CN103451225A - 水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育植物抗病品种中的应用 - Google Patents
水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育植物抗病品种中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103451225A CN103451225A CN201210183789XA CN201210183789A CN103451225A CN 103451225 A CN103451225 A CN 103451225A CN 201210183789X A CN201210183789X A CN 201210183789XA CN 201210183789 A CN201210183789 A CN 201210183789A CN 103451225 A CN103451225 A CN 103451225A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- oswrky21
- gene
- rice
- transcription factor
- plant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 title claims abstract description 67
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 title claims abstract description 66
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 title claims abstract description 62
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 title description 2
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims abstract description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 27
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 27
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 53
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 11
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 abstract description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 abstract 1
- 241001330975 Magnaporthe oryzae Species 0.000 description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 description 12
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 11
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 11
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 230000004665 defense response Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 102100032814 ATP-dependent zinc metalloprotease YME1L1 Human genes 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 101800000795 Proadrenomedullin N-20 terminal peptide Proteins 0.000 description 2
- 101150109071 UBC gene Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 102000007863 pattern recognition receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010089193 pattern recognition receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- PYIXHKGTJKCVBJ-UHFFFAOYSA-N Astraciceran Natural products C1OC2=CC(O)=CC=C2CC1C1=CC(OCO2)=C2C=C1OC PYIXHKGTJKCVBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- NDVRQFZUJRMKKP-UHFFFAOYSA-N Betavulgarin Natural products O=C1C=2C(OC)=C3OCOC3=CC=2OC=C1C1=CC=CC=C1O NDVRQFZUJRMKKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241001344131 