATTCCCACCTCCTGGTAATGGCTACTTCCCTCCATATGGAATGATGCCCACCATAATGAACCCATATTGTTCAAGCCAACAACAACAACAACAACAACCCAATGAGCAAATGAACCAGTTTGGACATCCTGGAAATCTTCAGAACACCCAACAACAACAACAGAGATCTGATAATGAACCTGCTCCACAGCAACAGCAACAGCCAACAAAGTCTTATCCGCGAGCAAGAAAGAGCAGGCAAGGGAGCACAGGAAGCAGTCCAAGTGGGCCACAGGGAATCTCTGGTAGCAAGTCCTTTCGGCCATTCGCAGCCGTTGATGAGGACAGCAACATCAACAATGCACCTGAGCAAACGATGACAACAACCACAACGACGACAAGAACAACTGTTACTCAGACAACAAGAGATGGGGGAGGAGTGACGAGAGTGATAAAGGTGGTACCTCACAACGCAAAGCTCGCGAGTGAGAATGCTGCCAGAATTTTCCAGTCAATACAAGAAGAACGTAAACGCTATGACTCCTCTAAGCCTTAA

SEQ ID NO.3ELF3-β基因的mRNA

acatgggacattctctgttgacctatattgtgcaaggtgcccgccgatggctttattactataccttctttgcatctggttgttggaacatgtccctgtctcggtttggtattgcttttattctgcactgtcgtcttgggcattttccctacttgtcattcaaggggttgaaccaggtagggaaatgtttttccgaggaccccaggatctaaattttagttaaccatacgtaaagttagttttgagtcttatgacgatgcagaattatagtttcttcttactactgcttaagaggatccttagtgtggttgtgaactacagagtttttatgattgtaggcttcatgacttaacttttaaggttcaatgtactctaatccatatggtaaggtatcggattcacgaccaatgcaaataataagatttttatttcttgcttcttgttaaatatctgacatctcattttgcagaggataagctgcgctgtaagctagatttcaataagcccgtcctttgcattgttatctatgctttaatatgtcattggacccattgatttggttttcttctatcttttttgattggctatgtattcttgtttcttttttcctatctcatttcgatcgtattgttccattagctgttcaacctaaactatgtctctctttgttgaacttttgatggataatcttcttaatgtgactctgtttctcattacagTCAACAAAGAGTATTTGCTGTTCAACTATTTGAGTTGCACAGACTGATTAAGGTTCAAAAACTTATTGCTGCATCACCGGATCTCTTGCTCGATGAGATCAGTTTTCTTGGAAAAGTTTCTGCTAAAAGCTATCCAGTGAAGAAGCTCCTTCCATCAGAATTTCTGGTAAAGCCTCCTCTACCACATGTTGTCGTCAAACAAAGGGGTGACTCGGAGAAGACTGACCAACATAAAATGGAAAGCTCAGCTGAGAACGTAGTTGGGAGGTTGTCAAATCAAGGTCATCATCAACAATCCAACTACATGCCTTTTGCAAACAACCCACCGGCTTCACCGGCTCCAAATGGATATTGCTTTCCTCCTCAGCCTCCTCCTTCAGGAAATCATCAGCAATGGTTGATCCCTGTAATGTCTCCCTCGGAAGGACTGATATACAAGCCTCACCCAGGTATGGCACACACGGGGCATTATGGAGGATATTATGGTCATTATATGCCTACACCAATGGTAATGCCTCAATATCACCCCGGCATGGGATTCCCACCTCCTGGTAATGGCTACTTCCCTCCATATGGAATGATGCCCACCATAATGAACCCATATTGTTCAAGCCAACAACAACAACAACAACAACCCAATGAGCAAATGAACCAGTTTGGACATCCTGGAAATCTTCAGAACACCCAACAACAACAACAGAGATCTGATAATGAACCTGCTCCACAGCAACAGCAACAGCCAACAAAGTCTTATCCGCGAGCAAGAAAGAGCAGGCAAGGGAGCACAGGAAGCAGTCCAAGTGGGCCACAGGGAATCTCTGGTAGCAAGTCCTTTCGGCCATTCGCAGCCGTTGATGAGGACAGCAACATCAACAATGCACCTGAGCAAACGATGACAACAACCACAACGACGACAAGAACAACTGTTACTCAGACAACAAGAGATGGGGGAGGAGTGACGAGAGTGATAAAGGTGGTACCTCACAACGCAAAGCTCGCGAGTGAGAATGCTGCCAGAATTTTCCAGTCAATACAAGAAGAACGTAAACGCTATGACTCCTCTAAGCCTTAAtcctctctatgcgtattgtacttgatatgtattttacaaaattagaaaaattgtgatagatgttatcctcaatatatgtaccatgtaaacgtattatggtgtaagcctcatttata

