CN115216487B - 调控水稻产量形成的基因nsp1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及水稻基因工程技术领域，具体涉及一个调控水稻产量性状形成的基因NSP1的鉴定及其功能应用。NSP1编码一个具有转录激活活性的bHLH转录因子，其编码蛋白特异性地与水稻侧生小穗发育蛋白LAX1相互作用，增强LAX1的转录激活活性，通过调控侧生分生组织的发育来影响籽粒的形成，是水稻产量性状形成的重要调节子。利用本发明克隆的NSP1基因及其编码蛋白，通过基因操作手段调控其表达活性可以改变LAX1的蛋白活性，从而调控侧生小穗的形成，对水稻产量性状的遗传改良具有重要的理论和实践价值。
Description
技术领域
本发明属于水稻基因工程技术领域，具体涉及调控水稻产量形成的基因NSP1及其应用。
背景技术
水稻单株产量主要由有效穗数、每穗实粒数、粒重三个因素决定，稻穗是产量形成的直接表现形式。稻穗形态由主穗轴以及侧生器官枝梗和着生在枝梗上的侧生小穗组成，穗分枝及侧生小穗的长度、着生部位以及数目影响着稻穗的形态和产量。生殖生长时期水稻花序分生组织经历一次枝梗分生组织、二次枝梗分生组织、小穗分生组织和小花分生组织的分化形成主穗轴、一次枝梗、二次枝梗、小穗和花器官，组成了水稻的花序结构，从而影响水稻产量(见Ikeda等， Developmental course of inflorescence and spikelet inrice.Breeding Science,(2004):147-156)。因此，通过基因工程方法调控水稻侧生器官的形成是水稻产量性状遗传改良的有效手段之一。
目前国内外通过正向遗传学筛选穗型突变体手段或者反向遗传学研究在水稻穗发育时期表达的基因，分离克隆了许多调控水稻穗形态相关的功能基因。其中，编码bHLH蛋白的LAX1基因是调控水稻枝梗和侧生小穗发育的关键基因，其表达部位和发挥功能部位具有时空性。在营养生长时期的侧生分生组织(分蘖)的形成过程中，LAX1 的mRNA在叶片发育P4期的茎顶端分生组织和即将起始的分蘖芽原基的边界表达，边界处翻译的蛋白定向移动到分蘖芽原基中，起始分蘖的发育。在生殖生长时期的侧生分生组织(枝梗和侧生小穗)的发育过程中，LAX1 mRNA在花序分生组织和即将起始的侧生分生组织边界处表达，随后LAX1蛋白定向移动到侧生分生组织中，促进侧生分生组织起始，研究表明LAX1的时空性调控对于侧生分生组织的起始和维持是必需的(见Komatsu等，LAX and SPA:Major regulator ofshoot branching in rice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(2003):11765-11770；见Oikawaand Kyozuka等，Two-step regulation of LAX PANICLE1 protein accumulation inaxillary meristem formation in rice.Plant Cell,(2009):1095-1108)。LAX1基因的功能缺失影响着侧生分生组织的形成，具体表现为弱等位突变体只产生顶端小穗，不产生二次枝梗和侧生小穗，强等位突变体只有主穗轴和个别一次枝梗产生，其它侧生器官均不能形成。而组成型超量表达LAX1材料植株矮小，分枝和侧生小穗都严重减少(见Komatsu等，LAX and SPA:Major regulator of shoot branching inrice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(2003):11765-11770)，由此可见LAX1特异的时空表达模式对水稻穗分枝及侧生小穗的发育至关重要。同时，LAX1也是一个影响产量的数量性状位点，影响水稻二次枝梗数和千粒重(见Gao等，Dissecting yield-associated loci insuper hybrid rice by resequencing recombinant inbred lines and improvingparental genome sequences.Proc Natl Acad Sci U S A,(2013):14492-14497；见Huang等，Genomic architecture of heterosis for yield traits in rice.Nature,(2016):629-633)。因此，LAX1 的时空性表达及其蛋白活性调控水稻穗分枝及侧生小穗的形成，进而影响水稻产量，而现有技术中对于LAX1复合体调控产量性状形成的分子机制解析并不清楚。
发明内容
为寻找LAX1互作的蛋白，解析LAX1复合体调控产量性状形成的分子机制，本发明通过酵母双杂交的方法鉴定了一个与LAX1互作的蛋白NSP1(No SPikelet 1)。通过分子生物学、细胞学和遗传学方法解析了NSP1在侧生分生组织中表达，作为LAX1共激活子调控LAX1的转录激活活性进而维持侧生分生组织的发育的分子机制，确定NSP1是控制水稻产量形成的重要因子。