Magnaporthe grisea Species 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- IHPVFYLOGNNZLA-UHFFFAOYSA-N Phytoalexin Natural products COC1=CC=CC=C1C1OC(C=C2C(OCO2)=C2OC)=C2C(=O)C1 IHPVFYLOGNNZLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108700005085 Switch Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- CUBCNYWQJHBXIY-UHFFFAOYSA-N benzoic acid;2-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1.OC(=O)C1=CC=CC=C1O CUBCNYWQJHBXIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 235000019994 cava Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 210000003298 dental enamel Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- OBISXEJSEGNNKL-UHFFFAOYSA-N dinitrogen-n-sulfide Chemical compound [N-]=[N+]=S OBISXEJSEGNNKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000618 nitrogen fertilizer Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- PIRWNASAJNPKHT-SHZATDIYSA-N pamp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)N)C(C)C)C1=CC=CC=C1 PIRWNASAJNPKHT-SHZATDIYSA-N 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000000280 phytoalexin Substances 0.000 description 1
- 150000001857 phytoalexin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于农业生物技术领域，公开了水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育植物抗病品种中的应用。本发明采用反向遗传学方法研究如SEQ ID NO.1所示的水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21的功能，发现OsWRKY21基因在水稻抗稻瘟病的防御反应中起正调控作用。将OsWRKY21基因克隆入合适的植物表达载体，转化水稻，获得的转基因水稻对稻瘟病的抗性显著增强。因此，可以利用OsWRKY21基因改良水稻及其它作物的抗病性状，培育出抗稻瘟病转基因植物新品种。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，特别涉及水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育植物抗病品种中的应用。
背景技术
水稻病害是导致水稻产量下降和品质劣化的主要因素之一，培育并推广抗病品种是防治水稻病害最为安全有效的方法。但是，传统的抗病育种不仅受可利用抗性遗传资源少的限制，而且选育周期过长，难以抗衡快速变异的病原微生物。而利用单个功能基因来对水稻抗病性进行改良的基因工程策略也没有达到理想的抗病效果。近年来，随着对植物与病原微生物相互识别机制和信号转导途径了解的深入，人们认识到主开关基因（master-switch genes）如转录因子等在植物抗病基因工程中有着广阔的应用前景（Gurr and Rushton,2005）。
研究表明，植物在应对外界病原微生物的长期进化过程中发展了一系列积极的防御机制来保护自身。当与毒力病原物发生相互作用时，植物利用模式识别受体（PRRs）识别病原物相关的分子模式（PAMPs），诱导PAMP触发性免疫应答（PTI），以阻抑病原物生长。另一类防御反应是由植物抗性（R）基因产物（R蛋白）直接或间接地识别生理小种特异的病原物效应子（无毒蛋白）而导致效应子触发性免疫应答（ETI），以阻截入侵病原物。而且，局部的PTI和ETI通常又激活周围甚至远端植物组织中的防御机制，导致系统获得抗性（SAR）的发展，抵抗潜在的再次入侵（An and Mou,2011;Bernoux et al.,2011）。
病原菌侵染引发的植物防御反应与大量植物宿主基因的转录激活有关。这些病原菌诱导的基因编码具有抗菌活性的病程相关（PR）蛋白、参与抗菌化合物（植物抗毒素）生物合成的酶、降解毒性物质的酶以及与植物防御应答信号转导有关的调控蛋白等（van Loon et al.,2006）。因此，植物宿主基因的转录调节是植物防御反应的中心部分，而转录调控基因表达在多数情况下是由反式作用的转录因子特异地识别并结合顺式作用的启动子元件来实现的。一个或少数几个转录因子可以调控一系列下游抗病防御反应基因的表达，有可能通过导入或改良转录因子的基因工程方法来综合改良植物抗病性状。因此，探寻在水稻抗病防御反应中具有正调控作用的转录因子基因对培育抗病转基因水稻新品种有着非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育抗稻瘟病植物品种中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育抗稻瘟病植物品种中的应用；
