CN109810991A

CN109810991A - 二氢蝶酸合酶基因folP的用途

Info

Publication number: CN109810991A
Application number: CN201910157935.3A
Authority: CN
Inventors: 罗义勇; 柳陈坚; 龙云
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2019-03-02
Filing date: 2019-03-02
Publication date: 2019-05-28
Anticipated expiration: 2039-03-02
Also published as: CN109810991B

Abstract

本发明公开了一种二氢蝶酸合酶基因folP的用途，即二氢蝶酸合酶基因folP在提高微生物菌株叶酸生物合成中的应用，或在提高微生物菌株生物量中的应用；将folP基因与温度敏感型质粒pFED760重组构建了敲除载体，将其导入食源性植物乳杆菌感受态细胞中，进而通过同源重组构建了folP基因敲除菌株；结果显示，folP基因与细胞形态相关；folP基因与菌株生长状态相关；通过液相色谱‑质谱联用技术测定菌株产叶酸能力，发现ΔfolP菌株产叶酸能力低于野生型菌株，故folP基因在叶酸合成中起关键作用，本发明在叶酸生物合成研究及应用领域具有巨大潜力。

Description

二氢蝶酸合酶基因folP的用途

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及二氢蝶酸合酶基因folP在提高植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）叶酸生物合成中的应用。

背景技术

叶酸，化学名为蝶酰谷氨酸（pteroylglutamic acid），是一种由蝶呤、对氨基苯甲酸（p-aminobenzoic acid, pABA）和一个或多个谷氨酸结合而成的水溶性B族维生素，即维生素B9。化学合成叶酸（folic acid）只含有一个谷氨酸尾巴，而天然叶酸（folate）则由多个谷氨酸尾巴组成。

叶酸具有重要生理功能，人无法离开叶酸而生存。据报道，叶酸参与DNA和RNA生物合成、DNA修复、氨基酸代谢及血红蛋白合成等生理代谢过程。此外，叶酸因可以提供大量游离碳离子，是形成神经末梢和构成传递神经冲动的重要化学原料物质，进而保障神经系统的正常发育，因此在怀孕、婴儿发育过程中尤为重要。

人无法合成叶酸，只能通过补充叶酸制剂或者从食物中摄入来满足自身需求。但大量摄食化学合成叶酸会给人的健康带来许多副作用，如掩盖由维生素B12缺乏所引起的早期贫血临床表现、改变肝脏中二氢叶酸还原酶的性、促进癌症发生、引发认知功能障碍等。所以与化学合成药品相比，选择食品中存在的或由微生物代谢产生的天然叶酸更为安全。

利用食品级微生物（例如乳酸菌）合成叶酸，具有经济效益较高、环境污染少、安全性高等特点。根据KEGG数据库（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html），微生物叶酸生物合成途径包括蝶呤代谢支路及对氨基苯甲酸代谢支路。为了提高天然叶酸产量进而满足人类需求，研究上述通路中叶酸生物合成关键基因或通过基因工程改变植物和微生物中叶酸的代谢受到相当重视，但是因为微生物菌种的特异性，叶酸合成基因缺乏系统性地研究，一些新功能有待发掘。

目前对微生物叶酸生物合成途径调控机理的研究，仅对对氨基苯甲酸代谢这一支路有较为深入的研究，而另一条蝶呤代谢支路的研究较少。深入研究蝶呤代谢支路的叶酸合成基因，更能系统性的阐述微生物叶酸合成途径调控机理，完成微生物及其代谢物在工业上的开发利用。

发明内容

针对研究现状的不足，本发明提供一种二氢蝶酸合酶基因folP的用途，即二氢蝶酸合酶基因folP在提高微生物菌株叶酸生物合成中的应用，或在提高微生物菌株生物量中的应用，所述二氢蝶酸合酶基因folP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；本发明将folP基因与温度敏感型质粒pFED760重组构建了敲除载体pFED760-folP，将其导入植物乳杆菌感受态进而通过同源重组构建了folP基因敲除菌株ΔfolP；通过比较野生型菌株与ΔfolP菌株的生理生化差异，证明folP基因与细胞形态及菌株生长状态相关，以及在叶酸合成中起关键作用，本发明在叶酸生物合成的的研究及应用领域具有很大潜力。