SEQ ID NO.4ELF3基因的全长基因组

AGAGTCCACGTCGTCACGCACTTTTCCGGTGGTGAAAAAAATGTCCAAATGGATTAAATCTATAATATCTCCAGAGAGATCCTCTCCTTCTATCTTTTTGGGCTCCACTTTTCCTATCTCTTTTTGCCCCTTTCCTCTCTCTGTTCACAAGTCATCTTCTTCCTTCCTCTGAATCTTGTTCCTTTTTGCTCTCTCTACTTGATTCACCCACTCTGTTTCTCGATTAGTACGTTGAAAACTCACTTTGGTTTTGTTTGATTCCTCTTTAGTCTGTTTTTCGATTTCGTTTTCTCTGATTGGTTTGGTGGTGAGATCTCTATCGTAGTTTGTCCTTTGGGTTAAGATATTTCATTTGATTGGTGGGTTTGTTTTATTGAAGCTTATTGTTGTGAAAGTTGGAGTCTTTCTCAGTTTTTAGGTTGAATTATTAAGAGAAAGGGAAGATTTTTGGTGTGAAGTTAGGTTATTTGGGGTTTGAGAAGTTTGCAAGTGAAAAAGGTTGTGAATTGTGAGTGATGAAGAGAGGGAAAGATGAGGAGAAGATATTGGAACCTATGTTTCCTCGGCTTCATGTGAATGATGCAGATAAAGGAGGGCCTAGAGCTCCTCCTAGAAACAAGATGGCTCTTTATGAGCAGCTTAGTATTCCTTCTCAGAGGTTTGGTGATCATGGAACGATGAATTCTCGTAGTAACAACACAAGCACTTTGGTTCATCCTGGACCATCTAGTCAGGTATTGTTTTGATTTTGATCATTGTATAGGCTCTTGATGTTATTAGTTGTATGAGTTTGGATGTTATATAGCCTGAAAGAGAAAGTAGGACATTGGTTGATCTATGTTTCAATTGTTATCAGATCATAGTATCTTCTTTTTGCTTATGGATTGAGCTTTTAGGATTGAATTCTCCTGTATATATGAGAGTCTTGTAGACACAAGTTTATCTAAGTGTGGTTTATTTCTTAAAACTAACATTCTTGTTGTGCCTGATTCTTTTTATGTTCTGAAGTTCGATGAAAGTTTCTTGTGATTGCCCTGAGCATTCAGACTATTGCAAGGACATGAGAAATAATCCTTTTTTACCCTCTTCAATGCAGCCTTGTGGTGTGGAAAGAAACTTATCTGTCCAGCATCTTGATTCTTCAGCCGCAAACCAAGCAACTGAGAAGTTTGTCTCCCAAATGTCCTTCATGGAAAATGTGAGATCTTCGGCACAGCATGATCAGAGGAAAATGGTGAGAGAGGAAGAAGATTTTGCAGTTCCAGTATATATTAACTCAAGAAGATCTCAGTCTCATGGCAGAACCAAGAGTGGTATTGAGAAGGAAAAACACACCCCAATGGTGGCACCTAGCTCTCATCACTCCATTCGATTTCAAGAAGTGAATCAGACAGGCTCAAAGCAAAACGTATGTTTGGCTACTTGTTCAAAACCTGAAGTTAGGGATCAGGTCAAGGCGAATGCAAGGTCAGGTGGCTTTGTAATCTCTTTAGATGTATCAGTCACAGAGGAGATTGATCTCGAAAAATCAGCATCAAGTCATGATAGAGTAAATGATTATAATGCTTCCTTGAGACAAGAGTCTAGAAATCGGTTATACCGAGATGGTGGCAAAACTCGTCTGAAGGACACTGATAATGGAGCTGAATCTCACTTGGCAACGGAAAATCATTCACAAGAGGGTCATGGCAGTCCTGAAGACATTGATAATGATCGTGAATACAGCAAAAGCAGAGCATGCGCCTCTCTGCAGCAGATAAATGAAGAGGCAAGTGATGACGTTTCTGATGATTCGATGGTGGATTCTATATCCAGCATAGATGTCTCTCCCGATGATGTTGTGGGTATATTAGGTCAAAAACGTTTCTGGAGAGCAAGGAAAGCCATTGCCAAGTAAGTTCACTAGAAATTTACAGTTTGGTTATTTATTCTCCGCTCTTTCTATTTATCTCCTTCTTTGATACCAACATTTTTTGCTTGAAAGAAGTTAATATTTAAGCATTGTTCCGTAGTCTTACTGAAGCTTTTTCCTCTGTTGTTTTTTGCTATTTTCATTGAGGACTGTGGTAGGGCATATTTCACTATCACCAAATTTCAAATTTCTAGAACACTCTCCTTCATATTTTTTTTCATGATTAATGCTGCAATTGATTGCTGATATACATATATGACTATAACTCAGTTTCATATTCTGTCTCATTTTGGGAGAAAGAGATTTCAGGTTTATGCTTGAGAAGTGATGGTTCTATAGTTGAGAGGCCCCTGATTCATCTAAAATGGTCCTATTATGTGTTTAGTTGTAGAGTCCTCGGTAGAATATTAACGCGTTTAACACGTTGGATCATGTTATAGCAGGGAGGGACATTCTCTGTTGACCTATATTGTGCAAGGTGCCCGCCGATGGCTTTATTACTATACCTTCTTTGCATCTGGTTGTTGGAACATGTCCCTGTCTCGGTTTGGTATTGCTTTTATTCTGCACTGTCGTCTTGGGCATTTTCCCTACTTGTCATTCAAGGGGTTGAACCAGGTAGGGAAATGTTTTTCCGAGGACCCCAGGATCTAAATTTTAGTTAACCATACGTAAAGTTAGTTTTGAGTCTTATGACGATGCAGAATTATAGTTTCTTCTTACTACTGCTTAAGAGGATCCTTAGTGTGGTTGTGAACTACAGAGTTTTTATGATTGTAGGCTTCATGACTTAACTTTTAAGGTTCAATGTACTCTAATCCATATGGTAAGGTATCGGATTCACGACCAATGCAAATAATAAGATTTTTATTTCTTGCTTCTTGTTAAATATCTGACATCTCATTTTGCAGAGGATAAGCTGCGCTGTAAGCTAGATTTCAATAAGCCCGTCCTTTGCATTGTTATCTATGCTTTAATATGTCATTGGACCCATTGATTTGGTTTTCTTCTATCTTTTTTGATTGGCTATGTATTCTTGTTTCTTTTTTCCTATCTCATTTCGATCGTATTGTTCCATTAGCTGTTCAACCTAAACTATGTCTCTCTTTGTTGAACTTTTGATGGATAATCTTCTTAATGTGACTCTGTTTCTCATTACAGTCAACAAAGAGTATTTGCTGTTCAACTATTTGAGTTGCACAGACTGATTAAGGTAAAGTCATTCAGAAACTTCTCATATGTTTCCATGAGTATTTGTTTCTTCTCGAGCTGAAACAAACCTCTTCAACTGTGTAATAATCAGGTTCAAAAACTTATTGCTGCATCACCGGATCTCTTGCTCGATGAGATCAGTTTTCTTGGAAAAGTTTCTGCTAAAAGCTATCCAGTGAAGAAGCTCCTTCCATCAGAATTTCTGGTAAAGCCTCCTCTACCACATGTTGTCGTCAAACAAAGGGGTGACTCGGAGAAGACTGACCAACATAAAATGGAAAGCTCAGCTGAGAACGTAGTTGGGAGGTTGTCAAATCAAGGTCATCATCAACAATCCAACTACATGCCTTTTGCAAACAACCCACCGGCTTCACCGGCTCCAAATGGATATTGCTTTCCTCCTCAGCCTCCTCCTTCAGGAAATCATCAGCAATGGTTGATCCCTGTAATGTCTCCCTCGGAAGGACTGATATACAAGCCTCACCCAGGTATGGCACACACGGGGCATTATGGAGGATATTATGGTCATTATATGCCTACACCAATGGTAATGCCTCAATATCACCCCGGCATGGGATTCCCACCTCCTGGTAATGGCTACTTCCCTCCATATGGAATGATGCCCACCATAATGAACCCATATTGTTCAAGCCAACAACAACAACAACAACAACCCAATGAGCAAATGAACCAGTTTGGACATCCTGGAAATCTTCAGAACACCCAACAACAACAACAGAGATCTGATAATGAACCTGCTCCACAGCAACAGCAACAGCCAACAAAGTCTTATCCGCGAGCAAGAAAGAGCAGGCAAGGGAGCACAGGAAGCAGTCCAAGTGGGCCACAGGGAATCTCTGGTAGCAAGTCCTTTCGGCCATTCGCAGCCGTTGATGAGGACAGCAACATCAACAATGCACCTGAGCAAACGATGACAACAACCACAACGACGACAAGAACAACTGTTACTCAGACAACAAGAGATGGGGGAGGAGTGACGAGAGTGATAAAGGTGGTACCTCACAACGCAAAGCTCGCGAGTGAGAATGCTGCCAGAATTTTCCAGTCAATACAAGAAGAACGTAAACGCTATGACTCCTCTAAGCCTTAATCCTCTCTATGCGTATTGTACTTGATATGTATTTTACAAAATTAGAAAAATTGTGATAGATGTTATCCTCAATATATGTACCATGTAAACGTATTATGGTGTAAGCCTCATTTATATGTGTTAATTTGTCTTAAAGCCTTGAAATC