所述的水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21的编码核苷酸序列如下所示：
ATGGCGATGCTGGGGAGCTCGTCGGCGGTGGTGCTGGAGCTGATGACGAT
GGGGTACCAGTCGGCGGCGTACCTCGGCGAGCTGCTCCGGGCGGCGTCCC
CGGCGCAGGCAGGGGATGAGCAGCAGGAGCTCGCCGCGGAGATCCTCCG
CTGCTGCGACCGCGTCATCGCCGAGCTGAACCGGGGAGGAGCCACTGGTG
CTACTACCGGCAAGAAGCGGAAGGCGGCGGAGTCCGCCGCCGCCGCCGC
CGTGACCTCCCCTTCTCTCCCCGTCACGCCGACCAAAAGAAGGGCGCGTG
GCGCGGAGGCGGTGAGGGAGGTGAGGAGCGGCACGACGACGGACGGGT
TCATCTGGAGGAAGTACGGGCAGAAGGAGATCAATGGCTGCAAGCACCCG
AGGCTCTACTACCGCTGCGCGTTCAGGGGCCAGGGCTGCCTCGCCACGCG
GCGGGTGCAGCAGTCGCAGTCGCAGGACGACCCGGCCGCGGCGTTCGTG
ATCGCCTACTACGGCGAGCACACCTGCGGAGGCGACGCCGCCGCCGCCGC
CGCGTGCCGGGACGGGGAACTAATGCCACCTGCCGTCATCAACTCCGGCG
CGTCGAGCTTCGCCGCCGCTTGGAACATGGCCTCGCGTGAGCCGGCGTCG
TCGCTCGCCGTCGAGCGGAGGAGCTGCGACGGCGACGCTCCCAGCGAGA
CGTCGCAGGGGTGGTCTCCCTCCTTCTCGTCGGAGGTGGAGCTGGACGTG
GTGGGATTCGACCTCGCCGGAGCCGACTCGTCGGCGTCGCCGGTGTGGGA
GTTCTTGAATGGCAGCTTCGACTGGGAATTCGTCATCAACTCCCTCTGA；
所述的植物指的是对稻瘟病菌敏感的禾本科植物，优选为水稻；
所述的水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育抗稻瘟病植物品种中的应用的步骤如下：应用农业生物技术方法，将水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21转化入植物细胞，得到表达OsWRKY21蛋白的植物品种。
其中，使用PCR技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsWRKY21基因部分以及全长DNA或与其同源的一段DNA。将上述分离到包含OsWRKY21基因的序列与合适的植物表达载体连接，转化植物，获得表达OsWRKY21基因的抗病转基因植物。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：与传统的抗病育种技术相比，植物抗病基因工程技术可以突破物种间的生殖隔离和远缘杂交不亲合性，在较短的时间内实现目标性状的定向改良，给作物提供更为全面而持续、广谱且特异的保护。然而，目前在植物抗病基因工程中，大多数是通过转入或改良个别功能基因的方法来提高作物的抗病性，抗病效果往往不太稳定或不够彻底。本发明的发明人通过基因功能研究，发现OsWRKY21基因在水稻抗稻瘟病的防御反应中起正调控作用，即OsWRKY21基因能够提高水稻抗稻瘟病的能力。OsWRKY21基因是转录因子基因，其在植物体内过量表达时，可以转录激活一系列下游抗病功能基因的表达，赋予转基因植物良好的抗病效果，从而克服转入个别功能基因的不足之处。
附图说明
图1是用105/ml稻瘟病菌00-193a孢子悬浮液喷施处理三周龄水稻苗后的OsWRKY21基因的表达谱分析图。
图2是用2mM SA喷施处理三周龄水稻苗后的OsWRKY21基因的表达谱分析图。
图3是用100μM JA喷施处理三周龄水稻苗后的OsWRKY21基因的表达谱分析图。
图4是0.5mM BTH喷施处理三周龄水稻苗后的OsWRKY21基因的表达谱分析图。
图5是载体pFGC1008的结构示意图。
图6是T3代OsWRKY21过量表达纯合植株（株系6、10）的分子检测图；上面一行是内参基因UBC（AK059694）的RT-PCR结果，中间一行是OsWRKY21基因的RT-PCR结果，下面一行是OsWRKY21基因的PCR结果；由于上游检测引物与载体序列配对，因此野生型植株PCR结果为阴性。
图7是OsWRKY21过量表达增强水稻对稻瘟病菌抗性的检测图；其中，
A：T3代OsWRKY21过量表达纯合植株（株系6、10）和野生型植株生长至3周龄时，人工喷雾法接种稻瘟病菌00-193a孢子悬浮液，7天后每株水稻剪取第4片叶中间10cm长部分拍照；
B：各个株系20片叶的10cm长叶片感性病斑数目的平均值和误差分析。感性病斑数目的测量使用软件image J完成，差异显著性分析使用SPSS 13.0完成，**表示P值<0.01。
图8是T3代OsWRKY21 RNAi纯合植株（株系2、9）的分子检测图；上面一行是内参基因UBC（AK059694）的RT-PCR结果，中间一行是OsWRKY21基因的RT-PCR结果，0.5mM BTH处理后12小时取样，同时设置一组未处理的野生型植株作对照，下面一行是OsWRKY21基因的PCR结果；由于上游检测引物与载体序列配对，因此野生型植株PCR结果为阴性。
