TWI582233B - 使用農桿菌改良轉形的方法 - Google Patents

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Description

使用農桿菌改良轉形的方法 相關申請案之相互參照
本申請案主張2011年12月15日提出的美國暫時性專利申請案序號61/576,138之利益。
發明領域
本發明係有關於使用農桿菌改良轉形的方法。
發明背景
植物轉形通常包括將植物可表現的外源基因引進植物細胞中所需要及使用之方法，如此可獲得穩定地維持及表現出該外源基因之能生育的後代植物。已經轉形許多單子葉及雙子葉分類的成員。轉殖基因的農藝作物和果實及蔬菜具商業利益。此農作物包括但不限於玉蜀黍、米、大豆類、油菜籽、向日葵、紫花苜蓿、高梁、小麥、棉花、花生、蕃茄、馬鈴薯及其類似物。
數種用以將外源基因材料引進植物細胞中，及用以獲得穩定維持及表現出所引進的基因之植物的技術已知。此技術包括促進已塗佈到微粒子上之基因材料直接進入細胞中(例如，美國專利案號4,945,050及美國專利案號 5,141,131)。其它轉形技術包括惠斯克斯(WHISKERS)TM技術(參見例如，美國專利案號5,302,523及美國專利案號5,464,765)。亦已使用電穿孔技術來轉形植物。參見例如，WO 87/06614、美國專利案號5,472,869、美國專利案號5,384,253、WO 92/09696及WO 93/21335。額外地，可使用植物原生質體與包含欲傳送的DNA之脂粒融合、直接注入DNA、和其它可能的方法。
一旦所插入的DNA已經整合進該植物基因組中，其通常遍及隨後數代相當穩定。經轉形的細胞以一般方式在植物內部生長。它們可形成胚芽細胞及將該轉形的特性傳播至後代植物。此植物可以正常方式生長及可與具有相同轉形的遺傳因子或其它遺傳因子的植物雜交。所產生的混種個體具有相應的顯型性質，例如，控制植物害蟲餵養的能力。
亦可使用一些可替代的技術將DNA插入宿主植物細胞中。那些技術包括但不限於使用藉由農桿腫瘤菌(Agrobacterium tumefaciens)或農桿根群菌(Agrobacterium rhizogenes)作為轉形試劑來傳送之T-DNA轉形。植物可使用農桿菌技術轉形，如描述例如在美國專利案號5,177,010、美國專利案號5,104,310、歐洲專利申請案案號0131624B1、歐洲專利申請案案號120516、歐洲專利申請案案號159418B1、歐洲專利申請案案號176112、美國專利案號5,149,645、美國專利案號5,469,976、美國專利案號5,464,763、美國專利案號4,940,838、美國專利案號 4,693,976、歐洲專利申請案案號116718、歐洲專利申請案案號290799、歐洲專利申請案案號320500、歐洲專利申請案案號604662、歐洲專利申請案案號627752、歐洲專利申請案案號0267159、歐洲專利申請案案號0292435、美國專利案號5,231,019、美國專利案號5,463,174、美國專利案號4,762,785、美國專利案號5,004,863及美國專利案號5,159,135中。將包含T-DNA的載體使用於植物細胞之轉形已經精深地研究及充分地描述在歐洲專利申請案120516；安(An)等人(1985，EMBO J.4：277-284)；弗雷利(Fraley)等人(1986，Crit.Rev.Plant Sci.4：1-46)，及李(Lee)及傑爾文(Gelvin)(2008，Plant Physiol.146：325-332)中，及已在該領域中充分地建立。
在植物細胞藉由農桿菌(Agrobacterium spp.)轉形時的關鍵第一步驟係讓該細菌細胞緊密接觸、黏合或黏附至欲轉形的宿主植物之細胞。在細胞-細胞黏合後，T-DNA從農桿菌轉移至植物細胞的生物學已知。參見例如傑爾文，2003，Microbiol.Molec.Biol.Rev.67：16-37；及傑爾文，2009，Plant Physiol.150：1665-1676。最少，至少T-DNA右邊界重覆，但是經常Ti或Ri質體的右邊界重覆及左邊界重覆二者將連結作為想要插入植物細胞中的基因之側翼區域。該左及右T-DNA邊界重覆係T-DNA轉移所需要的決定性順式作用序列。多種反式作用組分係在總農桿菌基因組內編碼。在這些當中，主要係由vir基因編碼出的蛋白質，其正常發現如為一系列在Ti或Ri質體上的操緃 子。多種Ti及Ri質體在vir基因的補體上稍微不同，其中例如virF不總是存在。由vir基因所編碼的蛋白質執行許多不同功能，包括識別及發出植物細胞/細菌交互作用信號、誘導vir基因轉錄、形成型式IV分泌通道、識別T-DNA邊界重覆、形成T-股、將T-股轉移至植物細胞、將T-股輸入植物細胞核中、及將T-股整合進植物核染色體中，諸如此類。參見例如，日飛拉(Tzfira)及西托維斯基(Citovsky)，2006，Curr.Opin.Biotechnol.17：147-154。
若使用農桿菌株來轉形時，可將欲插入植物細胞中的DNA選殖進入特別的質體中，例如，進入中間(穿梭)載體中或進入二元載體中。中間載體無法在農桿菌細胞中獨立的複製，但是可在常見的大腸桿菌(Escherichia coli)分子選殖株中操控及複製。常見的是，此中間載體包含由右及左T-DNA邊界重覆區域所構築的序列，其可包括一功能用於轉形植物細胞之選擇的可選擇性標誌基因、一選殖連結子、選殖多接頭或可作用為用來指定用於植物細胞轉形之基因的引進位置之其它序列。因此，想要轉移至植物的基因之選殖及操控可藉由標準方法，在大腸桿菌中，使用穿梭載體作為選殖載體簡單地進行。最後操控的穿梭載體隨後可引進農桿菌植物轉形株中用於進一步工作。該中間載體可藉由輔助質體(經由細菌接合)、藉由電穿孔法、藉由化學主導的直接DNA轉形、或藉由其它已知方法轉移進入農桿菌中。穿梭載體可由於在Ti或Ri質體或其衍生物與中間質體間同源之序列，藉由同源重組整合進入Ti或Ri質體 或其衍生物中。因此，此同源重組(即，質體整合)事件提供一種由共整合質體的Ti或Ri質體部分提供複製及其它質體維持功能之起源而在農桿菌中穩定地維持該已改變的穿梭載體之方法。該Ti或Ri質體亦包括該包含T-DNA之轉移所需要的vir基因之vir區域。常見的是，攜帶該vir區域的質體係一突變的Ti或Ri質體(輔助質體)，其中該包含右及左T-DNA邊界重覆的T-DNA區域已經刪除。此pTi衍生出的質體具有功能性vir基因及缺乏全部或實質上全部T-區域及相關元件，其於本文中敍述地指為輔助質體。