本发明一方面提供了NSP1基因在调控水稻侧生小穗形成中的应用，所述NSP1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
本发明另一方面提供了NSP1蛋白在调控水稻侧生小穗形成中的应用，所述NSP1蛋白的编码序列如序列表SEQ ID NO：2所示，所述NSP1蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO：3所示。
本发明另一方面提供了一种调控水稻侧生小穗形成及产量的方法，所述方法包括将权利要求1所述的NSP1基因连上合适的启动子进行遗传操作改变其表达量或表达模式，调控水稻穗型和产量。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)本发明在分子和细胞水平证实LIP1与NSP1蛋白直接互作，同源分析鉴定到NSP1的同源基因OsbHLH067、OsbHLH068。同时突变NSP1及其同源基因OsbHLH067、OsbHLH068影响水稻穗分枝和侧生小穗的形成，说明NSP1及其同源基因OsbHLH067、OsbHLH 068功能冗余，均具有调控穗分枝和侧生小穗发育的功能。
2)本发明在分子水平和细胞水平证实NSP1在穗侧生分生组织中与LAX1共表达，蛋白生化实验鉴定NSP1与LAX1形成异源二聚体/多聚体，增强LAX1的转录激活活性。遗传实验表明NSP1通过时空性调控LAX1在穗侧生分生组织中的活性，维持穗分枝和侧生小穗的形成，保障水稻的产量。
3)本发明克隆的水稻NSP1基因可用于与其它调控元件，如幼穗特异性启动子融合构建基因表达载体；通过转基因技术精细调控L AX1的活性，从而调控水稻穗分枝和侧生小穗的数目，进而遗传改良作物产量性状。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1：NSP1蛋白与LAX1蛋白互作。附图标记说明：图1中的 A图：NSP1不同区段作为诱饵蛋白与LAX1进行酵母双杂交实验。图1中的B图：酵母双杂交实验证实LAX1的bHLH区段作为诱饵蛋白与NSP1的bHLH区段互作。图1中的C图：酵母双杂交实验证实NSP1的bHLH区段作为诱饵蛋白与LAX1的bHLH区段互作。图 1中的D图：pull-down实验证实NSP1与LAX1在体外互作。
图2：NSP1基因的表达模式。附图标记说明：图2中的A图： NSP1基因在水稻品种“中花11”各组织器官中的表达谱。图2中的 B图：RNA原位杂交检测NSP1在一次枝梗分生组织中的表达。标尺为100μm。图2中的C图：RNA原位杂交检测NSP1正义链探针在二次枝梗发育时期的表达。标尺为100μm。
图3：NSP1家族基因的系统进化树及bHLH结构域氨基酸序列比对分析。附图标记说明：图3中的A图：NSP1家族蛋白的系统进化树分析。图3中的B图：NSP1与OsbHLH067，OsbHLH068蛋白的氨基酸序列比对分析。黑色下划线指示的氨基酸为bHLH结构域。
图4：nsp1 Osbhlh067 Osbhlh068三突变体的创制及表型鉴定。附图标记说明：图4中的A图：sgRNA在NSP1，OsbHLH067和 OsbHLH068这三个基因座位识别位置示意图。图4中的B图：nsp1 Osbhlh067 Osbhlh068三突变体分别在NSP1，OsbHLH067和 OsbHLH068基因座位上的编辑情况。图4中的C图：野生型与nsp1 Osbhlh067 Osbhlh068三突变体的株型。图4中的D图：野生型与nsp1 Osbhlh067 Osbhlh068三突变体的穗型以及一次枝梗形态。图4中的E图：野生型与nsp1 Osbhlh067 Osbhlh068三突变体在二次枝梗发育时期的幼穗形态观察。图4中的F图：定量统计野生型和nsp1 Osbhlh067 Osbhlh068三突变体每穗上的一次枝梗数。图4中的G图：定量统计野生型和nsp1 Osbhlh067 Osbhlh068三突变体每穗上的二次枝梗数。图4中的H图：定量统计野生型和nsp1 Osbhlh067 Osbhlh068三突变体着生在一次枝梗上的小穗数。图4中的I图：定量统计野生型和nsp1 Osbhlh067 Osbhlh068三突变体着生在二次枝梗上的小穗数。图4中的J图：定量统计野生型和nsp1 Osbhlh067 Osbhlh068三突变体每穗小穗数。
图5：NSP1 mRNA与LAX1蛋白表达重叠。附图标记说明：图 5中的A图：对处于一次枝梗原基发育时期的幼穗连续切片分别采用 NSP1和LAX1探针进行原位杂交的结果，标尺为100μm。图5中的 B图：对处于二次枝梗原基或小穗原基分化时期的幼穗连续切片分别采用NSP1和LAX1探针进行原位杂交的结果，标尺为100μm。
