CN117946235A - 水稻ago3蛋白在提高植物耐高温胁迫能力和产量中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水稻AGO3蛋白在提高植物耐高温胁迫能力和产量中的应用。本发明通过构建用于表达水稻AGO3蛋白的重组质粒并转化水稻植株，构建得到了超表达AGO3蛋白的转基因水稻植株。对所得转基因水稻植株进行高温胁迫处理发现，在水稻植株中超表达AGO3蛋白可以提高其对高温胁迫的耐受能力，提高受高温胁迫的水稻苗的存活率。此外，在水稻植株中超表达AGO3蛋白还可以显著提高水稻的每穗粒数、分蘖数、结实率和单株重，由此提高水稻产量。本发明有利于耐高温胁迫植物及产量高植物品种的培育，对克服水稻高温胁迫及提高水稻产量具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于基因遗传工程技术领域。更具体地，涉及水稻AGO3蛋白在提高植物耐高温胁迫能力和产量中的应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的作物之一，其产量对保障粮食安全具有重要意义。在现有基础上，水稻产量还需大幅增加，以满足日益增长的粮食需求。
随着全球温度的持续上升，水稻遭受高温胁迫的频率也不断上升。高温胁迫是主要的非生物胁迫源，其会干扰水稻的生理、分子和生化反应，通过影响水稻的光合作用、呼吸、酶活、两性器官的形成以及养分等的吸收，来影响水稻的生长繁殖，对水稻不同发育阶段造成不同程度的损害，降低水稻的产量和质量。如在苗期，水稻的最佳生长温度为28℃/日和22℃/夜，幼苗期受高温胁迫(42℃～45℃)则会导致其生长延迟、分蘖减少、叶色改变、水分损失增加、叶片萎蔫发黄、根系生长受损，严重时导致幼苗死亡。
而培育耐高温胁迫且高产的水稻品种是解决上述问题的重要手段。因此，需不断挖掘与水稻耐高温性状相关的蛋白和基因。
发明内容
本发明提供了水稻AGO3蛋白在提高植物耐高温胁迫能力和产量中的应用。
本发明的第一个目的是提供水稻AGO3蛋白或编码水稻AGO3蛋白的基因在提高植物耐高温胁迫能力中的应用。
本发明的第二个目的是提供所述水稻AGO3蛋白或编码水稻AGO3蛋白的基因在培育耐高温胁迫能力提高的植物品种中的应用。
本发明的第三个目的是提供所述水稻AGO3蛋白或编码水稻AGO3蛋白的基因在提高植物产量中的应用。
本发明的第四个目的是提供所述水稻AGO3蛋白或编码水稻AGO3蛋白的基因在培育产量提高的植物品种中的应用。
本发明的第五个目的是提供能够在植物中超表达所述水稻AGO3蛋白的产品在提高植物耐高温胁迫能力和/或产量中的应用。
本发明的第六个目的是提供能够在植物中超所述水稻AGO3蛋白的产品在培育耐高温胁迫能力和/或产量提高的植物品种中的应用。
本发明的第七个目的是提供一种提高植物耐高温胁迫能力和/或产量的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明通过构建用于表达水稻AGO3蛋白的重组质粒并转化水稻植株，构建得到了超表达AGO3蛋白的转基因水稻植株。对所得转基因水稻植株进行高温胁迫处理发现，在水稻植株中超表达AGO3蛋白可以提高其对高温胁迫的耐受能力，提高受高温胁迫的水稻苗的存活率。此外，在水稻植株中超表达AGO3蛋白还可以显著提高水稻的每穗粒数、分蘖数、结实率和单株重，由此提高水稻产量。因此，本发明请求保护所述水稻AGO3蛋白的以下应用：
本发明请求保护水稻AGO3蛋白或编码水稻AGO3蛋白的基因在提高植物耐高温胁迫能力中的应用。
本发明还请求保护所述水稻AGO3蛋白或编码水稻AGO3蛋白的基因在培育耐高温胁迫能力提高的植物品种中的应用。
本发明还请求保护所述水稻AGO3蛋白或编码水稻AGO3蛋白的基因在提高植物产量中的应用。
本发明还请求保护所述水稻AGO3蛋白或编码水稻AGO3蛋白的基因在培育产量提高的植物品种中的应用。
具体地，本发明所述水稻AGO3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
具体地，上述应用是通过在植物中超表达水稻AGO3蛋白实现的。
作为其中的一种选择，编码水稻AGO3蛋白的基因的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还请求保护能够在植物中超表达所述水稻AGO3蛋白的产品在提高植物耐高温胁迫能力和/或产量中的应用。