图9是OsWRKY21基因沉默使水稻对稻瘟病菌侵染更敏感的检测图；其中，
A：T3代OsWRKY21 RNAi纯合植株（株系2、9）和野生型植株生长至3周龄时，0.5mM BTH预处理2天后，人工喷雾法接种稻瘟病菌00-193a孢子悬浮液，7天后每株水稻剪取第4片叶中间10cm长部分拍照；
B：各个株系20片叶的10cm长叶片感性病斑数目的平均值和误差分析。感性病斑数目的测量使用软件image J完成，差异显著性分析使用SPSS 13.0完成，**表示P值<0.01。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
首先，对于实施例的内容进行简要概述：本发明前期对水稻受稻瘟病菌侵染24小时后的全基因组表达谱芯片进行了分析，发现水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21的表达能被稻瘟病菌侵染所诱导，由于OsWRKY21基因的生物学功能尚未见报道，因此本发明对OsWRKY21基因在植物抗病中的功能和应用开展了研究。本发明的发明人从稻瘟病菌诱导的水稻叶片cDNA文库中分离克隆出包含OsWRKY21基因全长编码框（SEQ ID NO.1）的DNA片段。采用荧光定量PCR技术分析OsWRKY21基因在多种因子刺激下的表达谱，结果表明OsWRKY21基因的表达能被SA、BTH和JA处理及稻瘟病菌侵染诱导而剧烈上调（图1～4）。在水稻中过量表达OsWRKY21基因，转基因植株对稻瘟病的抗性得到极大提高（图6和7）。而采用RNA干扰技术抑制OsWRKY21基因的表达，BTH诱导的水稻对稻瘟病的耐受性在OsWRKY21基因沉默植株中也被抑制（图8和9）。上述结果表明OsWRKY21基因在水稻抗稻瘟病的防御反应中起正调控作用，可以利用该基因改良水稻及其它作物的抗病性状，培育出抗病转基因植物新品种。
实施例1 OsWRKY21基因的分离克隆
以水稻品种日本晴（罗林广等.水稻雄性不育系珍汕97A抽穗期的基因型分析.遗传学报,2001,28(11)）为材料，对正常土培的三周龄野生型水稻苗喷施以广东省致病性较强、致病频率较高的稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）菌株00-193a（欧阳冬梅等，Basmatic370突变体BTX抗稻瘟病遗传分析及基因标记定位.分子植物育种,2009,7(1)）的孢子悬浮液（105个/mL），24小时后用Trizol试剂（购自Invitrogen）提取成功接种的水稻叶片总RNA（提取方法参见Trizol说明书），运用逆转录酶M-MLV（购自Invitrogen）将总RNA逆转录合成cDNA第一链（方法参见逆转录酶说明书），反应条件为：25℃ 5min；37℃ 60min；70℃ 10min。以cDNA为模板，利用OsWRKY21基因特异性引物F1（5’-AGTTGGCGCGCCAGAGTGAGGAGCATGG-3’，下划线序列为AscI酶切位点）和R1（5’-CAGGATCCATCGAAAATTCAGAGGG-3’，下划线序列为BamHI酶切位点）进行PCR，扩增出含有OsWRKY21基因全长编码框的DNA片段，反应条件为：94℃预变性2min；96℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 2min，30个循环；72℃延伸2min。将获得的PCR产物连入pGEM-T载体（购自Promega），转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（购自TaKaRa），筛选测序为正确的阳性克隆并命名为pGEM-OsWRKY21，扩增得到的序列如下：
GGCGCGCCAGAGTGAGGAGCATGGCGATGCTGGGGAGCTCGTCGGCGGT
GGTGCTGGAGCTGATGACGATGGGGTACCAGTCGGCGGCGTACCTCGGCG
AGCTGCTCCGGGCGGCGTCCCCGGCGCAGGCAGGGGATGAGCAGCAGGA
GCTCGCCGCGGAGATCCTCCGCTGCTGCGACCGCGTCATCGCCGAGCTGA
ACCGGGGAGGAGCCACTGGTGCTACTACCGGCAAGAAGCGGAAGGCGGC
GGAGTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTGACCTCCCCTTCTCTCCCCGTCACGCC
GACCAAAAGAAGGGCGCGTGGCGCGGAGGCGGTGAGGGAGGTGAGGAG
CGGCACGACGACGGACGGGTTCATCTGGAGGAAGTACGGGCAGAAGGAG
ATCAATGGCTGCAAGCACCCGAGGCTCTACTACCGCTGCGCGTTCAGGGG
CCAGGGCTGCCTCGCCACGCGGCGGGTGCAGCAGTCGCAGTCGCAGGAC
GACCCGGCCGCGGCGTTCGTGATCGCCTACTACGGCGAGCACACCTGCGG
AGGCGACGCCGCCGCCGCCGCCGCGTGCCGGGACGGGGAACTAATGCCA
CCTGCCGTCATCAACTCCGGCGCGTCGAGCTTCGCCGCCGCTTGGAACATG
GCCTCGCGTGAGCCGGCGTCGTCGCTCGCCGTCGAGCGGAGGAGCTGCGA
CGGCGACGCTCCCAGCGAGACGTCGCAGGGGTGGTCTCCCTCCTTCTCGT
CGGAGGTGGAGCTGGACGTGGTGGGATTCGACCTCGCCGGAGCCGACTCG
TCGGCGTCGCCGGTGTGGGAGTTCTTGAATGGCAGCTTCGACTGGGAATT
CGTCATCAACTCCCTCTGAATTTTCGATGGATCC。
