CN116655764A - 水稻OsUGT706E2基因在调控水稻稻瘟病抗性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子育种技术领域，具体涉及水稻OsUGT706E2基因在调控水稻稻瘟病抗性中的应用。为挖掘并克隆更多的稻瘟病数量抗性基因，本发明研究发现过表达OsUGT706E2能够显著降低转基因植株的稻瘟病叶瘟抗性，并且转基因植株在生长状态及农艺性状上没有明显的改变，表明OsUGT760E2负向调控水稻叶瘟抗性。本发明首次证明了水稻基因OsUGT760E2(LOC_Os05g45200)是调控水稻叶瘟抗性的功能基因，为后续通过基因工程培育水稻稻瘟病抗性种质提供了新的基因资源，可以通过基于基因编辑的技术手段应用于生产实践中，改良水稻的稻瘟病抗性，从而保障水稻生产的安全。
Description
技术领域
本发明属于分子育种技术领域，具体涉及水稻OsUGT706E2基因在调控水稻稻瘟病抗性中的应用。
背景技术
由真菌(Magnaporthe Oryza)引起的水稻稻瘟病是世界各稻区危害最严重的水稻病害之一，对全球稻作栽培具有毁灭性的影响。稻瘟病每年均给水稻栽培带来不同程度的危害，一般减产10～20％，重则达40～50％，局部田块甚至颗粒无收。当前，稻瘟病有越来越严重的趋势，大部分抗病品种推广应用2～3年后即丧失其稻瘟病抗性。如高抗稻瘟病品种“窄叶青8号”，推广种植不到三年便丧失抗性，高产抗病优质品种“粳籼89”，推广不到四年，其抗病性也明显下降。因此，水稻品种稻瘟病抗性周期短是水稻生产中的一个普遍而突出的问题，增强水稻的持久抗病性已成为水稻品种改良中需要优先解决的问题。
目前，利用品种的抗性开展稻瘟病抗性育种被认为是最经济、有效和环境友好的稻瘟病防治途径。然而，多年的生产实践证明，应用以往的常规遗传育种技术进行水稻稻瘟病持久抗性育种非常困难。同时，对稻瘟病持久抗性品种Moroberekan、谷梅2号和三黄占2号的抗病遗传分析结果表明，稻瘟病持久抗性由质量抗性和数量抗性两部分组成。其中，由主效基因控制的稻瘟病抗性称为质量抗性(完全抗性)，其表现为水稻寄主与稻瘟病菌的不亲和性，具有小种专化性。在以往的稻瘟病抗性育种中，往往只利用了个别的主效基因。这些品种大面积推广应用时，一旦遇到新的小种或毒性产生变异的病原菌时就会丧失其抗病性。这是造成水稻品种稻瘟病抗性周期短的根本原因。与之相对应的是数量抗性(部分抗性)，由多个微效基因组成。数量抗性表现为寄主与病菌的亲和性，抑制稻瘟病菌繁殖，延缓发病进程，在形态上表现为叶片的病斑数少、病斑小。由于数量抗性的小种专化性不强，且由于其微效多基因的性质不容易被稻瘟病菌克服，数量抗性被认为与水稻稻瘟病持久抗性紧密相关，已成为研究的热点和前沿。因此，挖掘并克隆更多的稻瘟病数量抗性基因是解决水稻持久抗病性的关键所在。鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种调控水稻叶瘟抗性的基因OsUGT760E2，该基因可以负向调控水稻叶瘟抗性，有望在生产实践中用于改良水稻的稻瘟病抗性，从而保障水稻生产的安全。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明第一方面提供了水稻OsUGT706E2基因在调控水稻稻瘟病抗性中的应用，所述OsUGT706E2基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，并具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。
优选地，所述OsUGT706E2基因负向调控水稻稻瘟病抗性。OsUGT706E2基因在水稻中的表达量增加，水稻的稻瘟病抗性降低；反之，OsUGT706E2基因在水稻中的表达受到抑制或者表达量降低，水稻的稻瘟病抗性提高。
本发明利用ubiquitin启动子过表达OsUGT760E2基因的水稻转化载体。该载体转化水稻后能大幅提高OsUGT760E2的表达量，伴随着表达量的提高，转化植株的叶瘟抗性显著降低，但转基因植株在生长状态及农艺性状上没有明显的改变，表明该基因负向调控水稻叶瘟抗性。因此，有望通过基因编辑技术(如CRISPR/Cas9)降低OsUGT760E2的表达，并应用于水稻的基因遗传工程育种中，最终提高水稻的稻瘟病抗性，保障粮食安全。
