BR102014025499A2 - elementos regulatórios de zea mays e uso dos mesmos - Google Patents

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Abstract

elementos regulatórios de zea mays e uso dos mesmos. a presente invenção refere-se a construtos de vetor e a métodos para expressar um transgene nas células de planta e/ou tecidos de planta com o uso de elementos regulatórios de gene, que incluem os promotores, 5'-utrs, introns e/ou 3'-utrs, isolados de zea mays.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ELEMENTOS REGULATÓRIOS DE ZEA MAYS E USO DOS MESMOS".
REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS [001] A presente invenção reivindica o benefício, conforme 35 U.S.C. 5 § 119(e), do Pedido de Patente Provisório n° U.S. 61/890.904, depositado em 15 de outubro de 2013, cujo conteúdo está ora incorporado em sua totalidade a título de referência.
INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA DE MATERIAL
ENVIADO ELETRONICAMENTE [002] É incorporada a título de referência em sua totalidade uma listagem de sequências de nucleotídeos/aminoácidos legível por computador enviada simultaneamente ao presente documento e identificada da seguinte forma: Um arquivo de ASCII (Texto) de 8 KB nomeado "74276" criado em 3 de outubro de 2014.
CAMPO DA INVENÇÃO [003] Esta invenção refere-se, de modo geral, ao campo de biologia molecular de planta e, mais especificamente, ao campo de expressão estável de genes em plantas transgênicas.
ANTECEDENTES [004] A transformação de planta é uma tecnologia atrativa para o uso na introdução de traços agronomicamente desejáveis ou características em espécies de planta de muda diferentes. As espécies de planta são desenvolvidas e/ou modificadas para terem traços desejáveis específicos. Em geral, os traços desejáveis incluem, por exemplo, aprimorar a qualidade de valor nutricional, aumentar o rendimento, atribuir resistência ao inseticida ou peste, resistência a doença, aumentar tolerância ao estresse e à estiagem, aprimorar qualidades hortícolas (por exemplo, pigmentação e crescimento), conferir tolerância ao herbicida, possibilitar a produção de compostos e/ou materiais industrialmente úteis a partir da planta e/ou possibilitar a produção de produtos farmacêuticos. [005] As plantas transgênicas que compreendem múltiplos transgenes empilhados em um único loco gênico são produzidas através de tecnologias de transformação de planta. As tecnologias de transformação de planta atribuem a introdução de transgenes em uma célula de planta, recuperação de uma planta transgênica fértil que contém a cópia integrada de modo estável do transgene no genoma de planta e a expressão de transgene subsequente através de transcrição e tradução do(s) transgene(s). Portanto, resultando em plantas transgênicas que têm traços e fenótipos desejáveis. Cada transgene em uma pilha, tipicamente, exige um promotor independente para expressão de gene no em uma planta e, assim, múltiplos promotores são usados em uma pilha de transgene. [006] A necessidade de coexpressão de múltiplos transgenes para regular o mesmo traço, frequentemente resulta no uso repetido do mesmo promotor para impulsionar a expressão dos múltiplos transgenes. Entretanto, o uso repetido dos promotores que compreende as sequências que compartilham um alto nível de identidade de sequência podem levar a silenciamento de gene à base de homologia (HBGS). Observa-se que o HBGS ocorre frequentemente em plantas transgênicas (Peremarti et al., 2010) quando as sequências de DNA repetitivas são usadas em um transgene. Além disso, o uso repetido de sequências de DNA similares em construtos de transgene provou ser desafiador em Agrobacterium devido à recombinação e instabilidade de plasmídeo. [007] Os elementos regulatórios de gene de mais são descritos neste documento (por exemplo, promotor, 5’ UTR e 3’ UTR). Os construtos e métodos que utilizam elementos regulatórios de mais são, adicionalmente, descritos.
SUMÁRIO [008] Neste documento, são revelados os polinucleotídeos purificados, vetores, construtos e métodos para expressar um transgene em células de planta e/ou tecidos de planta. Em uma modalidade, os elementos regulatórios de um gene a/b de clorofila são purificados a partir dos genomas de Zea mays e recombinados com sequências não ligadas nativamente aos ditos elementos regulatórios para criar um vetor de expressão para expressar os transgenes em células de planta não nativas às sequências regulatórias a/b de clorofila. Em uma modalidade, um vetor de expressão é fornecido em que os elementos regulatórios de um gene a/b de clorofila estão ligados de maneira funcional a uma sequência de poliligante. Tal vetor de expressão facilita a inserção de um gene, transgene, ou cassete de gene no vetor em um estado ligado de maneira funcional às sequências regulatórias de gene a/b de clorofila. [009] Em uma modalidade, um construto é fornecido de modo a compreender um promotor a/b de clorofila de Zea mays da SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene é fornecido de modo a compreender um promotor a/b de clorofila de Zea mays ligado de maneira funcional a um transgene. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene inclui uma 5'UTR a/b de clorofila de Zea mays ligada de maneira funcional a um transgene.
Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene inclui uma 5'UTR a/b de clorofila de Zea mays ligada de maneira funcional a um promotor. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene inclui um íntron a/b de clorofila de Zea mays ligado de maneira funcional a um transgene. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene inclui um íntron a/b de clorofila de Zea mays ligado de maneira funcional a um promotor. Em uma modalidade, um construto inclui uma 3'UTR a/b de clorofila de Zea mays de cassete de expressão de gene. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene inclui 3'UTR a/b de clorofila de Zea mays ligada de maneira funcional a um transgene. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene inclui, pelo menos, um, dois, três, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, ou mais transgenes. [0010] Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene inclui, independentemente, a) um promotor a/b de clorofila de Zea mays, b) um íntron a/b de clorofila de Zea mays, c) uma Zea mays 5'UTR a/b de clorofila e d) uma 3'UTR a/b de clorofila de Zea mays. [0011] De acordo com uma modalidade, um vetor de ácido nucleico é fornecido de modo a compreender um promotor ligado de maneira funcional a um transgene a/b não clorofila, em que o promotor consiste em SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1. Em uma modalidade adicional, o vetor de ácido nucleico compreende um cassete de gene, em que o cassete de gene compreende um promotor, um transgene a/b não clorofila e uma região 3' não traduzida, em que o promotor consiste em SEQ ID NO:1 ligado de maneira funcional a uma primeira extremidade de um transgene, em que a segunda extremidade do transgene está ligada de maneira funcional a uma sequência 3' não traduzida que consiste em SEQ ID NO:6. [0012] Os métodos para o crescimento de plantas que expressam um transgene com o uso dos promotores a/b de clorofila de Zea mays, 5'URTs, íntrons e 3'URTs são revelados neste documento. Os métodos para a cultura de tecidos de planta e células que expressam um transgene com o uso dos promotores a/b de clorofila de Zea mays, 5'URTs, íntrons e 3'URTs também são revelados neste documento.
Em uma modalidade, os métodos conforme revelados neste documento incluem expressão de gene específica de tecido em caule de planta, tecidos de folha, sabugo, seda, núcleo, caule, casca e pólen. [0013] Em uma modalidade adicional, um método de intensificação da superexpressão de um gene de interesse contida no interior de um segundo cassete de expressão de gene é revelado neste documento. [0014] De acordo com uma modalidade, uma planta, o tecido de planta, ou célula de planta é fornecida de modo a compreender um promotor ligado de maneira funcional a um transgene a/b não clorofila, em que o promotor compreende SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:5. De acordo com uma modalidade, uma planta ou célula de planta é fornecida de modo a compreender SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:5, ou uma sequência que tem 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 ligada de maneira funcional a um transgene. Em uma modalidade, a planta e uma variedade de milho. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta é fornecida de modo a compreender um promotor ligado de maneira funcional a um transgene a/b não clorofila, em que o promotor consiste em SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:5. Em uma modalidade, uma planta ou célula de planta é fornecida de modo a compreender um cassete de gene, em que o cassete de gene compreende um promotor ligado de maneira funcional a um transgene, em que, adicionalmente, o promotor consiste em SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:5. Em uma modalidade adicional, o promotor é ligado de maneira funcional a uma primeira extremidade de um transgene, em que a segunda extremidade do transgene está ligada de maneira funcional a uma sequência 3' não traduzida que consiste em SEQ ID NO:6.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0015] A Figura 1 é um fluxograma esquemático que exibe o processo de identificação de genes de alta expressão em mais com o uso de uma abordagem de traçamento de perfil transcricional com Sequenciamento de Nova Geração (Next Generation Sequencing) (NGS). [0016] A Figura 2 mostra o mapa de plasmídeo de vetor pDAB114411 que representa um cassete de expressão de gene para a expressão de um gene-repórter de cry34Ab1 impulsionado pelo promotor de Zea mays de SEQ ID NO:1 e terminado pelo elemento regulatório de 3’ UTR de StPinlI. [0017] A Figura 3 mostra o mapa de plasmídeo de vetor pDAB116038 que representa um cassete de expressão de gene para a expressão de um gene-repórter de phiYFP impulsionado pelo promotor de Zea mays de SEQ ID NO:1 e terminado pela 3' UTR de Zea mays de elementos regulatórios de SEQ ID NO:4. [0018] A Figura 4 mostra um mapa de plasmídeo de vetor do vetor de controle de pDAB101556 que contém um gene-repórter de YFP ao invés do gene-repórter de cry34Ab1 presente no construto de promotor de teste, pDAB114411. A expressão de gene de YFP foi impulsionada pelo promotor de ubiquitina-1 de Zea mays (ZmUbil) e terminada pela 3' UTR de Per5 de Zea mays (ZmPer5). [0019] A Figura 5 mostra um mapa de plasmídeo de vetor de pDAB108746, um vetor de controle positivo que contém o gene- repórter de cry34Ab1 impulsionado pelo promotor de ZmUbil e terminado pela 3' UTR de StPinlI. [0020] A Figura 6 mostra um mapa de pDAB113121, um vetor de controle positivo. Tal plasmídeo contém um gene-repórter de phiYFP impulsionado pelo promotor de ZmUbil e terminado pelo 3’ UTR de StPinlI. O gene de phiYFP contém um íntron. O cassete de gene de aac/-1 é idêntico tanto em pDAB113121 quanto em pDAB116038.
DESCRIÇÃO DETALHADA
DEFINIÇÕES [0021] Ao descreve e reivindicar a invenção, a seguinte terminologia será usada de acordo com as definições estabelecidas abaixo. [0022] O termo "cerca de" conforme usado neste documento significa maior ou menor que o valor ou faixa de valores mencionados em 10 por cento, mas não se destina a designar qualquer valor ou faixa de valores a apenas tal definição mais ampla. Cada valor ou faixa de valores antecedida pelo termo "cerca de" também se destina a englobar a modalidade do valor absoluto ou faixa de valores mencionados. [0023] Conforme usado neste documento, o termo "retrocruzamento" se refere a um processo em que um criador cruza progênie híbrida de volta com um dos parentais, por exemplo, uma primeira geração F1 híbrida com um dos genótipos parentais da híbrida F1. [0024] Um "promotor" é uma região regulatória de DNA que pode ligar polimerase de RNA em uma célula e iniciar a transcrição de uma sequência de codificação a jusante (direção 3'). Um promotor pode conter sequências específicas que são reconhecidas pelos fatores de transcrição. Tais fatores podem se ligar a uma sequência de DNA promotor, que resulta no recrutamento de polimerase de RNA. Para os propósitos de definição da presente invenção, a sequência de promotor é ligada em sua terminação 3' pelo sítio de iniciação de transcrição (isto é, sítio de ligação de ribossomo) e se estende a montante (direção 5') para incluir a quantidade mínima de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição a níveis detectáveis acima de antecedente. No interior da sequência de promotor será encontrado um sítio de iniciação de transcrição (convenientemente definido, por exemplo, por meio de mapeamento com S1 de nuclease), assim como domínios de ligação de proteína (sequência consenso) responsável pela ligação de polimerase de RNA. O promotor pode ser operacionalmente associado a outras sequências de controle de expressão, inclusive sequências intensificadoras e repressoras. [0025] Para os propósitos da presente revelação, um "gene" inclui uma região de DNA que codifica um produto de gene (consulte abaixo), assim como todas as regiões de DNA que regulam a produção do produto de gene, se tais sequências regulatórias são ou não adjacentes às sequências de codificação e/ou transcritas.
Consequentemente, um gene inclui, mas não se limita necessariamente às sequências de promotor, terminadores, sequências regulatórias de tradução, tais como, sítios de ligação de ribossomo e sítios de entrada de ribossomo internos, intensificadores, silenciadores, isolantes, elementos de fronteira, origens de replicação, sítios de fixação de matriz e regiões de controle de loco. [0026] Conforme usado neste documento, os termos "nativo" ou "natural" definem uma condição encontrada na natureza. Uma "sequência de DNA nativa" é uma sequência de DNA presente na natureza que foi produzida por meios naturais ou técnicas de reprodução tradicionais, mas não geradas por elaboração genética (por exemplo, com o uso de biologia molecular/técnicas de transformação). [0027] Conforme usado neste documento um "transgene" é definido como uma sequência de ácido nucleico que codifica um produto de gene, incluindo, por exemplo, mas sem limitação, um mRNA. Em uma modalidade, o transgene é um ácido nucleico exógeno, em que a sequência de transgene foi introduzida em uma célula hospedeira por meio de elaboração genética (ou a progênie da mesma) em que o transgene não é encontrado normalmente. Em um exemplo, um transgene codifica um composto útil industrialmente ou farmaceuticamente, ou um gene que codifica um traço agrícola desejável (por exemplo, um gene resistente ao herbicida). Em, ainda, um outro exemplo, um transgene é uma sequência antissenso de ácido nucleico, em que a expressão da sequência antissenso de ácido nucleico inibe a expressão de uma sequência-aivo de ácido nucleico.
Em uma modalidade, o transgene é um ácido nucleico endógeno, em que as cópias genômicas adicionais do ácido nucleico endógeno são desejadas, ou um ácido nucleico que está na orientação antissenso em relação à sequência de um ácido nucleico-alvo em um organismo hospedeiro. [0028] Conforme usado neste documento o termo "transgene a/b não clorofila" é qualquer transgene que codifica uma proteína com menos de 90% de identidade de sequência com a proteína codificada pela sequência de codificação a/b de clorofila de Zea mays (SEQ ID NO:20). [0029] A "expressão de gene", conforme definida neste documento, é a conversão das informações contidas em um gene, para um produto de gene. [0030] Um "produto de gene" conforme definido neste documento, é qualquer produto produzido pelo gene. Por exemplo, o produto de gene pode ser o produto transcricional direto de um gene (por exemplo, mRNA, tRNA, rRNA, RNA pequeno, RNA antissenso, RNA de interferência, ribozima, RNA estrutural ou qualquer outro tipo de RNA) ou uma proteína produzida por meio de tradução de um mRNA.
Os produtos de gene incluem, também, os RNAs que são modificados por meio de processos, tais como, capeamento, poliadenilação, metilação e edição e as proteínas modificadas por, por exemplo, metilação, acetilação, fosforilação, ubiquitinação, ribossilação de ADP, miristilação e glicosilação. A expressão de gene pode ser influenciada por sinais externos, por exemplo, exposição de uma célula, tecido, ou organismo a um agente que aumenta ou diminui a expressão de gene. A expressão de um gene pode, também, ser regulada em qualquer lugar na trajetória do DNA para o RNA para a proteína. A regulação de expressão de gene ocorre, por exemplo, através de controles que atuam na transcrição, tradução, transporte e processamento de RNA, degradação de moléculas intermediárias, tais como o mRNA, ou através de ativação, inativação, compartimentaiização, ou degradação de moléculas de proteína específicas após as mesmas serem produzidas, ou por meio de combinações dos mesmos. A expressão de gene pode ser medida no nível de RNA ou no nível de proteína por meio de qualquer método conhecido na técnica, inclusive, sem limitação, Northern blot, RT-PCR, Western blot, ensaio ELISA, ou ensaio(s) de atividade de proteína in vitro, in situ, ou in vivo. [0031] Conforme usado neste documento, o termo "RNA pequeno" se refere a diversas classes de ácido ribonucleico não codificador (ncRNA). O termo RNA pequeno descreve as cadeias curtas de ncRNA produzido em células bacterianas, animais, plantas e fungos.