本发明还请求保护所述能够在植物中超表达所述水稻AGO3蛋白的产品在培育耐高温胁迫能力和/或产量提高的植物品种中的应用。
本发明所述能够在植物中超表达所述水稻AGO3蛋白的产品包括能够在植物中超表达所述水稻AGO3蛋白的重组质粒，或含有所述重组质粒，能转化植物的重组菌。
具体地，所述重组质粒中含有编码所述水稻AGO3蛋白的基因。
本发明还提供了一种提高植物耐热性和/或产量的方法，所述方法为：在植物中超表达所述的水稻AGO3蛋白。
作为其中的一种选择，超表达所述水稻AGO3蛋白的方法为：构建含编码水稻AGO3蛋白的基因的超表达重组质粒并转入植物。
作为其中的一种选择，将超表达重组质粒转入植物是采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法转化植株愈伤组织实现的。
具体地，构建所述超表达重组质粒所用载体中含有组成型强启动子，可以使目的基因超表达。
可选地，所述载体为含有玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子的载体。
具体地，本发明构建超表达重组质粒所用的载体为pCambia1300-pOX载体，该载体是在pCambia1300载体的基础上，在启动子P35s后插入玉米泛素基因启动子(Pubi)改造得到。
具体地，本发明上述应用或方法中所述植物为水稻。
具体地，所述提高耐热性为提高苗期耐热性。
具体地，所述水稻AGO3蛋白用于提高水稻产量时，其是通过提高水稻的每穗粒数、分蘖数、结实率和单株重实现的。即水稻AGO3蛋白在提高水稻每穗粒数、分蘖数、结实率和/或单株重中的应用也在本发明的保护范围内。
相应地，编码所述水稻AGO3蛋白的基因或能够在植物中超表达所述水稻AGO3蛋白的产品在提高水稻每穗粒数、分蘖数、结实率和/或单株重中的应用也在本发明的保护范围内。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了水稻AGO3蛋白在提高植物耐高温胁迫能力和产量中的应用。本发明通过构建用于表达水稻AGO3蛋白的重组质粒并转化水稻植株，构建得到了超表达AGO3蛋白的转基因水稻植株。对所得转基因水稻植株进行高温胁迫处理发现，在水稻植株中超表达AGO3蛋白可以提高其对高温胁迫的耐受能力，提高受高温胁迫的水稻苗的存活率。此外，在水稻植株中超表达AGO3蛋白还可以显著提高水稻的每穗粒数、分蘖数、结实率和单株重，由此提高水稻产量。本发明有利于耐高温胁迫植物及产量高植物品种的培育，对克服水稻高温胁迫及提高水稻产量具有重要意义。
附图说明
图1为OsAGO3基因cDNA序列的PCR扩增产物的电泳检测结果。
图2为pCambia1300-pOX载体的结构示意图。
图3为T0代转化植株的PCR检测结果。
图4为超表达转基因株系OE5-1和OE152-1以及敲除株系casago3-1和casago3-2中OsAGO3基因的qPCR检测结果；＊＊＊P＜0.001。
图5为高温胁迫处理条件下，不同时间点的苗期水稻中基因OsAGO3的表达响应情况。
图6为超表达转基因株系OE5-1和OE152-1以及敲除株系casago3-1和casago3-2经高温胁迫处理后的苗期叶片的活性氧染色结果；图中的A为NBT染色结果；图中的B为DAB染色结果。
图7为超表达转基因株系OE5-1和OE152-1以及敲除株系casago3-1和casago3-2与野生型对照在高温胁迫处理前后的表型、存活率、离子泄露率和过氧化氢含量的检测结果；图中的A为高温胁迫处理前各株系植株的表型；图中的B为高温胁迫处理后各株系植株的表型；图中的C为各株系植株的存活率统计结果；图中的D为各株系植株的离子泄露率检测结果；图中的E为各株系植株的过氧化氢含量检测结果；图中＊＊P＜0.01。
图8为超表达转基因株系OE5-1和OE152-1以及敲除株系casago3-1和casago3-2与野生型对照在高温胁迫处理后的穗子和种子表型。
图9为超表达转基因株系OE5-1和OE152-1以及敲除株系casago3-1和casago3-2与野生型对照在高温胁迫处理后的每穗粒数、分蘖数、结实率及单株重统计结果；图中的A为各株系植株的每穗粒数统计结果；图中的B为各株系植株的分蘖数统计结果；图中的C为各株系植株的结实率统计结果；图中的D为各株系植株的单株重统计结果；图中＊＊P＜0.01；＊＊＊P＜0.001。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1水稻AGO3基因(OsAGO3)cDNA序列的克隆及其重组质粒的构建