实施例2 OsWRKY21基因的表达谱分析
以水稻品种日本晴为材料，对正常土培的三周龄野生型水稻苗喷施以105/ml稻瘟病菌00-193a孢子悬浮液、2mM水杨酸（SA）、0.5mM苯并噻二唑（BTH）和100μM茉莉酸（JA），所有溶液都加入0.05%（v/v）的Tween20以增加叶片表面黏附性；模拟对照组（mock）分别喷施各种溶液中的溶剂成分。稻瘟病菌诱导实验取样时间为0h，6h，12h，24h，48h，72h。SA和JA处理实验取样时间为0h，0.5h，1h，3h，6h，9h，12h，24h。BTH处理实验取样时间为0h，0.5h，1h，3h，6h，9h，12h，24h，36h，48h。用Trizol试剂（购自Invitrogen）提取各样品总RNA（提取方法参见Trizol说明书），运用DNaseI（RNase free，购自Promega）消化基因组DNA污染（方法参见DNaseI说明书），运用逆转录酶M-MLV（购自Invitrogen）将总RNA逆转录合成cDNA第一链（方法参见逆转录酶说明书），反应条件为：25℃ 5min；37℃ 60min；70℃ 10min。以cDNA为模板，以UBC基因（登录号：AK059694）为内参基因（UBC基因扩增引物为：F3：5’-CCGTTTGTAGAGCCATAATTGCA-3’和R3：5’-AGGTTGCCTGAGTCACAGTTAAGTG-3’），利用OsWRKY21基因特异性引物F4（5’-CCGGTGTGGGAGTTCTTGAA-3’）和R4（5’-TCGATAGTTCCCGCGAAATT-3’）进行实时定量PCR，反应条件为：95℃预变性2min；95℃ 15sec，60℃ 35sec，40个循环。在各种处理条件下对OsWRKY21基因表达量的检测结果表明（如图1～4所示），OsWRKY21基因能被稻瘟病菌侵染以及SA、BTH和JA处理不同程度地诱导而剧烈上调，是一个与植物抗病防御反应相关的转录因子基因。
实施例3 OsWRKY21基因过量表达转基因水稻的产生和抗病鉴定
以AscI、BamHI双酶切pGEM-OsWRKY21质粒并获得OsWRKY21的全长编码框序列，将获得的OsWRKY21基因全长编码框序列插入如图5所示的pFGC 1008载体（Kerschen et al.Effectiveness of RNA interference in transgenicplants.FEBS letters.2004,566(1)）的AscI和BamHI酶切位点之间，具体重组步骤参见TaKaRa公司限制性内切酶和T4连接酶说明书，将重组质粒转化大肠杆菌菌种DH5α，酶切鉴定为阳性的克隆即含有OsWRKY21基因过量表达载体。
以日本晴胚性愈伤组织为转化受体，采用农杆菌介导法将OsWRKY21基因过量表达载体导入到受体材料中，经过与农杆菌LBA4404（Hiei etal.Efficienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant Journal.1994,6(2)）共培养（Hieiet al.,1994）后，再进行潮霉素抗性愈伤组织的筛选、预再生、再生、生根等步骤产生T0代转基因植株（许新萍等.用基因枪法转化水稻获得转基因植株.中山大学学报（自然科学版）.1997,36(6)）。
T0代转基因植株自交产生后代，选取两个独立的OsWRKY21过量表达转基因纯合株系进行抗稻瘟病鉴定。将T3代OsWRKY21过量表达转基因材料浸种催芽后穴播在30×20×5cm搪瓷盘里，每盘播24穴，每穴10粒种子，同时播种野生型材料、抗病对照品种（三黄占2号）（朱小源等.三黄占2号及其衍生品种抗稻瘟病特征研究.广东农业科学.2003,39(2)）和感病对照品种（CO39）（何月秋等.利用PCR标记对水稻稻瘟病菌适合度的测定.植物病理学报,1999,29(3)），每种材料均设2组重复。秧苗长至1叶1心时施氮肥硫酸铵0.5g/盘，接种前共施3次。用三周龄苗人工喷雾接种广东省致病性较强、致病频率较高的稻瘟病菌株00-193a，接种孢子浓度为105/ml，接种菌液量为20ml/盘，25℃暗房保湿24h，再移至25～28℃荫棚下迷雾保湿。7d后进行病级调查，统计第4片叶中部10cm的感性病斑的数目，每种材料的统计样本数不少于20。实验重复3次。结果表明（如图6和7所示），OsWRKY21过量表达转基因水稻叶片上的感性病斑数目明显少于野生型对照植株（t检验P值均小于0.01），OsWRKY21过量表达能够极大地增强水稻对于稻瘟病的抗性。
实施例4 OsWRKY21基因沉默表达转基因水稻的产生和抗病鉴定
通过序列比对（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）发现OsWRKY21基因非编码区的一段序列（如下所示）特异性较高，因此以这一序列为基础构建OsWRKY21基因沉默载体较为合适。
ATTTTCGATGCTTCGTGATCAGTAGCACACCAGCTGCCCCAAGAGTGC
AGTAGTCTTTGCAAAACGCACAAAATTTCGCGGGAACTATCGAATTTCCCG
CGTTTGCGCTTAAGTTAATAGCCTCAGTAGTTCGTCAGATAATCGCACGCA
CTATTTTAATTCAGGAAGGGATTTAGATTGACAAAGTATATTAGGTGAGAGT
TAATATGGGAGAATTCGTAATGAAGAGTTGAATGTGTTGACGTTGACGTAC
AGGGGAAAAACACATGCTAAGAAGAAAAATGGCAGGTGAAAGGGGCAAG
AAATGGCAAAGCTGAGCAACAGAGCAGGTAATAATAGAGAATTGCTACTC
CTACTACTTGCAAGCATATATGTCCAGAAGAGCAGCCAAAGAGAACACAA