优选地，所述水稻的品种包括但不限于C419绿梗占。
优选地，所述稻瘟病抗性为稻瘟病数量抗性。
优选地，所述OsUGT706E2基因还包括与其相关的生物材料，所述相关的生物材料包括编码OsUGT706E2基因的蛋白，含有OsUGT706E2基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
本发明第二方面提供了一种培育高抗稻瘟病水稻品种的方法，其特征在于，利用基因编辑技术抑制OsUGT706E2基因在水稻中的表达，或者降低OsUGT706E2基因在水稻中的表达量；所述OsUGT706E2基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，并具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
优选地，所述基因编辑技术包括CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明经研究发现，表达OsUGT706E2能够显著降低转基因植株的稻瘟病叶瘟抗性，并且转基因植株在生长状态及农艺性状上没有明显的改变，表明OsUGT760E2负向调控水稻叶瘟抗性。本发明为后续通过基因工程培育水稻稻瘟病抗性种质提供了新的基因资源，可以通过基于基因编辑的技术手段应用于生产实践中，改良水稻的稻瘟病抗性，从而保障水稻生产的安全。同时，本发明首次证明了水稻基因OsUGT760E2(LOC_Os05g45200)是调控水稻叶瘟抗性的功能基因。该基因的克隆和生物学功能验证对于水稻稻瘟病抗性的分子机制研究有重要的参考意义。
附图说明
图1为1300-Ubi-GFP载体的结构图谱；
图2为转基因植株中OsUGT760E2表达水平的检测结果，星号表示与野生型相比有显著性差异；
图3为过表达OsUGT760E2降低水稻的叶瘟抗性；A：野生型和OsUGT760E2过表达植株接种B157后6天的照片；B：野生型和OsUGT760E2过表达植株接种B157后6天的菌斑大小；C：野生型和OsUGT760E2过表达植株接种Guy11后6天的照片；D：野生型和OsUGT760E2过表达植株接种Guy11后6天的菌斑大小。NI表示未接种稻瘟病菌的水稻叶片，星号表示与野生型相比有显著性差异。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
以下实施例涉及的OsUGT760E2基因的ID号为LOC_Os05g45200，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
SEQ ID NO.1：
ATGATGACAGAAACGGTGGTTGTGAACGCGGGGCTTGGCGTCGGCCATCTGGCCCCAATGGTGGAGCTTGCCAATCTCTTCCCGCGGCACGGCCTCGCCGTCACCGTCGTCCTCATTGAGCCTCCGGCAAAGCCGCCCAGCTTCGCCGCCGCGGTCTCCCGGTCCATGGCTTCCAACCCTCGCATCACCTTCCACGTGATGCCCTCGCCTTCCTGCCACAGCAACGTGCCCGAGCTCATCCGCGCCATGAATGCGCCACTGCGCGAGTGCCTACGCTCGTCGGTGCCCTCTGCTCGCGCGGTCGTCTTCGACATGTTCTGCGCCTGCGCGCTCGACGTCGCCGCCGAGCTCGGGCTACCGGCCTACTTCTTCCAGTGCGGCGGCGCCAGCCACCTCGCCGTCGGCTTGCACCTCCCGCACGTGCAGGCCGAGATAAACGCCAGCTTCGGGGAGATCGGCGACGAGCCCCTCCTGTTCCCCAGCGTCCCGCCGTTCAAACCCAGTGACCTCCCCAAGGCAGCACTCGACCGCAACGACGAGATGTACAGATGGATTCTGGGCGTGTTCGAGCGGCTCCCGGAATCCCGCGGCATCCTCGTCAACACGTTCCAGTGGCTGGAGACGAAGGCGCTGCGCGCGCTCGGGGACGGCGCGTGCGTCGTCGGCCGCCCCACGCCGCCGGTGTGCTGCGTCGGGCCACTGGTCTCGCGAAGCGGGGAGGACAAGAAGCACGGGTGCCTCTCATGGCTGGACGCGCAGCCGGAGAAGAGCGTCGTGTTCCTCTGCTTCGGGAGCATGGGCTCGTTCCCCAAGGAGCAGCTCGCGGAGATCGCCATTGGGCTGGAGAGGTCCGGACAGAGGTTCCTGTGGGTGGTGCGGCGTCCGCACGCCGGCGAGGCTTCGCTCTCAGGTTTGCTCGCCGGGTGTCACGGCACGCACGGCGAGCTGGACATCGACGAGCTCATGCCGGAGGGGTTCTTGGAGAGGACCAAGGGCAGGGGGCTCGCCGCCGGGTCGTGGGCGCCGCAGGCGGACGTGCTGCGGCACAGGGCGACCGGCGCGTTCGTGACGCACTGCGGGTGGAACTCGGTGCTGGAGGGGATCGCCGCCGGCGTGCCACTGCTGTGCTGGCCGCTCTACGCGGAGCAGAGGCTGAACAAGGTGTTCATCATGGAGGAGGTCGGGGTCGGCGCTGTGATGGCGGGGTACGACGGCGAGGTGGTCAGAGCCGAGGAGGTGGAGGCGAAGGTTAGGTGGATGCTGGAGTCGAATGAAGCGTCGCCGATCCGTGAGCGAGTGGCGCTGGCGAAGGAGCGGGCCGAAGAGGCGACGAGGAAATCTGGCTCGTCGCATCAATCATTTGTCAAGTTTCTGATAGACTTTGGCGTGA。
SEQ ID NO.2：
MMTETVVVNAGLGVGHLAPMVELANLFPRHGLAVTVVLIEPPAKPPSFAAAVSRSMASNPRITFHVMPSPSCHSNVPELIRAMNAPLRECLRSSVPSARAVVFDMFCACALDVAAELGLPAYFFQCGGASHLAVGLHLPHVQAEINASFGEIGDEPLLFPSVPPFKPSDLPKAALDRNDEMYRWILGVFERLPESRGILVNTFQWLETKALRALGDGACVVGRPTPPVCCVGPLVSRSGEDKKHGCLSWLDAQPEKSVVFLCFGSMGSFPKEQLAEIAIGLERSGQRFLWVVRRPHAGEASLSGLLAGCHGTHGELDIDELMPEGFLERTKGRGLAAGSWAPQADVLRHRATGAFVTHCGWNSVLEGIAAGVPLLCWPLYAEQRLNKVFIMEEVGVGAVMAGYDGEVVRAEEVEAKVRWMLESNEASPIRERVALAKERAEEATRKSGSSHQSFVKFLIDFGV。
实施例1水稻OsUGT706E2基因在稻瘟病抗性中的调控作用研究
1、OsUGT760E2基因的克隆及过表达载体的构建
利用玉米ubiquitin启动子构建的OsUGT760E2过表达水稻转化载体将OsUGT760E2基因的全长cDNA序列克隆到过表达载体1300-Ubi-GFP的ubiquitin启动子下游的Sma1的酶切位点之间，由此形成过表达载体，具体操作如下：
取来源于广东陆丰普通野生稻的幼苗叶片部位，用TriZol Reagent(Invitrogen公司，其货号为：15596026)提取叶片总RNA，采用甲醛变性凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的纯度(A260/A280比值一般在2.0-2.2之间)及量(一般要求大于500ng/uL)。然后取1μg总RNA进行起始逆转录反应，所采用的逆转录酶为PrimeScript(TAKARA公司)，逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。再以逆转录产物为模板，采用引物(F：CTGATTAACAGGGATCCCCCATGGAGCCCAATTCAAAACAGAGT；R：TCGAGACTAGTGGTACCCCCATCCACGAAATCAGAGAACGCC)进行PCR扩增，PCR所用的聚合酶为KOD FX(Toyobo公司)。