CN101573439B - 生成高产量谷氨酸的微生物及其制备谷氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

这里揭露的是突变株KCCM-10784P和KCCM-10785P，该突变株通过对谷氨酸棒状杆菌KFCC-11074的基因操作获得，同时还揭露一种利用该突变株生成L-谷氨酸的方法。该突变株能生成高产量的L-谷氨酸。

Description

生成高产量谷氨酸的微生物及其制备谷氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种生成高产量谷氨酸的微生物及其制备L-谷氨酸的方法，尤其是一种谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)KFCC-11074的突变株，以及利用该突变株制成L-谷氨酸的制备方法，其中该突变株对卡那霉素和/或氯霉素具有抗性，并能生成高产量L-谷氨酸。
背景技术
L-谷氨酸是一种典型的发酵制成的氨基酸。全世界每年L-谷氨酸的产量估计超过100万吨，可以和化工业中常用的化合物相比。L-谷氨酸已广泛用于药品、食物、动物饲料及其它产品中。
L-谷氨酸一般由发酵制成，主要是利用属于短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)或微杆菌属(Microbacterium)，或者是它们的突变株的称之为生产L-谷氨酸的棒状杆菌(“氨基酸发酵”，Gakkai Shuppan中心，195-215页，1986)。利用其它菌株发酵制成L-谷氨酸，包括利用属于芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)或青霉菌属(Penicillium)(美国专利号3,220,929)的微生物；属于假单胞菌属(Pseudomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)或念珠菌属(Candida)的微生物(美国专利号3,563,857)；一种微生物，比如属于芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属或产气杆菌属(Aerobacter aerogenes)(现在称为产气肠杆菌属(Enterobacter aerogenes))的一种细菌(经过审查的日本专利申请号32-9393(1957))，以及大肠杆菌(Escherichia coli)的突变株(日本专利未审公开号5-244970(1993))。
人们已研究，通过改变培养基组成以及发展抗性菌株来改善L-谷氨酸的生产力。例如，研制出一种对β-氟代丙铜酸具有抗性的菌株，用来增加丙酮酸的供应，该菌株用作生成谷氨酸代谢途径中的中间物。
上述方法大大改善了L-谷氨酸的生产力。然而，为了应对未来增长的需求量，需要发展出一种低成本、高效率的生产L-谷氨酸的方法。
就这个问题，本案的发明人对一种高产量生产L-谷氨酸的菌株的发展进行了大量充分的研究。研究显示，和具有生成L-谷氨酸能力的母株相比，即便用较低的生物量，当剔除基因cg2624和cg2115时，即它们不表现显型时，剔除后的突变体增加了丙三醇的利用率，并产生较高浓度的L-谷氨酸。
发明内容
要解决的技术问题
本发明的目的之一在于提供一种谷氨酸棒状杆菌KFCC-11074的突变株，该突变株可生成高产量的L-谷氨酸。
本发明的另一目的在于提供一种制备该突变株的方法。
本发明的又一目的在于提供一种利用该突变株生成高产量的L-谷氨酸的方法。
技术方案
一方面，本发明提供一种谷氨酸棒状杆菌KFCC-11074的突变株，该突变株可生成高产量的L-谷氨酸。
谷氨酸棒状杆菌KFCC-11074是一种L-谷氨酸生产菌株，在制备本发明前，通过诱变剂如UV辐射、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)处理母株谷氨酸棒状杆菌KFCC 10656，以获得谷氨酸棒状杆菌KFCC-11074，且该KFCC-11074能够在含有β-氟代丙酮酸的培养基上生长。谷氨酸棒状杆菌KFCC-11074在专利号为1999-09675的韩国专利上有揭露，这里参考其完整的揭露。