Tais cadeias curtas de ncRNA podem ser produzidas naturalmente no interior da célula ou pode ser produzida pela introdução de uma sequência exógena que expressa a cadeia curta ou ncRNA. As sequências de RNA pequeno não codificam diretamente para uma proteína e diferem em termos de função de outro RNA, no sentido de que as sequências de RNA pequeno são apenas transcritas e não traduzidas. As sequências de RNA pequeno são envolvidas em outras funções celulares, inclusive a expressão de gene e modificação. As moléculas de RNA pequeno são, normalmente, constituídas por 20 a 30 nucleotídeos. As sequências de RNA pequeno podem ser derivadas de precursores mais longos. Os precursores formam as estruturas que se dobram sobre si em regiões autocomplementares; os mesmos são, então, processados pelo Dicer de nuclease em animais, DCL1 em plantas, ou outras enzimas que processam a molécula de RNA pequeno. [0032] Diversos tipos de RNA pequeno existem tanto naturalmente quanto produzidos artificialmente, incluindo microRNAs (miRNAs), RNAs de interferência curtos (siRNAs), RNA antissenso, RN A em curva fechada curto (shRNA) e RNAs nucleolares pequenos (snoRNAs). Determinados tipos de RNA pequeno, tais como microRNA e siRNA, são importantes no silenciamento de gene e interferência de RNA (RNAi). O silenciamento de gene é um processo de regulação genética em que um gene que, normalmente, é expresso, é "desligado" por um elemento intracelular, nesse caso, o RNA pequeno. A proteína que, normalmente, é formada por tais informações genéticas não é formada devido à interferência e as informações codificadas no gene são bloqueadas da expressão. [0033] Conforme usado neste documento, o termo "RNA pequeno" engloba as moléculas de RNA descritas na literatura conforme "RNA minúsculo" (Storz, (2002) Science 296:1.260 a 1.263; lllangasekare et al., (1999) RNA 5:1.482 a 1.489); "RNA pequeno" procariótico (sRNA) (Wassarman et al., (1999) Trends Microbiol. 7:37 a 45); "RNA não codificador (ncRNA)" eucariótico; "micro-RNA (miRNA)"; "não mRNA pequeno (snmRNA)"; "RNA funcional (fRNA)"; "RNA de transferência (tRNA)"; "RNA catalítico" [por exemplo, ribozimas, inclusive as ribozimas de auto acilação (lllangaskare et al., (1999) RNA 5:1.482 a 1.489); "RNAs nucleolares pequenos (snoRNAs)"; "tmRNA" (também conhecido como "10S RNA", Muto et al., (1998) Trends Biochem Sei. 23:25 a 29; e Gillet et al., (2001) Mol Microbiol. 42:879 a 885); moléculas de RNAi incluindo, sem limitação "RNA de interferência pequeno (siRNA)", "siRNA preparado por endorribonuclease (e- siRNA)", "RNA em curva fechada curto (shRNA)" e "RNA temporariamente regulado pequeno (stRNA)"; "siRNA fragmentado (d- siRNA)", e aptâmeros, oligonucleotídeos e outros ácidos nucleicos sintéticos que compreendem, pelo menos, uma base de uracila. [0034] Conforme usado neste documento, o termo "íntron" é definido conforme qualquer sequência de ácido nucleico compreendida em um gene (ou sequência de nucleotídeo de interesse expressa) que é transcrita, mas não é traduzida. Os íntrons incluem a sequência de ácido nucleico não traduzida no interior de uma sequência de DNA expressa, assim como a sequência correspondente em moléculas de RNA transcritas da mesma. Um construto descrito neste documento também pode conter as sequências que intensificam a tradução e/ou estabilidade de mRNA, assim como os íntrons. Um exemplo de tal íntron é o primeiro íntron do gene II da variante de histona H3 de Arabidopsis thaliana ou qualquer outra sequência de íntrons comumente conhecida. Os íntrons podem ser usados em combinação com uma sequência de promotor para intensificar a tradução e/ou estabilidade de mRNA. [0035] Conforme usado neste documento, os termos "região 5' não traduzida" ou "5' UTR" são definidos como o segmento não traduzido na terminação 5' de pré-mRNAs ou mRNAs maduros. Por exemplo, em mRNAs maduros, uma 5' UTR, tipicamente, comporta e sua extremidade 5' um 'cap' 7-metilguanosina e está envolvida em diversos processos tais como emenda, poliadenilação, exportação de mRNA
em direção ao citoplasma, identificação da extremidade 5' do mRNA pelo maquinário de tradução e proteção de mRNAs contra a degradação. [0036] Conforme usado neste documento, os termos "terminador de transcrição" é definido conforme o segmento transcrito na terminação 3’ de pré-mRNAs ou mRNAs maduros. Por exemplo, os estiramentos mais longos de DNA além do sítio de "sinal de poliadenilação" são transcritos conforme um pré-mRNA. Tal sequência de DNA, em geral, contém um ou mais sinais de terminação de transcrição para o processamento adequado do pré-mRNA para que se torne mRNA maduro. [0037] Conforme usado neste documento, o termo "região 3' não traduzida" ou "3’ UTR" são definidos como o segmento não traduzido em uma terminação 3’ dos pré-mRNAs ou mRNAs maduros. Por exemplo, em mRNAs maduros, tal região comporta a cauda poli-(A) e sabe-se que a mesma tem diversas funções em estabilidade de mRNA, iniciação de tradução e exportação de mRNA. [0038] Conforme usado neste documento, o termo "sinal de poliadenilação" designa uma sequência de ácido nucleico presente em transcrições de mRNA que permite que as transcrições, quando estão na presença de uma polimerase de poli-(A), sejam poliadeniladas no sítio de poliadenilação, por exemplo, situadas 10 a 30 bases a jusante do sinal de poli-(A). Diversos sinais de poliadenilação são conhecidos na técnica e são úteis para a presente invenção. Uma sequência exemplifícadora inclui AAUAAA e variantes da mesma, conforme descrito Loke J., etal., (2005) Plant Physiology 138(3); 1.457 a 1.468. [0039] O termo "isolado" conforme usado neste documento significa ter sido removido de seu ambiente natural, ou removido de outros compostos presentes quando o composto é inicialmente formado. O termo "isolado" abrange materiais isolados de fontes naturais, assim como os materiais (por exemplo, ácidos nucleicos e proteínas) recuperados após a preparação por meio de expressão recombinante em uma célula hospedeira, ou compostos quimicamente sintetizados, tais como as moléculas de ácido nucleico, as proteínas e os peptídeos. [0040] O termo "purificado", conforme usado neste documento se refere a uma molécula ou composto sob uma forma que, substancialmente isenta de contaminantes, normalmente associada à molécula ou composto em um ambiente nativo ou natural, ou substancialmente enriquecida em concentração relativa a outros compostos presentes quando o composto é inicialmente formado e significa ter a pureza aumentada como um resultado de ter sido separado de outros componentes da composição original. O termo "ácido nucleico purificado" é usado neste documento para descrever uma sequência de ácido nucleico que foi separada, produzida independente, ou purificada longe de outros compostos biológicos que incluem, mas não se limitam a polipeptídeos, lipídeos e carboidratos, enquanto realizam uma mudança química ou funcional no componente (por exemplo, um ácido nucleico pode ser purificado de um cromossomo por meio da remoção de contaminantes de proteína e rompimento de ligações químicas que conectam o ácido nucleico ao DNA restante no cromossomo). [0041] Conforme usado neste documento, os termos "Silenciamento de Gene à Base de Homologia" ou "HBGS" são termos genéricos que incluem tanto o silenciamento transcricional de gene quanto o silenciamento pós-transcricional de gene. O silenciamento de um loco-alvo por um loco de silenciamento não ligado pode resultar da inibição de transcrição (Transcriptional Gene silenciamento; TGS) ou degradação de mRNA (Silenciamento de Gene Pós-Transcricional (Post-Transcriptional Gene Silencing); PTGS), devido à produção de RNA de filamento duplo (dsRNA) que corresponde às sequências de promotor ou transcritas, respectivamente. O envolvimento de componentes celulares distintos em cada processo sugere que o TGS e PTGS induzidos pelo dsRNA, provavelmente, resultam da diversificação de um mecanismo comum antigo. Entretanto, uma comparação rigorosa de TGS e PTGS foi difícil de alcançar devido ao fato de que a mesma, em geral, depende da análise de locos de silenciamento distintos. Um único loco de transgene pode ser descrito para acionar tanto o TGS quanto o PTGS, devido à produção de dsRNA que corresponde às sequências de promotor e transcritas de diferentes genes-alvo. [0042] Conforme usado neste documento, os termos "molécula de ácido nucleico", "ácido nucleico", ou "polinucleotídeo" (todos os três termos são sinônimos entre si) se referem a uma forma polimérica de nucleotídeo, que pode incluir tanto filamentos senso quanto filamentos antissenso de RNA, cDNA, DNA genômico e formas sintéticas e polímeros misturados dos mesmos. "Um nucleotídeo" pode se referir a um ribonucleotídeo, desoxiribonucleotídeo ou uma forma modificada de qualquer um dos dois tipos de nucleotídeo. Uma molécula de ácido nucleico normalmente tem, pelo menos 10 bases de comprimento, exceto quando especificado de outro modo. Os termos podem ser referir a uma molécula de RNA ou DNA de comprimento intermediário.
Os termos incluem formas de DNA de filamento único e filamento duplo. Uma molécula de ácido nucleico pode incluir tanto um quanto o outro ou ambos o nucleotídeo de ocorrência natural e o nucleotídeo modificado ligados um ao outro por ligações de ocorrência natural e/ou ligações de nucleotídeo de ocorrência não natural. [0043] As moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas quimicamente ou bioquimicamente, ou podem conter bases de nucleotídeo derivadas ou não naturais, conforme ficará prontamente evidente aos elementos versados na técnica. Tais modificações incluem, por exemplo, identificadores, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeo de ocorrência natural com modificações internucleotídeos análogas (por exemplo, ligações não carregadas: por exemplo, fosfatos de metila, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.; ligações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.; porções pendentes: por exemplo, peptídeos; intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc.; queladores; alquiladores; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). O termo "molécula de ácido nucleico" também inclui qualquer conformação topológica, incluindo conformações de filamento único, de filamento duplo, parcialmente duplexada, triplexada, em curva fechada, circular e travada. [0044] A transcrição segue de uma forma de 5’ a 3’ ao longo de um filamento de DNA. Isso significa que o RNA é formado por adição sequencial de trifosfatos de 5' de ribonucleotídeo à terminação 3’ da cadeia crescente (com uma eliminação de requisito do priofosfato).
Tanto em uma molécula de ácido nucleico linear quanto circular, os elementos distintos (por exemplo, sequências de nucleotídeo específicas) podem ser referidos como "a montante" em relação a um elemento adicional se os mesmos estiverem ligados ou devessem estar ligados ao mesmo ácido nucleico na direção 5’ de tal elemento.
De modo similar, os elementos distintos podem estar "a jusante" em relação a um elemento adicional se os mesmos estiverem ou devessem estar ligados ao mesmo ácido nucleico na direção 3' de tal elemento. [0045] Conforme usado neste documento, o termo "posição de base" se refere ao local de uma determinada base ou resíduo de nucleotídeo no interior de um ácido nucleico designado. Um ácido nucleico designado pode ser definido por meio de alinhamento com um ácido nucleico de referência. [0046] Conforme usado neste documento, o termo "hibridização" se refere a um processo em que os oligonucleotídeos e seus análogos se hibridizam, por meio de ligação de hidrogênio, o que inclui ligações de hidrogênio de Watson-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen reversa entre bases complementares. Em geral, as moléculas de ácido nucleico consistem em bases nitrogenadas que são tanto pirimidinas (citosina (C), uracila (U) e timina (T)) quanto purinas (adenina (A) e guanina (G)). Tais bases nitrogenadas formam ligações de hidrogênio entre uma pirimidina e uma purina e a ligação de uma pirimidina com uma purina é chamada de "acoplamento de base." Mais especificamente, A irá se ligar por hidrogênio a T ou U e G irá se ligar a C. O termo "complementar" se refere ao acoplamento de base que ocorre entre duas sequências de ácido nucleico distintas ou duas regiões distintas da mesma sequência de ácido nucleico. [0047] Conforme usado neste documento, os termos "especificamente passível de hibridização" e "especificamente complementar" se referem a um grau suficiente de complementaridade de modo que a ligação estável e específica ocorre entre um oligonucleotídeo e o alvo de DNA ou RNA. Os oligonucleotídeos não precisam ser 100% complementares a sua sequência-alvo para se hibridizarem especificamente. Um oligonucleotídeo é específicamente passível de hibridização quando a ligação do oligonucleotídeo à molécula-alvo de DNA ou RNA interfere com a função normal do DNA- alvo ou RNA-alvo e há um grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica de um oligonucleotídeo às sequências não alvo sob as condições em que a ligação específica é desejada, por exemplo, sob condições psicológicas no caso de ensaios ou sistemas in vivo. Tal ligação é chamada de hibridização específica. As condições de hibridização que resultam em determinados graus de severidade irão variar dependendo da natureza do método de hibridização escolhido e da composição e comprimento das sequências de ácido nucleico de hibridização. Em geral, a temperatura de hibridização e a força iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou Mg2+) de um tampão de hibridização irá contribui para a severidade de hibridização, embora a quantidade de lavagens também influencie a severidade. Os cálculos em relação às condições de hibridização necessárias para se obter determinados graus de severidade são discutidos em Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2o edição, volume 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, capítulos 9 e 11. [0048] Conforme usado neste documento, o termo "condições restritivas" engloba as condições sob as quais a hibridização ocorrerá apenas se houver menos do que 50% de incompatibilidade entre a molécula de hibridização e o alvo de DNA. As "condições restritivas" incluem determinados níveis adicionais de severidade. Dessa forma, conforme usado neste documento, as condições de "severidade moderada" são aquelas sob as quais as moléculas com mais de 50% de incompatibilidade de sequência não se hibridizam; as condições de "severidade alta" são aquelas sob as quais as sequências com mais de 20% de incompatibilidade não se hibridizam e as condições de "severidade muito alta" são aquelas sob as quais as sequências com mais de 10% de incompatibilidade não hibridizam. Em modalidades específicas, as condições restritivas podem incluir a hibridização a 65 Ό, seguida por lavagens a 65 Ό com 0,1x SSC/0,1% de SDS durante 40 minutos. A seguir estão condições de hibridização não-limitadoras e representativas: Severidade Muito Alta: Hibridização em 5x de tampão SSC a 65 O durante 16 horas; lavar duas vezes em 2x de tampão de SSC à temperatura ambiente durante 15 minutos, cada; e lavar duas vezes em 0,5x tampão de SSC a 65 Ό durante 20 minutos, c ada.
Severidade Alta: Hibridização em 5 a 6 x de tampão de SSC a 65 a 70 Ό durante 16 a 20 horas; lavar duas vezes em 2 x d e tampão de SSC à temperatura ambiente durante 5 a 20 minutos, cada; e lavar duas vezes em 1x de tampão de SSC a 55 a 70 O durante 3 0 minutos, cada.
Severidade Moderada: Hibridização em 6x tampão de SSC à temperatura ambiente a 55 Ό durante 16 a 20 horas; lavar, pelo menos, duas vezes em 2x a 3x de tampão de SSC à temperatura ambiente a 55 Ό durante 20 a 30 minutos, cada. [0049] Em uma modalidade, as moléculas de ácido nucleico especificamente passíveis de hibridização podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de severidade muito alta. Em uma modalidade, as moléculas de ácido nucleico especificamente passíveis de hibridização podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de severidade alta. Em uma modalidade, moléculas de ácido nucleico especificamente passíveis de hibridização podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de severidade moderada. [0050] Conforme usado neste documento, o termo "oligonucleotídeo" se refere a um polímero de ácido nucleico curto. Os oligonucleotídeos podem ser formados por meio de divagem de segmentos de ácido nucleico mais longos, ou por meio de polimerização de precursores de nucleotídeo individuais. Os sintetizadores automatizados permitem a síntese de oligonucleotídeos até várias centenas de pares de base de comprimento. Devido ao fato de que os oligonucleotídeos podem se ligar a uma sequência de nucleotídeo complementar, as mesmas podem ser usadas como sondas para a detecção de DNA ou RNA. Os oligonucleotídeos compostos de DNA (oligodesoxirribonucleotídeos) podem ser usados em PCR, um conjunto de técnicas para a amplificação de sequências pequenas de DNA. Em PCR, um oligonucleotídeo é, tipicamente, chamado de um "iniciador", o que permite que uma polimerase de DNA estenda p oligonucleotídeo e replique o filamento complementar. [0051] Conforme usado neste documento, os termos "Reação em Cadeia de Polimerase" ou "PCR" se referem a um procedimento ou conjunto de técnicas em que quantidades diminutas de ácido nucleico, RNA e/ou DNA são amplificadas conforme descrito no documento de Patente n° U.S. 4.683.195. Em geral, as informações de sequência das extremidades da região de interesse ou além devem estar disponíveis de modo que os iniciadores de oligonucleotídeo possam ser moldados; tais iniciadores serão idênticos ou similares em termos de sequência aos filamentos opostos do molde a ser amplificado. O nucleotídeo do terminal 5' dos dois iniciadores pode coincidir com as extremidades do material amplificado. A PCR pode ser usada para amplificar as sequências de RNA específicas, as sequências específicas de DNA do DNA genômico total e o cDNA transcrito a partir do RNA celular total, sequências de bacteriófago ou plasmídeo, etc. Consulte, em geral, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 (1987);
Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). [0052] Conforme usado neste documento, o termo "iniciador" se refere a um oligonucleotídeo que pode atuar com um ponto de iniciação de síntese ao longo de um filamento complementar quando as condições são adequadas para a síntese de um produto de iniciação de iniciador. As condições de sintetização incluem a presença de quatro trifosfatos de desoxiribonucleotídeo diferentes e, pelo menos, um agente de indução à polimerização, tal como transcriptase reversa ou polimerase de DNA. Os mesmos estão presentes em um tampão adequado, que pode incluir os constituintes que são cofatores ou que afetam as condições, tais como o pH e similares, a diversas temperaturas adequadas. Um iniciador é, preferenciaimente, uma sequência de filamento único, de modo que a eficiência de amplificação seja otimizada, porém, as sequências de filamento duplo podem ser utilizadas. [0053] Conforme usado neste documento, o termo "sonda" se refere a um oligonucleotídeo que se hibridiza a uma sequência-alvo.
No procedimento de ensaio de estilo TaqMan® ou TaqMan®, a sonda se hibridiza a uma porção do alvo situado entre o sítio de recozimento dos dois iniciadores. Uma sonda inclui cerca de oito nucleotídeos, cerca de dez nucleotídeos, cerca de quinze nucleotídeos, cerca de vinte nucleotídeos, cerca de trinta nucleotídeos, cerca de quarenta nucleotídeos, ou cerca de cinquenta nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma sonda inclui de cerca de oito nucleotídeos a cerca de quinze nucleotídeos. Uma sonda pode incluir adicionalmente um identificador detectável, por exemplo, um fluoróforo (Texas-Red®, Isotiocianato de fluoresceína (Fluorescein isothiocyanate), etc.,). O identificador detectável pode ser fixado de modo covalente diretamente ao oligonucleotídeo de sonda, por exemplo, situado na extremidade 5' da sonda ou na extremidade 3' da sonda. Uma sonda que inclui um fluoróforo pode, também, incluir adicionalmente um supressor, por exemplo, Black Hole Quencher™, lowa Black™, etc. [0054] Conforme usado neste documento, os termos "identidade de sequência" ou "identidade" podem ser usados de modo intercambiável e se referem aos resíduos de ácido nucleico ou sequências de aminoácidos em duas sequências que são iguais ao serem alinhadas para uma correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação especificada. [0055] Conforme usado neste documento, o termo "porcentagem de identidade de sequência" se refere a um valor determinado comparando-se duas sequências alinhadas de modo ideal (por exemplo, sequências de ácido nucleico ou sequências de aminoácidos) ao longo de uma janela de comparação, em que a porção de uma sequência na janela de comparação pode compreender as adições ou deleções (identificadores, vãos) em comparação a uma sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para um alinhamento ideal das duas sequências.
Uma porcentagem é calculada determinando-se a quantidade de posições em que ocorre um resíduo de ácido nucleico ou de aminoácido idênticos em ambas as sequências para render a quantidade de posições correspondentes, dividindo-se a quantidade de posições correspondentes pela quantidade total de posições na janela de comparação e multiplicando-se o resultado por 100 para render a porcentagem de identidade de sequência. Os métodos para alinhar as sequências para a comparação são bem conhecidos. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos em, por exemplo: Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482;
Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 85:2444; Higgins e Sharp (1988) Gene 73:237 a 244; Higgins e Sharp (1989) CABIOS 5:151 a 153;
Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10.881 a 10.890; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155 a 165; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307 a 331; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol.
Lett. 174:247 a 250. [0056] A Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básica (Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul et al. (1990) J.
