CN112961878B - 一种植物乳杆菌的基因在叶酸生物生成中的应用 - Google Patents

一种植物乳杆菌的基因在叶酸生物生成中的应用 Download PDF

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Abstract

通本发明公开了一种植物乳杆菌的基因在叶酸生物生成中的应用，通过对YML4‑3菌株叶酸合成DHPPP途径中folQ基因的敲除和回补，测定各菌株的生长曲线、pH、OD600和抑制病原菌能力等，确定folQ基因在叶酸合成中发挥重要作用，研究基因来源于食品级微生物，具有安全性，并且叶酸无论对微生物还是人体，都是其发育过程中比不可少的营养元素，适当的补充有助于健康发育，因此，探宄微生物中叶酸合成关键酶基因的功能与地位，有助于了解其产生叶酸的机理，进而提高叶酸产量，为后期开发叶酸发酵食品奠定基础。

Description

一种植物乳杆菌的基因在叶酸生物生成中的应用
技术领域
本发明属于叶酸合成技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌的基因在叶酸生物生成中的应用。
背景技术
叶酸，维生素B9，是一种水溶性B族维生素。是由喋呤、对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid,pABA)和一个或多个谷氨酸结合而成，是一种无色无味的黄色或橙黄的晶体或者晶状粉末，不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂，溶于氨水、氢氧化钾等碱性溶液，在酸性条件下极不稳定，在光照条件下，尤其是紫外线的照射下易被破坏,生物体普遍需要叶酸，然而不同的生物体获得该营养物的途径各不相同。动物本身不能够合成叶酸，然而能够通过摄入食物而获得。而植物和部分微生物能够完全生物合成叶酸，只是它们合成的方式存在差异。目前研究较多的是植物和乳酸菌的叶酸合成方式，因为果蔬和发酵食品中的叶酸是人体摄入该营养素的主要来源,人体不能够自身合成叶酸，只能从饮食中摄取，每个成人每日需摄取400μg叶酸才能满足自身生命活动所需，大量研究证明，叶酸摄入不足会引发很多疾病，它在快速的细胞分裂和生长过程(如婴儿发育、怀孕)中尤为重要，因此孕妇自怀孕前就必须摄入足够叶酸以保证胎儿神经系统的正常发育，此外，叶酸还可以提高精子质量，减少染色体缺陷从而降低新生儿唐氏综合征的发生几率。它还能够促进骨髓中的幼细胞发育成熟形成正常红细胞，叶酸缺乏会造成孕妇和婴儿贫血因此，每日补充叶酸则是非常重要。
在植物体中，叶酸作为一碳单位(one-carbon units)的供体和受体，参与C1转移反应，参与甲硫氨酸(methionine，Met)、丝氨酸(serine，Ser)和甘氨酸(glyc ine，Gly)的生物合成以及组氨酸(histidine,His)的分解代谢。此外，叶酸在甲基循环(methyl cycle)中也发挥核心作用，通过S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methio nine，SAM)来实现一系列的甲基化反应。叶酸也可以通过甲基循环为甜菜碱生成提供一碳基团，并且甘氨酸脱羧酶(glycine decarboxylase，GDC)和丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyltransferase，SHMT)(在光呼吸代谢中负责Gly和Ser相互转换的重要酶)均需要叶酸衍生物作辅酶来完成一碳基团的转移。近几年来，随着研究的不断深入，人们陆续又发现叶酸在植物体内尚具有调控基因表达、提供电子供体和作为天然色素等一些新功能。例如，最近的研究发现，叶酸能够与核糖体结合，达到类似于开关的效果以控制基因的表达，这为消除产叶酸病原微生物提供思路。因此，叶酸在植物体内具有不可忽视的作用，为以后揭示生命活动提供坚实的理论基础。
发明内容