GACCGTCAGCTTGACGCATAACTGACGCACTTCTGATGGTAACAAAAAAC
CGGCCACCATGTCCCATGTGAACGAATGGATTCATTAGTTGTAATAATGGTA
ATAGTAGTGACACTCAATTGCAATATCATGCTTGGTACAGGGTTAAGGATCA
GATGG；
OsWRKY21基因沉默载体的构建过程与上述过量表达载体构建过程类似：以同样的方法获得稻瘟病菌诱导的叶片cDNA文库，作为模板，以OsWRKY21基因特异性引物F2（5’-AACTAGTGGCGCGCCATTTTCGATGCTTCGTGATC-3’，下划线序列分别为SpeI、AscI酶切位点）和R2（5’-TTGGATCCATTTAAATCCATCTGATCCTTAACCCT-3’，下划线序列分别为Bam HI、SwaI酶切位点）扩增出含有OsWRKY21基因特异性片段的DNA，PCR条件同上，扩增产物即为上述序列。将获得的含有OsWRKY21基因特异性片段的DNA分别经过AscI和SwaI酶切并插入pFGC1008载体的相应酶切位点之间获得中间载体，再将含有OsWRKY21基因特异性片段的DNA分别经过Bam HI和SpeI酶切并插入中间载体的相应酶切位点之间，具体重组步骤参见TaKaRa公司限制性内切酶和T4连接酶说明书，将重组质粒转化大肠杆菌菌种DH5α，最终测序为正确的阳性克隆即含有OsWRKY21基因沉默载体。
同样，通过农杆菌介导的转化法将OsWRKY21基因沉默载体导入日本晴受体材料，获得转基因植株（具体方法同上）。
选取两个独立的OsWRKY21基因沉默转基因纯合株系进行抗稻瘟病鉴定，稻瘟病菌接种方法与实施例3类似，不同之处是在接种前2天用0.5mM BTH对OsWRKY21基因沉默植株和野生型植株进行喷施预处理，同时设一组未处理的野生型植株作为对照。结果表明（如图8和9所示），与未处理的野生型植株相比，0.5mM BTH预处理的野生型植株对稻瘟病的侵染表现出很大的抗性，而0.5mM BTH预处理的OsWRKY21 RNAi转基因植株对稻瘟病菌的侵染仍然敏感。因此，BTH诱导的水稻对稻瘟病的耐受性被OsWRKY21基因沉默所抑制，证实了OsWRKY21基因沉默使水稻对稻瘟病菌的侵染更加敏感。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育植物抗病品种中的应用，其中，所述的水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21的编码核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述的水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育植物抗病品种中的应用，其特征在于：所述的植物为水稻。
3.根据权利要求1所述的水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育抗病植物品种中的应用，其特征在于步骤如下：应用农业生物技术方法，将水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21转化入植物细胞，得到表达OsWRKY21蛋白的植物品种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210183789.XA CN103451225B (zh) | 2012-06-05 | 2012-06-05 | 水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育植物抗病品种中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210183789.XA CN103451225B (zh) | 2012-06-05 | 2012-06-05 | 水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育植物抗病品种中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103451225A true CN103451225A (zh) | 2013-12-18 |
| CN103451225B CN103451225B (zh) | 2015-06-17 |
Family
ID=49734062
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210183789.XA Active CN103451225B (zh) | 2012-06-05 | 2012-06-05 | 水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育植物抗病品种中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103451225B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108624599A (zh) * | 2018-06-14 | 2018-10-09 | 中山大学 | 水稻OsWRKY21转录因子基因在改良植物抗虫性中的应用 |
| CN110606877A (zh) * | 2019-09-09 | 2019-12-24 | 西北农林科技大学 | 用于小麦抗锈病品种改良的转录因子及其筛选获得方法 |
| CN111926035A (zh) * | 2020-09-08 | 2020-11-13 | 南京农业大学 | 水稻中两个wrky转录因子基因及其编码蛋白的应用 |
| CN114438114A (zh) * | 2020-10-20 | 2022-05-06 | 浙江省农业科学院 | 一种提高水稻对稻瘟病抗性的方法 |
