CN111926035B

CN111926035B - 水稻中两个wrky转录因子基因及其编码蛋白的应用

Info

Publication number: CN111926035B
Application number: CN202010935363.XA
Authority: CN
Inventors: 徐国华; 顾冕; 张骏
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-09-08
Filing date: 2020-09-08
Publication date: 2023-02-28
Anticipated expiration: 2040-09-08
Also published as: CN111926035A

Abstract

本发明公开了水稻中两个WRKY转录因子基因及其编码蛋白的应用研究表明，OsWRKY21和OsWKRY108基因是在富磷条件下发挥功能，并且其编码的蛋白可以通过与水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPHT1；1启动子结合，调控OsPHT1；1转录水平的表达，从而促进水稻磷素的吸收和积累，维持水稻体内的磷稳态。富磷条件下，pht1；1和wrky21 wrky108突变体营养器官和籽粒中的磷素积累降低。因此，我们提出利用OsWKRY21和OsWKRY108培育富磷条件下磷素奢侈吸收减少的水稻品种方法。

Description

水稻中两个WRKY转录因子基因及其编码蛋白的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，公开了水稻中两个WRKY转录因子基因的应用。

背景技术

磷(Phosphorus,P)是植物生长发育必需的大量营养元素之一。由于磷在土壤中容易被固定和沉淀，其在土壤溶液中的浓度通常只有1-10μM。磷的缺乏常常成为农田及自然生态系统中植物生长的主要限制因子之一(Raghothama,1999)，因此作物的高产优质离不开磷肥的施用。然而，我国磷肥的当季利用效率仅约为10～20％，常年连续施用磷肥使土壤成为潜在的磷库。据测定，我国农田土壤的有效磷含量从30多年前的平均7.4mg/kg增加到现在的24.7mg/kg，在保障粮食增产的同时造成8500万吨的肥料磷累积在土壤中，相当于约5年磷肥生产总量。不仅浪费磷资源，而且还存在与其他营养元素不平衡，及因地表径流、水土流失造成的水体富营养化等生态环境问题。

磷矿是不可再生的资源(Runge-Metzger,1995；Vance et al.,2003；Shen etal.,2011)，因此要充分利用土壤和磷肥资源，契合“化肥减量提效”的国家需求，迫切需要培育在不同供磷环境下均能高效利用磷素的品种，尤其是要面对农田土壤磷富集的现状，培育能够减少奢侈吸收和高效转运分配利用体内磷素的农作物高产优质品种。

植物在漫长的进化过程中形成了一套适应缺磷环境的形态变化及生理生化方面的机制，包括根系构型的改变、酸性磷酸酶及有机酸的分泌、与丛枝菌根真菌形成共生体系等等。所有这些机制都是由一系列复杂而精巧的分子机制进行调控的(Zhang et al.,2014)。近年来，该领域的研究者们针对这些复杂的分子机制做了大量的研究，初步构建了植物磷信号转导途径的分子调控网络。这个网络中还有很多“节点”即基因有待被发掘和研究，且这些基因之间在不同水平还存在着复杂的调控与被调控的关系，一个基因在表达丰度或时间空间上的变化可能会造成整个网络的重新调整(Chiou&Lin,2011)。因此，全面、深入地认知作物响应磷信号的分子调控网络是培育磷高效作物的一个重要前提(Tian etal.,2012；Wu et al.,2013；Liang et al.,2014)。

在自然和农田生态系统土壤中，磷素有效性的变幅巨大。在自然生态系统中约为0.3-3微摩尔/升(μM)(Bieleski,1973；Wang et al.,2012)，而在集约化施磷肥条件下则可达到30-300μM(Kalkhajeh et al.,2017)。上述转录因子大多参与磷缺乏条件下的信号转导途径，而迄今为止对磷充足条件下作物中的磷信号途径仍知之甚少。