本发明中的谷氨酸棒状杆菌KFCC-11074的突变株通过剔除基因cg2624和/或cg2115得到，使它们不在谷氨酸棒状杆菌KFCC-11074中表现显型。本发明利用丙三醇作为碳源，当该碳源更为有效地利用时，可以提高谷氨酸生产率，且除了谷氨酸合成外，降低了反应中的新陈代谢。为将丙三醇利用到谷氨酸棒状杆菌KFCC-11074中，用NTG处理谷氨酸棒状杆菌KFCC-11074，涂抹到含有丙三醇的极小的培养基上。在出现的菌落中，选择服从母株DNA排列分析的快速生长的菌落种群。和母株相比，该选出的单一菌落中基因cg2624和cg2115表现显型的程度降低了约2倍。本发明认为，如果KFCC-11074菌株发生突变，不表现出基因cg2624和cg2115，那么该菌株能够利用丙三醇作为碳源，这样改善了丙三醇的利用并提高了谷氨酸的生产力。这种假设经由实验得以证实。因而，一方面，本发明提供了一种谷氨酸棒状杆菌KFCC-11074的突变株KCCM-10784P，其中，基因cg2624不显性。同样地，另一方面，本发明提供了一种谷氨酸棒状杆菌KFCC-11074的突变株KCCM-10785P，其中基因cg2624和cg2115均不显性。突变株KCCM-10784P和KCCM-10785P于2006年9月28日贮藏在韩国微生物培育中心(KCCM)。由于母株KFCC-11074对卡那霉素具有抗性，所以本发明中的突变株主要选择在含有卡那霉素的培养基上。突变株KCCM-10785P(IBT03)进一步具有一氯霉素抗性基因。
另一方面，本发明提供了一种制备突变株KCCM-10784P(IBT02)和KCCM-10785P(IBT03)的方法。
一较佳观点中，从母株KFCC-11074中剔除基因cg2624和/或cg2115，制备出突变株，该突变株可生成谷氨酸。因而，本发明详细介绍了一种用于剔除基因cg2624和/或cg2115的载体。
这里所说的术语“载体”，其定义公众周知。“载体”指的是一种可包括一基因的染色体外的元素，不参加细胞中心的新陈代谢，且常为一环状双链DNA。该元素可以是线状的或环状的，单链或双链的DNA或RNA，其包括一自我复制序列，一基因组整合序列，或一噬菌体核苷酸序列。一般说来，该载体包括引导基因转移和转录的相适合的序列们，一可选择的基因标识，以及一引导自我复制或染色体整合的序列。一适合的载体含有一5’端和一3’端，其中该5’端包括一基因转移起始位点，该3’端用于控制该基因的转移终点。
该“合适的调节序列”指的是一能够控制一多核苷酸(一代码序列)的转移和转录的序列。这样的调节序列包括一核糖体结合序列(RBS)，一启动子以及一终止子。可以使用任何能够启动由载体运载的基因转移的启动子。这样的启动子不限，包括CYC1，HIS3，GAL1，GAL10，ADH1，PGK，PHO5，GAPDH，ADC1，TRP1，URA3，LEU2，ENO，TPI(对酵母中的显性有用)，lac，trp，λPL，λPR，T7，tac和trc(对大肠杆菌中的显性有用)。该终止子可以来源于较佳宿主细胞的各种基因，或不需要。
一较佳观点中，该载体包括一多核苷酸，该多核苷酸编译了谷氨酸棒状杆菌中基因cg2624和/或cg2115的一部分，以将基因cg2624和/或cg2115剔除出。在一较佳实施例中，一含有基因cg2624部分序列的多核苷酸具有序列SEQ ID No.1，一含有基因cg2115部分序列的多核苷酸具有序列SEQ ID No.2。然而，很显然，对于熟知该项技术的人而言，用于剔除的基因cg2624和/或cg2115的部分序列不限于上述序列，并且该部分序列包括含有该基因某部分序列的任何多核苷酸，只要它们通过同源重组，能够剔除转变菌株的基因组中的基因cg2624和/或cg2115。
除了基因cg2624和/或cg2115的部分序列，可使用该基因的完整序列。本案中，通过置换，该完整序列可部分改变，以剔除出基因cg2624和/或cg2115，导致缺少正常转换生产的产物。这样的剔除基因可使用一种熟知该项技术的人了解的方法制备。