超級雙元(superbinary)系統係該穿梭載體/同源重組系統的特別實施例(由小毬(Komari)等人回顧，2006，在：分子生物學方法(Methods in Molecular Biology)(K.王(Wang)，編輯)編號343：農桿菌協定(Agrobacterium Protocol)，PP.15-41；及小森(Komori)等人，2007，Plant Physiol.145：1155-1160中)。LBA4404(pSB1)株懷有二個獨立複製的質體，pAL4404及pSB1。pAL4404係一Ti-質體衍生出的輔助質體，其包含完整的vir基因組(來自Ti質體pTiACH5)，但是其無T-DNA區域(因此無T-DNA左及右邊界重覆序列)。質體pSB1提供額外部分來自pTiBo542的vir基因組；此部分的vir基因組包括virB操緃子及virC操緃子，和基因virG及virD1。在該超級雙元系統中所使用的穿梭載體之一個實施例係pSB11，其包含一提供作為植物細胞轉形所指定的基因之引進位置的選殖多接頭，此多接頭由右及左T-DNA邊界重覆區域嚙合。穿梭載體pSB11在農桿菌中無法 獨立複製，但是當藉由在存在於pSB1及pSB11上的共同序列間之同源重組整合進入pSB1中時，穩定地維持如為共整合質體。因此，引進LBA4404(pSB1)中在經修改的pSB11載體上之完全修改的T-DNA區域起多產地作用，及藉由來自二種不同農桿菌Ti質體來源(pTiACH5及pTiBo542)的vir蛋白質轉移進入植物細胞中。與該超級雙元系統使用的農桿腫瘤菌宿主株係LBA4404(pSB1)。已証明該超級雙元系統在單子葉植物物種之轉形上特別有用。參見飛影(Hiei)等人，(1994)Plant J.6：271-282；及石田(Ishida)等人，(1996)Nat.Biotechnol.14：745-750。
除了由農桿菌Ti質體懷有的vir基因外，其它染色體運送的毒力控制基因(稱為chv基因)已知可控制農桿菌細胞與植物細胞之交互作用的某些態樣，因此影響整體植物轉形頻率(潘(Pan)等人，1995，Molec.Microbiol.17：259-269)。毒力及接附所需要的數種染色體運送基因以跨距29個千鹼基的染色體基因座聚集在一起(美西誰(Matthysse)等人，2000，Biochim.Biophys.Acta 1490：208-212)。
除了許多用於轉形植物的技術外，與外源基因接觸的組織型式同樣可變化。此組織可包括但不限於胚體組織(embryogenic tissue)、癒傷組織(callus tissue)型式I及II、下胚軸及分生組織。幾乎全部的植物組織皆可在反分化期間使用在技藝人士的技藝內之適當技術轉形。熟練植物轉形領域之人士將了解可獲得多種方法來產生轉形的植物，及它們可經修改及特化以調和在不同宿主植物物種間之生 物差異。植物外植體(例如，葉片、莖斷片、分生組織、根，但是亦可係原生質體或懸浮液培養的細胞)可有利地與農桿腫瘤菌或農桿根群菌培養用以將該DNA轉移進植物細胞中。
癒傷組織培養物：植物組織培養物可有利地與農桿腫瘤菌或農桿根群菌培養用以將DNA轉移進植物細胞中，及通常從全植物的無菌片開始，其中該無菌片可由器官片諸如葉子或根組成，或可係特定的細胞型式，諸如花粉或胚乳。已知外植體的許多特徵會影響培養開始的效率。已認為若找到正確條件的話，可使用任何植物組織作為外植體。通常來說，較年輕、更快速生長的組織(或在成長的較早階段處之組織)最有效。在適當媒質上培養的外植體可引起細胞的無組織、生長及分裂主體(癒傷組織)。在培養時，癒傷組織可或多或少無限定地維持，其限制條件為定期地在新鮮媒質上次培養。在癒傷組織形成期間，在形態學(癒傷組織通常由未特化的薄壁細胞組成)及新陳代謝上二者有某些程度的去分化。
癒傷組織培養物在植物生物工藝學上極重要。在培養媒質中之植物激素比率的操控可導致幼芽、根或體細胞胚芽發展，從此可隨後產生(再生)全植物。癒傷組織培養物亦可使用來起始細胞懸浮液，其以多種方式使用在植物轉形研究中。
細胞懸浮液培養物：癒傷組織培養物廣泛來說分成二種種類之一：緊密型或鬆散型。在緊密型癒傷組織中， 細胞稠密地聚集；然而在鬆散型癒傷組織中，細胞僅有彼此鬆散地相關及該癒傷組織變成軟且容易打散。鬆散型癒傷組織提供接種體以形成細胞懸浮液培養物。來自某些植物物種或特別的細胞型式之外植體傾向於不形成鬆散型癒傷組織，使得其難以起始細胞懸浮液。鬆散型癒傷組織有時可藉由操控媒質組分、藉由重覆繼代培養、或藉由在半固體媒質(具有低膠凝劑濃度的媒質)上培養其而改良。當將鬆散型癒傷組織放進液體媒質中然後攪拌時，單一細胞及/或小團細胞會釋放進該媒質中。在正確條件下，這些釋放的細胞繼續生長及分裂，最終產生一細胞懸浮液培養物。細胞懸浮液可相當簡單地維持如為在圓錐形燒瓶中的批次培養物及藉由重覆繼代培養進新鮮媒質中繁殖。在繼代培養後，該細胞分裂及該培養物的生物量以特徵方式增加。細胞懸浮液培養物可有利地與農桿腫瘤菌或農桿根群菌培養用以將DNA轉移進植物細胞中。
莖頂及分生組織培養物：可試管內培養幼芽尖端(其包括莖頂分生組織)，從葉腋或不定芽產生幼芽團及可有利地與農桿腫瘤菌或農桿根群菌培養用以將DNA轉移進植物細胞中。幼芽分生組織培養物係使用於穀類再生(幼苗可使用作為供體材料)。
胚芽培養物：胚芽可使用作為外植體來產生癒傷組織培養物或體細胞胚芽。可使用不成熟及成熟胚芽二者作為外植體。不成熟、胚芽衍生出之胚芽形成的癒傷組織係一種使用在單子葉植物再生的組織，及可有利地與農桿 腫瘤菌培養用以將DNA轉移進植物細胞中。不成熟胚芽係一完整組織，其能細胞分裂而產生能分化而產生全植物的組織及器官之癒傷組織細胞。可從成熟玉蜀黍植物的受精雌穗獲得不成熟胚芽，例如，從使用紐弗(Neuffer)等人的方法授粉之植物(1982，生長用於基因目的之玉蜀黍(Growing maize for genetic purpose)。在：用於生物學研究的玉蜀黍(Maize for Biological Research)。W.F.謝雷登(Sheridan)編輯，大學出版社(UNIVERSITY PRESS)，北達科塔大學(University of North Dakota)，格蘭德福克斯(Grand Forks)，ND)。用於從玉蜀黍分離出不成熟胚芽的範例性方法係由格林(Green)及飛利浦(Phillips)描述(Crop Sci.15：417-421(1976))。不成熟胚芽較佳為使用殺菌處理方法從成長中雌穗分離及保持在無菌媒質中直到使用。在不成熟胚芽之轉形中使用農桿菌係由西多羅夫及唐肯(Sidorov & Duncan)(2009，分子生物學方法：轉殖基因的玉蜀黍(Methoas in Molecular Biology：Transgenic Maize)，第526冊第4章，M.保羅史卡特(Paul Scott)(編輯))及在美國專利案號5,981,840中揭示。
小孢子培養物：單倍體組織可使用花粉或花藥作為外植體來試管內培養，及可有利地與農桿腫瘤菌培養用以將DNA轉移進植物細胞中。可從花粉產生癒傷組織及胚芽二者。可採用二種方法從單倍體組織試管內產生培養物。在第一種中，花藥(體細胞組織，其包圍及包括花粉)係在固體媒質上培養。隨後，經由成熟花藥的裂開產生花 粉衍生出的胚芽。花藥之裂開依其在正確階段處分離及正確培養條件二者而定。在某些物種中，可藉由切割花藥壁規避對自然裂開的依賴性。在第二種方法中，花藥係在液體媒質中培養，及從花藥釋放出的花粉可引發形成胚芽。不成熟花粉亦可從成長中花藥取出及直接培養。