为了实现本发明的上述目的，本发明的技术方案如下：

1、二氢蝶酸合酶基因folP敲除载体的制备，所述敲除载体通过以下方法构建：以食源性植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）基因组为模板，利用引物对（up-PF+up-PR；down-PF+down-PR）分别扩增上下游同源臂，PCR产物用作模板，利用引物对（up-PF+ down-PR）扩增得到同源臂敲除片段，该片段纯化后，与温度敏感型质粒pFED760分别用限制性内切酶Spe I和Eco RI同步酶切，酶切产物经切胶回收后，进行连接实验，连接产物导入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，提取质粒得到folP基因敲除载体pFED760-folP；

其中引物序列如下：

up-PF：5’-GGACTAGTGGCAAGTGTGAAG-3’；

up-PR：5’-ATCGTCAAAATCATCCGGACTACTCCACCGATCCTTCC-3’；

down-PF：5’-GGAAGGATCGGTGGAGTAGTCCGGATGATTTTGACGAT-3’；

down-PR：5’-TGGAATTCCATTATCACGCTTATCTTG-3’；

本发明中二氢蝶酸合酶基因folP及其上下游同源臂序列如SEQ ID NO: 2所示，来源于食源性植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）；植物乳杆菌因其安全无害等特点，广泛应用于食品、药品等领域，故其基因也是对人体安全无害的，这将为该发明将来在叶酸生产领域的应用提供理论的安全保障。

2、二氢蝶酸合酶基因folP敲除菌株构建和筛选，包括上述二氢蝶酸合酶基因folP敲除载体构建及后期敲除载体转化和敲除菌株筛选；步骤如下：

（1）敲除载体pFED760-folP转化：在90~100μL植物乳杆菌感受态中加入10 μL敲除载体pFED760-folP，轻轻混匀，冰浴5min后转入预冷电击杯中，按照12.5kv/cm，200Ω的参数进行电击；电击完成后迅速向电转杯中加入900μL新鲜MRS培养液，用枪头轻轻吹打混匀后，将混合液转移至无菌1.5mL离心管中，28℃静止培养2.5~3 h使细胞复苏；培养后菌液8000~10000 rpm离心3min，弃900μL上清液，用剩余上清液重悬菌体，涂布于含有5 μg/mL红霉素MRS固体平板上，28℃静置培养。

（2）folP基因敲除菌株筛选：步骤（1）中长出的单菌落转接于含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基中，28℃静置培养直至菌液OD₆₀₀为0.2~0.3时，将菌液转移至37℃继续静置培养过夜，该培养菌液稀释10³~10⁵倍后涂布于含有5µg/mL红霉素的MRS固体平板上，37℃静置培养24h，挑取单克隆，接种至1mL含有5µg/mL 红霉素的MRS液体培养基中37℃静置培养过夜，该培养菌液按1%接种至不含抗生素的MRS液体培养基中，28℃静置培养过夜，然后菌液稀释10³~10⁵倍后涂布于无抗生素的MRS固体平板，37℃静置培养至长出单克隆，挑取较小单菌落一一对应划线于含有5µg/mL红霉素和不含抗生素的MRS固体平板，37℃静置培养24h，挑取在含抗生素的MRS琼脂平板上无法生长，而在不含抗生素的平板上可以生长的菌落进行菌液PCR验证；

本发明中所述菌液PCR验证中，前引物（folP-FF：5’-TGACCGTGTTACAGGAGCAAC

CT-3’）位于上游同源臂上游基因组上，后引物（folP-RR：5’-CACTTCATTCTTAGCTAACC

ACCT-3’）位于下游同源臂下游基因组上；野生型菌株PCR片段比敲除菌株大1149 bp。

（3）利用构建成功的敲除菌株证明了食源性植物乳杆菌的folP基因与植物乳杆菌细胞形态和菌株生长状态相关，且其在植物乳杆菌的叶酸合成中起关键作用。

本发明的特点之一在于研究基因来自于食源性食物乳杆菌，具有安全性，可用于后期食品发酵领域。

本发明的特点之二在于基因敲除菌株筛选的方法提高了敲除菌株的筛选效率。

本发明特点之三在于，证明了本发明研究基因folP基因在叶酸合成中的关键作用，为叶酸合成功能性食品的研发提供一定理论基础，且进一步发现了此基因在细胞形态及菌株生长中的作用。

与现有技术相比本发明具有以下优势：1）研究基因来源于食品级微生物，具有安全性；2）本发明研究基因folP基因除了在叶酸合成中发挥重要作用外，还与细胞形态及菌株生长相关。