本发明的一实施例中，构建了一种用于剔除基因cg2624的载体，并包括由SEQ ID No.1表示的多核苷酸。该载体叫做“pCJ200”。本发明的一实施例中，也构建了一种用于剔除基因cg2115的载体，并包括由SEQ IDNos.2和3表示的多核苷酸。SEQ ID No.3是一种编译氯霉素抗性基因的核苷酸序列。含有SEQ ID Nos.2和3的多核苷酸的剔除载体叫做“pCJ201”。
当容纳基因cg2624和/或cg2115的部分多核苷酸的载体转变为棒状杆菌种时，由该载体运载的多核苷酸通过同源重组整合成宿主染色体，从而剔除宿主染色体上的基因cg2624和/或cg2115。由于该载体具有一pUC起点，仅在大肠杆菌中起作用，不能在棒状杆菌中复制，并且仅当整合成宿主染色体时才能够复制。相应地，本发明中的载体可以使用来稳定地整合该载体本身，或把该载体运载的外源基因整合到棒状杆菌种微生物的染色体中。
这样，当该pCJ200引入一菌株时，染色体基因cg2624被剔除。当该pCJ201引入一菌株时，染色体基因c g2624和cg2115在该菌株中不起作用。也就是说，它们被剔除了。该转换的突变株不显性出基因mRNA。通过这种方式，一IBT02菌株，其中基因cg2624被破坏，以及一IBT03菌株，其中基因cg2624和cg2115都被破坏，均贮藏在韩国微生物培育中心(KCCM)并可获得。和母株相比，该突变株的OD值和谷氨酸生产力分别降低和提高了约20％和37％(见本发明的举例)。
另一方面，本发明提供了一种通过培育该突变株生产L-谷氨酸的方法。详细地说，该方法包括将作为母株的谷氨酸棒状杆菌KFCC-11074中的基因cg2624和/或cg2115剔除。如上所述，剔除的基因cg2624和/或cg2115通过将一种包含该基因部分序列的载体引入谷氨酸棒状杆菌KFCC-11074来获得，通过同源重组将基因cg2624的部分序列和/或cg2115的部分序列整合到KFCC-11074菌株，防止该基因的显性。通过在一合适的培养基上培育先前制备出的突变株来获得L-谷氨酸。
本发明的一详细实施例中，包含基因cg2624部分序列的该载体(pCJ200)转换成棒状杆菌，从而获得一IBT02菌株，其中基因cg2624被破坏。包含氯霉素抗性基因和基因cg2115部分序列的该载体(pCJ201)转换成IBT02菌株，从而获得一IBT03菌株，其中基因cg2624和cg2115都被破坏。这样获得的KFCC-11074突变株，KFCC-000(IBT02)和KFCC-000(IBT03)，和母株KFCC-11074(表1)相比，生成谷氨酸的生产力增加。
有益效果
根据本发明，一基因cg2624/cg2115剔除的突变株生成谷氨酸的产量高于母株。因此，当控制棒状杆菌种的一微生物的生物量时，这样的基因控制对提高代谢物的数量是有益的。
附图说明
图1是用于分裂棒状杆菌中基因cg2624的pCJ200载体的裂解图。
图2是用于分裂棒状杆菌中基因cg2115的pCJ201载体的裂解图。
图3是聚合酶链式反应样品的琼脂糖凝胶电泳的照片，说明pCJ200载体整合到棒状杆菌染色体中。
图4是聚合酶链式反应样品的琼脂糖凝胶电泳的照片，说明pCJ201载体整合到棒状杆菌染色体中。
具体实施方式
通过下面的举例，可较好的理解本发明。但本发明并不限于具体实施方式描述的内容。
例1：用于选择缺少基因cg2624和cg2115的菌株的诱变
为了利用丙三醇到母株谷氨酸棒状杆菌KFCC-11074，该母株用NTG处理，并涂抹到一极小的培养基上，该培养基包含丙三醇[10g/L丙三醇，5g/L硫酸铵，2g/L尿素，1g/L磷酸二氢钾，2g/L磷酸氢二钾，0.4g/L硫酸镁，0.5g/L氯化钠，200μg/L维生素H，3mg/L硫胺，1mg/L泛酸，5mg/L NCA，以及1ml/L微量元素(10mg/L氯化钙，270mg/L硫酸铜，1g/L氯化铁，10mg/L二氯化锰，40mg/L钼酸铵，90mg/L硼砂，10mg/L硫酸锌)]。在出现的菌落中，选择一快速生长的菌落种群，叫做“IBT01”。该IBT01菌株服从母株DNA排列分析。和母株相比，该IBT01菌株中基因cg2624和cg2115表现显型的程度降低了约2倍。