許多穀類(米、小麥、大麥及玉蜀黍)需要以植物生長調節素補充的媒質用於花粉或花藥培養。可藉由直接胚芽發生，或經由癒傷組織階段及隨後的胚芽發生獲得從小孢子外植體再生。
單倍體組織培養物亦可從雌配子體(小卵)開始。在某些情況中，此係一種比使用花粉或花藥更有效率的方法。
從單倍體培養物獲得的植物可不為單倍體。此可係在培養時期期間染色體加倍的結果。染色體加倍(其可藉由以化學品諸如秋水仙鹼處理引發)可係一優勢，如在許多情況中單倍體植物非為從單倍體組織再生之想要的結果。此植物經常指為雙單倍體，因為它們包括二個相同單倍體基因組的複製品。
在任何前述提及的植物材料藉由與農桿腫瘤菌培養轉形用以將DNA轉移進植物細胞中之後，然後，全植物可在放置於合適的生長條件及培養媒質中之後從經感染的植物材料再生，其中該媒質可包含用於轉形植物細胞之選擇的抗生素或除草劑。然後，可測試如此獲得的植物之插入的DNA之存在。
細胞轉形(包括植物細胞轉形)可包括將在特別細胞中作用的表現載體之架構。此載體可包含DNA，其包括一在控制元件(例如，啟動子)之控制下或操作連結至其的基因。該表現載體可包括一種以上的此操作連結基因/控制元件組合。該載體可呈質體形式及可單獨或與其它質體組合著使用，以使用如描述於本文的轉形方法將轉殖基因併入該植物細胞之基因材料中而提供轉形細胞。
植物細胞表現載體可包含至少一種操作連結至控制元件(例如，啟動子)的基因標誌，其允許藉由負選擇(即，抑制不包含該可選擇的標誌基因之細胞生長)或藉由正選擇(即，篩選由該基因標誌編碼的產物)重新找到包含該標誌的轉形細胞。許多合適於植物轉形之可選擇的標誌基因在轉形技藝中熟知，及包括例如，編碼出新陳代謝地解毒可係抗生素或除草劑之選擇性化學藥劑的酵素之基因；或編碼出可對該抑制劑不敏感之經改變的標的之基因。少數正選擇方法亦在技藝中已知。各別使用之可選擇的標誌基因可因此准許轉形細胞之選擇，同時可藉由該選擇性化合物抑制不包含插入的DNA之細胞生長。特別可選擇的標誌基因之較佳物係在技士的判斷力下，但是可使用任何下列可選擇的標誌和任何於本文中未列出可作用為可選擇的標誌之其它基因。可選擇的標誌之實施例包括但不限於對卡那黴素、G418、潮黴素(hygromycin)、博菜霉素(bleomycin)、胺基甲基葉酸、草胺膦(phosphinothricin)(畢拉草(bialaphos))、鎮草寧、咪唑啉酮類、磺醯脲類及三唑并嘧 啶除草劑，諸如氯磺隆(chlorosulfuron)、溴苯腈及茅草枯(dalapon)具抗性或耐受性。
除了可選擇的標誌外，可想要使用報導基因。在某些例子中，可使用報導基因而沒有可選擇的標誌。報導基因係典型不對接受者有機體或組織提供生長優點的基因。報導基因典型編碼出提供某些顯型改變或酵素性質的蛋白質。合適的報導基因包括但不限於編碼出刍-葡萄糖醛酸酶(GUS)、螢火蟲發光酶或螢光蛋白質，諸如綠色螢光蛋白質(GFP)或黃色螢光蛋白質(YFP，基本上如揭示在美國專利案號7,951,923中)的那些。
不管所使用的轉形技術，該外源基因可被併入一基因轉移載體中，且藉由在該載體中包含一植物啟動子而適應於在植物細胞中表現出該外源基因。除了植物啟動子外，可在植物細胞中有效率地使用來自多種來源的啟動子來表現出外源基因。例如，可使用細菌來源的啟動子，諸如章魚肉鹼合成酶啟動子、胭脂胺酸(nopaline)合成酶啟動子、甘露胺酸(mannopine)合成酶啟動子；病毒來源的啟動子，諸如花椰菜嵌紋病毒(CaMV)的35S及19S啟動子、來自甘蔗桿菌狀病毒的啟動子、及其類似物。植物衍生出的啟動子包括但不限於核酮糖-1,6-雙磷酸(RUBP)羧化酶小次單位(ssu)、β-伴大豆球蛋白(conglycinin)啟動子、菜豆蛋白(phaseolin)啟動子、ADH(醇脫氫酶)啟動子、熱休克啟動子、ADF(肌動蛋白解聚合因子)啟動子、及組織特定的啟動子。該啟動子亦可包含某些可改良轉錄效率的增強子序列 元件。典型的增強子包括但不限於醇脫氫酶1(ADH1)插入子1及ADH1-插入子6。可使用組成型啟動子(constitutive promoter)。組成型啟動子在幾乎全部細胞型式中及在幾乎全部時間點指揮連續的基因表現(例如肌動蛋白、泛素(ubiquitin)、CaMV 35S)。組織特定的啟動子是在特定細胞或組織型式諸如葉子或種子中基因表現的原由。可使用的其它啟動子之實施例包括在植物發展的某些階段期間具活性，和在特定植物組織及器官中具活性的那些。此啟動子的實施例包括但不限於根特定、花粉特定、胚芽特定、玉米絲特定、棉花纖維特定、種子胚乳特定及韌皮部特定的啟動子。
在某些情況下，可想要使用可誘導啟動子。可誘導啟動子是基因的表現性對特定信號反應之原由，諸如：物理刺激(例如，熱休克基因)；光(例如，核酮糖-雙-磷酸鹽1,5羧化酶)；激素(例如，葡萄糖皮質素)；抗生素(例如，四環素)；代謝物；及壓力(例如，乾旱)。亦可使用其它作用在植物中之想要的轉錄及轉譯元件，諸如例如，5’未轉化的領導序列、及3’RNA轉錄終止及聚腺苷酸化加入訊號序列。可使用任何由技藝已知之合適的植物特定的基因轉移載體。
包含昆蟲抗性(IR)特性的轉殖基因農作物在遍及北美的玉米及棉花植物中流行，及這些特性之使用全球地擴展開。結合IR及除草劑耐受性(HT)特性的商業轉殖基因農作物已經由許多種子公司發展。這些包括由蘇雲金桿 菌(Bacillus thuringiensis)(B.t.)殺蟲蛋白質授予的IR特性與HT特性諸如對下列的耐受性之組合：乙醯乳酸合成酶(ALS)抑制劑，諸如磺醯脲類、咪唑啉酮類、三唑并嘧啶、磺醯苯胺類(sulfonanilides)及其類似物；麩醯胺酸合成酶(GS)抑制劑，諸如畢拉草、固殺草(GLUFOSINATE)及其類似物；4-羥基苯基丙酮酸鹽二氧酶(HPPD)抑制劑，諸如硝磺草酮(Mesotrione)、異惡唑草酮(isoxaflutole)及其類似物；5-烯醇丙酮酸基莽草酸鹽-3-磷酸鹽合成酶(EPSPS)抑制劑，諸如鎮草寧及其類似物；及乙醯基-輔酶羧化酶(ACCase)抑制劑，諸如蓋草能(haloxyfop)、快伏草(quizalofop)、禾草靈(diclofop)及其類似物。其它實施例已知，其中基因轉殖提供的蛋白質提供植物對除草劑化學種類的耐受性，諸如苯氧基酸類除草劑及吡啶氧基醋酸鹽類生長素除草劑(參見WO 2007/053482 A2)，或苯氧基酸類除草劑及芳基氧基苯氧基丙酸鹽類除草劑(參見WO 2005/107437 A1)。透過IR特性控制多重害蟲問題的能力係一種有價值的商業產物概念，及若在相同植物中結合昆蟲控制特性及雜草控制特性時，此產物概念的方便性提高。再者，可經由下列之單一植物組合獲得改良的價值：由B.t.殺蟲蛋白質授予的IR特性與一種以上的額外HT特性諸如上述提及的那些，加上一種以上的額外輸入特性(例如，由B.t.衍生出或其它殺蟲蛋白質授予的其它昆蟲抗性、由諸如RNAi及其類似物之機制授予的昆蟲抗性、疾病抗性、壓力耐受性、改良的氮使用及其類似特性)或輸出特性(例如，高油含量、健康的油組成 物、營養改良及其類似特性)。此組合可經由習知的育種(例如，育種堆疊)或聯合地如為新穎的轉形事件包括同步引進多重基因(例如，分子堆疊)獲得。利益包括在農作物中管理昆蟲害蟲及改良雜草控制的能力，其對製造者及/或消費者提供二級利益。因此，可使用本揭示之方法來提供具有特性組合的轉形植物，其包括具有靈活及成本有效地控制任何數目的農藝問題之能力的改良的農作物品質之完整的農藝包裝。
