CN114438114A - 一种提高水稻对稻瘟病抗性的方法 - Google Patents

一种提高水稻对稻瘟病抗性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于农业生物技术领域，公开了一种利用OsWRKY7基因增强水稻对稻瘟病抗性的方法。所述OsWRKY7基因的核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：1所示。本发明通过基因功能研究，发现OsWRKY7基因发生突变能增强水稻对稻瘟病的抗性，证明它是水稻稻瘟病抗病反应的负调控因子。因此，通过突变或抑制OsWRKY7基因的功能可以改良水稻的抗病性，培育出具有兼抗性的水稻新品种。

Description

一种提高水稻对稻瘟病抗性的方法
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种在水稻中提高对稻瘟病抗性的方法。
背景技术
植物在其生长发育过程中，很容易受到多种外源病原物的侵害，如细菌、真菌、病毒等。长期以来，植物为抵抗病原物的侵害不断进化出适应性机制，通过激活防御相关的信号传导途径及抗病相关(defense-responsive)基因的表达来达到抵抗胁迫的目的，如调节生理生化过程(防御信号反应)和次生代谢物的合成(Feng et al.,2012)，因此植物宿主基因的转录调节是植物防御反应的核心部分。其中，转录因子是调控基因表达的重要因子，可以诱导一系列下游防御基因的表达，在多种生理生化反应过程中发挥着重要的作用(Eulgem et al.,2000)。
在植物中有许多转录调控因子的家族，比如MYC家族、MYB家族、WRKY家族和bZIP家族等，它们广泛参与植物的生长、发育和抗病耐逆，具有极其重要的生物学功能(Alves etal.,2014)。其中，WRKY转录调控因子家族是植物中最大的转录因子家族之一，在调控植物应对生物胁迫和非生物胁迫的响应中起重要的作用(Tripathi et al.,2015)。目前为止，水稻在经过全面基因组序列分析之后，已在栽培稻日本晴中预测到至少103个WRKY基因(Ramamoorthy et al.,2008)。已有的研究结果显示其大量成员参与了水稻对细菌、真菌和病毒等多种外源病原物的防御反应及水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)相关的抗病信号转导途径。如过表达OsWRKY13(Qiu et al.,2007)、OsWRKY53(Chujo et al.,2009)和OsWRKY71(Liuet al.,2007)等基因后水稻内源的抗病相关基因OsNPR1、OsNH1、病程相关(pathogenesis-related,PR)基因OsPR1等的表达量显著增强，进而表现出对白叶枯病或(和)稻瘟病的抗性。此外，也有一些WRKY基因在防御病原菌中起负调控作用，如同属于WRKYⅡa亚组的OsWRKY62和OsWRKY76基因，其RNA干扰和敲除转基因材料中，由于防御相关基因的表达和植物抗毒素的积累增加，表现出水稻对稻瘟病菌和白叶枯病菌的抗性(Liu et al.,2016)。OsWRKY42也是水稻抗病反应中的负调控因子，抑制表达OsWRKY42基因的转基因植株的抗稻瘟病能力显著提高(王石平等，水稻抗病相关基因WRKY42及在水稻改良中的应用，发明专利，CN 105368842 A)。由此可见，WRKY转录因子家族基因是水稻抗性改良的重要基因资源。
水稻是我国重要的粮食作物之一，在其生产过程中，很容易受到外源病原菌的侵害，严重影响水稻的产量和品质。通过挖掘和利用抗病新基因改良水稻，是控制水稻病害，增加水稻产量及品质的最经济有效的措施。本发明前期研究发现OsWRKY7基因能响应白叶枯病菌的侵染信号，可能在水稻抗病反应过程中发挥着重要的作用(李茹等2015)。对该基因的研究及应用对培育水稻抗病新品种有重要意义。
发明内容
本发明要解决的问题是提高水稻抗稻瘟病。
具体而言，在第一方面，本发明提供了提高水稻对稻瘟病抗性的方法，其包括对水稻染色体上的OsWRKY7基因进行突变，筛选突变植株；相应地，本发明还提供了培育增强稻瘟病抗性的水稻的方法，其包括对水稻染色体上的OsWRKY7基因进行突变，筛选突变植株。
优选在本发明第一方面的方法中，OsWRKY7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选在本发明第一方面的方法中，突变是使OsWRKY7基因的启示密码子ATG缺失碱基。
优选在本发明第一方面的方法中，突变是利用CRISPR-Cas9基因编辑技术进行的。
优选在本发明第一方面的方法中，突变植株是纯合突变植株。
优选在本发明第一方面的方法中，水稻的品种是日本晴。
在第二方面，本发明提供了突变的OsWRKY7基因在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用，其中，突变是使OsWRKY7基因的启示密码子ATG缺失碱基；相应地，本发明还提供了突变的OsWRKY7基因在培育增强稻瘟病抗性的水稻中的应用，其中，突变是使OsWRKY7基因的启示密码子ATG缺失碱基。
优选在本发明第二方面的应用中，OsWRKY7基因在突变前的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。
优选在本发明第二方面的应用中，突变是利用CRISPR-Cas9基因编辑技术进行的。
优选在本发明第二方面的应用中，水稻的品种是日本晴。
本发明取得的有益效果在于：水稻OsWRKY7基因的启示密码子ATG缺失碱基的纯合突变并没有影响水稻生长，但是却有效赋予水稻增强的稻瘟病抗性，为得到高抗病性水稻品种奠定了基础。
为了便于理解，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，其全文内容均纳入本文进行参考。
以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。
附图说明
图1显示了OsWRKY7基因的结构示意图，其中，“ATG”和“TAA”分别是翻译起始密码子和终止密码子，数字表示每一种结构的核苷酸数目，PCR引物用于基因编码区的扩增。
图2显示了OsWRKY7蛋白的转录激活域的确定，其中，左侧为基因5’端和3’端缺失载体示意图，右侧为各载体在酵母中转录激活活性鉴定，pBD为阴性对照载体，黑框表示WRKY结构域。
图3显示了遗传转化超表达载体示意图。L为左边界，其中，35ST为35S终止子，HPT为潮霉素抗性基因，35SP为CaMV35S启动子，UbiP为玉米泛素启动子，CDS为OsWRKY7基因的编码序列，rbcsT为rbcs终止子，R为右边界。
图4显示了转基因材料潮霉素基因PCR鉴定图，其中，M为Marker DL2000；1-16泳道为转基因T0株系1-16；PCR产物大小为320bp。
图5显示了过表达转化株系中OsWRKY7基因的表达量分析。
图6显示了过表达转化株系对白叶枯病菌P10生理小种的抗性鉴定，其中，灰色柱子表示转基因阳性植株的病斑长度，黑色柱子表示同一株系分离出的转基因阴性植株或日本晴野生型的病斑长度。每个数据为3株苗、每株8-10张叶片病斑长度的平均值和误差。
图7显示了基因突变载体示意图，其中，L为左边界，35ST为35S终止子，HPT为潮霉素抗性基因，35SP为CaMV35S启动子，UbiP为玉米泛素启动子，Cas9为Cas9核酸酶，NosT为Nos终止子，U6aP为U6a启动子，T为OsWRKY7的靶点序列，gRNA为导向RNA，R为右边界。
图8显示了突变材料对白叶枯病菌P10生理小种的抗性鉴定，其中，WT为日本晴野生型，mut1和mut2为突变模式不同的两个株系，百分数表示突变株系平均病斑长度是对照的百分比。
图9显示了突变材料对稻瘟菌RO1-1生理小种的抗性鉴定，其中，WT为日本晴野生型，mut1和mut2为突变模式不同的两个株系，Bar表示1cm。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明实施方式不限于此。
实施例1水稻OsWRKY7基因的分离克隆
本发明通过检索NCBI数据库，获得一个水稻WRKY转录因子Os05g0537100的基因序列，命名为OsWRKY7基因。该基因位于第5条染色体上，含有两个内含子和三个外显子，mRNA序列为1444bp，5’UTR和3’UTR分别长347bp和431bp，基因编码区为666bp，编码一个长度为221个氨基酸的蛋白质(附图1)。
本发明以水稻品种日本晴为材料，取两周苗龄的嫩叶，用Trizol试剂(购自Invitrogen)提取水稻叶片总RNA，用逆转录酶M-MuLV(购自NEB)将总RNA逆转录合成cDNA第一链(具体方法参照逆转录酶说明书)，反应条件为：42℃/1h；90℃/5min。以cDNA为模板，用特异性PCR引物OsWRKY_CDS_F(5’_TATGGCGGCAGTCGGCGCG_3’)和OsWRKY_CDS_R(5’_TTTAATTGAGAGAACCTGGCGGCTGCGTG_3’)进行PCR扩增，扩增含有OsWRKY7基因编码框的DNA片段，所用聚合酶为KOD-Fx(购自TOYOBO)，反应条件为98℃预变性2min；98℃10s，62℃30s，68℃1min，33个循环；68℃延伸7min，获得的PCR产物连入pB2E-T载体(本实验保存)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将测序正确的阳性克隆保存备用。获得的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例2 OsWRKY7转录活性及结构域的鉴定
为明确OsWRKY7蛋白的转录活性及结构域的分布，将其全长蛋白及N端和C端蛋白缺失片段分别与酵母表达载体pGBKT7中的DNA结合域融合表达，检测各蛋白片段在酵母细胞中的自激活活性。首先在TaKaRa网站上根据蛋白片段对应的核苷酸序列和用NdeI和BmaHI线性化的pGBKT7载体序列设计In-Fusion引物(https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tools)(见表1)。
Figure BDA0002733115430000051
表1用于扩增全长CDS及各缺失片段的引物序列。
以克隆的CDS-pB2E载体为模板扩增全长CDS片段(CDS_FW+CDS_RV，1-221aa)、C端缺失突变体CT1片段(CDS_FW+CT1_RV，1-192aa)、C端缺失突变体CT2片段(CDS_FW+CT2_RV，1-133aa)、N端缺失突变体NT1片段(NT1+CDS_RV，51-221aa)、N端缺失突变体NT2片段(NT2+CDS_RV，101-221aa)和N端缺失突变体NT3片段(NT3+CDS_RV，76-221aa)。根据In-Fusion系统(TaKaRa)说明书将线性化载体pGBKT7与扩增的目的片段进行同源重组，获得CDS-pBD、CT1-pBD、CT2-pBD、NT1-pBD、NT2-pBD和NT3-pBD表达载体(附图2)。
将上述构建的载体分别转化酵母菌株Y2H Gold，分别在SD/-Trp固体培养基上，30℃培养3天。然后在涂有X-α-Gal的SD/-Trp固体培养基平板上显色。以pGBKT7-T转化酵母菌株Y2H Gold得到的酵母转化子pBD为阴性载体对照。
结果如图2所示，CDS-pBD在涂有X-α-Gal的SD/-Trp固体培养基平板上有蓝色菌落长出，说明该WRKY蛋白具有转录激活活性。截去C端30个氨基酸(CT1-pBD)及C端包括WRKY结构域的89个氨基酸(CT2-pBD)后，目的蛋白仍有自激活活性，说明具有自激活活性的区间可能在其N端。截去N端的前50个氨基酸后(NT1-pBD)，目的蛋白仍有自激活活性，且显蓝程度与将C端截去的显蓝程度一致，可能N端前部分的功能和C端一样能减弱目的蛋白的自激活活性；截去N端前100个氨基酸后(NT2-pBD)，目的蛋白丧失了自激活活性，在截去N端前75个氨基酸后(NT3-pBD)，目的蛋白也没有自激活活性，说明目的蛋白的自激活活性区域在其N端的51至75个氨基酸区间内。
实施例3 OsWRKY7基因过量表达转基因水稻的产生和抗病性鉴定
1、过表达遗传转化载体的构建
本实施例所用的过表达双元载体是p1300SUR，它是由载体pCAMBIA1300改造而来的Gateway目标载体，含有玉米的Ubi启动子。通过Gateway重组技术，将含有全长编码框序列的入门载体CDS-pB2E与目标载体pU1300SUR进行LR重组，重组方法参照LR Clonase IIEnzyme mix(Thermo Fisher)说明书进行。重组后的载体结构如附图3所示。
2、遗传转化和转基因植株鉴定
将构建好的pU1300SUR-CDS超表达载体电击转化进入农杆菌EHA05中，再将农杆菌转入日本晴愈伤组织中，获得超表达转基因植株。粗提转基因水稻叶片总DNA，用引物HPT-F(5’_CGCCGATGGTTTCTACAAAG_3’)和HPT-R(5’_ACACATGGGGATCAGCAATC_3’)，以潮霉素抗性基因作为筛选转基因水稻阳性苗的标记，对转基因植株进行PCR阳性鉴定，部分鉴定结果见附图4。
提取超表达的阳性转基因植株叶片的总RNA并逆转录为cDNA，用定量RT-PCR分析转基因水稻植株中目的基因的超表达情况。Real-time PCR反应体系按照
Figure BDA0002733115430000063
480Probe Master试剂盒说明书配制，用Roche公司的LightCycler 480定量PCR仪进行分析，反应条件为：
Figure BDA0002733115430000061
以水稻OsActin基因(Os11g0163100)作为内参基因矫正模板量。所用引物序列极探针见表2。部分T1株系的定量PCR结果见附图5。
Figure BDA0002733115430000062
表2定量RT-PCR引物序列
3、转基因过表达植株的抗病性分析
在过表达转基因水稻的T2代阳性植株的最大分蘖期用剪叶法接种白叶枯病菌P10(POX124)生理小种，以野生型日本晴接种P10作为阴性对照。对转基因材料接种P10生理小种14天后测量病斑长度，统计结果显示，OsWRKY7基因过表达之后对白叶枯病菌P10的耐受性与野生型日本晴无明显差异(附图6)。
实施例4 OsWRKY7基因功能缺失突变体的产生和抗病性鉴定
1、功能缺失突变体的获得
根据CRISPR-Cas9基因编辑原理，在基因组序列上找到以‘NGG’结尾的序列，本实施例选取包含起始密码子ATG在内的20bp的序列(GGCCTCGTACTCGGCCATGG)作为靶点序列，设计相关接头引物，以OsU6a启动子进行gRNA表达，构建CRISPR/Cas9双元表达载体(附图7)。将构建好的载体，用农杆菌介导的方法转化水稻获得基因突变的材料。
2、基因突变位点分析
以粗提水稻总DNA为模板，然后以靶位点为中心，前后150bp左右处合成的引物Cas9_PCR_F(5’_ATCACGATCGATCTCATCCCTCT_3’)和Cas9_PCR_R(5’_CGCGTCGTCGAAGAAGAACTCGGA_3’)，用KOD Fx DNA聚合酶进行PCR扩增目的片段，然后送公司测序，测序结果与目的序列进行比对，并在DSDecode网站(http://dsdecode.scgene.com/)上进行分析。结果表明，33株T0代CRISPR-Cas9转基因株系中有19个植株的靶序列发生突变，突变率为57.6％，其中13个植株靶序列的突变模式为纯合突变，纯合突变率为39.4％。在纯合突变模式中有3种突变模式，三种模式均在ATG处缺失碱基，导致启始密码子ATG不完整，用DSDecode网站分析也获得同样的结果。令人意外地是，纯合突变并没有影响水稻的生长。
3、突变材料的抗病性分析
对2个月苗龄的纯合突变材料mut1和mut2(分别缺失碱基A和T)以及野生型日本晴(对照组)采用剪叶法接种白叶枯病菌P10。在接菌2周后，对接菌植株叶片的病斑长度进行测量并统计分析。结果显示(附图8)，纯合突变植株的病斑长度要明显短于野生型对照，说明OsWRKY7基因可能在水稻对白叶枯菌的免疫应答过程中起负调控作用。同时，采用打孔法对纯合突变材料接种稻瘟病菌RO1-1，12天后对病斑叶片进行扫描分析，结果显示(附图9)，纯合突变植株的病斑要明显小于野生型对照，说明OsWRKY7基因也负调控了水稻对稻瘟病菌的免疫应答过程。
这些结果说明OsWRKY7基因既是水稻抗白叶枯病反应的负调控因子，也是水稻抗稻瘟病反应的负调控因子。突变或抑制OsWRKY7基因功能可培育出具有兼抗性的水稻。
参考文献：
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引用专利：
CN105368842A，Aug 29 2014，Mar 02 2016，华中农业大学，水稻抗病相关基因WRKY42及在水稻改良中的应用。
Figure BDA0002733115430000101
Figure BDA0002733115430000111

Claims (10)

1.提高水稻对稻瘟病抗性的方法或者培育增强稻瘟病抗性的水稻的方法，其包括对水稻染色体上的OsWRKY7基因进行突变，筛选突变植株。
2.权利要求1所述的方法，其中，OsWRKY7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.权利要求1所述的方法，其中，突变是使OsWRKY7基因的启示密码子ATG缺失碱基。
4.权利要求1所述的方法，其中，突变是利用CRISPR-Cas9基因编辑技术进行的。
5.权利要求1所述的方法，其中，突变植株是纯合突变植株。
6.权利要求1所述的方法，其中，水稻的品种是日本晴。
7.突变的OsWRKY7基因在提高水稻对稻瘟病抗性或者培育增强稻瘟病抗性的水稻中的应用，其中，突变是使OsWRKY7基因的启示密码子ATG缺失碱基。
8.权利要求7所述的应用，其中，OsWRKY7基因在突变前的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
9.权利要求7所述的应用，其中，突变是利用CRISPR-Cas9基因编辑技术进行的。
10.权利要求7所述的应用，其中，水稻的品种是日本晴。
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