另一方面，水稻籽粒(糙米)中总磷含量普遍在2mg/g以上，若在磷供应充足的土壤中生长，部分品种的籽粒总磷含量可接近4mg/g。Pariasca-Tanaka et al.(2015)对在不同施磷水平下收获的水稻种子进行了分析，发现不同基因型水稻的籽粒总磷含量均与施磷水平呈正相关，并且部分基因型籽粒中的磷含量即便是低至0.9mg/g时仍可满足其萌发的需要，也不影响早期幼苗生长活力和最终的籽粒产量。此外，水稻吸收的磷中有60％-85％最终将转移至籽粒，而籽粒中的磷又有65-80％是以植酸形态存在。植酸不能被包括人类在内的单胃动物所消化吸收，而是随着排泄物释放到环境中去造成水体富营养化、磷素损失等环境问题(Yamaji et al.,2016)。综上，降低水稻籽粒中的磷含量对于农业可持续发展和环境保护具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21和OsWRKY108及其编码蛋白的工程应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现

水稻WRKY类转录因子基因OsWRKY21在促进植物对磷的吸收和积累方面的应用，OsWRKY21基因在MSU Rice Genome Annotation Project数据库的序列号为：LOC_Os01g60640；在The Rice Annotation Project数据库的序列号为：Os01g0821600。

作为本发明的一种优选，所述植物为单子叶植物，优选水稻、玉米或小麦，特别优选水稻。

水稻WRKY类转录因子基因OsWRKY108在促进植物对磷的吸收和积累方面的应用，OsWRKY108基因在MSU Rice Genome Annotation Project数据库的序列号：LOC_Os01g60600；在The Rice Annotation Project数据库的序列号为：Os01g0821300。

水稻WRKY类转录因子基因OsWRKY21和OsWRKY108在富磷条件下参与磷素的吸收和转运方面的应用。

水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21和OsWRKY108的编码产物，即转录因子蛋白OsWRKY21和OsWRKY108在促进植物对磷的吸收和积累方面的应用。

水稻WRKY类转录因子基因OsWRKY21和/或OsWRKY108在调控水稻籽粒中的磷含量中的应用。

利用OsWKRY21和OsWKRY108培育富磷条件下磷素奢侈吸收减少的水稻品种方法，通过突变OsWKRY21和OsWKRY108以抑制磷转运体基因OsPHT1；1的表达，并继而在富磷条件下减少水稻对磷素的奢侈吸收(即过量吸收)，即降低水稻营养器官和籽粒中的磷积累。

本发明的有益效果

1.本发明利用基因特异性引物研究了水稻OsWRKY21和OsWRKY108在不同磷处理条件下的基因表达，发现OsWRKY21和OsWRKY108在水稻根中的表达随着外界磷浓度的提高而提高(图1-2)。

2.本发明构建了水稻WRKY类转录因子基因OsWRKY21和OsWRKY108启动子融合了GUS报告基因的转基因植株，揭示了在正常供磷条件下，OsWRKY21和OsWRKY108基因在转录水平近乎组成型的表达模式(图3-4)。

3.本发明首次公开了两个水稻WRKY类转录因子OsWRKY21和OsWRKY108的基因工程应用。转基因实验证明该基因的过量表达显著提高了水稻对磷素的吸收和积累能力，正常供磷条件下转基因阳性苗的叶片、叶鞘和根部中有效磷的含量都达到了野生型的2-3倍(图5-6)。

4.本发明首次提供了两个水稻WRKY类转录因子OsWRKY21和OsWRKY108编码的转录因子蛋白OsWRKY21和OsWRKY108的工程应用。OsWRKY21和OsWRKY108能发生互作形成蛋白复合体(图7)，且其均能通过与水稻OsPHT1；1基因的启动子发生相互作用来调控OsPHT1；1基因的表达(图8)。因此，将这两个目的基因导入植物，有望应用于单子叶植物的遗传改良，特别优选水稻。

5.本发明发现在富磷条件下，pht1；1和wrky21 wrky108突变体营养器官和籽粒中的磷均发生显著降低。因此，我们提出利用OsWKRY21和OsWKRY108培育富磷条件下磷素奢侈吸收减少的水稻品种方法。

附图说明

图1：RT-qPCR分析水稻基因OsWRKY21在不同磷梯度处理条件下地上部与根部的表达。

图2：RT-qPCR分析水稻基因OsWRKY108在不同磷梯度处理条件下地上部与根部的表达。

图3：正常供磷处理条件下，OsWKRY21在水稻不同部位(根、叶片、叶鞘)的表达特征。i-v:主根不同部位；vi:侧根横切面；vii-x:对应主根区域的横切面(vii对应ii,viii对应iii,ix对应iv,x对应v)；xi:叶鞘横切面；xii:叶片横切面。