發明概要
本發明描述出一種用於植物細胞轉形的方法。這些方法包括在包含界面活性劑的液體媒質中讓植物細胞曝露至農桿菌細胞。該農桿菌細胞可在懸浮於包含界面活性劑的液體媒質中之前從固體媒質刮除或在液體生長媒質中生長。該界面活性劑的濃度範圍可在0.001重量百分比至0.08重量百分比內。該界面活性劑可係一非離子三矽氧烷界面活性劑及可使用多於一種界面活性劑。該植物細胞可係玉蜀黍細胞。該植物細胞可在曝露至農桿菌細胞後曝露至連續的光。
圖1係一長條圖，其顯示出當在共培養前將界面活性劑BREAK-THRU®S 233加入至使用來產生農桿菌細胞(懷有質體pEPS1083)懸浮液的感染媒質時，玉蜀黍不成熟胚芽轉形提高。
圖2係一長條圖，其顯示出當在共培養前將界面活性劑BREAK-THRU®S 233加入至使用來產生農桿菌細胞懸浮液的感染媒質時，玉蜀黍不成熟胚芽轉形提高。使用於顯示在圖2中的每個實驗之質體包括：實驗1=pEPS1053；GOI=IPT，可選擇的標誌=aad1。實驗2=pEPS1038；GOI=GF14，可選擇的標誌=aad1。實驗3及實驗4=pEPS1027；無GOI，可選擇的標誌=aad1。
詳細說明
本發明描述一種當使用農桿菌時增加在植物中的轉形頻率之方法。該方法包括在包含界面活性劑的液體媒質中讓植物細胞曝露至農桿菌細胞。某些方法包括在曝露至農桿菌細胞後讓該植物細胞曝露至連續的光。有用使用這些方法的植物之實施例包括玉蜀黍植物及不成熟玉蜀黍胚芽。
農桿菌株轉形不同物種的植物細胞之能力彼此不同。不管所考慮的農桿菌株/宿主植物之特別組合，農桿菌在轉形期間透過接附至宿主細胞而作用。參見麥克酷冷(McCullen)及賓斯(Binns)，2006，Ann.Rev.Cell Dev.Biol.22：101-127；及西托維斯基等人，2007，Cell.Microbiol.9：9-20。為此理由，提高農桿菌細胞黏合至植物細胞的方法，諸如揭示於本文使用界面活性劑的那些可產生轉形效率增加。提高農桿菌細胞黏合至植物細胞對不同物種及組織型式如不同植物物種來說不同，再者，單一物種的植物之不 同組織其細胞壁可在化學及生化學組成物上不同。再者，此差異亦可在單一植物組織的不同發展階段期間變化。
額外的是，不同屬及物種的細菌，及更確切來說，不同細菌物種株，其細胞壁經常在化學及生化學組成物上不同，及這些差異可在細菌生長循環期間改變。因此，藉由揭示於本文的方法增加植物轉形效率可產生自界面活性劑減少在農桿菌細胞壁與植物細胞壁間之疏水性排斥交互作用的能力，因此允許親密的細胞-細胞交互作用發生。
因此，可使用在不同界面活性劑間之化學差異來促進在植物組織培養的不同階段期間於不同農桿菌株之細胞(及此細胞的不同生長階段)與不同宿主植物的細胞及組織間之細胞-細胞交互作用，以便可觀察到提高的轉形效率。
界面活性劑屬於數種化學種類，及熟練植物轉形領域之人士將了解可使用不同化學種類的界面活性劑來提高不同植物宿主之植物轉形效率。來自對揭示於本文的方法有用之這些化學種類的界面活性劑之實施例包括佐藥、非離子界面活性劑、陰離子界面活性劑、油基底的界面活性劑、兩性界面活性劑及聚合界面活性劑。對描述於本文的方法有用之較佳界面活性劑的實施例有非離子三矽氧烷界面活性劑，諸如來自愛逢尼克工業(Evonik Industries)(埃森(Essen)，德國)的BREAK-THRU®S 233。對描述於本文的方法有用之更佳界面活性劑的實施例包括三矽氧烷烷氧基化物、乙氧基化的大豆油類、醇乙氧基化物C-13s、C12-C14- 烷基二甲基甜菜鹼類、及二仲級丁基酚環氧乙烷-環氧丙烷嵌段共聚物。表1顯現出可使用來實行描述於本文的方法之多種化學型式的界面活性劑之非為限制的表列。
揭示於本文之方法使用界面活性劑的轉形提高性質來戲劇性增加在植物諸如不成熟玉蜀黍胚芽中藉由農桿菌(例如，農桿腫瘤菌)的轉形效率。如上述建議般，根據 促進將提高轉形效率的細胞-細胞交互作用之能力來選擇描述於本文的方法所使用之界面活性劑。在液體媒質中的界面活性劑濃度可係0.001重量百分比至0.08重量百分比、0.001重量百分比至0.07重量百分比、0.001重量百分比至0.06重量百分比、0.001重量百分比至0.05重量百分比、0.001重量百分比至0.04重量百分比、0.001重量百分比至0.035重量百分比、0.001重量百分比至0.03重量百分比、0.001重量百分比至0.025重量百分比、0.001重量百分比至0.02重量百分比、0.001重量百分比至0.015重量百分比、0.001重量百分比至0.01重量百分比或0.005重量百分比至0.01重量百分比。
描述於本文的方法亦可使用一種以上的額外界面活性劑。如所指示，轉形效率係與多種因素相依，包括植物物種及組織型式及農桿菌株。提供所包括的多種交互作用，二種以上的界面活性劑系統可提供提高的轉形效率。可例如從表1中選擇該在二種以上的界面活性劑系統中所使用之額外界面活性劑。
描述於本文的方法可廣泛應用至多種植物物種及包括單子葉植物及雙子葉植物種類。有興趣的農作物包括但不限於玉蜀黍、米、大豆類、油菜籽、向日葵、紫花苜蓿、高梁、小麥、棉花、花生、蕃茄、馬鈴薯及其類似物。於本文之方法可使用在不同發展階段處的細胞，例如，不成熟胚芽。因此，描述於本文的方法可使用來轉形玉蜀黍不成熟胚芽。在描述於本文的方法中所使用之不成熟胚 芽的尺寸可變化。例如，該不成熟胚芽之長度可大於或等於1.5毫米及小於或等於2.5毫米。
可在曝露至農桿菌後根據描述於本文的方法控制維持該細胞的外部環境。例如，可根據描述於本文的方法改變在轉形後該細胞放置在上面之生長媒質的溫度、pH及其它要素，及其通常由熟習該項技術者熟知。那些變數之一為曝露至光。描述於本文的方法可包括將植物細胞曝露至常見的18小時光/6小時暗之協定，或此外在曝露至農桿菌細胞後曝露至連續的光。例如，根據描述於本文的方法處理之細胞可在處理後曝露至24小時白色螢光條件下數週，例如，直到植物製備之再生及苗分離階段。
額外的方法包括製備一包含界面活性劑的液體媒質、將農桿菌細胞懸浮在該液體媒質中、及在包含界面活性劑的液體媒質中將該植物細胞曝露至農桿菌細胞。該農桿菌細胞在懸浮於包含界面活性劑的液體媒質中之前可從固體媒質刮除。額外地，該農桿菌細胞可在懸浮於包含界面活性劑的液體媒質中之前在液體生長媒質中生長。
使用農桿菌來轉形植物之協定及方法由熟習分子生物學該項技術者熟知。任何已知型式將農桿菌使用於轉形植物的方法可與描述於本文之方法使用。下列實施例提供一方法的具體實例，其闡明描述於本文的方法之效率，但不想要在申請專利範圍的範圍上做限制。