图6：NSP1增强LAX1的转录激活活性。附图标记说明：图6 中的A图，B图和C图：烟草中证实NSP1加强LAX1的转录激活活性，三个生物学重复。
图7：NSP1协同LAX1调控侧生小穗形成的工作模式。附图标记说明：图7中的A图：LAX1和NSP1在侧生分生组织发育中的表达模式图，该图为一次枝梗的二次枝梗分生组织发育时期。图7中的B 图：在侧生分生组织形成阶段，NSP1与LAX1互作，共激活下游基因从而促进侧生分生组织发育的分子模型。
图8：酵母空载体pGBK-T7图谱(见https://www.takarabio.com/)
图9：酵母空载体pGAD-T7图谱(见https://www.takarabio.com/)
图10：GST标签空载体pGEX-4T-1图谱(见 http://www3.gehealthcare.cn/zh-CN)
图11：本发明构建的GST-NSP1载体图谱
图12：MBP标签空载体pMAL-c2x图谱(见Walker等，Mutations in maltose-binding protein that alter affinity and solubility properties.Appl MicrobiolBiotechnol,(2010):187–197)
图13：CRISPR/Cas9双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H空载体图谱(见Ma等，Arobust CRISPR/Cas9 system for convenient, high-efficiency multiplex genomeediting in monocot and dicot plants,Mol.Plant,(2015):1274–1284)
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
本发明的技术方案如下所述：
1.NSP1基因的鉴定
本发明采用酵母双杂交技术(见Yang等，The RING-Linger ubiquitin ligaseHAF1 mediates Heading date1 degradation during photoperiodic flowering inrice.Plant Cell,(2015):2455-2468)鉴定到 LAX1的互作蛋白NSP1，通过酵母双杂交实验表明NSP1与LAX1 通过它们的bHLH结构域互作，体外pull-down实验(见Xia等，Theubiquitin receptor DA1 interacts with the E3 ubiquitin ligase DA2 to regulateseed and organ size in Arabidopsis.Plant Cell,(2013): 3347-3359；Yang等，TheRING-Linger ubiquitin ligase HAF1 mediates Heading date1 degradation duringphotoperiodic flowering in rice.Plant Cell,(2015):2455-2468)进一步证实NSP1与LAX1在体外存在直接互作关系(见实施例1的第1部分)。NSP1对应日本晴参考基因组的位置为Chr1:33272395..3327430，基因组长度为1194bp，含有7个外显子和6个内含子，编码区长度为1179bp。定量RT-PCR检测NSP1 在各个组织器官中均表达，进一步在水稻幼穗中采用原位杂交技术 (见De Block等，RNA-RNA in situ hybridization using digoxigenin-labeled probes:The use of high-molecular-weight polyvinyl alcohol in thealkaline phosphatase indoxyl-nitroblue tetrazolium reaction.Anal.Biochem.(1993):86-89)进行检测，NSP1基因在包括一次枝梗分组织、二次枝梗分组织和小穗分生组织的各级侧生分生组织中表达 (见实施例1的第1部分，实施例3的第1部分)。采用生物信息学 (http://smart.embl-heidelberg.de/)分析NSP1蛋白，含有bHLH结构域，属于bHLH家族中的一员。对其水稻中的同源蛋白分析表明NSP1 与OsbHLH067，OsbHLH068同源性最高(见实施例2的第1部分)，表明NSP1与OsbHLH067，OsbHLH068可能功能冗余地发挥相同的生物学功能。
2.NSP1与OsbHLH067、OsbHLH068同源共同调控侧生小穗的形成