附图说明

图1是本发明folP基因敲除株的菌液PCR验证，其中泳道M：DNA marker；泳道1和2：敲除菌株∆folP基因组DNA为模板PCR产物；泳道3：植物乳杆菌野生型菌株基因组DNA为模板PCR产物；

图2是本发明植物乳杆菌野生型菌株和敲除菌株∆folP的扫描及透射电镜图；A ：野生型菌株扫描电镜图；B：敲除菌株∆folP扫描电镜图；C：野生型菌株透射电镜图；D：敲除菌株∆folP透射电镜图；

图3是本发明植物乳杆菌野生型菌株（A）和敲除菌株∆folP（B）的菌液生长状态；

图4是本发明植物乳杆菌野生型菌株和敲除菌株∆folP的生长曲线和pH动态曲线；

图5是本发明植物乳杆菌野生型菌株和敲除菌株∆folP发酵液总叶酸含量。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。温度敏感型质粒pPED760由伊利诺伊大学Michael J Federle 博士惠赠；下述实施例中的结果如无特别说明，均为三次重复的平均值。

实施例1：二氢蝶酸合酶基因folP敲除同源臂克隆

1、PCR扩增上下游同源臂

使用细菌基因组DNA提取试剂盒（百泰克生物技术有限公司，中国）提取食源性植物乳杆菌YM 4-3基因组，具体操作按照试剂盒说明书进行。folP基因编码区起始密码子ATG上游990 bp序列作为上游同源臂，终止密码子TAG下游992 bp序列作为下游同源臂长；

以提取基因组为模板，利用引物对up-PF（5’-GGACTAGTGGCAAGTGTGAAG-3’，下划线为Spe I酶切位点）+ up-PR（5’-ATCGTCAAAATCATCCGGACTACTCCACCGATCCTTCC-3’）和down-PF（5’-GGAAGGATCGGTGGAGTAGTCCGGATGATTTTGACGAT-3’）+ down-PR（5’-T

GGAATTCCATTATCACGCTTATCTTG-3’，下划线为Eco RI酶切位点）分别扩增上下游同源臂，PCR反应体系及扩增条件如下：

（1）PCR反应体系

（2）PCR扩增条件

95℃预变性3 min；95℃变性15 s；60～63℃退火30 s；72℃延伸1 min；循环30次；72℃延伸5 min，12℃保存。反应完成后取5 µL，在1%琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

2、基因敲除片段克隆与测序

以上下游同源臂PCR产物各1μL为模板，up-PF和down-PR为引物，按照上述PCR反应体系和扩增条件（延伸时间改为2 min）进行重叠PCR。切胶回收预期大小PCR产物（即基因敲除片段），按照大连宝生物公司（中国）TA克隆试剂盒说明书，将PCR产物连接至pMD19-T载体中。通过热激转化法将连接产物导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于Amp-LB平板上。37℃过夜培养后，随机选取10～15单菌落，提取其细胞中质粒，并用Spe I和Eco RI进行酶切验证，阳性质粒送测序公司测序。

实施例2：folP基因敲除载体构建

使用限制性内切酶Spe I和Eco RI分别对测序正确的基因敲除片段和温度敏感型质粒pFED760进行同步酶切，酶切体系为：Spe I，1 µL；Eco RI，1 µL；1×H buffer，2 µL；基因敲除片段或pFED760，10~16 µL；加灭菌去离子水到20 µL，37℃酶切4 h；回收酶切产物，按照目的基因:载体= 4:1～2:1（摩尔比）加样后，加入T4 DNA连接酶在16℃连接12～16 h。利用热激转化法将连接产物导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，随后涂布于红霉素-LB固体平板上。28℃过夜培养后，提取10～15单菌落细胞中质粒，并用Spe I和Eco RI酶切验证以获得阳性质粒，命名为pFED760-folP。

实施例3：folP基因敲除菌株构建

1、folP基因敲除载体导入植物乳杆菌感受态细胞

参照费永涛（2015，华南理工大学硕士学位论文）报道方法制备植物乳杆菌感受态细胞。在90~100 μL植物乳杆菌感受态中加入10 μL基因敲除载体pFED760-folP，轻轻混匀，冰浴5 min后转入预冷电击杯中，按照12.5 kv/cm，200 Ω的参数进行电击。电击完成后迅速向电转杯中加入900μL的新鲜MRS培养液，用枪头轻轻吹打混匀后，将混合液转移至无菌,1.5 mL离心管中，28℃静止培养2.5~3 h使细胞复苏；培养后菌液8000~10000 rpm离心3min，弃900μL上清液，用剩余上清液重悬菌体，涂布于含有5μg/mL红霉素MRS固体平板上，28℃静置培养。