Mol. Biol. 215:403 a 410) do Centro Nacional para Informações de Biotecnologia (National Center for Biotechnology Information (NCBI)) está disponível junto diversas fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD) e na internet, par ao uso em relação a diversos programas de análise de sequência. Uma descrição de como determinar a identidade de sequência com o uso de tal programa está disponível na internet mediante a seção "help" (ajuda) para BLAST™. Para comparações de sequências de ácido nucleico, a função de "Blast 2 sequências" (sequências de Blast 2) do programa BLAST™ (Blastn) pode ser empregada com o uso dos parâmetros predefinidos. As sequências de ácido nucléico com similaridades ainda maiores com às sequências de referência, irão mostrar uma identidade de porcentagem crescente ao serem avaliadas por meio de tal método. [0057] Conforme usado neste documento, o termo "ligado de maneira funcional" se refere aos dois componentes que foram colocados em uma relação funcional entre si. O termo, "ligado de maneira funcional", quando usado em referência a uma sequência regulatória e uma sequência de codificação, significa que a sequência regulatória afeta a expressão da sequência de codificação ligada. As "sequências regulatórias", "elementos regulatórios", ou "elementos de controle", se referem às sequências de ácido nucleico que influenciam a temporização e nível/quantidade de transcrição, processamento ou estabilidade de RNA, ou tradução da sequência de codificação associada. As sequências regulatórias podem incluir os promotores; as sequências líderes de tradução; regiões 5' e 3' não traduzidas, íntrons; intensificadores; sequências de enlace de caule; sequências de ligação de repressor; sequências de terminação; sequências de reconhecimento de poliadenilação; etc. As sequências regulatórias específicas podem estar situadas a montante e/ou a jusante de uma sequência de codificação ligada de maneira funcional à mesma. Além disso, as sequências regulatórias específicas ligadas de maneira funcional a uma sequência de codificação podem estar situadas no filamento complementar associado de uma molécula de ácido nucleico de filamento duplo. A ligação pode ser alcançada por meio de ligadura em sítio de restrição convenientes. Se tais sítios não existem, os adaptadores ou ligantes de oligonucleotídeo sintético são usados de acordo com a prática convencional. Entretanto, os elementos não precisam ser contíguos para serem ligados de maneira funcional. [0058] Conforme usado neste documento, o termo "transformação" engloba todos os conjuntos de técnicas pelos quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em tal célula. Os exemplos incluem, mas não se limitam a: transfecção com vetores virais; transformação com vetores de plasmídeo; eletroporação; lipofecção; microinjeção (Mueller et al. (1978) Cell 15:579 a 585); transferência mediada por Agrobacterium; captação de DNA direta; transformação mediada por WHISKERS®; e bombardeamento com micro projéteis. A transformação pode ser estável, em que a molécula de ácido nucleico é integrada com o genoma da planta, e é subsequentemente passado de geração para geração. Comparativamente, a transformação pode ser transitória, em que a molécula de ácido nucleico está situada no interior do citoplasma ou núcleo da célula e não é integrada ao genoma da planta. Tal transformante transitório pode resultar em tal expressão de proteína ou um produto de gene das sequências de codificação presentes na molécula de ácido nucleico. [0059] Conforme usado neste documento, o termo "realizar a transdução" se refere a um processo em que um vírus transfere o ácido nucleico para o interior de uma célula. [0060] Os termos "poliligante" ou "sítio de clonagem múltipla" conforme usado neste documento define uma aglomeração de um ou mais sítios de enzima de restrição do Tipo 2. Os sítios de restrição adjacentes podem ser incluídos em um poliligante e estão, tipicamente, situados no interior de 10 nucleotídeos um do outro em uma sequência de ácido nucleico. Os construtos que compreendem um poliligante são utilizados para a inserção e/ou remoção de sequências de ácido nucleico tais como a região de codificação de um gene, uma sequência de ligação de ribossomo, um íntron, ou uma 5' UTR. [0061] Conforme usado neste documento, os termos "endonucleases de restrição" e "enzimas de restrição" se referem a enzimas bacterianas, cada uma das quais sorta DNA de filamento duplo em uma sequência de nucleotídeo específica ou próxima à mesma. As enzimas de restrição de Tipo 2 reconhecem e clivam o DNA no mesmo sítio e incluem, mas não se limitam a Xbal, BamHI, Hindlll, EcoRI, Xhol, SalI, Kpnl, Aval, Pstl e Smal. [0062] O termo "vetor" é usado de maneira intercambiável com os termos "construto", "vetor de clonagem" e "vetor de expressão" e significa o veículo pelo qual uma sequência de DNA ou RNA (por exemplo, um gene estranho) pode ser introduzida no interior de uma célula hospedeira, de tal modo que transforme a hospedeira e promova a expressão (por exemplo, transcrição e tradução) da sequência introduzida. Um "vetor não viral" é destinado a significar qualquer vetor que não compreenda um vírus ou retrovírus. Em algumas modalidades um "vetor " é uma sequência de DNA que compreende, pelo menos, uma origem de replicação de DNA e, pelo menos, um gene marcador selecionável. Os exemplos incluem, mas não se limitam a um plasmídeo, cosmídeo, bacteriófago, cromossomo artificial bacteriano (BAC), ou vírus que transporta o DNA exógeno para o interior de uma célula. Um vetor pode, também, incluir um ou mais genes, moléculas antissenso e/ou genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica.
Um vetor pode realizar a transdução, transformar, ou infectar uma célula, portanto, fazendo com que a célula expresse as moléculas de ácido nucleico e/ou proteínas codificadas pelo vetor. O termo "plasmídeo" define um filamento circular de ácido nucleico que pode realizar a replicação autossômica tanto em uma célula hospedeira procariótica quanto eucariótica. O termo inclui o ácido nucleico que pode ser tanto DNA quanto RNA e pode ser de filamento único ou duplo. O plasmídeo da definição pode, ainda, incluir as sequências que correspondem a uma origem bacteriana de replicação. [0063] O termo "gene marcador selecionável" conforme usado neste documento define um gene ou outro cassete de expressão que codifica uma proteína que facilita a identificação de células no interior das quais o gene marcador selecionável é inserido. Por exemplo, um "gene marcador selecionável" engloba os genes-repórteres assim como genes usados em transformação de planta para, por exemplo, proteger as células de planta de um agente seletivo ou fornecer resistência/tolerância a um agente seletivo. Em uma modalidade, apenas as células ou plantas que recebem um marcador selecionável funcional podem se dividir ou crescer sob as condições de terem um agente seletivo. Os exemplos de agentes seletivos podem incluir, por exemplo, antibióticos, incluindo espectinomicina, neomicina, canamicina, paromomicina, gentamicina e higromicina. Tais marcadores selecionáveis incluem a fosfotransferase de neomicina (npt II), que expressa uma enzima que atribui resistência à canamicina de antibiótico e genes para a neomicina, paromomicina, gentamicina e G418 de antibióticos relacionados, ou o gene para fosfotransferase de higromicina (hpt), que expressa uma enzima que atribui resistência à higromicina. Os outros genes marcadores selecionáveis podem incluir os genes que codificam a resistência ao herbicida incluindo bar ou pat (resistência contra amônio de glufosinato ou fosfinotricina), sintase de acetolactato (ALS, resistência contra inibidores, tais como, sulfonilureias (SUs), imidazolinonas (IMIs), triazolopirimidinas (TPs), oxibenzoatos de pirimidinila (POBs) e triazolinonas de sulfonilamino de carbonila que evitam a primeira etapa da síntese dos aminoácidos de cadeia ramificada), glifosfato, 2,4-D e resistência ou sensibilidade ao metal. Os exemplos de "genes-repórteres" que podem ser usados como um gene marcador selecionável incluem a observação visual de proteínas de gene-repórter expresso, tais como as proteínas que codificam β-glicuronidase (GUS), luciferase, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente amarela (YFP), DsRed, β- galactosidase, acetiltransferase de cloranfenicol (CAT), fofatase alcalina e similares. A frase "positivo de marcador" se refere às plantas que foram transformadas para incluir um gene marcador selecionável. [0064] Conforme usado neste documento, o termo "marcador detectável" se refere a um identificador que pode detectar, tal como, por exemplo, um radioisótopo, composto fluorescente, composto bioluminescente, um composto quimiluminescente, quelador de metal, ou enzima. Os exemplos de marcadores detectáveis incluem, mas não se limitam aos seguintes: identificadores fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos lantanídeos), identificadores enzimáticos (por exemplo, peroxidase de raiz forte, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), quimiluminescente, grupos biotinila, epítopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de par de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, etiquetas de epítopo). Em uma modalidade, um marcador detectável pode ser fixado por braços espaçadores de diversos comprimentos para reduzir o potencial de bloqueio estérico. [0065] Conforme usado neste documento, o termo "detecção" é usado no sentido mais amplo para incluir as medições qualitativas e quantitativas de uma molécula específica, por exemplo, medições de um polipeptídeo específico. [0066] Conforme usado neste documento, os termos "cassete", "cassete de expressão" e "cassete de expressão de gene" se referem a um segmento de DNA que pode ser inserido em um ácido nucleico ou poiinucleotídeo em sítios de restrição específicos ou por meio de recombinação homóloga. Um segmento de DNA compreende um poiinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse e os sítios de restrição e cassete são moldados para garantir a inserção do cassete no quadro de leitura adequado para transcrição e tradução.
Em uma modalidade, um cassete de expressão pode incluir um poiinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse e que tem elementos além do poiinucleotídeo que facilita a transformação de uma célula hospedeira específica. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene pode, ainda, incluir os elementos que permitem uma expressão intensificada de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse em uma célula hospedeira. Tais elementos podem incluir, mas não se limitam a: um promotor, um promotor mínimo, um intensificador, um elemento de resposta, uma sequência terminadora, uma sequência de poliadenilação e similares. [0067] Conforme usado neste documento um "ligante" ou "espaçador" é uma ligação, molécula ou grupo de moléculas que liga duas entidades separadas, uma à outra. Os ligantes e espaçadores podem proporcionar o espaçamento ideal de duas entidades ou pode fornecer adicionalmente uma ligação suscetível que permite que as duas entidades sejam separadas uma da outra. As ligações suscetíveis incluem os grupos fotocliváveis, porções suscetíveis ao ácido, porções suscetíveis à base e grupos cliváveis por enzima. [0068] Conforme usado neste documento, o termo "controle" se refere a uma amostra usada em um procedimento analítico para propósitos de comparação. Um controle pode ser "positivo" ou "negativo". Por exemplo, se o propósito de um procedimento analítico é detectar uma transcrição ou polipeptídeo expressos diferentemente em células ou tecido, é, em geral, preferencial incluir um controle positivo, tal como uma amostra de uma planta conhecida que exibe a expressão desejada e um controle negativo, tal como uma amostra de uma planta conhecida desprovida da expressão desejada. [0069] Conforme usado neste documento, o termo "planta" inclui uma planta inteira e qualquer descendente, célula, tecido, ou parte de uma planta. Uma classe de planta que pode ser usada na presente invenção é, em geral, tão ampla quanto a classe de plantas superiores e inferiores receptivas à mutagênese, incluindo as angiospermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas), gimnospermas, samambaias e algas multicelulares. Dessa forma, "planta" inclui plantas dicotiledôneas (dicot) e monocotiledôneas (monocot). O termo "partes de planta" incluem qualquer(quaisquer) parte(s) de uma planta, incluindo, por exemplo, e sem limitação: a semente (incluindo semente madura e semente imatura); um corte de planta; uma célula de planta; uma célula de cultura de planta; um órgão de planta (por exemplo, pólen, embriões, flores, frutas, brotos, folhas, raízes, caules e explantes). Um tecido de planta ou órgão de planta pode ser uma semente, protoplasto, calo, ou qualquer outro grupo de células de planta que seja organizado em uma unidade estrutural ou funcional.
Uma cultura de célula de planta ou tecido pode ter a capacidade de regenerar uma planta que tem as características fisiológicas ou morfológicas da planta da qual a célula ou tecido foi obtida e de regenerar uma planta que tem, substancialmente, o mesmo genótipo da planta. Por outro lado, algumas células de planta não têm a capacidade de serem regeneradas para produzir as plantas. As células regeneráveis em uma célula de planta ou cultura de tecido pode ser embriões, protoplastos, células meristemáticas, calo, pólen, folhas, anteras, raízes, pontas de raiz, seda, flores, núcleos, espigas, sabugos, cascas, ou colmos. [0070] As partes de planta incluem partes passíveis de colheita e partes úteis para a propagação de plantas de progênie. As partes de planta úteis para a propagação incluem, por exemplo e sem limitação: a semente; fruta; um corte; uma plântula; um bulbo; e um porta- enxerto. Uma parte passível de colheita de uma planta pode ser qualquer parte útil de uma planta, incluindo, por exemplo e sem limitação: flor; pólen; plântula; bulbo; folha; caule; fruta; semente; e raiz. [0071] Uma célula de planta é a unidade fisiológica e estrutural da planta, que compreende um protoplasto e uma parede de célula. Uma célula de planta pode estar sob a forma de uma célula única isolada, ou um agregado de células (por exemplo, um calo friável e uma célula cultivada) e pode ser parte de uma unidade de organização superior (por exemplo, um tecido de planta, órgão de planta e planta). Dessa forma, uma célula de planta pode ser um protoplasto, uma célula de produção de gameta, ou uma célula ou coleção de células que podem se regenerar para se tornarem uma planta inteira. De tal modo, uma semente, que compreende múltiplas células de planta e tem a capacidade de se regenerar para que se torne uma planta inteira, é considerada uma "célula de planta" em modalidades neste documento. [0072] O termo "protoplasto", conforme usado neste documento, se refere a uma célula de planta que teve sua parede de célula completa ou parcialmente removida, com a membrana de bicamada de lipídeo da mesma descoberta e, assim, inclui protoplastos, que têm sua parede de célula completamente removidas e esferoplastos, que têm sua parede de célula apenas parcialmente removida, mas não se limita ao mesmo. Tipicamente, um protoplasto é uma célula de planta isolada, sem as paredes de célula, que tem a potência para a regeneração para se tornar uma cultura de célula ou uma planta inteira. [0073] Exceto quando explicado especificamente de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que é comumente entendido pelos elementos de habilidade comum na técnica aos quais a presente revelação pertence.
As definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas, por exemplo, em: Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0- 632-02182-9); e Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1- 56081-569-8).
MODALIDADES [0074] Conforme revelado neste documento, os construtos de recombinação inovadores são fornecidos para a expressão de um transgene a/b não clorofila com o uso das sequências regulatórias de um gene a/b de clorofila de Zea mays. Tais construtos podem ser usados para transformar células, inclusive as células de planta, para produzir organismos completos que expressam o produto de gene de transgene em suas células. [0075] Os promotores de planta usados para pesquisa básica ou aplicação biotecnológica são, em geral, unidirecionais, que direcionam apenas um gene que foi fundido em sua extremidade 3' (a jusante).
Frequentemente é necessário introduzir múltiplos genes em plantas para elaboração metabólica e empilhamento de traços e, portanto, múltiplos promotores são tipicamente necessários em mudas transgênicas para impulsionar a expressão de múltiplos genes. [0076] O desenvolvimento de produtos transgênicos tem se tornado crescente mente complexo, o que exige o empilhamento de múltiplos transgenes em um loco único. Tradicionalmente, cada transgene, normalmente precisa de um promotor para a expressão em que múltiplos promotores são necessários para expressar os transgenes diferentes em uma pilha de gene. Isso leva, frequentemente, ao uso repetitivo do mesmo promotor em uma pilha de transgene para se obter os níveis similares de padrões de expressão de transgenes diferentes para a expressão de um traço poligênico único. Os construtos de múltiplos genes impulsionados pelo mesmo promotor são conhecidos por causar o silenciamento de gene que resulta em produtos transgênicos menos eficientes no campo. O excesso de sítios de ligação de fator de transcrição (TF) devido à repetição de promotor pode causar a depleção de TFs endógenos, o que leva à inativação transcricional. O silenciamento de transgenes, provavelmente, irá afetar de forma indesejável o desempenho de uma planta transgênica produzida para expressar os transgenes. As sequências repetitivas em um transgene podem levar à recombinação homóloga de intraloco de gene que resulta em redisposições de polinucleotídeo. [0077] Ademais, os promotores específicos quanto a tecido (isto é, preferenciais de tecido) ou específicos quanto a órgão impulsionam a expressão de gene em um determinado tecido, tal como no núcleo, raiz, folha ou tapetum da planta. Os promotores de tecido e de estágio de desenvolvimento derivam a expressão de genes, que são expressos em tecidos específicos ou em períodos de tempo específicos durante o desenvolvimento de planta. Os promotores específicos quanto a tecido são necessários para determinadas aplicações na indústria de plantas transgênicas e são desejáveis devido ao fato de que permitem a expressão específica de genes heterólogos de uma maneira seletiva de tecido e/ou estágio de desenvolvimento, indicando a expressão do gene heterólogo de modo diferente em vários órgãos, tecidos e/ou momentos, mas não em outros. Por exemplo, a resistência aumentada de uma planta contra a infecção por patógenos do solo pode ser alcançada transformando-se o genoma de planta com um gene de resistência ao patógeno, de modo que a proteína de resistência ao patógeno é fortemente expressa nas raízes da planta. Alternativamente, pode ser desejável expressar um transgene em tecidos de planta que estão em uma determinada fase de crescimento ou desenvolvimento, tal como, por exemplo, divisão de célula ou alongamento de célula. Uma outra aplicação é a desejabilidade de usar os promotores específicos quanto a tecido, por exemplo, de modo que confinem a expressão dos transgenes codificando um traço agronômico em xilema em desenvolvimento. Um problema específico que permanece na identificação de promotores específicos quanto a tecido é como identificar os genes potencialmente mais importantes e seus promotores correspondentes e como relacionar os mesmos às propriedades de desenvolvimento da célula. Um outro problema é clonar todos os elementos de controle de transcrição de atuação de cis relevantes, de modo que o fragmento de DNA clonado impulsione a transcrição no padrão de expressão específico desejado. Um problema específico é identificar os promotores específicos quanto a tecido, relacionados a tipos de célula específicos, estágios de desenvolvimento e/ou funções na planta que não são expressos em outros tecidos de planta. [0078] É desejável usar os promotores diversificados para a expressão de transgenes diferentes em uma pilha de gene. Em uma modalidade, os elementos regulatórios obtidos a partir da espécie de planta Zea mays podem impulsionar a transcrição de múltiplas unidades de transcrição, inclusive sequências de RNA de enlace de curva fechada, miRNA artificial, RNAi e transgenes. Como uma modalidade adicional, um promotor a/b de clorofila pode ser obtido a partir de Zea mays para impulsionar a transcrição de múltiplas unidades de transcrição, inclusive sequências de RNA de enlace de curva fechada, miRNA artificial, RNAi e transgene. Em ainda outra modalidade, um promotor a/b de clorofila pode ser obtido a partir de Zea mays para impulsionar a transcrição de múltiplas unidades de transcrição, incluindo sequências de RNA de enlace de curva fechada, miRNA artificial, RNAi e transgene em tecidos de folha, sabugo, seda, núcleo, caule, casca e pólen de uma planta. [0079] São fornecidos os métodos e construtos com o uso dos elementos regulatórios de gene isolados de Zea mays para expressar os transgenes em planta. Em uma modalidade, um promotor de Zea mays pode ser um promotor isolado de SEQ ID NO:1. [0080] Em uma modalidade, um vetor de ácido nucleico (isto é, construto) é fornecido de modo a compreender um promotor. Em uma modalidade, um promotor pode ser um promotor de gene de Zea mays. Em uma modalidade, um vetor de ácido nucleico é fornecido de modo a compreender um promotor, em que o promotor é, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntico à SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, um vetor de ácido nucleico compreende um promotor de gene de Zea mays que está ligado de maneira funcional a um poliligante. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene é fornecido de modo a compreender um promotor de Zea mays que está ligado de maneira funcional a um transgene a/b não clorofila. Em uma modalidade, o promotor consiste em SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão de gene compreende um promotor de Zea mays que está ligado de maneira funcional a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. [0081] Além de um promotor, uma região de gene 3' não traduzida (identificadores, 3’UTR) ou terminador é necessária para a terminação de transcrição e poliadenilação do mRNA. Uma terminação de transcrição e poliadenilação de mRNA adequadas são importantes para a expressão estável de transgene. A terminação de transcrição se torna mais crucial para que as pilhas de múltiplos genes evitem a leitura através de transcrição até o próximo transgene. De modo similar, o RNA aberrante não non-poliadenilado (aRNA) é um substrato para que as polimerases de RNA dependentes de RNA de planta (RdRPs) convertam um aRNA para um RNA de filamento duplo (dsRNA) levando à pequena produção de RNA e silenciamento de transgene. Os terminadores de transcrição fortes, portanto, são muitos úteis tanto para pilhas de gene único quanto para pilhas de múltiplos genes. Embora um promotor seja necessário para impulsionar a transcrição, uma região de gene de 3’ UTR pode terminar a transcrição e iniciar a poliadenilação de uma transcrição de mRNA resultante para a tradução e síntese de proteína. Uma região de gene de 3’ UTR auxilia na expressão estável de um transgene. [0082] De acordo com uma modalidade, um construto de ácido nucleico é fornecido de modo a compreender um terminador de transcrição de Zea mays. Em uma modalidade, o terminador de transcrição de Zea mays é fornecido de modo a compreender um terminador de transcrição, em que o terminador de transcrição é, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntico à SEQ ID NO:6. Em uma modalidade, um construto de ácido nucleico é fornecido de modo a compreender um terminador de transcrição de Zea mays que está ligado de maneira funcional a um poliligante. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene é fornecido de modo a compreender um terminador de transcrição de Zea mays que está ligado de maneira funcional à extremidade 3' de um transgene a/b não clorofila. Em uma modalidade, o terminador de transcrição consiste em SEQ ID NO:6.
Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão de gene compreende um terminador de transcrição de Zea mays que está ligado de maneira funcional a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, em transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de marcador selecionável, ou combinações dos mesmos.
Em uma modalidade, um vetor de ácido nucleico é fornecido de modo a compreender um terminador de transcrição ligado de maneira funcional tanto a uma sequência de poliligante quanto um transgene a/b não clorofila ou uma combinação de ambos, em que o terminador de transcrição compreende SEQ ID NO:6 ou uma sequência que tem 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6. Em uma modalidade, o terminador de transcrição tem menos que 1 kb de comprimento e em uma modalidade adicional, o terminador de transcrição consiste na sequência 3’ UTR de SEQ ID NO:6. [0083] Em uma modalidade, um construto de ácido nucleico é fornecido de modo a compreender um promotor de Zea mays conforme descrito neste documento e uma 3’ UTR. Em uma modalidade, o construto de ácido nucleico compreende uma 3’ UTR de Zea mays. Em uma modalidade, a 3’ UTR de Zea mays é uma 3’ UTR de Zea mays. Em uma modalidade, uma 3’ UTR pode ser a 3’ UTR de Zea mays de SEQ ID NO:6. [0084] Em uma modalidade, um construto de ácido nucleico é fornecido de modo a compreender um promotor de Zea mays conforme descrito neste documento e uma 3’ UTR, em que a 3’ UTR é, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO:6. Em uma modalidade, um construto de ácido nucleico é fornecido de modo a compreender um promotor de Zea mays conforme descrito neste documento e a 3’ UTR em que o promotor de Zea mays e a 3' UTR são ambos ligados de maneira funcional às extremidades opostas de um poliligante. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene é fornecido de modo a compreender um promotor de Zea mays conforme descrito neste documento e um 3’ UTR, em que o promotor de Zea mays e a 3' UTR são ambos ligados de maneira funcional às extremidades opostas de um transgene a/b não clorofila. Em uma modalidade, a 3’ UTR, consiste em SEQ ID NO:6. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene é fornecido de modo a compreender um promotor de Zea mays conforme descrito neste documento e uma 3’ UTR, em que o promotor de Zea mays compreende a SEQ ID NO:1 e a 3' UTR compreende a SEQ ID NO:6, em que o promotor e a 3' UTR estão ligados de maneira funcional às extremidades opostas de um transgene a/b não clorofila. Em uma modalidade, a 3’ UTR, consiste em SEQ ID NO:6. Em uma modalidade, o promotor consiste em SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:5 e a 3’ UTR consiste em SEQ ID NO:6. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão de gene compreende uma 3’ UTR de Zea mays que está ligada de maneira funcional a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade adicional, o transgene está ligado de maneira funcional a um promotor de Zea mays e uma 3’ UTR do mesmo gene isolado de Zea mays. [0085] Em uma modalidade, um vetor é fornecido de modo a compreender um primeiro transgene e/ou poliligante e um segundo transgene e/ou poliligante, em que o primeiro transgene e/ou poliligante está ligado de maneira funcional a um promotor que compreende uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:5 e ligado de maneira funcional a uma 3’ UTR, que compreende uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO:6. [0086] A expressão de transgene pode, também, ser regulada por uma região de íntron situada a jusante da sequência de promotor.
Tanto um promotor quanto um íntron podem regular a expressão de transgene. Embora um promotor seja necessário para impulsionar a transcrição, a presença de um íntron pode aumentar os níveis de expressão, o que resulta em transcrição de mRNA para tradução e síntese de proteína. Uma região de gene de íntron auxilia a expressão estável de um transgene. [0087] Em uma modalidade, um construto de ácido nucleico é fornecido de modo a compreender um promotor de Zea mays conforme descrito neste documento e um íntron. Em uma modalidade, o íntron está ligado de maneira funcional à extremidade 3' do promotor. Em uma modalidade, um construto de ácido nucleico é fornecido de modo a compreender um íntron de Zea mays ligado de maneira funcional à extremidade 3' de um promotor de Zea mays ou um derivado de tal sequência de promotor. Em uma modalidade, o íntron de Zea mays é um íntron a/b de clorofila de Zea mays, ou um derivado de tal sequência de íntron. [0088] Em uma modalidade, um íntron pode ser o íntron a/b de clorofila de Zea mays de SEQ ID NO:2. Em uma outra modalidade, um íntron pode ser o íntron a/b de clorofila de Zea mays de SEQ ID NO:3.
Em uma modalidade, um construto de ácido nucleico é fornecido de modo a compreender um promotor de Zea mays conforme descrito neste documento e um íntron, em que o íntron é, pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntico à SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3. Em uma modalidade, um construto de ácido nucleico é fornecido de modo a compreender um promotor de Zea mays conforme descrito neste documento, uma sequência de íntron e um poliligante em que o promotor e o íntron estão ligados de maneira funcional a um poliligante. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene é fornecido de modo a compreender um promotor de Zea mays conforme descrito neste documento, uma sequência de íntron e um transgene a/b não clorofila, em que o promotor e o íntron estão ligados de maneira funcional à extremidade 5' do transgene. Opcionalmente, o construto compreende adicionalmente uma 3’ UTR que está ligada de maneira funcional à extremidade 3' do transgene a/b não clorofila ou poliligante. Em uma modalidade, o promotor e as sequências 3’ UTR são selecionadas dentre os descritos neste documento e a sequência de íntron consiste em SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende um íntron de Zea mays que está ligado de maneira funcional a um promotor, em que o promotor é um promotor de Zea mays da SEQ ID NO:1, ou um promotor oriundo de uma planta (por exemplo, promotor de ubiquitina 1 de Zea mays), um vírus (por exemplo, promotor de vírus de mosaico de veia de Cassava) ou bactérias (por exemplo, Agrobacterium tumefaciens delta mas). Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão de gene compreende um íntron de Zea mays que está ligado de maneira funcional a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. [0089] A expressão de transgene pode, também, ser regulada por uma região 5' UTR situada a jusante da sequência de promotor. Tanto um promotor quanto uma 5' UTR podem regular a expressão de transgene. Embora um promotor seja necessário para impulsionar a transcrição, a presença de uma 5' UTR pode aumentar os níveis de expressão que resultam na transcrição de mRNA para tradução e síntese de proteína. Uma região de gene de 5’ UTR auxilia na expressão estável de um transgene. [0090] Em uma modalidade, um construto de ácido nucleico é fornecido de modo a compreender um promotor de Zea mays conforme descrito neste documento e uma 5’ UTR. Em uma modalidade, a 5' UTR está ligada de maneira funcional à extremidade 3' do promotor. Em uma modalidade, um construto de ácido nucleico é fornecido de modo a compreender uma 5' UTR de Zea mays ligada de maneira funcional à extremidade 3' de um promotor a/b de clorofila isolado de Panicum Zea mays ou um derivado de tal sequência de promotor. Em uma modalidade adicional, a extremidade 3' da 5' UTR está ligada de maneira funcional à extremidade 5' de um íntron de Zea mays, conforme descrito neste documento. [0091] Em uma modalidade, uma 5’ UTR pode ser a 5’ UTR de Zea mays de SEQ ID NO:4. Em uma modalidade, um construto de ácido nucleico é fornecido de modo a compreender um promotor de Zea mays conforme revelado neste documento e uma 5' UTR, em que a 5' UTR é, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO:4. Em uma modalidade, um construto de ácido nucleico é fornecido de modo a compreender um promotor de Zea mays, em que o promotor é, pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntico à SEQ ID NO:4 e uma 5' UTR ligada de maneira funcional a um poliligante.
Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene é fornecido de modo a compreender um promotor de Zea mays, em que o promotor é, pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntico à SEQ ID NO:4 e sequências 5' UTR ligadas de maneira funcional a um transgene a/b não clorofila. Opcionalmente, o construto pode compreende adicionalmente um íntron de Zea mays, conforme revelado neste documento, ligado de maneira funcional à extremidade 3' da 5' UTR e a extremidade 5' do transgene a/b não clorofila e, opcionalmente, que compreende adicionalmente uma 3’ UTR que está ligada de maneira funcional à extremidade 3' do transgene a/b não clorofila. Em uma modalidade, o promotor, íntron e as sequências 3’ UTR são selecionados dentre os descritos neste documento e a sequência 5' UTR consiste em SEQ ID NO:4. Em uma modalidade, a 3' UTR consiste em SEQ ID NO:6. [0092] Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende uma 5’ UTR de Zea mays que está ligada de maneira funcional a um promotor, em que o promotor é um promotor de Zea mays de SEQ ID NO:1, ou um promotor oriundo de uma planta (por exemplo, promotor de ubiquitina 1 de Zea mays), um vírus (por exemplo, promotor de vírus de mosaico de veia de Cassava) ou bactérias (por exemplo, Agrobacterium tumefaciens delta mas). Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão de gene compreende uma 5’ UTR de Zea mays que está ligada de maneira funcional a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. [0093] Em uma modalidade, um construto de ácido nucleico é fornecido de modo a compreender um promotor e um poliligante e, opcionalmente, um ou mais dentre os seguintes elementos: a) uma região 5' não traduzida; b) um íntron; e c) uma região 3' não traduzida, em que, o promotor consiste em SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem 98% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1; a região 5' não traduzida consiste em SEQ ID NO:4 ou uma sequência que tem 98% de identidade de sequência com SEQ ID NO:4; o íntron consiste em SEQ ID NO:2, ou SEQ ID NO:3 ou uma sequência que tem 98% de identidade de sequência com SEQ ID NO:2, ou SEQ ID NO:3; a região 3' não traduzida consiste em SEQ ID NO:6 ou uma sequência que tem 98% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6; adicionalmente, em que o dito promotor está ligado de maneira funcional ao dito poliligante e cada elemento opcional, quando presente, também está ligado de maneira funcional tanto ao promotor quanto ao poliligante. [0094] Em uma modalidade, um construto de ácido nucleíco é fornecido de modo a compreender um promotor e um transgene a/b não clorofila e, opcionalmente, um ou mais dos seguintes elementos: a) uma região 5' não traduzida; b) um íntron; e c) uma região 3' não traduzida, em que, o promotor consiste em SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem 98% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1; a região 5' não traduzida consiste em SEQ ID NO:4 ou uma sequência que tem 98% de identidade de sequência com SEQ ID NO:4; o íntron consiste em SEQ ID NO:2, ou SEQ ID NO:3 ou uma sequência que tem 98% de identidade de sequência com SEQ ID NO:2, ou SEQ ID NO:3; a região 3' não traduzida consiste em SEQ ID NO:6, ou uma sequência que tem 98% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6; adicionalmente, em que o dito promotor está ligado de maneira funcional ao dito transgene e cada elemento opcional, quando presente, também está ligado de maneira funcional tanto ao promotor quanto ao transgene. Em uma modalidade adicional uma célula transgênica é fornecida de modo a compreender o construto de ácido nucleico revelado imediatamente acima. Em uma modalidade, a célula transgênica é uma célula de planta e em uma modalidade adicional, uma planta é fornecida em que a planta compreende as ditas células transgênicas. [0095] De acordo com uma modalidade, a expressão de transgene é regulada por um promotor ligado de maneira funcional a um íntron e a região 5' UTR, em que o íntron e a região 5' UTR estão situados a jusante da sequência de promotor. Um promotor ligado de maneira funcional a um íntron e à região 5' UTR pode ser usado para impulsionar a expressão de transgene. Embora um promotor seja necessário para impulsionar a transcrição, a presença do íntron e a 5' UTR pode aumentar os níveis de expressão, resultando em transcrição de mRNA para tradução e síntese de proteína. [0096] Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende um promotor ligado de maneira funcional a uma 5' UTR e uma região de íntron. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende um promotor de Zea mays ligado de maneira funcional a uma 5’ UTR de Zea mays e um íntron de Zea mays. Em uma modalidade, o promotor de Zea mays ligado de maneira funcional a uma 5' UTR e uma região de íntron está ligado de maneira funcional a um íntron e à 5' UTR. [0097] Em uma modalidade, um promotor ligado de maneira funcional a uma 5' UTR e um íntron pode ser o promotor de Zea mays ligado de maneira funcional a um íntron e à 5' UTR. Em uma modalidade, o promotor compreende ou consiste na sequência de SEQ ID NO:5. Em uma modalidade, um construto de ácido nucleico é fornecido de modo a compreender um promotor ligado de maneira funcional a um íntron e uma 5' UTR. Em uma modalidade, o construto compreende, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:5. Em uma modalidade, um construto de ácido nucleico é fornecido de modo a compreender uma sequência de promotor de Zea mays que compreende ou que consiste em uma sequência, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO:5 ligada de maneira funcional a um poliligante. Opcionalmente, o construto pode compreender adicionalmente a 3’ UTR que está ligada de maneira funcional à extremidade 3' do poliligante. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene é fornecido de modo a compreender uma sequência de promotor de Zea mays, em que a sequência de promotor compreende ou consiste em uma sequência, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO:5 ligada de maneira funcional a um transgene a/b não clorofila. Opcionalmente, o construto pode compreender adicionalmente a 3’ UTR que está ligada de maneira funcional à extremidade 3' do transgene a/b não clorofila.
Em uma modalidade, a sequência 3’ UTR consiste em SEQ ID NO:6.
Em uma modalidade ilustrativa, o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade, o transgene é um gene de resistência ao herbicida. Em uma modalidade, um vetor é fornecido de modo a compreender 1,2, 3 ou 4 sequências de promotor independentemente selecionadas dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:5. [0098] Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende um promotor de Zea mays, uma 5’ UTR de Zea mays, um íntron de Zea mays e uma 3’ UTR de Zea mays. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende: a) um promotor, em que o promotor é, pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntico à SEQ ID NO:1; b) uma 3’ UTR, em que a 3’ UTR é, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO:6; c) uma 5’ UTR, em que a 5’ UTR é, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO:4; ou, d) um íntron, em que o íntron é, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntico à SEQ ID NO:2, ou SEQ ID NO:3. [0099] Por exemplo, um cassete de expressão de gene pode incluir um promotor, um íntron ou uma 5’ UTR, em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO:1, o íntron é um polinucleotídeo de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 e a 5’ UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO:4. Ademais, um cassete de expressão de gene pode incluir um promotor, um íntron, uma 5’ UTR ou uma 3’ UTR, em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO:1, o íntron é um polinucleotídeo de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3, a 5’ UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO:4 e a 3’ UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO:6. Além disso, um cassete de expressão de gene pode incluir tanto um promotor quanto uma 3’ UTR, em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO:1 e uma 3’ UTR de SEQ ID NO:6 [00100] Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende um promotor de Zea mays, 5’ UTR de Zea mays e uma 3’ UTR de Zea mays que estão ligados de maneira funcional a um transgene a/b não clorofila. [00101] Um promotor, um íntron, uma 5’ UTR e 3’ UTR podem estar ligados de maneira funcional aos transgenes diferentes no interior de um cassete de expressão de gene quando um cassete de expressão de gene inclui um ou mais transgenes. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão de gene compreende um promotor de Zea mays que está ligado de maneira funcional a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão de gene compreende um promotor de Zea mays, um íntron de Zea mays e uma 5’ UTR de Zea mays que estão ligados de maneira funcional a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão de gene compreende uma 3’ UTR de Zea mays que está ligada de maneira funcional a um transgene, em que o transgene codifica para um produto de gene que intensifica a resistência ao inseticida, a tolerância ao herbicida, a eficiência de uso de nitrogênio, eficiência de uso de água, qualidade nutricional ou combinações dos mesmos. [00102] Um íntron de Zea mays e uma 5’ UTR podem estar ligados de maneira funcional a promotores diferentes no interior de um cassete de expressão de gene. Em uma modalidade ilustrativa, os promotores são oriundos de uma planta (por exemplo, promotor de ubiquitina 1 de Zea mays), um vírus (por exemplo, promotor de vírus de mosaico de veia de Cassava) ou bactérias (por exemplo, Agrobacterium tumefaciens delta mas). Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão de gene compreende um promotor de Zea mays que está ligado de maneira funcional a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. [00103] Em uma modalidade, um vetor compreende um cassete de expressão de gene conforme revelado neste documento. Em uma modalidade, um vetor pode ser um plasmídeo, um cosmídeo, um cromossomo artificial bacteriano (BAC), um bacteriófago, um vírus, ou um fragmento de polinucleotídeo excisado para o uso em transformação direta ou alvejamento de gene, tal como um DNA doador. [00104] De acordo com uma modalidade, um vetor de ácido nucleico é fornecido de modo a compreender um cassete de gene recombinante, em que o cassete de gene recombinante compreende um promotor de Zea mays de SEQ ID NO:1 ligado de maneira funcional a uma sequência de poliligante, um transgene a/b não clorofila ou combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o cassete de gene recombinante compreende um promotor de Zea mays de SEQ ID NO:1 ligado de maneira funcional a um transgene a/b não clorofila.