图4：正常供磷处理条件下，OsWKRY108在水稻不同部位(根、叶片、叶鞘)的表达特征。i-v:主根不同部位；vi:侧根横切面；vii-x:对应主根区域的横切面(vii对应ii,viii对应iii,ix对应iv,x对应v)；xi:叶鞘横切面；xii:叶片横切面。

图5：正常供磷(200μM Pi)和低磷(10μM Pi)处理条件下，OsWRKY21基因超表达株系和野生型(WT)的叶片、叶鞘和根部可提取磷含量。

图6：正常供磷(200μM Pi)和低磷(10μM Pi)处理条件下，OsWRKY108基因超表达株系和野生型(WT)的叶片、叶鞘和根部可提取磷含量。

图7：酵母双在实验验证OsWRKY21与OsWRKY108之间存在互作

图8：酵母单杂实验验证OsWRKY21和OsWRKY108均能与OsPHT1；1启动子之间发生互作

图9：高磷条件下pht1；1,wrky21 wrky108突变体营养器官中磷积累降低且wrky21wrky108中PHT1；1表达显著降低

图10：高磷条件下pht1；1,wrky21 wrky108突变体籽粒中磷积累降低

图11：pCAMBIA1305-GUSPlus质粒图谱

图12：pCAMBIA1300-GN质粒图谱

具体实施方式

实施例1.OsWRKY21和OsWRKY108基因编码区序列的获得

(1)OsWRKY21和OsWRKY108序列信息获得与特征分析

申请人以OsWRKY21(Os01g0821600)和OsWRKY108(Os01g0821300)的基因号在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)的网站数据库中获得其cDNA序列。分析表明，OsWRKY21基因全长编码区(即开放阅读框，ORF)为843bp,共编码280个氨基酸。OsWRKY21含有一个WRKY结构域和1个C2HC型锌指结构(WRKYGQK-X13-CX6C-X26-HTC)，属于典型的Group II型WRKY转录因子。OsWRKY108基因全长编码区为1077bp，共编码358个氨基酸。OsWRKY108含有一个WRKY结构域和1个C2HC型的锌指结构(WRKYGQK-X13-CX7C-X25-HTC)，同样属于典型的Group II型WRKY转录因子。

(2)总RNA提取，cDNA的合成及分子克隆

选用的水稻为粳稻，品种为日本晴(Nipponbare,水稻基因组测序品种)。将水稻籽粒去除颖壳后于30％NaClO中进行消毒30min，再用去离子水洗3-5次后，浸没于水中，28℃，暗培养2-3天至籽粒露白，然后将籽粒摆放于塑料漂浮网上，置于0.5mM CaCl₂中暗培养2-3天后，光照培养，并用1/2Kimura营养液进行培养直至苗龄达到4叶后，分别进行300μM Pi,90μM Pi和1μM Pi条件处理，每2天更换一次营养液，待水稻幼苗长至7叶后，采地上部和根部用于植物总RNA的提取。使用TRIzol Reagent(Invitrogen,USA)抽提植物组织总RNA，用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop仪器检测所提取的总RNA的完整性和浓度，已获得质量较高的总RNA模板，使用反转录试剂盒PrimeScriptRT Reagent(TaKaRa Biotechnology,Dalian,China)进行cDNA的合成。

根据NCBI数据库获得的OsWRKY21和OsWKRY108的CDS序列，并根据该序列设计扩增引物。W21-CDS-F:ATGGCGATGCTGGGGAGCT(SEQ ID NO.1)和W21-CDS-R:TCAGAGGGAGTTGATGACGAAT(SEQ ID NO.2)；W108-CDS-F:ATGCAGGCGCAATCCCGCCTC(SEQ IDNO.3)和W108-CDS-R:TTAATTAATTAGATCAAAACAG(SEQ ID NO.4)。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s,55℃复性30s,72℃延伸45s,32个循环后72℃5min。最终将PCR产物进行克隆，测序获得水稻OsWRKY21和OsWRKY108的序列。测序结果与NCBI数据库中的序列进行比对，完全一致。