1、OsAGO3基因cDNA序列的克隆
本发明所述水稻AGO3蛋白(OsAGO3)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。为扩增得到OsAGO3基因的cDNA序列，本发明参照NCBI数据库中提供的关于该基因的cDNA序列设计了相应的PCR扩增引物，设计所得PCR扩增引物(5’-3’)如下所示：
OsAGO3F：AAGCTTACTAGTACGATGGCCGGTCGCGGTGGCCG
OsAGO3R：TGATAGGATCCATAACGGAGGAAGAACATGTTGTTCA
OsAGO3基因cDNA序列的克隆过程如下：
取水稻品种ZH11的幼苗叶片，用TriZol Reagent(Invitrogen，货号：15596026)提取叶片总RNA，用紫外分光光度计检测所提取的总RNA的纯度及浓度，取纯度和浓度满足实验要求的总RNA 1μg进行起始逆转录反应。逆转录反应所用酶为TAKARA公司的AMV逆转录酶，逆转录反应的操作步骤参考所用逆转录酶的使用说明书。以逆转录反应所得产物为模板，用引物OsAGO3F和OsAGO3R进行PCR扩增。PCR反应所用聚合酶为Toyobo公司的KOD FX，按照KOD FX的使用说明书配制PCR反应体系；94℃3min；94℃30sec，60℃30sec，68℃150sec，35个循环；68℃5min。PCR扩增产物经电泳检测并测序。
OsAGO3基因cDNA序列的PCR扩增产物的电泳检测结果如图1所示。由图1可知，本发明扩增得到了大小约3.3kb的单一条带。结合测序结果可知，扩增所得的OsAGO3基因cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
2、重组质粒的构建
切胶回收PCR扩增所得的OsAGO3基因cDNA序列，用限制性内切酶Mlu I分别对OsAGO3基因cDNA序列和pCambia1300-pOX载体(在pCambia1300载体的基础上，在启动子P35s后插入玉米泛素基因启动子(Pubi)改造得到，其结构示意图如图2所示)进行酶切并回收酶切产物；用同源重组酶对酶切后的片段进行连接，连接体系为：同源重组酶5μL，酶切后的OsAGO3基因cDNA片段3μL(200ng)，线性化的pCambia1300-poX载体2μL(50ng)，连接条件为：50℃连接5min；取10μL连接产物，用热击转化法转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，转化产物涂布于含卡那霉素抗性的LB固体培养基；37℃培养过夜后挑10个单克隆提取质粒，进行酶切及测序鉴定。
测序鉴定所用引物(5’-3’)如下所示：
OsAGO3 TF：GCGGCGTCAGCGGCATCTGC
R2：CGATCTAGTAACATAGATGACAC
经酶切和测序鉴定结果可知，本发明成功构建了OsAGO3基因cDNA序列的超表达重组质粒，可用于超表达OsAGO3基因转基因水稻的构建。
实施例2超表达OsAGO3基因的转基因水稻的构建
本发明采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法将OsAGO3基因的超表达重组质粒转入野生型粳稻品种中花11(ZH11)的愈伤组织中，具体方法参照文献(周玲艳,姜大刚,吴豪,等.基于TAC载体的水稻转化系统的建立[J].遗传学报,2005,32(005):514-518.)进行。经过筛选、预分化和分化，本发明获得了6株T0代转化植株，T0代转化植株通过PCR及荧光定量PCR检测，从DNA水平和RNA水平鉴定其是否为阳性转化植株。
PCR检测所用引物(5’-3’)如下所示：
引物1：GACAGCGTCTCCGACCTGAT
引物2：CATCGCCTCGCTCCAGTCAAT PCR
反应体系如下表1所示：
表1
PCR反应条件为：94℃2min；94℃20sec，58℃20sec，72℃30sec，30个循环；72℃5min。
PCR反应结束后，PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，若所测样品为阳性转化植株，则能扩增得到大小约600bp的单一条带。T0代转化植株的PCR检测结果如图3所示。由图3可知，本发明所得T0代转化植株均为阳性转化植株。