於本文中所提出或引用的全部專利、專利申請案、臨時申請案及公告其全文以參考方式併入本文至它們 未與此專利說明書之詳盡教導不一致的程度。
實施例
下列實施例闡明實行申請專利範圍的程序。於本文中所描述的實施例及具體實例僅用於闡明目的，及將由熟知該技藝之人士按照其建議有多種修改或改變且欲包含在申請專利範圍的精神及範圍內。全部的百分比皆以重量計及全部的溶劑混合物比例皆以體積計，除非其它方面有提到。全部溫度皆以℃計。
實施例1。農桿菌轉形用以產生超級雙元載體。
農桿菌超級雙元系統合宜地使用於單子葉植物宿主之轉形。建構超級雙元載體及使其生效的方法已充分地揭示及以參考之方式併入本文(質體pSB1的操作手冊(Operating Manual for Plasid pSB1)，版本3.1，可從日本東京的日本煙草公司(Japan Tobacco,Inc.)購得)。使用標準分子生物學及微生物學方法來產生超級雙元質體。使用如在質體pSB1的操作手冊中所建議的方法完成超級雙元質體之結構的証明/確認。
在此操作中使用懷有多種超級雙元質體的農桿菌株。全部這些質體皆包括AAD1蛋白質的編碼序列(CDS)(美國專利7,838,733)作為可選擇的標誌/除草劑耐受性基因，其表現性係在米肌動蛋白1啟動子及相關的插入子1之轉錄控制下，基本上如在美國專利案號5,641,876中所揭示及基因銀行(Genbank)TM登錄編號EU155408.1。該aad1 mRNAs之轉錄終止及聚腺苷酸化係由玉蜀黍脂肪分解酶 3’UTR決定，基本上如揭示為基因銀行TM登錄編號GB|L35913.1|MZELIPASE的鹼基921至1277及在美國專利案號7,179,902中。此外，該超級雙元質體懷有一表現性預計不影響轉形頻率的基因。特別是，在質體pEPS1083中，有利地使用編碼出YFP蛋白質的CDS(基本上如揭示在美國專利案號7,951,923中)(其轉錄係由玉蜀黍泛素1啟動子與相關插入子1控制；美國專利案號5,510,474)，及其mRNAs係由玉蜀黍Per5 3’UTR終止(美國專利案號6,384,207))作為視覺標誌來監視轉形及測量相對轉形效率。使用來例證揭示於此的方法之其它超級雙元質體(質體pEPS1013、pEPS1018、pEPS1028、pEPS1036、pEPS1038、pEPS1059、pEPS1064、pEPS1066、pEPS1068、pEPS6004及pEPS6008)懷有編碼出道阿葛羅科學專利蛋白質的CDS，其表現性係由與使用於YFP CDS相同的轉錄/終止元件控制。
使用YFP的表現性來測量在某些實驗中的轉形效率。轉形效率百分比以顯示出YFP表現性的癒傷組織數目除以經處理的胚芽數目乘以100來計算。YFP表現性係藉由視覺觀察來測量，其係使用奧林帕斯(Olympus)SZX12(奧林帕斯美國公司(Olympus America Inc.)；中心谷(Center Valley)，PA)或萊卡(Leica)M165FC(萊卡微系統公司(Leica Microsystems Inc.)；野牛葛魯夫(Buffalo Grove)，IL)螢光顯微鏡，與涵蓋在514奈米處激發及在527奈米處測量的發射之範圍的YFP過濾器。
在使用懷有缺乏YFP基因的超級雙元質體之農 桿菌株的其它實驗中，在從藉由對蓋草能的抗性所選擇之胚芽產生的後代植物之塔克門(Taqman)®分析(生命技術(Life Technologies)；卡爾斯貝得(Carlsbad)，CA)後，計算轉形效率。所使用的塔克門®成分係對aad1編碼區特定。從所測量的塔克門®-正事件數目除以經處理的胚芽數目乘以100來計算轉形效率。對這些目的來說，產生一種以上的塔克門®證實的植物之胚芽視為一”事件”。各別的胚芽視為一個事件，不管其可已產生多少植物。
實施例2。藉由農桿菌株轉形玉蜀黍(轉形協定1)。
基本工作流程總整理如下。從在發展階段下長度約1.4至1.9毫米之年輕胚芽的玉米不成熟雌穗分離出胚芽。在全部處理當中，當欲比較不同轉形條件時，除以大約等於從單一雌穗分離的胚芽數目。胚芽以包含農桿菌細胞及界面活性劑(或不，用於比較)的懸浮液培養，然後將其移動至固體媒質板及允許共培養3至5天。將經處理的胚芽轉移到包含抗生素(用來抑制及殺死農桿菌細胞)及用於選擇性分離經基因轉形的玉米組織及植物之化合物的媒質上。在選擇媒質上生長該玉米組織(通常但不限於癒傷組織)直到植物再生。測試這些植物以證實其基因轉形及具有想要的修改的那些已生長至成熟而用於種子生產。
不成熟胚芽生產：將來自B104近親交配的種子播種進包含SUNSHINE CUSTOM BLEND 160(SUN GRO HORTICULTURE；貝爾優(Bellevue)，WA)的4加侖鍋中。 植物在溫室中使用高壓鈉及金屬鹵化物燈與16：8小時之光：暗曝光週期的組合生長。為了獲得用於轉形的不成熟胚芽，進行經控制的近親授粉。在授粉後10至13天當胚芽尺寸大約1.4至1.9毫米時，分離不成熟胚芽。玉蜀黍雌穗在移除外皮及鬚後，藉由沈浸漬在50%商業漂白水(克羅洛斯(CLOROX)®，5.25%次氯酸鈉)與屯(Tween)®-20(每500毫升1或2滴)中10分鐘進行表面消毒，及以無菌水三倍洗滌。
將不成熟胚芽殺菌處理地直接分離進包含2毫升感染媒質與懸浮的農桿菌細胞，及如適當的界面活性劑之微離心管中。讓該胚芽與包含界面活性劑(或不，用於對照實驗)的農桿菌細胞懸浮液培養5-30分鐘。
包含超級雙元載體的農桿菌細胞懸浮液係藉由下列方法製備：首先在包含YEP(克質量/升：酵母菌萃取物，5；蛋白腖，10；NaCl，5；瓊脂，15)與50毫克/升的觀黴素；10毫克/升的利福平；及50毫克/升的鏈黴素之固體瓊脂板上生長細胞，在25°下4天或在28°下3天，如為平板(lawn)。(在某些實驗中，農桿菌細胞在含有如上述的抗生素之固體LB媒質(西格瑪亞得富；聖路易斯，MO)20克質量/升上生長)。對此培養物從在相同條件下建立的單一菌落分離物劃線。從該平板刮除一或二個細胞菌環，然後均勻地再懸浮(藉由溫和地用吸量管上下吸取)於感染媒質(IfM)中至光學密度在600奈米(OD600)下0.35至0.45。該感染媒質包含：4.33克質量/升的MS鹽類；1X ISU修改的MS維他命；68.4克質量/升的蔗糖；36克質量/升的葡萄糖；700毫克/升 的L-脯胺酸；3.3毫克/升的麥草畏-KOH；及100μM的乙醯丁香酮(acetosyringone)(在DMSO中製備)；在pH 5.2下。依實驗而定，在懸浮該等細胞後，將適當量的界面活性劑溶液(例如，BREAK-THRU®S 233在0.01%最後濃度下)加入至該感染媒質。
讓該農桿菌及胚芽溶液在室溫下培養5至30分鐘，然後將胚芽轉移至共培養媒質，其包含4.33克質量/升的MS鹽類；1X ISU修改的MS維他命；30克質量/升的蔗糖；700毫克/升的L-脯胺酸；100毫克/升的肌醇；3.3毫克/升的麥草畏-KOH；100毫克/升的酪蛋白酵素水解產物；15毫克/升的AgNO3；100μM的乙醯丁香酮；及3克質量/升的傑爾忍(GELZAN)TM；在pH 5.8下。在24小時白色螢光(大約50μEm-2s-1)下，於25°下共培養培育3至4天。