本发明要解决的问题是通过对YML4-3菌株叶酸合成DHPPP途径中folQ基因的敲除和回补，测定各菌株的生长曲线、pH、OD600和抑制病原菌能力等，确定folQ基因在叶酸合成中发挥重要作用。
本发明采用如下技术方案实现发明目的：
一种植物乳杆菌的基因在叶酸生物生成中的应用，所述应用主要通过以下步骤：
(1)使用同源重组的方法，定向敲除L.plantarumYML4-3菌株叶酸合成DHPPP途径中folQ基因，得到folQ基因敲除菌株△fol Q；
(2)仍使用同源重组方法将folQ基因回补至△folQ菌株中与野生型菌株YML4-3中folQ基因的相同位置，得到回补型菌株HBQ；
(3)使用qPCR方法测定YML4-3、△fol Q和HBQ菌株叶酸合成途径中相关基因的相对表达量；
(4)测定三株菌生长情况、抑制病原菌情况；
(5)使用LC-MS测定三株菌不同时间点产生的叶酸含量。
进一步的，所述步骤(1)和步骤(2)中的同源重组方法中均使用温度敏感型质粒pFED760为骨架，构建载体。
进一步的，所述步骤(1)中folQ基因进行同源臂克隆后以质粒pFED760为骨架构建敲除载体，并将敲除载体转化YML4-3菌株感受态细胞完成基因敲除。
进一步的，所述folQ基因进行同源臂克隆的具体方法是先使用CTAB/酶法提取YML4-3基因组DNA，然后利用重叠PCR技术得到folQ基因上下游同源片段。
进一步的，所述质粒pFED760为骨架构建敲除载体是使用试剂盒进行质粒提取，并使用酶切方法得到酶切产物，纯化后连接目的片段和pFED760质粒，并使用PCR法筛选重组菌株，获得重组质粒。
进一步的，所述敲除载体转化YML4-3菌株感受态细胞完成基因敲除的具体步骤为：使用温度敏感型质粒pFED76进行基因敲除，并将YML4-3菌株接种至培养基中制备感受态细胞，敲除载体转化感受态细胞并整合至YML4-3基因组中发，最后敲除载体从基因组汇总脱离，完成基因敲除。
进一步的，所述步骤(2)中敲除菌株fol Q基因的回补中以野生型YML4-3菌株总DNA为模板，引物扩增含有folQ基因及其上下游片段的目的序列。
与现有技术性相比，本发明的有益效果：研究基因来源于食品级微生物，具有安全性，并且叶酸无论对微生物还是人体，都是其发育过程中比不可少的营养元素，适当的补充有助于健康发育，因此，探宄微生物中叶酸合成关键酶基因的功能与地位，有助于了解其产生叶酸的机理，进而提高叶酸产量，为后期开发叶酸发酵食品奠定基础。
附图说明
图1为本发明使用温度敏感型质粒pFED760进行基因敲除原理；
图2为本发明所述普通PCR以cDNA为模板验证folQ基因表达情况图；
图3为TA克隆阳性克隆质粒提取电泳图；
图4为本发明所述酶切验证敲除载体示意图；
图5为本发明所述敲除载体整合至YML4-3菌株电泳图；
图6为三株菌OD600和PH值变化；
图7为PCR产物电泳验证敲除载体从基因组脱落情况电泳图；
图8为验证试验电泳图；
图9为回补载体酶切验证M:50⑻bp Marker；泳道1-3:重组载体酶切；
图10为回补载体整合至A/o/Q菌株基因；
图11为PCR产物电泳验证回补载体从基因组脱落情况电泳图；
图12为双层培养基法测定三株菌抑制病原菌能力折线图；
图13为三株菌抑制并原菌生长；
图14为fol Q基因基因扩増标准曲线；
图15为三株菌叶酸合成DHPPP途径中五个基因的相对表达情况*和***代表显著性差异(P<0.05)和极显著性差异(P<0.001)；
图16为喋酰单谷氨酸叶酸标准曲线；
图17为三株菌LC-MS测定叶酸含量
A：三株菌不同时间点测定喋酰单谷氨酸叶酸含量(ng/mL)；B：三株菌不同时间点测定喋酰多谷氨酸叶酸峰面积；C三株菌不同时间点测定喋酰单谷氨酸叶酸占总叶酸百分比(％)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1、使用同源重组的方法，定向敲除L.plantarumYML4-3菌株叶酸合成DHPPP途径中folQ基因，得到folQ基因敲除菌株△folQ，具体方法如下：
(1)、分别配制MRS肉汤(琼脂)培养基、LB肉汤(琼脂)培养基和改良后的CDM培养基。