SEQ ID NO.5ELF3-α基因的mRNA

AGAGTCCACGTCGTCACGCACTTTTCCGGTGGTGAAAAAAATGTCCAAATGGATTAAATCTATAATATCTCCAGAGAGATCCTCTCCTTCTATCTTTTTGGGCTCCACTTTTCCTATCTCTTTTTGCCCCTTTCCTCTCTCTGTTCACAAGTCATCTTCTTCCTTCCTCTGAATCTTGTTCCTTTTTGCTCTCTCTACTTGATTCACCCACTCTGTTTCTCGATTAGTACGTTGAAAACTCACTTTGGTTTTGTTTGATTCCTCTTTAGTCTGTTTTTCGATTTCGTTTTCTCTGATTGGTTTGGTGGTGAGATCTCTATCGTAGTTTGTCCTTTGGGTTAAGATATTTCATTTGATTGGTGGGTTTGTTTTATTGAAGCTTATTGTTGTGAAAGTTGGAGTCTTTCTCAGTTTTTAGGTTGAATTATTAAGAGAAAGGGAAGATTTTTGGTGTGAAGTTAGGTTATTTGGGGTTTGAGAAGTTTGCAAGTGAAAAAGGTTGTGAATTGTGAGTGATGAAGAGAGGGAAAGATGAGGAGAAGATATTGGAACCTATGTTTCCTCGGCTTCATGTGAATGATGCAGATAAAGGAGGGCCTAGAGCTCCTCCTAGAAACAAGATGGCTCTTTATGAGCAGCTTAGTATTCCTTCTCAGAGGTTTGGTGATCATGGAACGATGAATTCTCGTAGTAACAACACAAGCACTTTGGTTCATCCTGGACCATCTAGTCAGCCTTGTGGTGTGGAAAGAAACTTATCTGTCCAGCATCTTGATTCTTCAGCCGCAAACCAAGCAACTGAGAAGTTTGTCTCCCAAATGTCCTTCATGGAAAATGTGAGATCTTCGGCACAGCATGATCAGAGGAAAATGGTGAGAGAGGAAGAAGATTTTGCAGTTCCAGTATATATTAACTCAAGAAGATCTCAGTCTCATGGCAGAACCAAGAGTGGTATTGAGAAGGAAAAACACACCCCAATGGTGGCACCTAGCTCTCATCACTCCATTCGATTTCAAGAAGTGAATCAGACAGGCTCAAAGCAAAACGTATGTTTGGCTACTTGTTCAAAACCTGAAGTTAGGGATCAGGTCAAGGCGAATGCAAGGTCAGGTGGCTTTGTAATCTCTTTAGATGTATCAGTCACAGAGGAGATTGATCTCGAAAAATCAGCATCAAGTCATGATAGAGTAAATGATTATAATGCTTCCTTGAGACAAGAGTCTAGAAATCGGTTATACCGAGATGGTGGCAAAACTCGTCTGAAGGACACTGATAATGGAGCTGAATCTCACTTGGCAACGGAAAATCATTCACAAGAGGGTCATGGCAGTCCTGAAGACATTGATAATGATCGTGAATACAGCAAAAGCAGAGCATGCGCCTCTCTGCAGCAGATAAATGAAGAGGCAAGTGATGACGTTTCTGATGATTCGATGGTGGATTCTATATCCAGCATAGATGTCTCTCCCGATGATGTTGTGGGTATATTAGGTCAAAAACGTTTCTGGAGAGCAAGGAAAGCCATTGCCAATCAACAAAGAGTATTTGCTGTTCAACTATTTGAGTTGCACAGACTGATTAAGGTTCAAAAACTTATTGCTGCATCACCGGATCTCTTGCTCGATGAGATCAGTTTTCTTGGAAAAGTTTCTGCTAAAAGCTATCCAGTGAAGAAGCTCCTTCCATCAGAATTTCTGGTAAAGCCTCCTCTACCACATGTTGTCGTCAAACAAAGGGGTGACTCGGAGAAGACTGACCAACATAAAATGGAAAGCTCAGCTGAGAACGTAGTTGGGAGGTTGTCAAATCAAGGTCATCATCAACAATCCAACTACATGCCTTTTGCAAACAACCCACCGGCTTCACCGGCTCCAAATGGATATTGCTTTCCTCCTCAGCCTCCTCCTTCAGGAAATCATCAGCAATGGTTGATCCCTGTAATGTCTCCCTCGGAAGGACTGATATACAAGCCTCACCCAGGTATGGCACACACGGGGCATTATGGAGGATATTATGGTCATTATATGCCTACACCAATGGTAATGCCTCAATATCACCCCGGCATGGGATTCCCACCTCCTGGTAATGGCTACTTCCCTCCATATGGAATGATGCCCACCATAATGAACCCATATTGTTCAAGCCAACAACAACAACAACAACAACCCAATGAGCAAATGAACCAGTTTGGACATCCTGGAAATCTTCAGAACACCCAACAACAACAACAGAGATCTGATAATGAACCTGCTCCACAGCAACAGCAACAGCCAACAAAGTCTTATCCGCGAGCAAGAAAGAGCAGGCAAGGGAGCACAGGAAGCAGTCCAAGTGGGCCACAGGGAATCTCTGGTAGCAAGTCCTTTCGGCCATTCGCAGCCGTTGATGAGGACAGCAACATCAACAATGCACCTGAGCAAACGATGACAACAACCACAACGACGACAAGAACAACTGTTACTCAGACAACAAGAGATGGGGGAGGAGTGACGAGAGTGATAAAGGTGGTACCTCACAACGCAAAGCTCGCGAGTGAGAATGCTGCCAGAATTTTCCAGTCAATACAAGAAGAACGTAAACGCTATGACTCCTCTAAGCCTTAATCCTCTCTATGCGTATTGTACTTGATATGTATTTTACAAAATTAGAAAAATTGTGATAGATGTTATCCTCAATATATGTACCATGTAAACGTATTATGGTGTAAGCCTCATTTATATGTGTTAATTTGTCTTAAAGCCTTGAAATC