休眠及選擇：在共培養後，將胚芽(36胚芽/板)小心地轉移至新鮮非選擇的休眠媒質，其包含4.33克質量/升的MS鹽類；1X ISU修改的MS維他命；30克質量/升的蔗糖；700毫克/升的L-脯胺酸；3.3毫克/升的麥草畏在KOH中；100毫克/升的肌醇；100毫克/升的酪蛋白酵素水解產物；15毫克/升的AgNO3；0.5克質量/升的MES；250毫克/升的卡本西林；及2.3克質量/升的傑爾忍TM；在pH 5.8下。在24小時白色螢光(大約50μEm-2s-1)下，於28°下連續培育7天。
在7天休眠時期後，將胚芽轉移至選擇媒質。為了選擇以包含植物可表現的aad1可選擇的標誌基因之超級 雙元質體轉形之玉蜀黍組織，首先將胚芽(36/板)轉移至包含休眠媒質(上述)的選擇媒質I，其包括100 nM R-蓋草能酸(0.0362毫克/升)。培育該胚芽1星期(28°；連續的光)，然後將其轉移至包含休眠媒質的選擇媒質II，其含有500 nM R-蓋草能酸(0.1810毫克/升)，在其上於連續光下培育額外7天。在此時，將它們移至新鮮的選擇媒質II及如上述連續培育額外一星期。
熟習玉蜀黍轉形該項技術者將了解當使用其它植物可表現的可選擇的標誌基因(例如，除草劑耐受性基因)時，可獲得其它轉形植物選擇方法。
再生前：在選擇方法後，將培養物轉移至再生前媒質，其包含4.33克質量/升的MS鹽類；1X ISU修改的MS維他命；45克質量/升的蔗糖；350毫克/升的L-脯胺酸；100毫克/升的肌醇；50毫克/升的酪蛋白酵素水解產物；1.0毫克/升的AgNO3；0.25克質量/升的MES；0.5毫克/升的萘醋酸在NaOH中；2.5毫克/升的離層酸在乙醇中；1毫克/升的6-苄基胺基嘌呤；250毫克/升的卡本西林；2.5克質量/升的傑爾忍TM；及500 nM R-蓋草能酸；在pH 5.8下。在如上述之連續白色螢光下，於28°下連續培育7天。
再生及苗分離：為了再生，將該培養物轉移至再生媒質I，其包含4.33克質量/升的MS鹽類；1X ISU修改的MS維他命；60克質量/升的蔗糖；100毫克/升的肌醇；125毫克/升的卡本西林；2.5克質量/升的傑爾忍TM；及500 nM R-蓋草能酸；在pH 5.8下；及允許苗產生及在連續白色螢光下 於28°下生長最高3週。
當苗到達合適的生長階段，它們以鑷子及解剖刀切除及轉移至再生媒質II，其包含4.33克質量/升的MS鹽類；1X ISU修改的MS維他命；30克質量/升的蔗糖；100毫克/升的肌醇；3.0克質量/升的傑爾忍TM；在pH 5.8下；及在如上述之連續白色螢光下於28°下培育，以允許幼芽及根進一步生長及發展。
種子生產：將植物移植進METRO-MIX 360無土生長媒質(SUN GRO HORTICULTURE；貝爾優，WA)中及在生長室中受冷而變得耐寒(hardened-off)。然後，將植物移植進SUNSHINE CUSTOM BLEND 160土壤混合物中及在溫室下生長至開花。進行經控制的授粉以用於種子生產。
實施例3。藉由農桿菌株轉形玉蜀黍(轉形協定2)。
基本工作流程總整理如下。從在發展階段下長度約1.8至2.4毫米之年輕胚芽的玉米不成熟雌穗分離出胚芽。在全部處理當中，當欲比較不同轉形條件時，除以大約等於從單一雌穗分離的胚芽數目。該胚芽以包含農桿菌細胞及界面活性劑(或不，用於比較)之懸浮液培育，然後移至固體媒質板及允許共培養1至4天。將經處理的胚芽轉移到包含抗生素(用來抑制及殺死農桿菌細胞)及用來選擇性分離經基因轉形的玉米組織及植物之化合物的媒質上。玉米組織(通常但不限於癒傷組織)在選擇媒質上生長直到植物再生。測試這些植物以證實其基因轉形及具有想要的修 改之那些生長至成熟以用於種子生產。
不成熟胚芽生產：將來自玉蜀黍近親品系B104(在1980年代早期商業釋放的愛荷華州(Iowa State)種類)的種子播種進包含SUNSHINE CUSTOM BLEND 160(SUN GRO HORTICULTURE；貝爾優，WA)的4-加侖鍋中。該植物在溫室中使用高壓鈉及金屬鹵化物燈與16：8小時的光：暗曝光週期之組合生長。為了獲得用於轉形的不成熟胚芽，進行經控制的近親授粉。在授粉後10至13天當胚芽尺寸大約1.8至2.4毫米時分離不成熟胚芽。玉蜀黍雌穗在移除外皮及鬚後，藉由浸入50%商業漂白液(克羅洛斯®，6.15%次氯酸鈉)與屯®-20(每500毫升1或2滴)中10分鐘進行表面消毒，及以無菌水三倍洗滌。
再者，玉蜀黍雌穗可藉由完整噴灑新鮮製備的70%乙醇溶液直到雌穗完全浸泡而表面消毒。在使用前，允許該雌穗在無菌的轉移抽風櫃中風乾半小時以允許乙醇溶液完全蒸發。
不成熟胚芽殺菌處理地直接分離進包含2毫升接種媒質與懸浮的農桿菌細胞，及如適當的界面活性劑之微離心管中。該胚芽與包含界面活性劑(或不，用於對照實驗)的農桿菌細胞懸浮液培育5-30分鐘。
該包含超級雙元載體的農桿菌細胞懸浮液係藉由下列方法製備：首先在125毫升(於500毫升裝有擋板的燒瓶中)的LB媒質(西格瑪亞得富；聖路易斯，MO)20克質量/升中生長細胞，其包含50毫克/升的觀黴素；10毫克/升的利 福平；及50毫克/升的鏈黴素，伴隨著在26°下搖晃(250 rpm在暗中)6小時。此培養物藉由25毫升過夜培養物(在相同媒質中生長)之1：5稀釋進入新鮮媒質中而建立。該細胞藉由在4°下以3500 rpm離心15分鐘製成丸粒，然後在接種媒質(InM)中均勻地再懸浮(藉由溫和地用吸量管上下吸取)至光學密度在600奈米(OD600)下大約1.0。該接種媒質包含：2.2克質量/升的MS鹽類(弗連(Frame)等人(2011，使用玉蜀黍不成熟合子胚芽基因轉形(Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos)。在植物胚芽培養方法及協定：分子生物學方法中。T.A.梭培(Thorpe)及E.C.楊(Yeung)(編輯)，史普林爵科學及商業媒體(Springer Science and Business Media)，LLC。pp 327-341)；1X ISU修改的MS維他命(弗連等人，2011前述)；68.4克質量/升的蔗糖；36克質量/升的葡萄糖；115毫克/升的L-脯胺酸；100毫克/升的肌醇；及200μM的乙醯丁香酮(在DMSO中製備)；在pH 5.4下。依實驗而定，在懸浮該等細胞後，將適當量的界面活性劑溶液(例如，BREAK-THRU®S 233在0.01%的最後濃度下)加入至該接種媒質。
在室溫下培育該農桿菌及胚芽溶液5至15分鐘，然後將該胚芽轉移至共培養媒質，其包含4.33克質量/升的MS鹽類；1X ISU修改的MS維他命；30克質量/升的蔗糖；700毫克/升的L-脯胺酸；3.3毫克/升的麥草畏在KOH中(3,6-二氯-鄰-大茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)；100毫克/升的肌醇；100毫克/升的酪蛋白酵素水解產物；15毫克/升 的AgNO3；100μM的乙醯丁香酮在DMSO中；及3克質量/升的傑爾忍TM(西格瑪-亞得富)；在pH 5.8下。在連續的白色螢光(大約50μEm-2s-1)下，於25°下共培養培育3至4天。