实施例2.利用RT-qPCR技术鉴定水稻OsWKRY21和OsWRKY108的时空表达模式

以实施例1获得的“日本晴”cDNA为模板，根据水稻OsWRKY21和OsWRKY108基因cDNA序列，在它们的3’非翻译区(3’UTR)设计特异引物进行定量(RT-qPCR)分析，来鉴定OsWRKY21和OsWRKY108基因的时空表达模式。引物序列如下：

W21-3’-qRT-F:AGTCTTTGCAAAACGCACAAAA

W21-3’-qRT-R:CGCAAACGCGGGAAATT

W108-3’-qRT-F:TCAGGCGCGCATCGAT

W108-3’-qRT-R:CACCGCGACTCGTCATATGT

RT-qPCR具体步骤为：以实施例1获得的cDNA为模板进行RT-qPCR扩增，根据TaKaRa试剂盒说明书使用10μL的反应体系：SYBR PremixExTaq 5μL，上下游引物各0.2μL，50×ROXReference Dye 0.2μL，ddH₂O 2.4μL，稀释后的cDNA模板2μL。反应条件为：95℃ 5min,95℃5s,60℃ 30s,40cycles；95℃ 15s，60℃ 1min,95℃ 15s。定量结果根据内参基因和待检测基因的C_T(Threshold Cycle)值用2^-ΔCt方法计算分析。本实验所使用的内参基因为水稻Actin基因OsActin1(McElroy et al.,1990)，其扩增引物为：

Act-Q-F:GAGTCTGGCCCATCCATTGT

Act-Q-R:AGCATTCTTGGGTCCGAAGA

由图1和图2可以看出，OsWRKY21和OsWKRY108在地上部的表达不受磷处理的影响，但两者在根中的表达与外界磷浓度梯度呈现正相关关系，这表明OsWRKY21和OsWKRY108很有可能是在富磷条件下发挥作用。

实施例3利用OsWRKY21和OsWRKY108启动子融合GUS报告基因的转基因水稻植株研究OsWKRY21和OsWRKY108的时空表达特征

(1)构建启动子融合GUS报告基因的表达载体

选用水稻品种“日本晴”，提取基因组DNA用于OsWRKY21和OsWRKY108启动子序列的克隆。设计带有酶切位点和保护碱基的PCR扩增引物，如下：

ProW21-F:TTaagcttGTCATCTTGGGATTTATGTTTG

ProW21-R:TTggtaccGCTCCTCACTCTCGCACGACA

ProW108-F:TTaagcttGCCTAGCTCGACCACCTC

ProW108-R:TTggatccGGTTCGTGTTGTTCGCTTCG

以野生型日本晴水稻基因组DNA为模板,进行PCR扩增获得OsWKRY21启动子片段(2519bp)和OsWRKY108的启动子序列片段(2582bp)，凝胶电泳回收并克隆到克隆载体pEasy-Blunt上送测序公司(金斯瑞)测序；随后将测序正确的克隆载体进行酶切酶连，最终克隆至表达载体pCAMBIA1300-GN(图12)上，重组载体ProWRKY21-GUS和ProWRKY108-GUS经酶切验证且测序后，通过电转法转入根癌农杆菌(EHA105)内，待用。

(2)转基因植株的获得与检测

将步骤(1)中获得的含有表达载体的农杆菌，通过根癌农杆菌介导的水稻转基因方法将表达载体转入到水稻日本晴品种中。大致步骤如下：诱导获得水稻成熟胚愈伤；将农杆菌侵染水稻愈伤组织，共培养2.5天后转入含有500mg/L羧苄青霉素和50mg/L潮霉素的培养基上进行第一轮筛选14天；移至含有500mg/L羧苄青霉素和80mg/L潮霉素的选二培养基上筛选14天；将新长出的抗性愈伤转入分化培养基中分化，30天后出出苗。最终将分化出的幼苗移入生根培养基中，生根炼苗获得完整的转基因水稻。

对获得的转基因植株以PCR进行阳性苗鉴定，以获得的转基因水稻植株基因组DNA为模板，设计特异的潮霉素片段引物，扩增潮霉素基因，引物序列为：

Hyg-F:ATCTTAGCCAGACGAGCGGG

Hyg-R:ACACAGCCATCGGTCCAGAC

(3)GUS染色检测

将获得的转基因阳性苗在高磷(200μM Pi)条件下处理至第七片叶片完全展开，分别取根、叶片、叶鞘检测β-葡糖糖醛酸苷酶(β-glucuronidase,β-GUS)报告基因的表达情况(Jefferson,R.D.,Kavanagh,T.A.and Bevan,M.W.GUS fusions:b-glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO J.19876,3901–3907)。通过GUS报告基因的表达位置来确定OsWRKY21和OsWRKY108的时空表达特征。结果显示，OsWRKY21和OsWRKY108具有近乎于组成型的表达特征，除根冠处没有表达，其余各组织部位均有强烈表达，而OsWKRY108相比与OsWRKY21，在根的中柱中，表达尤为强烈(图3-4)。

实施例4利用35S启动子+编码区转基因水稻植株研究OsWRKY21和OsWRKY108的功能

(1)目的基因过量表达载体构建

分别对OsWRKY21和OsWRKY108全长序列进行限制性酶切位点分析，设计含有酶切位点的PCR扩增引物，如下：

W21-Ox-F:TTggtaccATGGCGATGCTGGGGAGCT(SEQ ID NO.5)

W21-Ox-R:TTctgcagTCAGAGGGAGTTGATGACGAAT(SEQ ID NO.6)

W108-Ox-F:TTgagctcATGCAGGCGCAATCCCGCCTC(SEQ ID NO.7)

W108-Ox-R:TTtctagaTTAATTAATTAGATCAAAACAG(SEQ ID NO.8)

以实施例1中含有OsWRKY21或OsWRKY108全长CDS克隆质粒为模板进行PCR扩增，PCR产物经胶回收后连上pEasy-Blunt Cloning Vector，测序通过后，经酶切酶连，导入到pCAMBIA1305-GUSPlus超表达载体(图11)上，重组质粒WRKY21-Ox-1305及WRKY108-Ox-1305经酶切验证及测序后，通过电击转化法转入根癌农杆菌EHA105中。

(2)超表达转基因植株的获得与鉴定

步骤与实施例3中的转基因植株获得与检测相同。

(3)超表达转基因植株的功能鉴定

将WRKY21-Ox的两个过表达效果好的两个株系(Ox2,Ox6)和WRKY108-Ox的两个过表达效果较好的两个株系(Ox2,Ox7)分别与野生型植株在高磷(200μM Pi)和低磷(10μMPi)条件下培养生长至第七叶完全展开，分别取叶片、叶鞘和根部的样，提取并测样品中的可提取磷含量。提取和测定大致步骤如下：1.将鲜样用液氮研磨成粉末，置冰上至样品冻融，加入1ml 10％(w/v)的高氯酸(PCA)研磨均匀。2.匀浆液用5％(w/v)的高氯酸稀释10倍，于冰上放置30分钟，其间每隔5-10min混匀一次。3.4℃，10000g离心10分钟，上清液用于可提取磷含量的测定(钼蓝比色法)。4.取2ml工作溶液与1ml样品上清液混合，于40℃温育20分钟。5.反应液在冰上冷却后，于820nm可见光波长下测定吸光度值。如果样品浓度过高，应适当稀释，使其OD值落在标线的线性范围内，根据标准曲线计算获得各个部位的可提取磷含量。结果显示：无论高磷还是低磷处理，OsWRKY21和OsWRKY108的超表达株系叶片、叶鞘以及根中的无机磷含量相比与野生型均显著提高，并且都达到了极显著的差异。各处理条件下，OsWKRY21的超表达株系各个部位无机磷含量是野生型的2-3倍，OsWRKY108超表达株系各个部位无机磷含量是野生型的2-5倍不等。

实施例5利用酵母双杂体系，验证OsWKRY21和OsWRKY108之间存在互作

(1)酵母双杂载体构建

对OsWRKY21和OsWRKY108的全场CDS序列进行限制性酶切位点分析，设计PCR扩增引物，重组到pAD-GAL4-2.1载体中，用于构建Prey质粒。引物设计如下：

W21-AD-F:TTggtaccATGGCGATGCTGGGGAGCT(SEQ ID NO.9)

W21-AD-R:TTctgcagTCAGAGGGAGTTGATGACGAAT(SEQ ID NO.10)

W108-AD-F:TTgaattcATGCAGGCGCAATCCCGCC(SEQ ID NO.11)

W108-AD-R:TTagatctTTAATTAATTAGATCAAAAC(SEQ ID NO.12)

以实施例1中含有OsWRKY21或OsWRKY108全场CDS克隆质粒为模板进行PCR扩增，PCR产物经胶回收后连上pEasy-Blunt Cloning Vector，测序通过后，经酶切酶连，导入到pAD-GAL4-2.1载体上，重组质粒AD-WRKY21及AD-WRKY108经酶切验证及测序后备用。

由于转录因子本身存在结合结构域(Binding domain,BD)和转录激活结构域(Activation domain,AD)，因此为了避免OsWRKY21和OsWRKY108自身的转录激活结构域对实验结果产生影响，在构建Bait质粒过程中，我们首先验证了OsWRKY21和OsWRKY108的转录激活活性，且当OsWRKY21或OsWKRY108蛋白在C端缺失了45个氨基酸之后，该蛋白就不具备转录激活活性。因此针对pBD-GAL4 cam的载体构建，引物设计如下：

W21-BD-F:TTcccgggAAATGGCGATGCTGGGGAGCT(SEQ ID NO.13)

W21-BD-R:TTctgcagTCACCCCTGCGACGTCTCGCTGGG(SEQ ID NO.14)

W108-BD-F:TTgaattcATGCAGGCGCAATCCCGCC(SEQ ID NO.15)

W108-BD-R:TTcccgggTTAGGGCCCGGACGACGACGAC(SEQ ID NO.16)

以实施例1中含有OsWRKY21或OsWRKY108全场CDS克隆质粒为模板进行PCR扩增，PCR产物经胶回收后连上pEasy-Blunt Cloning Vector，测序通过后，经酶切酶连，导入到pBD-GAL4-cam载体上，分别得到重组质粒BD-WRKY21及BD-WRKY108经酶切验证及测序后备用。

(2)酵母感受态的制备及质粒转化

酵母菌株选用YRG-2，按照Yeastmaker^TM Yeast Transformation System 2UserManual(Clontech)方法进行酵母感受态的制备和质粒转化。按照Prey/Bait组合进行共转，将AD/BD,AD/BD-WRKY21,AD/BD-WRKY108,AD-WRKY21/BD,AD-WRKY21/BD-WRKY21,AD-WRKY21/BD-WRKY108,AD-WRKY108/BD,AD-WRKY108/BD-WRKY21,AD-WRKY108/BD-WRKY108分别共转入YRG-2酵母细胞中，涂布于相应氨基酸缺陷耐型SD/-W/-L培养基上，获取酵母转化子。

(3)OsWRKY21与OsWRKY108在酵母体系中的互作验证

分别挑取各组酵母阳性克隆于SD/-W/-L的液体培养基中，30℃，200rpm培养至OD₆₀₀至0.8-1.0之间，富集菌体，用无菌水洗涤菌体沉淀，并用无菌水重悬并调整各组菌液的OD₆₀₀值为1.0。分别吸取各组菌液打在SD/-W/-L(对照组)和SD/-W/-L/-H(实验组)固体培养基中，30℃培养箱培养3-5天，观察酵母生长状况。结果表明OsWKRY21和OsWRKY108在酵母体系中存在互作(图7)。

实施例6利用酵母单杂体系，验证OsWRKY21和OsWRKY108均能与磷酸盐转运蛋白基因OsPHT1；1启动子区域发生互作，继而调控OsPHT1；1基因的表达

(1)酵母单杂载体构建

对OsWRKY21和OsWRKY108的全场CDS序列进行限制性酶切位点分析，设计PCR扩增引物，重组到pGADT7-AD载体中，用于构建Prey质粒。引物设计如下：

W21-pGADT7-F:TTcatatgATGGCGATGCTGGGGAGCT(SEQ ID NO.17)

W21-pGADT7-R:TTctcgagTCAGAGGGAGTTGATGACGAAT(SEQ ID NO.18)

W108-pGADT7-F:TTcatatgATGCAGGCGCAATCCCGCCTC(SEQ ID NO.19)

W108-pGADT7-R:TTctcgagTTAATTAATTAGATCAAAACAG(SEQ ID NO.20)

以实施例1中含有OsWRKY21或OsWRKY108全场CDS克隆质粒为模板进行PCR扩增，PCR产物经胶回收后连上pEasy-Blunt Cloning Vector，测序通过后，经酶切酶连，导入到pGADT7-AD载体上，重组质粒pGADT7-WRKY21及pGADT7-WRKY108经酶切验证及测序后备用。

以水稻基因组DNA为模板，对OsPHT1；1基因启动子片段进行PCR扩增，用于构建Bait载体。引物设计如下：

ProPT1-F:TTgagctcCGTCATTCGCGGGGAGTAGTT(SEQ ID NO.21)

ProPT1-R:TTctcgagCAGGTCCAGTGTTGAATGCTC(SEQ ID NO.22)

PCR产物经胶回收后连上pEasy-Blunt Cloning Vector，测序通过后，经酶切酶连，导入到pAbAi载体上，重组质粒ProPT1-pAbAi经酶切验证及测序后备用。

(2)酵母感受态的制备及质粒转化

酵母菌株选用Y1HGold，按照Yeastmaker^TM Yeast Transformation System 2UserManual(Clontech)方法进行酵母感受态的制备和质粒转化。用限制性内切酶BstBI对重组质粒ProPT1-pAbAi进行线性化，并先将线性化质粒ProPT1-pAbAi通过酵母转化至Y1HGold中，获得bait菌株Y1HGold[ProPT1-pAbAi]。检测并确定bait菌株Y1HGold[ProPT1-pAbAi]的最低AbA(金担子素A)抑制浓度，即将Y1HGold[ProPT1-pAbAi]酵母细胞涂布于含有不同AbA浓度的SD/-Ura酵母培养基上，确定在最低的AbA抑制浓度下，Y1HGold[ProPT1-pAbAi]酵母细胞将不会正常生长。将Prey质粒pGADT7-WRKY21、pGADT7-WRKY108及阴性对照pGADT7AD空载质粒通过酵母转化方法转入bait菌株Y1HGold[ProPT1-pAbAi]中，涂布于SD/-Leu酵母培养基中，获得酵母转化子。

(3)验证OsWRKY21与OsWRKY108与OsPHT1；1启动子之间的互作

挑取实验组Y1HGold[pGADT7-WRKY21/ProPT1-pAbAi]、Y1HGold[pGADT7-WRKY108/ProPT1-pAbAi]和阴性对照组Y1HGold[pGADT7/ProPT1-pAbAi]酵母单克隆于SD/-Leu液体培养基中，30℃，200rpm培养至OD₆₀₀至0.8-1.0，然后富集菌体，用灭菌水洗涤菌体沉淀，再用灭菌水重悬并调整三组菌液的OD值均为OD₆₀₀为1，分别将这三组菌液用灭菌水逐级稀释10倍，100倍以及1000倍。分别吸取5μL已调好的菌液和稀释的菌液打在SD/-Leu(对照组)和含有最低AbA抑制浓度的SD/-Leu(实验组)固体培养基上，30℃培养箱培养3-5天，观察酵母生长状况。结果表明Y1HGold[pGADT7-WRKY21/ProPT1-pAbAi]和Y1HGold[pGADT7-WRKY108/ProPT1-pAbAi]酵母转化子可以在含有AbA的SD/-Leu培养基中正常生长，说明OsWRKY21与OsWRKY108均可以与OsPHT1；1启动子发生互作(图8)。

实施例7

在营养生长时期对pht1；1突变体和野生型植株进行低磷(LP：1μM磷)、对照(Ctrl：90μM磷)和高磷(HP：300μM磷)处理，结果显示在对照和高磷条件下pht1；1突变体根部磷积累与野生型相比显著降低，而其地上部磷积累在高磷条件下也显著降低(图9)。此外，wrky21 wrky108双突变体对PHT1；1的调控主要发生在供给1mM磷时，即仅在供给1mM磷时wrky21 wrky108双突变体中PHT1；1的表达才发生显著降低；与之对应的是此时wrky21wrky108双突变体根部的磷积累显著降低(图9)。另一方面，在完熟期，各突变体颖壳中的磷积累与野生型相比均没有变化，而pht1；1和wrky21 wrky108双突变体糙米中的磷积累与野生型相比均发生显著降低(图10)。