SEQ ID NO.6ELF3-α基因的CDS

ATGAAGAGAGGGAAAGATGAGGAGAAGATATTGGAACCTATGTTTCCTCGGCTTCATGTGAATGATGCAGATAAAGGAGGGCCTAGAGCTCCTCCTAGAAACAAGATGGCTCTTTATGAGCAGCTTAGTATTCCTTCTCAGAGGTTTGGTGATCATGGAACGATGAATTCTCGTAGTAACAACACAAGCACTTTGGTTCATCCTGGACCATCTAGTCAGCCTTGTGGTGTGGAAAGAAACTTATCTGTCCAGCATCTTGATTCTTCAGCCGCAAACCAAGCAACTGAGAAGTTTGTCTCCCAAATGTCCTTCATGGAAAATGTGAGATCTTCGGCACAGCATGATCAGAGGAAAATGGTGAGAGAGGAAGAAGATTTTGCAGTTCCAGTATATATTAACTCAAGAAGATCTCAGTCTCATGGCAGAACCAAGAGTGGTATTGAGAAGGAAAAACACACCCCAATGGTGGCACCTAGCTCTCATCACTCCATTCGATTTCAAGAAGTGAATCAGACAGGCTCAAAGCAAAACGTATGTTTGGCTACTTGTTCAAAACCTGAAGTTAGGGATCAGGTCAAGGCGAATGCAAGGTCAGGTGGCTTTGTAATCTCTTTAGATGTATCAGTCACAGAGGAGATTGATCTCGAAAAATCAGCATCAAGTCATGATAGAGTAAATGATTATAATGCTTCCTTGAGACAAGAGTCTAGAAATCGGTTATACCGAGATGGTGGCAAAACTCGTCTGAAGGACACTGATAATGGAGCTGAATCTCACTTGGCAACGGAAAATCATTCACAAGAGGGTCATGGCAGTCCTGAAGACATTGATAATGATCGTGAATACAGCAAAAGCAGAGCATGCGCCTCTCTGCAGCAGATAAATGAAGAGGCAAGTGATGACGTTTCTGATGATTCGATGGTGGATTCTATATCCAGCATAGATGTCTCTCCCGATGATGTTGTGGGTATATTAGGTCAAAAACGTTTCTGGAGAGCAAGGAAAGCCATTGCCAATCAACAAAGAGTATTTGCTGTTCAACTATTTGAGTTGCACAGACTGATTAAGGTTCAAAAACTTATTGCTGCATCACCGGATCTCTTGCTCGATGAGATCAGTTTTCTTGGAAAAGTTTCTGCTAAAAGCTATCCAGTGAAGAAGCTCCTTCCATCAGAATTTCTGGTAAAGCCTCCTCTACCACATGTTGTCGTCAAACAAAGGGGTGACTCGGAGAAGACTGACCAACATAAAATGGAAAGCTCAGCTGAGAACGTAGTTGGGAGGTTGTCAAATCAAGGTCATCATCAACAATCCAACTACATGCCTTTTGCAAACAACCCACCGGCTTCACCGGCTCCAAATGGATATTGCTTTCCTCCTCAGCCTCCTCCTTCAGGAAATCATCAGCAATGGTTGATCCCTGTAATGTCTCCCTCGGAAGGACTGATATACAAGCCTCACCCAGGTATGGCACACACGGGGCATTATGGAGGATATTATGGTCATTATATGCCTACACCAATGGTAATGCCTCAATATCACCCCGGCATGGGATTCCCACCTCCTGGTAATGGCTACTTCCCTCCATATGGAATGATGCCCACCATAATGAACCCATATTGTTCAAGCCAACAACAACAACAACAACAACCCAATGAGCAAATGAACCAGTTTGGACATCCTGGAAATCTTCAGAACACCCAACAACAACAACAGAGATCTGATAATGAACCTGCTCCACAGCAACAGCAACAGCCAACAAAGTCTTATCCGCGAGCAAGAAAGAGCAGGCAAGGGAGCACAGGAAGCAGTCCAAGTGGGCCACAGGGAATCTCTGGTAGCAAGTCCTTTCGGCCATTCGCAGCCGTTGATGAGGACAGCAACATCAACAATGCACCTGAGCAAACGATGACAACAACCACAACGACGACAAGAACAACTGTTACTCAGACAACAAGAGATGGGGGAGGAGTGACGAGAGTGATAAAGGTGGTACCTCACAACGCAAAGCTCGCGAGTGAGAATGCTGCCAGAATTTTCCAGTCAATACAAGAAGAACGTAAACGCTATGACTCCTCTAAGCCTTAA