为了解NSP1在穗侧生分生组织发育中的功能，本发明创制了 NSP1家族同源基因的功能缺失突变体。在NSP1和OsbHLH067基因组的相同序列座位选取2个靶位点并将其构建到CRISPR/Cas9双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H(见Ma等，A robust CRISPR/Cas9 systemfor convenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicotplants,Mol.Plant,(2015):1274-1284)中，通过农杆菌介导遗传转化粳稻中花11号愈伤中获得转基因植株，并Sanger测序鉴定靶位点突变情况，获得nsp1 Osbhlh067双突变体。同时在OsbHLH068基因座位选取2个靶位点，并将其构建到CRISPR/Cas9双元载体 pYLCRISPR/Cas9Pubi-H(见Ma等，A robust CRISPR/Cas9 system for convenient,high-efficiencymultiplex genome editing in monocot and dicot plants,Mol.Plant,(2015):1274-1284)中，通过农杆菌介导遗传转化到nsp1 Osbhlh067双突变体愈伤组织中获得转基因植株，通过 Sanger测序鉴定靶位点突变情况，获得nsp1 Osbhlh067 Osbhlh068三突变体，突变体表现为穗分枝和侧生小穗都减少的表型(见实施例2 的第2部分)，由此说明NSP1、OsbHLH067和OsbHLH068功能冗余地调控水稻侧生小穗的形成。
3.NSP1增强LAX1的转录激活活性调控侧生小穗形成
本发明采用原位杂交技术检测NSP1和LAX1在穗侧生分生组织中的时空表达模式，结果表明NSP1 mRNA在穗侧生分生组织中表达，与LAX1蛋白表达部位重叠(见实施例3的第1部分)。本发明采用体内转录活性实验(见Zhang等，An intrinsic microRNA timerregulates progressive decline in shoot regenerative capacity in plants.PlantCell,(2015):349-360)分析NSP1对LAX1的分子调控机制，结果表明LAX1 在体内表现转录激活活性，当NSP1与LAX1共同存在时，NSP1会显著增强LAX1的转录激活活性(见实施例3的第2部分)。根据以上内容以及LAX1的时空性表达(见Komatsu等，LAX and SPA:Majorregulator of shoot branching in rice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(2003):11765-11770；Oikawa等，Two-step regulation of LAX PANICLE1 protein accumulation inaxillary meristem formation in rice.Plant Cell,(2009):1095-1108)，提出NSP1与LAX1协同调控水稻穗侧生分生组织发育的工作模式：LAX1 mRNA在花序分生组织和即将起始的侧生分生组织边界区域表达，LAX1蛋白运定向移动到侧生分生组织中，在侧生分生组织中转录并翻译的NSP1与LAX1互作，作为LAX1的激活子发挥增强LAX1的转录激活活性作用，增强LAX1下游靶基因的表达，促进穗侧生分生组织的发育，从而维持水稻产量(见实施例 3的第3部分)。
实施例1NSP1基因的鉴定
1、NSP1与LAX1蛋白互作
本发明采用酵母双杂交技术鉴定到一个与LAX1互作的蛋白 NSP1。为验证LAX1与NSP1的互作关系及具体区段，本发明构建 10个酵母载体，分别为pGBK-NSP1，pGBK-NSP1(1-280aa)，pGBK-NSP1(271-335aa)，pGBK-NSP1(326-392aa)， pGBK-NSP1(△281-325aa)，pGAD-NSP1(271-335aa)， pGAD-NSP1(△281-325aa)，pGAD-LAX1，pGAD-LAX1(31-99aa)和pGAD-LAX1(△41-89aa)。
关于pGBK-NSP1酵母载体的构建方法如下：设计引物 BK/AD-NSP1-1AA-L/BK/AD-NSP1-392AA-R(引物序列见表1)，以中花11幼穗(2mm-5mm)cDNA为模板，扩增出NSP1全长CDS， TA克隆到pEASY-T3上并测序验证；选取序列正确的pEASY-T3用 EcoRI-BamHI(购自宝生物工程大连有限公司公司)消化获得目的外源片段、用T4连接酶(购自Promega公司)连接到相同酶处理的 pGBK-T7(见图8)，酶切正确后载体命名为pGBK-NSP1。