(2)、进行实验(Southern Bloting实验)
首先，基于使用本地blast比对及cDNA序列克隆测序结果确定该基因序列，基于fol Q基因blast比对寻找YML4-3菌株fol Q基因序列并通过cDNA序列TA克隆测序验证该基因序列；
其次，进行YML4-3fol Q基因的敲除，选取温度敏感型质粒pFED760为骨架，构建敲除载体，基于同源重组的方法对目的基因进行敲除，如图7中M:50⑻bp Marker；泳道3、5、6:疑似基因敲除菌株；泳道1、2、4、7-9:还原成野
生型菌株，并且在图8中A-菌株基因组酶切电泳图M:50⑻bp Marker；泳道1:野生型菌株YML4-3基因组酶切；泳道2:敲除菌株A/o/Q基因组酶切；泳道3:阳性对照；泳道4:阴性对照；B-Southern Bloting验证A/o/Q菌株泳道1:野生型菌株YML4-3；泳道2:敲除菌株A/o/Q；泳道3:阳性对照；泳道4:阴性对照。
(a)fol Q基因同源臂克隆；具体方法是先使用CTAB/酶法提取YML4-3基因组DNA，然后利用重叠PCR技术得到folQ基因上下游同源片段，PCR电泳图如图11所示，M:5000bpMarker；泳道1、3-7、9、10:回补载体从基因组脱离还原成敲除型菌株；泳道2、8、11:回补载体回补载体从基因组脱离成野生型菌株。
(b)以pFED760质粒为骨架构建敲除载体；使用试剂盒进行质粒提取，并使用酶切方法得到酶切产物，纯化后连接目的片段和pFED76质粒，并使用PCR法筛选重组菌株，获得重组质粒，如图9。
(c)敲除载体转化YML4-3菌株感受态细胞完成基因；使用温度敏感型质粒pFED76进行基因敲除，并将YML4-3菌株接种至培养基中制备感受态细胞，敲除载体转化感受态细胞并整合至YML4-3基因组中，最后敲除载体从基因组汇总脱离，完成基因敲除制得△fol Q菌株。
(d)敲除菌株分子生物学验证，野生型菌株及敲除菌株基因组DNA提取将已活化的YML4-3野生型菌株与Δfol Q敲除型菌株按4‰接种量接种至50mL MRS液体培养基中，37℃，静置培养16h后，8000rpm/min离心，弃上清，参考CTAB/酶法进行基因组DNA提取，最后用50μL无菌水溶解两个菌株基因组DNA于不同离心管中，-20℃保存，备用。
酶切基因组如表2.9所示：
表2.9酶切反应体系
试剂 体积
DNA15μg 2.3μL
10×Buffer 5μL
SpeI 8μL
NdeI 8μL
ddH2O To50μL
2、仍使用同源重组方法将将folQ基因回补至△folQ菌株中与野生型菌株YML4-3中folQ基因的相同位置，得到回补型菌株HBQ，如图10，M:5000bp Marker；泳道1-3:回补载体己整合至基因组中。
3、测定野生型菌株、敲除菌株及回补菌株生长情况、抑制病原菌情况。
(1)、三株菌动态生长检测(CFU、OD值、PH)
(a)菌株生长曲线对比
三株菌在改良后的CDM培养基中，按照相同体积比接种，观察其在同时间内的变化情况。三株菌在0-12h，CFU增加速率快，最高达到109CFU/mL处于对数生长期，消耗营养多，代谢快。12-30h，三株菌处于平台期，之后逐渐衰亡，但速度很慢，到108h时，仍有活菌(图表未显示)。
(b)菌株生长状况对比
三株菌在改良后的CDM培养基中，观察pH值的变化，发现随着取样时间的变化，三株菌的pH值都在逐渐降低，且野生型菌株YML4-3并没有因为活菌数较其它两株菌多而呈现出较低的pH值，相反，敲除型菌株Δfol Q在前18h的pH值较其它两株菌低(图6)。
(2)、双层培养基法测定三株菌抑制病原菌能力
使用三株菌通过双层培养基法对三株病原菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和单增李斯特菌)生长进行抑制，若菌体能够抑制病原菌的生长，则会看到如图12所示的菌落周围存在透明抑菌圈，通过测量抑菌圈直径大小，来计算三株菌抑制病原菌能力强弱。