SEQ ID NO.7

ELF3-F1:TGATTGGCTATGTATTCTTGTTTCTT

SEQ ID NO.8

ELF3-R1:GATGATTTCCTGAAGGAGGAG

SEQ ID NO.9

ELF3-F2:gattacgccaagcttGCAGAGGATAAGCTGCGCTGTAAGCTAG

SEQ ID NO.10

ELF3-R2:gattacgccaagcttAGCATAGATAACAATGCAAAGGACGGGCT

SEQ ID NO.11

ELF3-β-GFP-F:gagaacacgggggactctagaATGGAAAGCTCAGCTGAG

SEQ ID NO.12

ELF3-β-GFP-R:gcccttgctcaccatggatccAGGCTTAGAGGAGTCATAGCG

SEQ ID NO.13

ELF3-α-GFP-F:gagaacacgggggactctagaATGAAGAGAGGGAAAGATGAGG

SEQ ID NO.14

ELF3-α-GFP-R:gcccttgctcaccatggatccAGGCTTAGAGGAGTCATAGCG

SEQ ID NO.15

GFP-R:CGTCGTCCTTGAAGAAGATG

SEQ ID NO.16

ELF3-β-qF:GCTGTTCAACCTAAACTATGTCTCTC

SEQ ID NO.17

ELF3-β-qR:GCAGCAATAAGTTTTTGAACCTTAATCA

SEQ ID NO.18

AtActin-qF:GGTGTCATGGTTGGTATGGGTC

SEQ ID NO.19

AtActin-qR:CCTCTGTGAGTAGAACTGGGTGC

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种开花调控蛋白ELF3-β及其编码基因与应用

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 278

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

Met Glu Ser Ser Ala Glu Asn Val Val Gly Arg Leu Ser Asn Gln Gly

1 5 10 15

His His Gln Gln Ser Asn Tyr Met Pro Phe Ala Asn Asn Pro Pro Ala

20 25 30

Ser Pro Ala Pro Asn Gly Tyr Cys Phe Pro Pro Gln Pro Pro Pro Ser

35 40 45

Gly Asn His Gln Gln Trp Leu Ile Pro Val Met Ser Pro Ser Glu Gly

50 55 60

Leu Ile Tyr Lys Pro His Pro Gly Met Ala His Thr Gly His Tyr Gly

65 70 75 80

Gly Tyr Tyr Gly His Tyr Met Pro Thr Pro Met Val Met Pro Gln Tyr

85 90 95

His Pro Gly Met Gly Phe Pro Pro Pro Gly Asn Gly Tyr Phe Pro Pro

100 105 110

Tyr Gly Met Met Pro Thr Ile Met Asn Pro Tyr Cys Ser Ser Gln Gln

115 120 125

Gln Gln Gln Gln Gln Pro Asn Glu Gln Met Asn Gln Phe Gly His Pro

130 135 140

Gly Asn Leu Gln Asn Thr Gln Gln Gln Gln Gln Arg Ser Asp Asn Glu

145 150 155 160

Pro Ala Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Thr Lys Ser Tyr Pro Arg Ala