关于NSP1 酵母截短载体pGBK-NSP1(1-280aa)，pGBK-NSP1(271-335aa)，pGAD-NSP1(271-335aa)，pGBK-NSP1(326-392aa)构建方法如下：分别以BK/AD-NSP1-1AA-L/BK-NSP1-280AA-R(引物序列见表1)， BK/AD-NSP1-271AA-L/BK/AD-NSP1-335AA-R(引物序列见表1)，BK-NSP1-326AA-L/BK/AD-NSP1-392AA-R为引物对(引物序列见表 1)，以质粒pGBK-NSP1为模板，分别扩增出外源片段NSP1(1-280aa)， NSP1(271-335aa)，NSP1(326-392aa)，并用EcoRI-BamHI(购自宝生物工程大连有限公司公司)消化获得目的外源片段、用T4连接酶(购自Promega公司)连接到相同酶处理的pGBK-T7(见图8)或pGAD-T7 (见图9)载体上，酶切正确并测序正确的载体命名为pGBK-NSP1(1-280aa)，pGBK-NSP1(271-335aa)， pGAD-NSP1(271-335aa)，pGBK-NSP1(326-392aa)。关于 pGBK-NSP1(△281-325aa)和pGAD-NSP1(△281-325aa)载体的构建方法如下：采用两对引物BK/AD-NSP1-1AA-L/BK/AD-NSP1-△HLH-R (引物序列见表1)，BK/AD-NSP1-△HLH-L/BK/AD-NSP1-392AA-R(引物序列见表1)分别扩增质粒pGBK-NSP1，得到的PCR产物混合作为第二轮PCR的模板，同时以 BK/AD-NSP1-1AA-L/BK/AD-NSP1-392AA-R(引物序列见表1)为引物进行扩增，获得的第二轮PCR产物用EcoRI-BamHI(购自宝生物工程大连有限公司公司)消化获得目的外源片段、用T4连接酶(购自Promega公司)连接到相同酶处理的pGBK-T7(见图8)和pGAD-T7 (见图9)载体上，酶切正确并测序正确的载体命名为 pGBK-NSP1(△281-325aa)，pGAD-NSP1(△281-325aa)。关于 pGAD-LAX1和pGAD-LAX1(31-99aa)酵母载体构建方法如下：设计引物BK/AD-LAX1-1AA-L/BK/AD-LAX1-215AA-R(引物序列见表1)，AD-LAX1-31AA-L/AD-LAX1-99AA-R(引物序列见表1)，均以中花 11基因组为模板进行扩增，分别得到LAX1全长CDS和 LAX1(31-99aa)，扩增的PCR产物用EcoRI-BamHI(购自宝生物工程大连有限公司公司)消化获得目的外源片段、用T4连接酶(购自 Promega公司)连接到相同酶处理的pGAD-T7(见图9)载体上，酶切正确并测序正确的载体命名为pGAD-LAX1和pGAD-LAX1(31-99aa)。关于pGAD-LAX1(△41-89aa)载体的构建方法如下：采用两对引物AD-LAX1-1AA-L/AD-LAX1-△HLH-R(引物序列见表1)，AD-LAX1-△HLH-L/AD-LAX1-215AA-R(引物序列见表 1)分别扩增质粒pGAD-LAX1，得到的PCR产物混合作为第二轮PCR 的模板，同时以引物AD-LAX1-1AA-L/AD-LAX1-215AA-R(引物序列见表1)进行第二轮PCR扩增，获得目的片段用EcoRI-BamHI(购自宝生物工程大连有限公司公司)消化获得目的外源片段、用T4连接酶(购自Promega公司)连接到相同酶处理的pGAD-T7(见图9) 载体上，酶切正确并测序正确的载体命名为pGAD-LAX1(△41-89aa)。将相应组合的质粒经酵母快速转化方法转化酵母菌株AH109(配自 Clontech公司)，转化子涂布SD/-Trp-Leu平板(配方见Clontech公司，yeast protocols handbook,http://www.clontech.com/)，30℃倒置培养3-5天。将生长出的克隆在无菌水中进行稀释后并同时接种于 SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-Ade-His固体培养基中培养过夜，30℃倒置培养2-3天后观察酵母生长情况，结果显示LAX1可与NSP1(271-335aa)互作，但不与NSP1(326-392aa)互作(见图1中的A 图)。截短实验显示LAX1(31-99aa)与NSP1(271-335aa)互作，但不与 NSP1(△281-325aa)互作(见图1中的B图)，同时NSP1(271-335aa)与LAX1(31-99aa)互作，但不与LAX1(△41-89)互作(见图1中的C 图)，表明NSP1与LAX1在酵母细胞中互作，而且依赖于彼此的bHLH 结构域。