综上所述，本发明所提供的OsWRKY21和OsWRKY108的工程应用为水稻中首次报道。

发明人从单子叶植物水稻中克隆了两个WRKY类转录因子基因OsWRKY21和OsWRKY108。RT-qPCR研究表明其在水稻地上部和根部均有表达，并且在根中，这两个基因的表达明显随着外界磷浓度的提高而增强，说明OsWRKY21和OsWRKY108很可能是在富磷条件下发挥作用，通过调控下游基因的表达来维持水稻体内的磷稳态。

本发明方法中可利用OsWRKY21和OsWRKY108作为目的基因导入植物中，特别优选水稻，OsWRKY21和OsWRKY108所编码的蛋白，本身可以发生互作形成蛋白复合体，并均可以通过与水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPHT1；1启动子发生互作来调控OsPHT1；1的基因表达，从而促进水稻磷素的吸收和积累，提高磷的利用效率，为培育磷高效水稻新品种提供思路。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 水稻中两个WRKY转录因子基因及其编码蛋白的应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcgatgc tggggagct 19

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcagagggag ttgatgacga at 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcaggcgc aatcccgcct c 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttaattaatt agatcaaaac ag 22

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttggtaccat ggcgatgctg gggagct 27

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttctgcagtc agagggagtt gatgacgaat 30

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttgagctcat gcaggcgcaa tcccgcctc 29

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tttctagatt aattaattag atcaaaacag 30

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttggtaccat ggcgatgctg gggagct 27

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttctgcagtc agagggagtt gatgacgaat 30

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttgaattcat gcaggcgcaa tcccgcc 27

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttagatcttt aattaattag atcaaaac 28

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttcccgggaa atggcgatgc tggggagct 29

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttctgcagtc acccctgcga cgtctcgctg gg 32

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttgaattcat gcaggcgcaa tcccgcc 27

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttcccgggtt agggcccgga cgacgacgac 30

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttcatatgat ggcgatgctg gggagct 27

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ttctcgagtc agagggagtt gatgacgaat 30

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ttcatatgat gcaggcgcaa tcccgcctc 29

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ttctcgagtt aattaattag atcaaaacag 30

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttgagctccg tcattcgcgg ggagtagtt 29

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ttctcgagca ggtccagtgt tgaatgctc 29

Claims

1.水稻WRKY类转录因子基因OsWRKY21在促进水稻对磷的吸收和积累方面的应用，OsWRKY21基因在MSU Rice Genome Annotation Project数据库的序列号为：LOC_Os01g60640。

2.水稻WRKY类转录因子基因OsWRKY108在促进水稻对磷的吸收和积累方面的应用，OsWRKY108基因在MSU Rice Genome Annotation Project数据库的序列号：LOC_Os01g60600。

3.水稻WRKY类转录因子基因OsWRKY21和OsWRKY108在富磷条件下促进水稻磷素的吸收和转运方面的应用；OsWRKY21基因在MSU Rice Genome Annotation Project数据库的序列号为：LOC_Os01g60640，OsWRKY108基因在MSU Rice Genome Annotation Project数据库的序列号：LOC_Os01g60600。

4.水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21和OsWRKY108的编码产物即转录因子蛋白OsWRKY21和OsWRKY108在促进水稻对磷的吸收和积累方面的应用；OsWRKY21基因在MSU Rice GenomeAnnotation Project数据库的序列号为：LOC_Os01g60640，OsWRKY108基因在MSU RiceGenome Annotation Project数据库的序列号：LOC_Os01g60600。

5.水稻WRKY类转录因子基因OsWRKY21和/或OsWRKY108在提高水稻籽粒中的磷含量中的应用；OsWRKY21基因在MSU Rice Genome Annotation Project数据库的序列号为：LOC_Os01g60640，OsWRKY108基因在MSU Rice Genome Annotation Project数据库的序列号：LOC_Os01g60600。

6.利用OsWKRY21和OsWKRY108培育富磷条件下磷素奢侈吸收减少的水稻品种方法，其特征在于：通过突变OsWKRY21和OsWKRY108以抑制磷转运体基因OsPHT1;1的表达，并继而在富磷条件下减少水稻对磷素的吸收，即降低水稻营养器官和籽粒中的磷积累；OsWRKY21基因在MSU Rice Genome Annotation Project数据库的序列号为：LOC_Os01g60640，OsWRKY108基因在MSU Rice Genome Annotation Project数据库的序列号：LOC_Os01g60600。