Em uma modalidade, o cassete de gene recombinante compreende um promotor de Zea mays de SEQ ID NO:1, conforme revelado neste documento, ligado de maneira funcional a uma sequência de poliligante. O poliligante é ligado de maneira funcional ao promotor de Zea mays de SEQ ID NO:1 de tal maneira que a inserção de uma sequência de codificação para um dentre os sítios de restrição do poliligante ligue, de maneira funcional, a sequência de codificação de modo a permitir a expressão da sequência de codificação quando o vetor é transfectado para o interior de uma célula hospedeira. [00105] De acordo com uma modalidade, o promotor de Zea mays compreende a SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 35. De acordo com uma modalidade, a sequência de promotor tem um comprimento total de não mais que 1,5, 2, 2,5, 3 ou 4 kb. De acordo com uma modalidade, o promotor de Zea mays consiste em SEQ ID NO: 1 ou cerca de uma sequência de 379 bp que tem 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1. [00106] De acordo com uma modalidade, um vetor de ácido nucleico é fornecido de modo a compreender um cassete de gene que consiste em SEQ ID NO:1, um transgene a/b não clorofila e uma 3' UTR, em que SEQ ID NO:1 está ligada de maneira funcional à extremidade 5' do transgene a/b não clorofila e a 3' UTR está ligada de maneira funcional à extremidade 3' do transgene a/b não clorofila. Em uma modalidade adicional, a sequência 3' não traduzida compreende SEQ ID NO:6 ou uma sequência que tem 90, 95, 99 ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6. Em uma modalidade adicional, a sequência 3' não traduzida consiste em SEQ ID NO:6, ou cerca de uma sequência de 295 bp que tem 90, 95, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6. [00107] De acordo com uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente uma sequência que codifica um marcador selecionável. De acordo com uma modalidade, o cassete de gene recombinante está ligado de maneira funcional a uma borda de T-DNA de Agrobacterium. De acordo com uma modalidade, o cassete de gene recombinante compreende adicionalmente uma primeira e segunda bordas de T-DNA, em que a primeira borda de T-DNA está ligada de maneira funcional a uma extremidade do construto de gene e a dita segunda borda de T-DNA está ligada de maneira funcional à outra extremidade do construto de gene. A primeira e segunda bordas de T-DNA de Agrobacterium podem ser selecionadas independentemente das sequências de borda de T-DNA que são oriundas de filamentos bacterianos selecionados dentre o grupo que consiste em uma borda de T-DNA de Agrobacterium que sintetiza nopalina, uma borda de T-DNA de Agrobacterium que sintetiza octopina, uma borda de T-DNA de Agrobacterium que sintetiza succinamopina, ou qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade, uma estirpe de Agrobacterium selecionada dentre o grupo que consiste em uma estirpe que sintetiza nopalina, uma estirpe que sintetiza manopina, uma estirpe que sintetiza succinamopina, ou uma estirpe que sintetiza octopina é fornecida, em que a dita estirpe compreende um plasmídeo, em que o plasmídeo compreende um transgene ligado de maneira funcional a uma sequência selecionada dentre SEQ ID NO:6 ou uma sequência que tem 90, 95, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6. [00108] Os transgenes de interesse e adequados para o uso nos presentes construtos revelados incluem, mas não se limitam às sequências de codificação que atribuem (1) resistência às pestes ou doença, (2) resistência aos herbicidas e (3) traços adicionados de valor conforme revelado no documento WO2013116700 (DGT-28), US20110107455 (DSM-2), Patente de n22: U.S. 8.283.522 (AAD-12); 7.838.733 (AAD-1); 5.188.960; 5.691.308; 6.096.708; e 6.573.240 (Cry1 F); As Patentes de n22: U.S. 6.114.138; 5.710.020; e 6.251.656 (Cry1 Ac); As Patentes de n22: U.S. 6.127.180; 6.624.145 e 6.340.593 (Cry34Ab1); As Patentes de n22: U.S. 6.083.499; 6.548.291 e 6.340.593 (Cry35Ab1), as revelações que estão incorporadas neste documento. De acordo com uma modalidade, o transgene codifica um marcador selecionável ou um produto de gene que atribui resistência ao inseticida, tolerância ao herbicida, eficiência de uso de nitrogênio, eficiência de uso de água, ou qualidade nutricional. [00109] Em uma modalidade, uma célula ou planta é fornecida de modo a compreender um cassete de expressão de gene conforme revelado neste documento. Em uma modalidade, uma célula ou planta compreende um vetor que compreende um cassete de expressão de gene conforme revelado neste documento. Em uma modalidade, um vetor pode ser um plasmídeo, um cosmídeo, um cromossomo artificial bacteriano (BAC), um bacteriófago, ou um vírus. Portanto, uma célula ou planta que compreende um cassete de expressão de gene conforme revelado neste documento é uma célula transgênica ou planta transgênica, respectivamente. Em uma modalidade, uma planta transgênica pode ser uma planta monocotiledônea. Em uma modalidade, uma planta monocotiledônea transgênica pode ser, mas não se limita a mais, trigo, arroz, sorgo, aveia, canteio, bananas, cana de açúcar, e painço. Em uma modalidade, uma planta transgênica pode ser uma planta dicotiledônea. Em uma modalidade, uma planta dicotiledônea transgênica pode ser, mas não se limita a grão de soja, algodão, girassol e canola. Uma modalidade inclui, ainda, uma semente transgênica de uma planta transgênica conforme revelada neste documento. [00110] Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene inclui dois ou mais transgenes. Os dois ou mais transgenes podem não estar ligados de maneira funcional a um promotor, íntron, ou 5' UTR ou 3’ UTR conforme revelado neste documento. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene inclui um ou mais transgenes. Em uma modalidade, com um ou mais transgenes, pelo menos um transgene está ligado de maneira funcional a um promotor, íntron, 5' UTR, ou 3’ UTR ou a matéria da revelação.
Marcadores Selecionáveis; [00111] Vários marcadores selecionáveis também descritos como genes-repórteres podem ser incorporados em um vetor de expressão escolhido para permitir a identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). Diversos métodos estão disponíveis para confirmar a expressão de marcadores selecionáveis em plantas transformadas, incluindo, por exemplo, sequenciamento de DNA e PCR (reação em cadeia de polimerase), Southern blotting, Northern blotting, métodos imunológicos para a detecção de uma proteína expressa a partir do vetor, por exemplo, proteína precipitada que realiza a mediação de resistência à fosfinotricina, ou observação visual de outras proteínas, tais como genes-repórteres que codificam β- glicuronidase (GUS), luciferase, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente vermelha (RFP), β-galactosidase, fofatase alcalina e similares (Consulte Sambrook, et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira edição, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001, cujo conteúdo está incorporado integralmente neste documento, a título de referência). [00112] Os genes de marcador selecionável são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Os genes de marcador selecionável incluem os genes que codificam a resistência ao antibiótico, tais como os que codificam a fosfotransferase de neomicina II (NEO) e fosfotransferase de higromicina (HPT), assim como os genes que atribuem resistência aos compostos herbicidas.
Os genes de resistência ao herbicida, em geral, codificam para uma proteína de alvo modificado, insensível ao herbicida ou para uma enzima que degenera ou desintoxica o herbicida na planta antes que o mesmo possa atuar. Por exemplo, a resistência ao glifosfato foi obtida pode meio do uso de genes que codificam para enzimas de alvo mutante, sintase (EPSPS) ou DGT-28. Os genes e mutantes para EPSPS são bem conhecidos e descritos adicionalmente abaixo. As resistências ao amônio de glufosinato, bromoxinila e 2,4- diclorofenoxiacetato (2,4-D) foram obtidas por meio do uso de genes bacterianos que codificam um gene pat ou DSM-2, um nitrilase, um aací-1 ou um aacf-12, que desintoxica os respectivos herbicidas. [00113] Em uma modalidade, os herbicidas podem inibir o ponto de crescimento ou meristema, inclusive imidazolinona ou sulfonilureia e os genes para resistência/tolerância de sintase de ácido acetohidróxi (AHAS) e sintase de acetolactato (ALS) para tais herbicidas são bem conhecidos. Os genes de resistência de glifosato incluem os genes mutante sintase (EPSPs) e dgt-28 (através da introdução de ácidos nucleicos recombinantes e/ou várias formas de mutagênese in vivo de genes EPSPs nativos), genes aroA e genes de glifosfato acetil transferase (GAT), respectivamente). Os genes de resistência para outros compostos fosfonos incluem genes bar da espécie Streptomyces, incluindo Streptomyces hygroscopicus e Streptomyces viridichromogenes e ácidos propirônicos fenóxi ou piridinóxi e ciclohexonas (genes de codificação de inibidor de ACCase). Os genes exemplificadores que atribuem resistência às ciclohexanodionas e/ou ácido ariloxifenoxipropanoico (incluindo Haloxyfop, Diclofop, Fenoxyprop, Fluazifop, Quizalofop) incluem os genes de acetil coenzima A carboxilase (ACCase)—Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1-S3. Em uma modalidade, os herbicidas podem inibir a fotossíntese, inclusive a triazina (genes psbA e 1s+) ou benzonitrila (gene nitrilase). [00114] Em uma modalidade, os genes marcadores selecionáveis incluem, mas não se limitam aos genes que codificam: fosfotransferase de neomicina II; hidratase de cianamida; cinase de aspartato; dihidrodipicolinato sintase; triptofano decarboxilase; dihidrodipicolinato sintase e cinase de aspartato dessensibilizada; gene bar; triptofano decarboxilase; fosfotransferase de neomicina (NEO); fosfotransferase de higromicina (HPT ou HYG); diidrofolato redutase (DHFR); fosfinotricina acetiltransferase; dehalogenase de ácido 2,2-dicloropropanóico; sintase de ácido acetohidróxi; 5- enolpiruvilshiquimato-fosfato sintase (aroA); haloarilnitrilase; acetil- coenzima A carboxilase; diidropteroato sintase (sul I); e polipeptídeo de fotossistema II de 32 kD (psbA). [00115] Uma modalidade também inclui os genes que codificam a resistência a: cloranfenicol; metotrexato; higromicina; espectinomicina; bromoxinila; glifosfato; e fosfinotricina. [00116] A lista acima de genes marcadores selecionáveis não se destina a ser limitadora. Qualquer repórter ou gene marcador selecionável são englobados pela presente invenção. [00117] Os genes de marcador selecionável são sintetizados para a expressão ideal em uma planta. Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência de codificação de um gene foi modificada por otimização de códon para intensificar a expressão em plantas. Um gene marcador selecionável pode ser otimizado para a expressão em uma espécie de planta específica ou, alternativamente, pode ser modificado para expressão ideal em plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas. Os códons preferenciais de planta podem ser determinados a partir dos códons de frequência mais alta nas proteínas expressas na maior quantidade na espécie de planta específica de interesse. Em uma modalidade, um gene marcador selecionável é projetado para ser expresso em plantas a um nível superior, resultando em uma eficiência de transformação superior. Os métodos para otimização de planta de genes são bem conhecidos. A
orientação a respeito da otimização e produção de sequências de DNA sintéticas pode ser encontrada, por exemplo, nos documentos WO2013016546, WO2011146524, WO1997013402, Patente n° U.S. 6166302, e Patente n° U.S. 5380831, incorporados neste documento, a título de referência.
Transformação; [00118] Os métodos adequados para transformação de plantas incluem qualquer método pelo qual o DNA pode ser introduzido em uma célula, por exemplo e sem limitação: A eletroporação (consulte, por exemplo, Patente n° U.S. 5.384.253); bombardeamento com microprojéteis (consulte, por exemplo, as Patentes de n° U.S. 5.015.580, 5.550.318, 5.538.880, 6.160.208, 6.399.861 e 6.403865); transformação mediada por Agrobacterium (consulte, por exemplo, Patentes n° U.S. 5.635.055, 5.824.877, 5.591.616; 5.981.840 e 6.384.301); e transformação de protoplasto (consulte, por exemplo, Patente n° U.S. 5.508.184). Tais métodos podem ser usados para transformar de modo estável ou transformar de modo transitório uma planta. [00119] Um construto de DNA pode ser introduzido diretamente no interior do DNA genômico da célula de planta com o uso de conjuntos de técnicas tais como a agitação com fibras de carboneto de silício (Consulte, por exemplo, as Patentes n° U.S. 5.302.523 e 5.464.765), ou os construtos de DNA podem ser introduzidos diretamente no tecido de planta com o uso de métodos biolísticos, tais como bombardeamento com partícula de DNA (consulte, por exemplo, Klein et al. (1987) Nature 327:70 a 73). Alternativamente, o construto de DNA pode ser introduzido na célula de planta através de transformação de nanopartícula (consulte, por exemplo, a Publicação de Patente n° U.S. 20090104700, que está incorporado integralmente neste documento, a título de referência). [00120] Além disso, a transferência de gene pode ser alcançada com o uso bactérias ou vírus não Agrobacterium, tais como Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizoboium meliloti, Mesorhizobium loti, vírus X de batata (potato vírus X), vírus de mosaico couve-flor e vírus de mosaico de veia de cassava e/ou vírus de mosaico de tabaco, Consulte, por exemplo, Chung et al. (2006) Trends Plant Sei. 11(1):1 a 4. [00121] Ao longo da aplicação de técnicas de transformação, as células de, virtualmente, quaisquer espécies de planta podem ser transformadas de modo estável e tais células podem ser desenvolvidas para que se tornem plantas transgênicas pode meio de conjuntos de técnicas bem conhecidas. Por exemplo, os conjuntos de técnicas que podem ser particularmente úteis no contexto de transformação de algodão estão descritos nas Patentes n° U.S. 5.846.797, 5.159.135, 5.004.863 e 6.624.344; os conjuntos de técnicas para transformar as plantas Brassica em particular, estão descritos, por exemplo, na Patente n° U.S. 5.750.871; os conjuntos de técnicas para transformar grão de soja estão descritos, por exemplo, na Patente n° U.S. 6.384.301; e os conjuntos de técnicas para transformar mais estão descritos, por exemplo, nas Patentes n° U.S. 7.060.876 e 5.591.616 e na Publicação de PCT Internacional WO 95/06722. [00122] Após efetuar a distribuição de um ácido nucleico exógeno para uma célula receptora, uma célula transformada é, em geral, identificada para a cultura adiciona e regeneração de planta. Para aprimorar a habilidade de identificar os transformantes, pode-se desejar empregar um gene marcador selecionável com o vetor de transformação usado para gerar o transformante. Em uma modalidade ilustrativa, uma população de célula transformada pode ser avaliada expondo-se as células a um agente ou agentes seletivos, ou as células podem ser submetidas à triagem para o traço de gene marcador desejado. [00123] As células que sobrevivem à exposição a um agente seletivo, ou as células que foram pontuadas positivas em um ensaio de triagem, podem ser cultivadas em meios que sustentam a regeneração de plantas. Em uma modalidade, quaisquer meios de cultura de tecido de planta adequados podem ser modificados incluindo-se substâncias adicionais, tais como, reguladores de crescimento. O tecido pode ser mantido em um meio básico com reguladores de crescimento até que tecido suficiente esteja disponível para iniciar os esforços de regeneração de planta, ou após os ciclos repetidos de seleção manual, até que a morfologia do tecido esteja adequada para a regeneração (por exemplo, pelo menos 2 semanas), então, transferido para o meio de condução para a formação de brotos. As culturas são transferidas periodicamente até que uma formação de brotos suficiente tenha ocorrido. Uma vez que os brotos são formados, os mesmos são transferidos para o meio de condução para a formação de raiz. Uma vez que raízes suficientes são formadas, as plantas podem ser transferidas para o solo para crescimento e maturidade adicionais. [00124] Para confirmar a presença de um ácido nucleico desejado que compreende os construtos fornecidos na regeneração de plantas, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios podem incluir: ensaios biológicos moleculares, tais como Southern e northern blotting e PCR; ensaios bioquímicos, tais como detecção da presença de um produto de proteína, por exemplo, por meios imunológicos (ELISA, western blots e/ou espectrofotometria (de massa) LC-MS MS) ou por meio de função enzimática; ensaios de parte de planta, tais como ensaios de folha ou raiz; e/ou análise do fenótipo da planta inteira regenerada. [00125] Os eventos transgênicos podem ser submetidos à triagem, por exemplo, por meio de amplificação de PCR com o uso, por exemplo, de iniciadores de oligonucleotídeo específicos para as moléculas de ácido nucleico de interesse. Entende-se que a genotipagem de PCR inclui, mas não se limita à amplificação de DNA genômico de reação em cadeia de polimerase (PCR) derivada de tecido de calo de planta hospedeira isolado previsto para conter uma molécula de ácido nucleico de interesse integrada no genoma, seguido pela clonagem padrão e análise de sequência de amplificação de produtos de PCR. Os métodos de genotipagem de PCR foram bem descritos (consulte, por exemplo, Rios et al. (2002) Plant J. 32:243-53), e podem ser aplicados ao DNA genômico derivado de quaisquer espécies de planta ou tipo de tecido, incluindo culturas de célula. As combinações de iniciadores de oligonucleotídeo que se ligam tanto à sequência-alvo quanto à sequência introduzida podem ser usadas sequencialmente ou multiplexadas em reações de amplificação de PCR. Os iniciadores de oligonucleotídeo moldados para se temperar ao sítio-alvo, introduziram sequências de ácido nucleico e/ou combinações dos dois podem ser produzidas. Dessa forma, as estratégias de genotipagem de PCR podem incluir, por exemplo e sem limitação: a amplificação de sequências específicas no genoma de planta; amplificação de múltiplas sequências específicas no genoma de planta; amplificação de sequências não específicas no genoma de planta; e combinações de qualquer um dos supracitados. Um elemento versado na técnica pode conceber combinações adicionais de iniciadores e reações de amplificação para interrogar o genoma. Por exemplo, um conjunto de iniciadores diretos e reversos de oligonucleotídeo pode ser moldado para se temperar à sequência de ácido(s) nucleico(s) específico(s) para o alvo fora dos limites da sequência introduzida de ácido nucleico. [00126] Os iniciadores diretos e reversos de oligonucleotídeo podem ser moldados para se temperar especificamente a uma molécula de ácido nucleico introduzida, por exemplo, em uma sequência que corresponde a uma região de codificação no interior de uma sequência de nucleotídeo de interesse que é compreendida na mesma, ou outras partes da molécula de ácido nucleico. Os iniciadores podem ser usados em conjunto com os iniciadores descritos neste documento. Os iniciadores de oligonucleotídeos podem ser sintetizados de acordo com uma sequência desejada e estão comercialmente disponíveis (por exemplo, junto à Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA). A amplificação pode ser seguida por meio de clonagem e sequenciamento, ou por meio de análise de sequência direta de produtos de amplificação. Em uma modalidade, os iniciadores de oligonucleotídeo específicos para o alvo de gene são empregados em amplificações de PCR.