-
2012
- 2012-06-05 CN CN201210183789.XA patent/CN103451225B/zh active Active
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HAK SEUNG RYU ET AL.: "a comprehensive expression analysis of the wrky gene superfamily in rice plants during defense response", 《PLANT CELL REPORTS》 * |
| 宋钰等: "水稻WRKY转录调控因子基因功能研究进展", 《中国水稻科学》 * |
| 黄盼盼: "18个水稻WRKY基因的克隆和OsWRKY21功能分析，黄盼盼，《中山大学硕士学位论文》，2010年12月31日）公开了OsWRKY21在水稻抗酸雨胁迫中起正调控作用", 《中山大学硕士学位论文》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108624599A (zh) * | 2018-06-14 | 2018-10-09 | 中山大学 | 水稻OsWRKY21转录因子基因在改良植物抗虫性中的应用 |
| CN108624599B (zh) * | 2018-06-14 | 2021-10-26 | 中山大学 | 水稻OsWRKY21转录因子基因在改良植物抗虫性中的应用 |
| CN110606877A (zh) * | 2019-09-09 | 2019-12-24 | 西北农林科技大学 | 用于小麦抗锈病品种改良的转录因子及其筛选获得方法 |
| CN111926035A (zh) * | 2020-09-08 | 2020-11-13 | 南京农业大学 | 水稻中两个wrky转录因子基因及其编码蛋白的应用 |
| CN111926035B (zh) * | 2020-09-08 | 2023-02-28 | 南京农业大学 | 水稻中两个wrky转录因子基因及其编码蛋白的应用 |
| CN114438114A (zh) * | 2020-10-20 | 2022-05-06 | 浙江省农业科学院 | 一种提高水稻对稻瘟病抗性的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103451225B (zh) | 2015-06-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102816773B (zh) | 水稻OsWRKY28转录因子基因在改良植物抗病性中的应用 | |
| CN103201385A (zh) | 下调昆虫害虫中的基因表达 | |
| CN103906839A (zh) | 用于增加植物的农学性状的spl16组合物和方法 | |
| CN101548017A (zh) | 利用RNAi技术改良植物抗虫性的方法 | |
| CN102559666B (zh) | 抑制植物病毒的人工miRNA及其构建和用途 | |
| CN107058348A (zh) | 一种提高植物赤霉病抗性的小麦基因及其应用 | |
| CN101418040A (zh) | 植物茉莉酸信号传导调控蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN105087640B (zh) | 调节植物种子发育的基因及其应用 | |
| CN103451225B (zh) | 水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育植物抗病品种中的应用 | |
| CN105624188A (zh) | 一种spl18基因在提高植物产量中的应用 | |
| CN102202493A (zh) | 植物的耐盐性 | |
| CN103627716B (zh) | 一种用于改良玉米株型和提高玉米产量的基因的获得方法和应用 | |
| CN104955947A (zh) | 用于增加植物中胁迫耐受性和生物量的方法和工具 | |
| CN108251435B (zh) | 野生毛葡萄商-24抗病基因VqJAZ4及其应用 | |
| CN108034662B (zh) | 小麦条锈菌pstg_06025基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法 | |
| CN102851300B (zh) | 棉花黄萎病抗病相关基因GbVdr3及其应用 | |
| CN103243110B (zh) | 抗稻瘟病菌的水稻基因OsWRKY19及其应用 | |
| CN108359670A (zh) | 提高砷胁迫水稻耐受性的microRNA基因及其应用 | |
| CN105505946B (zh) | 一种提高水稻穗瘟抗性的基因GF14e、蛋白及其应用 | |
| CN102146126B (zh) | 一种与抗虫相关蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN105112423B (zh) | 一种增强桑树抗病能力的miRNA的克隆及其应用 | |
| CN112852862B (zh) | 拟南芥小肽信号分子rgf7基因的应用 | |
| CN102336826A (zh) | 一种大豆逆境相关转录因子erf及其编码基因与应用 | |
| CN113637678A (zh) | 基因GhSWEET42在防治棉花黄萎病中的应用 | |
| CN102559703B (zh) | 一种来自葡萄冠瘿病拮抗菌水生拉恩氏菌的抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |