CN101265293A

CN101265293A - 来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101265293A
Application number: CNA2007100645247A
Authority: CN
Inventors: 王涛; 邓昌旺; 董江丽; 陈曦
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2007-03-16
Filing date: 2007-03-16
Publication date: 2008-09-17
Anticipated expiration: 2027-03-16
Also published as: CN101265293B

Abstract

本发明公开了一种来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白及其编码基因与应用。该来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与开花时间相关的由(a)衍生的蛋白质。该来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白的编码基因可用于调控植物的开花时间。

Description

来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

自然界中各种植物都有各自的开花期。以人为的方法改变它的开花期，对于花卉生产、遗传育种及作物生产具有重要的价值。植物的开花受多种因素的影响，包括植株营养状态、环境温度和光周期等，而植株正是通过调节体内的一系列基因的表达变化来感知这些因素变化的影响。因此，认识植物开花调控的分子机制，进而通过遗传改良的方法调控植物的开花期，已成为当前分子生物学及农业科学家们研究的重点和热点。

蛋白的泛素化降解途径是植物体内广泛存在的分子机制。它广泛参与细胞周期、信号转导、逆境应答、生长发育等细胞过程(Moon J，Parry G，Estelle M.Theubiquitin-proteasome pathway and plant development.PlantCell，2004，16：3181-3195；Smalle J，Vierstra RD.The ubiquitin 26s proteasomeproteolytic pathway.Annu Rev Plant Biol.，2004，55：555-590)。泛素化降解途径由E1泛素激活酶、E2泛素结合转移酶和E3泛素连接酶三部分系统组成，E3泛素连接酶是识别特异底物的靶位点。植物体内存在大量编码泛素化降解途径的基因，其中占绝大部分是E3连接酶的因子。Sabine的研究结果表明，具有E3连接酶活性的蛋白因子BIG BROTHER(BB)能以一种剂量效应的方式来调节植物器官的形态(Sabine，et al.The E3Ubiquitin Ligase BIG BROTHER Controls Arabidopsis Organ Size in aDosage-Dependent Manner.Current Biology，2006，16：272-279)。Wang等的研究发现，拟南芥中的UFO(UNUSUAL FLORAL ORGANS)基因与COP9互作，参与调控花器官形态、种子结实率以及茎(或花)分生组织的形成(Wang X，et al.The COP9 signalosomeinteracts with SCF(UFO)and participates in Arabidopsis flower development.Plant Cell，2003，15：1071-1082)。

拟南芥(Arabidopsis Thaliana)是一种典型的模式生物(其作用与果蝇、线虫、实验鼠等作用相当)，已被广泛应用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究。拟南芥共有约1.3亿个碱基对，2.9万个基因，其中约有1300(约占5％)多个基因编码泛素化降解途径的蛋白因子，包括1200多个E3泛素连接酶组分。拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到同源类似物，有关拟南芥的绝大多数发现都能应用于其它植物研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白及其编码基因。

本发明所提供的来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白，其名称为ZbEB，来源于十字花科拟南芥(Arabidopsis thaliana sp.Columnbia)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与开花时间相关的由(a)衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由383个氨基酸残基组成，自氨基末端(N末端)第330至373位氨基酸残基为C3HC4锌指蛋白结构域。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列2的除C3HC4锌指蛋白结构域保守氨基酸残基外的位点进行取代和/或缺失和/或添加。

为了(a)中的ZbEB便于纯化，可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
标签	残基	序列	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK	c-myc	11	EQKLISEEDL

上述(b)中的ZbEB可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的ZbEB的编码基因可通过将序列表中SEQ ID №：1的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白的编码基因(ZbEB)也属于本发明的保护范围。

所述来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白的编码基因，其核苷酸序列是编码序列表中序列2的蛋白质的多核苷酸。

所述来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白的编码基因的编码序列可为序列表中序列1的自5′末端第48位至1199位脱氧核糖核苷酸组成的核苷酸序列。

所述来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白的编码基因，具体可为如下1)或2)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中的序列1或3；

2)在严谨条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白的DNA分子。

所述高严谨条件为杂交后在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，65℃下洗膜。

序列表中的序列1由1544个脱氧核糖核苷酸组成，是ZbEB的cDNA基因；序列表中的序列3由2529个脱氧核糖核苷酸组成，ZbEB的基因组基因。

序列3中，自5’端第1-47位碱基为该基因组基因的5’非翻译区，自5’端第48-131位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5’端第132-354位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5’端第355-431位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5’端第432-506位碱基为该基因组基因的第二个内含子，自5’端第507-701位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5’端第702-799位碱基为该基因组基因的第三个内含子，自5’端第800-872位碱基为该基因组基因的第四个外显子，自5’端第873-979位碱基为该基因组基因的第四个内含子，自5’端第980-1066位碱基为该基因组基因的第五个外显子，自5’端第1067-1215位碱基为该基因组基因的第五个内含子，自5’端第1216-1353位碱基为该基因组基因的第六个外显子，自5’端第1354-1438位碱基为该基因组基因的第六个内含子，自5’端第1439-1641位碱基为该基因组基因的第七个外显子，自5’端第1642-1718位碱基为该基因组基因的第七个内含子，自5’端第1719-1881位碱基为该基因组基因的第八个外显子，自5’端第1882-2052位碱基为该基因组基因的第八个内含子，自5’端第2053-2184位碱基为该基因组基因的第九个外显子，自5’端第2185-2529位碱基为该基因组基因的3’非翻译区，自5’端第48-50位碱基为该基因组基因的起始密码子ATG，自5’端第48-50位碱基为该基因组基因的起始密码子ATG，自5’端第2182-2184位碱基为该基因组基因的终止密码子TAA。

含有上述来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系和转基因宿主菌均属于本发明的保护范围。

所述转基因细胞系优选为植物细胞。

对用于植物细胞转化的载体没有限制，只要该载体能在植物细胞中表达所插入的基因。术语“植物细胞”包括各种形式的植物细胞，如培养细胞悬液，原生质体，叶切片，和愈伤组织。

本发明的另一个目的是提供一种调控植物开花时间的方法。

本发明所提供的调控植物开花时间的方法，是将上述来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白的编码基因，或其反义DNA导入目的植物细胞，调控所述目的植物的开花时间。

所述反义DNA，编码在植物细胞中抑制上述来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白的编码基因表达的RNA。如所述反义DNA可编码与上述来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白的编码基因的转录产物互补的RNA；所述反义DNA优选编码与序列表中的序列1或序列3的转录产物互补的RNA。

将上述来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白的编码基因导入目的植物细胞，可使植物的开花时间延迟。将上述来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白的编码基因的反义DNA导入目的植物细胞，可使植物的开花时间提前。

所述目的植物可为单子叶植物和双子叶植物。

所述单子叶植物可为水稻，如Oryza sativa L.subsp.Japonica“早恢92”品种。

所述双子叶植物优选为十字花科植物，所述十字花科植物优选为拟南芥，如拟南芥zbeb突变体。

使用本发明的上述来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白的编码基因构建表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、花粉特异表达启动子和水稻肌动蛋白启动子等，它们可以单独使用或与其他的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可以使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述的翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用的植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(如GUS基因、GFP基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(壮观霉素标记物、朝霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因等(如bar基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，或者引入删除机制删除抗性基因。

携带本发明基因的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、粒子轰击等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并培育成植株。

本发明的来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白及其编码基因对于研究植物开花调控的分子机制，以及利用其调节植物的开花时间具有重要的理论和实际意义。通过调节植物的开花时间对粮食作物进行遗传改良在农业领域具有广阔的应用价值及市场前景。

下面结合具体的实施实例对本发明做进一步的说明。

附图说明

图1示ZbEB基因定位及基因克隆结果

图2示野生型与zbeb突变体在长日照(每天光照16小时)条件下培育28天的表型观察结果

图3示野生型与转全长ZbEB cDNA序列的zbeb突变体在长日照(每天光照16小时)条件下培育28天的表型观察结果

图4为转基因水稻PCR检测电泳图

图5为培育至90天的转pART27植株和转pART-ZbEB植株照片

具体实施方式

本发明用以下实施例举例说明，但不应理解为本发明仅限于此。实施例中所用的方法如无特别的说明，均为常规方法。所用的引物合成由北京生工生物工程有限公司完成，测序工作由上海英骏生物技术有限公司完成。

实施例1、ZbEB及其编码基因的获得

拟南芥zbeb突变体(Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC提供)为Columbia生态型的突变体，该突变体与野生型相比，具有开花时间提前，叶片幼小，生育期短的特点。

1、高精度连锁分析

基于图位克隆的原理，以zbeb突变体为供体，Landsberg生态型的野生型为受体，构建了一个包含10,000个单株的分离群体。在这个F2群体中，正常开花的个体与提早开花的个体的比例为7653∶2347，符合3∶1的比例，表明这个调节植物开花的基因突变后性状为隐性，正常为显性。

应用NCBI上的拟南芥Map Viewer资源(即遗传图谱和物理图谱http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi？taxid＝3702)，根据CereonGenomics(http://www.arabidopsis.org/browse/Cereon/index.jsp)提供的多态性信息设计SSLP(simple sequence length polymorphism)分子标记引物，进行基因定位检测。结果证实ZbEB粗定位在1号染色体的中下部。进一步的精细定位将ZbEB定位在F20D21和F20N2两个细菌人工染色体(bacterial artificialchromosome，BAC)克隆之间，包含T22H22、F14C21、T7N22、F7A10、F7A10、T5A14共6个BAC克隆。更进一步的精细定位将ZbEB限定在细菌人工染色体F7A10上的F7A10-1(引物：5’-AGTTCCCAATGAGCAATG-3’和5’-AAATAGTTTCGGGTTCCA-3’)和F7A10-3(引物：5’-CTCTCATGTCCCTTTCTC-3’和5’-GTTTCTTCAACCAAGGAC-3’)两个SSLP分子标记之间的51kb范围内，并与分子标记F7A10-0共分离(引物：5’-TGTTGGGTTCTGTTTGT-3’和5’-CTTCGGTCTGTTGATGT-3’)。

2、通过核苷酸序列分析鉴定候选基因

为了界定ZbEB的候选基因组区并鉴定该候选基因，分析了拟南芥BAC克隆F7A10的核苷酸序列。在此51kb的范围内，根据TAIR的拟南芥基因组注释(http://www.arabidopsis.org/)共分布17个候选基因。根据TAIR的基因组信息，分别在每个基因的5’非翻译区上游和3’非翻译区的下游设计正义引物和反义引物，从基因组水平上进行扩增并克隆测序，结果表明At1g55255在第九个外显子处(即自序列3的5’端始第2053-2078位)发生了26个碱基的缺失(图1)。序列分析表明，At1g55255的基因组DNA由9个外显子和8个内含子组成，具有序列表中序列3的核苷酸序列，序列表中SEQ ID №：3由2529个碱基组成，自5’端第1-47位碱基为该基因组基因的5’非翻译区，自5’端第48-131位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5’端第132-354位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5’端第355-431位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5’端第432-506位碱基为该基因组基因的第二个内含子，自5’端第507-701位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5’端第702-799位碱基为该基因组基因的第三个内含子，自5’端第800-872位碱基为该基因组基因的第四个外显子，自5’端第873-979位碱基为该基因组基因的第四个内含子，自5’端第980-1066位碱基为该基因组基因的第五个外显子，自5’端第1067-1215位碱基为该基因组基因的第五个内含子，自5’端第1216-1353位碱基为该基因组基因的第六个外显子，自5’端第1354-1438位碱基为该基因组基因的第六个内含子，自5’端第1439-1641位碱基为该基因组基因的第七个外显子，自5’端第1642-1718位碱基为该基因组基因的第七个内含子，自5’端第1719-1881位碱基为该基因组基因的第八个外显子，自5’端第1882-2052位碱基为该基因组基因的第八个内含子，自5’端第2053-2184位碱基为该基因组基因的第九个外显子，自5’端第2185-2529位碱基为该基因组基因的3’非翻译区，自5’端第48-50位碱基为该基因组基因的起始密码子ATG，自5’端第48-50位碱基为该基因组基因的起始密码子ATG，自5’端第2182-2184位碱基为该基因组基因的终止密码子TAA。比较发现，zbeb突变体与Columbia生态型的野生型相比较，zbeb突变体在基因组水平上的自5’端第2053-2078位发生了26个碱基的丢失，而此处正是第九个外显子区，编码序列表中序列2的自N端第341-349位氨基酸残基序列(Val-Val-Ile-Val-Lys-Cys-Tyr-His-Leu)。发生碱基丢失后，造成此基因蛋白质编码在自N端第342位氨基酸处发生移码，残基序列对应变成Val-Leu-Pro-Ala-MET-His-Pro-Thr，自N端第349位氨基酸处发生终止。自序列1的N末端第330-373位氨基酸残基为C3HC4锌指蛋白结构域。

实施例2、通过转化鉴定候选基因的功能

根据野生型的ZbEB的全长cDNA序列设计引物对P1(引物：ZnOver-F：5’-at CC ATG GTA atg cta aca aag gca gac g-3’和ZnOver-R：5’-aa ACT AGTactatctccgtccatttgtg-3’其中下划线标示的CCATGG为NcoI酶切位点，ACTAGT为SpecI酶切位点)，以Columbia生态型拟南芥的野生型(Arabidopsis BiologicalResource Center)的总RNA反转录得到的cDNA为模板，PCR扩增拟南芥ZbEB的CDS序列，回收PCR产物连接到pMD18-T Simple Vector(TaKaRa)载体上测序，将测序结果表明含有序列表中序列1的自5′末端第48位至1199位脱氧核糖核苷酸的ZbEB片段的重组载体命名为pMD18-Ts-ZbEB。

用限制性内切酶NcoI和SpecI从pMD18-Ts-ZbEB切下ZbEB片段，插入植物表达载体pCAMBIA1305.1(购自CAMBIA)的多克隆位点NcoI和SpecI之间，将经NcoI和SpecI酶切鉴定表明含有1470bp ZbEB片段的重组载体命名为pCAM-ZbEB。

将pCAM-ZbEB转化到根癌农杆菌菌株Gv3101感受态细胞中，并利用上述引物对P1做PCR鉴定，将PCR鉴定得到1470bp ZbEB片段的阳性农杆菌菌落经2次摇菌扩繁后用Floral dip法(Clough SJ and Bent AF.Floral dip：a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliaha.PlantJ，1998，16：735-743)转化拟南芥zbeb突变体。对得到的T₀代转基因植株(转基因当代植株)用80mg/ml潮霉素(Hygromycin B，购自Roche公司)筛选转化苗。对经潮霉素筛选的转pCAM-ZbEB T₀代植株利用上述引物对P1做PCR鉴定，PCR鉴定得到1470bp ZbEB片段的植株为PCR阳性转pCAM-ZbEB T₀代植株。收获上述T₀代PCR阳性植株的所结种子(T₁代)进行种植，用80mg/ml潮霉素(Hygromycin B，购自Roche公司)筛选，挑出绿色的阳性转化植株25株经MS基本培养基复壮后移植到土中在长日照条件下(每天光照16小时)进行表型观察。同时以相同发育期(萌发期)的25株Columbia生态型拟南芥的野生型植株作为对照，以相同发育期(萌发期)的25株zbeb突变体作为对照，以相同发育期(萌发期)的25株转pCAMBIA1305.1的zbeb突变体作为对照，在相同的条件下进行培育至开花(该开花标准是指薹均高2.5±1cm，第一朵小花开放)。结果表明，25株转pCAM-ZbEB的zbeb突变体到达开花所需的天数与Columbia生态型拟南芥的野生型一致，无显著差异。叶片等表型也极为相似，转pCAM-ZbEB的zbeb突变体和Columbia生态型拟南芥的野生型植株在每天光照16小时、相同条件下培育至23±2天才开始开花(表1和表2)。图3为每天光照16小时培育28天结果，主茎第1、2个荚果已形成，第3朵花正开。图3中，CK表示Columbia生态型拟南芥的野生型植株，zbeb+ZbEB表示转pCAM-ZbEB的zbeb突变体。

而zbeb突变体和转pCAMBIA1305.1的zbeb突变体在每天光照16小时、相同条件下培育17±1天时开始开花(表3和表2)，至28天时除顶端个别小花外花已基本开完(图2)。图2中，CK表示Columbia生态型拟南芥的野生型植株，zbeb表示zbeb突变体。转pCAM-ZbEB的zbeb突变体到达开花所需的天数与zbeb突变体和转pCAMBIA1305.1的zbeb突变体均有显著差异。zbeb突变体到达开花所需的天数与转pCAMBIA1305.1的zbeb突变体无显著差异。

表

拟南芥各品种长日照条件培养至开花所需的天数(天)

表

方差分析：单因素方差分析

SUMMARY

方差分析

实施例3、利用编码与zbeb的cDNA互补的反义RNA调控水稻开花时间

根据野生型的ZbEB的全长cDNA序列设计引物对P2(引物：ZnRNAi-F1：5’-atTCTAGA aattcagatggctcaagtcg-3’和ZnRNAi-R1：5’-ta ATCGATatggaagagtgggaaggaag-3’其中下划线标示的TCTAGA为XbaI酶切位点，ATCGAT为ClaI酶切位点)和引物对P3(ZnRNAi-F2：5’-at CTCGAG tattcagatggctcaagtcg-3’和ZnRNAi-R2：5’-ta GAATTC atggaagagtgggaaggaag-3’其中下划线标示的CTCGAG为XhoI酶切位点，GAATTC为EcoRI酶切位点)，以Columbia生态型拟南芥的野生型(Arabidopsis Biological Resource Center)的总RNA反转录得到的cDNA为模板，PCR扩增拟南芥ZbEB的CDS序列自5’端805-1290位片段，分别回收PCR产物并连接到pMD18-T Simple Vector(TaKaRa)载体上测序，将测序结果表明含有P2扩增的目的片段(Z-ZbEB)的重组载体命名为pMD18-TsZ-ZbEB，含有P3扩增的目的片段(F-ZbEB)的重组载体命名为pMD18-TsF-ZbEB。

用限制性内切酶XbaI和ClaI从pMD18-TsZ-ZbEB切下Z-ZbEB片段，插入中间载体pKANNIBAL(购自CAMBIA)的多克隆位点XbaI和ClaI之间，得到含有Z-ZbEB片段的重组载体pKAN-Z-ZbEB。用限制性内切酶XhoI和EcoRI酶切从pMD18-TsF-ZbEB切下F-ZbEB片段，插入pKAN-Z-ZbEB的多克隆位点XhoI和EcoRI之间，将经XbaI和ClaI、XhoI和EcoRI两组酶分别酶切鉴定表明含有490bp Z-ZbEB和490bp F-ZbEB两个片段的重组载体命名为pKAN-ZbEB。

用限制性内切酶Not I酶切从pKAN-ZbEB切下ZF-ZbEB片段(含有Z-ZbEB和F-ZbEB片段)，插入植物表达载体pART27(购自CAMBIA)的多克隆位点NotI和NotI之间，将经NotI酶切鉴定表明含有3940bp包含有Z-ZbEB和F-ZbEB片段的序列的重组载体命名为pART-ZbEB。

将pART-ZbEB转化到根癌农杆菌菌株EHA105感受态细胞中，并利用上述引物对P2和P3做PCR鉴定，将PCR鉴定得到490bp Z-ZbEB和F-ZbEB片段的阳性农杆菌菌落经2次摇菌扩繁后用农杆菌介导法(Hiei Y，Ohta S，Komari T，et al.Efficienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium andsequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant Journal，1994，6：271-282)并在100mg/ml卡那霉素筛选压下转化水稻粳稻(Oryza sativa L.subsp.Japonica“早恢92”品种，福建省农业科学院)。对得到的转pART-ZbEBT₀代植株利用上述引物对P2和P3做PCR鉴定(如图4)，PCR鉴定得到490bp Z-ZbEB和F-ZbEB片段的植株为PCR阳性转pART-ZbEB T₀代植株。图4中，1为阴性对照，水；2-14为转基因植株；15为阳性对照，pART-ZbEB；16为DNA分子Marker，GeneRuler^TM 1kbLadder(购自晶美公司)。对获得的阳性转化植株(11株)在短日照条件下(每天光照10小时)进行表型观察。同时以相同发育期(萌发期)的11株未转基因水稻粳稻(Oryzasativa L.subsp.Japonica“早恢92”品种)植株作为对照，以相同发育期(萌发期)的11株转pART27水稻粳稻(Oryza sativa L.subsp.Japonica“早恢92”品种)植株作为对照，在相同的条件下培育，进行表型观察。结果表明，与未转基因水稻粳稻(Oryza sativa L.subsp.Japonica“早恢92”品种)和转pART27水稻粳稻(Oryza sativa L.subsp.Japonica“早恢92”品种)110天抽穗期相比，阳性转pART-ZbEB植株能在90天左右即抽穗扬花(表5和表4)。其中，开花的标准是指水稻全部分枝抽穗并裂颖。图5显示的是培育至90天的转pART27植株和转pART-ZbEB植株，可见，转pART-ZbEB植株已抽穗扬花，而转pART27植株均未抽穗。

转pART-ZbEB水稻粳稻(Oryza sativa L.subsp.Japonica“早恢92”品种)到达开花所需的天数，与未转基因水稻粳稻(Oryza sativa L.subsp.Japonica“早恢92”品种)和转pART27水稻粳稻(Oryza sativa L.subsp.Japonica“早恢92”品种)均有显著差异。未转基因水稻粳稻(Oryza sativa L.subsp.Japonica“早恢92”品种)到达开花所需的天数和转pART27水稻粳稻(Oryza sativa L.subsp.Japonica“早恢92”品种)无显著差异。

表4.水稻各品种培养至开花所需的天数(天)

表5.水稻各品种培养至开花所需的天数方差分析方差分析：单因素方差分析

SUMMARY

方差分析

序列表

<160>3

<210>1

<211>1544

<212>DNA

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

gtattggact aatttagtag actgctccct gaaatattga ttttctcatg ctaacaaagg 60

cagacgaaca gaagggtttg gaggataaat gtgctaaaca gatggcggaa attaaatctc 120

tcaaggctct aattgagaaa ctactcaaag aaaaactaca gctgcaaaat ctagcaagca 180

tctgtacgcg tgaatgtaat gatgacaggg gactggcaga aatcaaggat tcacaacgga 240

aagcccaagc tcaggctgaa gagctgaaaa acgttttgga tgaacacttt cttgaattga 300

gagtgaaagc ggctcatgag actgagagtg cttgccaaga aaggcttgct accgccaagg 360

ctgaaattgc tgaattgagg actcagttag atctttctga gagggaggtt ttggaactta 420

aggagggtat taaagttaaa gagcaggagg cagaggcatc cattgctgaa atggagacta 480

taggtcaagc ctatgaagac atgcagacac agaaccaaca tttgttgcag caggtggctg 540

agcgggacga ttataatatc aagcttgttt ccgaaagtgt caagacaaag catgcttaca 600

acactcactt atctgagaag caagtaatgg aaaagcagct ccatcaggtt aatgcatccg 660

tagagaattt taaagcaagg attgcacata atgaggaaca gatgaaaggc tgtttttctg 720

aggcttataa attgattcaa gaagatcgtc acctcgttat cagcctcgaa accaccaaat 780

gggaagtagc tgatgctgac aaggaattca gatggctcaa gtcggccgtg tcttcatccg 840

aaaaggaata tgaacagatc agtaggagga cagacgacat caaactggaa ctggatgatg 900

aaaggaggga gaagaagaag cttgaggaag agcttatgga gttgaacaaa gagcttgaag 960

agttgggttc tgagagtgta gaagctgcaa ttgtgaggct ccaggaagaa gttaagaatt 1020

gcaaaaacat cctcaaatgt ggtgtatgtt ttgatcggcc taaagaggtg gtaattgtga 1080

aatgttatca tctgttctgc cagcaatgca tccaacgtag cttagagatc cgacaccgga 1140

aatgtccagg ctgcggtacc gcctttggcc agaatgacgt ccggcttgtc aaaatgtaac 1200

tcaaaacatt cacacaaatg cactatgtgt tggtacataa caaacttaat taaggtccac 1260

acagtctcat cttccttccc actcttccat aaaattgtta gttagatatg tcatatatgt 1320

atcggttaaa acactgaatc tctggttttt ccagctaaga gggtgatgaa aaattaggtg 1380

ggttctttat ggagaaagtg taggttttag gtatgtgaca gtcgtgtttg tgttacctcc 1440

atttatgcct tggttttatg acatggggac cgacatagac atcacaaatg gacggagata 1500

gttggttttg tattttcctc aaaacaatat agaattatgt gaac 1544

<210>2

<211>383

<212>PRT

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>2

Met Leu Thr Lys Ala Asp Glu Gln Lys Gly Leu Glu Asp Lys Cys Ala

1 5 10 15

Lys Gln Met Ala Glu Ile Lys Ser Leu Lys Ala Leu Ile Glu Lys Leu

20 25 30

Leu Lys Glu Lys Leu Gln Leu Gln Asn Leu Ala Ser Ile Cys Thr Arg

35 40 45

Glu Cys Asn Asp Asp Arg Gly Leu Ala Glu Ile Lys Asp Ser Gln Arg

50 55 60

Lys Ala Gln Ala Gln Ala Glu Glu Leu Lys Asn Val Leu Asp Glu His

65 70 75 80

Phe Leu Glu Leu Arg Val Lys Ala Ala His Glu Thr Glu Ser Ala Cys

85 90 95

Gln Glu Arg Leu Ala Thr Ala Lys Ala Glu Ile Ala Glu Leu Arg Thr

100 105 110

Gln Leu Asp Leu Ser Glu Arg Glu Val Leu Glu Leu Lys Glu Gly Ile

115 120 125

Lys Val Lys Glu Gln Glu Ala Glu Ala Ser Ile Ala Glu Met Glu Thr

130 135 140

Ile Gly Gln Ala Tyr Glu Asp Met Gln Thr Gln Asn Gln His Leu Leu

145 150 155 160

Gln Gln Val Ala Glu Arg Asp Asp Tyr Ash Ile Lys Leu Val Ser Glu

165 170 175

Ser Val Lys Thr Lys His Ala Tyr Asn Thr His Leu Ser Glu Lys Gln

180 185 190

Val Met Glu Lys Gln Leu His Gln Val Asn Ala Ser Val Glu Asn Phe

195 200 205

Lys Ala Arg Ile Ala His Asn Glu Glu Gln Met Lys Gly Cys Phe Ser

210 215 220

Glu Ala Tyr Lys Leu Ile Gln Glu Asp Arg His Leu Val Ile Ser Leu

225 230 235 240

Glu Thr Thr Lys Trp Glu Val Ala Asp Ala Asp Lys Glu Phe Arg Trp

245 250 255

Leu Lys Ser Ala Val Ser Ser Ser Glu Lys Glu Tyr Glu Gln Ile Ser

260 265 270

Arg Arg Thr Asp Asp Ile Lys Leu Glu Leu Asp Asp Glu Arg Arg Glu

275 280 285

Lys Lys Lys Leu Glu Glu Glu Leu Met Glu Leu Asn Lys Glu Leu Glu

290 295 300

Glu Leu Gly Ser Glu Ser Val Glu Ala Ala Ile Val Arg Leu Gln Glu

305 310 315 320

Glu Val Lys Asn Cys Lys Asn Ile Leu Lys Cys Gly Val Cys Phe Asp

325 330 335

Arg Pro Lys Glu Val Val Ile Val Lys Cys Tyr His Leu Phe Cys Gln

340 345 350

Gln Cys Ile Gln Arg Ser Leu Glu Ile Arg His Arg Lys Cys Pro Gly

355 360 365

Cys Gly Thr Ala Phe Gly Gln Asn Asp Val Arg Leu Val Lys Met

370 375 380

<210>3

<211>2529

<212>DNA

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>3

gtattggact aatttagtag actgctccct gaaatattga ttttctcatg ctaacaaagg 60

cagacgaaca gaagggtttg gaggataaat gtgctaaaca gatggcggaa attaaatctc 120

tcaaggctct agtaagtttt ctttatgtcc ctaaaaccat ctactccaaa aaaatttgtg 180

tggtaattac aatgttcttt tgctctattt acatgcctct ctccaaccgt ttcctaggca 240

ctttaactca tccacgtact tagttgtttt tttgccatct tttaggaatt catggatact 300

gaaactccag aaaatttagc agtaagagtc tgaatttaaa ttgtaatatt gcagattgag 360

aaactactca aagaaaaact acagctgcaa aatctagcaa gcatctgtac gcgtgaatgt 420

aatgatgaca ggtatgtgac catttgagtg tgtttaagct cttcaaattt tgctgaaaac 480

atgagatttg agctttacaa tttcagggga ctggcagaaa tcaaggattc acaacggaaa 540

gcccaagctc aggctgaaga gctgaaaaac gttttggatg aacactttct tgaattgaga 600

gtgaaagcgg ctcatgagac tgagagtgct tgccaagaaa ggcttgctac cgccaaggct 660

gaaattgctg aattgaggac tcagttagat ctttctgaga ggtatgctct ctcatggtac 720

cacatccaag gtcattcatt atattctttt caccgttttg ggggcattaa tcagtattat 780

attgctttct catttgcagg gaggttttgg aacttaagga gggtattaaa gttaaagagc 840

aggaggcaga ggcatccatt gctgaaatgg aggtacaatc atccttctgc tcgtttttcc 900

tattttaatg ttcttaagga gtttattaga aatctgaaag tcgaaatgct cgtttctcat 960

caatacttta cttctctaga ctataggtca agcctatgaa gacatgcaga cacagaacca 1020

acatttgttg cagcaggtgg ctgagcggga cgattataat atcaaggtaa attttagtgt 1080

taataggaca ctttgatact gagatttgtt ttttgttttt tttttcatct tttctcaatt 1140

ccaatctttg actttaacta tatctagcct ttgaacacat cttttgtaga tttctgattt 1200

gatctatgat ttcagcttgt ttccgaaagt gtcaagacaa agcatgctta caacactcac 1260

ttatctgaga agcaagtaat ggaaaagcag ctccatcagg ttaatgcatc cgtagagaat 1320

tttaaagcaa ggattgcaca taatgaggaa caggttagag gagagttctt gtgtaatttt 1380

tgtaactctc taaaacttct ctcatcagtg tcttttacta atgttcttat gttcgcagat 1440

gaaaggctgt ttttctgagg cttataaatt gattcaagaa gatcgtcacc tcgttatcag 1500

cctcgaaacc accaaatggg aagtagctga tgctgacaag gaattcagat ggctcaagtc 1560

ggccgtgtct tcatccgaaa aggaatatga acagatcagt aggaggacag acgacatcaa 1620

actggaactg gatgatgaaa ggtgacctaa aaacagatct cttgtttgaa cccaattact 1680

atattatgac agtgatataa attctatcta tggaacagga gggagaagaa gaagcttgag 1740

gaagagctta tggagttgaa caaagagctt gaagagttgg gttctgagag tgtagaagct 1800

gcaattgtga ggctccagga agaagttaag aattgcaaaa acatcctcaa atgtggtgta 1860

tgttttgatc ggcctaaaga ggtaacaatg ctcataacaa tcctatatct cactgtcaag 1920

gcagacataa tgattcgata atcctttctc atcactgtca taatcatcat caatagtcat 1980

atatcatgca tcagaaaata tcattttcag cgcatatcaa caaccgcttt ttgtttcaaa 2040

cattatttgc aggtggtaat tgtgaaatgt tatcatctgt tctgccagca atgcatccaa 2100

cgtagcttag agatccgaca ccggaaatgt ccaggctgcg gtaccgcctt tggccagaat 2160

gacgtccggc ttgtcaaaat gtaactcaaa acattcacac aaatgcacta tgtgttggta 2220

cataacaaac ttaattaagg tccacacagt ctcatcttcc ttcccactct tccataaaat 2280

tgttagttag atatgtcata tatgtatcgg ttaaaacact gaatctctgg tttttccagc 2340

taagagggtg atgaaaaatt aggtgggttc tttatggaga aagtgtaggt tttaggtatg 2400

tgacagtcgt gtttgtgtta cctccattta tgccttggtt ttatgacatg gggaccgaca 2460

tagacatcac aaatggacgg agatagttgg ttttgtattt tcctcaaaac aatatagaat 2520

tatgtgaac 2529

Claims

1. 来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2. 权利要求1所述的来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白的编码基因。

3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白的编码基因，为如下1)或2)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中的序列1或3；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白的DNA分子。

4. 含有权利要求2或3所述的来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或转基因宿主菌；所述转基因细胞系优选为植物细胞。

5. 一种调控植物开花时间的方法，是将权利要求2或3所述的来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白的编码基因，或其反义DNA导入目的植物细胞，调控所述目的植物的开花时间。

6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述反义DNA，编码在植物细胞中抑制权利要求2或3所述的来源于拟南芥的与开花时间相关蛋白的编码基因表达的RNA。

7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述反义DNA编码与权利要求2或3所述的编码基因的转录产物互补的RNA；所述反义DNA优选编码与序列表中的序列1或序列3的转录产物互补的RNA。

8. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物和双子叶植物；所述单子叶植物优选为水稻。

9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述水稻为粳稻(Oryza sativa L.subsp.Japonica)早恢92。

10. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为十字花科植物，所述十字花科植物优选为拟南芥；所述拟南芥优选为拟南芥zbeb突变体。