MÉTODO PARA EXPRESSAR UM TRANSGENE [00127] Em uma modalidade, um método para expressar, pelo menos, um transgene em uma planta compreende cultivar uma planta que compreende um promotor de Zea mays ligado de maneira funcional a, pelo menos, um transgene. Em uma modalidade, um método para expressar, pelo menos, um transgene em uma planta que compreende cultivar uma planta que compreende uma 5’ UTR de Zea mays ligada de maneira funcional a, pelo menos, um transgene. Em uma modalidade, um método para expressar, pelo menos, um transgene em uma planta que compreende cultivar uma planta que compreende um íntron de Zea mays ligado de maneira funcional a, pelo menos, um transgene. Em uma modalidade, um método para expressar, pelo menos, um transgene em uma planta que compreende cultivar uma planta que compreende um promotor de Zea mays, uma 5’ UTR de Zea mays e um íntron de Zea mays ligados de maneira funcional a, pelo menos, um transgene. Em uma modalidade, um método para expressar, pelo menos, um transgene em uma planta que compreende cultivar uma planta que compreende uma 3' UTR de Zea mays ligada de maneira funcional a, pelo menos, um transgene. Em uma modalidade, um método para expressar, pelo menos, um transgene em um tecido de planta ou célula de planta que compreende cultivar um tecido de planta ou célula de planta que compreende um promotor de Zea mays ligado de maneira funcional a, pelo menos, um transgene. Em uma modalidade, um método para expressar, pelo menos, um transgene em um tecido de planta ou célula de planta que compreende cultivar um tecido de planta ou célula de planta que compreende uma 5’ UTR de Zea mays ligada de maneira funcional a, pelo menos, um transgene. Em uma modalidade, um método para expressar, pelo menos, um transgene em um tecido de planta ou célula de planta que compreende cultivar um tecido de planta ou célula de planta que compreende um íntron de Zea mays ligado de maneira funcional a, pelo menos, um transgene. Em uma modalidade, um método para expressar, pelo menos, um transgene em um tecido de planta ou célula de planta que compreende cultivar um tecido de planta ou célula de planta que compreende um promotor de Zea mays, uma 5’ UTR de Zea mays e um íntron de Zea mays ligados de maneira funcional a, pelo menos, um transgene. Em uma modalidade, um método para expressar, pelo menos, um transgene em um tecido de planta ou célula de planta que compreende cultivar um tecido de planta ou célula de planta que compreende uma 3’ UTR de Zea mays ligada de maneira funcional a, pelo menos, um transgene. [00128] Em uma modalidade, um método para expressar, pelo menos, um transgene em uma planta compreende cultivar uma planta que compreende um cassete de expressão de gene que compreende um promotor de Zea mays ligado de maneira funcional a, pelo menos, um transgene. Em uma modalidade, o promotor de Zea mays consiste em uma sequência selecionada dentre SEQ ID NO:1, ou uma sequência que tem 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com uma sequência selecionada dentre SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, um método para expressar, pelo menos, um transgene em uma planta compreende cultivar uma planta que compreende um cassete de expressão de gene que compreende um íntron de Zea mays ligado de maneira funcional a, pelo menos, um transgene. Em uma modalidade, um método para expressar, pelo menos, um transgene em uma planta ligado a, pelo menos, um transgene. Em uma modalidade, um método para expressar, pelo menos, um transgene em uma planta compreende cultivar uma planta que compreende um cassete de expressão de gene que compreende um promotor de Zea mays, uma 5’ UTR de Zea mays e um íntron de Zea mays ligado de maneira funcional a, pelo menos, um transgene. Em uma modalidade, um método para expressar, pelo menos, um transgene em uma planta compreende cultivar uma planta que compreende um cassete de expressão de gene que compreende uma 3’ UTR de Zea mays ligada de maneira funcional a, pelo menos, um transgene. Em uma modalidade, um método para expressar, pelo menos, um transgene em um tecido de planta ou célula de planta compreende cultivar um tecido de planta ou célula de planta que compreende um cassete de expressão de gene, um promotor de Zea mays, ligado de maneira funcional a, pelo menos, um transgene. Em uma modalidade, um método para expressar, pelo menos, um transgene em um tecido de planta ou célula de planta compreende cultivar um tecido de planta ou célula de planta que compreende um cassete de expressão de gene, um íntron de Zea mays, ligado de maneira funcional a, pelo menos, um transgene. Em uma modalidade, um método para expressar, pelo menos, um transgene em um tecido de planta ou célula de planta compreende cultivar um tecido de planta ou célula de planta que compreende um cassete de expressão de gene, uma 5’ UTR de Zea mays, ligada de maneira funcional a, pelo menos, um transgene. Em uma modalidade, um método para expressar, pelo menos, um transgene em um tecido de planta ou célula de planta compreende cultivar um tecido de planta ou célula de planta que compreende um cassete de expressão de gene, um promotor de Zea mays, uma 5’ UTR de Zea mays e um íntron de Zea mays, ligados de maneira funcional a, pelo menos, um transgene. Em uma modalidade, um método para expressar, pelo menos, um transgene em um tecido de planta ou célula de planta compreende cultivar um tecido de planta ou célula de planta que compreende um cassete de expressão de gene que compreende uma 3’ UTR de Zea mays ligada de maneira funcional a, pelo menos, um transgene. PLANTAS TRANSGÊNICAS; [00129] Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um promotor de Zea mays. Em uma modalidade, um promotor de Zea mays pode ser um promotor de SEQ ID NO:1 ou um promotor com, pelo menos, 90%, 95%, ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene, que compreende um promotor, em que o promotor é, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntico à SEQ ID NO:1, em que o promotor está ligado de maneira funcional a um transgene a/b não clorofila. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene que compreende uma sequência selecionada dentre SEQ ID NO:1, ou uma sequência que tem 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com uma sequência selecionada dentre SEQ ID NO:1 que está ligada de maneira funcional a um transgene a/b não clorofila. Em uma modalidade ilustrativa, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene que compreende um promotor de Zea mays que está ligado de maneira funcional a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. [00130] Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene que compreende uma 3’ UTR. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene que compreende uma 3’ UTR de Zea mays. [00131] Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene que compreende um íntron, em que o íntron é, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntico à SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende um íntron de Zea mays que está ligado de maneira funcional a um promotor, em que o promotor é um promotor de Zea mays de SEQ ID NO:1, ou um promotor oriundo de uma planta (por exemplo, promotor de ubiquitina 1 de Zea mays), um vírus (por exemplo, o promotor de vírus de mosaico de veia de Cassava) ou de bactérias (por exemplo, Agrobacterium tumefaciens delta mas). Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene que compreende um íntron de Zea mays que está ligado de maneira funcional a um transgene. Em uma modalidade ilustrativa, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta que compreende um cassete de expressão de gene que compreende um íntron de Zea mays que está ligado de maneira funcional a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. [00132] Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene que compreende uma 5' UTR, em que a 5' UTR é, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO:4. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende uma 5’ UTR de Zea mays que está ligada de maneira funcional a um promotor, em que o promotor é um promotor de Zea mays de SEQ ID NO:1, ou um promotor oriundo de uma planta (por exemplo, promotor de ubiquitina 1 de Zea mays), um vírus (por exemplo, um promotor de vírus de mosaico de veia de Cassava) ou de bactérias (por exemplo, Agrobacterium tumefaciens delta mas). Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene que compreende uma 5’ UTR de Zea mays que está ligada de maneira funcional a um transgene. Em uma modalidade ilustrativa, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta que compreende um cassete de expressão de gene que compreende uma 5’ UTR de Zea mays que está ligada de maneira funcional a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. [00133] Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene que compreende um promotor de Zea mays e uma 3’ UTR de Zea mays.
Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene que compreende a) um promotor, em que o promotor é, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntico à SEQ ID NO:1 e b) uma 3’ UTR, em que a 3’ UTR é, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO:6. [00134] Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um cassete de expressão de gene que compreende um promotor de Zea mays, 5’ UTR de Zea mays, íntron de Zea mays e uma 3’ UTR de Zea mays que estão ligados de maneira funcional a um transgene. O promotor, íntron, 5’ UTR e a 3’ UTR podem estar ligadas de maneira funcional aos transgenes diferentes no interior de um cassete de expressão de gene quando um cassete de expressão de gene inclui dois ou mais transgenes. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão de gene compreende um promotor de Zea mays que está ligado de maneira funcional a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão de gene compreende um íntron de Zea mays que está ligado de maneira funcional a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende um íntron de Zea mays que está ligado de maneira funcional a um promotor, em que o promotor é um promotor de Zea mays da SEQ ID NO:1, ou um promotor oriundo de uma planta (por exemplo, promotor de ubiquitina 1 de Zea mays), um vírus (por exemplo, promotor de vírus de mosaico de veia de Cassava) ou bactérias (por exemplo, Agrobacterium tumefaciens delta mas). Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão de gene compreende uma 5’ UTR de Zea mays que está ligada de maneira funcional a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene compreende uma 5’ UTR de Zea mays que está ligada de maneira funcional a um promotor, em que o promotor é um promotor de Zea mays de SEQ ID NO:1, ou um promotor oriundo de uma planta (por exemplo, o promotor de ubiquitina 1 de Zea mays), um vírus (por exemplo, o promotor de vírus de mosaico de veia de Cassava) ou de bactérias (por exemplo, Agrobacterium tumefaciens delta mas). Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão de gene compreende uma 3’ UTR de Zea mays que está ligada de maneira funcional a um transgene, em que a 3’ UTR pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA, um transgene de marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. [00135] Em uma modalidade, a expressão de transgene com o uso dos métodos descritos neste documento é específica quanto aos tecidos de folha de uma planta. Em uma modalidade, a expressão de transgene inclui mais que um transgene expresso nos tecidos de folha de planta. Em uma modalidade, um método de cultivo de uma planta transgênica conforme descrito neste documento inclui expressão de transgene específica quanto à folha. Em uma modalidade, um método para expressar um transgene em um tecido de planta ou célula de planta inclui tecidos específicos quanto à folha e células específicas quanto à raiz. Em uma modalidade, a expressão específica quanto à folha inclui expressão específica quanto à folha de mais. [00136] Em uma modalidade adicional, a expressão de transgene com o uso dos métodos descritos neste documento é expressa em tecidos de planta acima do solo (por exemplo, os tecidos de planta acima do solo incluem folha, casca, caule e seda). Em uma modalidade, a expressão de transgene inclui mais de um transgene expresso nos tecidos de planta acima do solo. Em uma modalidade, um método de cultivo de uma planta transgênica conforme descrito neste documento inclui a expressão de transgene de tecidos de planta acima do solo. Em uma modalidade, um método para expressar um transgene em um tecido de planta ou célula de planta inclui os tecidos de planta acima do solo e células de planta acima do solo. Em uma modalidade, a expressão de tecido de planta acima do solo inclui expressão de tecido de planta acima do solo de mais. [00137] Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um vetor que compreende um promotor de Zea mays, 5’ UTR de Zea mays, íntron de Zea mays e/ou 3’ UTR de Zea mays conforme revelados neste documento. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um vetor que compreende um promotor de Zea mays, 5’ UTR de Zea mays, íntron de Zea mays e/ou 3’ UTR de Zea mays conforme revelados neste documento ligados de maneira funcional a um transgene a/b não clorofila. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende um vetor que compreende um cassete de expressão de gene conforme revelado neste documento. Em uma modalidade, um vetor pode ser um plasmídeo, um cosmídeo, um cromossomo artificial bacteriano (BAC), um bacteriófago, ou um vírus. [00138] De acordo com uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta é fornecida, em que a planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende uma sequência de promotor derivada de Zea mays não endógena ligada de maneira funcional a um transgene, em que a sequência de promotor de Zea mays compreende uma sequência de SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem 90, 95, 98 ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta é fornecida, em que a planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tem 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 ligada de maneira funcional a um transgene a/b não clorofila. Em uma modalidade, a planta, tecido de planta, ou célula de planta é uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea ou uma célula ou tecido derivados de uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea. Em uma modalidade, a planta é selecionada dentre o grupo que consiste em mais, trigo, arroz, sorgo, aveia, canteio, bananas, cana de açúcar, grão de soja, algodão, girassol e canola. Em uma modalidade, a planta é Zea mays. [00139] Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta é fornecida de modo a compreender a SEQ ID NO:1, ou uma sequência que tem 90, 95, 98 ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1, ligada de maneira funcional a um transgene. De acordo com uma modalidade, a planta, tecido de planta, ou célula de planta é uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea ou célula de planta ou tecido derivada de uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea. Em uma modalidade, a planta é selecionada dentre o grupo que consiste em mais, trigo, arroz, sorgo, aveia, canteio, bananas, cana de açúcar, grão de soja, algodão, girassol e canola. Em uma modalidade, a planta é Zea mays. De acordo com uma modalidade, a sequência de promotor ligada de maneira funcional a um transgene é incorporada ao genoma da planta, tecido de planta, ou célula de planta. Em uma modalidade, a planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende adicionalmente uma sequência 5' não traduzida que compreende SEQ ID NO:4 ou uma sequência que tem 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO:4, em que a sequência 5' não traduzida é inserida entre e ligada de maneira funcional ao dito promotor e ao dito transgene. Em uma modalidade adicional, a planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende adicionalmente uma sequência de íntron inserida após a sequência 5' não traduzida. Em uma modalidade, a sequência de íntron é uma sequência de íntron isolada de um gene a/b de clorofila de Zea mays.
Em uma modalidade, a sequência de íntron compreende ou consiste em SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3. [00140] Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta é fornecida, que compreende SEQ ID NO:1, ou uma sequência que tem 90, 95, 98 ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1, ligada de maneira funcional à extremidade 5' de um transgene e uma sequência 3' não traduzida que compreende a SEQ ID NO:6 ou uma sequência que tem 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO:6, em que a sequência 3' não traduzida está ligada de maneira funcional ao dito transgene. De acordo com uma modalidade, a planta, tecido de planta, ou célula de planta é uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea ou é um tecido de planta ou célula derivados de uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea. Em uma modalidade, a planta é selecionada dentre o grupo que consiste em mais, trigo, arroz, sorgo, aveia, canteio, bananas, cana de açúcar, grão de soja, algodão, girassol e canola. Em uma modalidade, a planta é Zea mays. De acordo com uma modalidade, a sequência de promotor ligada de maneira funcional a um transgene é incorporada ao genoma da planta, tecido de planta, ou célula de planta. Em uma modalidade, a planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende adicionalmente uma sequência 5' não traduzida que compreende SEQ ID NO:4 ou uma sequência que tem 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO:4, em que a sequência 5' não traduzida é inserida entre e ligada de maneira funcional ao dito promotor e ao dito transgene. Em uma modalidade adicional, a planta, tecido de planta, ou célula de planta compreende adicionalmente uma sequência de íntron inserida após a sequência 5' não traduzida. Em uma modalidade, a sequência de íntron é uma sequência de íntron isolada de um gene a/b de clorofila de Zea mays. Em uma modalidade, a sequência 5' 5’ não traduzida consiste em SEQ ID NO:4. [00141] Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta de acordo com os métodos revelados neste documento pode ser uma planta monocotiledônea. A planta monocotiledônea, tecido de planta, ou célula de planta podem ser, mas não se limitam a milhos, arroz, trigo, cana de açúcar, cevada, canteio, sorgo, orquídeas, bambu, banana, tifas, lírios, aveia, cebola, painço e triticale. [00142] Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta, ou célula de planta de acordo com os métodos revelados neste documento podem ser uma planta dicotiledônea. A planta dicotiledônea, tecido de planta, ou célula de planta podem ser, mas não se limitam a colza, canola, Mostarda indiana, Mostarda da Etiópia, grão de soja, girassol e algodão. [00143] Em relação à produção de plantas geneticamente modificadas, os métodos para a elaboração genética de plantas são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, diversos métodos para a transformação de planta foram desenvolvidos, incluindo os protocolos de transformação biológica e física para dicotiledôneas plantas, assim como plantas monocotiledôneas (por exemplo, Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 17:282 a 286 (1999); Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. e Thompson, J. E.
Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, páginas 67 a 88 (1993)). Além disso, os vetores e métodos de cultura in vitro para transformação de célula de planta ou tecido e regeneração de plantas estão disponíveis, por exemplo, em Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. e Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, páginas 89 a 119 (1993). [00144] Ficará evidente para um elemento versado na técnica que após a sequência exógena ser incorporada de modo estável em plantas transgênicas e confirmada como operante, a mesma pode ser introduzida em outras plantas por meio de cruzamento sexual.