将所得阳性转化植株自交得到转基因1(T1)代株系，每个株系选择10株经PCR检测为阳性的植株自交繁种，得到T2代株系；T2代株系再进行PCR检测，得到来源于不同T0代植株的T2代纯合株系2个，分别命名为OE5-1和OE152-1。
另参考文献(Ma X,Zhang Q,Zhu Q,et al.A robust CRISPR/Cas9 system forconvenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicotPlants.Mol Plant[J],2015,8(8):1274-1284)中的方法，本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建了OsAGO3基因敲除株系。针对OsAGO3基因，本发明设计的接头引物如下所示，合成所设接头引物后将其连接gRNA表达盒到pYLCRISPR/Cas9载体上，将所得载体转化ZH11的愈伤组织，经筛选、分化和生根成苗后，通过测序鉴定筛选敲除株系。
设计的接头引物：
CasA3U3T1F：ggcaTGCTCATAGCATGGTTTAC
CasA3U3T1R：aaacGTAAACCATGCTATGAGCA
CasA3U6bT2F：gttgGAGTTGCCTCCGATGCACG
CasA3U6bT2R：aaacCGTGCATCGGAGGCAACTC
经测序鉴定，本发明成功构建得到了敲除株系casago3-1和casago3-2。
分别抽提超表达转基因株系OE5-1和OE152-1以及敲除株系casago3-1和casago3-2的扬花期剑叶总RNA并逆转录得到cDNA，以所得cDNA为模板进行qPCR，检测目标基因OsAGO3的表达量变化，以野生型(wildtype)植株的检测结果为对照。qPCR检测所用引物(5’-3’)如下所示：
引物F：GCGGCGTCAGCGGCATCTGC
引物R：CCTGAAGTCGGCAGCTCCCG
内参引物F：CACATTCCAGCAGATGTGGA
内参引物R：GCGATAACAGCTCCTCTTGG
qPCR所用反应体系和条件分别如下表2和3所示：
表2qPCR所用反应体系
表3qPCR所用反应条件
超表达转基因株系OE5-1和OE152-1以及敲除株系casago3-1和casago3-2中OsAGO3基因的qPCR检测结果如图4所示。由图4可知，基因OsAGO3在超表达转基因株系OE5-1和OE152-1中高表达，在野生型株系中低表达，在敲除株系casago3-1和casago3-2中基本不表达，表明本发明成功构建得到了OsAGO3基因超表达转基因纯合株系和敲除株系。
实施例3超表达转基因株系和敲除株系的耐热性和产量性状鉴定
为分析基因OsAGO3对苗期水稻耐高温胁迫能力的影响，本发明通过qPCR分析了高温胁迫处理条件下，不同时间点的ZH11苗期水稻中基因OsAGO3的表达响应情况。其中，苗期高温胁迫处理的条件设置为：45℃、12h光/12h暗；苗期常温处理的条件设置为：28℃、12h光/12h暗；第0、2、4、6、8、10、12、24、36、38h取一次样并提取RNA，qPCR检测同实施例2。同时，本发明对超表达转基因株系OE5-1和OE152-1以及敲除株系casago3-1和casago3-2经高温胁迫处理后的苗期叶片进行了活性氧染色(NBT染色和DAB染色)，高温胁迫处理同上。
高温胁迫处理条件下，不同时间点的苗期水稻中基因OsAGO3的表达响应情况如图5所示。由图5可知，对比常温(28℃)，基因OsAGO3在高温处理初期就能出现表达响应，在处理的38h内出现两次高表达，说明OsAGO3能够对高温环境做出响应，也说明6h是调控水稻苗期耐热的关键。
超表达转基因株系OE5-1和OE152-1以及敲除株系casago3-1和casago3-2经高温胁迫处理后的苗期叶片的活性氧染色结果如图6所示；图6中的A为NBT染色结果；图6中的B为DAB染色结果。由图6可知，超表达转基因株系OE5-1和OE152-1的NBT染色和DAB染色均相对较浅，而敲除株系casago3-1和casago3-2以及野生型经高温胁迫处理后的活性氧染色的NBT染色和DAB染色均相对较深，说明超表达转基因株系OE5-1和OE152-1中活性氧水平的积累较少。