2、folP基因敲除菌株的筛选和验证

随机选取2～3个单菌落，转接于含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基中，28℃静置培养直至菌液OD₆₀₀为0.2~0.3时，将菌液转移至37℃继续静置培养过夜，该培养菌液稀释10³~10⁵倍后涂布于含有5µg/mL红霉素的MRS固体平板上，37℃静置培养24 h，挑取单克隆，接种至1mL含有5µg/mL 红霉素的MRS液体培养基中37℃静置培养过夜，该培养菌液按1%接种至不含抗生素的MRS液体培养基中，28℃静置培养过夜，然后菌液稀释10³~10⁵倍后涂布于无抗生素的MRS固体平板，37℃静置培养至长出单克隆，挑取较小单菌落一一对应划线于含有5 µg/mL红霉素和不含抗生素的MRS固体平板，37℃静置培养24 h，挑取在含抗生素的MRS琼脂平板上无法生长，而在不含抗生素的平板上可以生长的菌落进行菌液PCR验证。菌液PCR验证：前引物（folP-FF：5’-TGACCGTGTTACAGGAGC

AACCT-3’）位于上游同源臂上游基因组上，后引物（folP-RR：5’-CACTTCATTCTTAGCT

AACCACCT-3’）位于下游同源臂下游基因组上；野生型菌株PCR片段比敲除菌株大1149bp。该筛选方法提高了敲除菌株的筛出效率，结果见图1。

实施例4：ΔfolP菌株细胞形态及生长状态检测

1、细胞形态观察

分别取1.5 mL培养好的植物乳杆菌野生型菌株和基因敲除菌株ΔfolP，5000 rpm离心5 min，弃上清后，菌体先用3.5%戊二醛固定液固定，随后按照下述步骤处理电镜观察样品。

（1）扫描电镜样品制备

戊二醛前固定后→磷酸缓冲液清洗→1%锇酸固定→磷酸缓冲液清洗→不同梯度乙醇脱水→叔丁醇置换→临界点冷冻干燥→离子溅射金→扫描电镜观察。

（2）投射电镜样品制备

戊二醛前固定后→磷酸缓冲液清洗→1%锇酸固定→磷酸缓冲液清洗→乙醇、丙酮逐级脱水→环氧树脂618渗透→包埋→半薄切片→光镜定位，修块→Leica-R型超薄切片机切片→柠檬酸铅-醋酸铀双染色→透射电镜观察。

与植物乳杆菌野生型菌株相比，扫描电镜发现，基因敲除菌株ΔfolP的胞质出现皱缩，发生质壁分离，菌株之间粘附性增强，有些菌体形态呈不规则杆状，甚至出现凹陷（图2A和图2B）；另外，透射电镜结果显示，基因敲除菌株ΔfolP部分细胞的细胞壁变薄，胞内容物凝集成颗粒状，甚至有的细胞细胞壁发生破裂，内容物外泄（图2C和图2D）；这些结果说明folP基因敲除改变了细胞结构形态，folP基因与植物乳杆菌细胞形态维持密切相关。

2、宏观菌液状态观察

将活化后的植物乳杆菌野生型菌株和基因敲除菌株ΔfolP按1.0×10⁶CFU/mL接种量接种至5mL新鲜MRS液体培养基中，37℃静置培养18～24h；菌株生长情况如图3所示，相比于野生型菌株，敲除菌株ΔfolP菌体明显沉降于液体底部，即沉淀生长，所以敲除folP基因后改变了菌株生长状态。