Qualquer um dentre diversos conjuntos de técnicas-padrão de reprodução pode ser usado, dependendo das espécies a serem cruzadas. [00145] Uma célula de planta, calo, tecido ou planta transformados podem ser identificados e isolados por meio de seleção ou triagem do material de planta elaborado para traços codificados pelos genes marcadores presentes no DNA de transformação. Por exemplo, a seleção pode ser realizada cultivando-se o material de planta elaborado em meios que contêm uma quantidade inibitória do antibiótico ou herbicida aos quais o construto de gene de transformação atribui resistência. Ademais, as células transformadas também podem ser identificadas por meio de triagem para as atividades de quaisquer genes marcadores visíveis (por exemplo, os genes yfp, gfp, β-glicuronidase, luciferase, B ou C1) que podem estar presentes nos vetores de ácido nucleico recombinantes. Tais metodologias de seleção e triagem são bem conhecidas pelos elementos versados na técnica. [00146] Os métodos físicos e bioquímicos também podem ser usados para identificar os transformantes de planta ou célula de planta que contêm construtos de gene inseridos. Tais métodos incluem, mas não se limitam a: 1) Análise Southern ou amplificação de PCR para detectar e determinar a estrutura da inserção de DNA recombinante; 2) Northern blot, proteção de RNase de S1, extensão de iniciador ou amplificação de PCR de transcriptase reversa para detectar e examinar as transcrições de RNA dos construtos de gene; 3) ensaios enzimáticos para detectar atividade de enzima ou ribozima, em que tais produtos de gene são codificados pelo construto de gene; 4) análise de Sequenciamento de Nova Geração (Next Generation Sequencing (NGS)); 5) eletroforese de gel de proteína, conjuntos de técnicas de Western blot, imunopreciptação, ou imunoensaio ligado à enzima (ELISA), em que os produtos de construto de gene são proteínas. Conjuntos de técnicas adicionais, tais como hibridização in situ, coloração de enzima e imunocoloração, também podem ser usados para detectar a presença ou expressão do construto recombinante em órgãos e tecidos de planta específicos. Os métodos para realizar todos os tais ensaios são todos bem conhecidos pelos elementos versados na técnica. [00147] Os efeitos de manipulação de gene com o uso dos métodos revelados neste documento podem ser observados por, por exemplo, Northern blots do RNA (por exemplo, mRNA) isoladas dos tecidos de interesse. Tipicamente, se o mRNA estiver presente ou a quantidade de mRNA tiver aumentado, pode-se supor que o transgene correspondente está sendo expresso. Os outros métodos para medir a atividade de polipeptídeo codificado e/ou de gene podem ser usados.
Os diferentes tipos de ensaios enzimáticos podem ser usados, dependendo do substrato usado e do método para detecção de aumento ou diminuição de um produto ou subproduto de reação. Além disso, os níveis de polipeptídeo expressos podem ser medidos imunoquimicamente, isto é, ELISA, RIA, EIA e outros ensaios à base de anticorpo bem conhecidos pelos elementos versados na técnica, tal como por meio de ensaios de detecção eletroforética (tanto com coloração ou Western blotting). Conforme um exemplo não-limitador, a detecção do AAD-1 (ariloxialcanoato dioxigenase; consulte WO 2005/107437) e PAT (fosfinotricina-N-acetil-transferase), de proteínas com o uso de um ensaio ELISA é descrita na Publicação de Patente n° U.S. 20090093366 que está incorporada integralmente neste documento, a título de referência. O transgene pode ser expresso seletivamente em alguns tipos de célula ou tecidos da planta ou em alguns estágios de desenvolvimento, ou o transgene pode ser expresso em, substancialmente, todos os tecidos de planta, substancialmente ao longo de todo o seu ciclo de vida. Entretanto, qualquer modo de expressão combinatória também é aplicável. [00148] A presente revelação também engloba as sementes das plantas transgênicas descritas acima, em que a semente tem o transgene ou construto de gene. A presente revelação engloba adicionalmente a progênie, clones, linhagens de célula ou células das plantas transgênicas descritos acima em que a dita progênie, clone, linhagem de célula ou célula têm o transgene ou construto de gene. [00149] Embora a invenção tenha sido descrita com referência aos métodos e modalidades específicos, ficará evidente que as diversas modificações e alterações podem ser realizadas sem que se afastem da invenção.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Identificação de elementos regulatórios de alta expressão [00150] Os elementos regulatórios de Zea mays inovadores foram identificados através de uma abordagem de traçamento de perfil transcricional com o uso de sequenciamento de nova geração (NGS).
Tais elementos regulatórios foram, então, isolados e clonados para caracterizar o perfil de expressão dos elementos regulatórios para o uso em plantas transgênicas. As linhagens de mais transgênico transformadas de modo estável com um gene-repórter cry34Ab1 isolado de Bacillus thuringiensis, um gene-repórter de phiyfp e um gene marcador selecionável de aad-1 foram produzidos e os níveis de expressão de transgene e especificidade de tecido foram avaliados.
De tal modo, os elementos regulatórios de Zea mays inovadores foram identificados e caracterizados. São revelados pela primeira vez os elementos regulatórios de promotor e 3’ UTR para uso em construtos de expressão de gene. [00151] Os tecidos de mais foram obtidos de plantas cultivadas a diferentes estágios de crescimento e desenvolvimento de planta para traçamento de perfil transcricional para identificar e selecionar os elementos regulatórios de genes de mais nativos com os perfis de expressão desejáveis para o uso em construtos de expressão de gene. Por exemplo, as amostras de tecido de 3 estágios de folha (V4 (duplicação), V12 e R3) e desenvolvimento de raiz (tecidos nodais e fibrosos de V4 e V12), pólen, seda, sabugo, núcleo imaturo, casca e caule (V4 e R1) foram coletadas. O mRNA total foi isolado de todos os tecidos descritos acima e o mRNA de alta qualidade em quantidades desejadas foi obtido. [00152] As bibliotecas de cDNA foram preparadas a partir de cada uma dentre as amostras de mRNA e o sequenciamento de alta produtividade foi concluído com o uso de um lllumina HiSeq® 2000 (lllumina Inc., San Diego, CA). Além disso, o kit de preparação de amostra de lllumina TruSeq® RNA foi usado de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante para preparação de amostra de RNAseq. Brevemente, 5 pg de RNA total foram purificados com o uso de microesferas magnéticas fixadas por oligo poli-t seguido de fragmentação em peças menores (comprimento médio de cerca de 200 bp) com o uso de cátions divalentes sob alta temperatura. A transcriptase reversa de SuperScript® II e os iniciadores aleatórios foram, então, usados para copiar o mRNA fragmentado para que se torne o primeiro cDNA de filamento. O cDNA foi adicionalmente convertido para cDNA de filamento duplo (ds cDNA) com o uso de polimerase I e RNase H de DNA. Os fragmentos de cDNA de filamento duplo, então, foram submetidos a reparo de extremidade, A-tailing (adição de cauda) e, então, ligadura aos adaptadores de extremidade acoplada (PE) de lllumina indexados. Finalmente, os produtos de biblioteca foram limpos e enriquecidos com 15 ciclos de PCR e purificados. As bibliotecas enriquecidas foram normalizadas a uma concentração de 2 nM, desnaturadas com hidróxido de sódio e diluídas a 12 pM em tampão de hibridização para o carregamento em uma linha única de uma célula de fluxo de HiSeq®. A geração de aglomerações, hibridização de iniciador e reações de sequenciamento foram executadas de acordo com o protocolo recomendado de lllumina. [00153] As leituras de sequenciamento foram, então, filtradas para remover leituras de baixa qualidade. Cerca de 99,9% das leituras de sequenciamento foram retidas após a filtração. As leituras de sequenciamento foram alinhadas ao genoma anotado de B73 de Zea mays c.v. B73 disponível no maizeGDB. As leituras de sequenciamento que foram mapeadas no genoma de mais em mais de um loco foram descartadas para evitar a confusão na identificação dos genes de alta expressão e sua caracterização adicional. Tal etapa levou ao alinhamento de > 70% de leituras de sequenciamento de cada uma das amostras com o genoma de mais. A unidade de expressão de gene quantitativa de fragmentos por quilobase (kilobase) de éxon por milhão de fragmentos mapeados ou os valores de FPKM foram usados para classificar genes para o teste de transformação estável que correspondeu a um padrão de expressão desejável para o uso em construtos de expressão de gene. Os genes altamente expressos em mais foram priorizados para o teste em linhagens transgênicas estáveis (Figura 1).
Exemplo 2: Seleção de elementos regulatórios inovadores de sequência de Zea mays [00154] As sequências de promotor, íntron, 5' UTR e 3’ UTR foram extraídas de uma sequência de gene de Zea mays que teve uma alta classificação para expressão através da abordagem de traçamento de perfil transcricional. A sequência do gene Zea mays nativo, do genoma B73 de Zea mays c.v., é fornecida conforme SEQ ID NO:7. A sequência de promotor de Zea mays de 379 bp (SEQ ID NO:1) é fornecida. Além da sequência de íntron de Zea mays de 119 bp (SEQ
ID NO:2) e a sequência de íntron (2) de Zea mays de 91 bp (SEQ ID NO:3) são fornecidas como fragmentos que formam a SEQ ID NO:7.
Ademais, a sequência de 5' UTR de Zea mays de 152 bp (SEQ ID NO:4) é fornecida. Por fim, a sequência 3' UTR de Zea mays de 295 bp (SEQ ID NO:6) também é fornecida.
Exemplo 3: Modelo de construto [00155] Os elementos de DNA foram sintetizados e clonados em vetores de entrada. O promotor, íntron e 5' UTR (SEQ ID NO:5) de Zea mays, cry34Ab1 (gene-repórter de B. thuringiensis), e a 3’ UTR de gene II inibidor de protease Solanum tuberosum (3' UTR v2 de StPinll;
An et al., (1989) Plant Cell 1; 115 a 122) foram amplificados com os iniciadores que contêm uma homologia de sobreposição de mínimo de 15 bp com o elemento de DNA de ladeamento no interior do construto doador. Todos os fragmentos foram purificados por gel. Todos os três fragmentos juntamente com uma estrutura principal de vetor de entrada, pENTR11, foram montados em uma ordem direcional através de uma reação de cloangem contínua de Geneart® (Invitrogen, Carlsbad, CA). O cassete de expressão de gene resultante continha o transgene cry34Ab1 ligado de maneira funcional à extremidade 3’ do promotor, íntron e 5' UTR (SEQ ID NO:5) de Zea mays. Uma reação de Gateway® LR Clonase® (Invitrogen) foi, então, realizada com o plasmídeo de entrada resultante, pDAB114404 e um vetor de destino, pDAB104153, levando a um vetor de expressão final, pDAB114411. O vetor de destino continha um cassete de marcação selecionável que compreende um gene de aad-1 impulsionado pelo Promotor de ubiquitina -1 de Zea mays (Christensen et al., (1992) Plant Molecular Biology 18; 675 a 689) e terminado por uma 3' UTR de lipase de mais (Patente n° U.S. 7.179.902). O construto resultante, pDAB114411 é um construto de expressão heterólogo que contém um cassete de expressão de gene aad-1 e um cassete de expressão de gene cry34Ab1 (Figura 2). [00156] Um segundo cassete de vetor de entrada, pDAB116024, foi montado com a reação de clonagem contínua de Geneart® por meio da substituição do gene cry34Ab1 por um gene-repórter phiYFP (Shagin et al., (2004) Mol Biol Evol 21; 841 a 850) que contém um íntron LS1 de Solanum tuberosum (St-LS1 ;Vancanneyt G F et ai, (1990) Mol Gen Genet 220(2):245 a 250) e por meio da substituição da 3' UTR de StPinll pela sequência de 3' UTR de 295 bp inovadora (SEQ ID NO:6) obtida a partir de Zea mays. Tanto os elementos de promotor, íntron e 5' UTR (SEQ ID NO:5) quanto os elementos de 3’ UTR (SEQ ID NO:6) foram derivados do mesmo gene nativo de Zea mays. O cassete de expressão de gene resultante continha o transgene phiYFP ligado de maneira funcional à extremidade 3' do promotor, íntron e 5’ UTR (SEQ ID NO:5) de Zea mays. Após a reação de Gateway com um vetor de destino, pDAB104153, um construto de expressão final, pDAB116038, foi montado. O vetor de destino continha um cassete de marcação selecionável que compreende um gene de aad-1 impulsionado pelo Promotor de ubiquitina -1 de Zea mays (Christensen et a!., (1992) Plant Molecular Biology 18; 675 a 689) e terminado por uma 3' UTR de lipase de mais (Patente n° U.S. 7.179.902). O construto resultante, pDAB116038 é um construto de expressão heterólogo que contém um cassete de expressão de gene aad-1 e um construto de expressão de gene phiYFP (Figura 3). [00157] Um construto de controle negativo, pDAB101556, foi montado de modo a conter um gene-repórter de proteína de fluorescência (YFP) em vez de um gene cry34Ab1 (Figura 4) e o mesmo cassete de expressão aad-1 conforme presente em pDAB114411. Um construto de controle positivo, pDAB108746, foi construído que compreende promotor de ubíquitina-1 de Zea mays e 3' UTR de gene II inibidor de protease de Solanum tuberosum (3' UTR v2 de StPinll; An et ai, (1989) Plant Cell 1; 115-22) que controlam a expressão do gene cry34Ab1 (Figura 5). O cassete aad-1 foi igual ao presente em pDAB114411. Um outro construto de controle positivo, pDAB113121, foi construído de modo a compreender o promotor de ubiquitina-1 de Zea mays e 3' UTR de gene II inibidor de protease de Solanum tuberosum (3' UTR v2 de StPinll; An et ai, (1989) Plant Cell 1; 115 a 122) que controlam a expressão do gene phiYFP que contém um íntron de St-LS1 (Figura 6). O cassete aad-1 foi igual ao presente em pDAB116038.
Exemplo 4: Transformação de planta e confirmação molecular Transformação de Agrobacterium tumefaciens: [00158] Os vetores de expressão binários foram transformados em estirpe DAt13192 de Agrobacterium tumefaciens (estirpe terciária deficiente de RecA) (Publicação de Patente Internacional n°: WO2012016222). As colônias bacterianas foram selecionadas e o DNA de plasmídeo binário foi isolado e confirmado através de digestão de enzima de restrição.
Iniciação de Cultura de Agrobacterium: [00159] As culturas de Agrobacterium foram aplicadas por esfregaço a partir de estoques de glicerol em um meio de AB mínimo (Gelvin, S., 2006, Agrobacterium Virulence Gene Induction, in Wang, K., ed., Agrobacterium Protocols Second Edition Vol. 1, Humana Press, página 79; realizado sem sacarose e com 5 g/l de glicose e 15 g/l de Ágar De Bacto™) e incubadas a 20 O no escuro durante 3 dias.
As culturas de Agrobacterium foram aplicadas por esfregaço a uma placa de meio YEP (Gelvin, S., 2006, Agrobacterium Virulence Gene Induction, in Wang, K., ed., Agrobacterium Protocols Second Edition Vol. 1, Humana Press, página 79) e incubadas a 20 Ό no escuro durante 1 dia. [00160] No dia de um experimento, uma mistura de Meio de inoculação (2,2 g/l de sais de MS, 68,4 g/l de sacarose, 36 g/l de glicose, 115 mg/l de L-prolina, 2 mg/l de glicina, 100 mg/l de mio- Inositol, 0,05 mg/l de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de piridoxina HCI, 0,5 mg/l de tiamina HCI) e acetoseringona foi preparada em um volume adequado ao tamanho do experimento. Uma solução de estoque de 1 M de acetoseringona em 100% de dimetilssulfóxido foi adicionado ao Meio de inoculação para fazer uma concentração de acetoseringona final de 200 μΜ. [00161] Para cada construto, 1 a 2 ciclos de Agrobacterium da placa de YEP foram suspensos em 15 ml do meio de inoculação/mistura de acetoseringona no interior de um tubo de centrifugação de 50 ml estéril e descartável e a densidade óptica da solução a 600 nm (O.D.600) foi medida em um espectrofotômetro. A suspensão foi, então, diluída para 0,25 a 0,35 de O.D.600 com o uso de Meio de inoculação/mistura de acetoseringona adicionais. O tubo de suspensão de Agrobacterium foi, então, colocado horizontal mente sobre um agitador de plataforma definido a cerca de 75 rpm à temperatura ambiente durante entre 1 e 4 horas antes do uso.
Transformação de Mais: [00162] Os construtos experimentais foram transformados em mais através de transformação mediada por Agrobacterium de embriões imaturos isolados da linhagem pura, B104 de Zea mays c.v. O método usado é similar aos publicados por Ishida et al., (1996) Nature Biotechnol 14:745 a 750 e Frame et al., (2006) Plant Cell Rep 25: 1.024 a 1.034, porém, com diversas modificações e aprimoramentos para tornar o método receptível a transformação de alta produtividade.
Um exemplo de um método usado para produzir uma quantidade de eventos transgênicos em mais é fornecido na Publicação de Pedido de Patente n° U.S. 2013/0157369 A1, a começar pela infecção embrionária e etapas de cocultivo.
Transferência e estabelecimento de plantas T0 na estufa: [00163] As plantas transgênicas foram transferidas regularmente para a estufa. As plantas foram transplantadas de Phytatrays™ para pequenos recipientes (T. O. Plastics, 8,89 cm (3,5") de SVD, 700022C) preenchidos com meios de crescimento (Premier Tech Horticulture, ProMix BX) e cobertos com humidomes (ambientes úmidos) para auxiliar na climatização das plantas. As plantas foram colocadas em uma câmara de crescimento Conviron™ (28 Ό/24 Ό, f otoperíodo de 16 horas, 50 a 70% de RH, 200 pmol de m~2 s‘1 de intensidade de luz) até alcançar o estágio V3 a V4. Isso auxiliou na climatização das plantas ao solo e às temperaturas mais severas. As plantas foram, então, movidas para a estufa (Tipo de Exposição à Luz: Foto ou Assimilação; Alto Limite de Luz: 1.200 pmol m'2 s'1 de radiação fotossinteticamente ativa (PAR); comprimento de dia de 16 horas; 27 Ό ao Dia/24 Ό à Noite) e transplantada de pequeno s recipientes para recipiente s de 13,97 cm (5,5 polegadas). Aproximadamente 1 a 2 semanas após a transplantação para recipientes maiores, foram tomadas amostras das plantas para o bioensaio. Uma planta por evento foi ensaiada.
Exemplo 5: Confirmação molecular de eventos/plantas transgênicas [00164] Foram tomadas amostras das supostas plantas de mais transgênicas no estágio de folha de V2 a 3 para a presença de transgene com o uso de ensaios de PCR quantitativo de cry34Ab1 e AAD-1. O DNA total foi extraído das amostras de folha com o uso do Kit de extração de DNA MagAttract® (Qiagen) conforme as instruções de fabricante. [00165] Para detectar os genes-de-interesse, os fragmentos de DNA específicos de gene foram amplificados com conjuntos de sonda/iniciador TaqMan® que contêm uma sonda fluorescente rotulada por FAM para o gene cry34Ab 1 e uma sonda fluorescente rotulada por HEX para o controle de gene de referência de invertase endógena. Os iniciadores a seguir foram usados para o cry34Ab 1 e as amplificações de gene de referência de invertase endógena.