本发明进一步采用体外pull-down技术验证NSP1与LAX1的互作关系。本发明构建了1个原核诱导表达融合载体为GST-NSP1。融合载体GST-NSP1构建方法如下：设计引物GST-NSP1-L/GST-NSP1-R (引物序列见表1)，以质粒pGBK-NSP1为模板，扩增出目的片段用EcoRI-XhoI(购自宝生物工程大连有限公司公司)消化获得目的外源片段、用T4连接酶连接到相同酶处理的pGEX-4T-1(见图10)载体上，酶切正确并测序正确的载体命名为GST-NSP1(见图11)。将 pGEX-4T-1，pMAL-C2X(见图12)，GST-NSP1和MBP-LAX1(见申请专利201911055255.7)质粒通过热激法转入到大肠杆菌表达菌株 BL21中(购自Transgen公司)。挑取单克隆在含50mg/L氨苄霉素的 LB培养基中培养至OD(600nm)值为0.5-0.6时，在温度为16℃，转速为160rpm，IPTG浓度为0.1mM条件下诱导表达10小时，收集菌体并超声破碎获得上清。体外pull-down实验具体步骤参考Xia等的实验方法进行(Xia等，The ubiquitinreceptor DA1 interacts with the E3 ubiquitin ligase DA2 to regulate seed andorgan size in Arabidopsis, Plant Cell,(2013):3347-3359)。Pull-down结果表明只有在GST-NSP1 和MBP-LAX1共同存在的情况下利用GST beads亲和纯化复合物，用anti-MBP抗体才能检测到MBP-LAX1(见图1中的D图)，说明 NSP1蛋白与LAX1蛋白存在直接互作关系。
2、NSP1基因的表达模式
为分析NSP1基因的时空表达模式，采用定量RT-PCR技术检测 NSP1基因在中花11各组织器官中的表达谱。具体为：武汉正季种植水稻品种“中花11，”对根，茎，叶，叶鞘和不同长度的幼穗穗进行取样，总RNA样抽提、反转录和定量RT-PCR实验具体步骤参照Huan g等的实验方法进行(Huang等，Down-regulation of a SILENT INF ORMATION REGULATOR2-related histone deacetylase gene,OsSRT1,induces DNA fragmentation and celldeath in rice.Plant Physiol, (2007):1508-1519)(NSP1的qRT-PCR引物序列见表1)。定量R T-PCR结果表明NSP1基因在营养器官和穗中均有表达，而且在随着穗的发育NSP1表达量逐渐升高(见图2中的A图)，该结果表明NS P1基因可能在穗发育过程发挥功能。为了进一步明确NSP1基因在水稻幼穗发育过程中扮演的角色，首先采用原位杂交技术检测NSP1基因在穗侧生分生组织中的时空表达模式。具体为：设计引物Insitu-N SP1-L和Insitu-NSP1-R(引物序列见表1)，扩增出目的片段，经转录标记dUTP后，碱水解纯化获得NSP1的反义链探针和正义链探针，对中花11幼穗采用石蜡包埋并进行切片，采用正义链和反义链探针分别杂交，经洗脱，抗体杂交，显色、固定封片后观察。与对照组(N SP1正义链探针)相比，NSP1反义链探针杂交结果表明NSP1基因在枝梗分组织中表达(见图2中的B图和C图)。NSP1基因的表达模式表明其可能在穗侧生分生组织发育过程中发挥功能。
表1本发明实施例1中所用的引物
实施例2NSP1调控侧生小穗的发育
1、NSP1基因家族分析
通过生物信息学网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml) 分析，NSP1基因的登录号为LOC_Os01g57580，对应日本晴参考基因组的位置为Chr1：33274308–33272395，有7个外显子，编码区长度为1179bp。结构域分析(http://smart.embl-heidelberg.de/)表明NSP1 编码392个氨基酸组成的bHLH转录因子。对NSP1基因家族成员及其同源基因进行进化树分析。将NSP1蛋白的氨基酸序列在NCBI蛋白数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)中作BLASTp检索得到NSP1的同源蛋白，选取13个bHLH基因与NSP1进行系统进化树的分析，具体为将得到的蛋白序列用MEGA5.1软件进行 ClustalW序列比对，采用邻近相连法(neighbor-joining)构建水稻中 NSP1蛋白的进化树，构建进化树的参数分别是：poisson correction model,pairwise deletion,和bootstrap 1000次重复。结果发现NSP1蛋白与OsbHLH067，OsbHLH068具有非常近的同源关系(见图3中的 A图)。将NSP1与OsbHLH067，OsbHLH068蛋白的氨基酸序列采用 MEGA5.1软件进行ClustalW比对，然后用GeneDOC软件作图，三者bHLH结构域序列(横线标注的氨基酸)的一致性较高(见图3 中的B图)，由此表明NSP1及其同源蛋白OsbHLH067，OsbHLH068 可能功能冗余地发挥相同的生物学功能。
2、NSP1基因家族突变体影响穗分枝和侧生小穗的发育