如表2.11所示，三株菌在抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌时，相比于野生型菌株YML4-3，抑菌圈直径虽有细微差别，但没有显著性差异(P>0.05)，说明对folQ基因进行的敲除和回补操作，没有影响乳酸菌的其他代谢物的合成能力。但敲除型菌株ΔfolQ在抑制单增李斯特菌时，相比于野生型菌株，其抑制能力显著增强(P<0.05)，具体折线图如图12所示，三株菌抑制并原菌生长状况如图13所示，图中A：三株菌抑制金黄色葡萄球菌生长情况；B三株菌抑制大肠杆菌生长情况，c三株菌抑制单増李斯特菌生长情况
表2.11三株菌抑制病原菌能力
Figure GDA0004146629840000061
注：*表示相对于野生型菌株YML4-3时，抑菌圈直径大小具有显著性差异(P<0.05)4、RT-qPCR测定三株菌叶酸合成DHPPP途径相关基因表达差异
(a)引物扩增效率
以设计fol Q基因qPCR引物为例，图14是以YML4-3菌株cDNA为模板针对fol Q基因进行扩增的标准曲线，R2为0.996，说明标准曲线线性关系可信，扩增效率为113.8％，处于80％-120％范围内，引物可用。同样方法得到内参基因、folB、folK、folP和fol E的扩增效率为86％、93.2％、104％、110％和110％，引物可用。
(b)目的基因qPCR计算相对表达量
分别以三株菌培养16h得到的cDNA为模版，检测叶酸合成DHPPP途径中五个关键基因及内参基因的表达情况，使用2-ΔΔCt计算敲除型菌株Δfol Q和回补型菌株HBQ相对与野生型菌株YML4-3的基因表达差异。fol Q基因，在Δfol Q菌株中表达量显著降低(P<0.001),说明fol Q基因敲除成功，没有表达；在HBQ菌株中，fol Q基因的表达量明显提高，约为野生型菌株的5倍(P<0.05)，说明回补该基因至敲除型菌株基因组中成功，且已经表达，恢复该基因功能。在敲除菌株中，folK基因的表达量显著降低(P<0.001)，而folP基因表达量显著提高(P<0.001)，fol E基因虽然也有变化(P<0.05)，但不及fol K和folP基因变化大，而folB基因变化最不显著(P>0.05)。在回补菌株中，folK基因表达量则是显著下降(P<0.05)，而folB、fol E和folP基因较野生型菌株表达量菌有显著提高(P<0.05)，但是其相比于敲除菌株，除了fol Q基因的极显著提高(P<0.001)之外，folB和fol P基因的表达量也都有所提高(P<0.05)，但是folK和fol E基因的变化并不显著。说明，回补fol Q基因，其叶酸合成DHPPP途径整体表达情况并没有完全恢复成野生型菌株表达状态，相反，其表达情况更倾向于敲除型菌株表达情况。值得注意的是，在对fol Q基因做处理得到的敲除型菌株和回补型菌株中的folK基因，相比于野生型菌株都是呈现下调表达的趋势，如图15所示。
5、LC-MS测定三株菌不同时间点产生的叶酸含量
将1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mL和0.01ng/mL的单谷氨酸叶酸标准品对应其峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制如图16所示的喋酰单谷氨酸叶酸标准曲线。由该曲线可根据LC-MS得到的峰面积推算所测样品含有的单谷氨酸叶酸浓度。另外，由于市面缺少多谷氨酸叶酸标品，故本实验只能根据峰面积半定量不同样品多谷氨酸叶酸含量。
由图17可以看出，三株菌随着时间的延长均产生单谷氨酸叶酸，且含量高于初始值，在不同阶段呈现不同的趋势。对于野生型YML4-3菌株，在72h之前，每隔12h产单谷氨酸叶酸趋势发生一次变化，若前一个12h为上升，则后一个12h为下降，一直到72h之后呈现一直上升的状态。对于敲除型菌株，在48h之前单谷氨酸叶酸含量呈现上升趋势，48h-108h呈现不同程度的下降，在108h之后一直保持上升的趋势。对于回补型菌株HBQ，在0h-24h单谷氨酸叶酸含量呈现上升趋势，24h-36h迅速下降，而后到72h又逐渐上升，到108h又下降。三株菌共同的特点是在0-12h和108h之后均产生单谷氨酸叶酸，且0-12h产生的速率最快，在其它时间则没有规律的波动，但总体仍呈现出产生单谷氨酸的状态。