例2：基因cg2624的克隆
谷氨酸棒状杆菌的基因cg2624的核苷酸序列通过在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索核苷酸数据库获得，并用来设计具有SEQ ID Nos.6和7核苷酸序列的寡核苷酸引物。
基因组DNA从谷氨酸棒状杆菌中提取。利用基因组DNA作为一模板来实现聚合酶链式反应，该模板带有具有SEQ ID Nos.6和7核苷酸序列的寡核苷酸引物，以放大基因cg2624的部分核苷酸序列(SEQ ID No.1)。
利用一TOPO TA克隆试剂盒(美国Invitrogen)，基因cg2624放大的部分核苷酸序列被克隆到pCR2.1-TOPO(TOPO TA克隆试剂盒中的一载体)，从而构成PCR2.1-TOPO-cg2624(pCJ200)。
例3：基因cg2115的克隆
谷氨酸棒状杆菌的基因cg2115的核苷酸序列通过在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索核苷酸数据库获得，并用来设计具有SEQ ID Nos.8和9核苷酸序列的寡核苷酸引物。基因组DNA从谷氨酸棒状杆菌中提取。利用基因组DNA作为一模板来实现聚合酶链式反应，该模板带有具有SEQ ID Nos.8和9核苷酸序列的寡核苷酸引物，以放大基因cg2115的部分核苷酸序列(SEQ ID No.2)。
利用一TOPO TA克隆试剂盒(美国Invitrogen)，基因cg2115放大的部分核苷酸序列被克隆到pCR2.1-TOPO(TOPO TA克隆试剂盒中的一载体)，从而构成PCR2.1-TOPO-cg2115。
然后，氯霉素抗性基因的核苷酸序列通过在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索核苷酸数据库获得，并用来设计具有SEQ ID Nos.10和11核苷酸序列的寡核苷酸引物。利用一pACYC-duet载体DNA作为一模板来实现聚合酶链式反应，该模板带有具有SEQ ID Nos.10和11核苷酸序列的寡核苷酸引物，以放大基因cg2115的氯霉素抗性基因(cmr)。
该放大的氯霉素抗性基因(cmr)嵌入到一pGEM-T载体内(Promega)，从而获得pGEM-T-cmr。该pCR2.1-TOPO-cg2115载体消化NsiI和SacI来去除基因cg2115的部分序列，该载体被净化并和预先消化NsiI和SacI的pGEM-T-cmr载体相连，从而形成pGEM-T-cmr-cg2115(pCJ201)。
例4：带有pCR2.1-Topo-cg2624的棒状杆菌的转录
在30℃下，把谷氨酸棒状杆菌KFCC-11074在No.2培养基(10g/L多聚蛋白胨，5g/L酵母抽提物，5g/L硫酸铵，1.5g/L尿素，4g/L磷酸二氢钾，8g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸镁，100μg/L维生素H，1mg/L硫胺，2mg/L泛酸，2mg/L NCA，20g/L葡萄糖)上培育12小时。此后，形成的培养菌植入No.2 EPO培养基(No.2培养基加上4g/L异烟肼，25g/L甘氨酸，1g/L吐温80)，直到培养菌溶液OD值达到0.3，然后在30℃下培育，直到培养菌溶液OD值达到1.0。接着，该培养菌在冰上搁置10分钟，以1500xg离心5分钟。该细胞团块用50ml预冷的10％丙三醇清洗四次，悬浮于0.5ml的10％丙三醇内。100μl的细胞悬浮被转移到一1.5ml的微量离心管内。
例1中制备的该pCJ200载体添加到该活性细胞内，并转移到一在冰上的2mm的电击管内。电穿孔在1.5kV，25μF以及600Ω下实现。紧接着电穿孔后，1mlBHIS培养基(37g/L脑心浸液，91g/L山梨糖醇)添加到该电击管内。该电击管置于46℃下6分钟，然后在冰上冷却。接着，该细胞涂抹到一活性的增加了25μg/ml卡那霉素的BHIS培养基(10g/L肉汁，10g/L多聚蛋白胨，5g/L酵母抽提物，5g/L氯化钠，18.5g/L脑心浸液，91g/L 山梨糖醇，20g/L琼脂)上。