休眠及選擇：在共培養後，將胚芽(36胚芽/板)小心轉移至非選擇的休眠媒質，其包含4.33克質量/升的MS鹽類；1X ISU修改的MS維他命；30克質量/升的蔗糖；700毫克/升的L-脯胺酸；3.3毫克/升的麥草畏在KOH中；100毫克/升的肌醇；100毫克/升的酪蛋白酵素水解產物；15毫克/升的AgNO3；0.5克質量/升的MES(2-(N-嗎福啉基)乙磺酸單水合物(飛脫科技(PHYTOTECHNOLOGIES)LABR.；列湼薩(Lenexa)，KS)；250毫克/升的卡本西林；及2.3克質量/升的傑爾忍TM；在pH 5.8下。在如上述的連續白色螢光條件下，於28°下連續培育7天。
在7天休眠時期後，將胚芽轉移至選擇媒質。為了選擇以包含植物可表現的aad1可選擇的標誌基因之超級雙元質體轉形的玉蜀黍組織，首先將該胚芽(18胚芽/板)轉移至由休眠媒質(上述)組成之選擇媒質I，及其包含100 nM R-蓋草能酸(0.0362毫克/升)。培育該胚芽1星期，然後將其轉移(12胚芽/板)至由休眠媒質(上述)組成的選擇媒質II，及其含有500 nM R-蓋草能酸(0.1810毫克/升)，在其上面培育額外2週。在24小時白色螢光條件(大約50μEm-2s-1)下，於28°下大約4至6週的進程獲得轉形的分離物。將回收的分離物轉移至新鮮的再生前媒質，用以起始再生及進一步分析。
熟習玉蜀黍轉形該項技術者將了解當使用其它 植物可表現的可選擇的標誌基因(例如除草劑耐受性基因)時，可獲得選擇轉形植物的其它方法。
再生前：在該選擇方法後，將已曝露至24小時光條件的培養物轉移(6至8癒傷組織/板)至再生前媒質，其包含4.33克質量/升的MS鹽類；1X ISU修改的MS維他命；45克質量/升的蔗糖；350毫克/升的L-脯胺酸；100毫克/升的肌醇；50毫克/升的酪蛋白酵素水解產物；1.0毫克/升的AgNO3；0.25克質量/升的MES；0.5毫克/升的萘醋酸在NaOH中；2.5毫克/升的離層酸在乙醇中；1毫克/升的6-苄基胺基嘌呤；250毫克/升的卡本西林；2.5克質量/升的傑爾忍TM；及500 nM R-蓋草能酸；在pH 5.8下。在28°連續白色螢光(大約50μEm-2s-1)下連續培育7至14天。
再生及苗分離：為了再生，將該培養物轉移(最高每飛塔崔(PHYTATRAY)TM(飛脫科技LABR.)12癒傷組織)至主要的再生媒質，其包含4.33克質量/升的MS鹽類；1X ISU修改的MS維他命；60克質量/升的蔗糖；100毫克/升的肌醇；125毫克/升的卡本西林；3.5克質量/升的結連膠(GELLAN GUM)G434(飛脫科技LABR.)；及500 nM R-蓋草能酸；在pH 5.8下；及允許苗產生及生長最高3週。
當苗長度到達3至5公分時，將其轉移(每飛塔崔TM6株植物)至植物生長媒質，其包含4.33克質量/升的MS鹽類；1X ISU修改的MS維他命；30克質量/升的蔗糖；100毫克/升的肌醇；3.5克質量/升的結連膠G434；及0.5毫克/升的吲哚醋酸在NaOH中；在pH 5.8下；及在16小時白色螢光條 件(大約50μEm-2s-1)下，於25°下培育以允許幼芽及根進一步生長及發展。
種子生產：將植物移植進METRO-MIX 360無土生長媒質(SUN GRO HORTICULTURE；貝爾優，WA)中及在生長室中受冷而變得耐寒。然後，將植物移植進SUNSHINE CUSTOM BLEND 160土壤混合物中及在溫室中生長至開花。進行經控制的授粉以用於種子生產。
實施例4。使用在液體媒質中生長的農桿菌細胞之轉形效率。
使用農桿菌超級雙元株LBA4404(pEPS1083)，藉由揭示在實施例2中的方法(轉形協定1)來轉形玉蜀黍不成熟胚芽。比較當使用從YEP瓊脂板刮除及再懸浮於感染媒質(IfM)中之農桿菌細胞所獲得，對在相同時間使用在液體媒質LB中生長，藉由離心採集及再懸浮於IfM的農桿菌細胞所完成之實驗的轉形效率。藉由在轉形實驗起始後之一至五週，計數在經處理的組織片上之黃色螢光斑點(YFP+)的數目來測量在該方法的不同階段處之比較轉形效率。表2總整理所獲得的結果。
總整理在表2中的結果闡明使用從液體培養新鮮採集的農桿菌細胞感染玉蜀黍胚芽提供明顯比使用從瓊脂板刮除的細胞獲得要高的轉形效率。
實施例5。藉由將界面活性劑加入至轉形協定1來改良轉形效率。
藉由揭示在實施例2中的方法，使用農桿菌超級雙元株LBA4404(PDAB108652)來轉形玉蜀黍不成熟胚芽。質體PDAB108652包括YFP編碼區，其表現性係由ZmUbi1啟動子驅動及亦懷有在米肌動蛋白1啟動子之表現性控制下的aad1除草劑耐受性編碼區。比較當懸浮在缺乏界面活 性劑的IfM中之農桿菌細胞所獲得，對在相同時間點以包含加入的界面活性劑BREAK-THRU®S 233之IfM在不同濃度下完成之實驗的轉形效率。轉形效率係藉由在4週之蓋草能選擇後計數具有螢光扇形部分的癒傷組織(每個癒傷組織皆起源於單一胚芽)來計算。此時，螢光扇形部分大，因此該組織表示穩定轉形的扇形部分。總整理在表3中的結果闡明使用界面活性劑增加轉形效率，且提高效應在所使用的界面活性劑之濃度上有一靈敏度。
藉由揭示在實施例2中的方法，使用農桿菌超級雙元株LBA4404(pEPS1083)來轉形玉蜀黍不成熟胚芽。比較當懸浮在缺乏界面活性劑的IfM中之農桿菌細胞所獲得，對在相同時間點於IfM中存在加入的界面活性劑時所完成的實驗之轉形效率。藉由在轉形實驗起始後之一至五週，計數在經處理的組織片上之黃色螢光斑點(YFP+)的數目來測量在該方法的不同階段處之轉形效率比較。表4總整理所獲得的結果。
在某些實驗中，在共培養步驟前，藉由懸浮及溫 和的離心且以IfM(含或不含，界面活性劑)清洗該農桿菌細胞(在表4中的”清洗”)。再者，在實驗5(表4)中，使用200μM乙醯丁香酮(而非如在實施例2中具體指定的100μM)來引發vir基因表現，及該農桿菌細胞係在含有適當抗生素的LB媒質而非YEP媒質之板上生長。
總整理在表4中的實驗明顯顯示出在使用來再懸浮從固體媒質板刮除的農桿菌細胞之感染媒質中存在界面活性劑BREAK-THRU®S 233戲劇性增加不成熟胚芽的轉形效率。再者，界面活性劑泰克帝克TM在提高轉形效率上具有正但是較不引人注目的效應。
在本揭示之方法的進一步例示中，使用農桿菌株LBA4404(pEPS1083)細胞，藉由實施例2的方法轉形不成熟玉蜀黍胚芽。藉由在從不成熟胚芽發展癒傷組織時的YFP+斑點或扇形部分外觀來監視轉形效率。圖1的左邊顯示出五個使用從固體瓊脂板刮除的農桿菌細胞之實驗(實驗1至5)，及圖1的右邊顯示出從液體生長培養採集的農桿菌細胞產生之三個實驗(實驗6至9)。在結合的實驗1至5中，轉形效率在來自所採集的全部九個雌穗之胚芽中皆增加(100%)，及在來自九個雌穗的六個胚芽中之轉形效率增加具統計顯著性(費雪(Fisher)精確p<-0.05)(67%)。在結合的實驗6至9(液體生長的農桿菌)中，來自所採集的全部八個雌穗之胚芽皆(100%)在轉形效率上顯示出統計顯著性增加。因此，從總整理在圖1中的結果明瞭，將BREAK-THRU®S 233加入至該感染媒質戲劇性增加玉蜀黍不成熟胚芽的轉形效率，在某些情況中產生超過90%的轉形效率。