Sondas/lniciadores Cry34Ab1: Iniciador Direto: TQ.8v6.1.F: GCCATACCCTCCAGTTG (SEQ ID NO:8) Iniciador Reverso: TQ.8v6.1.R: GCCGTTGATGGAGTAGTAGATGG (SEQ ID NO:9) Sonda: TQ.8v6.1 .MGB.P: 5-/56-FAM/ CCGAATCCAACGGCTTCA / MGB (SEQ ID NO:10) Iniciadores de Invertase: Iniciador Direto: InvertaseF: TGGCGGACGACGACTTGT (SEQ ID NO:11) Iniciador Reverso: InvertaseR: AAAGTTTGGAGGCTGCCGT (SEQ ID NO:12) InvertaseProbe (Sonda de Invertase): 5’- /5HEX/CGAGCAGACCGCCGTGTACTT /3BHQ_1/-3’ (SEQ ID NO:13) [00166] Em seguida, as reações de PCR foram executadas em um volume final de 10 μΙ de reação que contém 5 μΙ de Sondas de Mistura Master da Roche LightCycler® 480 (Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN); 0,4 μΙ de cada um dentre os iniciadores TQ.8v6.1.F, TQ.8v6.1.R, InvertaseF e InvertaseR de 10 μΜ de estoques a uma concentração final de 400 nM; 0,4 μΙ de cada um dentre TQ.8v6.1 .MGB.P e Sondas de Invertase de 5 μΜ de estoques a uma concentração final de 200 nM, 0,1 μΙ de 10% de polivinilpirrolidona (PVP) à concentração final de 0,1%; 2 μΙ de 10 ng/μΙ de DNA genômico e 0,5 μΙ de água. O DNA foi amplificado em um Sistema de Roche LightCycler® 480 sob as seguintes condições: 1 ciclo de 95 Ό durante 10 min; 40 ciclos das seguintes 3 etapas: 95 Ό durante 10 segundos; 58 Ό for 35 segundos e 72 O durante 1 s egundo e um ciclo final de 4 Ό durante 10 segundos. A quantidade de cópia de cry34Ab 1 foi determinada por meio de comparação de valores de Alvo(Target) (gene de interesse) / Referência (gene de Invertase) para amostras não conhecidas (emitira pelo LightCycler® 480) com valores Alvo/Referência de controles de quantidade de cópia cry34Ab 1. [00167] A detecção do gene AAD-1 foi executada conforme descrito acima para o gene cry34Ab 1 com o uso do gene de referência de invertase endógena. As sequências iniciadoras AAD-1 foram da seguinte forma;
Iniciador Direto AAD1: TGTTCGGTTCCCTCTACCAA (SEQ ID NO:14) Iniciador reverso AAD1: CAACATCCATCACCTTGACTGA (SEQ ID NO:15) Sonda AAD1: 5’-FAM/CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA- MGB/BHQ-3’ (SEQ ID NO:16). [00168] A detecção do gene PhiYFP foi executada conforme descrito acima para o gene cry34Ab1 com o uso do gene de referência de invertase endógena. As sequências iniciadoras PhiYFP foram da seguinte forma;
Iniciador Direto v3 PhiYFP: CGTGTTGGGAAAGAACTTGGA (SEQ ID NO:17) Iniciador Reverso v3 PhiYFP: CCGTGGTTGGCTTGGTCT (SEQ ID NO:18) Sonda v3 PhiYFP: 5’FAM/CACTCCCCACTGCCT /MGB_BHQ_1/3’(SEQ ID NO:19). [00169] Por fim, tomaram-se amostras das plantas T0 que contêm o gene de interesse em V4 a 5 para os ensaios ELISA de folha Cry34Ab1, PhiYFP e AAD-1. Foram tomadas amostras de quatro punções de folha. Foram tomadas amostras de um outro conjunto de plantas em V4 a 5 para toda a massa de raiz para os dois ensaios ELISA de proteína. Os ensaios ELISA de folha e raiz Cry34Ab1 (Agdia, Inc., Elkart, IN) e AAD-1 (Acadia BioScience) foram realizados de acordo com as instruções de fabricante. [00170] O ELISA de PhiYFP foi concluído da seguinte forma. As placas foram revestidas com anticorpo monoclonal de captura anti- YFP (Origene; Rockvile, MD). O anticorpo monoclonal de captura anti- YFP foi diluído em PBS a uma concentração de 1 pg/ml e 150 μΙ de solução foi adicionado às cavidades das placas e incubadas ao longo da noite a4O. Em seguida, as placas foram aqueci das à temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. As placas foram lavadas quatro vezes com 350 μΙ de tampão de lavagem (1X PBS e 0,5% de Tween 20). Então, 200 μΙ de tampão de bloqueio foi aliquotado para as placas e as placas foram incubadas a 37 O durante, pelo menos, uma hora.
As placas foram lavadas quatro vezes com 350 μΙ de tampão de lavagem (1X PBS e 0,5% de Tween 20). [00171] Os padrões de PhiYFP expresso por recombinação (Evrogen; Moscou, Rússia) forma adicionados às cavidades em diluições em série. Os padrões foram inicialmente fornecidos a uma concentração de 0,0313 ng/ml a 2 ng/ml. Em seguida, as placas foram colocadas em um agitador e incubadas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas quatro vezes com 350 μΙ de tampão de lavagem (1X PBS e 0,5% de Tween 20). O anticorpo policlonas anti-PhiYFP de coelho primário (Evrogen: Moscou, Rússia) foi reduzido em concentração a 1 pg/ml e adicionado às placas. Em seguida, as placas foram colocadas em um agitador e incubadas à temperatura ambiente.
As placas foram lavadas quatro vezes com 350 μΙ de tampão de lavagem (1X PBS e 0,5% de Tween 20). A peroxidase de raiz forte de anticorpo de anti-coelho (Pierce; Rockford, IL) foi adicionada às placas. Em seguida, as placas foram colocadas em um agitador e incubadas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas quatro vezes com 350 μΙ de tampão de lavagem (1X PBS e 0,5% de Tween 20). Por fim, o ELISA TMB Ultra de 1 etapa de Pierce, substrato para o anticorpo rotulado como peroxidase de raiz forte, foi adicionado às cavidades e agitado suavemente. Os resultados foram quantificados com um espectrofotômetro. [00172] Os ensaios ELISA de folha Cry34Ab1 foram expressos como ng/cm2, enquanto os resultados de ELISA de raiz foram expressos como partes por milhão (ou ng de proteína por mg de proteína de planta total). Os ensaios de proteína de raiz completos foram executados com o método de detecção de Bradford conforme as instruções de fabricante. [00173] As plantas T0 foram submetidas a auto polinização e polinização cruzada com linhagens de transformação não transgênica de B104 de Zea mays c.v. para obter semente T-,. Cinco a seis linhagens transgênicas ou eventos de cada um dos construtos de elemento regulatório de teste foram avançados para estudos de expressão de gene de proteína T-ι e RNA e, então, para produção de semente T2. Consequentemente, 30 a 40 sementes Tde cada um dos eventos foram semeadas; as plântulas foram aspergidas com Assurell® no estágio V2 a 3 de desenvolvimento para matar os segregantes não transgênicos. Foram tomadas amostras das plantas transgênicas em múltiplos estágios de desenvolvimento de planta para ELISA de Cry34Ab1, PhiYFP, e AAD-1 da seguinte forma: folha (V4, V12 e R3); raiz (V4 e R1); caule (R1); pólen (R1); seda (R1); casca (R3); núcleo imaturo (R3); e sabugo (R3). Todos os tecidos foram isolados e colocados em tubos embutidos em gelo seco; que foram, então, transferidos para -80 O. Os tecidos congela dos foram liofilizados antes da extração de proteína para ELISA. [00174] Foram tomadas amostras das supostas plantas Ti transgênicas que contêm trangêneses cry34Ab1, PhiYFP e AAD-1 em V4 a 5 para os ensaios ELISA de folha. Foram tomadas amostras de quatro punções de folha. As punções de folha foram colocadas em um tubo e uma única microesfera de aço inoxidável de 0,14 cm (1/8 polegadas) (Hoover Precision Products, Cumming, GA, USA) foi adicionada a cada tubo de 1,2 ml que contém 300 pl de tampão de extração (1X PBST suplementado com 0,05% de Tween 20 e 0,5% de BSA). As amostras foram processadas em uma Genogrinder™ (SPEX
SamplePrep, Metuchen, NJ) a 1.500 rpm durante 4 minutos. As amostras foram centrifugadas a 4.000 rpm durante 2 minutos em uma centrífuga Sorvall Legend XFR™. Em seguida, um adicional de 300 pl de tampão de extração foi adicionado e as amostras foram processadas mais uma vez em uma Genogrinder™ a 1.500 rpm durante 2 minutos. As amostras foram centrifugadas mais uma vez a 4.000 rpm durante 7 minutos. Por fim, o sobrenadante foi coletado e os ensaios ELISA foram concluídos a diferentes diluições juntamente com os padrões de proteína com o uso de Kits de ensaio ELISA de Cry34Ab1 (Agdia, Inc.) e AAD-1 (Acadia BioScience, LLC) comercialmente disponíveis, conforme as instruções de fabricante. [00175] A extração de proteína para vários ELISAs de tipo de tecido foi executada por meio da trituração de tecido liofilizado em um agitador de tinta durante 30 segundos. Para os tecidos que precisam de trituração, a etapa de trituração foi repetida durante outros 30 segundos. O pó de granalha foi adicionado para cobrir a porção curvada no fundo do tubo. O tecido grosseiramente triturado foi transferido para tubos de 2 ml e preenchido até a marca de 0,5 ml.
Uma bola de cerâmica foi adicionada a cada tubo, assim como 0,6 ml do tampão de extração parcial (200 pl de coquetel de inibidor de protease, 200 μΙ de EDTA 500 mM, 15,5 mg de pó de DTT e PBST a 20 ml). Todos os tubos foram mantidos em gelo durante 10 minutos.
Os tubos frios foram transferidos ao suporte de 2 ml do Genogrinder®.
As amostras foram trituradas duas vezes durante 30 segundos com um resfriamento de 5 minutos em gelo intermediário. Em seguida, 40 μΙ de 10% de Tween®-20 e 300 μΙ de tampão de extração foram adicionados às amostras. As amostras foram trituradas durante outros 30 segundos com 5 minutos de resfriamento intermediário. Por fim, cada amostra foi centrifugada a 13.000 rpm durante 7 minutos e o sobrenadante foi, cuidadosamente, transferido para um novo tubo para coletar o extrato. O extrato foi ressuspenso no tampão de extração e foi diluído conforme necessário para ensaios ELISA.
Exemplo 6: Triagem de expressão de Planta transgênica T0 [00176] Os resultados de ELISA indicaram que os elementos regulatórios isolados de Zea mays impulsionaram a expressão preferencial de tecido de folha de cry34Ab1 em eventos de T0 que foram transformados com o construto, pDAB114411. A expressão inferior de Cry34Ab1 pelos elementos regulatórios de Zea mays foram observados nas raízes (Tabelas 3 e 4), em comparação com controle positivo de pDAB108746, dos eventos de T0 que foram transformados com o construto, pDAB114411. Os eventos produzidos a partir do construto de controle Cry34Ab1 expresso por pDAB108746 tanto no tecido de folha quanto o tecido de raiz. Não houve expressão de folha Cry34Ab1 observada em eventos de planta transformados com o construto de controle, pDAB101556 que não continha o gene cry34Ab1. Todos os construtos expressam a proteína AAD-1 tanto no tecido de raiz quanto o tecido de folha. [00177] Os resultados do ELISA de PhiYFP indicaram que os eventos transgênicos de T0 transformados com o construto pDAB116038, que expressaram um transgene phiYFP terminado pelo elemento regulatório de 3' UTR de Zea mays do mesmo gene que o promotor, produziu altos níveis de proteína de PhiYFP em tecidos de folha. Os níveis de expressão da proteína de PhiYFP nos eventos pDAB116038 foram superiores aos níveis de expressão de proteína de PhiYFP produzidos nos eventos transgênicos transformados com um construto de controle positivo pDAB113121, que expressou um transgene phiYFP terminado pelo elemento regulatório de 3' UTR de StPinll (Tabela 5). Ambos os construtos, pDAB116038 e pDAB113121 expressaram a proteína AAD-1 tanto no tecido de raiz quanto no tecido de folha. Ademais, os eventos transgênicos pDAB116038 produzidos com o 3' UTR de Zea mays resultaram em expressão de proteína de PhiYFP aumentada em comparação com a expressão de proteína de Cry34Ab1 produzida a partir de eventos transgênicos cry34Ab1 transformados com pDAB114411 e pDAB108746, ambos os quais continham uma 3' UTR de StPinlI.
Tabela 3. Os resultados de ELISA de T0 que mostram a expressão de gene cry34Ab1 e aad-1 nos eventos de construto de folhas de mais V4 a V6.
Tabela 4. Os resultados de ensaio ELISA de T0 que mostram a expressão de transgene cry34Ab1 e aad-1 em raízes de mais de V4 a 6 de vários eventos de construto.
Tabela 5. Os resultados de ensaio ELISA de Τί que mostram a expressão de gene cry34Ab1 e aad-1 em múltiplos tipos de tecido de mais em vários eventos de construto.
Tabela 6. Os resultados de ensaio ELISA que representam a expressão de gene de phiYFP e aad-1 em folhas de mais (V4 a 6) de T0 quando uma 3’ UTR nativa, presente em pDAB116038 controla a expressão de gene phiYFP.
Tabela 7. Os resultados de ensaio ELISA que representam a expressão de gene de phiYFP e aad-1 em folhas de mais (V4 a 6) de T-ι quando uma 3’ UTR nativa, presente em pDAB116038 controla a expressão de gene phiYFP. [00178] De tal modo, os elementos regulatórios de mais inovadores isolados de Zea mays foram identificados e caracterizados. São revelados pela primeira vez os elementos regulatórios de promotor (SEQ ID NO:5) e 3’ UTR (SEQ ID NO:6) para o uso em construtos de expressão de gene. [00179] Todas as referências, incluindo as publicações, Patentes, e Pedidos de Patente mencionados neste documento estão, aqui, incorporados, a título de referência até o ponto em que os mesmos não sejam inconsistentes com os detalhes explícitos desta revelação e estão, portanto, incorporados até o ponto, como se cada referência estivesse individual e especificamente indicada como incorporada, a título de referência e fosse estabelecida integralmente neste documento. As referências discutidas neste documento são fornecidas apenas para sua revelação anterior à data de depósito do presente pedido. Nenhum aspecto do presente documento deve ser interpretado como uma suposição de que os inventores não são autorizados a antedatar tal revelação em virtude da invenção antecedente. Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar determinados recursos e/ou modalidades específicos. Os exemplos não devem ser interpretados de modo a limitar a revelação aos recursos ou às modalidades específicos exemplificados.

Claims (27)

1. Vetor de ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende um promotor ligado de maneira funcional a i) uma sequência de poliligante; ii) um transgene a/b não clorofila ou iii) uma combinação de i) e ii), em que o dito promotor compreende a SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tenha 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1.
2. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito promotor é menor que 3 kb em comprimento.
3. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito promotor consiste na SEQ ID NO:1 ou em uma sequência que tem 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1.
4. Vetor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, uma sequência que codifica um marcador selecionável.
5. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o dito promotor é ligado de maneira funcional a um transgene ou a um RNA pequeno.
6. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um marcador selecionável ou um produto de gene que confere resistência a inseticida, tolerância a herbicida, eficiência de uso de nitrogênio, eficiência de uso de água ou qualidade nutricional.
7. Vetor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou 5, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, uma sequência não traduzida 3’ que compreende a SEQ ID NO:6 ou uma sequência que tem 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:6, em que a sequência não traduzida 3’ é ligada de maneira funcional ao dito poliligante ou ao dito transgene ou ao dito RNA pequeno.
8. Vetor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou 5, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, uma sequência não traduzida 5’ que compreende a SEQ ID NO:4 ou uma sequência que tem 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4, em que a sequência não traduzida 5’ é inserida entre, e ligada de maneira funcional a, a dita sequência de promotor e o dito poliligante ou transgene ou RNA pequeno.
9. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, uma sequência de íntron inserida após a sequência não traduzida 5’.
10. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a sequência de íntron compreende a SEQ ID NO:2 ou a SEQ ID NO:3.
11. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a sequência de íntron compreende a SEQ ID NO:3.
12. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o promotor consiste na SEQ ID NO:5 ou em uma sequência que tem 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:5 e o dito promotor é ligado de maneira funcional a um transgene ou a um RNA pequeno.
13. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, uma sequência não traduzida 3’ que compreende a SEQ ID NO:6 ou uma sequência que tem 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:6, em que a sequência não traduzida 3’ é ligada de maneira funcional ao dito transgene.
14. Planta caracterizada pelo fato de que compreende a SEQ ID NO:5 ou uma sequência que tem 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:5 ligada de maneira funcional a um transgene.
15. Planta, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a dita planta é selecionada a partir do grupo que consiste em milho, trigo, arroz, sorgo, aveias, centeio, bananas, cana- de-açúcar, feijão-soja, algodão, girassol, Arabidopsis, tabaco e canola.
16. Planta, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a dita planta é Zea mays.
17. Planta, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizada pelo fato de que o transgene é inserido no genoma da dita planta.
18. Planta, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que compreende, ainda, uma sequência não traduzida 5’ que compreende a SEQ ID NO: 4 ou uma sequência que tem 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4, em que a sequência não traduzida 5’ é inserida entre, e ligada de maneira funcional a, o dito promotor e o dito transgene.
19. Planta, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que compreende, ainda, uma sequência de íntron inserida após a sequência não traduzida 5’.
20. Planta, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a sequência de íntron compreende a SEQ ID NO:2 ou a SEQ ID NO:3.
21. Planta, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que compreende, ainda, uma sequência não traduzida 3’ que compreende a SEQ ID NO:6 ou uma sequência que tem 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:6, em que a sequência não traduzida 3’ é ligada de maneira funcional ao dito transgene
22. Planta, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o promotor consiste na SEQ ID NO:1 ou em uma sequência que tem 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 e o dito promotor é ligado de maneira funcional a um transgene.
23. Planta, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o promotor consiste na SEQ ID NO:5 ou em uma sequência que tem 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:5 e o dito promotor é ligado de maneira funcional a um transgene.
24. Planta, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizada pelo fato de que compreende, ainda, uma sequência não traduzida 3’ que compreende a SEQ ID NO:6 ou uma sequência que tem 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:6, em que a sequência não traduzida 3’ é ligada de maneira funcional ao dito transgene.
25. Vetor de ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende um terminador de transcrição ligado de maneira funcional a i) uma sequência de poliligante; ii) um transgene a/b não clorofila ou iii) uma combinação de i) e ii), em que o dito terminador de transcrição compreende a SEQ ID NO:6 ou uma sequência que tem 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:6.
26. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o dito terminador de transcrição é menor que 1 kb em comprimento.
27. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o dito terminador de transcrição consiste na sequência 3’UTR da SEQ ID NO:6.
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