为分析NSP1及其同源基因OsbHLH067，OsbHLH068功能缺失后对穗侧生分生组织发育的影响，采用CRISPR/Cas9技术构建了 NSP1，OsbHLH067和OsbHLH068的三突变体。具体操作如下：选取NSP1和OsbHLH067相同基因组序列设计了两个gRNA靶位点(见图4中的A图)，引物分别为CAS9-HOMO-U3-L/CAS9-HOMO-U3-R (引物序列见表2)，CAS9-HOMO-U6a-L/CAS9-HOMO-U6a-R(引物序列见表2)；在靠近OsbHLH068基因ATG的区域设计了两个 gRNA 靶位点(见图4中的A图)，引物分别为CAS9-068-U3-L/CAS9-068-U3-R(引物序列见表2)； CAS9-068-U6a-L/CAS9-068-U6a-R(引物序列见表2)。先将选取的 NSP1和OsbHLH067的双靶点构建到CRISPR/Cas9双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H(见图13)中，通过农杆菌将构建好的载体遗传转化到中花11的愈伤组织，获得转基因植株。为检测转基因植株在NSP1和OsbHLH067基因座位的编辑情况，在NSP1靶位点附近设计引物HOMO-NSP1-L/HOMO-NSP1-R(引物序列见表2)，在 OsbHLH067靶位点附近设计引物HOMO-067-L/HOMO-067-R(引物序列见表2)，PCR扩增并测序鉴定编辑情况。在T1代获得了nsp1 Osbhlh067纯合双突变体阴性植株。然后将OsbHLH068双靶点构建到CRISPR/Cas9双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H中，通过农杆菌将构建好的载体遗传转化到nsp1 Osbhlh067纯合双突变体阴性愈伤组织，获得转基因植株。为检测转基因植株在OsbHLH068基因座位的突变情况，在OsbHLH068靶位点附近设计引物 MH-068-JC-L/MH-068-JC-R(引物序列见表2)，PCR扩增并测序鉴定编辑情况。获得的nsp1Osbhlh067 Osbhlh068三突变体单株在NSP1 和OsbHLH067基因区段的其中一个靶点没有发生编辑，另一个靶点均缺失1bp；在OsbHLH068基因区段的其中一个靶点缺失64bp，另一个靶点缺失1bp(见图4中的B图)。通过表型鉴定发现与野生型相比，nsp1 Osbhlh067 Osbhlh068纯合三突变体呈现出矮化，穗小及穗分枝减少的表型(见图4中的C图和D图)。通过细胞学观察发现三突变体的二次枝梗原基的数目与野生型相比明显减少(见图4中的 E图)。统计分析表明三突变体的穗部一次枝梗数目和二次枝梗数目减少(见图4中的F图和G图)，一次枝梗和二次枝梗上着生的小穗数目也减少(见图4中的H图和I图)，最终导致每穗数减少(见图4中的J图)。该结果表明NSP1与OsbHLH067，OsbHLH068功能冗余地调控穗侧生分生组织的发育。
表2本发明实施例2中所用的引物
实施例3NSP1增强LAX1的转录激活活性调控侧生小穗形成
1.NSP1 mRNA与LAX1蛋白重叠
为了判断NSP1与LAX1是否共同参与侧生分组织的发育过程，我们采用原位杂交技术对NSP1和LAX1的时空表达模式进行了研究。具体为：设计引物Insitu-LAX1-L和Insitu-LAX1-R(引物序列见表3)，扩增出目的片段，经转录标记dUTP后，碱水解纯化获得NSP1和LAX1 的反义链探针，对中花11幼穗采用石蜡包埋并进行连续切片，分别采用它们的反义链探针进行杂交，经洗脱，抗体杂交，显色、固定封片后观察。NSP1在一次枝梗分生组织和二次枝梗分生组织中表达，同时这些表达部位均被LAX1mRNA围绕(见图5中的A图和B图)。根据在AM起始过程中，LAX1 mRNA在边界表达，但是蛋白会定向运送到侧生分组织中(见Komatsu等，LAX and SPA:Major regulator of shoot branching inrice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(2003):11765-11770；Oikawa等，Two-step regulationof LAX PANICLE1 protein accumulation in axillary meristem formation inrice.Plant Cell,(2009):1095-1108)。以上结果说明NSP1蛋白可能与LAX1蛋白在 AM中重叠。
2、NSP1增强LAX1的转录激活活性