反应体系为50uL，按照KOD FX的说明书配制PCR反应体系。反应条件为：94℃、5min；94℃、30sec，60℃、30sec，68℃、1min30sec，34个循环；68℃、10min。PCR扩增获得约1413bp的片段。采用PCR产物直接纯化的方法回收该片段后，用Sma1(Takara)酶对片段和1300-Ubi-GFP载体(图1,同专利CN112662682A中的pCAMBIA1300-GFP载体)分别进行单酶切，酶切后分别回收目标片段和载体片段，用Exnase II重组酶(Vazyme公司)37℃重组连接30min，把OsUGT760E2的全长cDNA序列克隆到过表达载体1300-Ubi-GFP的ubiquitin启动子下游的Sma1的酶切位点之间。重组体系为：Exnase II重组酶1uL，5X CE II buffer 2uL，OsUGT760E2基因片段1uL(30ng)，1300-Ubi-GFP载体2uL(130ng),灭菌水4uL。取5uL连接产物，用热激法转化到大肠杆菌DH5α(上海生工)中，并将转化产物涂布于卡那霉素抗性的LB固体培养基。37℃培养过夜，挑8个单克隆进行质粒提取，经酶切鉴定8个均能切出约1400bp大小的条带，选择两个阳性克隆送上海生工进行测序，结果显示是目的条带。该序列全长1413个碱基，其序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白具有471个氨基酸残基，其序列如SEQ ID NO.1所示。由此构建OsUGT760E2的过表达载体。
2、OsUGT760E2过表达植株的获取
采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法将构建成功的过表达载体转入栽培稻品种C419(绿梗占)中。对所得转化原代(T0代)的转基因苗通过PCR扩增潮霉素载体片段，从DNA水平鉴定阳性转化植株。扩增潮霉素的引物序列如下：hptF：TCGTGCTTTCAGCTTCGATGTA；hptR：AGAAGAAGATGTTGGCGACCTC。
其中，PCR扩增体系为：TaqDNA聚合酶0.2μL、10×buffer 2μL、dNTP(10m mol/L)0.2μL、hptR(10μmol/L)0.3μL、hptF(10μmol/L)0.3μL、1μL DNA、ddH2O 16μL。PCR反应程序为：94℃4min；94℃0.5min，60℃0.5min，72℃0.5min，30个循环；72℃补充10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。所得阳性植株经自交得到转基因1代(T1代)株系，每个株系选择10株经PCR检测为阳性的植株繁种，得到T2代植株，T2代株系再进行PCR检测，找到来源于不同T0代植株的T2代纯合株系2个。对2个株系(OE3、OE5)的幼苗叶片进行荧光定量PCR，检测目标基因OsUGT760E2的表达量，并以野生型为对照。
荧光定量PCR鉴定OsUGT760E2基因在转基因植株中过表达效果的方法如下：
取PCR检测阳性的转基因植株三叶期幼苗叶片进行总RNA提取，采用的试剂为TriZol Reagent(Invitrogen公司，其货号为：15596026)，根据该试剂的说明书的步骤进行，并用甲醛变性凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的纯度及质量，取1μg总RNA进行起始逆转录反应，所采用的逆转录酶为PrimeScript(Takara公司)，逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。以逆转录产物为模板，采用引物对45200F和45200R检测OsUGT760E2基因的表达情况，并以水稻管家基因EF1α的引物对EF1αF和EF1αR检测水稻EF1α基因的表达作为内参。所采用的引物序列如下：45200F：GAGGGCGACTTGAAGGACAT；45200R：TGATAGACCAGCGAAGCACC；EF1αF：TTTCACTCTTGGTGTGAAGCAGAT；