165 170 175

Arg Lys Ser Arg Gln Gly Ser Thr Gly Ser Ser Pro Ser Gly Pro Gln

180 185 190

Gly Ile Ser Gly Ser Lys Ser Phe Arg Pro Phe Ala Ala Val Asp Glu

195 200 205

Asp Ser Asn Ile Asn Asn Ala Pro Glu Gln Thr Met Thr Thr Thr Thr

210 215 220

Thr Thr Thr Arg Thr Thr Val Thr Gln Thr Thr Arg Asp Gly Gly Gly

225 230 235 240

Val Thr Arg Val Ile Lys Val Val Pro His Asn Ala Lys Leu Ala Ser

245 250 255

Glu Asn Ala Ala Arg Ile Phe Gln Ser Ile Gln Glu Glu Arg Lys Arg

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Tyr Asp Ser Ser Lys Pro

275

<210> 2

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<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

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tccaactaca tgccttttgc aaacaaccca ccggcttcac cggctccaaa tggatattgc 120

tttcctcctc agcctcctcc ttcaggaaat catcagcaat ggttgatccc tgtaatgtct 180

ccctcggaag gactgatata caagcctcac ccaggtatgg cacacacggg gcattatgga 240

ggatattatg gtcattatat gcctacacca atggtaatgc ctcaatatca ccccggcatg 300

ggattcccac ctcctggtaa tggctacttc cctccatatg gaatgatgcc caccataatg 360

aacccatatt gttcaagcca acaacaacaa caacaacaac ccaatgagca aatgaaccag 420

tttggacatc ctggaaatct tcagaacacc caacaacaac aacagagatc tgataatgaa 480

cctgctccac agcaacagca acagccaaca aagtcttatc cgcgagcaag aaagagcagg 540

caagggagca caggaagcag tccaagtggg ccacagggaa tctctggtag caagtccttt 600

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gtgacgagag tgataaaggt ggtacctcac aacgcaaagc tcgcgagtga gaatgctgcc 780

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<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

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<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

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cactttggtt ttgtttgatt cctctttagt ctgtttttcg atttcgtttt ctctgattgg 300

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c 4381

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<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

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tgaattatta agagaaaggg aagatttttg gtgtgaagtt aggttatttg gggtttgaga 480

agtttgcaag tgaaaaaggt tgtgaattgt gagtgatgaa gagagggaaa gatgaggaga 540

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<400> 7

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gattacgcca agcttgcaga ggataagctg cgctgtaagc tag 43

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gattacgcca agcttagcat agataacaat gcaaaggacg ggct 44

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<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gagaacacgg gggactctag aatggaaagc tcagctgag 39

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

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<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

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<210> 14

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<212> DNA

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<400> 14

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<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

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Claims (8)

1.一种具有调控植物开花功能的ELF3-β蛋白，其特征在于，该蛋白是如下(a)或(b)：

(a)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(b)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有调控植物开花功能或活性的蛋白变体。

2.编码权利要求1所述ELF3-β蛋白的ELF3-β基因，其特征在于，该基因是如下(1)～(7)中的至少一种：

(1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(2)与(1)核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(3)与(1)核苷酸序列具有至少50％同源性的核苷酸序列；

(4)与(1)核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但在序列上不同的核苷酸序列；

(5)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或者，由于一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少50％同源性的氨基酸序列；

(6)(1)-(5)任何一个的核苷酸序列的活性片段；

(7)与(1)-(5)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

3.编码权利要求1所述ELF3-β蛋白的ELF3-β基因的全长mRNA序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

4.含有权利要求2中所述ELF3-β基因或权利要求3中所述mRNA序列全长或任一片段的引物。

5.用于克隆权利要求2所述ELF3-β基因的引物对，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。

6.含有权利要求2所述ELF3-β基因的重组表达载体、转基因细胞系或载体工程菌。

7.权利要求1中所述的ELF3-β蛋白、权利要求2中所述的ELF3-β基因或权利要求6中所述的重组表达载体、转基因细胞系或载体工程菌中的至少一种在植物育种中的应用。

8.权利要求1中所述的ELF3-β蛋白、权利要求2中所述的ELF3-β基因或权利要求6中所述的重组表达载体、转基因细胞系或载体工程菌中的至少一种在调控植物开花方面的应用。

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