本发明还对超表达转基因株系OE5-1和OE152-1以及敲除株系casago3-1和casago3-2进行了高温胁迫处理，比对高温胁迫处理前后植株的表型变化，检测高温胁迫处理后植株的存活率、离子泄露情况和过氧化氢含量，并将水稻植株培养至成熟后收取种子，进行产量性状分析(统计每穗粒数、分蘖数、结实率及单株重，穗子和种子形态拍照)。
实验过程如下：选取野生型、超表达转基因株系OE5-1和OE152-1以及敲除株系casago3-1和casago3-2的饱满种子若干，水发，待种子萌动后夹到96孔板上水培；生长14天后挑选长势一致的小苗进行高温胁迫处理，高温胁迫处理条件为：45℃、12h光/12h暗，高温处理时间为7天；高温处理后置于28℃恢复，恢复时间为5天。
离子泄露率的测定：将10mL灭菌ddH2O加入15mL离心管中，将0.05g大小相当的水稻植株小苗叶片剪成小块，放到15mL离心管中，使叶片完全浸泡其中，室温100rpm摇动过夜；过夜后，将15mL离心管上下颠倒混匀，混匀后用电导仪进行测定得到值R1；得到值R1后，将15mL离心管放入沸水中煮沸15min，自然冷却至室温后，用电导仪进行第二次测量，得到值R2；R1/R2即为离子泄露率。
过氧化氢(H2O2)含量的测定：使用碧云天过氧化氢含量检测试剂盒(货号：S0038)进行测定，具体操作参见试剂盒说明书。
超表达转基因株系OE5-1和OE152-1以及敲除株系casago3-1和casago3-2与野生型对照在高温胁迫处理前后的表型、存活率、离子泄露率和过氧化氢含量的检测结果如图7所示。由图7中的A和B可知，超表达转基因株系OE5-1和OE152-1表现出苗期耐高温的表型。不同株系的存活率、离子泄露率和过氧化氢含量有明显变化；其中，超表达转基因株系OE5-1和OE152-1在高温处理后的存活率较野生型显著升高，离子泄露率和H2O2含量与野生型没有差异，而敲除株系casago3-1和casago3-2离子泄露率和H2O2含量显著升高(图7中的C～E)，表明超表达OsAGO3基因可以提高水稻苗期对高温胁迫的耐受能力，从而提高水稻苗在经受高温胁迫后的存活率。
超表达转基因株系OE5-1和OE152-1以及敲除株系casago3-1和casago3-2与野生型对照在高温胁迫处理后的穗子和种子表型如图8所示。超表达转基因株系OE5-1和OE152-1以及敲除株系casago3-1和casago3-2与野生型对照在高温胁迫处理后的每穗粒数、分蘖数、结实率及单株重统计结果如图9所示。由图9可知，超表达OsAGO3基因能够显著提高水稻的每穗粒数、分蘖数、结实率及单株重，从而提高水稻的产量，而敲除OsAGO3基因则会显著降低水稻的分蘖数、结实率及单株重。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.水稻AGO3蛋白或编码水稻AGO3蛋白的基因在提高植物耐高温胁迫能力中的应用，其特征在于，所述水稻AGO3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1中所述的水稻AGO3蛋白或编码水稻AGO3蛋白的基因在培育耐高温胁迫能力提高的植物品种中的应用。
3.权利要求1中所述的水稻AGO3蛋白或编码水稻AGO3蛋白的基因在提高植物产量中的应用。
4.权利要求1中所述的水稻AGO3蛋白或编码水稻AGO3蛋白的基因在培育产量提高的植物品种中的应用。
5.根据权利要求1～4任一所述应用，其特征在于，所述应用是通过在植物中超表达所述水稻AGO3蛋白实现的。
6.根据权利要求1～4任一所述应用，其特征在于，所述编码水稻AGO3蛋白的基因的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
7.能够在植物中超表达权利要求1中所述的水稻AGO3蛋白的产品在提高植物耐高温胁迫能力和/或产量中的应用。
8.能够在植物中超表达权利要求1中所述的水稻AGO3蛋白的产品在培育耐高温胁迫能力和/或产量提高的植物品种中的应用。
9.根据权利要求7或8所述应用，其特征在于，所述产品为能够在植物中超表达所述水稻AGO3蛋白的重组质粒或重组菌。
10.一种提高植物耐高温胁迫能力和/或产量的方法，其特征在于，所述方法为：在植物中超表达权利要求1中所述的水稻AGO3蛋白。
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