三株菌随着时间的延长，多谷氨酸叶酸的含量整体呈现下降趋势，且前12h下降速度最快，这个时间正是三株菌合成单谷氨酸叶酸最快的时候，说明，合成单谷氨酸叶酸时，多谷氨酸叶酸的合成会受到影响。
随后，通过对比三株菌单谷氨酸叶酸占总叶酸百分比发现，在12h时，野生型菌株单谷氨酸叶酸所占百分比最高，回补型菌株其次，敲除型菌株则是最少，说明fol Q基因主要干扰的是单谷氨酸叶酸的合成，在12-24h时，敲除型菌株单谷氨酸叶酸含量仍低于野生型菌株，而回补型菌株超过野生型菌株。在36-48h时，敲除型菌株单谷氨酸所占百分比超过野生型菌株，48h最明显。在84h之后，敲除型菌株和野生型菌株单谷氨酸叶酸所占百分比基本持平。60-84h，回补型菌株单谷氨酸所占百分比菌高于其它菌株，所以，三株菌中单谷氨酸叶酸含量随着时间的增加，逐渐提高，已经由最初的36％长到61％，变化较为明显。
以上所述，仅是本发明的实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，利用上述揭示的方法内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，均属于权利要求书保护的范围。

Claims (7)

1.一种folQ基因在植物乳杆菌(L.plantarum)叶酸生物生成中的应用，其特征在于：所述应用主要通过以下步骤：
(1)使用同源重组的方法，定向敲除植物乳杆菌野生型菌株YML4-3菌株叶酸合成DHPPP途径中的folQ基因，得到folQ基因敲除菌株△fol Q；
(2)仍使用同源重组方法将folQ基因回补至△folQ菌株中与野生型菌株YML4-3中folQ基因的相同位置，得到回补型菌株HBQ；
(3)测定三株菌生长情况、抑制病原菌情况；
(4)使用qPCR方法测定YML4-3、△fol Q和HBQ菌株叶酸合成途径中相关基因的相对表达量；
(5)使用LC-MS测定三株菌不同时间点产生的叶酸含量，fol Q基因主要影响单谷氨酸叶酸的合成。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤(1)和步骤(2)中的同源重组方法中均使用温度敏感型质粒pFED760为骨架，构建载体。
3.根据权利要求1所述的，其特征在于：所述步骤(1)中folQ基因进行同源臂克隆后以质粒pFED760为骨架构建敲除载体，并将敲除载体转化YML4-3菌株感受态细胞完成基因敲除。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述folQ基因进行同源臂克隆的具体方法是先使用CTAB/酶法提取YML4-3基因组DNA，然后利用重叠PCR技术得到folQ基因上下游同源片段。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述以质粒pFED760为骨架构建敲除载体是使用试剂盒进行质粒提取，并使用酶切方法得到酶切产物，纯化后连接目的片段和pFED760质粒，并使用PCR法筛选重组菌株，获得重组质粒。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述敲除载体转化YML4-3菌株感受态细胞完成基因敲除的具体步骤为：使用温度敏感型质粒pFED76进行基因敲除，并将YML4-3菌株接种至培养基中制备感受态细胞，敲除载体转化感受态细胞并整合至YML4-3基因组中，最后敲除载体从基因组汇总脱离，完成基因敲除。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤(2)中敲除菌株fol Q基因的回补中以野生型YML4-3菌株总DNA为模板，引物扩增含有folQ基因及其上下游片段的目的序列。
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