为探究NSP1与LAX1互作的分子调控机制，本发明开展体内转录活性实验进行分析。具体为：设计引物 1301S-GFP-NSP1-L/1301S-GFP-NSP1-R(引物序列见表3)，以质粒pGBK-NSP1为模板，扩增出目的片段用KpnI-BamHI(购自宝生物工程大连有限公司公司)消化获得目的外源片段、用T4连接酶连接到相同酶处理的1301S-GFP(见申请专利201911055255.7)载体上，酶切正确并测序正确的载体命名为35S-NSP1。以6xUSA-LUC为报告系统，分别将载体组合GAL4BD(见申请专利201911055255.7)、 GAL4BD-LAX1(见申请专利201911055255.7)、 GAL4BD-LAX1/35S-NSP1经农杆菌转化到烟草叶片，室温培养2天，将整个叶片注射1mM的荧光素酶底物(购自Promega公司)，天能 5200成像系统收集光子并经伪彩处理，结果表明GAL4BD-LAX1表达时的萤光信号比阴性对照GAL4BD明显增强(见图6中A图)，说明LAX1发挥转录激活活性；但当GAL4BD-LAX1与35S-NSP1 共转化时可见萤光信号显著增强(见图6中A图)，而且另外两个生物学重复都得到相同的结果(见图6中B图和C图)，表明NSP1增强LAX1的转录激活活性。
3、NSP1协同LAX1调控水稻侧生小穗的分子模型
综合以上实施例的研究结果表明NSP1在穗侧生分生组织中表达，通过与LAX1互作增强LAX1蛋白转录活性，NSP1功能缺失改变 LAX1蛋白的转录活性，影响水稻侧生小穗的形成；结合已发表的 LAX1研究成果；提出一个NSP1与LAX1协同调控水稻穗侧生分生组织发育的工作模式。LAX1 mRNA在花序分生组织和即将起始的侧生分生组织边界区域表达，LAX1蛋白移动到侧生分生组织中(见 Komatsu等，LAX and SPA:Major regulator of shootbranching in rice. Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(2003):11765-11770；Oikawa等，Two-step regulation of LAX PANICLE1 protein accumulation in axillary meristemformation in rice.Plant Cell,(2009):1095-1108)；此时NSP1在侧生分生组织中表达，NSP1蛋白与LAX1蛋白在侧生分生组织中互作，NSP1 作为LAX1的激活子增强LAX1的转录活性，提高LAX1下游靶基因的表达，促进侧生分生组织的发育，保障水稻穗分枝和侧生小穗的形成(见图7中A图和B图)。由于LAX1是影响水稻产量的数量性状位点，增强LAX1的转录活性可以增加穗分枝和侧生小穗数目进而提高水稻产量(见Gao等，Dissecting yield-associated loci in super hybrid rice by resequencing recombinant inbred linesand improving parental genome sequences.Proc Natl Acad Sci USA,(2013):14492-14497)；Huang等，Genomic architecture of heterosis for yield traits inrice.Nature,(2016):629-633)。NSP1作为共激活子增强LAX1 蛋白的转录激活活性，因此，可通过基因操作手段，如增加NSP1的表达量，适当激活LAX1的转录活性，从而促进水稻穗分枝和侧生小穗的形成，增加水稻产量。
表3本发明实施例3中所用的引物
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
Claims (3)
1.NSP1基因在调控水稻侧生小穗形成中的应用，其特征在于，所述NSP1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
2.NSP1蛋白在调控水稻侧生小穗形成中的应用，其特征在于，所述NSP1蛋白的编码序列如序列表SEQ ID NO：2所示，所述NSP1蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。
3.一种调控水稻侧生小穗形成及产量的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1所述的NSP1基因连上合适的启动子进行遗传操作改变其表达量或表达模式，调控水稻穗型和产量。
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| Identification of Candidate Genes Associated with Positive and Negative Heterosis in Rice;R. C. Venu等;PLSO ONE;第9卷(第4期);第1-15页，尤其是第11页第2栏第3段 * |
| LOC_Os01g57580.Rice Genome Annotation Project.2011,第1-7页，尤其是第6页. * |
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