3、基因敲除菌株ΔfolP动态生长监测

将菌株活化计数后，按照1.0×10⁶CFU/mL接种量接种至300 mL新鲜MRS液体培养基中，37℃静置培养120 h，每隔2h取样，利用pH计测定pH值；利用分光光度计测定OD₆₀₀；同时，将菌液进行10倍梯度稀释，取100μL稀释菌液涂布于MRS固体平板上，随后在37℃培养箱中静置培养16～24h，选取平板中菌落数在30～300范围内的平板进行计数；结果表明，与植物乳杆菌野生型菌株相比，基因敲除菌株ΔfolP生长缓慢，生长周期延长，产酸能力下降；具体表现为：基因敲除菌株ΔfolP生长周期延长了近70h，然后folP基因敲除严重降低了菌株生物量，使OD₆₀₀最大值比野生型菌株小3.6；另外，基因敲除菌株ΔfolP pH值相对野生型菌株下降较为缓慢，其最终pH值也比敲除菌株高0.3左右（图4）。

实施例5：基因敲除菌株ΔfolP叶酸含量测定

将活化后的植物乳杆菌野生型菌株和基因敲除菌株ΔfolP按1.0×10⁷CFU/mL浓度接种于30mL FACM液体培养基中，37℃静置培养72 h，每隔12 h取出5 mL菌液，避光超声破碎处理20 min，12000 rpm离心10 min后，取1mL上清液冷冻干燥；随后加入1mL 1%氨水溶解，超声5min，12000 rpm离心10min，上清液用于HPLC分析叶酸含量。

（1）色谱条件：色谱柱，Waters ACQUITY UPLC BEH Amide柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 µm）；流动相为甲醇（含5 mmol/L甲酸铵）和水（含5 mmol/L甲酸铵）；梯度洗脱：0～5min，98%～95%甲醇；5～10 min，95%～55%甲醇；10～12 min，55%甲醇；12～14 min，55%～98%甲醇；14～20 min，98%甲醇。流速为0.2 mL/min，柱温为35℃，进样量为5 µL。

（2）质谱条件：4500 QTrap质谱参数设置如下：气帘气（CUR）25，碰撞气（CAD）中等，离子源气1（GS1）45，离子源气2（GS2）50，电喷雾电压5500 V，加热器温度350℃，选用正离子模式进行检测，离子源为ESI电离源。

由图5可知，植物乳杆菌野生型菌株和基因敲除菌株ΔfolP发酵液中叶酸含量呈波动式增减；随后基因敲除菌株ΔfolP叶酸含量虽有波动，但一直比野生型菌种低。该结果说明folP基因敲除严重影响了菌株叶酸产量，证明folP基因在植物乳杆菌叶酸合成中发挥关键作用；因此，后续可通过过量表达二氢蝶酸合酶的方式提高叶酸产量，以达到扩大生产的目的，为植物乳杆菌YM 4-3菌株及其代谢产物在工业上的应用提供理论基础。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 二氢蝶酸合酶基因folP的用途

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1149

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌YM 4-3(Lactobacillus plantarum YM 4-3)