EF1αR：GACTTCCTTCACGATTTCATCGTAA。
结果表明，相对于野生型，这2个株系的OsUGT760E2表达量都提高4倍以上(图2)。证明目标基因已经转化到水稻中，并且实现目标基因的表达量提高，筛选的纯合阳性转基因株系(OE3、OE5)用于后续的表型鉴定。
3、OsUGT760E2过表达转基因植株叶瘟抗性鉴定
稻瘟病叶瘟抗性鉴定采用离体接种的方法，使用的菌株为Guy11和B157(从华南农业大学邓懿祯老师课题组获取)，具体方法如下：
剪取三叶期水稻(OE3、OE5)幼苗的第1片叶片(从上至下)于方形培养皿(事先于底部靠边位置平行粘贴2条双面胶)内进行固定(叶尖端与末端分别粘于双面胶，叶片背面朝上)，将2条脱脂棉卷成适合放入方形培养皿大小的条状，蘸取含2μg·mL–1的激动素(kinetin,KT)的无菌超纯水,轻轻挤去多余的液体，分别贴于叶尖端与叶末端，盖上培养皿盖备用。用灼烧灭菌的打孔器在培养8d后的稻瘟病菌菌落边缘打取菌碟，用灭菌的牙签挑取3～5个菌碟倒扣(菌丝面朝下)于同一叶片(背面)上，并以同样数量、大小且无菌的西梅果汁培养基为对照进行接种。接种完成后，盖上培养皿盖(无需封口)，将整个方形培养皿轻轻放入托盘中，小心地向托盘中加入适量无菌水(注意不要没过培养皿导致培养皿内进水),用保鲜膜封住托盘以充分保湿，最后将整个托盘置于28℃下黑暗处理24h，再转移至光/暗交替(12h/12h)条件下继续处理，处理期间可观察托盘内水量，确保适量的水分，5d后可开始观察水稻离体叶片的发病情况。接种7d后通过ImageJ程序测量病斑面积，将接种后的叶片通过双面胶固定在白纸上并照相。
结果表明，与野生型相比，OsUGT760E2过表达植株的叶瘟抗性显著降低(图3)，表明OsUGT760E2负向调控水稻叶瘟抗性。
综上可见，水稻基因OsUGT760E2是水稻叶瘟抗性的功能基因，该基因的过表达OsUGT706E2能够显著降低转基因植株的稻瘟病叶瘟抗性，并且转基因植株在生长状态及农艺性状上没有明显的改变，表明OsUGT760E2负向调控水稻叶瘟抗性，为后续通过基因工程培育水稻稻瘟病抗性种质提供了新的基因资源，具有重要的潜在应用价值。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.水稻OsUGT706E2基因在调控水稻稻瘟病抗性中的应用，其特征在于，所述OsUGT706E2基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，并具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述OsUGT706E2基因负向调控水稻稻瘟病抗性。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻的品种包括C419绿梗占。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述稻瘟病抗性为稻瘟病数量抗性。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述OsUGT706E2基因还包括与其相关的生物材料，所述相关的生物材料包括编码OsUGT706E2基因的蛋白，含有OsUGT706E2基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
6.一种培育高抗稻瘟病水稻品种的方法，其特征在于，利用基因编辑技术抑制OsUGT706E2基因在水稻中的表达，或者降低OsUGT706E2基因在水稻中的表达量；所述OsUGT706E2基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，并具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的一种培育高抗稻瘟病水稻品种的方法，其特征在于，所述基因编辑技术包括CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术。
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