例5：将pCJ200载体整合到棒状杆菌染色体中的测定
基因组DNA从例4中制备的棒状杆菌转换株分离出。利用该基因组DNA作为一模板来实现聚合酶链式反应，该模板具有一对拥有SEQ IDNos.6和7(M13F和M13R)核苷酸序列的寡核苷酸引物，以决定该pCJ200载体是否整合到宿主染色体中。聚合酶链式反应产物被电泳。观察到一对应pCJ200载体的谱带，确定该载体被整合到宿主染色体中。
图3是琼脂糖凝胶电泳的照片，说明基因组DNA从和pCJ200载体转变的棒状杆菌细胞分离出，利用该基因组DNA作为一模板，该模板带有一对具有SEQ ID Nos.6和7(M13F和M13R)核苷酸序列的寡核苷酸引物。如图3所示，所有五个选择的复制品(1到5)均被发现其染色体内含有pCJ200载体。通过同源重组破坏基因cg2624的转换株叫做“IBT02”，并贮藏在韩国微生物培育中心。
例6：带有pCJ201的棒状杆菌的转换
例5中制备的该转换株“IBT02”，进一步和pCJ201载体转换。该IBT02菌株根据例4中同样的程序进行转换，并涂抹到一补充了7μg/ml氯霉素的活性BHIS培养基上。
例7：将pCJ201载体整合到棒状杆菌染色体中的测定
基因组DNA从例6中制备的棒状杆菌转换株分离出。利用该基因组DNA作为一模板来实现聚合酶链式反应，该模板带有一对具有SEQ IDNos.12和13核苷酸序列的寡核苷酸引物，以决定该pCJ201载体是否整合到宿主染色体中。聚合酶链式反应产物被电泳。SEQ ID Nos.12和13的寡核苷酸具有pGEM-T载体的部分序列。
图4是琼脂糖凝胶电泳的照片，说明基因组DNA从和pCJ201载体转变的棒状杆菌细胞分离出，利用该基因组DNA作为一模板，该模板带有一对具有SEQ ID Nos.12和13核苷酸序列的寡核苷酸引物。如图4所示，所有三个选择的复制品(1到3)均被发现其染色体内含有pCJ201载体。基因cg2624和cg2115均被破坏的转换株叫做“IBT03”，并贮藏在韩国微生物培育中心。
例8：该突变株谷氨酸生产力的测定
例1，5和6中分别制备的该IBT01，IBT02，IBT03，以及母株谷氨酸棒状杆菌KFCC-11074均用来测定谷氨酸生产力。该测试在一细颈瓶内进行。在30℃下，经过12小时，每个菌株都在一活动盘(10g/L肉汁，5g/L酵母抽提物，10g/L多聚蛋白胨，5g/L氯化钠，20g/L琼脂)上生长。每个菌株的一个循环在一含有40ml长颈瓶滴定度培养基(3％葡萄糖，1％糖蜜，0.04％硫酸镁，0.1％磷酸氢二钾，0.3％硫酸铵，0.001％硫酸铁，0.001％硫酸锰，500μg/L维生素H，2mg/L盐酸硫胺，0.1％尿素，pH7.1)的250ml的长颈瓶内培养，并在30℃下，生长40小时。该培养菌用来测定谷氨酸生产力。如表1所示，和母株相比，该IBT01菌株的OD值降低，谷氨酸产量增加。和母株相比，该IBT02和IBT03菌株降低的OD值和谷氨酸产量分别上升了20％和37％。这些结果说明，和母株相比，该IBT02和IBT03突变株产生较高产量的L-谷氨酸。
表1
谷氨酸生产力

Claims (4)

1.一种登陆号为KCCM-10784P的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)突变株，其中基因cg2624被剔除，该突变株生成高产量的L-谷氨酸。
2.一种登陆号为KCCM-10785P的谷氨酸棒状杆菌突变株，其中基因cg2624和cg2115被剔除，该突变株生成高产量的L-谷氨酸。
3.根据权利要求2所述的登陆号为KCCM-10785P的谷氨酸棒状杆菌突变株，该突变株对氯霉素具有抗性。
4.一种高产量L-谷氨酸的制备方法，该方法通过培育权利要求1至3中任一权利要求所述的突变株来实现。
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