<400> 1

atgttagtac aagatatcac cagttcatta gcacaagcaa cggattttgc gagtcaggcg 60

ttgaatgccc aagttcaacg acaacaacaa ttagttttgc gttttagtga ttataatcgg 120

gaacagcagc tccgattaac ccaactatgt cagcaattag atggggtcgt gctggcgagt 180

cctgaacagt tgaccgtctt gttgaaccag acagctggtc gccagttaac ccaccaatgg 240

tcgcgagtct ttacggatca agcaacgact caaattcaat tgacccaaat tatgaaacaa 300

tatgatgttt tttggcaagc gggtgagcac cggtttaatc tcaccaagaa gccgatgatt 360

tatggcatca tgaatattac gccggattcc tttttcgacg gtggccagta caagactaaa 420

gatgacgtac tgaatcacgt ggatgccatg ttacaagcag gagctgacgt aatcgaagtt 480

aatggtcaaa cgacacggcc gggcttcacg gaagtcacgc cgcaagttga attagaccgg 540

acgttgccgt acattcgcgc catcaaggct cgtttcccgg aagcagtctt agcggtcgat 600

acttataagt atgatgtcat gcaagccgtc ctggaagaag gtgtcagcat tattaacgat 660

gtgaacgcct ttacggacga ccctcgcaag ctcaaattga tggctgacag tcgcgtcggc 720

ttactaacga tgcacagtag tcgtgaccaa gaatataccg atctgacgag cagtatgcgt 780

aggttctttg aacaaaatct ggcagcattg acgagtcatg gcatcgatat tgaacgaatt 840

gctttagatc agggaatcgg ctattcacaa gtcgcacatg gggaacagga ttacgtgatg 900

atgcgtaaca ttgatgaatt taattacttg cgacgcccaa tgatggtggc tatttcacgg 960

aaaggttatt taggtctatt gcttggcctg aagaaggaag accggttacc aatgacgttg 1020

gtcactgaag cagcgatgat gcttaagggt ggccggatca tccgggtcca cgatgtggct 1080

gaaaccaagc aattgattac gctgttaggc cgaattgaga atggctattg gttatcgaat 1140

aatgattag 1149

<210> 2

<211> 3131

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

actagtggca agtgtgaagc aattactggc tggtcgtaaa ttgatttgga tcgtcggggt 60

cttacaagat aaggcctacc ctaaaatgct ggctgaacta ttaccggtag ctgacgtcct 120

gattacgaat acgcccgcaa atccagaacg agcgttatcc gcgactaagc tggccgacac 180

ggcgaccgca ttattaacgc ccacctttat gaccacggct gcgatgcaac gacagccaga 240

cttattgact gcaacgacaa tcacggatgc gttaacgcaa gctcagcagc aagcaaccag 300

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ttggccgggg ttaagccaat gacgacgact tggttgattg catccaacaa cgctggtaaa 420

agccgcgact tgatcgcgtg tttggcttat tatggcttga ctgctcgtca gtacttgaca 480

gtggcgccgc ggctcgaatt tcccgtggaa acgacgacga gctatgtcga taacgcggtt 540

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gcagtcagtg gctttgatcg caatcaggaa attttaacgg ccctacgcga tatccctgac 720

aacgagcggc aagcgttgat gcgtgctacg ttagcggctg cctggccaga tgggcggacc 780

ttggccgtac aagcttcgat caccggctac attgcgtcct atcaatttgg acgctattct 840

gggggatttg accgaatttt ctggctaccg cgctatggtc gaacttttgc cgaattacca 900

gcaacgtggc gcatcccgct gacacaccgg ggacgggccg ccttaaaatt aatcacaaaa 960

ctttaaaaat tggaaggatc ggtggagtag atgttagtac aagatatcac cagttcatta 1020

gcacaagcaa cggattttgc gagtcaggcg ttgaatgccc aagttcaacg acaacaacaa 1080

ttagttttgc gttttagtga ttataatcgg gaacagcagc tccgattaac ccaactatgt 1140

cagcaattag atggggtcgt gctggcgagt cctgaacagt tgaccgtctt gttgaaccag 1200

acagctggtc gccagttaac ccaccaatgg tcgcgagtct ttacggatca agcaacgact 1260

caaattcaat tgacccaaat tatgaaacaa tatgatgttt tttggcaagc gggtgagcac 1320

cggtttaatc tcaccaagaa gccgatgatt tatggcatca tgaatattac gccggattcc 1380

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aagaaggaag accggttacc aatgacgttg gtcactgaag cagcgatgat gcttaagggt 2040

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ggctagtcag ttaccagtat tgcggcaaca tatggcgggg ctgcgggtag acgccgtagc 2340

cgccctggac gaaccggatt ttgaacggct gatgttgact cccaaagtga tgcacaatgg 2400

tcgtaagtta cgtgcaatca ttcaggatgc gcgtgctatt caacaattac aggccgagta 2460

tggtagcttt agcaactacc tgtgggcgtt tgtcgatgcg acaccaatca ttatgccggc 2520

gcccgatgat gaattaccga cgcgctcacc cctgggcgcc cgcgttgcga aggatttaca 2580

ccggcatggt ttgaccttcg ttggaccagt cgtcacccac atgtttttgt tggcggcggg 2640

attgattaaa ttgaattagg tagaattagg ctggcggatg ctggcctttt ttatttgctt 2700

atgcctgcgt atttttgtga gtatcaatgt gtgaatgtaa gcaaggtggg tgctttaatc 2760

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agaagaacgc catggcagct ggtaattgat agccaagcaa ccattggcat aacaagataa 3120

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<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

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ggaaggatcg gtggagtagt ccggatgatt ttgacgat 38

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

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<213> 人工序列(Artificial)

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<213> 人工序列(Artificial)

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cacttcattc ttagctaacc acct 24

Claims

1.二氢蝶酸合酶基因folP在提高微生物菌株叶酸生物合成中的应用，所述二氢蝶酸合酶基因folP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

2.二氢蝶酸合酶基因folP在提高微生物菌株生物量中的应用，所述二氢蝶酸合酶基因folP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。