在本揭示的方法之另一個闡明中，不成熟玉蜀黍胚芽以懷有不同質體(其全部包含aad1可選擇的標誌基因)之農桿菌株LBA4404細胞，藉由實施例2之方法轉形。如先前，實驗處理比較含或不含使用0.01%界面活性劑 BREAK-THRU®S 233的轉形效率。該胚芽自始至終透過蓋草能對植物產物的選擇再生及採用。因此，在實質上比於圖1中總整理者晚後的階段處收集資料。轉形效率百分比係藉由將產生轉殖基因植物的胚芽(”事件”)數目除以經處理的不成熟胚芽數目乘以100來計算。為此目的，一胚芽計數如為單一事件，即使其產生多重轉殖基因植物。使用從瓊脂板刮除的農桿菌細胞之三個實驗結果顯示在圖2(實驗1、2及3)中。此外，圖2顯示出在液體媒質中生長，藉由離心採集及再懸浮於IM(含或不含BREAK-THRU®S 233)中之農桿菌細胞的實驗(實驗4)結果。在圖2中成對的長條顯示出來自各別雌穗的胚芽之反應。
從在圖2中的資料明瞭，加入界面活性劑BREAK-THRU®S 233在農桿菌主導的玉蜀黍不成熟胚芽轉形效率上產生戲劇性增加，不管農桿菌細胞的先前生長組態及不管轉形質體的基因組成物。在結合的實驗1、2及3中，轉形效率在來自所採集的26個雌穗之23個胚芽中增加(88%)，及在來自26個雌穗的12個胚芽中之轉形效率增加具統計顯著性(費希爾精確p<-0.05)(46%)。在實驗4(液體生長的農桿菌)中，來自所採集的12個雌穗之10個胚芽(83%)在轉形效率上顯示出增加，及該增加在12個雌穗之一個中具統計顯著性(8%)。
實施例6。不同化學種類的界面活性劑之轉形提高作用比較。
表1提供數種化學種類的界面活性劑之非為限制 的表列。使用如在實施例3中提供之轉形協定2進行不成熟胚芽的轉形實驗。將懷有不同質體的農桿菌細胞懸浮在包含BREAK-THRU®S 233或多種其它界面活性劑(全部濃度皆在0.01%)之接種媒質(InM)中，及比較在起始實驗後之7至10週的aad1基因之轉形速率(藉由塔克門®分析測量)。轉形效率百分比係藉由將產生轉殖基因植物的胚芽(”事件”)數目除以經處理的不成熟胚芽數目乘以100計算。為此目的，一個胚芽計數如為單一事件，即使其產生多重轉殖基因植物。表5顯現出所獲得的轉形效率。
總整理在表5中的結果闡明使用BREAK-THRU®S 233，當其包含在接種媒質中而使用來再懸浮於液體媒質 中生長及從其採集之農桿菌接種體細胞時，所提供之轉形效率優於以多數所測試的其它界面活性劑所獲得的那些。在三個實驗(實驗2、實驗9及實驗11)中，在二種界面活性劑間觀察到的轉形效率幾乎相同。
實施例7。來自不同操作者的轉形結果。
熟習玉蜀黍轉形該項技術者將了解植物轉形方法經常需要非常專門超過數月或數年實驗所獲得的技術。轉形效率可由於不同操作者所實行的程序妨礙之不一致而在廣泛範圍內變化。因此，提供改良由不同操作者在不同時間點獲得轉形效率之可預測性的玉蜀黍轉形程序是有利的。使用實施例3之方法(農桿菌株LBA4404懷有多種/不同的質體)及在接種媒質中包含BREAK-THRU®S 233，在數個月的時期內進行玉蜀黍不成熟胚芽之轉換。從所獲得的蓋草能耐受性癒傷組織之計數來估計轉形效率。表6總整理所獲得的結果。
總整理在表6中的結果顯示出揭示在實施例3中的轉形協定，當以在接種媒質中內含BREAK-THRU®S 233實行時提供一耐用及可預料的方法，其減低操作者至操作者在轉形效率上的變化。再者，改良該方法的可預測性允許更準確的決定實驗大小(例如必需處理的胚芽數量)以獲得想要的結果(例如所獲得的轉形事件數量)。
本發明不由揭示於本文的具體實例來限制範圍，其想要闡明本發明的幾個態樣及功能相等的任何具體實例皆在本發明之範圍內。除了於本文顯示及描述出的那些外之多種修改方法將由熟習該項技術者明瞭及想要落在 所附加的申請專利範圍之範圍內。再者，雖然在上述具體實例中僅特別討論揭示於本文的方法步驟之某些典型組合，將由熟習該項技術者明瞭該方法步驟的其它組合及其亦想要落在所附加的申請專利範圍之範圍內。因此，步驟之組合可於本文中明確提到；但是，包括其它步驟組合，即使其未明確地描述。若明確地敘述一值時，要瞭解與所敘述的值約相同的量之值亦在本發明的範圍內。若敘述一範圍的值時，亦特別揭示出在該範圍所敘述的上及下限間之每個插入其間的整數值及其每個分數，一起揭示出在此等值間之每個次範圍。如於本文中所使用，用語”包含”及其變化與用語”包括”及其變化同義地使用，且係一開放式、非為限制的用語。如於本文中所使用，用語”修改”或”改變”或其任何形式意謂著修改、改變、置換、刪除、代替、移除、變化或轉形。

Claims (12)

  1. 一種用於植物細胞轉形的方法，其包括在一含有BREAK-THRU S 233非離子三矽氧烷界面活性劑的液體媒質中讓不成熟胚芽植物細胞曝露至農桿菌細胞，該界面活性劑在該液體媒質中的濃度係0.001重量百分比至0.08重量百分比。
  2. 如申請專利範圍第1項之用於植物細胞轉形的方法，更包含一額外的界面活性劑。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之用於植物細胞轉形的方法，其中該植物細胞係玉蜀黍細胞。
  4. 如申請專利範圍第3項之用於植物細胞轉形的方法，其中該不成熟胚芽之長度係大於或等於1.5毫米且小於或等於2.5毫米。
  5. 如申請專利範圍第3項之用於植物細胞轉形的方法，其中該植物細胞係在曝露至農桿菌細胞後，曝露至連續的光。
  6. 一種用於植物細胞轉形的方法，其包括：製備一含有BREAK-THRU S 233非離子三矽氧烷界面活性劑的液體媒質，該界面活性劑在該液體媒質中的濃度係0.001重量百分比至0.08重量百分比；將農桿菌細胞懸浮在該液體媒質中；及在該包含界面活性劑的液體媒質中讓不成熟胚芽植物細胞曝露至農桿菌細胞。
  7. 如申請專利範圍第6項之用於植物細胞轉形的方法，其中該農桿菌細胞在懸浮於包含該界面活性劑的該液體媒質中之前，係從一固體媒質刮除。
  8. 如申請專利範圍第6或7項之用於植物細胞轉形的方法，其中該農桿菌細胞在懸浮於包含該界面活性劑的該液體媒質中之前，係在一液體生長媒質中生長。
  9. 如申請專利範圍第8項之用於植物細胞轉形的方法，更包含一額外的界面活性劑。
  10. 如申請專利範圍第6或7項之用於植物細胞轉形的方法，其中該植物細胞係玉蜀黍細胞。
  11. 如申請專利範圍第6或7項之用於植物細胞轉形的方法，其中該不成熟胚芽之長度係1.5至2.5毫米。
  12. 如申請專利範圍第6或7項之用於植物細胞轉形的方法，其中該植物細胞係在曝露至農桿菌細胞後，曝露至連續的光。
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